JPWO2009128209A1 - 検出方法および検出システム - Google Patents

Abstract

本発明は、試料液に含まれる被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法に関する。本発明の検出方法は、被検出物質に特異的に結合する認識物質がその表面に固定化されている粒子と、試料液とを含む混合液に交流電圧を印加して、前記粒子をパールチェーン化させるステップを有する。前記混合液は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、交流電圧を印加される。

Description

本発明は、被検出物質（親和性物質）をパルスイムノアッセイ法で検出する方法およびそれに用いられる検出システムに関する。

従来、試料に含まれる被検出物質を検出するために、被検出物質に特異的に結合しうる抗体を利用する方法が数多く開発されている。そのひとつに、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。

この方法では、被検出物質を含む液体試料に被検出物質に特異的に結合しうる抗体を一定量加えて免疫凝集物を形成させる。凝集物を形成させた後、液体試料に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する。透過光の量は凝集物の量に応じて変化し、凝集物の量は被検出物質の濃度に応じて変化する。したがって、透過光を測定することで、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。一般的に透過光を測定する免疫比濁法と散乱光を検出する免疫比朧法とは区別されているが、凝集物による光の散乱を観察するという点ではいずれも同じ検出原理である。したがって、透過光だけでなく散乱光または反射光を測定しても、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。

この原理を用いて感度をさらに向上させた方法が、ラテックス凝集法である。前述の方法において抗体をラテックス粒子の表面に固定化させておくと、被検出物質と抗体とが結合することでラテックス粒子の凝集物が形成される（サンドイッチ反応）。ラテックス粒子の凝集物は抗原および抗体からなる凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいため、ラテックス凝集法では被検出物質をより高感度に検出することができる。

ラテックス凝集法をさらに高感度化させた方法として、パルスイムノアッセイ法が知られている（例えば、特許文献１参照）。以下、図１および図２を用いてパルスイムノアッセイ法について説明する。図１Ａは、測定チップの断面図であり、図１Ｂは、測定装置の構成を示すブロック図である。図２は、測定チップの流路部分の拡大図である。

図１Ａに示されるように、測定チップは、２枚のスライドグラス１０，１２と、その間に配置された１対の電極１４，１６とから構成されている。電極１４，１６の厚さは０.０２ｍｍであり、電極間の間隔は０.５ｍｍである。２枚のスライドグラス１０，１２および１対の電極１４，１６に囲まれた流路１８内には、抗体を固定化されたラテックス粒子２０と試料液とを含む混合液が供給される。

流路１８内に混合液を提供した後、電極１４，１６に交流電源供給装置３０を用いて交流電圧を印加してラテックス粒子２０に誘電分極を生じさせることで、図２Ａに示されるように、複数のラテックス粒子２０を直鎖状に並べることができる（パールチェーン化）。その後、交流電圧の印加を停止すると、図２Ｂに示されるように、直鎖状に並んでいたラテックス粒子２０はブラウン運動により分散する。液体試料中に被検出物質が存在すると、交流電圧の印加を停止した後もラテックス粒子２０の凝集物が観察される。図１Ｂに示されるように、顕微鏡２２、ＣＣＤカメラ２４、画像処理ボード２６およびパーソナルコンピューター２８から構成される画像処理装置を用いてラテックス粒子２０の凝集状態を観察して、被検出物質を検出する。パルスイムノアッセイ法は、複数の担体粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に被検出物質を検出することができる。
特開平７−８３９２８号公報

しかしながら、上記従来の方法には、被検出物質が粒子間の接触部位に存在する確率がそれほど高くないため、本来は凝集するはずの粒子も凝集しないという問題があった。すなわち、上記従来の方法には、反応効率が低いという問題があった。

また、上記従来の方法には、被検出物質の分子量が小さい場合または被検出物質に抗体が結合しうる部位（エピトープ）が２箇所程度しかない場合、抗体で被検出物質を挟むときに抗体同士が衝突し（立体障害が生じ）、効率よくサンドイッチ反応が生じないという問題もあった。

本発明の目的は、試料液に含まれる被検出物質（親和性物質）をパルスイムノアッセイ法で検出または測定する方法であって、認識物質（例えば抗体）と被検出物質とが効率的に反応して、粒子が効率的に凝集することができる検出方法または測定方法、およびそれに用いられる検出システムまたは測定システムを提供することである。

本発明者は、交流電圧を連続して印加する代わりに、交流電圧の印加および停止を交互に繰り返すことで上記課題を解決しうることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第一は、以下の親和性物質（被検出物質）の検出方法（測定方法）に関する。

［１］試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、生物学的特異的凝集反応により親和性物質に特異的に結合する認識物質がその表面に固定化されている担体粒子と、試料液とを含む混合液に交流電圧を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させるステップを有し、前記混合液は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、交流電圧を印加される、親和性物質の検出方法。
［２］前記第１の時間および前記第２の時間は、それぞれ１５〜６０秒である、［１］に記載の検出方法。
［３］前記セットは、２〜６回繰り返される、［１］または［２］に記載の検出方法。
［４］前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質がその表面に固定化されている第１の担体粒子と、前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている第２の担体粒子とを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質、および前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［６］前記担体粒子は、その表面に一種類の前記認識物質が固定化されており、前記親和性物質は、前記一種類の認識物質が特異的に結合する部分を２以上有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［７］前記生物学的特異的凝集反応は、抗原抗体反応である、［１］〜［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］前記生物学的特異的凝集反応は、核酸の二本鎖形成反応である、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。

本発明の第二は、以下の親和性物質（被検出物質）の検出システム（測定システム）に関する。

［９］試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出するシステムであって、流路および前記流路に電場を形成するための電極対を有する検出チップと、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段と、前記流路の情報を取得する検出手段とを有し、前記電圧印加手段は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、前記電極対に交流電圧を印加する、親和性物質の検出システム。

本発明によれば、粒子をより効率的に凝集させることができるため、ＳＮ比の高い検出および測定を実現することができる。また、本発明によれば、認識分子が結合する部位（例えばエピトープ）が少ない親和性物質についても、高感度に検出または測定することができる。

従来の測定チップおよび測定装置の構成を示す図 従来の測定チップの流路部分を示す拡大図 認識物質が固定化された担体粒子の一例を示す模式図 交流電圧を繰り返し印加した際の担体粒子の状態を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 検出チップの一例を示す模式図 検出システムの構成の一例を示すブロック図 電圧の印加回数と凝集率との関係を示すグラフ

本明細書において「検出」とは、特定の物質の有無を調べる意味だけでなく、特定の物質の濃度や量を測定する意味も含む。

本発明の検出方法は、試料液に含まれる親和性物質（被検出物質）をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、担体粒子および試料液を含む混合液に交流電圧を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させるステップを有する。以下の説明では、このステップを、１）親和性物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている担体粒子を準備する第１のステップと、２）試料液と第１のステップで準備した担体粒子とを含む混合液に交流電圧を印加して、担体粒子をパールチェーン化させる第２のステップとに分けて説明する。また、本発明の検出方法は、上記第２のステップの後に、任意に、３）前記交流電圧の印加を停止した後に担体粒子の凝集状態を観察する第３のステップを含んでいてもよい。

