WO2004057339A1 - Elisa-verfahren zum nachweis von guanylat-bindungsprotein-1 (gbp-1) - Google Patents

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WO2004057339A1
WO2004057339A1 PCT/EP2003/014678 EP0314678W WO2004057339A1 WO 2004057339 A1 WO2004057339 A1 WO 2004057339A1 EP 0314678 W EP0314678 W EP 0314678W WO 2004057339 A1 WO2004057339 A1 WO 2004057339A1
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PCT/EP2003/014678
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Michael STÜRZL
Clara Lubeseder-Martellato
Eric Guenzi
Elisabeth Kremmer
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GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention relates to methods for identifying and / or quantifying GBP-1 or fragments of this protein in the culture supernatant of a tissue sample, a sample of body fluid or a sample of a cell culture supernatant.
  • the endothelium is a key organ in numerous physiological and pathophysiological processes such as cell-controlled immune response, menstruation, wound healing, inflammation, allergy, cardiovascular disease and tumor growth.
  • the endothelial pathofunction is inextricably linked to the activation of endothelial cells.
  • Activation of the endothelium is a complex process that is controlled by a variety of different soluble factors that circulate in the blood or are released by neighboring cells (Fig. 1A).
  • Fig. 1A the physiology and morphology of the endothelial cells are adapted to the respective requirements in the tissue.
  • the focus here is on the control of cell proliferation, apoptosis, invasion, migration and leukocyte adhesiveness of endothelial cells, as a result of which the new and re-formation of vessels and the extravasation of leukocytes are regulated (FIG. 1A).
  • the angiogenic growth factors activate basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial cell growth factor (VEGF) endothelial cell proliferation
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • the inflammatory cytokines interleukin (IL) -1 ⁇ , IL-1ß, tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ and interferon (IFN) - ⁇ inhibit proliferation and increase the leukocyte adhesiveness of endothelial cells.
  • IL interleukin
  • TNF tumor necrosis factor
  • IFN interferon
  • cytokine network The development of inflammatory reactions and the resulting inflammatory diseases is a very complex sequence (cascade) of different and synergistic effects of inflammatory factors such as cytokines that make it difficult to analyze a defined stage of an inflammatory reaction and / or to reliably predict its further development , Because of the complexity of the reactions taking place, this is also referred to as the so-called cytokine network.
  • GBP-1 indicates activation by inflammatory cytokines as in cultured cells in vascular endothelial cells in human tissues
  • immunohistochemical tests for the detection of GBP-1 using specific monoclonal antibodies were carried out.
  • an inflammatory component such as psoriasis, drug counter-reaction and Kaposi's sarcoma
  • All of the skin diseases mentioned have in common that there are numerous inflammatory cells concentrated in the lesions, which release the same inflammatory cytokines, which also lead to increased GBP-1 expression. In no case could GBP-1 be detected in the vessels of the healthy skin.
  • GBP-1 actually shows an inflammatory activation of endothelial cells in human tissues and can be used as a molecular marker for the detection of this activation in tissues (Lubeseder-Martellato et al. 2002, Guenzi et al. 2001).
  • this use as a molecular marker was restricted to solid tissue samples, since the results described showed that the protein GBP-1 is a protein which is active in the cell and is localized in the cytoplasm of the cell.
  • corresponding evidence included, for example, the acquisition of solid tissue samples from patients. However, taking solid tissue samples from inflammatory tissue has adverse effects for patients and is difficult.
  • GBP-1 GBP-1 mediates the inhibition of proliferation induced by inflammatory cytokines.
  • endothelial cells were transduced with retroviral vectors, which cause the constitutive expression of GBP-1 (GBP-1 vector) or an init / se / 7se-GBP-1 RNA (AS vector) (Fig. 3A).
  • GBP-1 vector GBP-1 vector
  • AS vector an init / se / 7se-GBP-1 RNA
  • GBP-1 actually inhibits cell proliferation induced by angiogenic growth factors (FIG. 3C, white bars) and that inflammatory cytokines also require proliferation of Can inhibit endothelial cells (Fig. 3D).
  • angiogenic growth factors FIG. 3C, white bars
  • inflammatory cytokines also require proliferation of Can inhibit endothelial cells (Fig. 3D).
  • the latter manifests itself in the fact that the inhibitory effect of inflammatory cytokines on cell proliferation is significantly reduced in cell cultures expressing anf / sense GBP-1 RNA (FIG. 3D, black bars) (see Guenzi et al. 2001).
  • GBP-1 inhibits the expression of matrix metalloproteinase-1 and the associated invasion of endothelial cells (see Guenzi et al., 2003).
  • GBP-1 is thus a new molecular marker for inflammatory vascular activation, which selectively controls the antiproliferative effect of inflammatory cytokines on endothelial cells.
  • GBP-1 is selectively induced by inflammatory cytokines and that this process correlates with an anti-angiogenic effect on the cells in question (Lubeseder-Martellato et al., 2002 and Guenzi et al., 2001). While the induction of GBP-1 via its antiproliferative effect could in principle be used for medical purposes in the context of an anti-angiogenic therapy, the use of inflammatory cytokines for such purposes is out of the question because of the pleiotropic and thus also disadvantageous effects of these cytokines.
  • cytokine network The object of the present invention was therefore to provide methods which enable simple and targeted analysis of the expression of GBP-1. This method should enable statements to be made about the stage and progression of an inflammatory reaction in an individual or in an in vitro model without the need for complex analysis and quantification of many different inflammatory factors in the so-called cytokine network.
  • the present invention relates to an in vitro method for identifying and / or quantifying GBP-1 or fragments of this protein in the culture supernatant of a tissue sample, a sample of body fluid or a sample of a cell culture supernatant, the method comprising the following steps:
  • fragment of GBP-1 preferably describes both fragments of the protein which have the biological activity of GBP-1 as described in the prior art and also in this application, and fragments of the protein which have been cleaved , e.g. enzymatic cleavage, arise and are indicative of inflammatory diseases.
  • body fluids encompasses all types of body fluids, possibly diluted or concentrated. Examples are blood / serum, plasma, amniotic fluid, cerebral spinal fluid, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, sputum, pharynx and pharynx secretions and other mucosal secretions, synovial fluid, ascites, tear fluid, lymph fluid and urine.
  • specific binding describes a specific interaction or interaction between a receptor and a ligand.
  • An example of such a ligand is GBP-1 or fragments of this protein.
  • the specific interaction or interaction can be characterized by a "key-lock principle".
  • the receptor and the ligand have structures or motifs that match each other specifically, such as an antigenic determinant (epitope) that is associated with the antigen binding site of an antibody Accordingly, specific interaction contrasts with a more universal, non-specific interaction.
  • GBP-1 has been shown to be a marker protein for inflammatory reactions that, surprisingly, includes is secreted by endothelial cells and monocytes. This surprising finding makes it possible to analyze GBP-1 in the culture supernatant from tissue samples, body fluid samples or cell culture supernatant samples and to make a statement about the stage of an inflammatory disease. Secreted GBP-1 can be detected simply and quickly with the method according to the invention and thus serves as a disease-associated diagnostic parameter.
  • the detection of inflammatory activation of endothelial cells and monocytes in the body fluid of patients using the method according to the invention is of particular importance on the basis of the surprising finding in inflammatory diseases, bacterial and viral infectious diseases (AIDS, menigitis), allergies, transplant reactions, cardiovascular and tumor diseases etc. In addition, these are important for determining the response in patients treated with inflammatory cytokines (eg interferon- ⁇ ); see Figure 5.
  • inflammatory cytokines eg interferon- ⁇
  • the detection or the quantified amount of GBP-1 in a sample of a patient's body fluid enables conclusions to be drawn about the degree of activation of endothelial cells and monocytes and thus a statement about the clinical picture of the patient.
  • the method according to the invention also comprises one or more washing steps before or after each step. These washing steps serve to minimize unspecific reactions (false positive or false negative detection) and can improve the sensitivity of the process.
  • Suitable wax buffers and their composition are known in principle to the person skilled in the art; see for example Harlow and Lane. Physiological buffer solutions are preferred.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention also comprises step (a ') or (a ") before contacting the first receptor:
  • the proteins and / or the first receptor contained in the sample can for example be chemically labeled, for example by coupling labeled chemical groups or markers to the free amino groups of cysteines contained in the proteins.
  • labeled chemical groups there are groups that contain special, detectable radioisotopes. Fluorescent dyes, for example, can also serve as markers. Another example of corresponding markers are nucleic acids.
  • PCR polymerase chain reaction
  • cells are incubated, for example, with radioactively labeled metabolites. Proteins that are present during this incubation period are marked from the biosynthesis of these cells and into which the labeled metabolites have been incorporated.
  • This method is e.g. suitable for labeling antibodies secreted by antibody-producing cells.
  • the receptor is immobilized on a surface before being brought into contact with GBP-1 or fragments of this protein.
  • the receptor is immobilized on a surface after being brought into contact with GBP-1 or fragments of this protein.
  • Receptors can be immobilized in a variety of ways. The procedure depends on various factors, such as the type of receptor or the material of the surface. Immobilization can be covalent or by adsorption.
  • the receptors are proteins, particularly preferably antibodies. The use of peptides or organic molecules as receptors is also preferred.
  • a corresponding surface usually consists of a polymeric plastic (e.g. polystyrene, polyvinyl, latex) and e.g. in the form of microtiter plates or multi-well plates, membranes or spherical “leads” (cross-linked polymers in particle form) used for this purpose (Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997), 401-24).
  • a polymeric plastic e.g. polystyrene, polyvinyl, latex
  • membranes or spherical “leads” cross-linked polymers in particle form
  • the material of the surface is selected from a group consisting of Sepharose, latex, glass, polystyrene, polyvinyl, nitrocellulose and silicon.
  • the surface in the method according to the invention is further preferably a membrane, a bead, a chip or a plate.
  • beads are Sepharose beads or latex beads, to which ligands are optionally bound, which favor immobilization of the receptors on the surface.
