KR20080074113A - 혈구 성분을 파괴하는 공정을 포함하는 시료 중 친화성 물질의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

담체 입자의 펄 체인화를 이용한 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 방법이 제공되었다. 담체 입자의 계수에 간섭하는 혈구 성분이 전기적으로 파괴된다. 또한 면역학적인 반응에 간섭하는 용혈제를 가하지 않고 혈구 성분을 파괴할 수 있다. 혈청이나 혈장을 분리하지 않고 전혈 시료를 그대로 측정 샘플로 이용할 수 있다. 따라서 혈액 성분의 분석에 있어서, 혈청이나 혈장을 분리할 필요가 없다.

Description

혈구 성분을 파괴하는 공정을 포함하는 시료 중 친화성 물질의 측정 방법{Method of assaying substance with affinity in sample including step of destroying blood-cell ingredient}

본 발명은 담체 입자의 응집반응을 이용한 친화성 물질의 측정 방법에 관한 것이다.

생물학적 특이적 반응성 물질의 존재를 검출 또는 측정하는 방법으로는, 예를 들어, 효소 면역 측정법, 또는 방사선 면역 측정법 등이 예전부터 사용되고 있다. 이러한 방법은 고감도이고 정밀도도 높다. 그러나, 효소, 또는 방사성 동위 원소를 표식으로서 사용하기 때문에 시약이 불안정하다. 또한 방사성 동위 원소의 이용에 있어서, 보관 및 저장상의 규제가 있는 점에서, 측정에 있어서 세심한 배려나 기술이 요구된다. 그 때문에, 더욱 간편한 측정 방법이 요구되고 있었다. 또한 이러한 방법은 측정에 비교적 장시간을 요하기 때문에, 긴급한 검사에 대응하는 것이 어렵다. 이들 배경 하에서 고감도이고 신속한 측정 방법이 계속 연구되게 되었다.

1970년 이후, 면역학적 반응을 담체 입자의 응집을 지표로서 측정하는 분석 방법이 실용화되었다. 이 방법은 담체 입자의 응집 정도를 광학적으로 측정함으로써 정량적인 분석을 가능하게 했다. 담체 입자로서 라텍스 입자를 이용한 면역학적 입자 응집 반응을 광학적으로 측정하는 방법은 라텍스 응집 비탁법(Latex Agglutination Turbidimetry)으로 불리고 있다. 이러한 분석 방법에서의 반응 온도는 일반적으로는 37∼45℃의 범위에서 이루어지고, 교반 날개 등에 의해 교반함으로써 특이적 응집 반응이 진행한다. 이 때, 측정(반응)에 필요한 시간은 대략 10∼20분으로 효소 면역 측정법, 또는 방사선 면역 측정법에 비해 신속하다. 한편, 측정 감도, 또는 측정 범위에 대해서는 효소 면역 측정법 등에 비해 뒤떨어진다고 한다.

라텍스 응집법에서의 입도 분포 측정법도 공지의 기술이다(Cambiaso CL J Immunol Methods. 1977; 18(1-2): 33-44., 마츠자와 등, 화학과 공업 Vol.36, No.4, p 206-208, 1983). 라텍스 응집 비탁법이 입자 현탁액의 광의 투과도를 측정하는데 대해, 입도 분포 측정법에 있어서는 분산한 개개의 입자 상태나 수가 측정된다. Cambiaso 등의 보고에 있어서는, 입자경 0.8μm의 라텍스에 항체를 결합시킨 시약과 항원을 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후의 입자수를 계수하고, 응집에 의한 입자수의 감소 레벨에 기초하여 항원을 측정했다. 입자수는 레이저 산란광을 원리로 한 계수기로 측정했다.

한편, 마츠자와 등은 입자경 1μm의 라텍스 입자에 항체를 결합시킨 시약을 항원과 6시간 반응시켰다. 반응 후 전기 저항법에 의해 평균 입자 용적을 계측하고, 항원을 측정했다. 그러나, 실용화되어 보급한 것은 쉬쓰 플라우에 의한 레이저 산란법을 이용한 PAMIA 시스템(시스렉스 주식회사) 뿐이다. PAMIA에서는 입자경 0.78μm의 라텍스 입자가 사용되고 있다. 45℃에서 15분간의 반응 후에 라텍스 입 자를 계수하여 면역 측정을 하는 것이다. PAMIA는 라텍스 응집 비탁법에 비해 고감도화되어 있는데, 방사 면역 측정법(RIA)이나 효소 면역 측정법(EIA)이라는 고감도 면역 측정에 비교하면, 감도는 뒤떨어진다고 한다.

라텍스 응집 비탁법에 있어서는, 일반적으로 입자경 0.05∼0.6μm의 라텍스 입자가 사용되고 있다. 라텍스 응집 입도 분포 해석법의 경우는, 이와 같이 작은 입자에서는 측정 방해 물질의 영향을 받기 쉽다. 예를 들어, 혈액이나 소변 등의 체액 중에는 지질, 단백, 혈구 성분 등이 공존한다. 이들 공존 물질은 담체 입자와의 식별이 어렵다. 그 때문에 담체 입자를 올바로 계수할 수 없는 경우가 있는, 이들 측정 방해 물질의 영향을 피하기 위해 비교적 큰 입자가 사용되어 왔다. 한편, 마츠자와 등과 같이 1μm정도의 입자경이 되면, 응집 반응이 일어나기 어려워지기 때문에, 0.8μm 정도의 라텍스 입자가 사용되고 있었다. 또한 마츠자와 등이 평균 입자의 용적을 계측하는데 사용한 애퍼처(aperture:세공)의 구경은 30μm이다. 이 사이즈에서는 세공의 막힘의 영향을 받기 쉽다. 그러나, 이보다 큰 구경의 세공에서는 0.8∼1μm의 입자의 검출은 불가능해진다.

나아가, 생물학적 특이적 응집 반응을 촉진하고, 또한 형성하는 응집 덩어리를 검출하기 쉽게 하기 위해, 반응계에 교류 전압을 인가하는 방법이 공지의 기술이다(특개평 7-83928호). 이 방법은 담체 입자의 생물학적 특이적 응집 반응에 의해 생물학적 특이적 반응성 물질의 존재를 검출 또는 측정하는 방법으로, 10mM 이상의 염의 공존하에 5∼50V/mm의 전계 강도가 되도록 교류 전압을 해당 반응계에 인가하는 것을 특징으로 하는 것이다.

전기장(electric field) 중의 담체 입자는 전기장에 따라 늘어선다(펄 체인화). 그 후 전기장을 정지하면 늘어서 있던 담체 입자는 재분산한다. 펄 체인화시에 생물학적 특이적 반응성 물질이 존재하면, 전기장의 정지 후에도 담체 입자의 재분산이 일어나지 않고 펄 체인화한 담체의 존재가 또한 인정된다. 상기 측정 방법은 이런 현상을 이용하고 있다. 즉, 전기장에 있어서는, 생물학적 특이적 반응성 물질의 반응이 촉진된다. 그리고 전기장의 정지 후에 담체 입자를 재분산시키면, 반응 생성물을 검출할 수 있다. 펄 체인화를 이용한 면역학적 측정 방법은 담체 입자를 3차원 정보를 지표로서 계수함으로써, 더욱 더 그 측정 정밀도가 개선되었다(PCT 팜플렛 WO2004/111649).

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

담체 입자를 이용하는 방법뿐 아니라, 일반적으로 혈액 시료의 분석에 있어서는, 혈구 성분을 분리한 혈청, 또는 혈장이 샘플로서 이용된다. 그 이유의 하나는 혈구 성분에 의해 측정이 방해되기 때문이다. 예를 들어, 담체 입자의 응집을 광학적으로 검출할 때, 샘플에 적혈구 등의 착색 성분이 존재하면, 측정 결과에 간섭할 우려가 있다. 또는, 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이(immunoassays)와 같이, 입자를 계수하는 공정을 포함하는 방법에 있어서도, 혈구 성분을 담체 입자로서 잘못 계수할 가능성이 있다.

혈구 성분의 분리에는 원심 분리 조작이나 필터를 사용한 분리 조작이 필요하다. 만약 전혈을 샘플로 이용할 수 있는 이뮤노어세이법이 제공되면, 이와 같은 조작을 생략할 수 있다. 특히, 긴급성이 높은 검사에 있어서는, 전혈를 샘플로서 이용할 수 있는 이뮤노어세이법을 실현할 수 있다면 유용하다.

이와 같은 과제를 해결하기 위해, 용혈시킨 전혈 시료를 이용하여 담체 입자의 응집을 광학적으로 측정하는 방법이 제안되었다(특개평 10-48214). 이 방법에 있어서는, 계면 활성제가 용혈제로서 이용되고 있다. 그러나 계면 활성제는 면역학적인 반응을 저해할 우려가 있었다. 또는, 면역 반응 후에 용혈제를 첨가하여 용혈시키는 방법(특개 2002-107365)에 있어서는, 면역학적 반응에 미치는 계면 활성제의 영향은 적을지도 모른다. 그러나 용혈제를 포함하는 특수한 희석액을 조제할 필요가 있었다. 시약 조성을 바꾸지 않고, 전혈 시료나 혈청 시료도 분석할 수 있는 방법이 제공되면 유용하다. 또는, 초음파 처리 등에 의해 혈구 성분을 물리적으로 파괴할 수도 있다. 그러나, 그를 위해서는 물리적으로 혈구 성분을 파괴하는 수단을 분석 장치에 구비할 필요가 있다.

나아가, 응집 입자와 비응집 입자를 광학적으로 계수하는 방법에 있어서, 혈구보다도 작은 담체 입자를 이용함으로써 전혈 시료를 샘플로 하는 시도가 공지의 기술이다(PCT팜플렛 WO2001/96868; 공표 2004-503779). 이 방법에 있어서는, 용혈제는 이용되지 않는다. 펄 체인화를 이용한 면역학적 측정 방법에 있어서도, 전혈 시료를 샘플로 할 수 있는 방법이 실현가능하면 유용하다.

즉, 본 발명은 펄 체인화를 이용한 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 혈구 성분을 포함하는 시료를 샘플로서 이용하기 위한 방법의 제공을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해, 혈구 성분의 간섭을 받기 어려운 측정 방법에 대해 연구를 거듭했다. 그리고, 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 것에 따라, 혈구 성분의 존재하에서도 응집된 또는 응집되지 않았던 담체 입자를 특이적으로 계수할 수 있는 것을 찾아내고 본 발명을 완성했다. 즉 본 발명은 이하의 측정 방법에 관한 것이다.

〔1〕 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1) 또는 (1'), 및 이들 공정 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 측정 방법;

(1) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,

(2) 공정 (1) 다음에 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정,및

(3) 공정 (2) 다음에 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는

(1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을, 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 또한 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

(2') 공정 (1') 다음에 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리,및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및,

(3') 공정 (2') 다음에 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.

〔2〕혈구 성분을 10-70V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 〔1〕에 기재된 방법.

〔3〕혈구 성분을 40-70V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 〔2〕에 기재된 방법.

〔4〕혈구 성분을 50-60V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 〔3〕에 기재된 방법.

〔5〕공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 응집 덩어리 또는 담체 입자의 3차원 정보를 물리적으로 측정하는 〔1〕에 기재한 방법.

〔6〕3차원 정보를 물리적으로 측정하기 위한 방법이 전기 저항법, 레이저 회절 산란법, 및 3차원 화상 해석법으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법인 [5〕에 기재된 방법.

〔7〕공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 전기장을 정지 후에 담체 입자를 계수하는 것을 특징으로 하는 〔1〕에 기재된 방법.

〔8〕공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 전기장을 정지 후에 다시 부가적으로 담체 입자를 희석하는 공정을 포함하는 〔7〕에 기재된 방법.

〔9〕전압 펄스를 복수회 가하는 것을 특징으로 하는 〔1〕에 기재된 방법.

〔10〕전압 펄스를 인가한 후에 담체입자를 분산시키고 나서 다음 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 〔9〕에 기재된 방법.

〔11〕 복수회의 전압 펄스가 서로 다른 방향의 전압 펄스인 〔9〕에 기재된 방법.

〔12〕담체 입자의 평균 입자경이 1μm 이상인 〔1〕에 기재된 방법.

〔13〕담체 입자의 평균 입자경이 1μm∼20μm인 〔12〕에 기재된 방법.

발명의 효과

본 발명은 혈구 성분을 포함한 시료 중의 친화성 물질을 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이에 의해 측정할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서는, 시료가 혈구 성분을 포함하고 있어도 친화성 물질을 측정할 수 있다. 그 때문에, 예를 들어 전혈 시료를 샘플로 하여 혈구 성분을 분리하지 않고도 혈액중의 친화성 물질을 측정할 수 있다.혈구 성분의 분리는 시간과 수고를 요하는 조작이다. 따라서, 예를 들어 긴급한 검사에 있어서, 전혈을 샘플로 이용할 수 있는 측정 방법의 제공은 유용하다.

한편, 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이는 담체 입자의 면역학적인 응집이 전기장에 의해 강화된다. 그 결과, 통상적인 조건에서는 응집 반응에는 부적합한 비교적 큰 담체 입자를 이용하면서 효율적인 면역학적 반응을 실현할 수 있다. 큰 담체 입자의 사용은 측정 정밀도의 향상에 공헌한다. 또한 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이는 미량의 시료를 사용하여 단시간에 게다가 높은 감도로 친화성 물질을 검출할 수 있는 방법이기도 하다. 따라서, 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이에 의해 전혈을 시료로 하는 측정 방법을 실현한 본 발명의 의의는 크다.

