WO2004072109A1 - Gene de resistance a aphis gossypii - Google Patents

Gene de resistance a aphis gossypii Download PDF

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WO2004072109A1
WO2004072109A1 PCT/FR2004/000050 FR2004000050W WO2004072109A1 WO 2004072109 A1 WO2004072109 A1 WO 2004072109A1 FR 2004000050 W FR2004000050 W FR 2004000050W WO 2004072109 A1 WO2004072109 A1 WO 2004072109A1
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seq
polynucleotide
aphid
resistance
vat
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PCT/FR2004/000050
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Inventor
Catherine Dogimont
Abdelhafid Bendahmane
Michel Pitrat
Emilie Burget-Bigeard
Lynda Hagen
Aline Le Menn
Jérôme PAUQUET
Patrick Rousselle
Michel Caboche
Véronique CHOVELON
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Genoplante-Valor
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to new means of combating insect pests, and in particular against aphids.
  • insect pests In addition to the damage produced by the insects themselves, attack by these insects very often promotes the transmission and infection of plants by bacterial, viral or fungal diseases.
  • aphids also known as aphids
  • aphids are the most common.
  • There are more than 4000 species of which the most widespread are Myzus persicae and Aphis gossypii.
  • Aphids are extremely dynamic organisms, which adapt quickly to environmental conditions. This rapid adaptation is mainly due to the various reproductive strategies developed by aphids. Depending on climatic conditions, aphids reproduce sexually or asexually and are oviparous or viviparous. They may or may not be winged, thus facilitating their passage from one plant to another. Thanks to this great ability to adapt and reproduce, the total infestation of a crop in the field and a fortiori in the greenhouse is extremely fast. A single individual gives birth to a number of larvae between 40 and 100. The cotton aphid or melon Aphis gossypii is present in most regions of the world except the most northern.
  • the melon aphid has a wide spectrum of hosts (around 700 cultivated or wild plants, including around fifty in France). Among these, the most sensitive are cucurbits including, for example, melon, zucchini, cucumber, malvaceae like cotton or hibiscus and to a lesser extent solanaceae and rutaceae like citrus.
  • the melon aphid mainly colonizes the underside of the leaves, buds and young shoots.
  • the aphid By drawing nutrients from the phloem, the aphid diverts the resources of the plant and weakens it.
  • the colonized tissues become chlorotic, the leaves roll up on themselves and the yield of photosynthesis decreases.
  • the aphid secretes a honeydew very rich in sugars serving as a substrate for saprophytic fungi such as fùmagine which deposits a black veil on the leaf further reducing the photosynthesis capacities of the plant and causing a strong commercial depreciation of the affected vegetables and fruits.
  • saprophytic fungi such as fùmagine which deposits a black veil on the leaf further reducing the photosynthesis capacities of the plant and causing a strong commercial depreciation of the affected vegetables and fruits.
  • the aphid is a vector of many viruses which it introduces directly into the phloem of the plant when it bites the vessels.
  • Biological control consists in using natural predators and parasites with Aphis gossypii such as for example ladybugs, certain heminoptera or pathogenic fungi. However, it can only be used for greenhouse crops.
  • Vat locus favorable to resistance was introduced by crossing into different varieties of melon on the market; however, the creation of aphid-resistant varieties of melon by the usual varietal improvement techniques remains long and costly. It therefore appears desirable to precisely identify and clone the gene
  • Vat in particular to allow: - to transfer the Vat allele favorable to resistance, by transgenesis, to varieties of melon sensitive to Aphis gossypii, and also to other species sensitive to this aphid and for which no natural resistance has been detected, such as for example zucchini, cucumber or cotton; the allele of the V ⁇ t gene favorable to resistance can also be transferred into plant species sensitive to viral transmission by aphids, such as for example solanaceae, in particular tomatoes;
  • the V ⁇ t gene has been located on the V melon chromosome in the sub-telomeric position (PERIN et al., Theor Appl Genêt, 104, 1017-1034, 2002).
  • Several sequences homologous to resistance genes have been mapped in this region (KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001; BROTMAN et al., Theor. Api. Genêt. , 104, 1055-1063, 2002), which suggests that the V ⁇ t gene belongs to the NBS-LRR superfamily, of which a large number of resistance genes are currently cloned.
  • NBS-LRR nucleotide binding site
  • LRR leucine-rich repeat sequences
  • NBS-LRR homologous sequences have been observed to be linked to the V ⁇ t locus (KLLNGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001).
  • NBS-2, NBS46-7, NBS5a and NBS5b were located respectively at 4.75, 7.5, 10 and 11 cM of V ⁇ t; however, none of them co-aggregates with the V ⁇ t locus (BROTMAN et al., Theor. Appl. Genêt, 104, 1055-1063, 2002).
  • the inventors have constructed a BAC (bacterial artificial chromosome) bank from genomic melon DNA homozygous for the V ⁇ t allele favorable to resistance to Aphis gossypii and to resistance to viral transmission by this vector. At the same time, they defined markers more precisely framing the V ⁇ t locus than the markers known in the prior art. Screening of the BAC library using these markers made it possible to identify clones carrying the entire V ⁇ t locus.
  • Vat-like gene The sequence of this Vat-like gene is represented in the sequence list in the annex under the number SEQ ID NO: 4.
  • the cDNA sequence and the deduced polypeptide sequence are respectively represented in the annex under the numbers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • Figure 2 shows the sequence alignment between the Vat cDNA and the Vat-like cDNA.
  • Vat cDNA comprises 4,422 bp
  • Vat-like cDNA only comprises 4,233 bp due to a 195 bp deletion located between positions 3014 and 3210 of the Vat sequence and an addition of 6 bp located between positions 3649 and 3656 of the Vat-like sequence.
  • the Vat and Vat-like sequences have 92.4% identity between them.
  • FIG. 3 shows the alignment of the sequences of the deduced VAT and VAT-like proteins which consist respectively of 1473 amino acids and 1410 amino acids.
  • the VAT and VAT-like sequences show approximately 90% identity between them.
  • the Vat gene and Vat-like are genetically and physically linked (17 kb apart). Recombinant plants between Vat and Vat-like have been identified by genetic analysis. Plants carrying only the Vat-like gene are susceptible to colonization and transmission of viruses by A. gossypii. On the contrary, plants carrying only the Vat gene are resistant to colonization and transmission of viruses by A. gossypii. Therefore, the Vat gene is necessary and sufficient to confer the double phenotype described above.
  • the subject of the present invention is an isolated polynucleotide chosen from: a) a polynucleotide coding for a polypeptide involved in resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, which polypeptide has at least 80%, preferably at least at least 90% and most preferably at least 95% identity with the polypeptide SEQ ID NO: 3; b) a polynucleotide complementary to polynucleotide a); c) a polynucleotide capable of hybridizing selectively, under stringent conditions, with the polynucleotide a); or polynucleotide b).
  • the percentages of sequence identity indicated here for the nucleotide or peptide sequences refer to the value obtained, on a comparison window constituted by the entire reference sequence, with the BLAST software suite (ALTSCHUL et al. ., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) in using the default settings, on a comparison window consisting of the entire reference sequence
  • a polynucleotide "coding for" a given polypeptide is defined as any polynucleotide containing the genetic information allowing the synthesis of said polypeptide.
  • polynucleotides in accordance with the invention coding for a polypeptide involved in the resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid in particular include the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1 and the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also includes any fragment of at least 10 bp, preferably at least 20 bp, and most preferably at least 50 bp of a polynucleotide a) or b) above, or capable of selectively hybridizing, under stringent conditions, with a polynucleotide a) or b) above.
  • Preferred fragments are those of any of the polynucleotides of sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ED NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or those capable of hybridizing selectively under stringent conditions with one of these polynucleotides or its complement.
  • Other preferred fragments are those of any of the polynucleotides SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, which are not present in the polynucleotides SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or fragments which are capable of hybridizing selectively with one of the polynucleotides SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, without hybridizing with the polynucleotides SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • Stringent hybridization conditions for a given polynucleotide, can be identified by a person skilled in the art according to the size and the base composition of the polynucleotide concerned, as well as the composition of the hybridization mixture (in particular pH and ionic strength). Generally, stringent conditions, for a polynucleotide of given size and sequence, are obtained by operating at a temperature which is approximately 5 ° C. to 10 ° C. below the melting point (Tm) of the hybrid formed, in the same reaction mixture, by this polynucleotide and its complement.
  • Tm melting point
  • a polynucleotide capable of hybridizing selectively with a polynucleotide a) or b) according to the invention any polynucleotide which when hybridized under stringent conditions with a melon nucleic acid library (in particular a library of Genomic or cDNA) produces a detectable hybridization signal (i.e. at least 2 times higher, preferably at least 5 times higher than the background noise) with said polynucleotide, but produces no detectable signal with other sequences of said library, and in particular with sequences coding for other proteins of the NBS-LRR family.
  • the present invention also relates to polynucleotide probes or amplification primers obtained from polynucleotides a) or b) according to the invention or fragments thereof.
  • the present invention also encompasses any polynucleotide encoding a polypeptide involved in resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, and which can be obtained from a genomic DNA or plant cDNA library by screening said bank using probes or primers according to the invention.
  • the present invention also includes genetic markers enabling the detection of the presence or absence in a plant, and in particular in melons, of an allele of the Vat gene favorable to resistance to colonization by the aphid Aphis gossypii and / or resistance to viral transmission by said aphid.
  • Genetic markers in accordance with the invention include in particular the following markers: L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8, marker E, marker D.
  • the markers E and D are more particularly usable for differentiating the Vat and Vat-like genes in PI161375.