  • ligands are, for example, protein A or protein G, which favor the binding of antibody to a surface via the Fc part of the antibody.
  • the binding of the receptor to the carrier material can also be achieved by a covalent chemical coupling reaction (e.g. hydrazide coupling).
  • Example 3 describes a corresponding method.
  • Another example of immobilization of the receptors on the surface using ligands is the use of biotin and avidin or streptavidin.
  • Examples of chips are silicon plates on which a large number of different or the same receptors can be immobilized in an orderly manner. This enables the analysis of a variety of different parameters in a sample or the Analysis of a large number of different samples for one or more parameters, for example identification and / or quantification of GBP-1 or fragments of this protein in different tissue samples, samples of body fluid or samples of cell culture.
  • Examples of the plates mentioned are microtiter plates or multi-well plates. These preferably have 6, 12, 24, 48, 96, 128, 356, 1024 or more wells.
  • Example 4 describes a method in which 96-well plates are used.
  • this further comprises step (a '") before the step of detecting a specific binding:
  • Beads can be precipitated gravimetrically from a sample, for example. This can be accelerated, for example, by centrifugation. Appropriate methods are known to the person skilled in the art, inter alia Rehm, Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics, Spektrum Akademischer Verlag, 2002. Furthermore, a corresponding precipitation is described in Example 3.
  • the detection of the specific binding in step (b) comprises gel electrophoretic separation, optionally also a Western blot analysis (see Example 3).
  • Appropriate methods are among those skilled in the art from Rehm, loc. cit. known.
  • the sample in order to detect a specific binding of GBP-1 or a fragment of this protein to the first receptor in step (a), the sample is brought into contact with a second receptor for GBP-1 or a fragment of this protein that binds to an epitope of GBP-1 or a fragment of this protein that is accessible after binding of the first receptor to GBP-1 or a fragment of this protein.
  • a second receptor for GBP-1 or a fragment of this protein that binds to an epitope of GBP-1 or a fragment of this protein that is accessible after binding of the first receptor to GBP-1 or a fragment of this protein.
  • This preferred embodiment relates, for example, to methods which make use of the mechanistic principle of the sandwich ELISA. This principle is generally known to the person skilled in the art and is described, inter alia, in Stryer, Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag, 1996. A corresponding method is also described in the attached example 4.
  • the second receptor for GBP-1 or fragments of this protein is labeled in a preferred embodiment of the method according to the invention. Methods that enable labeling of a receptor have been described above and can also be used here.
  • the labeling of the second receptor for GBP-1 or a fragment of this protein comprises a signaling system.
  • An example of such a signaling system is the isotope labeling described above, the signal being the emission of radioactive radiation.
  • fluorescence labeling of the corresponding receptor results in the labeling with a signal-generating system in the sense of the invention, the signal being the emission of a fluorescence signal after appropriate excitation of the dye.
  • the signaling system further preferably comprises an enzyme which emits a signal.
  • enzymes include alkaline phosphatases, peroxidases, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, urease and chloramphenicol acetyl transferase.
  • alkaline phosphatases peroxidases
  • ⁇ -galactosidase glucoamylase
  • urease chloramphenicol acetyl transferase
  • chloramphenicol acetyl transferase chloramphenicol acetyl transferase.
  • suitable substrates for the detection with the aid of enzymatic reactions are known to the person skilled in the art, including commercially available detection kits from the instruction leaflets or from Rehm, loc. cit. Such commercially available detection kits often contain antibodies which recognize antibodies of certain species, for example anti-mouse, and to which signaling enzymes are coupled.
  • Corresponding antibodies thus represent an example of a third receptor that recognize a specific label of the second receptor, namely its Fc part.
  • the first and the second receptor and, optionally, also the third receptor is selected from the group consisting of peptides, polypeptides, low molecular weight substances, antibodies or fragments or derivatives thereof and aptamers.
  • peptides usually refers to amino acid chains with up to 30 amino acids.
  • polypeptides refers to peptides that usually comprise more than 30 amino acid chains and includes proteins.
  • low molecular weight substances or small molecules are understood to mean molecules which are of less molecular complexity than the macromolecules defined above.
  • low molecular weight substances is not used uniformly in the literature.
  • WO 89/03041 and WO 89/03042 describe molecules with molecular weights of up to 7000 g / mol as small molecules. Usually, however, molecular weights between 50 and 3000 g / mol are given, but more often between 75 and 2000 g / mol and mostly in the range between 100 and 1000 g / mol.
  • Low molecular weight substances can be organic or inorganic in nature.
  • antibody encompasses polyclonal sera, as well as monolonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies and methods for their production are known to the person skilled in the art. These are based on a method first described by Köhler and Milstein (1975). This is i.a. described in detail in Harlow and Lane's laboratory manual (Antibodies, A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory; (1988); Chapter 6).
  • the definition also includes bispecific antibodies, synthetic antibodies and fragments or derivatives of these antibodies. These include fragments such as Fab, Fv or scFv and chemically modified derivatives of these antibodies or antibody fragments.
  • the method according to the invention is preferably an ELISA, EIA, or RIA.
  • Appropriate methods are known in principle to the person skilled in the art from Harlow and Lane, loc. cit. and Rehm, loc. cit.
  • the method according to the invention is preferably carried out automatically. This includes possible through the use of pipetting robots and work processes optimized for automated evaluation.
  • the invention further relates to the use of body fluid or a sample of a cell culture supernatant, as defined above, for the detection of GBP-1 or fragments of this protein, the positive detection being indicative of the presence of an inflammatory disease.
  • Fig. 1 Complexity and redundancy of inflammatory endothelial cell activation.
  • Fig. 3 GBP-1 mediates the antiproliferative effect of inflammatory cytokines in endothelial cells.
  • A Schematic representation of the retroviral expression vector pBabePuro (control vector, K vector) in which the cDNA of GBP-1 in both orientations for the constitutive expression of GBP-1 (GBP-1 vector) and for the expression of a GBP-1 -ar ⁇ f / sense-RNA (AS vector) was used.
  • B GBP-1 expression in K, GBP-1, and AS vector transduced endothelial cells that were either untreated or stimulated with 20 U / ml IL-1 ⁇ over a 24 hour period. The GBP-1 expression was detected by Western blot analysis with a polyclonal anti-GBP-1 antibody. The simultaneous staining with actin shows that the same amounts of protein were applied.
  • C Proliferation experiments with K vector and GBP-1 vector transduced endothelial cells in the presence of increasing concentrations of angiogenic growth factors (bFGF and VEGF in combination).
  • D Proliferation experiments of K vector and AS vector transduced endothelial cells in the presence of angiogenic growth factors and increasing concentrations of IL-1ß. (Modified from (Guenzi, Topolt et al. 2001))
  • Fig. 4 Detection of GBP-1 protein in culture medium of IFN- ⁇ stimulated HUVEC by ELISA and immunoprecipitation
  • HUVEC were stimulated with 100 U / ml IFN- ⁇ (IFN- ⁇ ) or left untreated
  • Fig. 5 Measurement of circulating GBP-1 in plasma from IFN- ⁇ treated patients
  • concentration of circulating GBP-1 in plasma was determined by means of ELISA .
  • the increase in the GBP-1 concentration from day 9 to day 28 is shown for three patients.
  • ELISA microtiter plates were coated with a monoclonal rat anti-GBP-1 antibody, clone 1 B1, for 16 h at 4 ° C. The plates were then saturated with PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS) and free binding sites were saturated with PBS-T / BSA 2% (PBS-TB) for 30 min at room temperature (RT).
  • the GBP-1 protein / antibody complex was visualized by incubation with 100 ⁇ ⁇ p-nitrophenyl phosphate. The absorption was measured at 405 nm in the microplate reader. The concentration was determined using a standard curve for which increasing concentrations of purified GBP-1-His were used. The linearity of the measurement is given for a range from 0.1 to 100 ng / ml.
  • HUVEC were cultivated overnight in 0.5% FBS-containing EBM medium and with
  • interferon- ⁇ 100 U / ml interferon- ⁇ (IFN- ⁇ , Röche) stimulated. Control cells (medium) were left untreated. 24 hours after stimulation, the cells were dead red
  • Dyed dye Cells that have an altered membrane permeability
  • FIG. 7 The ELISA reacts specifically with GBP-1 and not with the heterologous proteins BSA and eGFP
  • GBP-1 ELISA was used to investigate solutions that contained increasing amounts of GBP-1-His (black bars), His-GBP-1 (white bars, a GBP-1 protein that was purified from bacteria and was used for the purpose of Purification is provided with 6 histidine residues at the amino terminus) and His-GBP-2 [gray bars, a protein homologous to GBP-1 (homology at the amino acid level 76%, at the nucleic acid level 82%) with 6 histidine residues at the amino terminus].
  • GBP-1-His was incubated in various dilutions with (black and white bars) or without (black bars) rat anti-GBP-1 antibody and subsequently added to the plate.
  • a concentration-dependent increase in signal strength was observed (black bars).
  • pre-incubation with anti-GBP-1 antibodies black and white bars
  • the binding of His-GBP-2 could be blocked by pre-incubation with the rat anti-GBP-1 antibody (gray-white bar).
  • Fig. 8 Determination of the linear detection range of the ELISA
  • Fig. 9 Elevated GBP-1 concentrations in the serum are detectable in patients with inflammatory diseases
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • the GBP-1 serum concentrations were determined by diluting the serum samples 1: 2. The concentration of GBP-1 in the samples was calculated using a standard curve. Since the ELISA method also recognizes GBP-2 and GBP-2 may also be present in the serum, the concentrations determined were given in relative units.
  • the GBP-1 serum concentrations were significantly increased in the patients with SLE (median: 46.1 relative units) and arthritis (median: 58.2 relative units) but not in patients with erysipelas (median: 8.6 relative units) in comparison to the control subjects (median: 13.3 relative units).
  • the differences between the GBP-1 concentration in patients with SLE and arthritis and the GBP-1 concentration in healthy controls are statistically significant (Wilcoxon test p ⁇ 0.01 for SLE and arthritis).