本発明の検出方法は、第２のステップにおいて混合液に交流電圧を印加する際に、交流電圧の印加および停止を交互に繰り返して、交流電圧を複数回印加することを主たる特徴とする。すなわち、本発明の検出方法は、複数回パールチェーン化させることを主たる特徴とする。

［第１のステップ］
第１のステップでは、親和性物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている担体粒子を準備する。

認識物質を固定化される担体粒子の種類は、特に限定されない。担体粒子の例には、ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉、微生物、およびアミノ基やスルフヒドリル基、カルボキシル基など反応性の高い官能基が修飾された粒子などが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子、金属コートラテックス粒子などが含まれる。

担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡で識別可能な０.５μｍ以上、かつブラウン運動による分散が容易に生じうる１００μｍ以下であることが好ましい。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。

担体粒子に固定化される認識物質は、生物学的特異的凝集反応により親和性物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されず、天然の物質であってもよいし、人工の物質であってもよい。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素、補酵素、レクチン、糖タンパク質、ヘム、ポルフィリンなどが含まれる。たとえば、抗体を認識物質とした場合は、認識物質（抗体）は抗原抗体反応により親和性物質（抗原）に特異的に結合する。また、核酸を認識物質とした場合は、認識物質（核酸）は二本鎖形成反応により親和性物質（他の核酸）に特異的に結合する。認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。たとえば、抗体を担体粒子に固定化する場合、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やスルフヒドリル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。

図３は、認識物質が固定化された担体粒子の一例を示す模式図である。図３Ａに示されるように、認識物質が固定化された担体粒子（修飾粒子）１００は、担体粒子１１０と、担体粒子１１０の表面に固定化された第１の抗体１２０ａ（第１の認識物質）および第２の抗体１２０ｂ（第２の認識物質）を含む。第１の抗体１２０ａおよび第２の抗体１２０ｂは、同一の親和性物質１３０に結合する抗体であるが、それぞれ異なるエピトープを認識する。すなわち、第１の抗体１２０ａは、親和性物質１３０の第１のエピトープに結合し、第２の抗体１２０ｂは、親和性物質１３０の第２のエピトープに結合する。したがって、修飾粒子１００を含む溶液中に親和性物質１３０が存在する場合、図３Ｂに示されるように、修飾粒子１００は抗原抗体反応（サンドイッチ反応）により他の粒子１００と会合して凝集塊を形成する。

図３の例に示されるように、１つの担体粒子には、親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質と、同一の親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されていてもよい。

また、それぞれ異なる認識物質が固定化されている複数種類の担体粒子を準備してもよい。たとえば、親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質をその表面に固定化されている第１の担体粒子と、同一の親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質をその表面に固定化されている第２の担体粒子とを準備してもよい。

たとえば、血液中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide；以下「ＢＮＰ」と略記する。）を検出する場合は、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体５０Ｅ１（ヒトＢＮＰ前駆体の７７〜１０８アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第１の認識物質とし、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体２４Ｃ５または２６Ｅ２（いずれもヒトＢＮＰの１１〜２２アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第２の認識物質とすればよい。また、腫瘍マーカーの１つであるα−フェトプロテイン（α-fetoprotein；以下「ＡＦＰ」と略記する）を検出する場合は、ヤギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｃ−１９（ヒトＡＦＰのＣ末端を認識する抗体）を第１の認識物質とし、ウサギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｈ−１４０（ヒトＡＦＰの１７１〜３１０アミノ酸残基を認識する抗体）を第２の認識物質とすればよい。

１つの親和性物質に結合部位（例えばエピトープ）が複数箇所ある場合は、担体粒子に固定化される認識物質の種類は一種類であってもよい。

認識物質が固定化された担体粒子は、使用する際に各自で調製してもよいし、市販品を購入してもよい。

［第２のステップ］
第２のステップでは、試料液と第１のステップで準備した担体粒子を含む混合液に交流電圧を印加して、担体粒子をパールチェーン化させる。

試料液は、特に限定されず、検出対象や検出目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物などが含まれる。

混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。たとえば、第１のステップで担体粒子を懸濁液として準備した場合は、試料液にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで担体粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に試料液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。

混合液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により担体粒子が泳動し（誘電泳動）、担体粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化；図２Ａ参照）。このとき、混合液に親和性物質が存在すれば、担体粒子は親和性物質を介して他の担体粒子に会合するため、複数の担体粒子が凝集する。その後、交流電圧の印加を停止すると、他の担体粒子に会合できなかった担体粒子はブラウン運動により分散する（図２Ｂ参照）。従来の検出方法では、この交流電圧の印加は１回行うのみであったが、本発明の検出方法では、交流電圧の印加を複数回繰り返して行う。

以下、図４〜７を参照して、本発明の検出方法における電圧印加の方法を説明する。

図４は、混合液に交流電圧を繰り返し印加した際の担体粒子の状態を示す模式図である。また、図５〜７は、パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図である。図４〜７において、白い担体粒子（修飾粒子）１００は、親和性物質が結合していない粒子を示し、黒い担体粒子（修飾粒子）１００は、親和性物質が結合している粒子を示す。

まず、１回目の電圧印加を開始すると、印加開始前は分散していた担体粒子１００（図４Ａ参照）は、誘電泳動力によりパールチェーン１４０を形成する（図４Ｂ参照）。その後、電圧印加を停止すると、試料液中に親和性物質１３０が存在しなければ、担体粒子１００は分散する。一方、試料液中に親和性物質１３０が存在し、かつ担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は凝集塊１５０を形成する（図４Ｃ参照）。

図５は、試料液中に親和性物質が存在し、かつ担体粒子間に親和性物質が存在する場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図５Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図であり、図５Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図である。これらの図に示されるように、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は、サンドイッチ反応により凝集塊１５０を形成する。

図６は、試料液中に親和性物質が存在するが、担体粒子間に親和性物質が存在しない場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図６Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図を示し、図６Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図を示す。これらの図に示されるように、担体粒子１００に親和性物質１３０が結合していても、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在していなければ、これらの担体粒子１００は分散する。

図７は、担体粒子間に親和性物質が存在しても、担体粒子が凝集できない場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図７Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図を示し、図７Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図を示す。これらの図に示されるように、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在していても、親和性物質１３０に認識物質が結合する部位が足りなければ、これらの担体粒子１００は分散する。たとえば、親和性物質にエピトープが１つしかない場合である。また、親和性物質１３０の分子量が小さい場合も、認識物質間の立体障害により結合が阻害されるため、担体粒子が凝集できない可能性が高い。

図６および図７に示されるように、担体粒子に親和性物質が結合していても、担体粒子が凝集しないことがある。したがって、従来の検出方法のように電圧印加を１回行うのみでは、凝集率は低い値となり、親和性物質を高感度に検出することはできない。そこで、本発明の検出方法では、担体粒子が凝集する確率を高めるために、交流電圧を複数回印加する。

図４の説明に戻る。１回目の電圧印加を停止した後（図４Ｃ参照）、２回目の電圧印加を開始すると、分散していた担体粒子１００および凝集塊１５０は、再びパールチェーン１４０を形成する（図４Ｄ参照）。その後、電圧印加を停止すると、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は新たに凝集塊１５０を形成する（図４Ｅ参照）。