  • markers in accordance with the invention are respectively defined by the following primers: L273: F2-B2: GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO: 7)
  • F2-Br TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO: 8)
  • L246 F2-B2 Eco: ATTGATTCATCTACT SEQ ID NO: 9)
  • V681 GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO: 11)
  • V681R GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO: 12)
  • V588 CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO: 13)
  • V551R GAAGAAGGTGACGAGAGATGCC (SEQ ID NO: 14)
  • V432 AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15)
  • V432R TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO: 16)
  • GRP805 GRP805: ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO: 17)
  • GRP805R AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO: 18)
  • LRR842R CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ H> NO: 22)
  • LRR915 AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO: 23)
  • LRR1R GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO: 24)
  • Other genetic markers of resistance to aphid A gossypii and / or to viral transmission by said aphid can also be defined from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, by comparing these sequences with their homologs obtained from from plants sensitive to A. gossypii and / or to viral transmission by this aphid, in order to detect the polymorphisms existing between these sequences, and to determine the form associated with resistance and the form associated with sensitivity.
  • polymorphisms can be located in the coding regions of the Vat gene, and can result in modifications to the peptide sequence of the protein.
  • VAT can also be polymorphisms located in the non-coding 5 ′ region or in the introns of the Vat gene, or polymorphisms located in the coding regions but which do not result in a sequence modification of the VAT protein.
  • polymorphism When a polymorphism has been thus identified, it is possible to use it as a genetic marker of resistance or sensitivity, and to define tools (nucleic acid probes, amplification primers, restriction enzymes) making it possible to distinguish its different forms.
  • the present invention also encompasses the use of at least one polynucleotide or at least one genetic marker according to the invention for the detection of the presence, in a plant, of an allele of the Vat gene favorable to resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to resistance to viral transmission by said aphid.
  • the subject of the present invention is in particular a process for evaluating the resistance or the sensitivity of a plant to the aphid Aphis gossypii, and or to viral transmission by said aphid, characterized in that it comprises the determination of the allelic form of the Vat gene present in said plant.
  • the present invention also relates to oligonucleotide primers which can be used for the implementation of the detection methods defined above.
  • the subject of the present invention is:
  • any pair of primers allowing the amplification of a region of the Vat gene comprising at least one polymorphism associated with resistance or sensitivity to Aphis gossypii and / or viral transmission by said aphid;
  • kits for implementing a method according to the invention comprise at least one pair of primers in accordance with the invention, optionally associated with reagents allowing the implementation of an amplification reaction, with means for detecting the amplification product, with one or more enzymes. restriction, and / or positive controls and / or negative amplification controls.
  • the subject of the present invention is also:
  • an expression cassette comprising a polynucleotide in accordance with the invention, and in particular a polynucleotide coding for a polypeptide involved in the resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, placed under the transcriptional control of a promoter appropriate;
  • the present invention also encompasses a method for producing a recombinant polypeptide, characterized in that it comprises the transformation of a host cell, prokaryotic or eukaryotic, with a polynucleotide in accordance with the invention coding for a polypeptide involved in resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, and the recovery of said polypeptide produced by said cell.
  • the subject of the present invention is also a polypeptide involved in resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, which polypeptide has at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 95% identity with the polypeptide SEQ ID NO: 3, as well as fragments of at least 5, preferably at minus 10, and most preferably at least 15 consecutive amino acids of said polypeptide.
  • the present invention also encompasses host cells genetically transformed with a polynucleotide or an expression cassette in accordance with the invention.
  • Host cells can be eukaryotic or prokaryotic cells.
  • bacteria in particular E. coli or Agrobacterium, yeasts, for example Saccharomyces, animal cells or, preferably, plant cells.
  • the present invention also encompasses transgenic plants genetically transformed with a polynucleotide according to the invention.
  • the genetic transformation of plants with a polynucleotide in accordance with the invention makes it possible to obtain transgenic plants resistant to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid.
  • the present invention thus relates to the use of a polynucleotide in accordance with the invention, for increasing the resistance of a plant to the aphid Aphis gossypii.
  • a more particular subject of the present invention is therefore a process for the production of a transgenic plant resistant to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid, characterized in that it comprises the genetic transformation of said plant by a polynucleotide according to the invention.
  • Said plant is advantageously chosen from species sensitive to Aphis gossypii, in particular from cucurbits such as melon, cucumber or zucchini, or malvaceae such as cotton or hibiscus, or from species sensitive to viruses transmitted by A gossypii, especially among nightshades such as tomatoes or peppers.
  • overexpression of the Vat gene at a high level can lead to constitutive resistance of the plant against more varied pathogens in melons or in other plant species (cucurbits, solanaceae or malvaceae).
  • this over-expression can allow the plant to recognize aphids phylogenetically distant from Aphis gossypii or confer low constitutive resistance which will delay the infectious cycle of pathogens in general.
  • a strong promoter 35S
  • the genetic transformation of plants can be carried out by conventional methods known in themselves to those skilled in the art.
  • GUIS et al. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15, 289-311, 1998; Scientia horticulturae, 84, 91-99, 2000.
  • PANNETIER et al. Euphytica, 96, 163-166, 1997.
  • HAMZA and CHUPEAU J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993).
  • plants having increased resistance to the aphid Aphis gossypii and / or to viral transmission by said aphid can be obtained by site-directed mutagenesis, in order to introduce into the allele of the Vat gene present in said plants the modifications necessary to confer this resistance.
  • the invention also relates to the transformed plants obtained by a process of transgenesis or of directed mutagenesis according to the invention, as well as the descendants of these plants.
  • the invention also encompasses the products obtained from these plants, such as plant organs or tissues, cells, seeds, etc.
  • BAC bank of melon genomic DNA (variety PI 161375 resistant to Aphis gossypii and to viral transmission by this aphid) representing approximately 29 genome equivalents were constructed.
  • the first part of the BAC library comprises 66,048 clones (DNA digested with BamHI, HindIII), the second 56,448 clones (DNA digested with EcoR).
  • the marker L273 is defined by the primers: F2-B2: GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO: 7) and F2-Br: TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO: 8)
  • the amplification product obtained from genomic DNA from the Védrantais variety (Vilmorin) (sensitive to Aphis gossypii) or from the PI 161375 variety (accession of Korean origin multiplied by INRA) (resistant to A. gossypii) has a length of 210 bp.
  • the amplification product has a BsiWl restriction site in the PI 161375 variety, leading to the production of two fragments of 181 bp and 29 bp.
  • digestion by the enzyme BsrGl restricts the amplification of Védrantais into three fragments: 153 bp, 28 bp and 29 bp and that of PI 161375 into two fragments of 182 bp and 28 bp.
  • the L246 marker is defined by the primers:
  • F2-B2 Eco ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO: 9) and
  • the amplification product obtained from the genomic DNA of the Védrantais variety or of the PI 161375 variety is 173 bp long.
  • the amplification product of the variety PI 161375 has a restriction site for the enzyme EcoRV leading to the production of two fragments of 144 bp and 29 bp respectively.
  • oligonucleotides (Table 1) were designated in the region between these two markers in order to reduce the interval and precisely delimit the gene Vat.
  • the V432 marker is defined by the primers:
  • V432 AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15) and
  • V432R TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO: 16)
  • the amplification product obtained from the genomic DNA of the Védrantais variety or of the PI 161375 variety has a length of 432bp.
  • the amplification product of the variety PI 161375 has a restriction site for the Haell enzyme leading to the production of two fragments of 223 bp and 209 bp respectively. This restriction site is absent in the Védrantais variety.
  • the marker V681 is defined by the primers:
  • V681 GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO: 11) and
  • V681R GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO: 12)
  • the amplification product obtained from the genomic DNA of the Védrantais variety or of the PI 161375 variety has a length of 681 bp.
  • the amplification product of the variety PI 161375 has two restriction sites for the enzyme
  • the marker VI 684 is defined by the primers: V588: CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO: 13) and
  • V551R GAAGAAGGTGACGAGAGATGCC (SEQ ID NO: 14)
  • the amplified fragment in the Védrantais variety measures approximately 1300 bp while in the PI161375 variety, the amplifier measures 1684 bp. In this case, it is a large polymorphism.
  • markers as well as markers D, E, and M8 (cf. example 4 below) and the oligonucleotides defining them are indicated in Table 1 below:
  • the plant P26 64 presents a recombination event between the marker V432 and the Vat gene.
  • the plant P49 40 exhibits a recombination event between the marker L246 and the Vat gene.
  • Plant P10 35 exhibits a recombination event between marker VI 684 and the Vat gene.
  • marker VI 684 includes the ATG of the Vat gene, this plant exhibits an intragenic recombination destroying the function of the gene.
  • V681 marker co-segregates with the Vat gene. These data therefore make it possible to genetically identify the Vat gene.
  • a subcloning Vat gene was performed in the vector pGEM ® 3Zff (Promega). To do this, digestion of the clone BAC 3-18-9 with the restriction enzyme Mscl was carried out. Each fragment thus generated was ligated into the vector pGEM 3Zf + (Promega) and then screened with the markers flanking the Vat gene or internal to this gene.
  • the cDNA was obtained using the Marathon TM cDNA clone kit, (Clontech). This cDNA is represented on the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 2.
  • the Vat gene has 4 exons and 3 introns:
  • the first exon has 2367bp and extends from base 1 of the ATG initiation codon (corresponding to position 2344 according to SEQ ID NO: 1) to base 2367 (corresponding to position 4710 according to SEQ ID NO: 1).
  • the first intron extends from base 2368 to base 2921 (4711 to 5264 according to SEQ ID NO: 1).
  • the second exon extends from base 2922 to base 4055 (5265 to 6398 according to SEQ ID NO: 1).
  • the second intron extends from base 4056 to base 4876 (6399 to 7219 according to SEQ ID NO: 1).
  • the third exon extends from base 4877 to base 5734 (7220 to 8077 according to SEQ ID NO: 1).
  • the third intron extends from base 5735 to base 5833 (8078 to 8176 according to SEQ ID NO: 1).
  • the fourth exon extends from base 5834 to base 5896 (8177 to 8239 according to SEQ ID NO: 1).
  • F ⁇ t-like a clone carrying a homolog of the Vat gene (F ⁇ t-like) was identified (93.8% identity at the nucleic level and 89.9% at the protein level).
  • the F ⁇ t-like sequence is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 4.
  • Vat and Vat-like genes are genetically and physically linked since they are 17 kb apart.