또한 본 발명의 측정 방법에 있어서는, 혈구 성분은 전기적으로 파괴된다. 그 때문에,면역학적인 반응에 간섭할 우려가 있는 용혈제는 본 발명에는 불필요하다. 또는 용혈제를 포함하는 특수한 시약을 준비할 필요도 없다. 게다가, 원래 펄 체인화를 이용한 이뮤노어세이에 있어서는, 반응액에 전기장을 인가하기 위한 전극이 사용되고 있다. 따라서, 동일한 전극을 매개하여 전기장을 인가하면, 혈구 성분을 전기적으로 파괴할 수 있다. 즉, 혈구 성분의 파괴를 위해 부가적인 장치를 구비할 필요가 없는 것이다.

나아가, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 혈구 성분의 부피로 측정값을 보정하고, 측정 대상 물질의 혈청 농도를 결정할 수도 있다. 전혈 중에 차지하는 혈구 성분의 비율은 피검자 사이에 큰 차이가 있다. 또는 같은 피검자라도 혈구 성분의 비율의 변동폭은 크다. 예를 들어 혈청 농도에서는 차이가 없어도 혈구 성분의 비율이 다른 경우에는, 전혈 중의 물질 농도에는 차이가 생긴다. 즉, 혈구 성분이 많은 피검자의 전혈 중의 물질 농도는 혈구 성분이 적은 피검자에 비해 낮아진다. 그 때문에, 혈액 중의 물질 농도는 자주 혈청 농도에 기초하여 비교된다. 혈청 농도는 혈구 성분의 비율의 영향을 제거한 수치이므로, 피검자간의 수치를 보다 올바로 비교할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 담체 입자의 계수와는 별도로, 측정 대상으로 한 혈구 성분을 포함하는 매체에서의 혈구 성분의 부피를 결정할 수 있다. 결정된 혈구 성분의 부피에 기초하여 측정 대상 물질의 측정값을 보정하면, 그 혈청 농도를 명확히 할 수 있다. 즉, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 전혈을 샘플로서 사용했다고 해도, 혈청의 분리 조작 없이 측정 대상 물질을 분석할 수 있고, 나아가 혈청 농도를 구할 수도 있다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1) 또는 (1'), 및 이들 공정 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법에 관한 것이다.

(1) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와,측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,

(2) 공정 (1) 다음에 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을, 3차원 정보를 지표로서 계수하는 공정, 및

(3) 공정 (2) 다음에 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는

(1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을, 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

(2') 공정 (1') 다음에 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및,

(3') 공정 (2') 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.

본 발명에 있어서 친화성 물질, 및 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너란,결합 반응을 구성할 수 있는 모든 물질의 조합을 포함한다. 즉, 어느 물질과 어느 물질이 결합할 때, 한 쪽이 친화성 물질이고, 다른 쪽은 결합 파트너이다. 본 발명에서의 친화성 물질 및 결합 파트너는 천연 물질일 수도 있고, 인공적으로 합성된 화합물일 수도 있다. 또한 친화성 물질 및 결합 파트너는 정제된 물질일 수도 있고, 불순물의 공존도 허용된다. 나아가, 친화성 물질 및 결합 파트너는 세포나 바이러스의 표면에 존재하기도 한다.

본 발명에 있어서, 친화성 물질과 결합 파트너와의 결합 반응예로서, 예를 들어 다음과 같은 반응을 나타낼 수 있다. 이러한 반응을 구성하는 물질은 모두 본 발명에서의 친화성 물질 또는 결합 파트너라고 할 수 있다.

항원 또는 합텐과 항체의 반응(면역 반응)

상보적인 염기 서열을 가진 핵산간의 혼성화

렉틴과 그 수용체와의 반응

렉틴과 당쇄의 반응

리간드와 수용체의 반응

DNA와 전사 조절 인자의 반응

상기 결합 반응 중에서 본 발명에서의 바람직한 결합 반응으로서, 예를 들어 면역 반응을 나타낼 수 있다. 면역 반응을 구성하는 항원으로서, 다음과 같은 물질을 나타낼 수 있다. 이들 항원은 항원 분자 그 자체뿐만 아니라, 그 단편이나 세포 표면에 존재한 상태일 수도 있다. 즉, 이들 물질은 항원 물질의 예이고, 이들 이외의 항원물질에 본 발명을 응용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다. 예를 들어, 라텍스, 혈구 등을 담체로 하여 사용하는 면역학적 응집반응에 기초한 측정이 가능한 항원성 물질은 어느 것도 본 발명에 있어서 친화성 물질로 할 수 있다.

종양 마커:

AFP, CEA, CA19-9, PSA 등

섬유소 용해계 마커:

프로틴C, 프로틴S, 안티트롬빈(AT)III, FDP, FDP-D-다이머 등

감염증 마커:

CRP, ASO, HBs 항원 등

호르몬:

갑상선 자극 호르몬(TSH), 프로락틴, 인슐린 등

조직 성분:

미오글로빈, 미오신, BNP(뇌나트륨 이뇨펩티드; Brain Natriuretic Peptide), 헤모글로빈 등

기타:

DNA 등의 핵산 등

항원성 물질과 그것을 인식하는 항체는 어느 하나를 친화성 물질로 하고, 다른 하나를 결합 파트너로서 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 친화성 물질이란, 해당 물질을 측정 대상이라고 할 때, 친화성 물질이라고 부른다. 한편, 결합 파트너란 친화성 물질을 측정하기 위해 프로브로서 이용할 수 있는 해당 친화성 물질에 대한 결합 활성을 가진 물질을 말한다. 따라서, 항원을 측정할 때는 항체를 결합 파트너로서 이용할 수 있다. 반대로, 항체를 측정할 때는 해당 항체가 인식하는 항원을 결합 파트너로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 라텍스, 혈구 등을 담체로서 사용하는 면역학적 응집반응에 기초하는 측정이 가능한 항체는 모두 본 발명에서의 친화성 물질로 할 수 있다. HBs(B형 간염 바이러스 표면 항원), HBc(B형 간염 바이러스 코어 항원), HCV(C형 간염), HIV(AIDS 바이러스), TP(매독) 등에 대한 항체가 면역학적 응집반응에 의해 측정 되고 있다.

친화성 물질과 결합 파트너와의 반응을 담체 입자의 응집을 지표로 하여 측정하기 위한 몇몇 반응 원리가 공지되어 있다. 이들 반응 원리는 모두 본 발명에 응용할 수 있다. 이하에 담체 입자의 응집을 지표로 하는 친화성 물질과 결합 파트너와의 반응을 이용한 측정 원리를 예시한다.

직접 응집 반응:

측정 대상 물질과 담체 입자상의 결합 파트너와의 반응에 의한 담체 입자의 응집이 검출된다. 예를 들어, 항원 분자를 결합 파트너인 항체에 의해 측정하는 경우가 이 원리에 포함된다. 또는 반대로, 항원을 결합한 담체 입자의 응집을 지표로서 친화성 물질인 항체를 측정하는 경우도 이 원리에 포함된다. 직접 응집 반응에 있어서는, 통상 응집의 레벨과 측정 대상 물질인 친화성 물질의 분량은 정비례한다. 즉, 응집 덩어리의 형성 레벨이 높을 때는 친화성 물질의 레벨(즉, 농도)이 높다. 반대로, 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨이 높을 때는 친화성 물질의 레벨(즉, 농도)은 낮다.

응집 저지 반응:

합텐이라고 불리는 저분자 항원은 담체 입자의 응집에 필요한 항원을 매개한 가교 구조를 만들기 어렵다. 그 때문에, 직접 응집 반응 원리에서는 합텐을 검출할 수 없다. 그래서, 복수 분자의 합텐 또는 그 에피토프를 포함하는 단편을 담체에 결합한 폴리합텐과 담체 입자상의 항체와의 결합에 의한 응집 반응이 이용된다. 폴리합텐은 복수의 항체 분자를 가교할 수 있기 때문에, 담체 입자를 응집시킨다. 그러나, 합텐이 존재하면, 폴리합텐과 항체와의 반응이 저지되고, 담체 입자의 응집이 저지된다. 응집 저지 레벨은 합텐의 존재와 정비례한다. 환언하면, 측정 대상 물질의 분량과 응집 반응 레벨은 역비례한다. 즉, 응집 덩어리의 형성 레벨이 높을 때는 친화성 물질의 레벨(즉, 농도)이 낮다. 반대로, 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨이 높을 때는 친화성 물질의 레벨(즉, 농도)은 높다.

합텐으로 분류되는 측정 대상 항원에는 이하와 같은 성분을 들 수 있다.

호르몬:

에스트로겐, 에스트라디올

약제:

테오필린

본 발명에 있어서, 합텐를 응집 저지 반응 원리에 기초하여 측정하기 위해서는, 합텐에 대한 항체를 결합한 담체 입자를 응집시킬 수 있는 성분이 필요하다. 합텐에 대한 항체를 결합한 담체 입자를 응집시킬 수 있는 성분을 본 발명에 있어서는 응집 시약이라고 한다. 응집 시약은 항체와의 특이적인 친화성을 가지고, 또한 항체와의 결합에 의해 담체 입자를 가교하는 작용을 가진 시약이라고 정의된다. 앞에서 말한 폴리합텐은 합텐의 측정에 있어서 응집 시약으로서 사용할 수 있다.

직접 응집 반응이든 응집 저지 반응이든, 사전에 일정량의 친화성 물질을 포함하는 표준 시료에 대해 동일한 반응계로 측정하여 응집 덩어리 또는 응집하지 않았던 담체 입자의 레벨을 측정하여 표준 곡선, 또는 회귀식을 작성해 둘 수 있다. 시료의 측정에 의해 얻어진 응집 덩어리의 형성 레벨 및 응집하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나를 표준 곡선 또는 회귀식에 적용하면, 시료 중의 친화성 물질의 레벨을 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 결합 파트너는 담체 입자에 결합하여 사용된다. 본 발명의 담체 입자로는 라텍스 입자, 카올린, 금콜로이드, 젤라틴, 리포좀 등을 들 수 있다. 라텍스 입자로는, 응집 반응에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 폴리스틸렌계 라텍스, 폴리비닐톨루엔계 라텍스, 폴리메타크릴레이트계 라텍스 입자가 주지의 기술이다. 바람직한 입자 담체는 폴리스틸렌계 라텍스 입자이다. 관능기를 가진 모노머의 공중합에 의해 라텍스 입자 표면에 관능기를 도입한 라텍스 입자를 사용할 수도 있다. 예를 들어, -COOH, -OH, -NH₂, -SO₃ 등의 관능기를 가진 라텍스 입자가 공지되어 있다. 관능기를 가진 라텍스 입자에는 결합 파트너를 화학적으로 결합시킬 수 있다.

담체 입자의 평균 입경은, 예를 들어 라텍스 입자의 경우, 0.5∼20μm가 바람직하다.평균 입경이 0.5μm이하, 또는 20μm이상이면 펄 체인이 형성되기 어려워 바람직하지 않다. 담체 입자의 평균 입경은, 예를 들어 라텍스 입자의 경우, 구체적으로는 1∼10μm, 더욱 바람직하게는 1.4∼10μm이고, 가장 바람직하게는 1.4∼5μm, 예를 들어 1.4∼1.6μm이다. 또한 유전 분극이 큰 타원형 입자를 이용함으로써 더욱 작은 담체 입자를 사용할 수도 있다.

이와 같이 공지된 라텍스 응집 비탁법에서의 담체 입자가 0.05∼0.6μm인 것에 비해, 본 발명의 방법에 있어서는 1μm이상의 큰 사이즈의 입자를 이용할 수 있다. 전압 펄스를 인가하는 공정의 이용에 의해 응집 반응이 촉진되는 결과, 큰 사이즈의 입자라도 단시간에 충분한 반응이 진행하기 때문이다. 담체 입자가 큰 것은 이하와 같은 이점으로 이어진다. 우선, 입자를 계측하기 위한 애퍼처(aperture) 사이즈를 크게 할 수 있다. 그 결과, 애퍼처가 막히기 어려워진다. 또한 담체 입자가 커짐에 따라, 체액에 포함되는 측정 방해 물질과의 식별이 쉬워진다. 그 결과, 측정 정밀도가 향상한다.

결합 파트너와 입자 담체는 각각의 소재에 따른 방법에 의해 결합시킬 수 있다. 당업자는 양자의 결합 방법을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 라텍스 입자에는 항원이나 항체, 또는 그들의 단편 등의 단백질을 물리 흡착할 수 있다. 표면에 관능기를 가진 라텍스 입자에 있어서는, 해당 관능기와의 공유 결합이 가능한 치환기를 화학적으로 결합시킬 수 있다. 예를 들어, -COOH를 가진 라텍스에는 단백질의 -NH₂를 결합시킬 수 있다.

결합 파트너를 결합시킨 담체입자는, 필요에 따라 블로킹할 수 있다. 구체적으로는 담체 입자 표면을 불활성 단백질로 처리함으로써 담체 입자 표면에 대한 비특이적인 단백질의 결합을 방지할 수 있다. 불활성 단백질로는, 소혈청 알부민이나 탈지분유 등을 사용할 수 있다. 나아가, 담체 입자의 분산성을 향상시키기 위해서 분산매에 계면활성제나 당류를 추가할 수 있다. 또한 미생물의 번식을 막기 위해서 입자 담체에 항균제를 첨가할 수도 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 혈구 성분이란 혈액 중에 존재하는 고형 성분을 말한다. 구체적으로는 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판 등이 혈구 성분에 포함된다. 성인의 혈액 1 mm³에서의 각 혈구 성분의 수와 그 크기는 다음과 같다. 또한 적혈구수는 여성에서는 450만개, 유아에서는 690만개로, 성인 남성과는 다르다.