さらに、３回目の電圧印加を開始すると、分散していた担体粒子１００および凝集塊１５０は、再びパールチェーン１４０を形成する（図４Ｆ参照）。その後、電圧印加を停止すると、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は新たに凝集塊１５０を形成する（図４Ｇ参照）。

このように、交流電圧の印加および停止を繰り返してパールチェーン化を複数回行うことで、親和性物質の濃度に応じた適切な値まで凝集率を高めることができる。

各回の電圧を印加する時間は、半数以上の担体粒子がパールチェーンを形成できる時間が好ましい。本発明者らの実験では、半数以上の担体粒子がパールチェーンを形成するのに早くとも１５秒はかかり、また６０秒超電圧を印加してもパールチェーン化した粒子の数は変化しなかった。このことから、交流電圧を印加する時間（第１の時間）は、それぞれ１５〜６０秒の範囲内が好ましい。

また、交流電圧の印加は、凝集していない担体粒子が十分に分散した状態で行うことが好ましい。異なる粒子と新たにパールチェーンを形成させるためである。本発明者らの実験では、ある程度の数の担体粒子が分散するのには早くとも１５秒はかかり、また６０秒でほぼすべての担体粒子が分散していた。このことから、交流電圧の印加を停止する時間（第２の時間）は、それぞれ１５〜６０秒の範囲内が好ましい。

凝集率は、理論的には親和性物質の濃度に依存するため、交流電圧を印加する回数は、それ以上回数を増やしても凝集率が増加しない回数であることが好ましい。具体的には、交流電圧を印加する回数は、２〜１０回の範囲内が好ましく、２〜６回の範囲内が特に好ましい。より正確には、交流電圧を印加するステップおよび交流電圧の印加を停止するステップからなるセットは、２〜１０回（好ましくは２〜６回）繰り返されることが好ましい。

混合液に交流電圧を印加する方法（装置）は、特に限定されず、従来のパルスイムノアッセイ法と同じ方法（装置）でよい。例えば、１）ガラスなどからなる基板と、前記基板上に対向するように配置された一対の電極と、前記一対の電極の間に設けられた流路とを有する検出チップを準備し；２）各電極を交流電源供給装置に接続し；３）試料液と担体粒子を含む混合液を流路内に提供した後に電極間に交流電圧を印加すればよい。

検出チップは、上記の例に限られず、従来のパルスイムノアッセイ法で用いられてきた検出チップから選択してもよい。また、検出チップの流路内には、第１のステップで準備した担体粒子を予め配置しておいてもよい。すなわち、混合液の調製は流路内で行われてもよい。たとえば、担体粒子を含む固形物（担体粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を予め流路内に配置しておくことで、試料液を注入口から流路内に提供するのみで混合液を調製することができる。

混合液に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、特に限定されないが、１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であることが好ましい。

混合液に印加する交流電圧の電界強度は、５〜１００Ｖ（波高値）／ｍｍの範囲内であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。

図８は、検出チップの一例を示す模式図であり、図８Ａは斜視図、図８Ｂは断面図である。これらの図に示されるように、検出チップ２００は、上基板２１０と、下基板２２０と、前記上基板２１０と下基板２２０との間に配置された１対の対向電極２３０と、前記電極２３０とそれぞれ接続している１対の端子２４０とを有する。上基板２１０は、下基板２２０に面する面に凹部を有する。図８Ｂに示されるように、この凹部は、担体粒子を含む混合液を提供される流路２５０として機能する。

上基板２１０および下基板２２０は絶縁性の板である。上基板２１０および下基板２２０は、流路２５０内の担体粒子を観察する観点から少なくとも一方は透明であることが好ましい。上基板２１０および下基板２２０の材料は、例えば透明性を有する有機絶縁材料や無機絶縁材料などである。

透明性を有する有機絶縁材料の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンが含まれる。

透明性を有する無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラスが含まれる。ガラスの例には、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスが含まれる。

上基板２１０および下基板２２０の面積および厚さは、目的に応じて任意に設定することができる。また、流路２５０の幅および深さも、目的や提供される混合液の量に応じて任意に設定することができる。

流路２５０の内部表面は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。また、流路２５０の内部表面の一部が親水性で、他の部分が疎水性であってもよい。さらに、流路２５０の内部表面は、担体粒子の吸着を抑制する表面処理が施されていてもよい。

上基板２１０または下基板２２０は、流路２５０内に液体を提供するための注入口２６０、および流路２５０内の液体を排出するための排出口２７０を設けられていてもよい。注入口２６０および排出口２７０は、流路２５０と繋がっていれば、その位置や大きさは特に限定されない。

対向電極２３０は、下基板２２０上に形成された電極である。対向電極２３０の形状は、流路２５０に平行であれば特に限定されない。対向電極２３０の材料は、導電性を有するものであれば特に限定されない。対向電極２３０の材料の例には、金、銀、銅などの無機物質が含まれる。下基板２２０上に対向電極２３０を形成する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。対向電極を形成する方法の例には、スパッタ法、印刷法、ディップコート法が含まれる。

図８に示される検出チップ２００は、例えば、１）上基板２１０および下基板２２０を準備し、２）上基板２１０に流路２５０の形状の凹部を形成し、３）下基板２２０上に電極２３０を形成し、４）上基板２１０と下基板２２０とを貼り合わせることで、作製することができる。

上基板２１０に凹部を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。必要に応じて、注入口２６０および排出口２７０を形成してもよい。

下基板２２０上に電極２３０を形成する方法は、スパッタや蒸着などの薄膜堆積技術、印刷技術などの当業者に公知の技術から選択することができる。電極薄膜が薄いほど上基板２１０と下基板２２０との間の隙間を無くすことが可能であるが、スパッタはこのような薄い電極薄膜を容易に形成することができるので好ましい。

上基板２１０と下基板２２０とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。

［第３のステップ］
任意に含まれる第３のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、担体粒子の凝集状態を観察する。

前述の通り、交流電圧の印加を停止すると、凝集していない担体粒子はブラウン運動により混合液中に分散するが、特異的結合により凝集した担体粒子は凝集した状態が維持される。したがって、担体粒子の凝集率を求めることにより、被検出物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。

凝集率の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよい。例えば、光学顕微鏡に接続したカメラ（ＣＣＤカメラなど）で混合液中の担体粒子の凝集状態を撮像し、得られた画像から凝集率を算出すればよい。担体粒子の凝集率は、例えば以下の式により算出することができる。

凝集率（％）＝（他の粒子と会合している粒子の数）／（すべての粒子の数）×１００

図９は、検出システムの構成の一例を示すブロック図である。図９に示されるように、検出システム３００は、光学顕微鏡３１０、ＣＣＤカメラ３２０、画像処理ボード３３０、パーソナルコンピューター３４０および交流電源供給装置３５０を有する。

交流電源供給装置３５０は、検出チップ２００の対向電極２３０間に交流電圧を繰り返し印加して、流路２５０内の担体粒子をパールチェーン化させる。交流電圧の印加を停止した後、ＣＣＤカメラ３２０は、光学顕微鏡３１０を介して検出チップ２００の流路２５０内の担体粒子を撮像する。得られた画像は画像処理ボード３３０に入力される。パーソナルコンピューター３４０および画像処理ボード３３０は、他の粒子と会合している粒子の数から凝集率を算出する。

