WO2004056990A1 - 新規なニトリルヒドラターゼ - Google Patents

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WO2004056990A1
WO2004056990A1 PCT/JP2003/016014 JP0316014W WO2004056990A1 WO 2004056990 A1 WO2004056990 A1 WO 2004056990A1 JP 0316014 W JP0316014 W JP 0316014W WO 2004056990 A1 WO2004056990 A1 WO 2004056990A1
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WO
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amino acid
sequence
seq
acid sequence
nitrile
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Application number
PCT/JP2003/016014
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English (en)
French (fr)
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Toshifumi Yamaki
Shinichi Banba
Kaori Matoishi
Kiyoshi Ito
Hideki Kobayashi
Eishi Tanaka
Toshihiro Oikawa
Original Assignee
Mitsui Chemicals, Inc.
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Publication date
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Priority to EP03780752.6A priority patent/EP1586637B1/en
Priority to US10/539,560 priority patent/US7595184B2/en
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Priority to AU2010202683A priority patent/AU2010202683B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a novel nitrile hydratase, a gene encoding the same, a plasmid containing the gene, a cell line transformed with the plasmid, and a cell line transformed with the plasmid.
  • the present invention relates to a method for producing nitrile hydrazine enzyme, and a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a culture solution, a cell, and a treated cell obtained by culturing the cell line.
  • the present invention also relates to a method for modifying the properties of an enzyme having nitril hydratase activity.
  • the present invention provides an enzyme whose properties have been modified, a gene encoding the same, a plasmid containing the gene, a cell line transformed with the plasmid, and the production of nitrile hydrase using the cell line.
  • the present invention relates to a method, and a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a culture solution, a cell, and a treated cell obtained by culturing the cell line.
  • the present invention is useful in the field of substance production using a biocatalyst.
  • Nitrile hydratase an enzyme having nitrile hydration activity that converts a nitrile group of various compounds into an amide group by hydration, has been discovered, and a number of microorganism strains producing the enzyme have been disclosed.
  • the microorganism having nitrile hydrase activity is Rhodococcus rhodochrous J1-1 (according to the Budapest Treaty, accession number FERM BP-1478, 1-chome, Higashi 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan) It has been deposited at the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.) ⁇ ⁇ Shudonocardia Samomo Fila (This strain is a microorganism strain preservation facility of RIKEN (2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama) It is stored under the number J CM3095 and is freely available for sale to any person upon request.In accordance with the Budapest Treaty, it is deposited at the Patent Organism Depositary under the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-7379. Has been found (see Patent Documents 1 and 3).
  • nitrile hydrase was isolated from these strains, and it has been confirmed that the enzyme contains two types of polypeptides, commonly called hysunitun and / 3 subunit.
  • the nitrile hydrase gene was isolated from these strains, and the amino acid sequence and nucleotide sequence thereof were determined.
  • plasmids capable of expressing these nitrile hydrases in transformants and cell lines transformed with the same plasmids for example, TGl / pNHJ 10H and MT-10822: these are subject to the Bush Treaty
  • the former was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary under the Accession No.
  • FERM BP-2777 was deposited under the Accession No. FE RM BP-5785, Tsukuba East, Ibaraki Pref. No. 1 has been deposited at the Patent Organism Depositary, the 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on February 7, 1996.
  • AIST Advanced Industrial Science and Technology
  • Non-Patent Literature 1 Attempts have also been made to analyze the three-dimensional structure of nitrile hydratase, and the results of the analysis have been published as PDB numbers 1AHJ, 2AHJ, and 1 IRE. .
  • a dimer in which an en subunit and a / 3 subunit are associated is a basic structural unit, and the dimer is further associated to form a tetramer, an octamer, or a 12mer (origin) It has been clarified that they form and exert their activities. In addition, the regions and structures that form the active centers have been clarified.
  • the active center exists not at the position exposed to the outside of the enzyme in direct contact with the reaction solvent but at a position embedded in the enzyme. Coordination of metal atoms (cobalt atoms or iron atoms: depending on the biological species from which they originate) to the active center, which is essential for exhibiting activity, is also known. However, it has also been shown that cysteine residues in the amino acid sequence forming the region forming the active center cause post-translational oxidation. Specifically, X iCXLC!
  • Patent Document 1 JP-A-2-470
  • Patent Document 2 JP-A-4-21379
  • Patent Document 3 JP-A-8-56684
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-275978
  • Patent Document 5 JP-A-11-253168
  • Non-Patent Document 1 Kobayashi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, Be Advisor T, Yamada H. Cloning, nucleotide seauence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes from hodococcus rhodochrous Jl. Biochim Biophys Acta. 1991 Dec 2; 1129 (1): 23-33.
  • Non-Patent Document 2 Huang W, Jia J, Cummings J, Nelson M, Schneider G,
  • Non-Patent Document 3 Nagashima S, Nakasako M, Dohmae N, Tsuj iinura M, Takio K, Odaka M, Yohda M, Kamiya N, Endo I. Novel non-heme iron center of ni tri le hydratase wi th a claw sett ing of oxygen atoms. Nat Struct Biol. 1998 May; 5 (5): 347-51.
  • Non-Patent Document 4 Miyanaga, A., Fushinobu, S., I to, K., and Wakagi, T.
  • An object of the present invention is to provide an amino acid sequence of a nitrile hydratase having a novel substitution mutation site which does not substantially change the function.
  • the purpose is to provide the nucleotide sequence of the gene.
  • a plasmid containing the gene, a cell line transformed with the plasmid, a method for producing the enzyme using the cell line, and a culture solution, cells, and a cell processed product obtained by culturing the cell line are used.
  • Another object of the present invention is that the activity of the nitrile hydrase is not impaired, but the activity is as follows: activity, substrate specificity, VmaX, Km, thermal stability, stability to the substrate, stability to the product. It is to provide a specific method for a method that involves changing one or more of these properties. Specifically, it is an object of the present invention to provide a method for modifying the above properties by introducing a mutation which changes the three-dimensional structure of nitrile hydratase into the nitrile hydrase enzyme.
  • nitrile hydratase obtained by the modification method a gene encoding the nitrile hydratase, a plasmid containing the gene, a cell line transformed with the gene or the plasmid, and the cell line were used.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a nutrient solution, a cell, and a processed cell.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-2757978
  • a substitution mutation site was introduced, and the nucleotide sequence of the gene after the mutation was determined.
  • a plasmid containing the gene and a cell line transformed with the plasmid were prepared.
  • intensive studies have been made on production of the enzyme using the cell line and production of the corresponding amide compound from nitrile compounds using a culture solution, a cell, and a cell-treated product obtained by culturing the cell line. As a result, the present invention has been completed.
  • the subunit of the nitrile hydratase according to the present invention may be any one of the 36th, 71st, 148th, and 204th amino acids of the amino acid sequence of the subunit shown in SEQ ID NO: 1. It is characterized by having an amino acid sequence having a mutation in which one or more amino acids are substituted with another amino acid.
  • the / S subunit of nitrile hydratase according to the present invention is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; 10th, 32nd, 37th, 41st, and 46th amino acid sequences of the 8 subunits , 48th, 51st, 72nd, 118th, 127th, 146th, 160th, 186th and 217th amino acids It has an amino acid sequence having a mutation in which the above amino acid is substituted with another amino acid.
  • the nitrile hydratase according to the present invention has an a subunit and a ⁇ subunit, and at least one of these subunits has the above mutation.
  • the gene encoding the nitrile hydrase of the present invention is characterized in that it encodes an amino acid sequence having a mutation in the above-mentioned hysunitun.
  • the gene encoding s-subunit of nitrile hydratase according to the present invention is characterized by encoding the above-mentioned amino acid sequence having a mutation in ⁇ -subunit.
  • the gene encoding nitrile hydrase according to the present invention has a gene encoding a subunit and a gene encoding a subunit. At least one of the bunits has the above mutation.
  • the plasmid of the present invention has any one of the above-mentioned genes.
  • the transformant of the present invention is characterized in that it is obtained by transforming a host cell using the above plasmid.
  • the production of nitrile hydrase of the present invention comprises the step of recovering nitrile hydratase from the above-mentioned transformant, a culture solution of the transformant, or the transformant—a treated product of the culture solution. It is characterized by the following.
  • the method for producing an amide compound of the present invention comprises a step of bringing the nitrile compound into contact with the above nitrile hydrazine in an aqueous medium to convert the nitrile compound into a corresponding amide compound. I do.
  • a nitrile hydratase modification method was carried out by adding a change such as substitution, insertion or deletion to the amino acid in the amino acid sequence corresponding to the amino acid residue forming the region. More specifically, by performing intensive analysis by referring to the three-dimensional structure of nitrile hydrase disclosed in Non-Patent Documents 2, 3, and 4 and PDB No. 1 AH J2AH J1 IRE, Identified areas for change that suit the purpose.
  • a region that forms a cavity through which the substrate passes from the outside of the enzyme to the active center or the product passes from the active center to the outside of the enzyme, and dimer formation Regions that form the interface between the participating subunits and the] 3 subunits and the interface that participates in the association between dimers were identified.
  • a method for making a change such as substitution, insertion or deletion in the amino acid sequence is not particularly limited, but a mutagenesis method using a genetic recombination technique can be mentioned as an example.
  • nucleotide sequence of the gene after the change is determined, a plasmid containing the gene, a cell line transformed with the gene or the plasmid are prepared, and the production of the enzyme using the cell line and the cell
  • a specific amino acid residue is specified by the following steps, and the amino acid residue is substituted, inserted or deleted at one or more of the specified amino acid residues.
  • Enzyme activity Substrate specificity-Vmax-Km-Thermal stabilityStability to substrateStability to product Modification method to change at least one property,
  • a specific amino acid residue is specified by the following steps, and the amino acid residue is substituted, inserted or deleted at one or more of the specified amino acid residues.
  • Enzyme activity ⁇ Substrate specificity ⁇ Vmax ⁇ Km ⁇ Heat stability ⁇ Stability to substrate ⁇ Stability to product Modification method to change one or more of properties
  • a specific amino acid residue is specified by the following steps, and the amino acid residue is substituted, inserted, or deleted at one or more of the specified amino acid residues.
  • Enzyme activity Substrate specificity-Vmax-Km-ThermostabilityStability to substrateStability to product Modification method to change at least one property,
  • [A] a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing at least 40% homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the sequence listing
  • [B] a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 25% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 99 in the sequence listing
  • [ ⁇ ] a polypeptide consisting of an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence encoded by ⁇ RF (open reading frame) consisting of the 704th position and the 1315th position of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 104 in the sequence listing,
  • polypeptide of [E] according to [10] Of the two polypeptides contained as components in the enzyme having nitrile hydratase activity before modification, one is the polypeptide of [E] according to [10], and the other is a lolipeptide.