  • Fig. 10 Increased GBP-1 concentrations in the cerebrospinal fluid are detectable in patients with bacterial meningitis
  • the GBP-1 concentration in the cerebrospinal fluid of healthy controls showed no statistically significant difference (Wilcoxon test p> 0.05) to the GBP-1 concentration in the serum. This indicates that GBP-1 is not enriched in the CSF of healthy Parsons and that the increase in GBP-1 concentrations in meningitis patients is disease-related.
  • the 237 bp GBP-1 promoter fragment (pro237-GBP-1) was PCR amplified (PCR 2 Advantage Kit, Clontech) from the construct pro3757-GBP-1 with the oligonucleotides 5'-ATTTGAAGCTTCTGGTTGAG-3 '[insert a Hindlll- Interface (underlined)] or 5'-TGGCTTCTAGCACTTCTG-3 'generated.
  • the construct pro3757-GBP-1 contains 3757 bp of the 5 'regulatory sequence upwards of the ATG codon of the GBP-1 gene (gi: 4503938, NM_002053) in the vector pT-Adv (Clontech).
  • the 237 bp fragment was ligated in antisense orientation with the vector pT-Adv, cut with HindIII and subcloned into the pGL3 basic vector (Promega). All constructs were cleaned up with the Endofree Maxi Kit (Qiagen) and sequenced for verification.
  • Example 2 Establishment of a suitable cell line
  • HEK 293 T cells human embryonic epithelial kidney cell line with human adenovirus type 5 (Ad 5) DNA transformed (ATCC CRL 1573), which are additionally transformed with SV40 T antigen) were treated with 3x10 5 cells / well (6-multi-well plate , Corning) sown 24 h before transfection. A total of 0.8 ⁇ g plasmid was used per well of the 6-well plate, the test plasmid pro237-GBP-1 in a ratio of 1: 5 with the selection plasmid pBABE-Puro (P. Monini, Laboratory of Virology, Instituto Superiore di Santiä, Rome, Italy).
  • the test plasmid pro237-GBP-1 contains the 237 bp promoter fragment coupled to the indicator gene firefly-luciferase
  • the selection plasmid pBABE-Puro contains the resistance gene puromycin, whereupon selection is carried out.
  • the transfection of the cells was carried out in accordance with the manufacturer's instructions with Effectene (Qiagen) and after 24 hours the selection was started with 0.7 ⁇ g / ml puromycin (Sigma).
  • the growth of single clones was observed on days 8-10, which were then trypsinized with cloning rings and transferred to single wells of a 96-well plate (Falcon).
  • the clones were further passaged and examined for their reporter gene activity in the luciferase assay.
  • the clones were stimulated with inflammatory cytokines IFN- ⁇ , IL-1ß and TNF- ⁇ , as well as buffers for 5 h and harvested in 1x "passive lysis buffer” (Promega).
  • the lysates were examined for firefly luciferase activity and accordingly stable Clones established.
  • Freshly prepared cell lysates were prepurified by incubation with 2 ⁇ ⁇ rabbit pre-immune serum not reacting with GBP-1 and 25 ⁇ ⁇ protein A / G agarose beads for at least 3 h at 4 ° C. on a shaking platform. After pelleting the beads, the supernatant was incubated with 25 ⁇ l protein A / G agarose beads and 1 ⁇ l polyclonal rabbit serum against GBP-1 at 4 ° C. overnight on a shaking platform. The beads were washed four to five times in PBS. The beads were then resuspended in 30 ⁇ l Laemmli sample buffer (2X) and boiled for 5 min.
  • 2X Laemmli sample buffer
  • the samples were separated in an SDS-PAGE (10%) and analyzed in a western emblot or in an autoradiography.
  • 10 ml of culture medium were placed on ice, centrifuged at 1000 rpm for 5 min, filtered through a filter with a pore size of 45 ⁇ m and in some cases a proeinase inhibitor cocktail (0.02 mg / ml pancreatic extract, 5 ⁇ g / ml pronase, 0.5 ⁇ g / ml thermolysin, 3 ⁇ g / ml chymotrypsin and 0.33 ⁇ m / ml papin) were added.
  • the pre-cleaning was carried out by incubation with 10 ⁇ l rabbit serum and 120 ⁇ l Protein A / G agarose beads for more than 3 h at 4 ° C on a shaking platform. After pelleting the beads, the supernatant was incubated with 120 ⁇ l protein A / G agarose beads and 6 ⁇ l polyclonal rabbit serum against GBP-1 at 4 ° C. overnight on a shaking platform. The beads were washed four to five times in PBS. The beads were then resuspended in 60 ⁇ l PBS + 60 ⁇ l Laemmli sample buffer (2X) and boiled for 5 min. Usually 15 ⁇ l of each sample were separated in an SDS-PAGE (10%) and analyzed in a Western blot.
  • FIG. 4B An example of the result of detection of GBP-1 by immunoprecipitation from culture medium is shown in FIG. 4B.
  • PBS-T PBS containing 0.1% Tween 20
  • PBS-TB PBS containing 0.1% Tween 20 and 2% BSA
  • 96-well ELISA plates (Nunc-Immuno Plates) were coated with 100 ⁇ l / well anti-GBP-1 hybridoma supernatant (diluted 1: 5 with PBS) or with purified receptor in the concentration of 1-5 ⁇ g / ml (Incubation for 16 h at 4 ° C). The plates were washed with PBS-T and blocked with PBS-TB for at least 30 min at room temperature.
  • the wells were aspirated and incubated as doublets for 2 h at room temperature with 100 ⁇ l of the standard (GBP-1-His, diluted in cell culture medium containing 5% FBS), the same concentration of BSA as a control or with 100 ⁇ l of a sample in a suitable dilution (diluted in PBS).
  • the wells were washed four times with PBS-T and incubated with 100 ⁇ l of a polyclonal antibody against GBP-1, diluted in 1: 500 in PBS-TB for 2 h at room temperature.
  • the sensitivity of the ELISA was determined using a dilution series of GBP-1-His (a G BP-1 protein that was purified from bacteria and provided with 6 histidine residues at the carboxy terminus for the purpose of purification) in PBS.
  • the sensitivity of the ELISA was determined as the lowest concentration of GBP-1-His at which the associated measured value differed significantly, i.e. by at least two standard deviations, from the measured value when compared to the approach without GBP-1-His (plus two standard deviations ) was obtained.
  • the sensitivity of the ELISA described here was determined to be 12.3 ng / ml.
  • GBP-1-His 400 ng / ml, 180 ng / ml, 40 ng / ml

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins im Kulturüberstand einer Gewebeprobe, einer Probe von Körperflüssigkeit oder einer Probe eines Zellkulturüberstandes.

Description

EL ISA- VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON GUANYLAT-BINDUNGSPROTEIN-1 (GBP-1 )
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins im Kulturüberstand einer Gewebeprobe, einer Probe von Körperflüssigkeit oder einer Probe eines Zellkulturüberstandes.
Verschiedene Dokumente werden im Text dieser Beschreibung zitiert. Der Offenbarungsgehalt der zitierten Dokument (einschließlich aller Herstellerbeschreibungen, -angaben etc.) ist hiermit per Referenz Teil dieser Beschreibung.
Das Endothel ist ein Schlüsselorgan bei zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Zeil-gesteuerter Immunantwort, Menstruation, Wundheilung, Entzündung, Allergie, Herz-Kreislauferkrankung und Tumorwachstum. Die Pathofunktion des Endothels ist untrennbar mit der Aktivierung von Endothelzellen verbunden.
Die Aktivierung des Endothels ist ein komplexer Vorgang, der durch eine Vielzahl verschiedener löslicher Faktoren gesteuert wird, die im Blut zirkulieren oder von benachbarten Zellen freigesetzt werden (Fig. 1A). In Folge dieses Prozesses werden die Physiologie und Morphologie der Endothelzellen an die jeweiligen Erfordernisse im Gewebe angepasst. Im Vordergrund stehen hierbei die Steuerung der Zeilproliferation, Apoptose, Invasion, Migration und Leukozyten- Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen, wodurch die Neu- und Rückbildung von Gefäßen und die Extravasation von Leukozyten reguliert werden (Fig. 1A).
Die Vielzahl der beteiligten Faktoren legt nahe, dass mehrere Faktoren den selben Phänotyp steuern und zu wirkungsgleichen Gruppen zusammengefaßt werden können (Fig. 1B). Zum Beispiel aktivieren die angiogenen Wachstumsfaktoren basic fibroblast growth factor (bFGF) und vascular endothelial cell growth factor (VEGF) die Endothelzellproliferation, wohingegen die inflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1α, IL-1ß, tumor necrosis factor (TNF)-α und Interferon (IFN)-γ die Proliferation hemmen und die Leukozyten-Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen erhöhen.
Derzeit gibt es keine geeigneten Methoden, mit denen bestimmt werden kann, wo und wann die verschiedenen Faktoren in entzündlichen Geweben auf die Endothelzellen wirken. Daher ist über die räumliche und zeitliche Verteilung der verschiedenen Aktivierungszustände von Endothelzellen im Rahmen entzündlicher Erkrankungen nur sehr wenig bekannt.
Die Entwicklung von Entzündungsreaktionen und sich daraus ergebender entzündlicher Erkrankungen ist eine sehr komplexe Abfolge (Kaskade) von unterschiedlichen und synergistischen Wirkungen von inflammatorischen Faktoren wie Zytokinen, die eine Analyse eines definierten Stadiums einer Entzündungsreaktionen und/oder eine verlässliche Voraussage über deren weitere Entwicklung schwer möglich machen. Aufgrund dieser Komplexheit der ablaufenden Reaktionen spricht man in diesem Zusammenhang auch von sogenannten Zytokinnetzwerk.