以上のように、本発明の検出方法は、交流電圧の印加および停止を繰り返してパールチェーン化を複数回行うことで、親和性物質の濃度に応じた適切な値まで凝集率を高めることができる。したがって、本発明の検出方法は、親和性物質を高感度かつ高精度に検出することができる。

以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

本実施例では、本発明の検出方法により、抗原抗体反応を利用して甲状腺刺激ホルモン（以下「ＴＳＨ」と略記する）を検出した例を示す。

１．担体粒子および試料液の準備
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、それぞれ異なるエピトープに結合する２種類の抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以下「抗ＴＳＨ抗体」と略記する）をその表面に固定化した。具体的には、１）２種類の抗ＴＳＨ抗体を含む溶液にラテックスビーズを加え、２）２時間攪拌し、３）遠心分離して上清を除去し、４）牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と略記する）を添加して、抗ＴＳＨ抗体を固定化された担体粒子を調製した。

ＴＳＨを緩衝溶液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭグリシン、０.１％ ＢＳＡ、ｐＨ８.６）に溶解させて、試料液（３６０ｐＭ ＴＳＨ溶液）を調製した。

２．検出チップの作製
本実施例では、図８に示されるパルスイムノアッセイ用の検出チップを使用した。

まず、上基板を作製した。上基板の材料には、厚さ０.１ｍｍのホウケイ酸ガラス板（Ｄ−２６３；SCHOTT社）を用いた。フォトリソグラフィーおよびウェットエッチングを行い、ガラス板に流路となる凹部を形成した。流路の幅は０.７５ｍｍ、長さは１０ｍｍ、深さは１０μｍである。

次に、下基板を作製した。下基板の材料には、厚さ１.１ｍｍのホウケイ酸ガラス板（Ｄ−２６３；SCHOTT社）を用いた。電極パターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してガラス板上にクロムをスパッタした後、さらに金をスパッタして、電極および端子を形成した。クロム薄膜の膜厚は５ｎｍ、金薄膜の膜厚は９５ｎｍである。クロム薄膜は、ガラス板表面と金薄膜との密着性を向上させる。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極のそれぞれの幅は１ｍｍ、長さは５ｍｍ、矩形電極間の間隔は０.５ｍｍである。

作製した上基板と下基板とをＵＶ硬化性接着剤を用いて貼りあわせて、検出チップを作製した。

３．測定
電極対に印加する電圧ならびにその周波数および波形を制御するべく、電圧印加部として交流電源供給装置（３３１２０Ａ；Hewlett-Packard社）を測定チップの端子に接続した。

抗ＴＳＨ抗体を固定化された担体粒子を試料液（３６０ｐＭ ＴＳＨ溶液）に加えて混合し、９０秒間室温で反応させた。混合液の量は９μＬ、混合液中の粒子の濃度は０.４重量％、混合液中のＴＳＨの濃度は３６ｐＭである。

反応後の混合液１μＬを検出チップの流路内に提供した。検出チップの電極対に交流電圧（２０Ｖ、１００ｋＨｚ）を１５秒間印加して、担体粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、倒立顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて流路内を透過光観察して、粒子の凝集率を求めた。透過光観察の際、各粒子が顕微鏡の焦点からずれることはなく、常に輪郭をはっきりと確認することができた。

粒子の凝集率は、以下の式により求めた。顕微鏡を用いて撮像した３枚の画像のそれぞれについて凝集率を算出し、その平均値を算出した。

凝集率（％）＝（他の粒子と会合した粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００

上記電圧印加、電圧印加の停止および凝集率の算出を１セットとし、７セット繰り返した。

また、比較例として、検出チップの電極対に交流電圧（２０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加し、電圧の印加を停止してから６０秒後に流路内を透過光観察して粒子の凝集率を求めた（１セットのみ）。

４．結果
図１０は、電圧の印加回数（セット数）と凝集率との関係を示すグラフである。横軸は電圧の印加回数（セット数）を示し、縦軸は凝集率を示している。黒丸は、３６ｐＭ ＴＳＨ溶液を試料液とした場合の結果を示し、白丸は、緩衝溶液（０Ｍ ＴＳＨ溶液）を試料液とした場合の結果を示す。図１０に示されるように、３６ｐＭ ＴＳＨ溶液を試料液とした場合、電圧の印加を繰り返すことにより、凝集率が上昇した。一方、緩衝溶液（０Ｍ ＴＳＨ溶液）を試料液とした場合は、電圧の印加を繰り返しても、凝集率はほとんど変化しなかった。このことから、電圧の印加を繰り返すことで、ＳＮ比が向上することがわかる。また、電圧を６回印加した場合と７回印加した場合とで、凝集率に大きな差は見られなかった。このことから、電圧の印加を７回以上繰り返しても凝集率はほとんど向上せず、電圧を印加する回数は、６回で十分であることがわかる。

表１は、本発明の検出方法（電圧印加：１５秒、４回）により求めた凝集率（実施例）と、従来の検出方法（電圧印加：６０秒、１回）により求めた凝集率（比較例）を示す。

表１に示されるように、１５秒間の電圧印加を４回繰り返したときの凝集率（６１．１％）は、６０秒間の電圧印加を１回繰り返したときの凝集率（４８.２％）よりも高い値となった。このことから、電圧の印加を繰り返すことで、粒子間の衝突確率が向上し、粒子間に抗原が存在する確率が高まったことが示唆される。

特許文献１に開示されているように、電圧の印加時間を長くすれば、パールチェーン化した粒子の数が増加し、凝集率が上昇することが知られている。しかしながら、上記の実験において、電圧の合計印加時間は、実施例（１５秒、４回）と比較例（６０秒、１回）とで同じ（６０秒）である。このことから、本発明の検出方法によるＳＮ比の向上は、パールチェーン化した粒子の数の増加による寄与よりも、粒子間の衝突確率の向上による寄与のほうが大きいことが示唆される。

以上のように、本発明の検出方法は、従来の検出方法よりもＳＮ比が優れている。また、本発明の検出方法は、ＴＳＨのような２価抗原であっても、ｐＭレベルの被検出物質を検出することができる。

本出願は、２００８年４月１４日出願の特願２００８−１０４４４５に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の検出方法および検出システムは、分子量の小さい２価抗原であってもサンドイッチ法により検出することができるため、被検出物質をより高感度に検出することができる。したがって、本発明の検出方法および検出システムは、例えば、血液や血漿を検体としてパルスイムノアッセイ法による検査を行う方法およびそれに用いる検出システムとして有用である。

本発明は、被検出物質（親和性物質）をパルスイムノアッセイ法で検出する方法およびそれに用いられる検出システムに関する。

従来、試料に含まれる被検出物質を検出するために、被検出物質に特異的に結合しうる抗体を利用する方法が数多く開発されている。そのひとつに、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。

この方法では、被検出物質を含む液体試料に被検出物質に特異的に結合しうる抗体を一定量加えて免疫凝集物を形成させる。凝集物を形成させた後、液体試料に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する。透過光の量は凝集物の量に応じて変化し、凝集物の量は被検出物質の濃度に応じて変化する。したがって、透過光を測定することで、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。一般的に透過光を測定する免疫比濁法と散乱光を検出する免疫比朧法とは区別されているが、凝集物による光の散乱を観察するという点ではいずれも同じ検出原理である。したがって、透過光だけでなく散乱光または反射光を測定しても、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。