  • Marker D is defined by the primers: LRR1: CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO: 21) and
  • LRR842R CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO: 22) This marker makes it possible to amplify in PI 161375 a fragment of 1722 bp corresponding to the Vat gene, and a fragment of 1527 bp corresponding to the Vat-like gene.
  • the amplification product obtained from the genomic DNA of the Védrantais variety has an agarose gel length of approximately 1.3 kb.
  • Marker D is defined by the primers: LRR915: AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO: 23) and LRR1R: GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO: 24)
  • This marker makes it possible to amplify in PI161375 a fragment of 1549 bp corresponding to the Vat gene and a fragment of 1372 bp corresponding to the Vat-like gene.
  • the marker makes it possible to amplify 4 DNA fragments of approximately 750 bp, 900 bp, 1100 bp, 1300 bp.
  • the markers L246 and M8 make it possible to characterize recombinants between the Vat gene and the Vat-like gene and to genetically distinguish these two genes.
  • the M8 marker is defined by the primers: M8: CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO: 19) and
  • the amplification product obtained from genomic DNA of the Védrantais variety and PI 161375 has a length of 228 bp.
  • the amplification product of the variety PI 161375 has a restriction site for the enzyme Aatll leading to the production of two fragments of 195 bp and 33 bp respectively.
  • Vat and Vat-like genes have been identified within the backcross population [FI (Védrantais x PI 16135) x Védrantais]. Plants carrying only the Vat-like gene are sensitive to Aphis gossypii, for example, plant 848 (Table 2). Conversely, plants not having the Vat-like gene are resistant to A. gossypii aphids, for example the plant P4940 (Table 2).
  • the genomic DNA of the Vat gene without its promoter is introduced into the binary vector pBin 61 (BENDAHMANE et al, The Plant Journal 32, 195-204, 2002; sequence also available on the site http: //www.sainsbury-laboratory. ac.uk/david-baulcombe / Services / pBin ⁇ l.doc) containing in particular the chimeric NOS / NPTII gene, the kanamycin resistance selection marker and the p35S promoter.
  • the Vat gene in sense orientation is introduced after the p35S promoter.
  • the vector pBin ⁇ l is introduced into different strains of Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, C58Cl-pch32)
  • the complete genomic DNA comprising approximately 2.5 kb upstream and downstream of the Vat gene in order to ensure the presence of the promoter and regulatory sequences, is introduced with blunt ends into the vector SLJ7292 (JONES and a , Transgenic Research, 1, 285-30297, 1992) and pBin 19 (BEVAN et a, Nucleic Acids Res 12: 8711-8721, 1984).
  • the binary vectors SLJ7292 and pBin 19 containing the Vat gene are introduced into different strains of Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, C58Cl-pch32, C58Cl-pMP90) (SCHWEITZER et al, Plasmid, 4 (2), 196-204, 1980; GOODNER and al, Science, 294 (5550), 2323-2328, 2001), or C58pGV2260 (DEBLAERE. et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985).
  • Table 3 shows the constructions used depending on the plants.
  • Young explants of sensitive melon leaves of the Védrantais variety are incubated with shaking in a suspension of Agrobacterium tumefaciens (10 6 to 10 8 cells / mL), for 30 minutes.
  • the transformations are carried out with the constructions described in Example 5.
  • the potentially transformed explants are then transferred to Whatman paper No. 1 for 10 minutes, then incubated for 2 days at 27 ° C. in the dark on a coculture medium containing l ⁇ M of 6-benzylaminopurine (BAP), l ⁇ M of 6- (g, g- dimethylallylamino) -purine (2iP), 0.2mM of acetosyringone and 0.7g.L _1 of agar.
  • BAP 6-benzylaminopurine
  • 2iP l ⁇ M of 6- (g, g- dimethylallylamino) -purine
  • the regeneration of leaf explants is obtained using the conditions described by KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7, 449-451, 1988) with some modifications.
  • the leaf explants are transferred to a regeneration medium composed of MURASHIGE and SKOOG medium (MS) (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962) supplemented with 1 ⁇ M of 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ⁇ M of 6- (g, g-dimethylallylamino) -purine (2iP), containing 100 mg.L "1 of kanamycin and 225 mg.L _1 of timentin and solidified in agar 0.7g.L _1 .
  • the buds formed on the leaf explants are excised and incubated on a development medium constituted by the MS medium supplemented with 1 ⁇ M of BAP and 0.3 ⁇ M of gibberelic acid (GA3) containing 100 mg.L "1 of kanamycin and 225 mg.L _1 of timentin and solidified in 0.7g.L 'of agar.
  • the buds are then placed in the rooting medium constituted by the MS medium without growth regulator and containing the same amounts of antibiotics and agar.
  • the PCR conditions are as follows:
  • Reaction mixture water qs lO ⁇ L; 10X l ⁇ L buffer; dNTP's (4mM) 0.6 ⁇ L; primer 1 (10 pM) 0.4 ⁇ L and primer 2 (10 pM) 0.4 ⁇ L; Taq Takara (5U / ⁇ L) 0.08 ⁇ L; DNA 1.2 ⁇ L.
  • step 1 2 min at 94 ° C step 2 denaturation: 30 sec at 94 ° C step 3 pairing: 45 sec at 60 ° C step 4 elongation: 2 min at 72 ° C step 5: 30 cycles from step 2 to step 4 step 6: 10 min at 72 ° C b-
  • step 1 2 min at 94 ° C step 2 denaturation: 30 sec at 94 ° C step 3 pairing: 45 sec at 60 ° C step 4 elongation: 2 min at 72 ° C step 5: 30 cycles from step 2 to step 4 step 6: 10 min at 72 ° C b-
  • Kana II 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3 '(SEQ ID NO: 25) and Kana III: 5'-GCGATAGAAGGCGATGCG-3' (SEQ ID NO: 26) are used under the following conditions:
  • step 1 2 min at 94 ° C step 2 denaturation: 30 sec at 94 ° C step 3 pairing: 1 min at 53 ° C step 4 elongation: 1 min at 72 ° C step 5: 30 cycles from step 2 to step 4 step 6: 10 min at 72 ° C.
  • step 2 2 min at 94 ° C step 2 denaturation: 30 sec at 94 ° C step 3 pairing: 1 min at 53 ° C step 4 elongation: 1 min at 72 ° C step 5: 30 cycles from step 2 to step 4 step 6: 10 min at 72 ° C.
  • PicA + primers ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG; SEQ ID NO : 27
  • PicA " GCGCAACGCATCCTCGATCAGCT; SEQ ID NO: 28
  • construction B1-1 are identified as carriers of the insert containing the nptll and Vat genes.
  • the rooted diploid plants are cuttings in vitro on medium devoid of antibiotics, then weaned and acclimatized in an air-conditioned room (8h night at 18 ° C-16h day at 24 ° C) for 4 weeks before carrying out the biological tests.
  • Nml clone collected from melons G. LABONNE, INRA, Montpellier
  • clone 13 LUPOLI et al, Entomologia Experimentalis and Applicata, 65, 291-300, 1992
  • Aphids A. gossypii are reared on Védrantais melons in a culture chamber (16 hours of day at 24 ° C and 8 hours of night at 18 ° C).
  • the colonization resistance test by A. gossypii is adapted from PITRAT and LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Wingless adults are removed with a fine brush and fasted for 1 hour in a petri dish. Ten aphids are placed on two spread sheets of each plant to be tested. 48 hours after deposit, the number of aphids attached to the leaves is counted. At 48 hours, on susceptible plants the 10 deposited aphids are fixed while on resistant plants only a few aphids (generally less than 5) remain on the leaves. Then 7 days after infestation, the number of adult aphids and larvae, as well as their stage of development is observed.
  • the sensitive control used is the Védrantais cultivar and the resistant control is the cultivar Margot homozygous for the Vat locus.
  • 3 aphids can be placed instead of 10 on the leaves of each plant to be tested. Aphids can be kept in a cage or not. Seven days after the aphids were deposited, the number of adult aphids and larvae present on the plants were counted.
  • CMV Cucumber Mosaic Virus
  • strain II 7F can be used for transmission tests by A. gossypii in transformed plants and Védrantais and Margot control lines. The virus is multiplied on Védrantais melons by mechanical inoculation. After 1 hour lunch, the adult aphids are deposited for 5 minutes of acquisition on the virose leaves placed in a Petri dish. The aphids are then transferred to the plants to be tested.
  • the aphids are removed with a brush and then the plants are treated with an insecticide and placed in a culture chamber (12 hours of day at 24 ° C and 12 hours of night at 18 ° C). Fifteen days after inoculation, plants sensitive to CMV transmission by A. gossypii develop severe mosaic symptoms. Resistant plants have no symptoms and the virus is not detected by ELISA in these plants.
  • the ELISA test follows the protocol described by CLARK and ADAMS (J. Gen. Virol, 34, 475-483, 1977) with an antibody directed against the capsid protein of CMV (ADGEN, supplied by the company LCA, Bordeaux, France) .
  • the transformation protocol is adapted from HAMZA and CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993) by P. Rousselle (INRA, Montfavet, France) from cotyledons of several Férum genotypes (INRA line), and Montfavet 63.5 (FI hybrid).
  • the strains used for the transformation are those described in Example 5.
  • the regenerated and rooted plants are analyzed by flow cytometry and only the diploid plants are preserved. Molecular analyzes intended to verify the presence of
  • Pinsert containing the nptll gene and the Vat gene as well as its expression in the genome of the regenerated plants are carried out by PCR and RT-PCR.
  • the PCR conditions used are identical to those described in Example 6.
  • Four pairs of primers were used: V1684 (SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14) located at the level of the Vat promoter, the pairs of primers markers D (SEQ ID No 23 and SEQ ID No 24) and E (SEQ ID No 21 and SEQ ID No 22) located in the middle of the Vat gene and primers V632 which amplify a fragment located 3 'to the uncomfortable.
  • V632 primers are as follows: Vat 632R: CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO: 29) Vat 632F: CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO: 30) Several series of transformations are carried out on tomatoes from the different constructions (Table 8) and on two different genotypes Ferum and Montfavet (INRA).
  • Vat gene including the marker V1684.