적혈구 약 500만개(남성) 크기 약 8μm, 두께 약 2μm

백혈구 평균 약 7,500개 크기 약 6∼14μm

혈소판 약 14∼36만개 크기 약 2∼3μm(직경 약 2μm의 원반 모양)

따라서, 혈구 성분을 포함하는 매체란, 이러한 혈액 중에 존재하는 고형 성분을 포함하는 매체를 말한다. 구체적으로는 혈구 성분을 포함하는 매체에는, 예를 들어 이하와 같은 매체가 포함된다. 그 중에서도 전혈이 본 발명에서의 매체로서 바람직하다.

전혈,

전혈을 희석한 것, 또는

전혈의 혈구 성분을 포함하는 분획

본 발명에 있어서는, 혈구 성분을 포함하는 시료의 측정을 실현하기 위해, 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 이용했다. 혈구 성분의 전기적인 파괴란, 혈구 성분을 포함하는 시료에 전기장을 주고, 혈구를 물리적으로 파괴하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 파괴란, 혈구를 상기 공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 담체 입자를 3차원 정보를 지표로 하여 계수할 때, 혈구 성분이 입자로서 계수되지 않는 상태로 하는 것을 말한다. 적혈구나 백혈구는 세포막의 파괴에 의해 세포로서의 형상을 유지할 수 없게 된다. 이와 같은 상태를 혈구 성분의 붕괴라고 할 수도 있다. 그 결과, 세포막이 파괴된 혈구 세포는 3차원 정보를 지표로 하여 계수되지 않는다. 즉, 본 발명에서의 혈구 세포의 파괴란, 혈구 세포의 세포막의 파괴를 포함한다.

한편, 본 발명에서의 매체가 전혈인 경우, 매체에 포함되는 혈구 성분의 대부분은 적혈구이다. 적혈구의 세포막의 파괴는, 특히 용혈이라고 불리고 있다. 용혈이란, 적혈구의 세포막이 파괴되고, 세포내의 단백질이 누출된 상태를 말한다. 따라서, 본 발명에서의 혈구 성분의 파괴는 용혈을 포함한다.

본 발명에 있어서, 파괴해야 하는 혈구 성분은 매체에 포함되는 혈구 성분의 적어도 50% 이상, 예를 들어 70% 이상, 또는 80% 이상, 바람직하게는 매체에 포함되는 혈구 성분의 적어도 85-95%이다. 파괴된 혈구 성분의 비율은 전기적인 파괴 전후에 혈구 성분을 비교함으로써 확인할 수 있다.

통상, 담체 입자의 농도(w/v%)가 같으면, 작은 담체 입자를 포함하는 현탁액 쪽이 동일 부피당 입자수가 많다. 일반적으로, 담체 입자의 수가 많은 현탁액에서는 적은 현탁액과 비교하여 반응액에서의 혈구 성분의 수가 상대적으로 적어진다. 즉, 입자수가 많은 현탁액 쪽이 혈구 성분의 영향을 받기 어렵다고 할 수 있다. 만일 담체 입자로서 입자경(φ)1∼4.5μm의 라텍스 입자를 사용한 경우, 적혈구의 수와의 비율은 다음과 같이 변화한다. 또한 반응액의 조성은 (전혈 시료+제1 시약R1): 제2 시약 R2 =(1+9):10으로서 계산했다.

라텍스 입자경	라텍스 입자수/적혈구수
	반응액중의 최종 라텍스 농도
	0.125%	0.250%	0.500%
1㎛	9.1	18.2	36.4
2㎛	1.15	2.3	4.6
4.5㎛	0.1	0.2	0.4

담체 입자를 계수 할 때, 파괴되지 않는 혈구 성분이 남는 조건에서는, 반응액을 차지하는 혈구 성분의 비율을 낮추는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 파괴 전의 반응액에서의 라텍스 입자수와 혈구 성분의 비가, 예를 들어 1:1∼30:1, 또는 4:1∼20:1이 되도록 조정할 수 있다. 그러나, 거의 완전히 혈구 파괴가 이루어질 때는, 더 많은 혈구 성분이 혼입되어도 혈구 성분의 간섭을 방지할 수 있음은 두 말할 필요도 없다. 또한, 본 발명에 있어서는, 전기적인 혈구 파괴에 의해 혈구 성분은 통상 3μm이하의 용적으로 변화한다. 따라서, 입자경 3μm 이상의 담체 입자를 사용한 경우는, 혈구 성분의 영향을 받기 어려워진다.

본 발명에 있어서는, 혈구 성분이 전기적으로 파괴된다. 전기적인 혈구 성분의 파괴란,혈구가 포함되는 액체에 전기장을 인가하고, 전기적인 자극에 의해 세포막의 구조를 파괴하는 것을 말한다. 구체적으로는, 전기적인 혈구 성분의 파괴는 혈구 성분이 포함되는 액체에 접촉한 전극에 통전하는 공정을 포함한다. 인가 조건은 측정해야 하는 친화성 물질이나 전압을 인가되는 액체의 전기적인 변성이나 분해를 야기하지 않는 범위에서 다음과 같은 조건을 고려하여 적절히 조절할 수 있다.

우선, 전압의 크기에 비례하여 매체의 전기 분해 가능성이 높아진다. 전압과 인가시간이 일정한 경우, 전원 주파수에 역비례하여 매체의 전기 분해 가능성이 높아진다. 한편, 주파수가 낮은 쪽이 혈구 성분은 파괴되기 쉽다. 나아가 전압과 주파수가 일정할 때, 인가시간에 비례하여 매체의 전기 분해 가능성이 높아진다.

구체적으로는, 예를 들어 10-70V/mm, 통상 30-70V/mm, 바람직하게는 50-60V/mm의 전압을 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 전기적인 파괴에 이용되는 전원은 직류일 수도 있고 교류일 수도 있다. 바람직한 전원은 교류 성분을 포함하는 전원, 또는 교류 전원이다. 교류 전원의 주파수는, 예를 들어, 10KHz∼10MHz, 통상 100KHz∼1MHz, 바람직하게는 300KHz∼600KHz이다. 이들 조건에 있어서, 5초-3분, 또는 5초-60초, 예를 들어 10-30초 동안에, 혈구 성분을 파괴하는 인가 조건을 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서, 혈구 성분은 담체 입자가 계수되는 공정 (2) 또는 (2')보다도 전에 파괴되어 있으면 된다. 바람직하게는 상기 공정 (1) 또는 (1') 전에 혈구 성분을 파괴할 수 있다. 통상, 친화성 물질과 결합 파트너의 반응을 위해 인가되는 전기장과, 혈구의 파괴를 위해 주어지는 전기장은 조건이 다르다. 그 때문에, 상기 공정 (1) 또는 (1') 전에 혈구 성분의 파괴를 위한 전기장 조건을 주는 것이 바람직하다. 그러나, 반응액에 주어지는 전기장은 연속적으로 변화시킬 수도 있다. 따라서, 공정 (1) 또는 (1')에 있어서, 친화성 물질과 결합 파트너의 반응을 위해 인가되는 전기장과, 혈구의 파괴를 위해서 주어지는 전기장을 연속적으로 인가할 수도 있다.

본 발명은 친화성 물질과 담체 입자를 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함한다. 전계(電界) 중에 담체 입자를 정렬시키고, 응집 반응을 하게 하는 방법은 주지의 기술이다(특개평 7-83928호). 즉, 친화성 물질과 담체 입자를 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가함으로써 담체 입자를 전계를 따라 정렬시킬 수 있다.

이 때, 응집 저지 반응 원리를 이용하는 경우에는, 친화성 물질과 담체 입자는 응집 시약의 공존하에 정렬시킬 수 있다. 응집 시약은 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질의 접촉 후에 접촉시킬 수 있다. 또는 미리 측정 대상 친화성 물질과 응집 시약을 혼합한 후에 담체 입자를 첨가함으로써 3개의 성분을 동시에 접촉시킬 수 있다.

전압 펄스에는 교류 성분, 또는 직류 성분을 이용할 수 있다. 양자를 임의로 조합할 수도 있다. 반응액은 전기 분해를 일으키기 쉽기 때문에, 교류 전압이 바람직하다. 교류 전압으로는, 사각형파, 직사각형파, 또는 정현파 등을 이용할 수 있다. 반응액(시약)의 이온 강도에 의해 교류 전압의 전원 주파수를 임의로 설정할 수 있다. 교류 전압은 파고값으로 나타냈을 때, 5∼50V/mm의 전해 강도를 얻을 수 있도록 인가한다. 전해 강도가 5V/mm보다도 작으면 담체의 펄 체인화가 일어나기 어렵고, 따라서 응집 반응 촉진이 불충분해진다. 전해 강도가 50V/mm를 넘으면 반응액의 전기 분해가 일어나기 쉽고, 응집 반응 측정이 어렵게 된다. 더욱 바람직하게는 10∼20V/mm의 전계 강도가 얻어지도록 인가한다. 교류 주파수는 10KHz∼10MHz의 주파수가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 50KHz∼1MHz의 주파수이다.

본 발명에 있어서, 전압 펄스란 통상 정상 상태로부터 전압이 전이하고, 유한의 시간만큼 지속하여 원래의 상태로 되돌아가는 파 또는 파형을 가진 전압을 말한다. 교류 전압은 대표적인 전압 펄스이다. 교류 전압은 전압의 평균값이 0과 같은 시간의 주기 함수이다. 예를 들어, 정현파, 직사각형파, 사각형파, 또는 톱파 등을 가진 전압은 분명 진폭이 주기적이며, 교류 전압에 포함된다. 일반적으로 교류 전압에 있어서는, 임의의 1주기에 있어서, 정전위측의 면적과 부전위측의 면적은 같고, 양자의 합계는 0이 된다. 각 면적은 가로축(전압이 0)과 상측의 곡선, 또는 하측의 곡선에 의해 규정되는 면적이다. 본 발명에 있어서는, 반응액의 전기 분해를 막기 위해, 전압 펄스가 인가된다. 따라서, 반응액의 전기 분해가 일어나지 않는, 또는 일어났다고 해도 실질적으로 반응에 간섭하지 않는 레벨로 억제할 수 있는 경우에는, 정전위와 부전위의 합계가 0이 아닌 전압 펄스를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 사각형파, 또는 직사각형파의 전압 펄스는 정전위/전위차0/부전위를 반복하고, 또한 정전위 및 부전위의 적어도 한 쪽은 전위차가 일정 상태를 포함하는 전원을 말한다. 그리고, 사각형파, 또는 직사각형파의 전위치가 0인 상태에서 다음 0인 상태에 이르는 동안의 시간이 펄스폭이다. 또한 사각형파란, 세로축을 전압, 가로축을 시간으로 하는 그래프에 전압의 변화를 그렸을 때, 거의 사각형의 형상이 되는 전압 펄스를 말한다. 사각형에는 정사각형과 직사각형이 포함된다. 이에 대해 직사각형파는, 정사각형을 포함하지 않는 직사각형 형상의 전압 펄스이다. 따라서, 직사각형파는 사각형파에 포함된다. 본 발명에 있어서, 바람직한 펄스폭은 통상 50μsec이하이다. 바람직한 펄스폭으로 0.1∼10μsec를 예시할 수 있다.

사각형파 또는 직사각형파를 구성하는 전위차가 0인 상태의 시간은 제한되지 않는다. 일반적으로는 전위차가 0이 되는 것은, 정전위와 부전위 사이의 이행 순간이다. 그러나, 전위차가 0인 상태가 더욱 긴 시간 계속되는 전압 펄스를 본 발명으로 사용할 수도 있다. 예를 들어, 0.1∼10μsec의 펄스폭을 가진 정전위/부전위의 반복 동안에 0.1∼100μsec의 전위차가 0인 상태를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 전압 펄스 인가시의 반응액의 온도는 한정되지 않는다. 통상 0∼20℃, 예를 들어 0∼15℃, 바람직하게는 1∼8℃, 또는 2∼4℃로 할 수 있다. 전압 펄스의 인가에 의해 반응액의 온도는 상승한다. 따라서, 반응액의 온도를 낮게 유지하기 위해서는, 냉각 수단을 이용하는 것이 유리하다. 국소적으로 저온 환경을 만들어 내기 위한 적절한 냉각 수단으로, 예를 들어 펠티어 소자를 나타낼 수 있다. 펠티어 소자란 펠티어(Jean Charles A. Peltier)에 의해 발견된 펠티어 효과를 이용한 반도체로 구성되는 전자 소자이다. N형과 P형의 반도체에 직류 전류를 흘리면, 반도체의 한 쪽에서 온도가 흡수되고, 다른 쪽에서 방열이 일어난다(열교환 현상). 온도가 흡수되는 쪽의 온도는 저하하고, 냉각된다. 시판 펠티어 소자는 통상 -10℃ 전후의 냉각 능력을 갖고 있다. 펠티어 소자의 냉각 능력은 반도체에 공급하는 전류에 의해 자유롭게 제어할 수 있다. 따라서, 전압 펄스를 인가하고 있는 동안, 온도 센서로 반응액의 온도를 감시하고, 필요에 따라 펠티어 소자를 작동시킴으로써 소정의 온도 범위로 반응액의 온도를 유지할 수 있다.