  • the polypeptide according to [F] wherein a specific amino acid residue is specified by the following steps, By substituting, inserting or deleting one or more of the amino acid residues, the activity, substrate specificity, Vmax, Km, thermal stability, substrate stability, and product stability of the enzyme A method of altering one or more properties of any of the
  • C is cysteine
  • X is serine or threonine
  • L is mouth isine
  • S is serine
  • C 2 is cysteine sulfenic acid.
  • X x ⁇ X 2 ⁇ X 3 ⁇ X 4 ⁇ X 5 represent any amino acid.
  • (21) a method for preparing a modified enzyme, comprising a step of recovering the modified enzyme from a culture solution, cells, or a processed product thereof obtained by culturing the transformant according to (20).
  • the amino acid sequence of nitrile hydratase having a novel mutation point which does not change the essential function of nitrile hydratase derived from Pseudonocardia samofila and the base of the gene An array is provided. Further, a plasmid containing the gene, a transformant containing the plasmid, a method for producing the enzyme using the transformant, and a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using the transformant Is provided.
  • a method for modifying an enzyme having nitrile hydratase activity before modification by using a method characterized by changing a three-dimensional structure of the enzyme having nitrile hydrase activity.
  • the present invention also provides a nitrile hydrase having a novel mutation point, and a gene encoding a polypeptide chain constituting the enzyme. Furthermore, a plasmid containing the gene, a transformant containing the gene or the plasmid, a method for producing the enzyme using the transformant, and a corresponding amide compound from a nitrile compound using the transformant Is provided.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1 is a restriction map of the plasmid pPT-DB1 extracted from MT10822. (Reference Example 1, Example 1, 83)
  • FIG. 2 is a restriction map of a plasmid pJ1H-DB1 constructed for the active expression of nitrile hydratase derived from Rhodococcus rhodochrous J-11 strain. (Example 84)
  • Co 1 El-ori Indicates the replication initiation site of the Co 1 E1 system.
  • ORF that encodes the ⁇ -subunit of nitrile hydratase derived from Pseudomonadia samurai.
  • P 16 ORF that encodes a protein characterized by being involved in the activation of nitrile hydratase derived from Pseudomonadia serrata.
  • nhhA ORF coding for the subunit of nitrile hydrase derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain.
  • nhhB ORF encoding the j3 subunit of nitrile hydratase derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain.
  • the nitrile hydrase of the present invention is obtained by introducing a mutation into an enzyme having nitrile hydratase activity, for example, by introducing a mutation into nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermofila. It is obtained.
  • an amino acid sequence is specifically described in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing. It is basically composed of amino acids in at least one or more of the specified sites replaced with other amino acids. That is, the present invention provides a nitrile hydratacetase comprising a subunit represented by the sequence of 205 amino acids shown in SEQ ID NO: 1 in which at least one or more units are substituted with another amino acid.
  • amino acid sequences used in nitrile hydrase obtained by introducing a mutation into nitrile hydrase derived from Pseudonocardia sa morphira include the following. included.
  • (a-2) Amino acid sequence of the ⁇ -subunit shown in SEQ ID NO: 1 at positions 6, 19, 38, 77, 9 Q, 102, 106, 126, 130, 142
  • the nitrile hydratase obtained by introducing a mutation into the nitrile hydrase derived from Pseudonocardia thermophila was selected from the above (a-0) to (b-2). It consists of the following components having an amino acid sequence.
  • (A-1) a nitrile hydrazyme whose ⁇ subunit has the amino acid sequence containing the mutation of the above (a-1)
  • (A-2) a nitrile hydratase having an amino acid sequence in which the subunit has the above mutations (a-1) and (a-2)
  • (B-2) A nitrile hydrase having an amino acid sequence in which the ⁇ subunit has the above mutations (b-1) and (b-2)
  • the ⁇ -subunit has the amino acid sequence containing the above mutation (a-1); and the eight subunits have the amino acid sequence of the above (b-0) nitrile hydratase.
  • A-4) a subunit having the amino acid sequence containing the above mutation (a-1); and 8 subunits having an amino acid sequence containing the above mutation (b-1).
  • (A-5) a subunit having the amino acid sequence containing the mutation of the above (a-1); and 3 subunits having an amino acid sequence containing the above mutation of the (b-2).
  • (A-6) an amino acid sequence in which the ⁇ subunit has the above-mentioned mutation (a-1) and the ⁇ subunit has the above-mentioned mutation (b-1) and (b-2) With nitrile hydra
  • A-7 a subunit having an amino acid sequence containing the above mutations (a-1) and (a-2), and an S subunit having the above amino acid sequence (b-0) Avian rehydratase
  • the ⁇ subunit contains the above mutations (a-1) and (a_2). Nitrile hydratase having an amino acid sequence and a subunit having an amino acid sequence containing the mutation of the above (b-1)
  • the subunit has an amino acid sequence containing the above mutations (a-1) and (a-2), and the ⁇ subunit has the amino acid sequence containing the above mutation (b-2).
  • (A-10) one subunit having the amino acid sequence containing the mutations of the above (a-1) and (a-2); and 5 subunits having the above (b-1) and (b-2).
  • Nitrile hydratase having an amino acid sequence containing a mutation
  • (B-4) a nitrile hydrazide having a subunit having the amino acid sequence of the above (a-0) and a ⁇ subunit having an amino acid sequence containing the mutation of the above (b-1) and (b-2) -Se
  • (B-5) a subunit having the amino acid sequence containing the mutation of the above (a-2); and 8 subunits containing an amino acid sequence containing the mutation of the above (b-1) and (b-2).
  • amino acids other than the specified mutation site may be substituted, inserted, or deleted with amino acid within a range that does not impair the desired nitrile hydratase activity due to the mutation at the specified site. Is also good.
  • the nitrile hydraidase gene obtained by introducing a mutation into the nitrile hydraidase derived from Pseudonocardia thermophila includes a gene encoding a nitrile hydraidase subunit and a gene encoding a nitrile hydraidase subunit. Includes the genetic power encoding the trityl hydratase subunit.
  • a group of the genes according to the present invention include those obtained by mutagenizing the nitrile hydrase gene derived from Pseudomonadia 'Sammophylla, which encodes the amino acid sequence of the subunit. Gene; a gene encoding a subunit; and a nitrile hydrase gene having both a gene encoding an ⁇ -subunit and a gene encoding a subunit.
  • G-2 a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence having the mutations (a-1) and (a-2) described above;
  • (G-3) a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence having the mutation of (b-1) described above;
  • (G-4) a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence having the mutations of (b-1) and (b-2) described above;
  • (G-3) A gene having a nucleotide sequence encoding the nitrile hydratase of any of (A-1) to (B-4) described above.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the ⁇ -subunit of SEQ ID NO: 1 which is the basis of the above mutation the base sequence of SEQ ID NO: 3 is preferable. Further, as the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; the base sequence of the above mutation, the base sequence of SEQ ID NO: 4 is preferable.
  • the mutation of the above (a-2) based on SEQ ID NO: 3 is based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from 16th to 18th, 55th to 57th, 112th to 114th, 229th to 231st, 268th to 270th, 304th to 306th, 316th to 318th, 376th to 378th, 388th to 390th, 424th to 426th, 436th to 438th , 559th to 561th, 580th to 582th, and 607th to 609th can be obtained by substituting a part of the base sequence in which at least one base sequence is replaced with another base sequence. .
  • the mutation of the above (b-1) based on SEQ ID NO: 4 is based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 from 28th to 30th, 94th to 96th, 109th to 11th, 121-123, 136-138, 142 1 4 4th, 1 5 1st to 15 3rd, 2 1 4th to 2 16th, 3 5 2nd to 3 54th, 3 7 9th to 3 1st, 4 3 6 4th to 4th, 478th to 480th, 556th to 558th, and 649th to 651st It can be obtained by substituting with the nucleotide sequence of
  • the mutation of the above (b-2) based on SEQ ID NO: 4 is based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 from 58th to 60th, 61st to 63rd, and 32nd Substitute a part of the base sequence obtained by substituting one or more base sequences from 324 to 324, 598 to 600, and 634 to 636 with another base sequence You can get it.
  • substitutions are made in such a range that the activity of nitrile hydratase, which is encoded by each gene and incorporates at least one of the ⁇ subunits, is maintained in the state before the substitution or is improved therefrom.
  • the means for introducing a mutation is not particularly limited.
  • the site other than the mutation sites (a_l), (a-2), (b-1) and (b-2) is the nitrile hydratase As far as it can function as type I of a protein having zease activity, it may have a further mutation by substitution, insertion or deletion of a base.
  • Examples of such further mutations include the following. Even when a gene having a certain base sequence is transcribed and translated as type III, the type of host cell into which it is introduced, the components and composition of the nutrient medium used for culture, the temperature during culture, pH, etc. In some cases, the desired enzymatic action is retained, but one or more amino acids near the N-terminus in the sequence listing may be deleted due to modification with host intracellular enzymes after gene expression, etc. However, a variant may be produced in which one or more amino acids are newly added to the N-terminus. Therefore, such atypical nitrile hydratase is also included in the present invention.
  • the plasmid for producing nitrile hydrase according to the present invention can be prepared by using the nitrile hydrase gene described above. Specific examples include the following. (P-1) a plasmid having a base sequence encoding the amino acid sequence having the mutation of (a-1) described above;
  • (P-2) a plasmid having a base sequence encoding the amino acid sequence having the mutations of (a-1) and (a-2) described above;
  • (P-3) a plasmid having a base sequence encoding the amino acid sequence having the mutation of (b-1) described above;
  • (P-4) a plasmid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence having the mutations of (b-1) and (b-2) described above;
  • (P-3) A plasmid having a nucleotide sequence encoding the nitrile hydrase of any of (A-1) to (B-4) described above.
  • the transformant or cell line according to the present invention is obtained by transforming an arbitrary host cell using this plasmid.
  • the method for producing nitrile hydratase of the present invention comprises a step of culturing the above transformant or cell line to produce nitrile hydratase.
  • the method for producing an amide compound of the present invention is characterized in that a culture solution, a cell, or a cell-treated product obtained by culturing such a transformant or cell line that produces nitrile hydrase is used in a medium.
  • a step of producing a corresponding amide compound by contacting with a tolyl compound is used in detail.
  • the nitrile hydratase activity refers to an activity of hydrating a nitrile compound to a corresponding amide compound.
  • the enzyme having the activity is characterized by comprising two kinds of polypeptide chains, generally called subunit and j3 subunit, as a component.