  • V1684 (located on a region of the Vat promoter) does not make it possible to screen the transformants.
  • the set of primers used on the transformed plants of the Montfavet genotype makes it possible to determine 14 plants coming from different explants having integrated all of the transgene.
  • the same strain of A. gossypii (Nml) and the same transmission protocol by A. gossypii as for tests for resistance to transmission of the virus to melon are used.
  • the virus chosen is the CMV (cucumber mosaic virus) strain II 7F which infects melons and tomatoes. This strain is effectively transmitted to the tomato, when it is inoculated mechanically or transmitted by Myzus persic ⁇ e (JACQUEMOND et ⁇ /., Molecular Breeding, 8 (1), 85-94, 2001).
  • the virus is multiplied on Védrantais melon seedlings.
  • the acquisition of CMV by A. gossypii is made on these infected melon seedlings.
  • Transmission is done on tomato seedlings from in vitro at the 5 leaf stage or on seedlings from sowing at the 2 leaf stage (about 5 weeks after sowing) by depositing 10 viruliferous aphids on each plant.
  • the transmission rate on each genotype (control and transformed tomatoes) is evaluated on at least 2 repetitions of 20 plants.
  • the sensitive control variety is the Ferum variety.
  • the ELISA test follows the protocol described by CLARK and AD AMS (J. Gen. Virol., 34, 475-483, 1977) with an antibody directed against the capsid protein of CMV (ADGEN, supplied by the company LCA, Bordeaux, France).
  • the plants of the T1 code, carrying a truncated Vat gene, and those of the sensitive control are 100% infected.
  • the virus was not transmitted, which suggests that the Vat gene would have an effect on resistance to viral transmission by A. gossypii in transgenic tomatoes having integrated Vat.
  • the genetic transformation of cotton is based on the regeneration of transformants via a somatic embryogenesis process published by SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3, 178-181, 1986) and by TROLINDER and GOODIN (Plant Cell Reports, 6, 231-234, 1987).
  • This transformation process uses the bacterium Agrobacterium tumefaciens as a transformation vector according to UMBECK et al. (Biotechnology, 5, 263-266, 1987) and FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10, 105-116, 1987) with some modifications and adaptations compared to the publications mentioned.
  • the Agrobacteria strains used for the transformation are the same as those described in Example 5 and in particular the LBA4404, C58ClpGV2260 and C58ClpMP90 strains.
  • the first strain contains either the plasmid pSLJ7292 composed inter alia of the kanamycin resistance gene under the control of the Nos promoter and the Vat gene under the control of its own promoter, namely the plasmid pBin 61 which comprises the Vat gene under the control of the 35S promoter.
  • the other two strains carry the plasmid pBin19 composed, inter alia, of the kanamycin resistance gene under the control of the Nos promoter and the Vat gene under the control of its own promoter.
  • Explants of hypocotyls taken from young plants cultivated under aseptic conditions are used. They are placed in the presence of the Agrobacterium for 20 minutes then cultured for 48 hours on a culture medium (base medium) composed of the mineral elements of MURASHIGE and SKOOG (MS), 30 g L "1 of glucose, the vitamins from MOREL and WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143, 1951), 0.1 to 0.05 mg L "1 of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid and 0.1 to 0.01 mg L " 1 of kinetin. This medium contains no selection agent or antibiotic intended to stop the growth of the bacteria.
  • base medium composed of the mineral elements of MURASHIGE and SKOOG (MS), 30 g L "1 of glucose, the vitamins from MOREL and WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143, 1951), 0.1 to 0.05 mg L "1 of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid and 0.1 to 0.01 mg L " 1 of kinetin.
  • This medium contains
  • the explants are subcultured on the same medium supplemented with kanamycin at a concentration of 25 mg L " 1 and cefotaxime at a concentration of 500 mg L "1.
  • the explants are then subcultured every 15 days on this same medium. Calluses resulting from the proliferation of transformed cells appear after 3 to 5 weeks of culture. When their size reaches approximately 0.5 cm in diameter, they are isolated and transplanted onto the same medium in which the cefotaxime concentration has been reduced by half and the concentration of growth substances (2,4 dichlorophenoxyacetic acid and kinetin) has also been reduced.
  • the subcultures then take place every 2 weeks until the appearance of the embryonic tissues.
  • sequences of media varying for the concentration of growth substances can be applied.
  • the embryonic tissues are isolated from the base medium without the addition of growth substances. On this medium a certain proportion of the pro-embryos develops into seedlings. The latter are transferred into a tube on a vermiculite support "sprinkled" by the liquid base medium devoid of growth substances and where sucrose replaces glucose. When they reach a size of around 4-6 cm, they are directly transferred to the S2 greenhouse.
  • the molecular analysis intended to verify the presence of the Vat gene and its expression in the genome of the regenerated plants is carried out by PCR.
  • a pair of primers is used to amplify the npt IL gene
  • Two pairs of primers were used for the Vat gene: the first pair called 632 amplifies a fragment of Vat located 3 ′ of the gene, the second called LRR amplifies a fragment located in the middle of the gene.
  • sequences of the pair of primers used to amplify the npt11 gene are as follows:
  • the sequences of the primer pair 632 are as follows: Vat632F: CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO: 30) Vat632R: CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO: 29) The sequences of the LRR primer pair are as follows:
  • LRR F GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC (SEQ ID NO: 32)
  • LRR R CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC (SEQ ID NO: 33)
  • the PCR conditions are as follows, whatever the primers used: For 25 ⁇ L of reaction medium:
  • Oligo 1 (10 ⁇ M): 2.5 ⁇ L Oligo 2 (10 ⁇ M) 2.5 ⁇ L
  • a clone of A. gossypii taken from cotton (Reunion Island origin) is used and maintained on cotton. Indeed, it has been shown that populations ⁇ 'A. gossypii are strongly structured genetically according to the host plant (VANLERBERGHE-MASUTTI and CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7, 905-914, 1998). The test is carried out according to the same protocol as on melon but with plant culture conditions suitable for cotton. Cotton plants are kept in greenhouse type S2 at a temperature of 28 ° C to 30 ° C, additional lighting, in intensity and duration, is provided for a photoperiod of 12-12.

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Abstract

La présente invention est relative au clonage du gène Vat intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi qu'à l'identification de nouveaux marqueurs de ce gène.

Description

GENE DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII La présente invention est relative à de nouveaux moyens de lutte contre les insectes ravageurs, et notamment contre les pucerons.
Les insectes ravageurs constituent une des préoccupations majeures en agriculture. Outre les dégâts produits par les insectes eux-mêmes, l'attaque par ces insectes favorise très souvent la transmission et l'infection des plantes par des maladies bactériennes, virales ou fongiques.
Parmi les ravageurs, les pucerons (également dénommés aphides) sont les plus courants. Il en existe plus de 4000 espèces dont les plus répandues sont Myzus persicae et Aphis gossypii.
Chaque espèce possède un cycle de vie particulier et un ensemble d'hôtes privilégiés. Les aphides sont des organismes extrêmement dynamiques, qui s'adaptent rapidement aux conditions environnementales. Cette rapide adaptation est essentiellement due aux diverses stratégies reproductives développées par les aphides. Selon les conditions climatiques, les aphides se reproduisent par voie sexuée ou asexuée et sont ovipares ou vivipares. Ils peuvent ou non être ailés, facilitant ainsi leur passage d'une plante à une autre. Grâce à cette grande faculté d'adaptation et de reproduction, l'infestation totale d'une culture en plein champ et a fortiori en serre est extrêmement rapide. Un seul individu donne naissance à un nombre de larves compris entre 40 et 100. Le puceron du cotonnier ou du melon Aphis gossypii est présent dans la plupart des régions du monde à l'exception des plus septentrionales. Il est capable d'effectuer un cycle complet de développement et de se reproduire en moins d'une semaine. Grâce à ses facultés d'adaptation et de reproduction, un grand nombre de générations peut être produit en une saison quelles qu'en soient les conditions climatiques. Le puceron du melon a un large spectre d'hôtes (environ 700 plantes cultivées ou sauvages dont une cinquantaine en France). Parmi celles-ci, les plus sensibles sont les cucurbitacées dont par exemple le melon, la courgette, le concombre, les malvacées comme le cotonnier ou l'hibiscus et dans une moindre mesure les solanacées et les rutacées comme les agrumes. Le puceron du melon colonise principalement la face inférieure des feuilles, les bourgeons et jeunes pousses. En puisant dans le phloème ses éléments nutritifs, le puceron détourne les ressources de la plante et l'affaiblit. Les tissus colonisés deviennent chlorotiques, les feuilles s'enroulent sur elles même et le rendement de la photosynthèse diminue. Le puceron sécrète un miellat très riche en sucres servant de substrat à des champignons saprophytes comme la fùmagine qui dépose un voile noir sur la feuille réduisant encore les capacités de photosynthèse de la plante et provoquant une forte dépréciation commerciale des légumes et des fruits atteints. De surcroît, le puceron est un vecteur de nombreux virus qu'il introduit directement dans le phloème de la plante lorsqu'il en pique les vaisseaux.
La lutte chimique est actuellement encore la plus répandue. Elle présente toutefois de nombreux inconvénients. Les produits utilisés ont fréquemment un spectre d'action large, et détruisent en même temps que les pucerons les insectes bénéfiques. Les risques de pollution de l'environnement sont également importants : les aphicides font en effet partie des produits les plus toxiques pour l'homme, la faune utile et l'environnement (Recueil des effets non intentionnels des produits phytosanitaires, Acta 1998, 256p, BERGER et VAN HOLST, 2001, environ. Sci. Pollut. Res. Int., 8, 109-112). Par ailleurs, le puceron Aphis gossypii a développé dans certaines régions des résistances aux composés chimiques employés comme les organophosphates, les carbamates, les pyrethroïdes et organochlorés (LARRY et al. the Journal of Cotton Science, 5, 22-29, 2001 ; DELORME Pesticide Science, 49, 90-96, 1997).