この原理を用いて感度をさらに向上させた方法が、ラテックス凝集法である。前述の方法において抗体をラテックス粒子の表面に固定化させておくと、被検出物質と抗体とが結合することでラテックス粒子の凝集物が形成される（サンドイッチ反応）。ラテックス粒子の凝集物は抗原および抗体からなる凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいため、ラテックス凝集法では被検出物質をより高感度に検出することができる。

ラテックス凝集法をさらに高感度化させた方法として、パルスイムノアッセイ法が知られている（例えば、特許文献１参照）。以下、図１および図２を用いてパルスイムノアッセイ法について説明する。図１Ａは、測定チップの断面図であり、図１Ｂは、測定装置の構成を示すブロック図である。図２は、測定チップの流路部分の拡大図である。

図１Ａに示されるように、測定チップは、２枚のスライドグラス１０，１２と、その間に配置された１対の電極１４，１６とから構成されている。電極１４，１６の厚さは０.０２ｍｍであり、電極間の間隔は０.５ｍｍである。２枚のスライドグラス１０，１２および１対の電極１４，１６に囲まれた流路１８内には、抗体を固定化されたラテックス粒子２０と試料液とを含む混合液が供給される。

流路１８内に混合液を提供した後、電極１４，１６に交流電源供給装置３０を用いて交流電圧を印加してラテックス粒子２０に誘電分極を生じさせることで、図２Ａに示されるように、複数のラテックス粒子２０を直鎖状に並べることができる（パールチェーン化）。その後、交流電圧の印加を停止すると、図２Ｂに示されるように、直鎖状に並んでいたラテックス粒子２０はブラウン運動により分散する。液体試料中に被検出物質が存在すると、交流電圧の印加を停止した後もラテックス粒子２０の凝集物が観察される。図１Ｂに示されるように、顕微鏡２２、ＣＣＤカメラ２４、画像処理ボード２６およびパーソナルコンピューター２８から構成される画像処理装置を用いてラテックス粒子２０の凝集状態を観察して、被検出物質を検出する。パルスイムノアッセイ法は、複数の担体粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に被検出物質を検出することができる。
特開平７−８３９２８号公報

しかしながら、上記従来の方法には、被検出物質が粒子間の接触部位に存在する確率がそれほど高くないため、本来は凝集するはずの粒子も凝集しないという問題があった。すなわち、上記従来の方法には、反応効率が低いという問題があった。

また、上記従来の方法には、被検出物質の分子量が小さい場合または被検出物質に抗体が結合しうる部位（エピトープ）が２箇所程度しかない場合、抗体で被検出物質を挟むときに抗体同士が衝突し（立体障害が生じ）、効率よくサンドイッチ反応が生じないという問題もあった。

本発明の目的は、試料液に含まれる被検出物質（親和性物質）をパルスイムノアッセイ法で検出または測定する方法であって、認識物質（例えば抗体）と被検出物質とが効率的に反応して、粒子が効率的に凝集することができる検出方法または測定方法、およびそれに用いられる検出システムまたは測定システムを提供することである。

本発明者は、交流電圧を連続して印加する代わりに、交流電圧の印加および停止を交互に繰り返すことで上記課題を解決しうることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第一は、以下の親和性物質（被検出物質）の検出方法（測定方法）に関する。

［１］試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、生物学的特異的凝集反応により親和性物質に特異的に結合する認識物質がその表面に固定化されている担体粒子と、試料液とを含む混合液に交流電圧を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させるステップを有し、前記混合液は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、交流電圧を印加される、親和性物質の検出方法。
［２］前記第１の時間および前記第２の時間は、それぞれ１５〜６０秒である、［１］に記載の検出方法。
［３］前記セットは、２〜６回繰り返される、［１］または［２］に記載の検出方法。
［４］前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質がその表面に固定化されている第１の担体粒子と、前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている第２の担体粒子とを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質、および前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［６］前記担体粒子は、その表面に一種類の前記認識物質が固定化されており、前記親和性物質は、前記一種類の認識物質が特異的に結合する部分を２以上有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［７］前記生物学的特異的凝集反応は、抗原抗体反応である、［１］〜［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］前記生物学的特異的凝集反応は、核酸の二本鎖形成反応である、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。

本発明の第二は、以下の親和性物質（被検出物質）の検出システム（測定システム）に関する。

［９］試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出するシステムであって、流路および前記流路に電場を形成するための電極対を有する検出チップと、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段と、前記流路の情報を取得する検出手段とを有し、前記電圧印加手段は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、前記電極対に交流電圧を印加する、親和性物質の検出システム。

本発明によれば、粒子をより効率的に凝集させることができるため、ＳＮ比の高い検出および測定を実現することができる。また、本発明によれば、認識分子が結合する部位（例えばエピトープ）が少ない親和性物質についても、高感度に検出または測定することができる。

本明細書において「検出」とは、特定の物質の有無を調べる意味だけでなく、特定の物質の濃度や量を測定する意味も含む。

本発明の検出方法は、試料液に含まれる親和性物質（被検出物質）をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、担体粒子および試料液を含む混合液に交流電圧を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させるステップを有する。以下の説明では、このステップを、１）親和性物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている担体粒子を準備する第１のステップと、２）試料液と第１のステップで準備した担体粒子とを含む混合液に交流電圧を印加して、担体粒子をパールチェーン化させる第２のステップとに分けて説明する。また、本発明の検出方法は、上記第２のステップの後に、任意に、３）前記交流電圧の印加を停止した後に担体粒子の凝集状態を観察する第３のステップを含んでいてもよい。

本発明の検出方法は、第２のステップにおいて混合液に交流電圧を印加する際に、交流電圧の印加および停止を交互に繰り返して、交流電圧を複数回印加することを主たる特徴とする。すなわち、本発明の検出方法は、複数回パールチェーン化させることを主たる特徴とする。

［第１のステップ］
第１のステップでは、親和性物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている担体粒子を準備する。

認識物質を固定化される担体粒子の種類は、特に限定されない。担体粒子の例には、ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉、微生物、およびアミノ基やスルフヒドリル基、カルボキシル基など反応性の高い官能基が修飾された粒子などが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子、金属コートラテックス粒子などが含まれる。

担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡で識別可能な０.５μｍ以上、かつブラウン運動による分散が容易に生じうる１００μｍ以下であることが好ましい。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。

担体粒子に固定化される認識物質は、生物学的特異的凝集反応により親和性物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されず、天然の物質であってもよいし、人工の物質であってもよい。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素、補酵素、レクチン、糖タンパク質、ヘム、ポルフィリンなどが含まれる。たとえば、抗体を認識物質とした場合は、認識物質（抗体）は抗原抗体反応により親和性物質（抗原）に特異的に結合する。また、核酸を認識物質とした場合は、認識物質（核酸）は二本鎖形成反応により親和性物質（他の核酸）に特異的に結合する。認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。たとえば、抗体を担体粒子に固定化する場合、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やスルフヒドリル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。