  • the nitrile hydratase gene is It refers to two amino acid sequences characterized by forming a polypeptide chain or base sequences forming two ORFs (open reading frames) characterized by encoding them.
  • a specific example is the nitrile hydrase derived from Pseudonocardia thermofila J CM3095 (see SEQ ID NOs: 98 and 99 in the sequence listing, Patent Document 3, Non-patent Document 4, PDB No .: 1 IRE).
  • the key described in SEQ ID NO: 98 in the sequence listing Polypeptide comprising an amino acid sequence and PDB No. 1 The A-chain in the nitrile hydratase three-dimensional structure described in IRE is an ⁇ -subunit, a polypeptide comprising an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 in the sequence listing, and PDB No.
  • the ⁇ chain in the nitrile hydratase three-dimensional structure described in the IRE is the / 3 subunit.
  • the ORF consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 100 in the sequence listing and the ⁇ RF consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101 in the sequence listing are referred to as nitrile hydrase enzyme.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 104 in the sequence listing is obtained.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence encoded by the ORF consisting of the 7th 4th to 13th 5th is composed of the amino acid sequence, consisting of the 1st to the 69th of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 104 in the sequence listing.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence encoded by the ORF has three subunits.
  • the two ORFs encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 104 in the sequence listing are referred to as nitrile hydratase genes.
  • the modification method according to the present invention refers to the activity of nitrile hydrase without impairing the original activity of the enzyme, the activity of the enzyme, substrate specificity, Vmax, Km, thermal stability, substrate stability, and product stability.
  • This technique aims to change the three-dimensional structure of an enzyme having nitrile hydratase activity before modification with the purpose of changing one or more properties of the sex.
  • the region that forms a cavity through which the substrate passes from the outside of the enzyme to the active center or the product passes from the active center to the outside of the enzyme, and Z or ⁇ -subunits involved in dimer formation Identify the region that forms the association interface between the subunits and the interface that participates in the association between the dimers, and specify the region at one or more amino acids in the amino acid sequence corresponding to the amino acid residues present in the region.
  • Replacement The method includes a step of making a change such as insertion or deletion.
  • a nitrile hydrase derived from J. Donnocardia thermofila JCM3095 see SEQ ID Nos.
  • the amino acid residues in the region forming the cavity through which the substrate passes from the outside of the enzyme to the active center or the product passes from the active center to the outside of the enzyme correspond to , PDB number 1
  • the second helix ⁇ An amino acid residue that forms a region corresponding to the loop part sandwiched between them, PDB number 1 I Glutamine which is the 89th amino acid residue from the N-terminal in the A chain in the nitrile hydratase three-dimensional structure described in the RE, an amino acid residue corresponding to glutamic acid which is the 165th amino acid residue, and N in the B chain 37th amino acid residue from the end, phenylalanine4th amino acid residue corresponding to leucine, 48th amino acid Amino acid residue containing
  • amino acid residues present in the region forming the association interface between the subunit involved in dimer formation and the] 3 subunit and the interface involved in the association between dimers correspond to PDB No. 1 I
  • the second helix counted from the N-terminus in the ⁇ chain in the nitrile hydratase three-dimensional structure described in the RE the second helix counted from the N-terminus in the B chain, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the sequence listing Region from threonine 36 to asparagine 48, amino acid residues corresponding to the region from lysine 112 to leucine 127 in seq. ID No. 99 in the sequence listing, amino acid sequence in seq. No.
  • A165E The amino acid residue corresponding to glutamic acid (A165E), which is the 165th amino acid, phenylalanine (B37F), the 37th amino acid from the N-terminal of the B chain, and leucine (B48L), the 48th amino acid
  • A165E The amino acid residue corresponding to glutamic acid
  • B37F phenylalanine
  • B48L the 37th amino acid from the N-terminal of the B chain
  • B48L leucine
  • the 48th amino acid Identify the four corresponding amino acid residues and set the shortest inter-atomic distance between A165E and B48L to dl, the shortest inter-atomic distance between A89Q and B48L to d2, and the shortest interatomic distance between B37L and B48L
  • the distance between heavy atoms is defined as d3
  • the shortest distance between A165E and B37F is defined as d4
  • the shortest distance between A89Q and B37F is defined as d5.
  • one or more of the target nitrile hydrases (such as those derived from Shiudonocardia Thermofila J CM3095 can be cited as representative examples) can be cited above.
  • a modification method comprising a step of making a change, such as substitution, insertion or deletion, to an amino acid in the amino acid sequence corresponding to the amino acid residue is included in the present invention.
  • nitrile hydra from a species other than Syudonocardia samofila J CM3095 (for example, two torylhydra from serovar Rhodococcus rhodochrous J1-1) was used.
  • the three-dimensional structure and amino acid sequence of the conventional nitrile hydratase are aligned, the amino acid residue corresponding to the above amino acid residue is found, and the modification method by changing the amino acid in the corresponding amino acid sequence is also described in the present invention. Included in the invention.
  • the means used for alignment based on the three-dimensional structure or amino acid sequence is not particularly limited.
  • amino acid sequence alignment include DNAS by Hitachi Software Inc.
  • Gene sequence analysis software such as IS ⁇ free software CLUSTALW and BLAST is used as a means for modeling the three-dimensional structure based on the alignment of amino acid sequences. Prediction software is given as an example.
  • the amino acid residue corresponding to SEQ ID NO: 104 is the amino acid residue corresponding to the 51st amino acid sequence of the ORF encoded by the ORF consisting of the first to sixth amino acids of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 104 in the sequence listing: S er. This result is consistent between the alignment based on the amino acid sequence and the alignment based on the stereostructure.
  • a modification method by changing one or both of the amino acids in the amino acid sequence corresponding to the two amino acid residues is also included in the present invention.
  • the means for introducing a mutation for changing the amino acid in the amino acid sequence corresponding to the amino acid residue is not particularly limited.
  • a mutagenesis method in which an amino acid in the sequence is substituted with another amino acid can be cited as an example.
  • nitrilyl hydrase before modification to be subjected to the modification method of the present invention examples include nitrilyl hydrase from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain 1 and nitrile hydra from Rhodococcus rhodochrous J-1 Nitrile hydra sunset.
  • a nitrile hydratase comprising a polypeptide chain formed by an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence encoded by the ORF consisting of positions 704 to 1315 of the base sequence described in 104 and a sequence listing A nitrile hydrase comprising a polypeptide chain formed by the amino acid sequence described by SEQ ID NO: 98 and a polypeptide chain formed by the amino acid sequence described by SEQ ID NO: 99 in the sequence listing, Can be mentioned.
  • the nitrile hydratase before the modification which is the object of the modification method in the present invention, includes a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 40% homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the Sequence Listing and the sequence in the Sequence Listing. Also included are nitrile hydrases which comprise the amino acid sequence of No. 99 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 25% or more homology as a constituent.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 40% homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the Sequence Listing examples include a polypeptide comprising an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the Sequence Listing, A polypeptide comprising an amino acid sequence in which at least one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 98 has been substituted, inserted, or deleted, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the sequence listing has a number of 6, 19, 38 ⁇ 77 ⁇ 90 ⁇ 102 ⁇ 106 ⁇ 126 ⁇ 130 ⁇ 142 ⁇ 146 ⁇ 187 • A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid of amino acids 194-203 has been replaced with another amino acid, SEQ ID NO: 104 in the sequence listing The polypeptide includes an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence encoded by the ORF consisting of positions 704 to 1315 of the described base sequence.
  • a polypeptide includes
  • X 4 X 5 (where C is cysteine, X is serine or threonine, L is leucine, is cysteine sulfinic acid (CYSTEINE SULFINIC ACID-3-SULFINOALANINE), S is serine, and C 2 is cysteine sulfone. It is a polypeptide containing a region represented by phenic acid (CYSTEINE SULFENIC ACID 'S-HYDROXY-CYSTEINE), and ⁇ ⁇ X 2 ⁇ X 3 ⁇ X 4 ⁇ X 5 represents an arbitrary amino acid. It may be.
  • ⁇ may be characterized in that it is a polypeptide in which palin, X 4 is tributophan, and X 5 is proline.
  • the polypeptide may be characterized in that X 2 is a tyrosine and X 3 is a proline.
  • the above case may be characterized by being bonded to a metal atom via a region represented by XCXLCiSCsXsXgXaXs.
  • the metal is cobalt.
  • Examples of a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology of 25% or more with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 in the Sequence Listing include a polypeptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 in the Sequence Listing, A polypeptide comprising an amino acid sequence in which at least one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 99 has been substituted, inserted, or deleted, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 in the sequence listing has a number of 20, 21 • 108 -A poly'peptide consisting of an amino acid sequence in which at least one of the amino acids at positions 200 to 212 has been replaced with another amino acid, and an ORF consisting of positions 1 to 690 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 104 in the sequence listing
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence to be encoded can be mentioned.
  • nitrile hydrazine enzyme derived from Pseudonocardia thermophila J CM3095 is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 in the sequence listing And a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 in the Sequence Listing, which is a nitrile hydrase which is a target of the modification method of the present invention. It is.
  • the constituent elements of a nitrile hydrazyme derived from Shudnocardia samofuira J CM3095 are as follows. Wherein the polypeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 98 in the Sequence Listing is obtained by modifying at least one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 98 in the Sequence Listing by substitution, insertion or deletion.
  • SEQ ID NO: 99 in the sequence listing A polypeptide comprising the amino acid sequence described above, wherein at least one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 99 in the Sequence Listing is substituted, inserted, or deleted, or a polypeptide comprising the amino acid sequence, or a sequence in the Sequence Listing
  • a nitrile hydrase derived from a nitrile hydrase derived from Pseudonocardia thermofila J CM3095 is also included in the unmodified nitrile hydrase which is a target of the modification method of the present invention.
  • the modified enzyme refers to nitrile hydrase obtained by performing the modification method on an enzyme having nitrile hydratase activity.
  • a modified enzyme characterized by being obtained by changing the character of nitrile hydrase before modification using the above-described modification method can be mentioned as an example.
  • Changes in the traits include the substrate characteristics when compared to the unmodified tritrihydrase. PT / JP2003 / 016014
  • Relatively less bulky nitrile compounds can be used as substrates.
  • Vmax is improved when any nitrile compound is used as a substrate.
  • the Km is reduced when using any nitrile compound as a substrate.
  • a change in substrate specificity can be cited as one of the representative examples.
  • the modified enzyme obtained by the modification method of the present invention has a modified substrate specificity
  • the modified enzyme is included in the modified enzyme of the present invention.