La lutte biologique consiste à utiliser les prédateurs et parasites naturels à Aphis gossypii comme par exemple les coccinelles, certains héminoptères ou les champignons pathogènes. Elle n'est toutefois utilisable que pour les cultures sous serre.
Une autre approche repose sur la recherche de variétés naturellement résistantes aux pucerons, et sur leur utilisation pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides. Des variétés résistantes aux pucerons ont ainsi été trouvées notamment chez le blé, le pommier, le pois fourrager, la laitue, la tomate, etc...
Chez le melon (Cucumis melo), l'existence d'un locus dominant conférant une résistance au puceron Aphis gossypii, a été découverte chez des lignées de melons originaires d'Extrême-Orient ou d'Inde. Ce locus, qui a été dénommé Ag (pour Aphis gossypii Résistance) ou Vat (pour Virus Aphid Transmission Résistance) confère un double phénotype de résistance : une résistance à l'infestation de la plante par Aphis gossypii, et une résistance à la transmission par ce puceron des virus dont il est le vecteur (KISHABA et al., J. Econ. Entomol., 64, 935-937, 1971 ; BOHN et al., J. Amer. Soc. Hort. Science, 98, 37-40, 1973 ; LECOQ et al., Phytopathology, 69, 1223-1225, 1979 ; PITRAT et LECOQ, Phytopathology, 70, 958-961, 1980).
Le locus Vat favorable à la résistance a été introduit par croisement dans différentes variétés de melon commercialisées ; cependant, la création de variétés de melon résistantes aux pucerons par les techniques usuelles d'amélioration variétale demeure longue et coûteuse. II apparaît donc souhaitable d'identifier précisément et de cloner le gène
Vat, afin de permettre notamment : - de transférer l'allèle Vat favorable à la résistance, par transgenèse, à des variétés de melon sensibles a Aphis gossypii, et également à d'autres espèces sensibles à ce puceron et pour lesquelles aucune résistance naturelle n'a été détectée, telles que par exemple la courgette, le concombre ou le cotonnier ; l'allèle du gène Vαt favorable à la résistance peut aussi être transféré dans des espèces de plantes sensibles à la transmission virale par les pucerons, comme par exemple les solanacées, notamment la tomate ;
- de rechercher des orthologues du gène Vαt chez d'autres espèces que le melon ;
- de définir de nouveaux marqueurs, utilisables notamment dans le cadre des techniques classiques de sélection variétale, pour faciliter l'identification de variétés résistantes, et/ou le suivi de l'introgression du caractère de résistance dans des variétés d'intérêt agronomique.
Le gène Vαt a été localisé sur le chromosome V du melon en position sub-télomérique (PERIN et al., Theor Appl Genêt, 104, 1017-1034, 2002). Plusieurs séquences homologues à des gènes de résistance ont été cartographiées dans cette région (KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001 ; BROTMAN et al., Theor. Api. Genêt., 104, 1055-1063, 2002), ce qui permet de supposer que le gène Vαt appartient à la superfamille des NBS-LRR, dont font partie un grand nombre de gènes de résistance actuellement clones. Cette superfamille regroupe des gènes contenant un site de liaison à un nucléotide (NBS pour nucleotide binding site) et des séquences répétées riches en leucine (LRR pour leucine-rich repeats). Il a été observé que des séquences homologues à des NBS-LRR étaient liées au locus Vαt (KLLNGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56- 63, 2001). Parmi ces homologues de gènes de résistance, NBS-2, NBS46-7, NBS5a et NBS5b ont été localisés respectivement à 4,75, 7,5, 10 et 11 cM de Vαt ; cependant, aucune d'entre elles ne coségrège avec le locus Vαt (BROTMAN et al., Theor. Appl. Genêt, 104, 1055-1063, 2002).
Les Inventeurs ont construit une banque BAC (bacterial artificial chromosome) à partir d'ADN génomique de melon homozygote pour l'allèle Vαt favorable à la résistance à Aphis gossypii et à la résistance à la transmission virale par ce vecteur. Ils ont parallèlement défini des marqueurs encadrant plus précisément le locus Vαt que les marqueurs connus dans l'art antérieur. Le criblage de la banque BAC à l'aide de ces marqueurs a permis d'identifier des clones portant la totalité du locus Vαt.
Le sous-clonage de l'un de ces clones a permis d'obtenir un fragment d'ADN génomique de 11000 pb environ contenant le gène Vαt. La séquence de ce fragment est représentée sur la Figure 1 (les 4 exons sont surlignés en gris et les 3 introns sont soulignés), ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ LD NO: 1. La séquence de l'ADNc correspondant a également été obtenue et la séquence polypeptidique correspondante a été déterminée. Ces séquences d'ADNc et polypeptidique sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3. Un paralogue du gène Vat, ci-après dénommé Vat-like a également été isolé à partir de la banque BAC. La séquence de ce gène Vat-like est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique déduite sont respectivement représentées en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6. La Figure 2 montre l'alignement de séquence entre l'ADNc de Vat et l'ADNc de Vat-like. L'ADNc de Vat comprend 4422 pb alors que l'ADNc de Vat-like ne comprend que 4233 pb du fait d'une délétion de 195 pb localisée entre les positions 3014 et 3210 de la séquence de Vat et d'une addition de 6 pb localisée entre les positions 3649 et 3656 de la séquence de Vat-like. Les séquences de Vat et Vat-like présentent 92,4% d'identité entre elles.
La Figure 3 montre l'alignement des séquences des protéines VAT et VAT-like déduites qui se composent respectivement de 1473 acides aminés et 1410 acides aminés. Les séquences de VAT et VAT-like présentent environ 90% d'identité entre elles. Le gène Vat et Vat-like sont liés génétiquement et physiquement (séparés de 17 kb). Des plantes recombinantes entre Vat et Vat-like ont été identifiées par analyse génétique. Les plantes portant uniquement le gène Vat-like sont sensibles à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypii. Au contraire, les plantes portant uniquement le gène Vat sont résistantes à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypii. Donc, le gène Vat est nécessaire et suffisant pour conférer le double phénotype décrit précédemment.
La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques ou peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référença
On définit comme polynucléotide « codant pour » un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide.
Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, comprennent notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 et le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2. La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux d'un quelconque des polynucléotides de séquence SEQ ID NO: l, SEQ ED NO: 2, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un de ces polynucléotides ou son complémentaire. D'autres fragments préférés sont ceux de l'un quelconque des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, qui ne sont pas présents dans les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5, ou des fragments qui sont capables de s'hybrider sélectivement avec l'un des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sans s'hybrider avec les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybride en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de melon (notamment une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres protéines de la famille NBS-LRR. La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention ou des fragments de ceux-ci.
La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention.
Ceci inclut notamment d'autres allèles du gène Vat de melon, et notamment d'autres allèles capables de conférer une résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi que des orthologues du gène Vat chez des plantes autres que le melon, notamment chez d'autres cucurbitacées telles que la courgette et le concombre, et de manière plus générale chez des plantes susceptibles d'être infectées par Aphis gossypii (par exemple des malvacées comme le cotonnier) et/ou sensibles à la transmission virale par ledit puceron (par exemple des solanacées comme la tomate).
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, et notamment chez le melon, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance à la colonisation par le puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, comprennent notamment les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D.
Les marqueurs E et D sont plus particulièrement utilisables pour différencier les gènes Vat et Vat-like chez PI161375.
Ces marqueurs sont utilisables notamment chez les cucurbitacées, en particulier le melon. Ils peuvent également être utilisés chez d'autres plantes, par exemple des malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus ou des solanacées telles que la tomate. Les marqueurs conformes à l'invention sont respectivement définis par les amorces suivantes : L273 : F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) L246 : F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11)
V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
VI 684 :
V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) V551R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
V432 :
V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
GRP805 : GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17)
GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18)
M8 :
M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID O : 19)
M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E :
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21)
LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ H> NO : 22)
Marqueur D :
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à partir des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypii et/ou à la transmission virale par ce puceron, afin de détecter les polymorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la forme associée à la résistance et la forme associée à la sensibilité.
Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène Vat, et se traduire par des modifications de la séquence peptidique de la protéine
VAT. Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène Vat, ou de polymorphismes situés dans les régions codantes mais ne se traduisant pas par une modification de séquence de la protéine VAT.
Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes.
La présente invention englobe également l'utilisation d'au moins un polynucléotide ou d'au moins un marqueur génétique conforme à l'invention pour la détection de la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypii, et ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène Vat présente chez ladite plante.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en œuvre des méthodes de détection définies ci-dessus. En particulier la présente invention a pour objet :
- tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène Vat comprenant au moins un polymorphisme associé à la résistance ou la sensibilité à Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron ;
- tout couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs L273, L246, V681, VI 684, V432, GRP805, M8, marqueur E, ou marqueur D, mentionnés ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention a aussi pour objet :
- une cassette d'expression comprenant un polynucléotide conforme à l'invention, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
- un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule.
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3, ainsi que des fragments d'au moins 5, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 15 acides aminés consécutifs dudit polypeptide. La présente invention englobe aussi des cellules-hôtes génétiquement transformées par un polynucléotide ou une cassette d'expression conforme à l'invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines recombinantes, sont utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée.
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide conforme à l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques résistantes au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour augmenter la résistance d'une plante au puceron Aphis gossypii. La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé de production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation génétique de ladite plante par un polynucléotide conforme à l'invention.
Ladite plante est avantageusement choisie parmi les espèces sensibles à Aphis gossypii, notamment parmi les cucurbitacées telles que le melon, le concombre ou la courgette, ou les malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus, ou parmi les espèces sensibles aux virus transmis par A. gossypii, notamment parmi les solanacées telles que la tomate ou le piment.