혹은 또한, 전압 펄스 인가시에 반응액을 충분히 냉각하고, 전압 펄스의 인가 후에도 반응액의 온도가 소정의 범위에 있는 경우에는, 전압 펄스 인가시의 냉각은 반드시 필요하지 않다. 예를 들어, 전압 펄스의 인가 종료시의 반응액의 온도가 20℃ 이하이면, 인가하는 동안 냉각하지 않아도 필요한 온도 조건을 충족시킬 수 있다. 미리 충분히 반응액을 냉각하고, 나아가 필요에 따라, 반응액이 놓여지는 환경의 온도 상승을 억제할 수 있으면, 전압 펄스 인가시의 적극적인 냉각은 필수는 아니다.

본 발명에 있어서, 전압 펄스를 인가하는 반응액은 미리 배양할 수 있다. 배양을 위한 조건은 후술한다. 반응액이 37∼90℃의 고온에서 배양된 경우에는 전압 펄스를 인가하기 전에 충분히 냉각한다. 통상 반응액의 부피는 1mL 이하이기 때문에, 반응액은 극히 단시간에 냉각할 수 있다. 고온에서 배양한 반응액을 냉각하고, 0∼20℃에 있어서 전압 펄스를 인가한다는 조건은, 본 발명에서의 바람직한 조건이다.

전압 펄스 인가시의 온도 상승이 응집 반응에 저해적으로 작용하는 메카니즘은, 다음과 같이 생각할 수 있다. 전압 펄스를 인가받은 반응액 중에서는, 담체 입자의 정렬과 분산이 반복되고 있다. 담체 입자상의 결합 파트너와 반응액 중의 친화성 물질(또는 응집 시약 성분)과의 접촉 기회를 늘리기 위해서는, 담체 입자의 분산이 유효하다. 동시에, 복수의 담체 입자를 친화성 물질(또는 응집 시약 성분)과의 결합에 의해 가교하고, 응집 덩어리를 형성하기 위해서는, 담체 입자의 정렬이 유효하다. 그러나, 반응액에서의 담체 입자의 움직임이 심한 경우에는, 담체 입자가 충분히 정렬될 수 없을 가능성이 있다. 반응액의 온도가 상승한 상태는 반응액에 포함되는 담체 입자의 브라운 운동이 거세져서 전압 인가시의 담체 입자의 정렬이 어려워진 상태라고 할 수 있다. 그 결과, 전압의 인가에 의한 담체 입자의 정렬이 저해되고, 응집 반응이 저해된다. 본 발명에 기초하여 전압 펄스 인가시의 반응액의 온도가 제어된 경우에는, 전압인가에 의한 담체 입자의 정렬 효과를 충분히 얻을 수 있고, 온도 상승에 의한 응집 반응 저해를 억제할 수 있다.

전압 펄스를 인가받은 반응액에서의 담체 입자의 움직임을 억제하기 위해, 반응액의 점도를 높이는 것도 유효하다. 일반적인 응집 반응의 반응액은 0.75mPas(파스칼·초, 또는 포아즈(P)) 미만이다. 이와 같은 점도에서는 담체 입자의 움직임은 억제되지 않고 응집 반응이 저해되는 경우가 있다. 이에 대해, 본 발명자는 0.8mPas 이상의 점도에 있어서, 응집 반응을 효율적으로 진행시킬 수 있음을 확인했다. 즉, 본 발명은 특정 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 상기 특정 물질을 포함하는 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 담체 입자를 응집시키기 위한 방법에 있어서, 전압을 인가하고 있는 동안의 반응액의 점도를 0.8mPas 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 상기 공정 (1)-(3) 또는 (1')-(3')을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 반응액의 점도가 0.8mPas 이상인 방법이 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명에 있어서, 반응액의 점도는 통상 0.8mPas 이상, 예를 들어 1∼3mPas, 바람직하게는 1∼2mPas이다. 반응액의 점도는 점도를 조절할 수 있는 화합물의 첨가에 의해 조절할 수 있다. 점도를 조절할 수 있는 화합물로는 친화성 물질과 결합 파트너와의 결합에 간섭하지 않는 임의의 화합물을 이용할 수 있다. 예를 들어, 소혈청 알부민, 카제인, 글리세린, 수크로오스, 또는 염화콜린 등을 첨가함으로써 반응액의 점도를 높일 수 있다. 이들 화합물의 첨가량은, 예를 들어 0.05∼5%에서 적절히 선택할 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.1∼3%, 더욱 바람직하게는 0.3∼1%이다. 또한 반응액의 조성이 같아도 반응액의 온도가 저하되면, 일반적으로 점도는 높아진다. 따라서, 반응액의 점도를 높인다는 의미에서도, 저온 조건 하에의 전압 펄스의 인가는 유효하다.

당업자는 이들 화합물을 반응액에 첨가하고, 전압 펄스를 인가하는 온도 조건 하에서 그 점도를 측정함으로써 적절한 첨가량을 설정할 수 있다. 액체의 점도를 결정하는 방법은 공지의 기술이다. 일반적으로는 회전식 점도계, 초음파식 점도계, 또는 진동식 점도계 등이 이용된다.

본 발명에 있어서는, 반응액에 대해 임의의 방향에서 전압 펄스를 인가할 수 있다. 예를 들어, 복수의 서로 다른 방향의 전압 펄스를 인가할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들어 2쌍의 전극을 조합하여 반응액에 전압 펄스를 인가할 수 있다. 또는, 반응액에 대해 전극을 이동시킴으로써, 서로 다른 방향의 전압 펄스를 줄 수 있다. 예를 들어, 전극을 회전시킴으로써 임의의 각도의 전압 펄스를 줄 수 있다. 이동시키는 전극의 수는 1쌍일 수도 있고, 2쌍 이상의 전극을 이동시킬 수도 있다.

일반적으로, 반응계 중의 담체 입자의 농도가 높을수록 펄 체인이 형성되기 쉬우므로 응집이 촉진된다. 그러나 한편, 담체 입자의 농도의 상승에 수반하여 생물학적 특이적 반응성 물질이 존재하지 않는 경우에 재분산했을 때의 담체 입자의 응집율(백그라운드)가 커지는 경향이 있었다. 2차원의 정보에 기초하여 응집 입자를 관찰한 한 공지의 방법(특개평 7-83928호)에 있어서는, 담체 입자의 농도가 높을수록 응집하지 않은 입자를 실수로 응집입자로서 잡아 버릴 가능성이 높아진다. 입자 농도가 높은 경우에는, 입자가 접근하기 때문에, 단순한 입자의 중복과 응집에 의해 형성된 입자 덩어리의 식별이 어려워지는 것이다. 따라서 응집 덩어리를 특이적으로 식별하기 위해서는, 입자 농도를 낮게 유지할 필요가 있다. 구체적으로는, 특개평 7-83928호에 개시된 반응계 중의 담체 입자의 농도는, 예를 들어 라텍스 입자의 경우, 바람직하게는 0.01∼1중량%, 더욱 바람직하게는 0.025∼0.5중량%, 가장 바람직하게는 0.05∼0.1중량%이다. 이와 같은 입자 농도는 펄 체인화에 있어서는 반드시 최적의 조건이라고는 할 수 없다. 즉, 2차원 정보에 기초하여 응집 덩어리를 계수하는 방법에 있어서는, 입자 농도를 희생시킴으로써 응집 덩어리의 특이적인 식별을 실현하고 있었다.

본 발명은 3차원의 정보에 기초하여 응집입자가 계측되기 때문에, 입자 농도와는 무관하게 응집 덩어리를 특이적으로 식별할 수 있다. 그 결과, 펄 체인의 형성에 최적인 조건을 줄 수 있다. 즉, 측정 대상 친화성 물질과 결합 활성을 가진 결합 파트너와의 균형을 고려하여 담체 입자의 농도를 결정할 수 있다. 가령 높은 담체 입자 농도가 선택되더라도 응집 덩어리는 특이적으로 검출된다. 본 발명에 있어서는, 통상 반응계 중의 담체 입자의 농도는, 예를 들어 라텍스 입자의 경우, 바람직하게는 0.01∼5중량%,더욱 바람직하게는 0.1∼2중량%이다. 이 농도 범위는 2차원의 정보에 기초하는 방법의 2배∼10배이다. 최적인 담체 입자의 농도는 담체입자의 크기나 측정 대상 친화성 물질의 측정 감도 등에 맞춰서 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 반응액에는 응집 반응을 촉진하는 염을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 10mM 이상의 비교적 높은 농도로 염을 첨가함으로써 응집 반응을 촉진할 수 있다. 다만, 염의 농도가 반응계 중에 600mM 이상의 농도로 존재하면 반응액의 전기분해가 일어나기 쉬워지므로 바람직하지 않다. 더욱 바람직한 염의 농도는 10∼300mM, 가장 바람직한 염의 농도는 25∼150mM이다. 생체 시료 자체가 응집반응을 촉진하는 염을 포함하고 있을 가능성이 있는 경우에는, 반응액 중의 최종 염농도가 상기 범위에 들어가도록 시약의 염농도를 조정하면 된다. 또한 전압 펄스로서 직류 성분을 사용하는 경우에는 약 6mM의 염농도의 반응액에서도 전기분해가 일어나기 때문에, 염의 존재 하에서는 생물학적 특이적 응집 반응 측정은 어렵다.

본 발명에서의 염은 생물학적 특이적 응집 반응을 촉진하는 것 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 질산 나트륨, 질산 칼륨, 염화 암모늄을 들 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 몰 전기 전도도가 10mM, 25℃의 수용액에서 100cm²/(Ω·mol)이상의 값을 나타내는 염은 본 발명에 이용하는 염으로서 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어 염화 나트륨, 염화 칼륨, 및 염화 암모늄 등을 바람직한 염으로서 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 혈구 성분을 포함하는 매체는 원액일 수도 있고, 또는 자동희석하여 측정에 사용된다. 희석 배율은 임의로 설정할 수 있다. 반응에 필요한 시약이 복수종류가 될 때는, 복수의 시약을 차례로 첨가할 수도 있다. 여기서 말하는 복수의 시약을 구성하는 시약으로는, 예를 들어 이하와 같은 시약을 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 비특이 반응의 원인이 되는 물질을 미리 분해, 및/또는 흡수하기 위한 시약을 사용할 수 있다. 이와 같은 시약은 비특이 억제제를 포함하는 시약으로서 유용하다. 비특이 억제제를 포함하는 시약은 담체입자를 포함하는 시약과 조합되어 복수의 시약을 구성한다. 비특이 억제제를 포함하는 시약은, 예를 들어, 미리 검체와 혼합할 수 있다. 비특이 억제제는, 예를 들어, 종래 주지의 것을 사용할 수 있다.

이뮤노어세이에 있어서, 비특이 반응의 원인이 되는 다양한 물질이 시료 중에 포함되는 것이 명백히 되어 있다. 예를 들어, 류머티즘 인자 등의 글로블린류는 이뮤노어세이를 구성하는 면역 반응에 간섭하는 일이 있다. 글로블린류의 이뮤노어세이에의 간섭을 방지하기 위해 비특이 억제제가 이용된다. 예를 들어, 글로블린류를 인식하는 항체에 의해 그 비특이 작용을 흡수할 수 있다. 류머티즘 인자는 IgG나 IgM 유래의 글로블린이다. 따라서, 항인간 IgG 항체, 또는 항인간 IgM 항체를 사용하여 류머티즘 인자를 흡수할 수 있다. 또한 비특이 원인 물질의 분해에 의해 간섭을 막는 방법도 공지의 기술이다. 구체적으로는, 글로블린류를 환원에 의해 분해하고, 그 간섭 작용을 억제할 수 있는 것이 알려져 있다. 글로불린류는 디티오쓰레이톨, 또는 2-머캅토에탄올 등에 의해 환원된다.

또한, 다른 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자를 포함하는 시약을 2종류 이상 조합할 수 있다. 이와 같은 구성에 의해 서로 다른 종류의 측정 대상 친화성 물질을 동시에 측정할 수 있다. 각 시약은 각각 개별로 첨가할 수 있다. 또는, 미리 복수의 시약을 혼합한 후에, 검체와 혼합할 수도 있다.

검체와 시약은 전압을 인가하기 전에 미리 혼합해 놓는 것이 바람직하다. 교 반자를 사용하여 물리적으로 양자를 혼합할 수 있다. 또는 전기적인 방법에 의해 양자를 혼합할 수도 있다. 전기적인 방법으로는 서로 다른 방향의 전압 펄스의 단속적인 인가에 의해 담체 입자의 위치를 물리적으로 움직이는 방법을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액을 미리 배양할 수 있다. 본 발명자는 전압 펄스 인가 전의 반응액의 배양에 의해 전압 펄스 인가후의 응집 덩어리의 형성이 촉진되는 것을 밝혀냈다. 즉, 전압 펄스 인가 전의 배양에 의해 반응이 촉진된다. 반응 촉진을 목적으로 하는 배양의 공정에 있어서, 혈구 성분을 파괴하기 위한 전압 펄스를 인가할 수도 있다. 또는, 배양 전, 또는 후에 혈구를 전기적으로 파괴할 수도 있다. 배양 전에 혈구를 파괴하는 경우에는, 전압 펄스의 인가에 의해 반응액의 온도가 상승한다. 그 결과, 배양에 알맞은 온도로 할 수 있다.