Erste Arbeiten, einen molekularen Marker zu identifizieren, der eine Aktivierung von Endothelzellen durch die oben genannten inflammatorischen Zytokine im Gewebe anzeigt, führten zu vergleichenden Untersuchungen zur Genexpression in kultivierten Endothelzellen in Gegenwart unterschiedlicher Aktivierungsbedingungen. Mit diesem Ansatz konnte ein Gen isoliert werden, dessen Expression in Endothelzellen selektiv durch inflammatorische Zytokine induziert wird (Fig. 2A) (Guenzi et al., 2001 ; Lubeseder-Martellato et al. 2002). Dieses Gen kodiert für das Guanylat-Bindungsprotein-1 (GBP-1), das zur Proteinfamilie der großen GTPasen gehört.
Um zu bestimmen, ob GBP-1 wie in kultivierten Zellen auch bei Gefäßendothelzellen in humanen Geweben eine Aktivierung durch inflammatorische Zytokine anzeigt, wurden immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis von GBP-1 mittels spezifischer monoklonaler Antikörper durchgeführt. Dazu wurden histologische Schnitte gesunder Haut und von Hauterkrankungen mit einer entzündlichen Komponente, wie zum Beispiel Psoriasis, Arzneimittelgegenreaktion und Kaposi-Sarkom untersucht (Fig. 2B). Allen genannten Hauterkrankungen ist gemeinsam, dass in den Läsionen fokal konzentriert zahlreiche Entzündungszellen vorliegen, die dieselben inflammatorischen Zytokine freisetzen, die auch zu einer erhöhten GBP-1 -Expression führen. In den Gefäßen der gesunden Haut konnte GBP-1 in keinem Fall nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu waren in allen untersuchten entzündlichen Erkrankungen einzelne Gefäße deutlich positiv für GBP-1 (Fig. 2B, Pfeile). Diese Ergebnisse zeigten, dass GBP-1 tatsächlich auch in humanen Geweben eine inflammatorische Aktivierung von Endothelzellen anzeigt und als molekularer Marker für den Nachweis dieser Aktivierung in Geweben eingesetzt werden kann (Lubeseder-Martellato et al. 2002, Guenzi et al. 2001). Diese Nutzung als molekularer Marker war jedoch auf feste Gewebeproben beschränkt, da die beschriebenen Ergebnisse zeigten, das das Protein GBP-1 ein in der Zelle wirkendes Protein ist, das im Zytoplasma der Zelle lokalisiert ist. Entsprechend umfassten entsprechende Nachweise die z.B. die Gewinnung von festen Gewebeproben von Patienten. Eine Entnahme von festen Gewebeproben aus entzündlichem Gewebe geht jedoch mit nachteiligen Effekten für die Patienten einher und ist schwierig.
Die Induktion der GBP-1 -Expression durch inflammatorische Zytokine geht in Endothelzellen mit einer Hemmung der Zeilproliferation einher. Daher wurde untersucht, ob GBP-1 die durch inflammatorische Zytokine induzierte Proliferationshemmung vermittelt. Dazu wurden Endothelzellen mit retroviralen Vektoren transduziert, welche die konstitutive Expression von GBP-1 (GBP-1- Vektor) oder einer anf/se/7se-GBP-1-RNA (AS-Vektor) bewirken (Abb. 3A). Western blot-Analysen belegten, dass Endothelzellen die mit dem GBP-1 -Vektor transduziert wurden, GBP-1 sehr stark exprimierten (Fig. 3B). In Zellen, die mit dem AS-Vektor transduziert wurden, war die Induktion der GBP-1 -Expression durch IL-1ß effizient blockiert (Fig. 3B). Nachfolgende Proliferationsexperimente mit den verschiedenen transduzierten Zellkulturen zeigten, dass GBP-1 tatsächlich die durch angiogene Wachstumsfaktoren induzierte Zeilproliferation hemmt (Fig. 3C, weiße Balken) und darüber hinaus notwendig ist, dass inflammatorische Zytokine die Proliferation von Endothelzellen hemmen können (Fig. 3D). Letzteres äußert sich darin, dass in anf/sense-GBP-1-RNA exprimierenden Zellkulturen die Hemmwirkung inflammatorischer Zytokine auf die Zeilproliferation deutlich herabgesetzt ist (Fig. 3D, schwarze Balken) (siehe Guenzi et al. 2001). Darüber hinaus hemmt GBP-1 die Expression von Matrix-Metalloproteinase-1 und damit einhergehend die Invasion von Endothelzellen (siehe Guenzi et al., 2003).
Weiterführende Untersuchungen zur Struktur-/Funktionsbeziehung von GBP-1 zeigten, dass interessanterweise die Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen für Leukozyten, die ebenfalls durch inflammatorische Zytokine induziert wird, durch GBP-1 nicht beeinflusst wird (Guenzi et al. 2001). GBP-1 ist somit ein neuer, molekularer Marker für eine entzündliche Gefäßaktivierung, der selektiv die antiproliferative Wirkung inflammatorischer Zytokine auf Endothelzellen steuert.
Bislang konnte gezeigt werden, dass GBP-1 selektiv durch inflammatorische Zytokine induziert wird und dass dieser Prozeß mit einer anti-angiogenen Wirkung auf die betreffenden Zellen korreliert (Lubeseder-Martellato et al., 2002 und Guenzi et al., 2001). Während man sich die Induktion von GBP-1 über dessen antiproliferative Wirkung im Prinzip für medizinische Zwecke im Rahmen einer anti- angiogenen Therapie zu Nutze machen könnte, ist der Einsatz inflammatorischer Zytokine für derartige Zwecke aufgrund der pleiotropen und damit auch nachteiligen Effekte dieser Zytokine indiskutabel.
Obwohl ein Bedarf an geeigneten molekularen Markern für inflammotorische Erkrankungen besteht, sind eine Vielzahl von Zytokinen und Faktoren, die an der Entstehung und Entwicklung von inflammatorischen Erkrankungen beteiligt sind, im Stand der Technik aufgrund Ihrer Instabilität als für diesen Zweck ungeeignet beschrieben. Darüber hinaus ist eine Quantifizierung einzelner inflammatorischer Zytokine oder Faktoren nicht ausreichend für einen eindeutigen Befund und erfordert deshalb die Bestimmung einer Vielzahl unterschiedlicher Zytokine und Faktoren, die nur in einem sogenannten „Zytokinnetzwerk" ihre jeweilige Wirkung zeigen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit Verfahren bereitzustellen, welches eine einfache und gezielte Analyse der Expression von GBP-1 ermöglicht. Diese Verfahren sollte Aussagen über das Stadiums und Fortschreiten einer Entzündungsreaktion in einem Individuum oder in einem in vitro Modell ermöglicht ohne dass eine aufwendige Analyse und Quantifizierung von vielen verschiedenen inflammatorischen Faktoren des sogenannten Zytokinnetzwerks notwendig ist.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins im Kulturüberstand einer Gewebeprobe, einer Probe von Körperflüssigkeit oder einer Probe eines Zellkulturüberstandes, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) In Kontakt bringen der Probe mit einem ersten Rezeptor, der GBP-1 oder ein Fragmente dieses Proteins spezifisch bindet; und
(b) Nachweis einer spezifischen Bindung des Rezeptors mit GBP-1 oder einem Fragmente dieses Proteins. Der Begriff Fragment von GBP-1 beschreibt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise sowohl Fragmente des Proteins, welche die biologische Aktivität von GBP-1 besitzen wie im Stand der Technik wie auch in dieser Anmeldung beschrieben, als auch Fragmente des Proteins, die durch Spaltung, z.B. enzymatische Spaltung, entstehen und indikativ für inflammatorische Erkrankungen sind.
Der Begriff Körperflüssigkeiten umfasst im Zusammenhang mit der Erfindung alle Arten von Körperflüssigkeiten, ggf. verdünnt oder aufkonzentriert. Beispiele sind Blut/Serum, Plasma, Fruchtwasser, Hirn-Rückenmarkflüssigkeit, Liquor, Zerebro- spinalflüssigkeit, Sputum, Rachen und Schlund-Sekrete und andere Schleimhaut- sekrete, Synovialflüssigkeit, Ascites, Tränenflüssigkeit, Lymphflüssigkeit und Urin. Der Begriff der „spezifische Bindung" beschreibt erfindungsgemäß eine spezifische Interaktion oder Wechselwirkung zwischen einem Rezeptor und einem Liganden. Ein Beispiel für einen solchen Liganden ist GBP-1 oder Fragmente dieses Proteins. Die spezifische Interaktion oder Wechselwirkung kann mit einem „Schlüssel-Schloß- Prinzip" charakterisiert werden. Der Rezeptor und der Ligand besitzen Strukturen oder Motive, die spezifisch zueinander passen, wie z.B. eine antigene Determinante (Epitop), die mit der Antigen-Bindungstelle eines Antikörpers wechselwirkt. Entsprechend steht spezifische Interaktion im Gegensatz zu einer universelleren, unspezifischen Wechselwirkung.
Es wurde gezeigt, dass GBP-1 ein Markerprotein für Entzündungsreaktionen ist, dass überraschenderweise u.a. von endothelialen Zellen und Monozyten sezemiert wird. Durch diesen überraschenden Befund wird es möglich GBP-1 im Kulturüberstand von Gewebeproben, Proben von Körperflüssigkeit oder Proben von Zellkulturüberständen zu analysieren und eine Aussage über das Stadium einer entzündlichen Erkrankung zu treffen. Sezemiertes GBP-1 kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einfach und schnell nachgewiesen werden und dient somit als krankheitsassoziierter diagnostischer Parameter.
Der Nachweis einer entzündlichen Aktivierung von Endothelzellen und Monozyten in der Körperflüssigkeit von Patienten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist auf Grundlage des überraschenden Befundes von besonderer Bedeutung bei Entzündungserkrankungen, bakteriellen und viralen Infektionserkrankungen (AIDS, Menigitis), Allergien, Transplantationsreaktionen, Herz-Kreislauf- und Tumorerkrankungen usw. Darüber hinaus sind diese von Bedeutung für die Bestimmung der Ansprechreaktion bei Patienten unter der Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z.B. Interferon-α); siehe Figur 5. Der Nachweis, bzw. die quantifizierte Menge von GBP-1 in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten ermöglicht Rückschlüsse auf den Aktivierungsgrad von Endothelzellen und Monozyten und damit eine Aussage über das Krankheitsbild des Patienten.