En outre, la sur-expression du gène Vat à un niveau élevé peut conduire à une résistance constitutive de la plante contre des agents pathogènes plus variés chez le melon ou dans d'autres espèces végétales (cucurbitacées, solanacées ou malvacées). Par exemple, cette sur-expression peut permettre à la plante de reconnaître des pucerons phylogénétiquement éloignés de Aphis gossypii ou de conférer une résistance constitutive faible qui retardera le cycle infectieux des agents pathogènes en général. Pour cela, on peut produire des plantes transgéniques qui expriment le gène Vat sous contrôle d'un promoteur fort (35S) et donc qui l'exprimeront à un niveau supérieur à celui qu'il a lorsqu'il est sous contrôle de son propre promoteur. Cependant, il faudra nécessairement contrôler l'expression du gène à son plus juste niveau afin d'éviter des effets néfastes sur la biologie de la plante (mort cellulaire par exemple).
La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les méthodes classiques connues en elles-mêmes de l'homme du métier. A titre d'exemples non limitatifs, pour la transformation des cucurbitacées et notamment du melon, on pourra utiliser les techniques décrites par GUIS et al. (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15, 289-311, 1998 ; Scientia horticulturae, 84, 91-99, 2000). Pour la transformation du cotonnier on pourra utiliser les techniques décrites par PANNETIER et al. (Euphytica, 96, 163-166, 1997). Pour la transformation de la tomate, il est possible d'utiliser les protocoles décrits par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993).
Alternativement, des plantes possédant une résistance accrue au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, peuvent être obtenues par mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle du gène Vat présent chez lesdites plantes les modifications nécessaires pour conférer cette résistance.
Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la présente invention sont connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; elles sont par exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds INRA 1999).
L'invention concerne également les plantes transformées obtenues par un procédé de transgenèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la définition de marqueurs associés au gène Vat, le clonage de ce gène et l'utilisation dudit gène pour obtenir des plantes résistantes au puceron A. gossypii et/ou à la transmission virale.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DU GENE VAT PAR UNE APPROCHE GENETIQUE :
- Création de la banque BAC Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375 résistante à Aphis gossypii et à la transmission virale par ce puceron) représentant environ 29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC comporte 66048 clones (ADN digéré par BamHI, HindlII), la seconde 56448 clones (ADN digéré par EcoR ).
- Criblage de la banque BAC et choix du clone BAC porteur du locus Vat Afin d'identifier le clone porteur du gène Vat, la banque a été criblée à l'aide de marqueurs flanquant le locus Vat. Plusieurs clones BAC couvrant le locus Vat ont été identifiés et ordonnés. A partir de ces clones BAC de nouveaux marqueurs ont été générés. Le clone BAC 3.18.9 porteur d'une insertion de 170 kb comprenant le locus Vat a été choisi pour l'identification du gène Vat et séquence. Ce clone comprend les marqueurs L273 et L246 encadrant le locus Vat. Dix plantes recombinantes sur 6000 plantes issues d'une population backcross [(Védrantais(sensible) x PI 161375 (résistant)) x Védrantais] ont été identifiées entre le marqueur L273 et le gène Vat, alors qu'une seule a été identifiée entre le marqueur L246 et le gène Vat. Le marqueur L273 est défini par les amorces: F2-B2 :GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) et F2-Br :TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8)
Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypii) ou de la variété PI 161375 (accession d'origine coréenne multipliée par l'INRA) (résistante à A. gossypii) a une longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction BsiWl dans la variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29 pb. En revanche, la digestion par l'enzyme BsrGl restreint l'amplifiât de Védrantais en trois fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de 182 pb et 28 pb.
Le marqueur L246 est défini par les amorces:
F2-B2 Eco:ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) et
F2 Eco:GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme EcoRV conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
A partir du clone BAC 3-18-9 possédant les deux marqueurs L273 et L246, des oligonucléotides (Tableau 1) ont été désignés'dans la région comprise entre ces deux marqueurs afin d'en réduire l'intervalle et de délimiter précisément le gène Vat. Le marqueur V432 est défini par les amorces:
V432:AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15) et
V432R:TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme Haell conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb. Ce site de restriction est absent chez la variété Védrantais. Le marqueur V681 est défini par les amorces :
V681: GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) et
V681R: GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour l'enzyme
Rsal conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221 pb et 25 pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le marqueur VI 684 est défini par les amorces : V588 :CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) et
V551R :GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiât mesure 1684 pb. Il s'agit dans ce cas, d'un polymorphisme de taille.
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci- dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après :
Tableau 1
Figure imgf000014_0001
Des combinaisons de ces oligonucléotides (Tableau 2) ont été utilisées pour amplifier l'ADN de plantes backcross issues du croisement [FI (Védrantais x PI 161375) x Védrantais] et qui présentent des événements de recombinaison à proximité du locus Vat.
Les résultats sont illustrés par le Tableau 2 ci-après, et la Figure 4.
Tableau 2
Figure imgf000014_0002
Ces résultats montrent que :
La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V432 et le gène Vat.
La plante P49 40 présente un événement de recombinaison entre le marqueur L246 et le gène Vat.
La plante P10 35 présente un événement de recombinaison entre le marqueur VI 684 et le gène Vat. Comme le marqueur VI 684 comprend l'ATG du gène Vat, cette plante présente une recombinaison intragénique détruisant la fonction du gène.
Le marqueur V681 co-ségrège avec le gène Vat. Ces données permettent donc d'identifier génétiquement le gène Vat.
EXEMPLE 2 : SOUS-CLONAGE ET VERIFICATION DE LA SEQUENCE DU
GENE VAT
Un sous clonage du gène Vat a été réalisé dans le vecteur pGEM®3Zff (Promega). Pour ce faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de restriction Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur pGEM 3Zf+ (Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène Vat ou internes à ce gène.
Un clone de 18185 pb contenant le gène Vat a été identifié (Clone C7.1). Le séquençage des extrémités du clone C7.1, des restrictions enzymatiques ainsi que le séquençage du gène Vat avec les oligonucléotides du Tableau 1 ont permis de vérifier qu'il s'agissait bien du gène Vat. La séquence d'une portion de 11097 pb de ce clone est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe (SEQ ID NO: 1). EXEMPLE 3 : OBTENTION DE L'ADNc DU GENE VAT
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit Marathon™ cDNA clone kit, (Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Le gène Vat comporte 4 exons et 3 introns :
Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la base 2367 (correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1). Le premier intron s'étend de la base 2368 à la base 2921 (4711 à 5264 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième exon s'étend de la base 2922 à la base 4055 (5265 à 6398 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième intron s'étend de la base 4056 à la base 4876 (6399 à 7219 selon SEQ ID NO : 1). Le troisième exon s'étend de la base 4877 à la base 5734 (7220 à 8077 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième intron s'étend de la base 5735 à la base 5833 (8078 à 8176 selon SEQ ID NO : 1). Le quatrième exon s'étend de la base 5834 à la base 5896 (8177 à 8239 selon SEQ ID NO : 1).
EXEMPLE 4 : DISTINCTION ENTRE LE GENE VAT ET LE GENE VAT-LIKE
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène Vat (Fαt-like) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au niveau protéique). La séquence de Fαt-like est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4.
Les gènes Vat et Vat-like sont liés génétiquement et physiquement puisqu'ils sont séparés de 17 kb.
Deux marqueurs (marqueur D et marqueur E) permettent de distinguer le gène Vat du gène Vat-like chez PI 161375. Le marqueur E est défini par les amorces : LRR1 :CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) et
LRR842R:CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb correspondant au gène Vat, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène Vat-like.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais a sur gel d'agarose une longueur d'environ 1,3 kb. Le marqueur D est défini par les amorces : LRR915:AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) et LRR1R:GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549 pb correspondant au gène Vat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène Vat-like. Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ 750 pb, 900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Les marqueurs L246 et M8 permettent de caractériser des recombinants entre le gène Vat et le gène Vat-like et de distinguer génétiquement ces deux gènes.
Figure imgf000017_0001
Le marqueur M8 est défini par les amorces : M8 :CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) et
M8R :TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais et PI 161375 a une longueur de 228 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme Aatll conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 195 pb et 33 pb.
En effet, des plantes recombinantes entre les gènes Vat et Vat-like ont été identifiées au sein de la population backcross [FI (Védrantais x PI 161375) x Védrantais]. Les plantes portant uniquement le gène Vat-like sont sensibles à Aphis gossypii, par exemple, la plante 848 (tableau 2). A l'inverse, les plantes ne possédant pas le gène Vat- like sont résistantes aux pucerons A. gossypii, par exemple la plante P4940 (Tableau 2).
EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION CONTENANT LE GÈNE VA T
L'ADN génomique du gène Vat sans son promoteur est introduit dans le vecteur binaire pBin 61 (BENDAHMANE et al, The Plant Journal 32, 195-204, 2002 ; séquence également disponible sur le site http://www.sainsbury-laboratory.ac.uk/david- baulcombe/Services/pBinόl.doc) contenant notamment le gène chimérique NOS/NPTII, le marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le gène Vat en orientation sens est introduit après le promoteur p35S. Le vecteur pBinόl est introduit dans différentes souches d Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, C58Cl-pch32 )
Alternativement, l'ADN génomique complet, comprenant 2,5 kb environ en amont et en aval du gène Vat afin de s'assurer de la présence du promoteur et des séquences régulatrices, est introduit en bouts francs dans le vecteur SLJ7292 (JONES et a , Transgenic Research, 1, 285- 30 297, 1992) et pBin 19 (BEVAN et a , Nucleic Acids Res 12 : 8711-8721, 1984). Les vecteurs binaires SLJ7292 et pBin 19 contenant le gène Vat sont introduits dans différentes souches d Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, C58Cl-pch32, C58Cl-pMP90)(SCHWEITZER et al, Plasmid, 4(2), 196-204, 1980 ; GOODNER et al, Science, 294(5550), 2323-2328, 2001), ou C58pGV2260 (DEBLAERE. et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985).
Le tableau 3 indique les constructions utilisées en fonction des plantes. Tableau 3
Figure imgf000018_0001
EXEMPLE 6 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE MELON
- Obtention de plantes de melon génétiquement transformées
Le protocole suivi est adapté à partir de celui de GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 84, 91 -99, 2000).