  • Methods for observing changes in the substrate specificity of the resulting modified enzyme include a method in which a reaction is performed using a plurality of types of nitrile compounds having different bulks as substrates, and the difference in the amount of the corresponding amide compound produced is measured.
  • the modified enzyme in which the value of [molar amount of methacrylamide formed] ⁇ [molar amount of acrylamide formed] is increased as compared to the target before the modification is a more bulky nitrile. It can be said that a change in the trait that makes the compound easy to use as a substrate was exhibited, and that the modified enzyme whose value was changed to a smaller value showed a change in the trait that made it easier to use a smaller bulk nitrile compound as a substrate.
  • a nitrile hydrazyme derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 and a nitrile hydrazyme derived from the nitrile hydraase derived from Shudnocardia thermophila JCM3095 were used.
  • analysis of the steric structure revealed a region that formed a cavity through which the substrate passed from the outside of the enzyme to the active center and the product from the active center to the outside of the enzyme, and / or 2 Identify the region that forms the association interface between the subunits involved in the formation of the dimer and the three subunits, or the interface that participates in the association between the dimers, and determine the amino acid sequence corresponding to the amino acid residues present in the region.
  • the modification method including the step of making a change such as substitution, insertion, or deletion at one or more of the amino acids
  • acrylonitrile is used as the substrate compared to the target before modification.
  • Modified enzyme that the molar ratio of methacrylamide has been changed to produce a Akuriruamido and methacrylic nits Lil formed by the reaction in the reaction of the substrate was obtained. Since this can be said to be a change in the substrate specificity, that is, the trait, the modified enzyme obtained is included in the modified enzyme of the present invention.
  • the amino acid encoded by the ORF consisting of the first to sixth amino acids of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 104 in the sequence listing Amino acid residue corresponding to the 48th position of the sequence:
  • a bulkier nitrile compound is used as a substrate compared to the target before modification. It showed a change in traits that made it easier. Therefore, the protein showing the acquired trait change is included in the modified enzyme of the present invention.
  • a modified enzyme obtained by such a combination of mutation sites is also included in the modified enzyme of the present invention.
  • the gene encoding the modifying enzyme is defined as two amino acid sequences characterized by forming two kinds of polypeptide chains constituting the modifying enzyme or two amino acid sequences encoding them. Refers to the base sequence that forms the ORF.
  • a plasmid characterized by including a gene is characterized by coding two amino acid sequences characterized by forming two kinds of polypeptide chains constituting a modified enzyme. Include two ORFs in the sequence Refers to a plasmid characterized by:
  • the above-mentioned plasmids may be obtained by transforming any host cell, such as a control region necessary for expression of each gene and a region necessary for autonomous replication, in addition to the gene of the present invention, or a transformant or cell strain obtained by the transformation. It is possible to have a configuration that allows production of the modified enzyme.
  • the term "optional host cell” refers to, for example, Escherichia coli, as in the examples described below, but is not limited thereto. Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, yeast, actinomycetes, etc. Other microorganisms can also be used.
  • Control regions required for expression include a promoter sequence (including an operator sequence that controls transcription), a ribosome binding sequence (SD sequence), a transcription termination sequence, and the like. ,
  • promoter sequences include trp promoter of Escherichia coli-derived tributophan operation, 1 ac promoter of lac1 ⁇ 1 supoperon, PL promoter and PR promoter of lambda phage, and Bacillus subtilis. And an alkaline protease promoter (apr), a neutral protease promoter (npr), an ⁇ -amylase promoter (amy), and the like. Also, artificially designed and improved sequences such as tac promoter and trc promoter can be used.
  • ribosome binding sequence examples include those derived from Escherichia coli or Bacillus subtilis, or the original sequences of Bacillus dococcus eudonocadia, but are not particularly limited as long as they function in a desired host cell such as Escherichia coli or Bacillus subtilis. Not something.
  • a consensus sequence in which a sequence complementary to the 3 ′ terminal region of 16S liposome RNA is continuous for 4 bases or more may be prepared by DNA synthesis and used.
  • p-factor independent ones such as the lipoprotein ⁇ ' ⁇ ' tr trp operon ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , etc. can be used.
  • control regions on the plasmid is preferably such that the promoter sequence and the ribosome binding sequence are located at the 5'-end upstream of the gene of the present invention, and the transcription termination sequence is three times longer than the gene of the present invention. 'It is desirable to be located downstream of the terminal side.
  • nucleotide sequence encoding each ORF constituting the gene of the present invention may be expressed as an independent cistron by such a control region, or the polymorphic sequence may be expressed by a common control region.
  • plasmid vectors examples include PBR322, pUC18, pBluescript, pKK223-3, pSClOl, which have autonomously replicable regions in E. coli, PUB110, pTZ4, pC194, ⁇ 11, ⁇ 1, ⁇ 105, etc., which have a region capable of autonomous replication in Bacillus subtilis.
  • plasmid vectors capable of autonomous replication in two or more types of host cells include pHV14, TRp7, YEp7, and pBS7.
  • nitrile hydratase When the gene of the present invention is expressed to produce nitrile hydratase having a desired activity, a protein involved in the activation of nitrile hydrase may be required.
  • the protein involved in the activation of nitrile hydrase is a protein having the property that the presence or absence of the expression of the protein directly influences the activation of nitrile hydratase.
  • the protein involved in the activation of nitrile hydrase from the pseudonocardia sammophila described above can be mentioned as an example.
  • nitrile hydratase-activating protein a protein composed of a sequence of 144 amino acids shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102 can be mentioned as an example.
  • a heterologous protein obtained by amino acid substitution, insertion, or deletion in a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102 may be a nitrile hydratase as long as it is involved in the activation of nitrile hydrase. Shall be included in the ze-activated protein.
  • This atypical protein has mutations due to substitution, insertion or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, and retains properties involved in activation of nitrile hydrazine enzyme. Things can be mentioned.
  • the gene encoding the nitrile hydratase activating protein is not particularly limited as long as it is a gene encoding the nitrile hydrase activating protein. Genes having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence and genes encoding the above-mentioned atypical proteins can be mentioned. Furthermore, the gene encoding this nitrile hydrase activating protein is preferred. A good example is a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 103. Furthermore, the gene encoding the nitrile hydratase activity protein may have a sequence in which one or more base sequences of SEQ ID NO: 103 have been subjected to base substitution, insertion, or deletion. If it functions as a gene encoding nitrile hydrase-activating protein, it shall be included in the range of the gene encoding nitrile hydratase-activating protein.
  • ORF When a gene encoding a nitrile hydratase activating protein is used, there may be mentioned an example in which the ORF is included in the plasmid of the present invention together with the two ORFs constituting the gene of the present invention.
  • the order of these ORFs on the plasmid is not particularly limited, and three ⁇ RFs may be controlled by the same control region, and two ORFs are controlled by the same control region, and the remaining 1 One ORF may be controlled by a different control region from the other two, and three ORFs may be controlled by different control regions.
  • a method of constructing the plasmid of the present invention by inserting the gene of the present invention into such a vector plasmid together with a region necessary for expressing the activity of the modified enzyme of the present invention, and a method of transforming the plasmid into a desired host cell A method for producing nitrile hydrase in the transformant is described in, for example, "Molecular C 1 on ng 3 rd Editi on J (J. Samrook et al .; Cold Spring Harbor. Labo ratory Press, 2001) and the like. General methods and host cells known in the field of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering can be used.
  • the transformant obtained by the transformation includes those obtained by transforming a host cell using the gene or the plasmid of the present invention.
  • An example of culturing the transformant is a method characterized in that the transformant is planted in a culture medium and then grown at an appropriate culture temperature (generally, 20 ° C to 50 ° C). .
  • an LB medium, an M9 medium, or the like is generally used as a medium for culturing the above transformant.
  • Metal ion may be added to such a medium component.
  • the metal ions to be added include Fe ions and Co ions.
  • the addition amount is, for example, 0.1 gZmL or more.
  • the method for preparing a modified enzyme which comprises a step of recovering the modified enzyme from a culture solution, cells, or a processed product thereof obtained by culturing the transformant, comprises the steps of Examples include a transformant, a culture solution of the transformant, or a characteristic example having a step of recovering nitrile hydratase activity from the transformant—a treated product of the culture solution.
  • the method for producing an amide compound which comprises a step of converting a nitrile compound into a corresponding amide compound, comprises the above transformant, a culture solution of the transformant, or the transformant.
  • the body a treated product of the culture solution, or an example having a feature of having a step of converting a nitrile compound to a corresponding amide compound using a nitrile hydratase activity recovered by the above-mentioned preparation method as a catalyst. I can do it.
  • a desired nitrile conjugate can be prepared by purifying the purified enzyme or crude enzyme.
  • the method includes a step of contacting the enzyme preparation, the culture solution of the transformant of the present invention, the transformant obtained from the culture solution, or the processed product of the transformant in a solvent.
  • treated product refers to an extract from the transformant, a crushed product, a crude enzyme preparation obtained by separating a ditrihydrhydrase active fraction of these extracts or crushed product, Post-isolated products such as purified enzyme products obtained by purification, the transformants, and the immobilized products obtained by immobilizing extracts, triturated products or post-isolated products of the transformants using appropriate means.
  • the temperature for the contact is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydrase is not inactivated, and is more preferably not lower than the freezing point and not higher than 60 ° C.
  • the nitrile compound is not particularly limited as long as the improved enzyme of the present invention can act as a substrate.
  • a nitrile compound having 2 to 4 carbon atoms, such as non-hydroxyisobutyronitrile, may be mentioned as an example.
  • the concentration of the nitrile compound in the solvent is The reaction temperature is not particularly limited, and the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydratase is not inactivated, and is more preferably a freezing point or higher and 50 ° C or lower.
  • LB liquid medium 10 mL was prepared in a 3 OmL test tube, and sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. After ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 g / mL, one loopful of MT-10822 was inoculated and cultured at 37 ° C./300 rpm for about 20 hours. After 1 mL of the culture solution was collected in an appropriate centrifuge tube, the cells were separated by centrifugation (15000 rpm 5 minutes). Subsequently, plasmid pPT-DB1 was prepared from the cells by AlS-USDS extraction.
  • the PCR reaction No. 1 was a system with a total amount of 50 iL containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) Performed by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • Excess primers and dNTP were removed from each PCR reaction solution using Microcon OO (manufactured by Takara Shuzo), and TE was added to prepare 50 L of each solution.
  • 0.5 tL of TaKaRa LA Taq was added to the annealing solution, and heat treatment was performed at 72 ° C. for 3 minutes to complete a heteroduplex.
  • PCR reaction No. 3 was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. . DNA amplification products were analyzed by agarose electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration of 0.8% by weight) using 5 ⁇ L of the reaction completion solution of PCR reaction No. 3.