Verfahren zur Gewinnung von den genannten Proben sind dem Fachmann bekannt. Optional umfasst das erfindungsgemäße Verfahren darüber hinaus einen oder mehrere Waschschritte vor oder nach jedem Verfahrensschritt. Diese Waschschritte dienen der Minimierung von unspezifischen Reaktionen (falsch positiver oder falsch negativer Nachweis) und können die Sensitivität des Verfahrens verbessern. Geeignete Wachpuffer und deren Zusammensetzung sind dem Fachmann im Prinzip bekannt; siehe z.B. Harlow und Lane. Bevorzugt sind physiologische Pufferlösungen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst darüber hinaus den Schritt (a') oder (a") vor dem in Kontakt bringen mit dem ersten Rezeptor:
(a') Markieren der in der Probe enthaltenen Proteine; oder (a") Markieren des ersten Rezeptors. Die in der Probe enthaltenen Proteine und/oder der erste Rezeptor können beispielsweise chemisch markiert werden, z.B. durch die Kopplung von markierten chemischen Gruppen oder Markern an die freien Aminogruppen von in den Proteinen enthaltenen Cysteine. Beispiele für solche markierte chemische Gruppen sind Gruppen, die spezielle, nachweisbare Radioisotope enthalten. Als Marker können z.B. auch Fluoreszenzfarbstoffe dienen. Ein weiteres Beispiel für entsprechende Marker stellen Nukleinsäuren dar. Die Anwesenheit von auf diese Weise markierten Proteinen oder Rezeptoren in einer Probe kann dann mit geeigneten Primern in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden. Des weiteren ist es möglich Proteine physiologisch zu markieren, d.h. durch den metabolischen Einbau von markierten Molekülen. Zu diesem Zweck werden Zellen beispielsweise mit radioaktiv markierten Metaboliten inkubiert. Proteine, die während dieser Inkubationszeit aus der Biosynthese dieser Zellen hervorgehen und in welche die markierten Metaboliten eingebaut wurden, sind makiert. Dieses Verfahren ist z.B. geeignet, um von antikörperproduzierenden Zellen sezernierte Antikörper zu markieren.
In einer weitern bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Rezeptor vor dem in Kontakt bringen mit GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins auf einer Oberfläche immobilisiert.
Entsprechend einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Rezeptor nach dem in Kontakt bringen mit GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins auf einer Oberfläche immobilisiert. Rezeptoren können auf vielfältige Weise immobilisiert werden. Das entsprechende Verfahren hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z.B. von der Art des Rezeptors oder dem Material der Oberfläche. Eine Immobilisierung kann kovalent oder durch Adsorption erfolgen. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Rezeptoren Proteine, besonders bevorzugt Antikörper. Ebenso bevorzugt ist auch die Verwendung von Peptiden oder organischen Molekülen als Rezeptoren.
Für die Immobilisierung von Rezeptoren, die Proteine sind, werden Verfahren beschrieben, bei welchen diese direkt auf einer Oberfläche mittels passiver Adsorption immobilisiert werden. Üblicherweise besteht eine entsprechende Oberfläche aus einem polymeren Kunststoff (z.B. Polystyrol, Polyvinyl, Latex) und z.B. in Form von Mikrotiterplatten oder Multi-well-Platten, Membranen oder sphärischen Εeads' (quervernetzten Polymeren in Partikelform) für diesen Zweck verwendet (Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997), 401-24).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Material der Oberfläche ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Sepharose, Latex, Glass, Polystyrol, Polyvinyl, Nitrocellulose und Silicium. Weiter bevorzugt ist die Oberfläche in dem erfindungsgemäßen Verfahrens eine Membran, ein Kügelchen, ein Chip oder eine Platte.
Beispiele für Kügelchen sind Sepharose-beads oder Latex-beads, an die optional Liganden gebunden sind, die eine Immobilisierung der Rezeptoren an die Oberfläche begünstigen. Solche Liganden sind beispielsweise Protein-A oder Protein-G, die eine Bindung von Antikörper an eine Oberfläche über den Fc-Teil der Antikörper begünstigen. Die Bindung des Rezeptors an Trägermaterial kann auch durch eine kovalente chemische Kopplungsreaktion (z.B. Hydrazid-Kopplung) erreicht werden. Beispiel 3 beschreibt ein entsprechendes Verfahren. Ein anderes Beispiel für die Immobilisierung der Rezeptoren an die Oberfläche unter Verwendung von Liganden ist die Verwendung von Biotin und Avidin, bzw. Streptavidin.
Beispiele für Chips sind Siliziumplatten, auf die eine Vielzahl von verschiedenen oder gleichen Rezeptoren geordnet imobilisiert werden kann. Dies ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von unterschiedlichen Parametern in einer Probe oder die Analyse einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben auf einen oder mehrere Parameter hin, z.B. Identifizierung und/oder Quantifizierung von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins in unterschiedlichen Gewebeproben, Proben von Körperflüssigkeit oder Proben von Zellkulturüberstanden. Beispiele für die genannten Platten sind Mikrotiterplatten oder Multi-well-Platten. Diese besitzen vorzugsweise 6, 12, 24, 48, 96, 128, 356, 1024 oder mehr Vertiefungen. In Beispiel 4 ist ein Verfahren beschrieben, in dem 96well-Platten verwendet werden.
Entsprechend einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst dieses darüber hinaus den Schritt (a'") vor dem Schritt des Nachweises einer spezifischen Bindung:
(a'") präzipitieren der Kügelchen mit den daran gebundenen Komplexen aus erstem Rezeptor und GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins Kügelchen können aus einer Probe z.B. gravimetrisch prazipitiert werden. Dies kann beispielsweise durch Zentrifugation beschleunigt werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann u.a. aus Rehm, Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, Spektrum Akademischer Verlag, 2002 bekannt. Des weiteren wird eine entsprechende Präzipitation in Beispiel 3 beschrieben.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der Nachweis der spezifischen Bindung in Schritt (b) eine gelelektrophoretische Auftrennung, optional darüber hinaus eine Western-Blot- Analyse (siehe Beispiel 3). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann u.a. aus Rehm, loc. cit. bekannt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zum Nachweis einer spezifischen Bindung von GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins an den ersten Rezeptor in Schritt (a) die Probe mit einem zweiten Rezeptor für GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins in Kontakt gebracht, der an ein Epitop von GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins bindet, das nach Bindung des ersten Rezeptors an GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins zugänglich ist. Diese bevorzugt Ausführungsform betrifft beispielsweise Verfahren, die sich das mechanistische Prinzip des Sandwich-ELISA's zu Nutze machen. Dieses Prinzip ist dem Fachmann allgemein bekannt und wird u.a. in Stryer, Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag, 1996 beschrieben. Ein entsprechendes Verfahren ist darüber hinaus im beigefügten Beispiel 4 beschrieben.
Weiter ist der zweite Rezeptor für GBP-1 oder Fragmente dieses Proteins in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens markiert. Verfahren, die eine Markierung eines Rezeptors ermöglichen, wurden oben beschrieben und können auch hier eingesetzt werden.
Darüber hinaus ist bevorzugt, dass die Markierung des zweiten Rezeptors für GBP- 1 oder eines Fragmentes dieses Proteins ein signalgebendes System umfasst. Ebenso bevorzugt ist eine spezifische Erkennung der Markierung durch einen weiteren, dritten Rezeptor, der ein signalgebendes System umfasst. Ein Beispiele für ein solches signalgebendes System ist die oben beschriebene Isotopenmarkierung, wobei das Signal die Abgabe von radioaktiver Strahlung ist. Ebenso resultiert eine Fluoreszenzmarkierung des entsprechenden Rezeptors in der Markierung mit einem signalgebenden System im Sinne der Erfindung, wobei das Signal die Emission eines Fluoreszenzsignals nach entsprechender Anregung des Farbstoffes ist.
Weiter bevorzugt umfasst das signalgebende System erfindungsgemäß ein Enzym, das ein Signal abgibt. Beispiele für solche Enzyme umfassen alkalische Phosphatasen, Peroxidasen, ß-Galaktosidase, Glukoamylase, Urease und Chloramphenikol-Azetyltransferase. Entsprechende Beispiele und der Einsatz notwendiger Substrate für den Nachweis mit Hilfe von enzymatischen Reaktionen sind dem Fachmann bekannt, u.a. aus den Beipackzetteln kommerzielle erhältlichen Nachweiskits oder aus Rehm, loc. cit. Solche kommerzielle erhältlichen Nachweiskits enthalten oft Antikörper, die Antikörper bestimmter Spezies erkennen, z.B. anti-Maus, und an die signalgebende Enzyme gekoppelt sind. Somit stellen entsprechende Antikörper ein Beispiel für einen dritten Rezeptor dar, die eine bestimmte Markierung des zweiten Rezeptors, nämlich dessen Fc-Teil erkennen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der erste und der zweite Rezeptor und, optional, auch der dritte Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Polypeptiden, niedermolekularen Substanzen, Antikörpern oder Fragmenten oder Derivaten davon und Aptameren.
Der Begriff Peptide bezeichnet üblicherweise Aminosäureketten mit bis zu 30 Aminosäuren. Der Begriff Polypeptide bezeichnet Peptide, die üblicherweise mehr als Aminosäureketten 30 Aminosäuren umfassen und schließt Proteine ein. Unter dem Begriff "niedermolekulare Substanzen" oder kleine Moleküle werden Moleküle verstanden, die von geringerer molekularer Komplexität sind, als die oben definierten Makromoleküle. In der Literatur wird der Begriff "niedermolekulare Substanzen" nicht einheitlich verwendet. In WO 89/03041 und WO 89/03042 werden Moleküle mit Molekülmassen bis 7000 g/mol als kleine Moleküle beschrieben. Üblicherweise werden jedoch Molekülmassen zwischen 50 und 3000 g/mol, häufiger aber zwischen 75 und 2000 g/mol und meistens im Bereich zwischen 100 und 1000 g/mol angegeben. Beispiele sind dem Fachmann aus den Schriften WO86/02736, W097/31269, US-A-5928868, US-A-5242902, US-A-5468651, US-A-5547853, US-A-5616562, US-A-5641690, US-A-4956303 und US-A-5928643 bekannt. Niedermolekulare Substanzen können organischer oder anorganischer Natur sein.