図３は、認識物質が固定化された担体粒子の一例を示す模式図である。図３Ａに示されるように、認識物質が固定化された担体粒子（修飾粒子）１００は、担体粒子１１０と、担体粒子１１０の表面に固定化された第１の抗体１２０ａ（第１の認識物質）および第２の抗体１２０ｂ（第２の認識物質）を含む。第１の抗体１２０ａおよび第２の抗体１２０ｂは、同一の親和性物質１３０に結合する抗体であるが、それぞれ異なるエピトープを認識する。すなわち、第１の抗体１２０ａは、親和性物質１３０の第１のエピトープに結合し、第２の抗体１２０ｂは、親和性物質１３０の第２のエピトープに結合する。したがって、修飾粒子１００を含む溶液中に親和性物質１３０が存在する場合、図３Ｂに示されるように、修飾粒子１００は抗原抗体反応（サンドイッチ反応）により他の粒子１００と会合して凝集塊を形成する。

図３の例に示されるように、１つの担体粒子には、親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質と、同一の親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されていてもよい。

また、それぞれ異なる認識物質が固定化されている複数種類の担体粒子を準備してもよい。たとえば、親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質をその表面に固定化されている第１の担体粒子と、同一の親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質をその表面に固定化されている第２の担体粒子とを準備してもよい。

たとえば、血液中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide；以下「ＢＮＰ」と略記する。）を検出する場合は、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体５０Ｅ１（ヒトＢＮＰ前駆体の７７〜１０８アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第１の認識物質とし、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体２４Ｃ５または２６Ｅ２（いずれもヒトＢＮＰの１１〜２２アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第２の認識物質とすればよい。また、腫瘍マーカーの１つであるα−フェトプロテイン（α-fetoprotein；以下「ＡＦＰ」と略記する）を検出する場合は、ヤギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｃ−１９（ヒトＡＦＰのＣ末端を認識する抗体）を第１の認識物質とし、ウサギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｈ−１４０（ヒトＡＦＰの１７１〜３１０アミノ酸残基を認識する抗体）を第２の認識物質とすればよい。

１つの親和性物質に結合部位（例えばエピトープ）が複数箇所ある場合は、担体粒子に固定化される認識物質の種類は一種類であってもよい。

認識物質が固定化された担体粒子は、使用する際に各自で調製してもよいし、市販品を購入してもよい。

［第２のステップ］
第２のステップでは、試料液と第１のステップで準備した担体粒子を含む混合液に交流電圧を印加して、担体粒子をパールチェーン化させる。

試料液は、特に限定されず、検出対象や検出目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物などが含まれる。

混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。たとえば、第１のステップで担体粒子を懸濁液として準備した場合は、試料液にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで担体粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に試料液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。

混合液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により担体粒子が泳動し（誘電泳動）、担体粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化；図２Ａ参照）。このとき、混合液に親和性物質が存在すれば、担体粒子は親和性物質を介して他の担体粒子に会合するため、複数の担体粒子が凝集する。その後、交流電圧の印加を停止すると、他の担体粒子に会合できなかった担体粒子はブラウン運動により分散する（図２Ｂ参照）。従来の検出方法では、この交流電圧の印加は１回行うのみであったが、本発明の検出方法では、交流電圧の印加を複数回繰り返して行う。

以下、図４〜７を参照して、本発明の検出方法における電圧印加の方法を説明する。

図４は、混合液に交流電圧を繰り返し印加した際の担体粒子の状態を示す模式図である。また、図５〜７は、パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図である。図４〜７において、白い担体粒子（修飾粒子）１００は、親和性物質が結合していない粒子を示し、黒い担体粒子（修飾粒子）１００は、親和性物質が結合している粒子を示す。

まず、１回目の電圧印加を開始すると、印加開始前は分散していた担体粒子１００（図４Ａ参照）は、誘電泳動力によりパールチェーン１４０を形成する（図４Ｂ参照）。その後、電圧印加を停止すると、試料液中に親和性物質１３０が存在しなければ、担体粒子１００は分散する。一方、試料液中に親和性物質１３０が存在し、かつ担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は凝集塊１５０を形成する（図４Ｃ参照）。

図５は、試料液中に親和性物質が存在し、かつ担体粒子間に親和性物質が存在する場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図５Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図であり、図５Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図である。これらの図に示されるように、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は、サンドイッチ反応により凝集塊１５０を形成する。

図６は、試料液中に親和性物質が存在するが、担体粒子間に親和性物質が存在しない場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図６Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図を示し、図６Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図を示す。これらの図に示されるように、担体粒子１００に親和性物質１３０が結合していても、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在していなければ、これらの担体粒子１００は分散する。

図７は、担体粒子間に親和性物質が存在しても、担体粒子が凝集できない場合の担体粒子の様子を示す模式図である。図７Ａは、電圧を印加している状態の担体粒子の様子を示す模式図を示し、図７Ｂは、電圧印加を停止した状態の担体粒子の様子を示す模式図を示す。これらの図に示されるように、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在していても、親和性物質１３０に認識物質が結合する部位が足りなければ、これらの担体粒子１００は分散する。たとえば、親和性物質にエピトープが１つしかない場合である。また、親和性物質１３０の分子量が小さい場合も、認識物質間の立体障害により結合が阻害されるため、担体粒子が凝集できない可能性が高い。

図６および図７に示されるように、担体粒子に親和性物質が結合していても、担体粒子が凝集しないことがある。したがって、従来の検出方法のように電圧印加を１回行うのみでは、凝集率は低い値となり、親和性物質を高感度に検出することはできない。そこで、本発明の検出方法では、担体粒子が凝集する確率を高めるために、交流電圧を複数回印加する。

図４の説明に戻る。１回目の電圧印加を停止した後（図４Ｃ参照）、２回目の電圧印加を開始すると、分散していた担体粒子１００および凝集塊１５０は、再びパールチェーン１４０を形成する（図４Ｄ参照）。その後、電圧印加を停止すると、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は新たに凝集塊１５０を形成する（図４Ｅ参照）。

さらに、３回目の電圧印加を開始すると、分散していた担体粒子１００および凝集塊１５０は、再びパールチェーン１４０を形成する（図４Ｆ参照）。その後、電圧印加を停止すると、担体粒子１００間に親和性物質１３０が存在すれば、これらの担体粒子１００は新たに凝集塊１５０を形成する（図４Ｇ参照）。

このように、交流電圧の印加および停止を繰り返してパールチェーン化を複数回行うことで、親和性物質の濃度に応じた適切な値まで凝集率を高めることができる。

各回の電圧を印加する時間は、半数以上の担体粒子がパールチェーンを形成できる時間が好ましい。本発明者らの実験では、半数以上の担体粒子がパールチェーンを形成するのに早くとも１５秒はかかり、また６０秒超電圧を印加してもパールチェーン化した粒子の数は変化しなかった。このことから、交流電圧を印加する時間（第１の時間）は、それぞれ１５〜６０秒の範囲内が好ましい。

また、交流電圧の印加は、凝集していない担体粒子が十分に分散した状態で行うことが好ましい。異なる粒子と新たにパールチェーンを形成させるためである。本発明者らの実験では、ある程度の数の担体粒子が分散するのには早くとも１５秒はかかり、また６０秒でほぼすべての担体粒子が分散していた。このことから、交流電圧の印加を停止する時間（第２の時間）は、それぞれ１５〜６０秒の範囲内が好ましい。