  • the conversion and selectivity in the production of the amide compound using the obtained transformant were determined by the following methods.
  • the separated cells were resuspended in 5 OmL of physiological saline, and the cells were separated again by centrifugation (5,000 GX 15 minutes).
  • 0.1 lg of the cells was suspended in 2 OmL of 50 mM potassium phosphate aqueous solution (pH 7.0), and 1 mL of acrylonitrile or methacrylonitrile was added thereto.
  • the reaction was allowed for hours.
  • the reaction mixture was analyzed using HP LC.
  • the reaction mixture contained a molar amount of the amide compound (acrylamide or acrylamide) corresponding to the nitrile compound (acrylonitrile or methacrylonitrile) added. Only methacrylamide) was present, and no nitrile compound (acrylonitrile or methacrylonitrile) and the corresponding organic acid (acrylic acid or methacrylic acid) were not found. That is, the conversion and selectivity were 100%.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Then, use the sequencing kit from ABI and the Auto Sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 1, the sixth Leu of the ⁇ -subunit of nitrile hydrazine was replaced with Met.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 / L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and M4 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 2, the sixth Leu of the ⁇ -subunit of nitrile hydrazine was replaced with Thr.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazine gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 3, the sixth Leu of the nitrile hydrazine subunit was replaced with A1a.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 4, the sixth Leu of the nitrile hydrazine subunit was replaced with Va1.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is the condition described in the kit This was performed by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 5, the 19th A1a of the nitrile hydrasubunit was replaced with Va1.
  • the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Reference Example 1 was 2003/016014
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 juL total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 6, the 38th met of the nitrile hydrazine subunit was replaced with Leu.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The composition was based on the conditions described in the kit), and heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C> 120 seconds) were repeated 25 cycles.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-137A. As a result, in the clones shown in Table 7, Thr at position 77 of the ⁇ -subunit of nitrile hydrazine was replaced with Ser.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and the Ml3 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Then, use the sequencing kit 373 A made by AB I The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 8, the 90th Gy in the nitrile hydrazine subunit was replaced with Ala.
  • the PCR reaction No. 1 was a system of 50 jt L containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 18 in the Sequence Listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing). Was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a sequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 9, the 102nd Va1 of the nitrile hydratase subunit was replaced with A1a.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primers listed in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • Transformant No. 10 was obtained by the same operation as in Reference Example 1.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a sequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 10, the 106th Va 1 in the nitrile hydratase subunit was replaced with I 1 e.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50-ml total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit) and repeated 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 11, the 126th Phe in the nitrile hydrazine subunit was replaced with Tyr.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO: TJP2003 / 016014
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protocol 373A. As a result, in the clones shown in Table 12, the G1n at the 130th position in the subunit of nitrile hydra was replaced with G1u.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles (according to the conditions described in the kit).
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 13, the 142nd Leu in the nitrile hydratase supplement was replaced with Va1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is based on the conditions described in the kit), and is repeated by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Continued Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and 373A. As a result, in the clones shown in Table 14, G1u at position 146 of the nitrile hydratase subunit was replaced with Asp.
  • site-specific mutagenesis was performed in the same manner as in Reference Example 1 using pPT-DII plasmid DNA as type II.
  • PCR reaction No. 1 was a 50-L system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 15, the A1a at position 187 of the nitrile hydrazyme subunit was replaced with Thr.
  • site-specific mutagenesis was performed in the same manner as in Reference Example 1 using pPT-DB1 plasmid DNA as type III.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit) by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72.C) for 120 seconds. .
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72.C
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) were each 50 p.
  • the procedure was the same as that for PCR reaction No. 1 in a system with a total amount of 5 including mo 1 (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • the DNA amplification products were analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 juL each of the PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solutions, the presence of the amplified DNA products was confirmed. It could be confirmed .
  • a transformant No. 16 was obtained by the same operation as in Reference Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and 373A. As a result, in the clones shown in Table 16, the 194th Ser in the subunit of nitrile hydra was replaced with Leu.
  • site-specific mutagenesis was carried out in the same manner as in Reference Example 1 using pPT-D—1 plasmid DNA as type I.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is the condition described in the kit The denaturation was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. In PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-137A. As a result, in the clones shown in Table 17, the 203rd A1a of the nitrile hydrazine subunit was replaced with G1u.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and Auto Sequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 18, the 20th A1a in the ⁇ subunit of nitrile hydrase was converted to Va1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 19, the Asp at the 21st position of the nitrile hydrazine; 8 subunit was replaced with Asn. [Table 19]
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) The cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, extension reaction (72.C) for 120 seconds is repeated 25 cycles. went. The PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Continued The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 20, the 108th G1u of the 8 subunits of nitrile hydrazine was replaced with Asp.
  • the PCR reaction No. 1 was a system of 50 juL in total containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) By repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds went. PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 21, the 108th G1u in the iS subunit of nitrile hydrazine was replaced with Pro.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is based on the conditions described in the kit), and is repeated by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) were each 50 p.
  • the same operation as in PCR reaction No. 1 was performed using a 50-juL system containing mo 1 (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • the DNA amplification products were analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.'0% by weight) using 5 juL each of the PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solutions, the presence of the amplified DNA products was confirmed. It could be confirmed . Thereafter, a transformant No. 22 was obtained in exactly the same manner as in Reference Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 22, the 108th G1u in the ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with Ser. '[Table 22]
  • Site-specific mutagenesis was performed in the same manner as in Reference Example 1 using the pPT-DB1 plasmid DNA as type III in order to replace the 108th G1u of 8 subunits with Arg.
  • PCR reaction No. 1 was a 50-L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is the condition described in the kit. This was performed by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 23, the G1u at position 108 in the ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with Arg.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • PCR reaction No. 2 contains 50 pmo1 of each of MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing). In a 50 L system (the composition was based on the conditions described in the kit), the same operation as in PCR reaction No. 1 was performed.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a 373A sequencing kit. As a result, in the clones shown in Table 24, the 108th G1u in 8 subunits of nitrile hydra was substituted with Cys.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 34 in the Sequence Listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing). The composition is based on the conditions described in the kit.) The cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 cycles. It went by doing. PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using the sequencing kit 373A manufactured by ABI and the sequencing primer 373A. As a result, in the clones shown in Table 25, the G1u at position 108 of the ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with Leu. [Table 25]
  • PCR reaction No. 1 Two types of PCR reactions were performed using 10 ng of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Reference Example 1 as each type II.
  • the PCR reaction No. 1 was performed in a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Continued The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 26, the 108th G1u of the ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with Thr.
  • site-specific mutagenesis was performed in the same manner as in Reference Example 1 using pPT-DIII plasmid DNA as type III.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 juL total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 27, the Ala at position 200 of the nitrile hydrase subunit was replaced with Asp.
  • site-specific mutagenesis was performed in the same manner as in Reference Example 1, using pPT-D D1 plasmid DNA as type I.
  • the PCR reaction No. 1 was a system (50 juL total) containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 37 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and was repeated 25 times under the following conditions: heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer-RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) were each 50 p.
  • the same operation as in PCR reaction No. 1 was performed using a 50-juL system containing mo 1 (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • Analysis of DNA amplification products by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 ⁇ L each of PCR reaction Nos. 1 and 2 The existence was confirmed. Thereafter, a transformant No. 28 was obtained in exactly the same manner as in Reference Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 28, the 200th A1a in the subunit of nitrile hydra was replaced with I1e.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 38 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is the condition described in the kit This was performed by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a sequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 29, the A1a at position 200 in the yS subunit of nitrile hydratase was substituted with Va1.
  • PCR reaction No. 2 contains 50 pmo 1 each of MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing) and M13 primer one RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing) The procedure was the same as that for PCR reaction No. 1 in a system with a total volume of 5 ⁇ l (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a sequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 30, the 200th A1a in the ⁇ subunit of nitrile hydra was replaced with G1u.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in Sequence Listing of Sequence Listing: 40 and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in Sequence Listing). The composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazine gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 31, Ser at the 2nd 2nd of the ⁇ subunit (of nitrile hydrazine) was substituted with Tyr. [31]
  • 10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube, and sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. After adding ampicillin to this medium to a final concentration of 100 ⁇ gZml, inoculate a platinum loop of the clone No. 11 obtained in Reference Example 11 and incubate at 37 ° C and 300 rpm. Incubated for 20 hours. After the culture solution lm 1 was collected in an appropriate centrifuge tube, the cells were separated by centrifugation (15000 rpm 5 minutes). Subsequently, a plasmid DNA of clone No. 11 was prepared from the cells by an Al-U-SDS extraction method.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a total of 501 containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds was repeated 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, as shown in Table 32, the 19th A1a of the wild-type nitrile hydra subunit was replaced by Va1 and the 126th Phe of the subunit was replaced by Tyr. .
  • plasmid DNA of clone No. 32 was prepared from the cells by alkaline SDS extraction.
  • PCR reaction No. 1 was a system having a total amount of 501 containing 50 pmol each of the primer described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) Performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • PCR reaction No. 2 includes MUT 4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and Ml 3 primer RV
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protein sequencing 373A. As a result, as shown in Table 33, the 6th Leu of the wild-type nitrile hydra subunit is met, the 19th A1a of the subunit is Va1 and the 126th of the subunit is Was replaced by Tyr. [Table 33]
  • the PCR reaction No. 1 was a system having a total amount of 501 containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) By repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds went.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, as shown in Table 34, the sixth Leu of the ⁇ -subunit of wild-type nitrile hydratase was Thr, the 19th A1a of the subunit was Va1 and the ⁇ -subunit The 126th Ph e of the bird was replaced by Tyr respectively.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO: Heat denaturation was carried out in a system with a total amount of 501 containing 50 pmo1 of each of the primer described in 12 and the M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) (the composition is based on the conditions described in the kit) The test was performed by repeating 25 cycles of 15 seconds at 98 ° C), 30 seconds at annealing (55 ° C), and 120 seconds at elongation reaction (72 ° C). PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, as shown in Table 35, the 6th Leu of the wild-type nitrile hydra subunit is A1a, the 19th A1a of the subunit is Va1, and the subunit is The 126th Ph e of the bird was replaced by Tyr respectively.
  • PCR reaction No. 1 was a 50/1 total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds was repeated 25 cycles.
  • PCR reaction No. 2 is MU T4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing) '' and Ml R
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, as shown in Table 36, G1u at position 108 of the S subunit of wild-type nitrile hydratase was substituted with Asp, and Ser at position 212 of the subunit was substituted with Tyr.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a total of 501 systems each containing 50 pmo1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) The composition was based on the conditions described in the kit), and was repeated 25 times under the following conditions: heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, as shown in Table 37, the 108th G1u of the yS subunit of wild-type nitrile hydrase was replaced with Arg, and the 212th Ser of the ⁇ -supunit was replaced with Tyr. It had been.