Der Begriff „Antikörper" umfasst erfindungsgemäß polyklonale Sera, wie auch monolonale Antikörper.
Monoklonale Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt. Diese basieren auf einer zuerst von Köhler und Milstein (1975) beschriebenen Methode. Diese ist u.a. in dem Laborhandbuch von Harlow und Lane (Antibodies, A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory; (1988); Chapter 6) detailliert beschrieben. Durch die Definition umfaßt sind ebenfalls bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper und Fragmente oder Derivate dieser Antikörper. Diese umfassen Fragmente wie Fab, Fv oder scFv und chemisch modifizierte Derivate dieser Antikörper oder Antikörperfragmente.
Aptamere sind dem Fachmann dem Fachmann im Prinzip aus dem Stand der
Technik bekannt.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein ELISA, EIA, oder RIA. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann im Prinzip bekannt aus Harlow und Lane, loc. cit. und Rehm, loc. cit.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise automatisiert ausgeführt. Dies ist u.a. möglich durch die Verwendung von Pipetierrobotern und für eine automatisierte Auswertung optimierter Arbeitsgänge.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Körperflüssigkeit oder einer Probe eines Zellkulturüberstandes, wie vorstehend definiert, zum Nachweis von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins, wobei der positive Nachweis indikativ ist für das Vorhandensein einer inflammatorischen Erkrankung.
Die weiteren (bevorzugten) Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung entsprechen den für das oben beschriebene Verfahren.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 : Komplexität und Redundanz entzündlicher Endothelzellaktivierung.
(A) Die Aktivierung des Endothels bei entzündlichen Prozessen wird durch eine Vielzahl verschiedener löslicher Faktoren aus dem Blut und von benachbarten Zellen gesteuert. Dabei stehen im Rahmen der Neu- und Rückbildung von Gefäßen, sowie der Extravasation von Leukozyten die Steuerung von Zeilproliferation, Apoptose, Invasion, Migration und Adhäsionsfähigkeit für Leukozyten im Vordergrund.
(B) Die Vielzahl der beteiligten Faktoren legt nahe, dass mehrere Faktoren ein- und dieselbe Aktivierung beeinflussen und zu wirkungsgleichen Gruppen zusammengefasst werden können. Gegenwärtig kann nicht bestimmt werden, wann und wo die verschiedenen Faktoren auf die einzelnen Endothelzellen einwirken. Darüber hinaus sind die Beziehungen der meisten Aktivierungsarten zueinander weitgehend unbekannt. Es ist zu bestimmen, ob alle Aktivierungen gleichzeitig in einer Zelle auftreten können (I) oder aufgrund zellbiologischer Restriktionen zeitlich, beziehungsweise räumlich separiert sein müssen (II). Fig. 2: Expression von GBP-1 in kultivierten Endothelzellen und in entzündlichen Erkrankungen der Haut.
(A) Western Blot-Analyse der GBP-1 Expression in Endothelzellen, die mit den aufgeführten Faktoren für 24 h stimuliert worden waren. Folgende Konzentrationen wurden eingesetzt: IFN-γ (100 U/ml), IL-1α (5 ng/ml), IL-1 ß (200 U/ml), TNF-α (300 U/ml), IL-4 (10 U/ml), IL-6 (50 U/ml), IL-10 (50 ng/ml), IL-18 (100 ng/ml), Oncostatin M (10 ng/ml), MCP-1 (50 ng/ml), PF4 (25 ng/ml), SDF-1α (200 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), VEGF (10 ng/ml), Ang-2 (800 ng/ml) und PDGF B/B (100 ng/ml). Der gleichzeitige Nachweis des Zytoskelettproteins Aktin zeigt, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden.
(B) Induktion der GBP-1 -Expression in vaskulären Endothelzellen bei Hauterkrankungen mit einer inflammatorischen Komponente. Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von GBP-1 (grün) und dem Endothelzell-assoziierten Antigen CD31 (rot) in Gewebeschnitten von gesunder Haut, Kaposi-Sarkom, entzündlicher Arzneimittelgegenreaktion der Haut und Psoriasis. Die Überlagerung der Bilder zeigt eine Ko-Expression (gelb) von GBP-1 und CD31 (weiße Pfeile). (Modifiziert nach (Lubeseder-Martellato, Guenzi et al. 2002))
Fig. 3: GBP-1 vermittelt die antiproliferative Wirkung inflammatorischer Zytokine in Endothelzellen.
(A) Schematische Darstellung des retroviralen Expressionsvektors pBabePuro (Kontrollvektor, K-Vektor) in den die cDNA von GBP-1 in beiden Orientierungen für die konstitutive Expression von GBP-1 (GBP-1 -Vektor) und für die Expression einer GBP-1-arϊf/sense-RNA (AS-Vektor) eingesetzt wurde. (B) GBP-1 -Expression in K-, GBP-1-, und AS-Vektor transduzierten Endothelzellen, die entweder unbehandelt waren oder über einen Zeitraum von 24 h mit 20 U/ml IL- 1ß stimuliert wurden. Der Nachweis der GBP-1 -Expression erfolgte mittels Western- Blot-Analyse mit einem polyklonalen anti-GBP-1 -Antikörper. Die gleichzeitige Färbung mit Aktin zeigt, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden. (C) Proliferationsexperimente mit K-Vektor- und GBP-1-Vektor-transduzierten Endothelzellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen angiogener Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF in Kombination). (D) Proliferationsexperimente von K-Vektor- und AS-Vektor-transduzierten Endothelzellen in Anwesenheit angiogener Wachstumsfaktoren und aufsteigender Konzentrationen von IL-1ß. (Modifiziert nach (Guenzi, Topolt et al. 2001))
Fig. 4: Nachweis von GBP-1 Protein in Kulturmedium von IFN-γ stimulierten HUVEC durch ELISA und Immunopräzipitation
HUVEC wurden Stimuliert mit 100 U/ml IFN-γ (IFN-γ) oder unbehandelt gelassen
(Medium). Nach 24 h Kultur wurde das Kulturmedium durch ELISA (A) oder
Immunopräzipitation (B) analysiert. (A) Eine Verdünnungsserie mit rekombiantem aufgereinigtem GBP-1 wurde als
Standard verwendet (weiße Säulen). Die Menge von sekretiertem GBP-1 Protein wurde im ELISA bestimmt (graue Säulen). Die Absorption wurde bei 405 nm bestimmt.
(B) Westemblot-Analyse von immunopräzipitierten menschlichem GBP-1 Protein mit monoklonalem anti GBP-1 Antikörper (Klon 1B1) aus dem selben
Kulturüberstand wie in (A).
Fig. 5: Messung von zirkulierendem GBP-1 im Plasma von IFN-α behandelten Patienten Bei Melanom-Patienten, die für 9 bzw. 28 Tage mit IFN-α behandelt wurden, wurde die Konzentration von zirkulierendem GBP-1 im Plasma mittels ELISA bestimmt. Dargestellt ist der Anstieg der GBP-1 Konzetration von Tag 9 zum Tag 28 bei drei Pateinten. ELISA-Mikrotiterplatten wurden mit einem monoklonalen Ratten anti- GBP-1 Antikörper, Klon 1 B1, für 16 h bei 4°C beschichtet. Anschließend wurden die Platten mit PBS-T (0,1 % Tween 20 in PBS) und für 30 min wurden bei Raumtemperatur (RT) freie Bindungsstellen mit PBS-T/BSA 2 % (PBS-TB) abgesättigt. Nach dem absaugen des PBS-TB erfolgte Inkubation (2 h) mit je 100 μ\ verschiedener Plasma Proben (1 :2) bei RT. Als Standard wurde gereinigtes GBP-1- His Protein, verdünnt in Zellkulturmedium (EMB-0,5% FCS) benutzt. Als Negativkontrolle diente BSA. Die Proben wurden 4x mit PBS-T gewaschen, je 100 μ\ polyklonaler Kaninchen anti-GBP-1 Antikörper (1 :500) zugegeben und für 2 h bei RT inkubiert. Nach viermaligen Waschen mit PBS-T erfolgte eine Inkubation (1 h,RT) mit je 100 μ\ AP-konjugiertem anti-Kaninchen Antikörper (1 :500 verdünnt in PBS-TB). Nach vier weiteren Waschschritten wurde der GBP-1 Protein/Antikörper- Komplex durch Inkubation mit 100 μ\ p-Nitrophenyl Phosphat visualisiert. Die Absorption wurde bei 405 nm im Mikroplatten-Reader gemessen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte anhand einer Standardkurve für die steigende Konzentrationen von gereinigtem GBP-1-His verwendet wurden. Sie Linearität der Messung ist für einen Bereich von 0,1 bis 100 ng/ml gegeben.
Fig. 6: Die Sekretion von GBP-1 Protein aus IFN-γ behandelt HUVEC ist nicht zunehmende Zellmembranpermeabilität oder Apoptose zurückzuführen
Färbung von HUVEC mit dem nicht membrangängigen Farbstoff „Dead-Red"
(Molekular Probes).
HUVEC wurden über Nacht in 0,5 % FBS-haltigen EBM-Medium kultiviert und mit
100 U/ml Interferon-γ (IFN-γ, Röche) stimuliert. Kontrollzellen (Medium) wurden unbehandelt belassen. 24 h nach der Stimulierung wurden die Zellen mit Dead-Red
Farbstoff angefärbt. Zellen, die eine veränderte Membranpermeabilität aufweisen
(schwarze Balken), sind als Prozentsatz der Gesamtzahl (weiße Balken) angegeben.