凝集率は、理論的には親和性物質の濃度に依存するため、交流電圧を印加する回数は、それ以上回数を増やしても凝集率が増加しない回数であることが好ましい。具体的には、交流電圧を印加する回数は、２〜１０回の範囲内が好ましく、２〜６回の範囲内が特に好ましい。より正確には、交流電圧を印加するステップおよび交流電圧の印加を停止するステップからなるセットは、２〜１０回（好ましくは２〜６回）繰り返されることが好ましい。

混合液に交流電圧を印加する方法（装置）は、特に限定されず、従来のパルスイムノアッセイ法と同じ方法（装置）でよい。例えば、１）ガラスなどからなる基板と、前記基板上に対向するように配置された一対の電極と、前記一対の電極の間に設けられた流路とを有する検出チップを準備し；２）各電極を交流電源供給装置に接続し；３）試料液と担体粒子を含む混合液を流路内に提供した後に電極間に交流電圧を印加すればよい。

検出チップは、上記の例に限られず、従来のパルスイムノアッセイ法で用いられてきた検出チップから選択してもよい。また、検出チップの流路内には、第１のステップで準備した担体粒子を予め配置しておいてもよい。すなわち、混合液の調製は流路内で行われてもよい。たとえば、担体粒子を含む固形物（担体粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を予め流路内に配置しておくことで、試料液を注入口から流路内に提供するのみで混合液を調製することができる。

混合液に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、特に限定されないが、１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であることが好ましい。

混合液に印加する交流電圧の電界強度は、５〜１００Ｖ（波高値）／ｍｍの範囲内であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。

図８は、検出チップの一例を示す模式図であり、図８Ａは斜視図、図８Ｂは断面図である。これらの図に示されるように、検出チップ２００は、上基板２１０と、下基板２２０と、前記上基板２１０と下基板２２０との間に配置された１対の対向電極２３０と、前記電極２３０とそれぞれ接続している１対の端子２４０とを有する。上基板２１０は、下基板２２０に面する面に凹部を有する。図８Ｂに示されるように、この凹部は、担体粒子を含む混合液を提供される流路２５０として機能する。

上基板２１０および下基板２２０は絶縁性の板である。上基板２１０および下基板２２０は、流路２５０内の担体粒子を観察する観点から少なくとも一方は透明であることが好ましい。上基板２１０および下基板２２０の材料は、例えば透明性を有する有機絶縁材料や無機絶縁材料などである。

透明性を有する有機絶縁材料の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンが含まれる。

透明性を有する無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラスが含まれる。ガラスの例には、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスが含まれる。

上基板２１０および下基板２２０の面積および厚さは、目的に応じて任意に設定することができる。また、流路２５０の幅および深さも、目的や提供される混合液の量に応じて任意に設定することができる。

流路２５０の内部表面は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。また、流路２５０の内部表面の一部が親水性で、他の部分が疎水性であってもよい。さらに、流路２５０の内部表面は、担体粒子の吸着を抑制する表面処理が施されていてもよい。

上基板２１０または下基板２２０は、流路２５０内に液体を提供するための注入口２６０、および流路２５０内の液体を排出するための排出口２７０を設けられていてもよい。注入口２６０および排出口２７０は、流路２５０と繋がっていれば、その位置や大きさは特に限定されない。

対向電極２３０は、下基板２２０上に形成された電極である。対向電極２３０の形状は、流路２５０に平行であれば特に限定されない。対向電極２３０の材料は、導電性を有するものであれば特に限定されない。対向電極２３０の材料の例には、金、銀、銅などの無機物質が含まれる。下基板２２０上に対向電極２３０を形成する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。対向電極を形成する方法の例には、スパッタ法、印刷法、ディップコート法が含まれる。

図８に示される検出チップ２００は、例えば、１）上基板２１０および下基板２２０を準備し、２）上基板２１０に流路２５０の形状の凹部を形成し、３）下基板２２０上に電極２３０を形成し、４）上基板２１０と下基板２２０とを貼り合わせることで、作製することができる。

上基板２１０に凹部を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。必要に応じて、注入口２６０および排出口２７０を形成してもよい。

下基板２２０上に電極２３０を形成する方法は、スパッタや蒸着などの薄膜堆積技術、印刷技術などの当業者に公知の技術から選択することができる。電極薄膜が薄いほど上基板２１０と下基板２２０との間の隙間を無くすことが可能であるが、スパッタはこのような薄い電極薄膜を容易に形成することができるので好ましい。

上基板２１０と下基板２２０とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。

［第３のステップ］
任意に含まれる第３のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、担体粒子の凝集状態を観察する。

前述の通り、交流電圧の印加を停止すると、凝集していない担体粒子はブラウン運動により混合液中に分散するが、特異的結合により凝集した担体粒子は凝集した状態が維持される。したがって、担体粒子の凝集率を求めることにより、被検出物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。

凝集率の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよい。例えば、光学顕微鏡に接続したカメラ（ＣＣＤカメラなど）で混合液中の担体粒子の凝集状態を撮像し、得られた画像から凝集率を算出すればよい。担体粒子の凝集率は、例えば以下の式により算出することができる。

凝集率（％）＝（他の粒子と会合している粒子の数）／（すべての粒子の数）×１００

図９は、検出システムの構成の一例を示すブロック図である。図９に示されるように、検出システム３００は、光学顕微鏡３１０、ＣＣＤカメラ３２０、画像処理ボード３３０、パーソナルコンピューター３４０および交流電源供給装置３５０を有する。

交流電源供給装置３５０は、検出チップ２００の対向電極２３０間に交流電圧を繰り返し印加して、流路２５０内の担体粒子をパールチェーン化させる。交流電圧の印加を停止した後、ＣＣＤカメラ３２０は、光学顕微鏡３１０を介して検出チップ２００の流路２５０内の担体粒子を撮像する。得られた画像は画像処理ボード３３０に入力される。パーソナルコンピューター３４０および画像処理ボード３３０は、他の粒子と会合している粒子の数から凝集率を算出する。

以上のように、本発明の検出方法は、交流電圧の印加および停止を繰り返してパールチェーン化を複数回行うことで、親和性物質の濃度に応じた適切な値まで凝集率を高めることができる。したがって、本発明の検出方法は、親和性物質を高感度かつ高精度に検出することができる。

以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

本実施例では、本発明の検出方法により、抗原抗体反応を利用して甲状腺刺激ホルモン（以下「ＴＳＨ」と略記する）を検出した例を示す。

１．担体粒子および試料液の準備
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、それぞれ異なるエピトープに結合する２種類の抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以下「抗ＴＳＨ抗体」と略記する）をその表面に固定化した。具体的には、１）２種類の抗ＴＳＨ抗体を含む溶液にラテックスビーズを加え、２）２時間攪拌し、３）遠心分離して上清を除去し、４）牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と略記する）を添加して、抗ＴＳＨ抗体を固定化された担体粒子を調製した。

ＴＳＨを緩衝溶液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭグリシン、０.１％ ＢＳＡ、ｐＨ８.６）に溶解させて、試料液（３６０ｐＭ ＴＳＨ溶液）を調製した。

２．検出チップの作製
本実施例では、図８に示されるパルスイムノアッセイ用の検出チップを使用した。

まず、上基板を作製した。上基板の材料には、厚さ０.１ｍｍのホウケイ酸ガラス板（Ｄ−２６３；SCHOTT社）を用いた。フォトリソグラフィーおよびウェットエッチングを行い、ガラス板に流路となる凹部を形成した。流路の幅は０.７５ｍｍ、長さは１０ｍｍ、深さは１０μｍである。