  • Amino acid mutation of clone No. 27 (; 200th of 8 subunits: A1a is Asp) and amino acid mutation of clone No. 31 (212th of 8 subunits: Ser is Tyr) It was confirmed that the nitrile hydrase activity was maintained in the amino acid substitution product.
  • the PCR reaction No. 1 was a system containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) in a total amount of 501 (composition: This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protocol 373A. As a result, as shown in Table 38, the 200th A1a of the S-subunit of wild-type nitrile hydrase was Asp, and the 212th Ser of the ⁇ -subunit was Tyr. Have been replaced respectively.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a 50 1 total system containing 50 pmo 1 of each of the primer listed in SEQ ID NO: 39 and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The composition is based on the conditions described in the kit.) Thermal denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, extension reaction (72 ° C) 120 seconds was repeated 25 times.
  • the PCR reaction No. 2 was composed of MUT4 primer (sequence is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and M The PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit and an A-137A manufactured by ABI. As a result, as shown in Table 39, the 200th A1a of the wild type nitrile hydratase subunit was G1u, and the 212th Ser of the ⁇ subunit was Tyr. Had been replaced.
  • LA PCR invitro mu tagenesis Kit manufactured by Takara Shuzo.
  • the “LA PCR invitro mu tagenesis kit” is simply referred to as a kit.
  • the key is basically The principles and operation methods of the kit were followed.
  • LB liquid medium 10 mL was prepared in a 3 OmL test tube, and sterilized by an autoclave at 121 ° C for 20 minutes. After ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 gZmL, one platinum loop of MT-108'22 was inoculated and cultured at 37 ° C. at 300 rpm for about 20 hours. After 1 mL of the culture solution was collected in an appropriate centrifuge tube, the cells were separated by centrifugation (15000 rpm 5 minutes). Subsequently, a plasmid pPT-DB1 was prepared from the cells by an Al-U-SDS extraction method.
  • ⁇ CR reaction ⁇ .1 is a total of 50 / L containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 41 in the sequence listing and ⁇ 13 primer ⁇ 4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • composition is based on the conditions described in the kit
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • PCR was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. Reaction No. 3 was performed.
  • the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration of 0.8% by weight) using 5 juL of the reaction end solution of PCR reaction No. 3. The presence of the amplified DNA product of kb was confirmed.
  • pPT-DB1 was cut with EcoRI and Hindlll, and subjected to agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration of 0.7%). Only a 7 Kb DNA fragment was cut out.
  • the cut agar mouth pieces (about 0.1 lg) were finely ground, suspended in 1 mL of TE solution, and kept at 55 ° C for 1 hour to completely melt the agarose. This melt was subjected to phenol / mouth opening form extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment, which was finally dissolved in 10 L of TE.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 40, nitrile hydra C 36 th Th r of Buyunitto it was confirmed that have been replaced in Me t 40] 'Table 40
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 42 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Continued The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 41, it was confirmed that the 71st Arg of the subunit of nitrile hydra was replaced with His.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 43 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 42, it was confirmed that 148th Gy in the nitrile hydratase subunit was substituted with Asp.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 / L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 44 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 43, it was confirmed that the 204th V a1 in the nitrile hydrazine subunit was substituted with Arg.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a 373A sequencing kit. As a result, in the clones shown in Table 44, it was confirmed that Lys was substituted for the 204th Va1 in the nitrile hydrase subunit.
  • PCR reaction No. 1 Two types of PCR reactions were performed using 10 ng of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 1 as each type II.
  • the PCR reaction No. 1 had a total volume of 50 ⁇ L each containing 50 pmo 1 of the primers listed in SEQ ID NO: 46 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • System The composition is the condition described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 45, it was confirmed that the 204th Va1 in the nitrile hydratase subunit was replaced with Trp.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 47 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 46, it was confirmed that the 204th Va1 of the nitrile hydratase subunit was replaced with Thr.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 48 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazyme gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protein sequencing 373A. As a result, in the clones shown in Table 47, it was confirmed that Thr at the 10th position of the yS subunit of nitrile hydrazine was replaced with Asp.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 ⁇ L total system containing 50 mo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 49 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing)
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and was repeated 25 times under the following conditions: heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 48, it was confirmed that the 10th Thr in ⁇ subunit of nitrile hydra was replaced with G1u. [3 ⁇ 448] Table 48
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 50 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is based on the conditions described in the kit), 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, extension reaction (72 ° C) for 120 seconds Performed by repeating.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Then use the ABI Sequencing Kit and Auto Sequencer 373 A The nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 49, it was confirmed that Thr at the 10th position of the nitrile hydratase subunit was replaced with Trp.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 51 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazyme gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 50, it was confirmed that the 10th Thr in the ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with G1y.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 52 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit 373A manufactured by ABI and a sequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 51, it was confirmed that the 10th Thr in the subunit of nitrile hydra was replaced with Tyr.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type I, and the mutation specific to position 15 was introduced in the same manner as in Example 1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50-L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 53 in the sequence listing and the Ml3 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of thermal denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. .
  • thermal denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • elongation reaction 72 ° C
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protocol 373A. As a result, in the clones shown in Table 52, it was confirmed that the 10th Thr of the S subunit of nitrile hydrazine was replaced with Cys.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 54 in the Sequence Listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing). Is based on the conditions described in the kit), heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, The test was performed by repeating the conditions of the reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • PCR reaction No. 1 contained 50 pmo1 each of the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
  • the same operation as in PCR reaction No. 1 was performed using the juL system (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • the PCR products No. 1 and No. 2 were analyzed for DNA amplification products by agarose gel electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 juL of each end solution. The existence of was confirmed. Thereafter, a transformant No. 53 was obtained in exactly the same manner as in Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using the sequencing kit 373A manufactured by ABI and the sequencing primer 373A. As a result, in the clones shown in Table 53, it was confirmed that the 32nd Va1 in the ⁇ subunit of nitrile hydra was replaced with G1y.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO:
  • the primers described in 55 and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) were each 50 L in total containing 50 pmo1 (the composition was based on the conditions described in the kit). This was performed by repeating the conditions of 15 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 54, it was confirmed that Thr at position 37 of the yS subunit of nitrile hydratase was replaced with Thr.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type II, and the site-specific modification was performed in the same manner as in Example 1. Different introduction was performed.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 56 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 57 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) Repeat the cycle of 15 cycles of heat denaturation (98 ° C), 30 seconds of annealing (55 ° C), and 120 seconds of elongation reaction (72 ° C) for 25 cycles. Was performed. In PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 56, it was confirmed that 37th Phe of 8 subunits of nitrile hydra was substituted with Leu. 56] Table 56
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 / L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 58 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Next, use the ABI Sequencing Kit and Auto Sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 57, it was confirmed that the 37th Phe of the ⁇ subunit of nitrile hydrase was replaced with I1e.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a 50-L total system containing 50 pmo1 each of the primers listed in SEQ ID NO: 59 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The composition is based on the conditions described in the kit) . The cycle of thermal denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 cycles. went. PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a kit of 373A. As a result, it was confirmed that in the clones shown in Table 58, Ph 37 at the y8 subunit of nitrile hydratase was substituted with Va1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 60 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listing in the sequence listing &).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 times.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 59, it was confirmed that the 41st Phe of) 8 subunit of nitrile hydra was substituted with G1u.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 61 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) By repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds went. In PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 60, it was confirmed that the 41st Ph e ′ of the; 3 subunit of nitrile hydratase was substituted with Thr.
  • the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 1 was used as each type II, and two types of PCR reactions were performed.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primers listed in SEQ ID NO: 62 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition depends on the conditions described in the kit), heat denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, Four
  • PCR reaction No. 2 contained 50 pmo1 each of the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
  • ⁇ Performed in the same manner as in PCR reaction No. 1 using the iL system (composition is based on the conditions described in the kit).
  • Analysis of DNA amplification products by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 juL each of PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solution revealed the presence of amplified DNA products. Was confirmed. Thereafter, a transformant No. 61 was obtained by the same operation as in Example 1.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO: Heat denaturation was carried out in a 50-L system (containing the composition described in the kit) containing 50 pmo1 each of the primer described in 63 and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The test was performed by repeating 25 cycles of 15 seconds at 98 ° C), 30 seconds at annealing (55 ° C), and 120 seconds at elongation reaction (72 ° C). PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 62, it was confirmed that the 41st Phe of the nitrile hydratase subunit was replaced with Leu.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type II, and the site-specific modification was performed in the same manner as in Example 1. Different introduction was performed. ⁇ 'Two types of PCR reactions were performed using each of the PPT-DB1 plasmid DNA1 Ong prepared in Example 1 as type II.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the PCR reaction No. 2 contains 50 pmo1 of each of the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
  • the procedure was the same as in PCR reaction No. 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and 373A. As a result, in the clones shown in Table 63, it was confirmed that the 41st ⁇ e of the ⁇ subunit of nitrile hydra-yucase was replaced by I1e.
  • PCR reaction No. 1 was a 50-L system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 65 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 64, it was confirmed that the 41st Ph in S subunit of nitrile hydra was replaced with Va1. [Table 64] Table 64
  • ⁇ Reaction 1 ⁇ 0.1 is a 50 L total system containing 50 pmo 1 each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 66 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition is based on the conditions described in the kit.) By repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds went. PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Next, use an ABI Sequencing Kit and an Auto Sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 65, it was confirmed that the 46th met in ⁇ subunit of nitrile hydratase was substituted with Gy.
  • site-specific mutagenesis was carried out by the same procedure as in Example 1 using pPT-DB1 plasmid DNA as type III.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 67 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 67 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazine gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-137A. As a result, in the clones shown in Table 66, it was confirmed that the 46th met in the S subunit of nitrile hydratase was replaced with Tyr.
  • PCR reaction No. 1 Two types of PCR reactions were performed using 1 ng of the plasmid DNA of PPT-DB1 prepared in Example 1 as each type II.
  • the PCR reaction No. 1 was carried out in a total volume of 50 L containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 68 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • Thermal denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • elongation reaction 72 ° C) for 120 seconds in the system (composition is based on the conditions described in the kit) was repeated 25 times.