De jeunes explants de feuilles de melon sensible de la variété Védrantais (VILMORIN) sont incubés sous agitation dans une suspension d 'Agrobacterium tumefaciens (106 à 108 cellules/mL), pendant 30 minutes. Les transformations sont réalisées avec les constructions décrites dans l'exemple 5. Les explants potentiellement transformés sont ensuite transférés sur du papier Whatman n°l pendant 10 minutes, puis incubés 2 jours à 27°C à l'obscurité sur un milieu de coculture contenant lμM de 6-benzylaminopurine (BAP), lμM de 6-(g,g- diméthylallylamino)-purine (2iP), 0,2mM d'acétosyringone et 0,7g.L_1 d'agar.
La régénération des explants foliaires est obtenue en utilisant les conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7, 449-451, 1988) avec quelques modifications. Les explants foliaires sont transférés sur un milieu de régénération composé du milieu MURASHIGE et SKOOG (MS) (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962) supplémenté avec lμM de 6-benzylaminopurine (BAP), lμM de 6-(g,g- diméthylallylamino)-purine (2iP), contenant 100 mg.L"1 de kanamycine et 225 mg.L _1 de timentin et solidifié dans l'agar 0,7g.L _1.
Après 3 semaines de culture, les bourgeons formés sur les explants foliaires sont excisés et incubés sur un milieu de développement constitué par le milieu MS supplémenté avec 1 μM de BAP et 0,3 μM d'acide gibbérélique (GA3) contenant 100 mg.L"1 de kanamycine et 225 mg.L _1 de timentin et solidifié dans 0,7g.L' d'agar. Les bourgeons sont ensuite placés dans le milieu d'enracinement constitué par le milieu MS sans régulateur de croissance et contenant les mêmes quantités d'antibiotiques et d'agar.
Dès que les racines apparaissent, les plantules sont acclimatées selon GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 69, 199-206, 1997) et transférées en serre suivant les pratiques culturales décrites par AYUB étal. (Nature Biotechnology, 14, 862-866, 1996).
Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux. Seules les plantes diploïdes sont conservées et étudiées au niveau moléculaire par PCR pour vérifier la présence du transgène. Pour révéler la présence du gène Vat, la paire d'amorces VI 684 (SEQ ID
N° 13 et 14) située au niveau du promoteur Vat et la paire d'amorces D (SEQ ID N° 23 et 24) située au milieu du gène Vat comme décrites dans l'exemple 1, sont utilisées.
Les conditions de PCR sont les suivantes :
Mélange réactionnel : eau qsp lOμL ; tampon 10X lμL ; dNTP's (4mM) 0,6μL ; amorce 1 (10 pM) 0,4μL et amorce 2 (10 pM) 0,4μL ; Taq Takara (5U/μL) 0,08μL ; ADN l,2μL.
- Conditions de PCR utilisées: étape 1 : 2 mn à 94°C étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C étape 3 appariement : 45 sec à 60°C étape 4 élongation : 2 mn à 72°C étape 5 : 30 cycles de l 'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 mn à 72°C b- Pour révéler la présence du gène nptll de résistance à la kanamycine, les amorces
Kana II : 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' (SEQ ID NO : 25) et Kana III : 5'-GCGATAGAAGGCGATGCG-3' (SEQ ID NO : 26) sont utilisées dans les conditions suivantes :
- Mélange réactionnel : eau qsp lOμL ; tampon 10X lμL ; MgC12 (25mM) 0,6μL ; dNTP's (4mM) 0,2μL ; amorce 1 (10 pM) 0,4μL et amorce 2 (10 pM)
0,4μL ; Taq Promega (5U/μL) 0,04μL ; ADN l,2μL.
- Conditions de PCR utilisées: étape 1 : 2 min à 94°C étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C étape 3 appariement : 1 min à 53°C étape 4 élongation : 1 min à 72°C étape 5 : 30 cycles de l 'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 min à 72°C c- Pour vérifier qu'aucune amplification n'est due à la présence de bactéries résiduelles dans les tissus étudiés, les plantes sont également testées par PCR avec les amorces PicA+ (ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG ; SEQ ID NO : 27) et PicA" (GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT; SEQ ID NO : 28) spécifiques de l'ADN chromosomique des souches C58 d'A. tumefaciens ; le mélange réactionnel et les conditions de PCR étant identiques à ceux utilisés vis-vis du gène nptll.
Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur melon à partir des différentes constructions présentées dans l'exemple 5. Les résultats de ces transformations sont synthétisés dans le tableau 4.
Tableau 4
Figure imgf000020_0001
la construction B1-1 sont identifiées comme porteuses de l'insert contenant les gènes nptll et Vat.
Deux transformants porteurs du gène Vαt du génotype Védrantais ont été obtenus par ce premier protocole.
Les plantes racinées diploïdes sont bouturées in vitro sur milieu dépourvu d'antibiotiques, puis sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques.
Alternativement, la méthode de transformation génétique d'expiants cotylédonnaires décrite dans le brevet EP0412912 (LIMAGRAIN) a également été suivie. Environ 10 000 explants du génotype de melon CITzl ont été inoculés avec la bactérie C58Clpmp90 porteuse de la construction pVat-gène Vat. Les plantes régénérées et enracinées sur le milieu pourvu de 100 mg. L-l de kanamycine ont été analysées par PCR pour vérifier la présence des transgènes : nptll et Vαt. Les amorces et conditions PCR utilisées sont celles décrites ci-dessus. 27 événements de transformation ont été identifiés comme porteurs du gène nptll.
Au total, 2 transformants porteurs du gène Vat du génotype Védrantais ont été obtenus par le premier protocole et 27 transformants ont été obtenus par le second protocole. - Mesure de la résistance à la colonisation par A. gossypii
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA , Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al, Entomologia Experimentalis et Applicata, 65, 291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypii sont élevés sur melon Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24°C et 8 heures de nuit à 18°C).
Les plantes in vitro issues des expériences de transformation génétique ainsi que des mises en germination in vitro des plantes témoin ont été acclimatées in vivo pendant 10 jours.
Le test de résistance à la colonisation par A. gossypii est adapté de PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Les adultes aptères sont prélevés avec un pinceau fin et mis à jeûner pendant 1 heure dans une boîte de Pétri. Dix pucerons sont déposés sur deux feuilles étalées de chaque plante à tester. 48 heures après dépôt, le nombre de pucerons fixés sur les feuilles est comptabilisé. A 48 heures, sur les plantes sensibles les 10 pucerons déposés sont fixés alors que sur les plantes résistantes seuls quelques pucerons (en général moins de 5) restent sur les feuilles. Puis 7 jours après infestation, le nombre de pucerons adultes et de larves, ainsi que leur stade de développement est observé. Au bout de cette période sur les plantes sensibles, une nouvelle génération de pucerons est produite (plus de 100 pucerons présents en moyenne) et de nombreuses larves sont présentes (également plus de 100). Sur les plantes résistantes, quelques adultes (en général moins de 5) restent sur les feuilles et seules quelques larves peu développées sont présentes (moins de 30). Dans chaque test, le témoin sensible utilisé est le cultivar Védrantais et le témoin résistant est le cultivar Margot homozygote pour le locus Vat.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 5 et 6 :
Tableau 5
Figure imgf000022_0001
Tableau 6
Figure imgf000022_0002
Alternativement, on peut déposer 3 pucerons au lieu de 10 sur les feuilles de chaque plante à tester. Les pucerons peuvent être maintenus en cage ou non. Sept jours après le dépôt des pucerons, le nombre de pucerons adultes et de larves présents sur les plantes sont comptés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7:
Tableau 7
Figure imgf000022_0003
Ces résultats montrent que les clones Ml, M4, V2.15, V3.1, V3.6, V4.18 et V7.19 sont résistants aux pucerons. - Mesure de la résistance à la transmission des virus par ^4. gossypii.
Les tests de transmission virale sont réalisés essentiellement comme décrit par PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). La souche II 7F du CMV (Cucumber Mosaic Virus) peut être utilisée pour les tests de transmission par A. gossypii chez les plantes transformées et les lignées témoins Védrantais et Margot. Le virus est multiplié sur melons Védrantais par inoculation mécanique. Après 1 heure déjeune, les pucerons adultes sont déposés pour 5 minutes d'acquisition sur les feuilles virosées placées en boîte de Pétri. Les pucerons sont ensuite transférés sur les plantes à tester. Environ 15 minutes après dépôt des pucerons virulifères, les pucerons sont retirés au pinceau puis les plantes sont traitées avec un insecticide et mises en chambre de culture (12 heures de jour à 24°C et 12 heures de nuit à 18°C). Quinze jours après inoculation, les plantes sensibles à la transmission du CMV par A. gossypii développent des symptômes de mosaïque sévères. Les plantes résistantes ne présentent aucun symptôme et le virus n'est pas détecté par ELISA dans ces plantes. Le test ELISA suit le protocole décrit pas CLARK et ADAMS (J. Gen. Virol, 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV (ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
EXEMPLE 7 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LA TOMATE
Transformation de la tomate
Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993) par P. Rousselle (INRA, Montfavet, France) à partir de cotylédons de plusieurs génotypes Férum (lignée INRA), et Montfavet 63.5 (hybride FI).
Les souches utilisées pour la transformation sont celles décrites dans l'exemple 5. Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux et seules les plantes diploïdes sont conservées. Les analyses moléculaires ayant pour objet de vérifier la présence de
Pinsert contenant le gène nptll et le gène Vat ainsi que son expression dans le génome des plantes régénérées sont effectuées par PCR et RT-PCR. Les conditions PCR utilisées sont identiques à celles décrites dans l'exemple 6. Quatre paires d'amorces ont été utilisées : V1684 (SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14) située au niveau du promoteur Vat, les paires d'amorces des marqueurs D (SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24) et E (SEQ ID N°21 et SEQ ID N°22) situées au milieu du gène Vat et les amorces V632 qui amplifient un fragment situé en 3 ' du gène. Les séquences des amorces V632 sont les suivantes : Vat 632R : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO : 29) Vat 632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur tomate à partir des différentes constructions (tableau 8) et sur deux génotypes différents Ferum et Montfavet (INRA).
Tableau 8
Figure imgf000024_0001
une fraction du gène Vat (incluant le marqueur V1684) ont été intégrés.