次に、下基板を作製した。下基板の材料には、厚さ１.１ｍｍのホウケイ酸ガラス板（Ｄ−２６３；SCHOTT社）を用いた。電極パターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してガラス板上にクロムをスパッタした後、さらに金をスパッタして、電極および端子を形成した。クロム薄膜の膜厚は５ｎｍ、金薄膜の膜厚は９５ｎｍである。クロム薄膜は、ガラス板表面と金薄膜との密着性を向上させる。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極のそれぞれの幅は１ｍｍ、長さは５ｍｍ、矩形電極間の間隔は０.５ｍｍである。

作製した上基板と下基板とをＵＶ硬化性接着剤を用いて貼りあわせて、検出チップを作製した。

３．測定
電極対に印加する電圧ならびにその周波数および波形を制御するべく、電圧印加部として交流電源供給装置（３３１２０Ａ；Hewlett-Packard社）を測定チップの端子に接続した。

抗ＴＳＨ抗体を固定化された担体粒子を試料液（３６０ｐＭ ＴＳＨ溶液）に加えて混合し、９０秒間室温で反応させた。混合液の量は９μＬ、混合液中の粒子の濃度は０.４重量％、混合液中のＴＳＨの濃度は３６ｐＭである。

反応後の混合液１μＬを検出チップの流路内に提供した。検出チップの電極対に交流電圧（２０Ｖ、１００ｋＨｚ）を１５秒間印加して、担体粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、倒立顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて流路内を透過光観察して、粒子の凝集率を求めた。透過光観察の際、各粒子が顕微鏡の焦点からずれることはなく、常に輪郭をはっきりと確認することができた。

粒子の凝集率は、以下の式により求めた。顕微鏡を用いて撮像した３枚の画像のそれぞれについて凝集率を算出し、その平均値を算出した。

凝集率（％）＝（他の粒子と会合した粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００

上記電圧印加、電圧印加の停止および凝集率の算出を１セットとし、７セット繰り返した。

また、比較例として、検出チップの電極対に交流電圧（２０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加し、電圧の印加を停止してから６０秒後に流路内を透過光観察して粒子の凝集率を求めた（１セットのみ）。

４．結果
図１０は、電圧の印加回数（セット数）と凝集率との関係を示すグラフである。横軸は電圧の印加回数（セット数）を示し、縦軸は凝集率を示している。黒丸は、３６ｐＭ ＴＳＨ溶液を試料液とした場合の結果を示し、白丸は、緩衝溶液（０Ｍ ＴＳＨ溶液）を試料液とした場合の結果を示す。図１０に示されるように、３６ｐＭＴＳＨ溶液を試料液とした場合、電圧の印加を繰り返すことにより、凝集率が上昇した。一方、緩衝溶液（０Ｍ ＴＳＨ溶液）を試料液とした場合は、電圧の印加を繰り返しても、凝集率はほとんど変化しなかった。このことから、電圧の印加を繰り返すことで、ＳＮ比が向上することがわかる。また、電圧を６回印加した場合と７回印加した場合とで、凝集率に大きな差は見られなかった。このことから、電圧の印加を７回以上繰り返しても凝集率はほとんど向上せず、電圧を印加する回数は、６回で十分であることがわかる。

表１は、本発明の検出方法（電圧印加：１５秒、４回）により求めた凝集率（実施例）と、従来の検出方法（電圧印加：６０秒、１回）により求めた凝集率（比較例）を示す。

表１に示されるように、１５秒間の電圧印加を４回繰り返したときの凝集率（６１．１％）は、６０秒間の電圧印加を１回繰り返したときの凝集率（４８.２％）よりも高い値となった。このことから、電圧の印加を繰り返すことで、粒子間の衝突確率が向上し、粒子間に抗原が存在する確率が高まったことが示唆される。

特許文献１に開示されているように、電圧の印加時間を長くすれば、パールチェーン化した粒子の数が増加し、凝集率が上昇することが知られている。しかしながら、上記の実験において、電圧の合計印加時間は、実施例（１５秒、４回）と比較例（６０秒、１回）とで同じ（６０秒）である。このことから、本発明の検出方法によるＳＮ比の向上は、パールチェーン化した粒子の数の増加による寄与よりも、粒子間の衝突確率の向上による寄与のほうが大きいことが示唆される。

以上のように、本発明の検出方法は、従来の検出方法よりもＳＮ比が優れている。また、本発明の検出方法は、ＴＳＨのような２価抗原であっても、ｐＭレベルの被検出物質を検出することができる。

本出願は、２００８年４月１４日出願の特願２００８−１０４４４５に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の検出方法および検出システムは、分子量の小さい２価抗原であってもサンドイッチ法により検出することができるため、被検出物質をより高感度に検出することができる。したがって、本発明の検出方法および検出システムは、例えば、血液や血漿を検体としてパルスイムノアッセイ法による検査を行う方法およびそれに用いる検出システムとして有用である。

従来の測定チップおよび測定装置の構成を示す図 従来の測定チップの流路部分を示す拡大図 認識物質が固定化された担体粒子の一例を示す模式図 交流電圧を繰り返し印加した際の担体粒子の状態を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 パールチェーン化した担体粒子が分散する様子を示す模式図 検出チップの一例を示す模式図 検出システムの構成の一例を示すブロック図 電圧の印加回数と凝集率との関係を示すグラフ

Claims (9)

1. 試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、
   生物学的特異的凝集反応により親和性物質に特異的に結合する認識物質がその表面に固定化されている担体粒子と、試料液とを含む混合液に交流電圧を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させるステップを有し、
   前記混合液は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、交流電圧を印加される、
   親和性物質の検出方法。
2. 前記第１の時間および前記第２の時間は、それぞれ１５〜６０秒である、請求項１に記載の検出方法。
3. 前記セットは、２〜６回繰り返される、請求項２に記載の検出方法。
4. 前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質がその表面に固定化されている第１の担体粒子と、前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている第２の担体粒子とを含む、請求項１に記載の検出方法。
5. 前記担体粒子は、前記親和性物質の第１の部分に特異的に結合する第１の認識物質、および前記親和性物質の第２の部分に特異的に結合する第２の認識物質がその表面に固定化されている、請求項１に記載の検出方法。
6. 前記担体粒子は、その表面に一種類の前記認識物質が固定化されており、
   前記親和性物質は、前記一種類の認識物質が特異的に結合する部分を２以上有する、
   請求項１に記載の検出方法。
7. 前記生物学的特異的凝集反応は、抗原抗体反応である、請求項１に記載の検出方法。
8. 前記生物学的特異的凝集反応は、核酸の二本鎖形成反応である、請求項１に記載の検出方法。
9. 試料液に含まれる親和性物質をパルスイムノアッセイ法で検出するシステムであって、
   流路および前記流路に電場を形成するための電極対を有する検出チップと、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段と、前記流路の情報を取得する検出手段とを有し、
   前記電圧印加手段は、第１の時間交流電圧を印加するステップおよび第２の時間交流電圧の印加を停止するステップからなるセットを複数回繰り返して、前記電極対に交流電圧を印加する、
   親和性物質の検出システム。

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