반응액의 배양은, 예를 들어 실온 이상의 온도에서 실시된다. 배양의 온도는 반응액에 포함되는 각종 반응 성분의 활성을 유지할 수 있는 한, 가능한 한 고온인 것이 바람직하다. 배양을 위한 시간은 한정되지 않는다. 즉 배양의 온도에 있어서, 반응 성분의 변성을 야기하지 않는 범위에서 배양할 수 있다. 배양의 시간은 길수록 촉진 효과도 증강된다. 따라서, 필요한 레벨의 촉진 효과를 기대할 수 있는 온도와 시간의 조건을 미리 설정하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 예를 들어 배양을 위한 온도 조건으로서 통상 37∼90℃, 바람직하게는 40∼90℃, 또는 45∼80℃를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 친화성 물질인 단백질 항원을 결합 파트너인 항체를 이용하여 본 발명에 기초하여 측정할 수 있다. 항체나 항원을 구성하는 단백질은 고온에서는 변성하는 것이 알려져 있다. 그러나, 예를 들어 혈청의 비동화(非動化)를 위한 일반적인 조건인 56℃, 30분이라는 배양 조건은, 많은 단백질이 변성하지 않는다. 나아가, 본 발명자들은 이뮤노어세이와 같은 낮은 단백질 농도 조건에서 단시간의 처리이면, 90℃정도의 온도라도 단백질의 변성은 무시할 수 있음을 확인했다. 예를 들어, 45∼80℃의 범위에 있어서, 5∼180초의 배양은 거의 같은 레벨의 반응 촉진 효과를 얻을 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명에서의 바람직한 배양 조건으로서, 바람직하게는 45∼80℃, 더욱 바람직하게는 50∼65℃에서, 5초 이상, 예를 들어 5∼30초를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서는, 더욱 긴 배양 시간도 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 그러나, 반응 시간의 단축이 요망되는 경우에는, 5초 이상의 짧은 시간을 채용함으로써 반응 시간을 희생시키지 않고 원하는 반응 촉진 효과를 기대할 수 있다. 또한 예를 들어, 80℃를 넘는 고온 조건에 있어서는, 배양 시간을 5∼180초로 함으로써 단백질의 변성을 피할 수 있다.

또는, 본 발명의 방법을 내열성 물질의 반응에 응용하는 경우에는, 고온 조건은 문제가 되지 않는다. 예를 들어, DNA는 고온 조건 하에도 극히 안정된다. 따라서, DNA간의 결합을 담체 입자의 응집에 의해 측정하고자 하는 경우에는, 배양을 위한 온도로서 더 높은 온도를 선택할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 배양에 의해 반응이 촉진되는 메커니즘은 다음과 같이 설명할 수 있다. 전압 펄스의 인가에 의해 정렬한 담체 입자는 그 위에 고정된 결합 파트너가 친화성 물질을 매개하여 다른 담체 입자상의 결합 파트너와 가교됨으로써 응집 덩어리를 구성한다. 일련의 반응은 담체 입자가 정렬했을 때 일어난다고 생각되고 있었다. 그러나, 본 발명자가 얻은 식견에 의하면, 전압 펄스 인가 전의 배양이 반응 효율화에 공헌하는 것이 확인되었다. 또한 이 배양 동안에 담체 입자상의 결합 파트너에 친화성 물질이 결합한 상태가 형성되는 것도 명확히 했다. 즉, 전압 펄스 인가에 의해 담체 입자를 정렬시키기 전에, 결합 파트너가 친화성 물질을 포착한 상태로 두는 것이 반응을 효율화한다고 생각된다.

전압 펄스를 인가받지 않은 조건 하에서는, 전압 펄스 인가시와 비교하여 담체 입자의 자유도는 훨씬 크다고 생각된다. 따라서, 담체 입자상의 결합 파트너와 친화성 물질은 접촉할 수 있고, 결합 파트너는 친화성 물질을 포착할 수 있다. 여기에 전압 펄스를 인가하면, 친화성 물질을 포착한 결합 파트너를 가진 담체 입자는 다른 담체 입자와 함께 전기장에 정렬한다. 이 때, 결합 파트너는 이미 친화성 물질을 포착하고 있으므로, 접근한 다른 담체 입자의 결합 파트너와의 결합에 의해 신속히 응집 덩어리가 형성된다. 전기장이 단속적으로 인가되고, 담체 입자의 정렬과 분산이 반복됨으로써 접촉 기회가 늘어나고, 응집 덩어리의 형성이 촉진된다.

즉, 전압 펄스의 인가 후에 담체 입자의 응집을 검출하고, 그 응집을 지표로하여 친화성 물질을 측정하는 방법에 있어서는, 담체 입자의 응집 덩어리는 이하의 1차 반응과 2차 반응을 거쳐 형성된다고 할 수도 있다.

1차 반응: 담체 입자상의 결합 파트너가 친화성 물질을 포착하는 반응. 이 때, 반드시 친화성 물질을 매개한 담체 입자간의 가교 구조는 형성되지 않을 수도 있다.

2차 반응: 복수의 담체 입자상의 결합 파트너가 친화성 물질에 결합하는 반응. 그 결과, 친화성 물질을 매개한 담체 입자간의 가교 구조(즉 응집 덩어리)가 형성된다.

2차 반응은 전압 펄스의 인가에 의해 촉진된다. 그러나, 지금까지 1차 반응을 촉진하기 위한 구체적인 조건은 명확히 되지 않았다. 따라서, 본 발명은 1차 반응 촉진을 위한 조건을 제공했다고 파악할 수도 있다. 즉, 본 발명에서의 전압 펄스의 인가 전의 배양 공정은 1차 반응 촉진을 위한 공정이라고 할 수도 있다.

본 발명에 있어서는, 전압 펄스를 인가하기 전의 반응액 중에 수용성 고분자 화합물을 첨가할 수 있다. 수용성 고분자 화합물의 존재 하에서, 친화성 물질과 결합 파트너의 결합을 입자 응집 반응에 의해 검출함으로써 응집 반응 강화, 또는 안정화를 달성할 수 있다. 반응액 중의 수용성 고분자 화합물의 농도는, 예를 들어 0.05∼5%에서 적절히 선택할 수 있다. 더 바람직하게는 0.1∼3%, 더욱 더 바람직하게는 0.3∼1%이다. 응집 반응 강화 작용이 강한 화합물은 5%를 넘는 농도에서, 비특이적 응집 반응 가능성을 크게 하는 경향이 있다. 또한 0.05% 이하의 낮은 농도에서는 그 효과를 충분히 기대할 수 없는 경우가 있다.

수용성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 이용할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6000∼2000000이 바람직하다. 이들 수용성 고분자 화합물은 1종류일 수도 있고, 2종류 이상을 조합할 수도 있다. 수용성 고분자 화합물을 반응액에 첨가하기 위해서는, 입자 담체를 포함하는 시약 중에 미리 필요량을 첨가해 둘 수 있다. 또는 수용성 고분자 화합물을 입자 담체와는 다른 시약으로 혼합할 수도 있다. 예를 들어, 샘플의 희석액 중에 수용성 고분자 화합물을 첨가해 둘 수 있다. 나아가, 혼합되는 복수의 시약, 및 희석액 중에 첨가해 둘 수도 있다.

바람직하게는 2시약계로 하고, 완충액 등의 제1 시약에 함유시켜 두고, 담체를 포함하는 제2 시약과 혼합하여 측정에 사용한다. 이 때, 제1 시약 중에는 이호성 항체(heterophile antibody) 등의 비특이 물질을 흡수하는 비특이 흡수제나 류미티즘 인자를 흡수하기 위한 물질을 첨가할 수 있다.

본 발명에 기초한 전압 펄스의 인가 전의 배양에 의한 반응 효율의 향상은 응집저지 반응에 응용할 수도 있다. 즉, 상기 공정 (1')∼(3')을 포함하는 본 발명의 방법에 있어서도 마찬가지로, 측정 대상 친화성 물질을 포함하는 반응액을 응집 시약 성분과 혼합하기 전 또는 후에 배양할 수 있다. 배양 조건은 상기 조건과 마찬가지다. 또한 응집 저지 반응계에서도 반응액에 수용성 고분자 화합물을 첨가할 수 있다.

상기한 바와 같이, 전압 펄스의 인가 전의 반응액의 배양은 담체입자의 응집 반응 촉진에 유효하다. 이 때, 배양의 온도는 높은 쪽이 더욱 효과가 큰 것은 이미 설명했다. 한편, 전압 펄스를 인가받은 반응액의 온도는 줄열 때문에 상승한다. 도체를 전류가 흐를 때, 도체에서 발생하는 열이 줄열이다. 본 발명자는 배양에서의 고온 조건이 응집 반응에 촉진적으로 작용하는 것에 대해, 전압 펄스 인가시의 온도 상승이 응집 반응에 대해 저해적으로 작용하는 것을 찾아냈다. 따라서, 전압 인가시에는 반응액의 온도를 낮게 유지하는 것이 유리하다.

본 발명은 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1) 또는 (1'), 및 이들 공정 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법이다.

(1) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,

(2) 공정 (1) 다음에 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로서 계수하는 공정, 및

(3) 공정 (2) 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는

(1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 또한 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

(2') 공정 (1') 다음에 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로서 계수하는 공정, 및,

(3') 공정 (2') 다음에 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.

본 발명의 측정 방법을 구성하는 각 공정을 이하에 구체적으로 설명한다.

혼합된 반응액은 다음에 전극을 매개한 조(槽)로 이동하고, 전압 펄스를 인가한다. 전압 펄스는 혈구 성분을 파괴하기 위한 조건과, 담체 입자의 펄 체인화를 위한 조건 중 어느 한 조건으로 할 수 있다. 통상 혈구 성분을 파괴하기 위한 조건으로 전압 펄스를 인가한 후에, 펄 체인화를 위한 조건으로 전압 펄스를 인가한다. 전기장을 걸면 담체 입자는 유전 분극을 일으켜 정전기적으로 서로 당기고 직쇄 모양으로 늘어선다. 이 현상은 펄 체인화라고 불리고 있다. 그 후 전기장을 정지하면 직쇄로 늘어서 있던 담체 입자는 순식간에 재분산한다. 한편 펄 체인화시에 생물적 특이적 반응 물질이 존재하면, 생물적 특이적 반응에 관여한 담체 입자는 전기장을 정지한 후에도 분산하지 않고 응집 덩어리를 형성한 상태 그대로 존재한다. 이러한 생물적 특이적 응집반응에 관여하는 응집 입자 및/또는 관여하지 않았던 분산된 담체 입자를 측정함으로써 생물적 특이적 반응 물질의 존재를 검출 또는 측정할 수 있다.

본 발명의 측정 방법에 있어서는, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽이 3차원 정보를 지표로 하여 계수된다. 본 발명에 있어서, 입자는 전기장을 정지한 후에 측정할 수 있다. 또는 전기장에 놓여진 입자를 전기장을 정지하지 않고 측정할 수도 있다. 예를 들어, 전기장에 놓여진 입자는,전기장 속에서 꺼냄으로써 계수할 수 있다. 나아가, 입자의 계수 전에 입자를 분산시키는 공정을 실시할 수 있다. 계수 전의 분산 공정에 의해 비특이적인 요인에 의해 응집한 입자를 분산시킬 수 있다. 그 결과, 측정 정밀도의 향상을 기대할 수 있다. 입자는 교반이나 반응액의 희석에 의해 분산시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 반응액의 희석에 있어서, 상기 공정 (3) 또는 (3') 전에 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화할 수 있다. 결합 강화에 의해 희석에 따른 응집 덩어리의 붕괴를 방지할 수 있다. 예를 들어, 반응액을 전압 펄스의 인가 조건하에서 희석하는 방법은, 본 발명에서의 바람직한 희석 방법이다. 더욱 구체적으로는 전압 펄스를 인가한 희석액에 반응액을 첨가함으로써 희석이 이루어진다. 희석액은 전극 사이에 배치되고, 전압 펄스가 인가된다. 환언하면, 대향하는 전극 사이에 희석액이 배치된다.

반응액은 전압 펄스가 인가된 조건하에서 희석할 수 있다. 이 때, 전극의 크기나 전극의 간격은 특별히 한정되지 않는다. 즉 펄 체인화 후의 반응액과 희석액의 초기 접촉이 대향 전극을 사이에 두는 전계 중에서 이루어진다.

희석 공정에 있어서는, 전압 펄스는 교류 전압이 바람직하다. 전압 펄스의 인가 조건은 반응액 및 희석액의 전기분해를 유발하지 않는 임의의 조건이라고 할 수 있다. 전압 펄스의 전압은, 예를 들어 0.1V부터 1.2V, 더욱 바람직하게는 0.3부터 0.9V이다. 전압 펄스의 주파수는, 예를 들어 100KHz부터 10MHz, 더욱 바람직하게는 400KHz부터 1MHz이다. 전압 펄스에는 임의의 파형을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 사각형파, 정현파, 삼각파 등을 나타낼 수 있다. 더욱 바람직한 전압 펄스는 사각형파이다. 본 발명에 있어서는, 적어도 반응액과 희석액이 접촉하는 순간을 포함하는 시간대에서, 전압 펄스가 인가되어 있는 것이 바람직하다. 인가시간은 극히 단시간이라도 희석에서의 결합 강화 작용을 기대할 수 있다. 더 구체적으로는, 0.5-30초, 통상 1-10초, 예를 들어 1-5초이다.

희석액에는 염을 포함하는 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로는 50mM부터 600mM의 염이 첨가된 생리 식염수, 글리신 완충액, 인산 완충액 등을 사용할 수 있다. 염으로는 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 나타낼 수 있다. 희석액에는 아지화나트륨 등의 방부제나 Triton X-100 등의 계면활성제, 글리세린, 수크로오스 등이 포함되어 있을 수도 있다.