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing) and the M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing) were each 50 pmo 1
  • the reaction was performed in the same manner as in PCR reaction No. 1 with a total amount of 5 ⁇ iL (including the composition described in the kit). Perform agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 L each of PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solution. Further analysis of the DNA amplification product confirmed the presence of the amplified DNA product. Thereafter, a transformant No. 67 was obtained by the same operation as in Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 67, it was confirmed that the 46th met in the 3-subunit of nitrile hydratase was replaced by Leu.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 69 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This was performed by repeating the conditions of thermal denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. .
  • thermal denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • elongation reaction 72 ° C
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the Ml3 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) were each 50 p.
  • the same operation as in PCR reaction No. 1 was performed using a 50-L system containing mo 1 (composition is based on the conditions described in the kit).
  • the DNA amplification products were analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 jt L each of the PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solution, the presence of the amplified DNA products was confirmed. It could be confirmed .
  • a transformant No. 68 was obtained in exactly the same manner as in Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 68, it was confirmed that Lys was substituted for 46th met in the nitrile hydratase subunit.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 70 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Heat denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55.C) 30 seconds, elongation The test was performed by repeating the conditions of the reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 69, it was confirmed that the 46th met in the j8 subunit of nitrile hydratase was replaced with Asp.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO: A heat-denaturing system (50 L in total, containing 50 pmo 1 each of the primers described in 71 and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing)) (the composition is based on the conditions described in the kit) was used. The test was performed by repeating 25 cycles of 15 seconds at 98 ° C), 30 seconds at annealing (55 ° C), and 120 seconds at elongation reaction (72 ° C). PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazine gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 70, it was confirmed that the Leu at position 48 of the nitrile hydra subunit was replaced with Gy.
  • the plasmid DNA of PPT-DB1 prepared in Example 1 was used as type II, and two types of PCR reactions were performed.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 72 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 72 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and 373A. As a result, in the clones shown in Table 71, it was confirmed that the 48th Leu in the nitrile hydrase subunit was replaced with A1a.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 73 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 72, it was confirmed that the 48th Leu of nitrile hydratase; 3 subunit was replaced with Va1. . [Table.72] Table 72
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 74 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) This was performed by repeating the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles under the conditions described in the kit.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Then, use a sequencing kit manufactured by ABI and an auto sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 73, it was confirmed that the 48th Leu in the subunit of nitrile hydrase was replaced with Ser.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type III, and site-specific mutagenesis was carried out in the same manner as in Example 1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 75 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated for 25 cycles. went.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and Auto Sequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 74, it was confirmed that the 48th Leu in the nitrile hydrase subunit was replaced with Thr.
  • the PCR reaction No. 1 was a system of 50 juL in total containing 50 pmo 1 each of the primer 1 described in SEQ ID NO: 76 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and was repeated 25 times under the following conditions: heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and Auto Sequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 75, it was confirmed that the 48th Leu of the; 8 subunit of nitrile hydrase was substituted with Arg.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 77 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Is based on the conditions described in the kit '), and repeated 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the Diodekin method using a sequencing kit manufactured by ABI and a 373A autosequencer. As a result, in the clones shown in Table 76, it was confirmed that Phe at position 51 of the nitrile hydratase; 8 subunits was replaced with Ala.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type III, and site-specific mutagenesis was carried out in the same manner as in Example 1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 78 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Heat denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, The test was performed by repeating the conditions of the reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using the sequencing kit ABI 373A and the protocol 373A. As a result, in the clones shown in Table 77, it was confirmed that the 51st Phe of S-subunit (of nitrile hydra) was substituted with Va1.
  • the PCR reaction No. 1 is represented by SEQ ID NO: Thermal denaturation in a system with a total volume of 50 L containing 50 pmo1 each of the primer described in 79 and the M13 primer M (sequence number is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) (the composition is based on the conditions described in the kit) (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds were repeated for 25 cycles.
  • SEQ ID NO: 8 the composition is based on the conditions described in the kit
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-1373A. As a result, in the clones shown in Table 78, it was confirmed that the 72nd T rp of the jS subunit of nitrile hydrazine was replaced with P he.
  • the pPT-DB1 plasmid DNA was used as type III, and site-specific by the same procedure as in Example 1. Mutagenesis was performed.
  • the PCR reaction No. 1 was a system of 50 juL in total containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 80 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 79, it was confirmed that the 118th Phe of the j8 subunit of nitrile hydratase was substituted with A1a.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 81 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and is repeated by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds.
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and a protocol 373A. As a result, in the clones shown in Table 80, it was confirmed that the 118th Ph of the S subunit of nitrile hydratase was substituted with Leu. [Table 80] Table 80
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 each of the primer described in SEQ ID NO: 82 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). 25 cycles of thermal denaturation (98 ° C) for 15 seconds, ⁇ -ring (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. It was done by doing. PCR reaction No.
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Next, use a sequencing kit made by ABI and an auto sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 81, it was confirmed that the 118th Phe of the; 3 subunit of nitrile hydra was replaced by I1e.
  • site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in Example 1 using pPT-DB1 plasmid DNA as type III.
  • PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 83 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 82, it was confirmed that the 118th Phe of the nitrile hydraidase; 8 subunits was replaced with Va1.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 84 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, it was confirmed that in the clones shown in Table 83, Leu at position 127 of the ⁇ subunit (of nitrile hydratase) was substituted with A1a.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 / L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 85 of the sequence column and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit), by repeating 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and elongation reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 84, it was confirmed that 127th Leu of nitrile hydratase (subunit 3) was substituted with Va1.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a 50 juL total system containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 86 in the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The composition depends on the conditions described in the kit), heat denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, The test was performed by repeating the conditions of the reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 85, it was confirmed that the 127th Leu of ⁇ -unit of nitrile hydratase was replaced with Ser.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO:
  • the primers described in 87 and the M13 primer M4 (sequence number is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) each containing 50 pmo1 in a total amount of 50 juL (the composition is based on the conditions described in the kit) were used.
  • the denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds were repeated 25 times.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrazine gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, it was confirmed that in the clones shown in Table 86, Arg at position 146 of ⁇ subunit of nitrile hydratase was substituted with Gy.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 ⁇ L total system containing 50 pmo 1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 88 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). This is performed under the conditions described in the kit) by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles. I got it. PCR reaction No.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 87, it was confirmed that Arg at position 160 of 8 subunits of nitrile hydratase was replaced with Leu.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 89 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • heat denaturation 98 ° C
  • annealing 55 ° C
  • extension reaction 72 ° C
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, it was confirmed that in the clones shown in Table 88, Arg at position 160 of the; 3 subunit of nitrile hydratase was substituted with Trp. [Table 88] Table 88
  • the PCR reaction No. 1 was a system of 50 juL in total containing 50 pmo1 each of the primer described in SEQ ID NO: 90 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition was based on the conditions described in the kit), and was repeated 25 times under the following conditions: heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • Plasmids were prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Then, use the sequencing kit from ABI and the Auto Sequencer 373A. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method. As a result, in the clones shown in Table 89, it was confirmed that Leu at position 186 of (8) supunit of nitrile hydratase was substituted with G1u.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 each of the primers listed in SEQ ID NO: 91 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
  • the composition is based on the conditions described in the kit), and the cycle of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds is repeated for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, in the clones shown in Table 9, it was confirmed that Lep at position 186 of the y8 subunit of nitrile hydratase was substituted with Asp.
  • the PCR reaction No. 1 was composed of a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 92 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit manufactured by ABI and an autosequencer-373A. As a result, it was confirmed that in the clones shown in Table 91, Leu at position 186 of ⁇ subunit of nitrile hydratase was replaced with Lys.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50-liter total system containing 50 pmo1 of each of the primer described in SEQ ID NO: 93 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). Was performed under the conditions described in the kit) and repeated 25 cycles of heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds. .
  • the MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and the M13 primer-RV (sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) were each 50 p.
  • the system was performed in the same manner as in PCR reaction No. 1 using a system with a total amount of 50; t / L containing mo 1 (the composition was based on the conditions described in the kit).
  • Analysis of DNA amplification products by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by weight) using 5 juL each of PCR reaction No. 1 and No. 2 reaction completion solution confirmed the presence of amplified DNA products did it .
  • a transformant No. 92 was obtained in exactly the same manner as in Example 1.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene portion was determined by the dideoxy method using a sequencing kit from ABI and an autosequencer 373A. As a result, in the clones shown in Table 92, it was confirmed that Leu at position 186 of 8 subunits of nitrile hydratase was substituted with Arg.
  • the PCR reaction No. 1 was a 50 L total system containing 50 pmo 1 each of the primers listed in SEQ ID NO: 94 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence listed in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). (The composition depends on the conditions described in the kit.) Thermal denaturation (98 ° C) 15 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, elongation The test was performed by repeating the conditions of the reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.
  • a plasmid was prepared from the cells by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydrase gene was determined by the dideoxy method using a sequencing kit 373A from ABI. As a result, in the clones shown in Table 93, it was confirmed that the 186th Leu in ⁇ subunit of nitrile hydra was replaced with Asn.
  • PCR reaction No. 1 is as shown in SEQ ID NO: Heat denaturation (98%) was carried out in a 50 L total system containing 50 pmo1 of each of the primers described in 95 and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) (the composition was based on the conditions described in the kit). This was performed by repeating the conditions of 15 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds for 25 cycles.