Fig.7. Der ELISA reagiert spezifisch mit GBP-1 und nicht mit den heterologen Proteinen BSA und eGFP
(A) Die Spezifität des GBP-1 -ELISA wurde in mehreren Kontrollexperimenten bestimmt. Zunächst wurde mit dem ELISA eine Verdünnungsreihe von gereinigtem GBP-1-His (ein GBP-1 -Protein, das aus Bakterien gereinigt wurde und zum Zwecke der Aufreinigung mit 6 Histidinresten am Carboxyterminus versehen ist) in PBS in den angegebenen Konzentrationen erzeugt und im ELISA gemessen. Hierbei wurde ein konzentrationsabhängiger Anstieg der Absorption bei 405 nm (A405) beobachtet (schwarze Balken). Wenn anstelle des anti-GBP-1 -Kaninchenserums (wird als zweiter Antikörper zum Nachweis des gebundenen GBP-1 eingesetzt) ein Präimmunserum des Kaninchens verwendet wurde, wurden keine Signale erhalten (weiße Balken). Beim Zusatz aufsteigender Konzentrationen heterologer Proteine [BSA (graue Balken), His-eGFP (gestreifte Balken)] wurden mit dem GBP-1- spezifischen ELISA ebenfalls keine Signale beobachtet. (B) Der GBP-1 -ELISA zeigt eine geringe Reaktivität mit dem GBP-1 -homologen GBP-2.
Mit dem GBP-1 -ELISA wurden Lösungen untersucht, die aufsteigende Mengen an GBP-1-His (schwarze Balken), His-GBP-1 (weiße Balken, ein GBP-1 -Protein, das aus Bakterien gereinigt wurde und zum Zwecke der Aufreinigung mit 6 Histidinresten am Aminoterminus versehen ist) und His-GBP-2 [graue Balken, einem zu GBP-1 homologen Protein (Homologie auf Aminosäureebene 76 %, auf Nukleinsäureebene 82 %) mit 6 Histidinresten am Aminoterminus] enthielten. Der Vergleich der Steigungen der Messwerte für GBP-1-His (schwarze Balken), His- GBP-1 (weiße Balken) und His-GBP-2 (graue Balken) zeigte, dass die Reaktivität dieses ELISA mit GBP-2 im Vergleich zur Reaktivität mit GBP-1 verringert ist und das die Histidinreste am Amino- oder Carboxyterminus die Reaktivität von rekombinantem GBP-1 nicht beeinflussen. Zusätzlich wurden immunchemische Blockierungsversuche durchgeführt, um die Spezifität der Bindung von gereinigtem GBP-1-His and die mit Ratten-anti-GBP-1- Antikörpern beschichtete ELISA-Platte zu bestimmen. Hierzu wurde GBP-1-His in verschiedenen Verdünnungen mit (schwarz-weiße Balken) oder ohne (schwarze Balken) Ratten-anti-GBP-1 -Antikörper inkubiert und nachfolgend auf die Platte gegeben. In den Ansätzen, in denen GBP-1-His nicht mit Antikörpern vorinkubiert wurde, wurde eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Signalstärke beobachtet (schwarze Balken). Wohingegen, durch Vorinkubation mit anti-GBP-1 -Antikörpern (schwarz-weiße Balken) die Bindung von GBP-1 an die Plattenoberfläche blockiert werden konnte. In einem vergleichbar durchgeführten Ansatz konnte auch die Bindung von His-GBP-2 durch Vorinkubation mit dem Ratten-anti-GBP-1 -Antikörper blockiert werden (grau-weiße Balken).
Fig. 8: Bestimmung des linearen Nachweisbereichs des ELISA
(A) Gepoolte Seren gesunder Personen wurden 1:2 (Quadrate), 1 :4 (Kreise), 1:8 (Dreiecke) und 1 :16 (Rauten) in PBS/2% BSA verdünnt. In die unterschiedlichen Verdünnungen wurden jeweils aufsteigende Konzentrationen von GBP-1-His zugegeben. Nachfolgend wurden alle Proben mit dem GBP-1 -ELISA vermessen. Es zeigte sich, dass bei jeder der unterschiedlichen Serumverdünnungen die Nachweissignale (A405) mit der GBP-1 -Konzentration zunahmen. (B) Zwischen 0 und 200 ng/ml wurde bei den in (A) beschriebenen Ansatz eine lineare Zunahme des Signals beobachtet.
Fig.9: Bei Patienten mit Entzündungserkrankungen sind erhöhte GBP-1 Konzentrationen im Serum nachweisbar
Die GBP-1 Konzentration wurde mittels ELISA in gesunden Kontrollpersonen (n = 20) und in Seren von Patienten mit verschiedenen Entzündungserkrankungen (n = 10) gemessen: Systemischer Lupus Erythematosus (SLE) (n = 5) und Arthritis (n = 5), diese Erkrankungen sind generalisierte Entzündungen, und in Patienten mit Erysipel (n=8), eine örtlich begrenzte Entzündung der Haut.
Die GBP-1 Serumkonzentrationen wurden bestimmt, wobei die Serum-Proben 1:2 verdünnt wurden. Die Konzentration von GBP-1 in den Proben wurde mit Hilfe einer Standardkurve berechnet. Da das ELISA-Verfahren auch GBP-2 erkennt und möglicherweise auch GBP-2 im Serum vorhanden ist, wurden die ermittelte Konzentrationen in relativen Einheiten angegeben.
Die GBP-1 Serumkonzentrationen waren deutlich erhöht bei den Patienten mit SLE (Mediän: 46,1 relative Einheiten) und Arthritis (Mediän: 58,2 relative Einheiten) aber nicht in Patienten mit Erysipel (Mediän: 8,6 relative Einheiten) im Vergleich zu den Kontrollpersonen (Mediän: 13,3 relative Einheiten). Die Unterschiede der GBP-1 Konzentrationen bei Patienten mit SLE und Arthritis und der GBP-1 Konzentration in gesunden Kontrollpersonen sind statistisch signifikant (Wilcoxon-Test p < 0,01 für SLE und Arthritis).
Fig.10: Bei Patienten mit bakterieller Meningitis sind erhöhte GBP-1- Konzentrationen im Liquor nachweisbar
In einem Blindversuch wurde mittels ELISA die GBP-1 Konzentration in 17 Liquor- Proben nachgewiesen (Figur 10). Nach Entblindung des Versuches zeigte sich, dass bei Patienten mit bakterieller (Pneumokokkus, Staphylokokkus aureus, Pseudomonas aeruginosa) Meningitis (n = 8) im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (n = 9) signifikant erhöhte (Wilcoxon-Test p<0,03) GBP-1 Konzentrationen im Liquoren nachweisbar waren (Kontrollpersonen = 36,6 relative Einheiten und bakterieller Meningitis = 105,8 relative Einheiten). Die GBP-1 Liquorkonzentrationen wurden bestimmt wie beschrieben. Die Liquor-Proben wurden 1 :2 in PBS verdünnt. Die Konzentration von GBP-1 in der Probe wurde mit Hilfe einer Standardkurve berechnet. Da das ELISA-Verfahren auch GBP-2 erkennt und möglicherweise auch GBP-2 im Liquor vorhanden ist, wurden die ermittelte Konzentrationen in relativen Einheiten angegeben.
Die GBP-1 Konzentration im Liquor gesundern Kontrollpersonen zeigten keinen statisch signifikanten Unterschied (Wilcoxon-Test p>0,05) zu den GBP-1 Konzentrationen im Serum. Dies weist darauf hin, dass GBP-1 nicht im Liquor gesunder Parsonen angereichert ist und dass der Anstieg der GBP-1 Konzentrationen bei Patienten mit Meningitis krankheitsbedingt ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Herstellung eines Vektorkonstruktes
Das 237 bp GBP-1 Promotorfragment (pro237-GBP-1) wurde mittels PCR- Amplifikation (PCR 2 Advantage Kit, Clontech) von dem Konstrukt pro3757-GBP-1 mit den Oligonukleotiden 5'-ATTTGAAGCTTCTGGTTGAG-3' [einfügen einer Hindlll-Schnittstelle (unterstrichen)] bzw. 5'-TGGCTTCTAGCACTTCTG-3' generiert. Das Konstrukt pro3757-GBP-1 enthält 3757 bp der 5'-regulatorischen Sequenz aufwärts des ATG-Kodons des GBP-1 Gens (gi:4503938, NM_002053) im Vektor pT-Adv (Clontech). Das 237 bp Fragment wurde in Antisense-Orientierung mit dem Vektor pT-Adv ligiert, mit Hindlll geschnitten und in den pGL3-Basic Vektor (Promega) subkloniert. Alle Konstrukte wurden mit dem Endofree Maxi Kit (Qiagen) aufgereinigt und zur Verifizierung sequenziert.
Beispiel 2: Etablierunq einer geeigneten Zellinie
HEK 293 T-Zellen (humane embryonische epitheliale Nierenzellinie mit humanen Adenovirus Typ 5 (Ad 5) DNA transformiert (ATCC CRL 1573), welche zusätzlich mit SV40 T Antigen transformiert sind) wurden mit 3x105 Zellen/Well (6-Multi-Well Platte, Corning) 24 h vor der Transfektion ausgesät. Pro Well der 6-Well Platte wurden gesamt 0,8 μg Plasmid verwendet, wobei das Testplasmid pro237-GBP-1 im Verhältnis 1 :5 mit dem Selektionsplasmid pBABE-Puro (P. Monini, Laboratory of Virology, Instituto Superiore di Santiä, Rome, Italien) eingesetzt wurde. Das Testplasmid pro237-GBP-1 enthält das 237 bp Promotorfragment gekoppelt an das Indikatorgen firefly-Luziferase, das Selektionsplasmid pBABE-Puro das Resistenzgen Puromycin, worauf anschließend selektioniert wird. Die Transfektion der Zellen wurde analog Vorschrift des Herstellers mit Effectene (Qiagen) durchgeführt und nach 24 h die Selektion mit 0,7 μg/ml Puromycin (Sigma) begonnen. Bei Tag 8-10 konnte das Wachstum von Einzelklonen beobachtet werden, die anschließend mit Klonierringen trypsiniert und in Einzelwells einer 96- well Platte (Falcon) überführt wurden. Bei entsprechender Konfluenz wurden die Klone weiter passagiert und auf ihre Reportergen-aktivität im Luziferaseassay untersucht. Die Klone wurden mit inflammatorischen Zytokinen IFN-γ, IL-1ß und TNF-α, sowie Buffer für 5 h stimuliert und in 1x „passive lysis buffer" (Promega) abgeerntet. Die Lysate wurden auf firefly-Luziferase-Aktivität untersucht und entsprechend stabile Klone etabliert.