전압 펄스를 인가한 상태에서 희석함으로써 응집 덩어리를 구성하는 친화성 물질(또는 응집 시약)과 결합 파트너의 결합 반응은 강화된다. 전압 펄스에 의해 야기된 전계에 의한 쌍극자 모멘트 효과가 양자의 결합을 강화하기 때문이라고 생각되었다. 어쨌든 전압 펄스 인가 조건하에서의 희석에 의해 응집 덩어리의 붕괴는 억제되고, 응집 덩어리를 유지한 채로 반응액의 희석을 실현할 수 있음이 확인되었다.

또는, 친화성 물질과 결합 파트너, 또는 응집 시약과 결합 파트너와의 결합을 강화할 수 있는 희석 수단으로서 양자의 결합을 강화할 수 있는 결합 강화제를 이용할 수 있다. 결합 강화제란 반응액에의 첨가함으로써 양자의 결합을 강화할 수 있는 성분을 말한다. 예를 들어, 단백질간의 결합은 글루탈 알데히드 또는 카본디이미드 등의 화합물의 첨가에 의해 강화된다. 따라서, 단백질 항원과 항체의 면역학적인 결합은 글루탈 알데히드 또는 카본디이미드 등에 의해 강화할 수 있다. 이러한 화합물은 결합 강화제로서 바람직하다.

결합 강화제는 친화성 물질과 결합 파트너의 관능기에 작용하여 양자를 화학적으로 결합한다. 또는 응집 저지 반응계에서는 응집 시약과 결합 파트너 사이의 결합을 강화한다. 그 결과, 양자의 결합에 의해 형성된 응집 덩어리가 물리적으로 고도의 안정성을 획득한다. 예를 들어, 친화성 물질 또는 응집 시약, 및 결합 파트너가 단백질이면, 분자 내에는 아미노기나 카르복실기가 있다. 이들 관능기는 글루탈알데히드나 카르보디이미드 등의 화학 물질에 가교된다.

반응액 중에서의 결합 강화제의 농도는 결합 강화제의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 글루탈알데히드의 경우, 반응액에서의 최종농도는 통상 0.1∼25%, 바람직하게는 0.2∼18%이다. 결합 강화제는 친화성 물질과 결합 파트너와의 결합체를 포함하는 반응액의 희석 전에 반응액에 첨가하면 된다. 결합 강화제의 첨가 후의 반응액은, 바람직하게는 37℃에서 수초∼20초 정도, 바람직하게는 2∼10초, 또는 2∼5초의 배양 후에 희석할 수 있다. 결합 강화제로 글루탈알데히드 또는 카르보디이미드를 사용한 경우에는, 반응액에 첨가한 후 바로 희석할 수도 있다.

결합 강화제의 첨가는 본 발명에서의 희석 공정으로서 유효하다. 본 발명에 있어서는,나아가 앞서 설명한 전압 펄스 인가 조건하에서의 희석 공정에 결합 강화제를 조합할 수도 있다. 즉, 반응액에 결합 강화제를 첨가한 후에 앞서 말한 조건에 따라 전압 펄스 인가 조건하에서 반응액을 희석할 수 있다. 또는, 결합 강화제가 첨가된 희석액을 이용하여 앞서 말한 조건에 따라 전압 펄스 인가 조건하에서 반응액을 희석할 수도 있다. 양자를 조합함으로써 결합 강화 작용을 강하게 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 반응액의 희석이란, 반응액과 희석액의 혼합에 의해 반응액 중에서의 담체 입자의 농도를 저하시키는 것을 말한다. 반응액에서의 담체 입자의 농도는 시료의 분량과 시약으로서 공급되는 담체 입자의 분량에 의해 결정된다. 나아가 본 발명에 있어서는, 반응액에서의 담체 입자의 농도는 통상 펄 체인화에 의해 담체 입자의 응집을 촉진할 수 있는 범위로 설정된다. 구체적으로는, 반응액에서의 담체 입자의 농도는 통상 0.01∼5중량%, 더욱 바람직하게는 0.1∼2중량%이다. 이에 대해, 예를 들어 100배 이상, 통상 1000배 이상, 구체적으로는 1000∼100000배, 바람직하게는 2000∼40000배로 희석할 수 있다. 희석 후의 담체 입자의 농도는 0.1×10^―5∼0.005중량%, 바람직하게는 0.00001∼0.001중량%이다.

본 발명에 있어서는, 입자는 3차원 정보를 지표로 하여 계수된다. 본 발명에 있어서, 3차원 정보를 지표로 하는 계수란, 입자 및/또는 응집 덩어리의 3차원 정보를 측정하고, 그 결과에 기초하여 입자 및/또는 응집 덩어리를 계수하는 것을 말한다. 현미경 화상을 해석하는 공지의 방법은 2차원 정보에 기초하여 응집의 레벨을 결정하고 있다. 따라서, 3차원 정보를 지표로 하는 본 발명과 공지의 방법이라는 것은 명확하게 구별된다.

3차원 정보를 측정하기 위한 방법은 한정되지 않는다. 또한 본 발명에서의 계수란, 입자 및/또는 응집 덩어리의 수를 구하는 것을 말한다. 입자 및/또는 응집덩어리의 수는 단지 수만을 측정할 수도 있다. 또는 응집한 입자를 응집하지 않은 입자와 구별하여 측정할 수도 있다. 나아가, 응집한 입자에 대해서는 응집한 입자의 수마다 그 응집 덩어리의 수를 측정할 수도 있다. 3차원 정보를 지표로 하여 입자를 계수하기 위한 몇몇 방법이 공지되어 있다.

본 발명에 이용할 수 있는 입자의 계수 방법은 물리적인 원리에 기초하는 측정 방법이 유리하다. 본 발명에 있어서 물리적인 측정 방법이란, 입자 또는 응집 덩어리에 고유의 물리적인 정보를 평가할 수 있는 측정 방법을 말한다. 입자 또는 응집 덩어리에 고유의 물리적인 정보는 진짜 측정 결과라고 환언할 수도 있다. 이에 대해, 화상 정보로부터 취득되는 2차원 정보를 해석하는 방법은 실제로는 응집하지 않은 입자의 중복을 응집 덩어리로서 검출해 버린다. 이와 같은 검출 결과는 입자에 고유의 물리적인 정보라고는 할 수 없다.

입자 또는 응집덩어리를 물리적으로 측정하려면, 플라우 시스템(flow system)의 이용이 유리하다. 플라우 시스템은 미세한 플라우 셀 안을 통과하는 입자의 물리적인 정보를 해석할 수 있는 시스템이다. 플라우 시스템을 이용함으로써 쉽게 물리적인 측정을 실시할 수 있다. 즉 본 발명에서의 물리적인 측정이란, 플라우 시스템에 의해 입자 및 응집 덩어리 중 어느 하나 또는 양쪽의 3차원 정보를 측정하여 계수하는 공정을 포함한다. 3차원 정보를 지표로 하여 입자를 물리적으로 계수하기 위한 방법으로, 예를 들어, 쿨터 원리 또는 레이저 회절 산란법을 나타낼 수 있다.

쿨터 원리(USPA2656508, 1953년)란, 애퍼처(세공)의 양측에 전극을 두고, 애퍼처 안을 통과하는 입자에 의한 전기저항의 변화에 기초하여 입자의 부피를 검출하는 해석 방법이다. 전해액을 통하여 양전극간에 미소 전류를 흘려 보냈을 때, 전해액 중에 현탁한 입자가 흡인되어 애퍼처를 통과하면, 입자 부피에 상당하는 전해액이 입자에 의해 치환된다. 그 결과, 양전극간의 전기저항에 변화를 일으키므로, 이 변화를 측정함으로써 입자의 계수와 사이즈(부피)를 측정할 수 있다. 부피를 검출하는 방법으로 정전 용량법이 있는데, 실용화되어 있는 것은 전기 저항법이 대부분이다.

애퍼처 사이즈는 분석 대상이 되는 입자에 맞추어 모두 적절히 조절할 수 있다. 일반적인 면역학적인 입자 응집 반응에 사용되는 담체 입자의 응집을 검출하는 경우, 애퍼처 사이즈로는 통상 30∼1000μm, 바람직하게는 50∼200μm을 나타낼 수 있다.

애퍼처 사이즈는 담체 입자의 평균입경에 대해 수배∼수100배, 예를 들어 수배∼100배, 바람직하게는 5배 ∼50배로 하는 것이 유리하다. 이 경우, 부피에 비례한 시그널을 검출할 수 있고, 정밀도 좋은 고감도 측정을 실현할 수 있다. 입자경에 대해 애퍼처 사이즈의 배율은 작은 쪽이 감도는 좋아지는데, 너무 작으면 입자가 막히기 쉬워지고, 너무 크면 입자의 검출 감도가 저하하므로 바람직하지 않다.

보다 구체적으로는, 예를 들어 입자경이 1∼5μm, 특히 2∼3μm의 담체 입자를 계수하는 경우, 애퍼처 사이즈는 30∼100μm, 바람직하게는 50∼80μm, 예를 들어 65∼75μm의 범위에서 선택할 수 있다. 2∼3μm의 담체 입자는 본 발명에 의한 친화성 물질의 측정 방법에 있어서, 특히 바람직한 입자 사이즈라고 할 수 있다. 즉, 본 발명은 다음 공정 (1)∼(3), 또는 (1')∼(3')을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1) 또는 (1'), 및 이들 공정 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법을 제공한다.

(1) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 평균입경 2∼3μm을 가진 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,

(2) 공정 (1) 다음에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을, 50∼80μm의 애퍼처 사이즈를 가진 쿨터 원리에 의해, 그 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및

(3) 공정 (2) 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는

(1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 평균 입경 2∼3μm을 가진 담체 입자와 측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 또한 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

(2') 공정 (1') 다음에 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리,및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 50∼80μm의 애퍼처 사이즈를 가진 쿨터 원리에 의해, 그 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및,

(3') 공정 (2') 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.

일반적으로 애퍼처 사이즈가 작은 쪽이 비응집 입자를 더욱 정확하게 계수할 수 있다. 반대로 애퍼처 사이즈를 크게 함으로써 응집 입자가 애퍼처에 막히기 어려워진다. 애퍼처의 막힘은 해석 효율 저하의 원인이 된다. 막히는 빈도를 낮추는 것이 해석 효율의 향상으로 이어진다. 예를 들어, 응집 입자가 다량으로 생성하는 것이 예측되는 경우에는, 애퍼처 사이즈를 조금 크게 설정함으로써 애퍼처의 막힘를 방지할 수 있다. 또는, 입자경이 작은 담체 입자를 사용함으로써 동일한 효과를 기대할 수 있다. 나아가, 시료의 희석에 의해 응집 입자의 비율을 저하시키고, 애퍼처의 막힘를 방지할 수도 있다. 통상은 기대되는 검출 감도, 예상되는 검출 대상 물질의 농도, 그리고 기기 구성(특히 애퍼처 사이즈)에 따라 각각 적절한 조건을 선택하면 된다.

이렇게 하여 응집 입자를 계수함으로써 응집 입자의 비율을 알 수 있다. 응집 입자의 비율이란, 계수한 전입자에 차지하는 응집한 입자의 비율을 말한다. 또한 응집 입자의 비율을 응집 비율(agglutination ratio)이라고 한다. 나아가, 미리 농도를 알고 있는 표준 시료에 대해 응집 비율을 구하고, 양자의 관계를 그래프에 플롯함으로써 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이에 대해, 검체의 응집율을 조회하면, 검체에 포함되는 측정 대상 친화성 물질의 농도를 명확히 할 수 있다.

또는 상기 표준 곡선을 회귀식으로 나타낼 수도 있다. 회귀식이 얻어지면, 응집 비율을 회귀식에 대입함으로써 측정 대상 친화성 물질의 농도를 산출할 수도 있다.

한편 레이저 회절 산란법이란, 입자에 레이저를 조사했을 때 생기는 흔들림을 검출함으로써 입자의 계수와 평균 지름을 측정하는 것이다. 어떠한 경우도 측정 정밀도를 높이기 위해서 입자의 오측정을 억제하는 목적으로서 반응 입자를 희석, 초음파의 인가 또는/및 쉬쓰플라우(sheath flow) 방식 등을 사용하는 것이 바람직하다.

그 밖에도 이하와 같은 방법을 입자 부피의 측정 방법으로서 나타낼 수 있다.

원심 침강법: 액체 속에서의 입자의 침강 속도와 입경의 관계를 나타내는 스톡스의 식에 의해 입경 분포를 측정하는 방법(광투과식 원심 침강법에서는 스톡스의 법칙을 적용하고, 동일한 비중의 입자라면 큰 입자 쪽이 작은 것보다도 빨리 침강하는 것을 이용한다. 그 때 입자 농도를 광투과에 의한 탁도 변화로서 해석하고, 입도 분포를 구할 수 있다).

캐필러리 방식: 캐필러리 속을 흐르는 점성 유체의 레이놀즈수가 작은 경우, 거기에는 Hagen-Poiseuille의 유체가 발생한다. 이 흐름은 캐필러리 중앙만큼 빠르고, 관벽만큼 늦기 때문에, 큰 입자는 평균적으로 빠른 유속 안을, 작은 입자는 평균적으로 늦은 유속 안을 흘러가게 된다. 즉 입자는 일정 길이의 캐필러리 안을 흐를 때,이 이동 속도의 차이에 의해 사이즈별로 분리되어 검출된다.