** La construction A6-3 contient le gène Vat sous contrôle du promoteur 35S ; la paire d'amorces
V1684 (situé sur une région du promoteur Vat) ne permet pas de cribler les transformants.
Les analyses moléculaires par RT-PCR sur la plante T7 et un témoin Ferum avec la paire d'amorces du marqueur D (selon les conditions décrites dans l'exemple 6) ont permis de révéler l'expression du gène Vαt dans la plante transformée
(T7)
L'ensemble des amorces utilisées sur les plantes transformées du génotype Montfavet permet de déterminer 14 plantes provenant d'expiants différents ayant intégré la totalité du transgène.
Au total, 2 plantes du génotype Ferum et 14 plantes du génotype
Montfavet 63.5 ont intégré le gène Vαt.
Seules les plantes transformées sont bouturées, sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques. Seules les deux plantes Ferum ont été analysées à ce jour.
- Mesure de la transmission virale
La même souche d 'A. gossypii (Nml) et le même protocole de transmission par A. gossypii que pour les tests de résistance à la transmission du virus sur melon sont utilisés. Le virus choisi est le CMV (virus de la mosaïque du concombre) souche II 7F qui infecte le melon et la tomate. Cette souche est efficacement transmise à la tomate, lorsqu'elle est inoculée mécaniquement ou transmise par Myzus persicαe (JACQUEMOND et α/., Molecular Breeding, 8(1), 85-94, 2001). Le virus est multiplié sur plantules de melon Védrantais. L'acquisition du CMV par A. gossypii est faite sur ces plantules de melon infectées. La transmission est faite sur des plantules de tomate issues d'in vitro au stade 5 feuilles ou sur plantules issues de semis au stade 2 feuilles (environ 5 semaines après semis) en déposant 10 pucerons virulifères sur chaque plante. Le taux de transmission sur chaque génotype (tomates témoins et transformées) est évalué sur au minimum 2 répétitions de 20 plantes. La variété témoin sensible est la variété Férum.
Le test ELISA suit le protocole décrit par CLARK et AD AMS (J. Gen. Virol., 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV (ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
Les premiers résultats obtenus sur un faible effectif de plantes sont décrits dans le tableau 9.
Tableau 9
Figure imgf000025_0001
* absence de symptômes et de virus détecté par ELISA
Les plantes du code Tl, porteur d'un gène Vat tronqué, et celles du témoin sensible sont infectées à 100%. Dans quelques plantes transformées des codes T2 et T7, le virus n'a pas été transmis, ce qui suggère que le gène Vat aurait un effet sur la résistance à la transmission virale par A. gossypii chez les tomates transgéniques ayant intégré Vat.
EXEMPLE 8 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE COTONNIER
- Transformation du cotonnier
La transformation génétique du cotonnier (Gossypium hirsutum L.) est basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse somatique publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3, 178-181, 1986) et par TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6, 231-234, 1987). Ce procédé de transformation utilise la bactérie Agrobacterium tumefaciens comme vecteur de transformation selon UMBECK et al. (Biotechnology, 5, 263-266, 1987) et FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10, 105-116, 1987) avec quelques modifications et adaptations par rapport aux publications mentionnées. Les souches d'Agrobactéries utilisées pour la transformation sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 5 et notamment les souches LBA4404, C58ClpGV2260 et C58ClpMP90. La première souche contient soit le plasmide pSLJ7292 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène Vat sous contrôle de son propre promoteur, soit le plasmide pBin 61 qui comprend le gène Vat sous contrôle du promoteur 35S. Les deux autres souches sont porteuses du plasmide pBinl9 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène Vat sous contrôle de son propre promoteur. - Régénération du cotonnier
Des explants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en présence de l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur un milieu de culture (milieu de base) composé des éléments minéraux de MURASHIGE et SKOOG (MS), 30 g L"1 de glucose, les vitamines de MOREL et WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143, 1951), 0,1 à 0,05 mg L"1 d'acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et 0,1 à 0,01 mg L"1 de kinétine. Ce milieu ne contient ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de stopper la croissance de la bactérie. Après cette période de co-culture, les explants sont repiqués sur le même milieu additionné de kanamycine à la concentration 25 mg L"1 et de céfotaxime à la concentration 500 mg L"1. Les explants sont ensuite repiqués tous les 15 jours sur ce même milieu. Les cals issus de la prolifération des cellules transformées apparaissent après 3 à 5 semaines de culture. Lorsque leur taille atteint environ 0,5 cm de diamètre, ils sont isolés et repiqués sur le même milieu dans lequel la concentration en céfotaxime a été réduite de moitié et la concentration en substances de croissance (acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et kinétine) a été également réduite. Les repiquages interviennent ensuite toutes les 2 semaines jusqu'à l'apparition des tissus embryonnaires. Selon le comportement des cals, des séquences de milieux variant pour la concentration en substances de croissance peuvent être appliquées. Les tissus embryonnaires sont isolés sur le milieu de base sans ajout de substances de croissance. Sur ce milieu une certaine proportion des pro-embryons se développe en plantules. Ces dernières sont transférées en tube sur un support de vermiculite « arrosé » par le milieu de base liquide dépourvu de substances de croissance et où le saccharose remplace le glucose. Lorsqu'elles atteignent une taille d'environ 4-6 cm, elles sont directement transférées en serre de type S2.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène Vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR. Une paire d'amorces est utilisée pour amplifier le gène npt IL Deux paires d'amorces ont été utilisées pour le gène Vat : la première paire appelée 632 amplifie un fragment de Vat situé en 3' du gène, la seconde appelée LRR amplifie un fragment situé dans le milieu du gène.
Les séquences de la paire d'amorces utilisées pour amplifier le gène nptll sont les suivantes :
Kana III GCGATAGAAGGCGATGCG (SEQ ID NO : 26)
Figure imgf000027_0001
kana R CCGGCTACCTGCCATTCG (SEQ ID NO : 31)
Les séquences de la paire d'amorces 632 sont les suivantes : Vat632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Vat632R : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO : 29) Les séquences de la paire d'amorces LRR sont les suivantes :
LRR F : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC (SEQ ID NO : 32) LRR R : CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC (SEQ ID NO : 33)
Les conditions de PCR sont les suivantes, quelles que soient les amorces utilisées : Pour 25 μL de milieu réactionnel :
Eau 9,5 μL tampon 10X : 2,5μL dNTP (2,5mM) : 2μL
Oligo 1 (10 μM) : 2,5 μL Oligo 2 (10 μM) 2,5 μL
Taq (5u/μL) : 0,25 μL
ADN : 5μL programme :
3 minutes à 94°C puis 35 cycles de : 30 secondes à 94°C - 45 secondes à 59°C - 45 secondes à 72°C.
Au total après 8 mois, 12 plantes transformées ont été transférées en serre ; elles sont issues de 5 souches embryogènes différentes. Parmi celles-ci 2 sont issues de 2 souches différentes pour lesquelles l'amplification du gène Vat a été obtenue dans les conditions de PCR présentées ci-dessus. Les autres sont issues de souches pour lesquelles l'amplification du gène nptll a été obtenu mais pas celle du gène Vat. Il n'est pas impossible qu'elles représentent des faux négatifs dans la mesure ou en faisant varier la quantité de matrice il a été possible d'obtenir une amplification à la bonne taille avec un extrait qui s'était avéré précédemment négatif. Mesure de la résistance à l'infection ΌΆT Aphis gossypii
Un clone dA. gossypii prélevé sur cotonnier (origine Ile de la Réunion) est utilisé et maintenu sur cotonnier. En effet, il a été montré que les populations ά'A. gossypii sont fortement structurées génétiquement en fonction de la plante hôte (VANLERBERGHE-MASUTTI et CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7, 905-914, 1998). Le test est réalisé selon le même protocole que sur melon mais avec des conditions de culture des plantes adaptées au cotonnier. Les cotonniers sont maintenus en serre de type S2 à une température de 28°C à 30°C, un éclairage d'appoint, en intensité et en durée, est apporté pour une photopériode de 12-12.
En plus de l'évaluation de la résistance réalisée comme pour le test melon, une évaluation plus précise de l'histoire de vie des pucerons sur les plantes transformées (durée des différents stades larvaires, durée de survie des adultes, taux d'accroissement intrinsèque,...) (XIA et al. Entomologia Experimentalis et Applicata, 90, 25-35, 1999) peut être également réalisée afin de détecter des effets éventuellement plus faibles du gène Vat sur A. gossypii en situation hétérologue.

Claims

REVENDICATIONS
1) Polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%), de préférence au moins 90%> et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b). 2) Polynucléotide selon la revendication 1, choisi parmi : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ; b) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2 ; c) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ou du polynucléotide b) ; d) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec l'un quelconque des polynucléotides a), b) ou c).
3) Polynucléotide constitué par un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'une plante à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Marqueur génétique permettant la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance à Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les marqueurs suivants : L273, L246, V681, VI 684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D, respectivement définis par les amorces suivantes :
L273 : F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8)
L246 :
F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681 :
V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684 :
V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
V551R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
V432 : V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
GRP805 :
GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17)
GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8 :
M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19)
M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20)
Marqueur E :
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22)
Marqueur D :
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23)
LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
6) Couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs tel que défini dans la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8,
- le couple d'amorces constitué par les polunucléotides SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10,
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID O : 13 et SEQ ID NO : 14,
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16,
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18,
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20,
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22, et - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24. 7) Kit pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6. 8) Utilisation d'au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
9) Utilisation d'au moins un marqueur génétique selon la revendication 5 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
10) Utilisation selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite plante est une cucurbitacée.
11) Procédé de détection de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypii et/ou de la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène Vat présente chez ladite plante.
12) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
13) Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 ou une cassette d'expression selon la revendication 12.
14) Cellule génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
15) Utilisation d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
16) Plante transgénique génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
17) Plante transgénique selon la revendication 16, choisie parmi les cucurbitacées, les malvacées et les solanacées.
18) Polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il possède au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO : 3.
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