Beispiel 3: Immunopräzipitation von GBP-1
Frisch hergestellte Zelllysate wurden vorgereinigt durch Inkubation mit 2 μ\ nicht mit GBP-1 reagierendem Präimmunserum von Kaninchen und 25 μ\ Protein A/G Agarosebeads für mindestens 3 h bei 4°C auf einer Schüttelplattform. Nach dem Pelletieren der Beads wurde der Überstand mit 25 μ\ Protein A/G Agarosebeads und 1 μ\ von polyklonalem Kaninchenserum gegen GBP-1 über Nacht bei 4°C auf einer Schüttelplattform inkubiert. Die Beads wurden vier bis fünf mal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Beads in 30 μl Laemmli-Probenpuffer (2X) resuspendiert und für 5 min gekocht. Die Proben wurden in einer SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und in einem Westemblot oder in einer Autoradiographie analysiert. Für die Immunopräzipitation von GBP-1 oder MMP-1 aus Zellkulturüberständen wurden 10 ml Kulturmedium auf Eis gestellt, 5 min zentrifugiert bei 1000 rpm, filtriert durch einen Filter mit einer Porengröße von 45 μm und in einigen Fällen ein Proeinaseninhibitor-Cocktail (0,02 mg/ml Pankreasextrakt, 5 μg/ml Pronase, 0,5 μg/ml Thermolysin, 3 μg/ml Chymotrypsin und 0,33 jm/ml Papin) zugegeben. Die Vorreinigung wurde ausgeführt durch Inkubation mit 10 μl Kaninchenserum und 120 μl Protein A/G Agarosebeads für mehr als 3 h bei 4°C auf einer Schüttelplattform. Nach dem Pelletieren der Beads wurde der Überstand mit 120 μl Protein A/G Agarosebeads und 6 μl von polyklonalem Kaninchenserum gegen GBP-1 über Nacht bei 4°C auf einer Schüttelplattform inkubiert. Die Beads wurden vier bis fünf mal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Beads in 60 μl PBS + 60 μl Laemmli-Probenpuffer (2X) resuspendiert und für 5 min gekocht. Üblicherweise wurden 15 μl jeder Probe in einer SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und in einem Westernblot analysiert.
Ein Beispiel für das Ergebnis eines Nachweises von GBP-1 durch Immunopräzipitation aus Kulturmedium ist in Figur 4B dargestellt.
Beispiel 4: GBP-1 ELISA
Für den entwickelten GBP-1 ELISA wurden folgende Puffer verwendet: PBS enthaltend 0,1% Tween 20 (PBS-T) und PBS enthaltend 0,1 % Tween 20 und 2% BSA (PBS-TB).
96-well-ELISA-Platen (Nunc-Immuno Plates) wurden beschichtet mit 100 μl/well anti-GBP-1 Hybridomaüberstand (im Verhältnis 1 :5 mit PBS verdünnt) oder mit gereinigtem Rezeptor in der Konzentration von 1-5 μg/ml (Inkubation für 16 h bei 4°C). Die Platten wurden mit PBS-T gewaschen und geblockt mit PBS-TB für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Die wells wurden abgesaugt und als Dubletten für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert mit 100 μl des Standards (GBP-1- His, verdünnt in Zellkulturmedium enthaltend 5% FBS), der gleichen Konzentration von BSA als Kontrolle oder mit 100 μl einer Probe in geeigneter Verdünnung (verdünnt in PBS). Die wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl eines polyklonalen Antikörpers gegen GBP-1 , verdünnt in 1 :500 in PBS-TB für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl einer alkalinen Phosphatase, die an einen antiKaninchen Antikörper konjugiert ist (Zymed, Berlin, Germany), verdünnt 1 :500 in PBS-TB, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl von p-Nitrophenyl Phosphat (Zymed) inkubiert. Die Absorption wurde bei 405 nm in einem „microplate reader" (BioRad) bestimmt. Die Konzentration von GBP-1 in der Probe wurde mit Hilfe der Standardkurve berechnet. Das Verfahren zeigte eine Linearität von 0,1 bis 100 ng/ml von GBP-1/well. Die Variabilität der Ergebnisse in unterschiedlichen Assays lag zwischen 2,3 und 6%. Ein Beispiel für das Ergebnis eines Nachweises von GBP-1 in Kulturüberstand durch ELISA ist in Figur 4A dargestellt.
Die Sensitivität des ELISAs wurde anhand einer Verdünnungsreihe von GBP-1-His (ein G BP- 1 -Protein, das aus Bakterien gereinigt wurde und zum Zwecke der Aufreinigung mit 6 Histidinresten am Carboxyterminus versehen ist) in PBS bestimmt.
Die Sensitivität des ELISA wurde festgelegt als die niedrigste Konzentration an GBP-1-His, bei der der zugehörige Messwert sich signifikant, das heißt um mindestens zwei Standardabweichungen, von dem Messwert unterschied, der beim Ansatz ohne GBP-1-His (plus zwei Standardabweichungen) erhalten wurde. Hierbei wurde die Sensitivität des hier beschriebenen ELISA mit 12,3 ng/ml bestimmt.
1. Intra-Assay- Variabilität.
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse innerhalb eines Versuchs wurde durch dreifach Messungen bestimmt. Dabei wurde die Variabilität auf folgende Weise berechnet:
Variabilität = (Standardabweichung / Mittelwert) X 100 %.
Es wurden durch Zugabe von GBP-1-His in Serum (1 :2 in PBS verdünnt) eines gesunden Probanden drei Testlösungen mit unterschiedlichen GBP-1-His Konzentrationen (400 ng/ml, 180 ng/ml, 40 ng/ml) erzeugt. Mit jeder Lösung wurde die Intra-Assay-Variabilität bestimmt: GBP-1-His 400 ng/ml; Intra-assay Variabilität = 2,7 % GBP-1 -His 180 ng/ml; Intra-assay Variabilität = 2,8 % GBP-1-His 40 ng/ml; Intra-assay Variabilität = 2,0 %
2. Inter-Assay-Variabilität: Zur Bestimmung der Inter-Assay-Variabilität wurde die Reproduzierbarkeit des ELISA in verschiedenen Versuchen bestimmt. Hierzu wurde jede der oben beschriebenen Lösungen sechsmal gemessen. Die inter-Assay-Variabilität wurde wie oben beschrieben berechnet. GBP-1 -His 400 ng/ml; Inter-assay Variabilität = 4,4 % GBP-1-His 180 ng/ml; Inter-assay Variabilität = 2,8% GBP-1-His 40 ng/ml; Inter-assay Variabilität = 3,0%
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Claims

Ansprüche
In vitro Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins im Kulturüberstand einer Gewebeprobe, einer Probe von Körperflüssigkeit oder einer Probe eines Zellkulturüberstandes, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(c) In Kontakt bringen der Probe mit einem ersten Rezeptor, der GBP-1 oder ein Fragmente dieses Proteins spezifisch bindet; und
(d) Nachweis einer spezifischen Bindung des Rezeptors mit GBP-1 oder einem Fragment dieses Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1 , darüber hinaus umfassend den Schritt (a') oder
(a") vor dem in Kontakt mit dem ersten Rezeptor:
(a') Markieren der in der Probe enthaltenen Proteine; oder
(a") Markieren des ersten Rezeptors.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rezeptor vor dem in Kontakt bringen mit GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins auf einer Oberfläche immobilisiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rezeptor nach dem in Kontakt bringen mit GBP-1 oder von Fragmenten dieses Proteins auf einer Oberfläche immobilisiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Material der Oberfläche ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Sepharose,
Latex, Glass, Polystyrol, Polyvinyl, Nitrocellulose und Silicium.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Oberfläche eine Membran, ein Kügelchen, ein Chip oder eine Platte ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, darüber hinaus umfassend den Schritt (a'") vor dem Schritt des Nachweises einer spezifischen Bindung:
(a'") präzipitieren der Kügelchen mit den daran gebundenen Komplexen aus erstem Rezeptor und GBP-1 oder eines Fragmentes dieses
Proteins.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Nachweis der spezifischen Bindung in Schritt (b) eine gelelektrophoretische Auftrennung, optional darüber hinaus eine Western-Blot-Analyse umfasst.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zum Nachweis einer spezifischen Bindung von GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins an den ersten Rezeptor in Schritt (a) die Probe mit einem zweiten Rezeptor für GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins in Kontakt gebracht wird, der an ein Epitop von GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins bindet, das nach Bindung des ersten Rezeptors an GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins zugänglich ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der zweite Rezeptor für GBP-1 oder Fragmente dieses Proteins markiert ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Markierung des zweiten Rezeptors für GBP-1 oder eines Fragmentes dieses Proteins ein signalgebendes System umfasst oder durch einen weiteren, dritten Rezeptor, der ein signalgebendes System umfasst, spezifisch erkannt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei das signalgebende System ein Enzym umfasst, das dieses Signal abgibt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der erste und der zweite Rezeptor und, optional, auch der dritte Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Polypeptiden, niedermolekulare Substanzen, Antikörpern oder Fragmenten oder Derivaten davon und Aptameren.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Verfahren ein ELISA, EIA, oder RIA ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Verfahren automatisiert ausgeführt wird.
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