3차원적 화상 해석: 서로 다른 방향에서 촬영한 복수의 화상 정보를 해석하고, 입자의 3차원 정보를 구할 수 있다. 또는 xy 평면의 화상 정보를 z축 방향으로 스캔함으로써 입자의 3차원 정보를 구할 수 있다.

본 발명의 측정 방법은 3차원 정보를 지표로 하여 응집한 (또는 하지 않은) 담체 입자가 계수된다. 계수 결과에 의해 측정 대상인 친화성 물질이 정성적으로, 또는 정량적으로 측정된다. 정성적인 측정에 있어서는, 응집 입자의 존재는 측정 대상인 친화성 물질의 존재를 의미한다. 또는 응집 저지 반응의 경우에는, 응집의 저지가 검출되었을 때, 측정 대상의 존재가 증명된다.

또한 정량적인 측정에 있어서는, 응집의 레벨을 측정 대상인 친화성 물질의 양과 연관시킬 수 있다. 더 구체적으로는, 미리 친화성 물질의 양이 명확한 시료에 대해 본 발명의 측정 방법을 수행하고, 3차원 정보에 기초하는 응집 입자의 검출 결과와 친화성 물질의 양의 관계를 명확히 해 둔다. 이어, 시료에 대해 동일한 측정을 하고, 퇴적(堆積)에 기초하는 응집 입자의 검출 결과로부터 친화성 물질의 양을 명확히 할 수 있다. 응집 저지 반응의 경우라도, 똑같이 하여 정량적인 측정은 가능하다.

입자 및/또는 응집 덩어리의 계수 방법으로는 일정한 입자수를 카운트하는 수단에 있어서는, 2개 이상으로 응집한 입자수/총입자수나 단입자/총입자수 등 목적에 맞춰서 연산식을 선택할 수 있다. 총입자수란, 어느 계측 시간 내에 계측된 모든 입자의 수일 수도 있고, 반응액의 전량을 해석 대상으로 하는 경우에는, 글자 그대로, 반응액에 포함되는 입자의 총수로 할 수도 있다. 반응액에 포함되는 입자의 총수는 반응액의 전량이 명확한 경우에는, 일부를 계수함으로써 근사적으로 산출할 수도 있다.

나아가, 본 발명에 있어서는, 샘플인 혈구 성분을 포함하는 매체에 차지하는 혈구 성분의 부피를 구할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 담체 입자와 함께 배양된 반응액에 포함되는 혈구 성분은 파괴된다. 따라서, 측정 대상으로서 반응액에 혼합된 매체에 대해, 별도로 그 혈구 성분의 부피를 구하면 된다. 혈구 성분은 3차원 정보를 지표로 하여 계수함으로써 그 부피도 알 수 있다. 혈구 성분의 부피를 알면, 샘플로 한 매체에 차지하는 혈구 성분의 비율을 결정할 수도 있다. 이렇게 해서 결정된 전혈 성분에 차지하는 혈구 성분의 비율은 헤마토크릿값와 거의 같은 의미를 가진다.

따라서, 예를 들어 전혈을 샘플로서 이용했을 때, 전혈의 부피에서 혈구 성분의 부피를 제외한 부피는 혈청(또는 혈장)의 부피에 상당한다. 양자의 부피비에 기초하여 본 발명에 의해 측정된 전혈 중에 포함되는 측정 대상 물질의 농도를 혈청 농도로 보정할 수 있다.

예를 들어, 쿨터 원리(USPA2656508, 1953년)를 이용한 검출법은 입자의 계수와 사이즈(부피)를 측정할 수 있는 점에서 미응집과 응집 덩어리의 입도 분포, 및 혈구 성분의 용적과 갯수를 동시에 계측할 수 있다. 즉, 반응 용액 중의 혈구 성분의 용적과 갯수를 측정할 수 있기 때문에, 혈구 성분의 총량을 산출할 수 있다. 따라서 측정에 사용한 전혈의 시료 중의 혈구 성분의 용량의 비율을 구할 수 있다. 혈장(또는 혈청) 시료는 전혈에서 혈구 성분을 제외한 것인 점에서, 혈구 성분의 비율에 의해 보정함으로써 혈장(또는 혈청)의 측정값으로 환산할 수 있다.

AR(혈장)=AR(전혈)×100/(100-혈구 성분의 비율%)

또는, 전기 저항법이나 레이저 회절 산란법 등에 의해 일정 시간당 검출된 입자 및/또는 응집 덩어리의 수에 기초하여 친화성 물질을 검출 또는 측정할 수 있다. 즉, 응집 반응에 의해 단입자는 응집하여 응집 덩어리를 형성하는 점에서 시간당 계수되는 입자수가 적어진다. 또는, 소정수의 입자 및/또는 응집 덩어리를 계수하는데 요하는 시간을 지표로 할 수도 있다. 이와 같은 계수 방법을 본 발명에 적용하는 경우에는, 각각 입자 및/또는 응집 덩어리의 수와 친화성 물질의 양 사이의 관계를 회귀식으로 나타낼 수 있다.

항체가 감작된 입자는 항원의 농도에 따라 2개 이상의 입자로 이루어지는 응집 덩어리의 비율이 많아진다. 그리고, 2개 이상으로 응집한 입자수/총입자수로 표시되는 응집비율은 1.00(100%)에 수렴한다.

쿨터 원리든 레이저 회절 산란법이든, 입자의 3차원 정보를 계측하는 방법은 2차원적인 화상 데이터를 해석하는 방법과 비교하여 간단한 기기 구성에 의해 고정밀도의 해석을 기대할 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 2차원적인 화상 데이터의 해석에 있어서는, 반응액의 용적이 제한된다. 이에 대해, 3차원 정보를 계측하는 방법은 플라우식 해석 방법을 응용할 수 있기 때문에, 반응액의 용적은 제한되지 않는다. 또한 반응 공간의 물리적인 형상도 제한되지 않는다. 이런 이유에 의해, 기기 구성은 심플해진다. 게다가, 반응액의 양을 자유롭게 설정할 수 있는 것이 재현성이나 검출 감도의 향상에 공헌한다.

또는 본 발명은 다음 공정 (1')∼(3')을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1'), 및 공정 (1') 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법을 제공한다.

(1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와,측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 또한 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

(2') 공정 (1') 다음에 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리,및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자 중 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및,

(3') 공정 (2') 다음에 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨중 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.

응집 시약을 이용한 응집 저지 반응에 기초하는 면역학적 입자 응집 반응법의 원리는 이미 설명했다. 상기 공정에 의해 면역학적 입자 응집 반응에 본 발명을 응용할 수 있다. 상기 공정을 구성하는 전압 펄스의 인가나 응집 덩어리의 형성 레벨, 또는 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨의 해석은 앞서 구체적으로 설명한 바와 같은 방법에 의해 실시할 수 있다.

또한 응집 저지 반응 원리에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우에는, 2개 이상의 입자가 응집한 응집 덩어리가 더 많이 생성되는 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 또는, 단입자/총입자수를 지표로 하여 응집 레벨을 평가하는 방법이 바람직하다. 응집 저지 반응 원리에 기초하는 경우에는, 이와 같은 연산식을 이용한 편이 2개 이상으로 응집한 입자수/총입자수의 연산식에 기초하는 해석보다도 높은 감도를 기대할 수 있다.

본 발명의 방법은, 반응액을 유지하여 전압 펄스를 인가하는 기구와 담체 입자를 계수 하는 기구를 구비한 장치에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 장치로서, 다음 수단을 포함하는 친화성 물질의 측정 장치를 사용할 수 있다.

(a) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와,측정 대상 친화성 물질을 유지하는 공간,

(b) 상기 공간에 유지된 담체 입자에 전압 펄스를 인가 하기 위한 전극, 및

(c) 상기 공간에 유지된 담체 입자의 응집에 의해 생긴 응집 덩어리, 및 응집하지 않았던 상기 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 수단.

본 발명에 있어서, (a) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 유지하는 공간에는 반응액을 유지하기 위한 임의의 공간을 이용할 수 있다. 미량의 시료를 반응시키기 위해서는, 소량의 공간인 것이 유리하다. 예를 들어 1μL∼10mL, 바람직하게는 10∼500μL 정도의 공간을 이용할 수 있다. 이 공간은 필요에 따라 시료나 시약의 공급 수단, 또는 후술하는 담체 입자의 계측 수단을 구비할 수도 있다.

이어, 본 발명에서의 (b) 상기 공간에 유지된 담체 입자에 전압 펄스를 인가하기 위한 전극에 대해 설명한다. 담체 입자를 전기장에 정렬하기 위한 전극은, 예를 들어 앞서 기재한 선행 기술 문헌에서도 이용되고 있다. 이들 공지의 전극을 본 발명에 이용할 수 있다. 본 발명의 장치에는 전극에 전압을 공급하기 위한 전원을 구비할 수 있다.

본 발명을 실시하기 위한 장치에서의 전압 펄스를 인가하기 위한 전극은, 적어도 1쌍(2개)의 전극으로 구성된다. 복수의 서로 다른 방향의 전압 펄스를 주기 위해 3이상의 전극을 구비할 수도 있다. 예를 들어, 3개의 전극 A, B, C를 배치하고, A-B간, B-C간, 및 A-C간의 3개의 방향의 전압 펄스를 인가할 수 있다. 이 밖에, 2쌍(4개)의 전극을 배치하고, 직교하는 전압 펄스를 인가할 수도 있다.

나아가, 서로 다른 방향의 전압 펄스를 인가하기 위해, 전극을 구동하는 기구를 구비할 수 있다. 예를 들어, 반응액 중에서 전극을 회전시킴으로써 복수의 서로 다른 방향에서 전압 펄스를 인가할 수 있다. 서로 다른 방향에서 전압 펄스를 인가할 때, 인가 방향은 임의의 각도로 할 수 있다.

나아가, 본 발명을 실시하기 위한 장치는, (c) 상기 공간에 유지된 담체 입자의 응집에 의해 생긴 응집 덩어리, 및 응집하지 않았던 상기 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 수단을 포함한다. 해당 계수 수단은 상기 공간에 구비할 수 있다. 또는 상기 공간에 유지된 반응액을 상기 공간에서 꺼내어 계수 수단에 도입한 후에 계수할 수도 있다.

3차원 정보를 지표로 하여 응집한, 또는 응집하지 않은 담체 입자를 계수하는 수단으로는, 쿨터 원리, 또는 레이저 회절 산란법을 이용한 계측 수단을 이용할 수 있다. 쿨터 원리를 위해서는, 예를 들어, 상기 공간내의 반응액을 쿨터 원리를 위한 전극을 구비한 애퍼처에 도입하여 필요한 해석이 이루어진다. 애퍼처의 사이즈는 상술한 바와 같은 기준에 기초하여 적절히 조절할 수 있다.

시약에 이용하는 입자경, 또는 예측되는 응집 입자의 비율에 따라, 서로 다른 사이즈를 가진 복수의 애퍼처를 변환하여 이용하는 기구를 채용할 수도 있다. 나아가, 담체 입자와는 별도로, 혈구 성분을 계수하기 위한 애퍼처를 구비할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치는 복수의 애퍼처에 반응액을 이끌기 위한 유로 변환 기구를 구비할 수 있다. 나아가, 시약의 종류나 예측되는 응집 입자의 비율 등에 기초하여 유로를 자동적으로 선택하는 기구를 조합할 수도 있다. 또는, 본 발명을 실시하기 위한 장치는 애퍼처 사이즈의 변환에 의해 자동적으로 검출 감도를 조절하는 기구를 구비할 수 있다. 검출 감도의 조절 기구로서, 예를 들어, 우선 큰 애퍼처 사이즈로 해석하고, 응집 입자의 비율이 작다고 예측된 경우에, 더 작은 애퍼처로 변환하는 기구를 나타낼 수 있다. 레이저 회절 산란법을 이용하는 경우도 마찬가지로, 해석을 위한 광학 셀에 반응액을 도입하여 해석하면 된다.

본 발명에 있어서, 전기장에 있어서 펄 체인화된 담체 입자는 필요에 따라 재분산시킨 후에 3차원 정보를 취득할 수 있다. 본 발명을 실시하기 위한 장치에는 담체 입자의 재분산을 위한 기구를 구비할 수 있다. 담체 입자는 희석이나 초음파 처리에 의해 재분산할 수 있다.

본 발명을 실시하기 위한 장치를 구성하는 상기 (a)-(c)의 요소는 하나의 연속하는 유로 내에 배치할 수 있다. 또는, 각 요소를 불연속적인 공간으로 구성하고, 각 요소의 사이를 반응액을 이동시킴으로써 본 발명의 측정 방법을 실시할 수도 있다.

본 발명을 실시하기 위한 장치에는, 상기 측정 방법을 실시하기 위한 부가적인 기구를 조합할 수 있다. 본 발명의 장치에 조합할 수 있는 부가적인 기구를 이하에 예시한다.

시료의 분취 기구

시료의 희석 기구

측정 결과의 기록 기구

측정 결과의 표시 기구

측정 결과의 인쇄 기구

또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로 하여 명세서에 통합된다.

도 1A는 본 발명에 기초하는 장치의 구성을 나타내는 도면이다. 또한, 도 1B 는 펄스 인가조의 단면을 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 전혈 성분을 붕괴하고, 혈구 성분의 입도 분포 측정을 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 계수된 입자의 수를, 가로축은 입자의 부피(㎛³)를 나타낸다.

도 3은 초음파 또는 계면 활성제(Tween20 또는 TritonX-100)에 의해 혈구 성분을 파괴하고, 혈구 성분의 입도 분포 측정을 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 계수된 입자의 수를, 가로축은 입자의 부피(㎛³)를 나타낸다.

[부호의 설명]

1: 분주+교반 수단

2: 온도 제어 기구

3: 반응조

4: 전극(펄스 인가 수단)

5: 희석 수단

6: 입도 분포 측정 수단

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

〔실시예 1〕전혈의 붕괴성 시험 1

(1) 측정 장치

도 1A의 장치를 사용하여 전혈에 포함되는 혈구 성분의 붕괴성을 검증했다. 전혈 검체와 시약(1)을 분주하여 혼합하고, 이어 반응조(3)(펄스 인가조)에 혼합액을 이동시키고, 전극(4)을 매개하여 펄스 전압을 수초에서 몇 분간 인가하고, 혈구 성분을 붕괴시켰다. 이 때, 시약(2)(라텍스 시약)은 사용하지 않았다. 그 후, 혼합액을 희석조(5)에서 희석하고, 입도 분포계(6)로 혈구 성분의 입도 분포를 측정했다. 온도 제어 기구(1 및 2)는 OFF 설정으로 했다.

도 1B는 펄스 인가조의 단면을 나타내는 도면이고, 전극간의 거리는 0.8mm, 전극의 두께는 0.03mm, 전극의 길이는 20mm이다.

(2) 측정 방법

건강한 사람의 전혈 시료를 검체로 측정했다. 검체 2.0μL와 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM 염화 나트륨, 0.09% 아지화나트륨 함유, 이하 GBS로 약칭한다) 18μL을 혼합하고, 바로 전극이 부착된 반응 셀에 주입하고, 전술한 장치를 이용하여 주파수 400KHz의 교류 전압(직사각형파) 0∼60V/mm의 전해 강도로 30 초간 인가한 후, 바로 전기장을 멈추고 반응액을 생리 식염수로 희석하고, 입도 분포계(6)에 의해 전혈 검체의 입도 분포를 측정했다. 또한, 입도 분포계(6)는 폴리스틸렌 라텍스 비즈에 의해 교정 후에 사용했다.

(3) 결과

결과를 도 2에 나타냈다. 또한 측정 결과로부터 측정 입자의 평균 용적을 구하고, 표 1에 나타냈다. 0V∼33V의 조건에서는 혈구 성분이 계수되었다. 39V∼42V의 조건에서는 혈구의 수는 대폭 감소하고, 그 크기도 작아져 있음을 알 수 있다. 나아가, 45V 이상의 조건에서는 혈구 성분이 대부분 계수되지 않았다. 따라서, 400KHz의 주파수에 30 초 정도의 펄스 전압의 인가 조건에 있어서는, 전원 전압은 35V 이상, 바람직하게는 40V 이상, 더 바람직하게는 45V 이상인 것이 명백하다.

인가전압 평균용적 3㎛< Vp-p/0.8mm Vp-p/mm ㎛3 개/초
0	0	46.3	133.9
33	41.25	39.4	109.6
39	48.75	29.6	92.3
42	52.5	15.0	73.3
45	56.25	9.4	30.2
48	60	6.5	4.2
초음파		5.1	2.7
Tween20		5.5	53.3

〔실시예 2〕전혈의 붕괴성 시험 2

실시예 1과 동일한 전혈 시료와 장치를 이용하여 다음 조건에서 혈구 성분을 파괴했다.

펄스 전압: 주파수 400KHz의 교류 전압(직사각형파)

전계 강도: 48V/0.8mm

인가 시간: 0∼60초간

결과를 표 2에 나타냈다. 계수된 입자의 평균 용적은 10초 정도의 펄스 전압 인가에서 현저히 작아진다. 나아가 혈구 성분에 해당하는 3μm보다 큰 입자수가 10∼30초의 인가에 의해 대부분 계수되지 않게 되는 것도 확인되었다. 따라서, 주파수 400KHz의 교류 전압(직사각형파) 48V/0.8mm의 전해 강도에서는 인가 시간은 10초 정도로 충분하다는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명에 의해 신속 간편하게 혈구 성분을 파괴할 수 있다.

인가시간 (초)	평균용적 ㎛3	3㎛< 개/초
0	46.3	133.9
10	8.2	26.8
30	6.5	4.2

[비교예 1]

실시예 1의 전혈 시료 0.5μL과 25μL의 GBS를 마이크로 튜브에 분취하여 혼합했다. 혼합액을 초음파 세정기(SND사 제조)에 의해 5분간 초음파(고주파 전력 120W, 발신 주파수 38KHz) 처리하여 혈구 성분을 붕괴시켰다. 실시예 1의 입도 분포계(6)를 이용하여 혈구 성분의 입도 분포를 측정했다. 결과는 도 3에 나타냈다.

〔비교예 2〕

실시예 1의 전혈 시료 0.5μL과 0.5%의 계면활성제(Tween20, 또는 TritonX-100)를 포함하는 25μL의 GBS를 마이크로 튜브에 분취하여 혼합하고, 25℃에서 5분간 배양함으로써 혈구 성분을 붕괴시켰다. 실시예 1의 입도 분포계(6)를 이용하여 혈구 성분의 입도 분포를 측정했다. 결과는 도 3에 나타냈다.

본 발명에 의하면, 전혈 성분을 붕괴하기 위해 종래부터 사용되고 있는 초음파나 계면활성제 등의 약제에 의한 방법과 마찬가지로, 비교적 단시간에, 또한 쉽게 혈구 성분이 붕괴되는 것을 알 수 있다.

〔실시예 3〕

(1) 항CRP 항체 감작 라텍스 시약의 조제

0.15mg/mL 항CRP 항체(시바야기사 제조)를 포함하는 글리신 완충액(50mM 글리신, 50mM염화 나트륨, 0.09% 아지화나트륨 함유, 이하 GBS라고 약칭한다)을 항체 용액으로서 라텍스 시약을 조제했다. 라텍스 입자는 1.0μm의 라텍스(積水 화학사 제조, 고형분 10% 현탁액) 0.1mL에 GBS 0.9mL을 가하여 라텍스 현탁액으로 만들었다.

1mL의 항체 용액과 라텍스 현탁액을 혼합하고, 37℃에서 2시간 교반한 후, 감작한 라텍스를 원심분리하여 상청액을 제거했다. 침전을 0.5% 소혈청 알부민의 글리신 완충액(0.5% BSA-GBS) 2mL에 현탁시키고, 항CRP 항체 감작 라텍스 시약을 조제했다.

(2) 측정 장치

도 1A의 장치를 사용하여 생물학적 특이적 응집 반응(항원 항체 반응)을 측정했다. 장치는 검체와 시약(1)을 분주하여 혼합하고, 나아가 시약(2)(라텍스 시약)을 분주하여 혼합하기 위한 분주·교반조 온도 제어 기구(1)를 구비하고 있다. 시약(1)은 2시약계의 경우에 사용되는 완충액이다. 1시약계(라텍스 시약만)의 경우에는 완충액은 사용되지 않는다. 혼합된 반응액은, 다음에 반응조(펄스 인가조)(3)로 이동시키고, 전극(4)을 매개하여 펄스 전압을 수초에서 수십초 동안 인가하여 라텍스 입자를 펄 체인화 시킨다. 반응액은 펄 체인화된 후, 희석조(5)에서 희석되고, 입도 분포계(6)를 이용하여 담체의 응집 상태가 측정된다. 온도 제어 기구(1 및 2)는 OFF 설정으로 했다.

도 1B는 펄스 인가조의 단면을 나타내는 도면이고, 전극간의 거리는 0.8mm, 전극의 두께는 0.03mm, 전극의 길이는 20mm이다.

(3) 측정 방법

건강한 사람의 전혈 시료를 검체로 하여 측정했다. 검체 2.0μL과 18μL의 GBS를 혼합하고, 2.0μL과 상술한 항CRP 항체 감작 라텍스 시약 2.0μL을 마이크로 튜브에 넣고 혼합 했다. 혼합한 후의 반응액을 바로 전극부착 반응 셀에 주입하고, 전술한 장치를 이용하여, 주파수 400KHz의 교류 전압(직사각형파) 48Vp-p(±24V)의 전해 강도로 30 초간 인가하여 펄 체인을 형성시켰다. 이 30초 동안의 인가후, 바로 전기장을 중지하고 반응액을 생리 식염수에 희석하고, 입도 분포계(6)(멀티사이더―III, 베크만 쿨터사)를 사용하여 라텍스 입자의 입도 분포를 측정하고, 라텍스의 응집도(AR)를 이하의 식에 의해 구했다.

AR=(2개 이상으로 응집한 입자수)/(총입자수)×100(%)

(4) 결과

결과를 표 3에 나타냈다.

	전기적 파괴	동결용혈 파괴
총입자수	4289	4285
2이상으로 응집한 입자수	884	893
AR	20.6%	20.8%

[비교예 3]

본 발명에 기초하여 얻어진 측정 결과를 혈구 성분을 동결에 의해 용혈시킨 경우의 측정 결과와 비교했다. 실시예 2의 전혈 검체의 혈구 성분을 동결용혈에 의해 붕괴시켜 용혈 검체로 만들었다. 실시예 2의 항CRP 감작 라텍스 시약을 사용하여 동일한 조작에 의해 CRP를 측정했다. 결과를 표 3에 나타냈다.

표 3에서 알 수 있듯이, 본 발명의 방법(혈구 성분을 전기적으로 파괴)과, 비교예(혈구 성분을 동결용혈에 의해 파괴한 검체를 사용한 방법)에서, 응집비율이 거의 일치했다. 동결에 의한 용혈은 혈구 성분을 거의 완전히 파괴할 수 있는 방법이다. 따라서, 본 발명에 의해 전혈 시료를 대상으로 간편하게 측정할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 측정 방법 또는 측정 장치는 혈구 성분을 포함하는 매체 내의 친화성을 가진 모든 물질의 측정에 유용하다. 구체적으로는, 예를 들어 전혈 시료의 해석에 의해 다양한 질환의 진단에 유용한 정보를 얻을 수 있다. 더 구체적으로는, 호르몬, 종양 마커, 효소, 약제, 감염성 병원체, 또는 그들에 대한 항체는 의료 기관에서, 일상적으로 측정되고 있다. 이들 측정 대상 성분은 모두 본 발명에서의 친화성 물질에 포함된다.

Claims (13)

1. 다음 공정을 포함하는 친화성 물질의 측정 방법으로서, 측정 대상 친화성 물질이 혈구 성분을 포함하는 매체에 포함되어 있고, 공정 (1) 또는 (1') 및 이러한 공정 전의 어느 하나, 또는 양쪽에서 혈구 성분을 전기적으로 파괴하는 공정을 포함하는 측정 방법;

   (1) 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정,

   (2) 공정 (1) 다음에, 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응집 덩어리, 및 측정 대상인 친화성 물질과 결합하지 않고 응집 덩어리를 형성하지 않은 담체 입자 중 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정,및

   (3) 공정 (2) 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨 중 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정, 또는

   (1') 측정 대상 친화성 물질과의 결합 활성을 가진 결합 파트너를 결합한 담체 입자와, 측정 대상 친화성 물질을 응집 시약 성분과 혼합한 반응액에 전압 펄스를 인가하는 공정으로, 상기 담체 입자는 응집 시약에 의해 응집하고, 또한 측정 대상 친화성 물질에 의해 그 응집이 저해되는 공정,

   (2') 공정 (1') 다음에, 응집 시약과의 결합에 의해 형성된 담체 입자의 응 집 덩어리,및 측정 대상인 친화성 물질과의 결합에 의해 응집이 저해된 담체 입자의 어느 하나 또는 양쪽을 3차원 정보를 지표로 하여 계수하는 공정, 및,

   (3') 공정 (2') 다음에, 응집 덩어리의 형성 레벨, 및 응집 덩어리를 형성하지 않았던 담체 입자의 레벨 중 어느 하나, 또는 양쪽에 기초하여 측정 대상 물질의 레벨을 결정하는 공정.
2. 제1항에 있어서,

   혈구 성분을 10-70V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 방법.
3. 제2항에 있어서,

   혈구 성분을 40-70V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 방법.
4. 제3항에 있어서,

   혈구 성분을 50-60V/mm의 교류 전압 펄스에 의해 파괴하는 방법.
5. 제1항에 있어서,

   공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 응집 덩어리 또는 담체 입자의 3차원 정보를 물리적으로 측정하는 방법.
6. 제5항에 있어서,

   3차원 정보를 물리적으로 측정하기 위한 방법이 전기 저항법, 레이저 회절 산란법, 및 3차원 화상 해석법으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법인 방법.
7. 제1항에 있어서,

   공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 전기장을 정지 후에 담체 입자를 계수하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서,

   공정 (2) 또는 (2')에 있어서, 전기장을 정지 후에 더 부가적으로 담체 입자를 희석하는 공정을 포함하는 방법.
9. 제1항에 있어서,

   전압 펄스를 복수회 가하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서,

    전압 펄스를 인가한 후에 담체 입자를 분산시킨 다음 전압 펄스를 인가하는 공정을 포함하는 방법.
11. 제9항에 있어서,

    복수의 전압 펄스가 다른 방향의 전압 펄스인 방법.
12. 제1항에 있어서,

    담체입자의 평균 입자경이 1μm 이상인 방법.
13. 제12항에 있어서,

    담체 입자의 평균 입자경이 1μm∼20μm인 방법.

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