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Abstract

本発明は新規な変異点を有するニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供することを課題とし、また、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法を提供することをも課題としている。上記課題を解決する手段として、シュードノカルディア・サーモフィラ　Pseudonocardia　thermophila　JCM3095由来であり、ヘテロな2種のサブユニットから構成されるニトリルヒドラターゼに新規な変異を導入し、得られる変異体のアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供する。更に、改変の対象となる領域をニトリルヒドラターゼ中の立体構造/アミノ酸配列中に特定し、該領域を形成するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸に置換・挿入・削除等の変更を加える事によってニトリルヒドラターゼを改変する。本発明により、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に、従来技術に比して効率良く変換することが可能となる。

Description

新規な二トリルヒドラターゼ 技術分野 本発明は、 新規な二トリルヒドラ夕一ゼ及びそれをコードする遺伝子、 該遺伝 子を含有するプラスミド、 該プラスミドにより形質転換された細胞株、 該細胞株 を用いて二トリルヒドラ夕一ゼを産生する方法、 及び該細胞株を培養して得られ る培養液 ·細胞 ·細胞処理物を用いて二卜リル化合物から対応するアミド化合物 を製造する方法に関する。
また本発明は、 二卜リルヒドラターゼ活性を有する酵素の性質を改変する方法 に関するものである。 また、 本発明は性質が改変された酵素、 及びそれをコード する遺伝子、 該遺伝子を含有するプラスミド、 該プラスミドにより形質転換され た細胞株、 該細胞株を用いて二トリルヒドラ夕一ゼを産生する方法、 及び該細胞 株を培養して得られる培養液 ·細胞 ·細胞処理物を用いて二トリル化合物から対 応するアミド化合物を製造する方法に関する。 本発明は、 生体触媒を用いた物質 生産の分野に於いて有用である。 背景技術 種々の化合物の二トリル基を水和によりアミド基に変換する二トリル水和活性 を有する酵素である二トリルヒドラターゼが発見され、 該酵素を産生する微生物 株が多数開示されている。 二トリルヒドラ夕一ゼを用いて二トリル化合物よりァ ミド化合物を工業的に製造するためには、 アミド化合物の製造コストに占める該 酵素の製造コストを下げることが重要である。 具体的には、 酵素調製物の単位重 量あたりの該酵素含有量を高くする必要がある。 そこで、 該酵素の遺伝子を用い て遺伝子工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的として、 該酵素 の遺伝子をク口一ニングする試みがなされている。 03016014
二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する微生物としては、 ロドコッカス ロドクロ ウス J一 1株 （ブタペスト条約に則って、 受託番号 FERM BP— 1478と して茨城県つくば市東一丁目一番一号中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センタ一に寄託されている。 ) ゃシユードノカルディア サ一モ フイラ （本菌株は、 理化学研究所微生物系統保存施設 （埼玉県和光市広沢 2— 1 ) に番号 J CM3095として保管され、 何人にも請求により自由に分譲される 。 また、 ブタペスト条約に則って、 受託番号 FERM BP— 7379として独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。 ） が見 い出されている （特許文献 1及び 3参照） 。
また、 これらの株より二トリルヒドラ夕一ゼが単離され、 同酵素が、 一般的に ひサブュニット及び /3サブユニットと呼ばれる 2種類のポリペプチドを構成要素 としている事が確認されている。 そして、 これらの株より二トリルヒドラ夕ーゼ 遺伝子が単離され、 そのアミノ酸配列及び塩基配列が明らかにされた。 更に、 こ れらの二トリルヒドラ夕一ゼを形質転換体内で発現できるプラスミド及び同ブラ スミドにより形質転換された細胞株 （例として TGl/pNHJ 10H及び MT - 10822 :これらはブ夕ぺスト条約に則って、 前者は受託番号 FERM B P- 2777として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に寄 託され、 後者は受託番号 F E RM BP— 5785として、 茨城県つくば巿東ー 丁目一番一号中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター に 1996年 2月 7日付けにて寄託されている。 ） が作出された。 加えて、 これ らの細胞株による二トリルヒドラ夕ーゼの生産及び該細胞株又はそれより得られ る二トリルヒドラターゼをニトリル化合物と接触させる事による対応するァミド 化合物の製造が可能となっている。 （特許文献 2及び 4、 非特許文献 1参照） また、.二トリルヒドラターゼの立体構造を解析する試みもなされており、 その 解析結果は、 PDB番号 1AHJ、 2AHJ、 1 I R Eとして公開されている。 該酵素は、 enサブユニットと /3サブュニットが会合した 2量体がその基本構造単 位となっており、 その 2量体が更に会合して 4量体や 8量体、 12量体 （由来と なる生物種によって異なる。 ） を形成してその活性を発揮している事が明らかと なっている。 更に、 その活性中心を形成する領域や構造も明らかになつており、 活性中心は、 反応溶媒に直接接触する酵素外側に露出した位置ではなく、 酵素内 部に包埋される様な位置に存在する事が知られている。 活性の発揮に必須である 金属原子 （コバルト原子又は鉄原子：由来となる生物種によって異なる。 ） の活 性中心への配位の様子も知られており、 金属原子の配位に伴う現象として、 活性 中心を形成する領域を成すアミノ酸配列中のシスティン残基が翻訳後酸化を生じ る事も明らかになつている。 具体的には、 aサブユニットのアミノ酸配列中の X iCXLC! S C2X2X3X4Xr, (Cはシスティンを、 Xはセリン又はスレオニ ンを、 Lはロイシンを、 はシステインスルフィン酸 (CYSTEINE SULFINIC ACID - 3-SULFIN0ALANINE) を、 Sはセリンを、 C 2はシステインスルフェン酸 ( CYSTEINE SULFENIC ACID · S- HYDROXY- CYSTEINE) を、 Xx · X2 · X3 · X4 · X5 は任意のアミノ酸を示す。 ） という配列で表される領域が活性中心への金属原子 の配位を担う領域とされている。 （非特許文献 2力、ら 4参照）
しかし、 二卜リルヒドラタ一ゼ本来の活性は損なう事無く、 活性 ·基質特異性 - Vmax - Km-熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性等の 性質を改変する方法に関しては、 具体的な手法を開示した発明は未だなされてい ない。 特に、 二トリルヒドラタ一ゼの立体構造に注目し、 その構造を変化させる 事によって上記の性質を改変する方法に関しては、 その試み自体がなされていな い。
尚、 エトリルヒドラ夕一ゼをコードする遺伝子を宿主細胞で発現させて酵素活 性のある二トリルヒドラ夕ーゼを生産する場合に該酵素の活性化に関与するタン パク質が存在する点が特許文献 5に開示されている。
特許文献 1 ：特開平 2— 470号公報
特許文献 2 ：特開平 4— 211379号公報
特許文献 3 ：特開平 8— 56684号公報
特許文献 4 ：特開平 9一 275978号公報
特許文献 5 ：特開平 11一 253168号公報
非特許文献 1 ： Kobayashi M， Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, Be顧 T, Yamada H. Cloning, nucleotide seauence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes from hodococcus rhodochrous Jl. Biochim Biophys Acta. 1991 Dec 2 ; 1129 (1) : 23-33.
非特許文献 2 ： Huang W, J ia J, Cummings J, Nelson M, Schneider G,
LindQvist Y. Crystal structure of ni tri le hydratase reveals a novel iron centre in a novel fold. Structure. 1997 May 15 ; 5 (5) : 691-9.
非特許文献 3 ： Nagashima S, Nakasako M, Dohmae N, Tsuj iinura M, Takio K, Odaka M, Yohda M, Kamiya N, Endo I. Novel non-heme iron center of ni tri le hydratase wi th a claw sett ing of oxygen atoms. Nat Struct Biol. 1998 May ; 5 (5) : 347-51.
非特許文献 4 : Miyanaga, A. , Fushinobu, S. , I to, K. , and Wakagi, T.
Crystal structure of cobal t-containing ni tri le hydratase. Biochem.
Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 16 ; 288 (5) : 1169-74. 発明の開示 本発明の目的は、 機能を実質的に変化させない新規な置換変異部位を有する二 トリルヒドラタ一ゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供する事である 。 さらに、 該遺伝子を含むプラスミド、 該プラスミドにより形質転換された細胞 株、 該細胞株を用いた該酵素の産生方法、 及び該細胞株を培養して得られる培養 液 ·細胞 ·細胞処理物を用いて二トリル化合物から対応するアミド化合物を製造 する方法をも提供する事である。 '
また本発明の他の目的は、 二トリルヒドラ夕ーゼ本来の活性は損なう事無く、 活性'，基質特異性 · Vm a X · Km ·熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に 対する安定性等の性質のうちの一つ以上を変化させる事を含む方法に関する具体 的手法を提供する事である。 具体的には、 二トリルヒドラターゼの立体構造に変 化を及ぼす変異を二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子に導入する事によって上記の性質 を改変する方法を提供する事である。 更に、 改変方法によって得られた二トリル ヒドラ夕一ゼ、 該ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子、 該遺伝子を含むプ ラスミド、 該遺伝子乃至該プラスミドにより形質転換された細胞株、 該細胞株を 用いた該ニ卜リルヒドラターゼの産生方法、 及び該細胞株を培養して得られる培 T JP2003/016014
養液 ·細胞 ·細胞処理物を用いて二トリル化合物から対応するアミド化合物を製 造する方法をも提供する事である。
本発明者らはかかる状況の下、 特開平 9一 2 7 5 9 7 8号公報 （特許文献 4 ) に開示されている二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子に、 該公報には開示されていない 新規な置換変異部位を導入し、 該変異導入後の該遺伝子の塩基配列を決定した。 さらに、 該遺伝子を含むプラスミド、 該プラスミドにより形質転換された細胞株 を作製した。 また、 該細胞株を用いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られ る培養液 ·細胞 ·細胞処理物を用いた二トリル化合物からの対応アミド化合物の 製造に関しても鋭意検討を重ねた結果、 本願発明を完成させるに至った。
本発明にかかる二トリルヒドラターゼの サブュニットは、 配列番号： 1に示 される サブユニットのアミノ酸配列の 3 6番目、 7 1番目、 1 4 8番目、 及び 2 0 4番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変 異を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする。
本発明にかかる二トリルヒドラターゼの/ Sサブュニットは、 配列表の配列番号 ： 2に示す ;8サブユニットのアミノ酸配列の 1 0番目、 3 2番目、 3 7番目、 4 1番目、 4 6番目、 4 8番目、 5 1番目、 7 2番目、 1 1 8番目、 1 2 7番目、 1 4 6番目、 1 6 0番目、 1 8 6番目及び 2 1 7番目のアミノ酸の何れか一つ以 上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列を有すること を特徴とする。
本発明にかかる二トリルヒドラターゼは、 a?サブユニットと; δサブュニットを 有し、 これらのサブュニッ卜の少なくとも一方が上記の変異を有することを特徴 とする。
本発明にかかる二トリルヒドラ夕ーゼのひサブュニットをコ一ドする遺伝子は 、 上記のひサブュニットにおける変異を有するアミノ酸配列をコードすることを 特徴とする。 本発明にかかる二トリルヒドラターゼの) sサブュニットをコードす る遺伝子は、 上記の; δサブュニットにおける変異を有するアミノ酸配列をコード することを特徴とする。
本発明にかかる二トリルヒドラ夕ーゼをコードする遺伝子は、 サブュニット をコードする遺伝子と サブュニッ卜をコードする遺伝子とを有し、 これらのサ ブュニットの少なくとも一方が上記の変異を有することを特徴とする。
本発明のプラスミドは、 上記の遺伝子のいずれかを有することを特徴とする。 本発明の形質転換体は、 上記のプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換するこ とに得られたものであることを特徴とする。
本発明の二トリルヒドラ夕ーゼの製造は、 上記の形質転換体、 該形質転換体の 培養液、 または該形質転換体ゃ該培養液の処理物から二トリルヒドラターゼを回 収する工程を有することを特徴とする。
本発明のアミド化合物の製造方法は、 水性媒体中で二トリル化合物を上記の二 卜リルヒドラ夕一ゼとを接触させて該ニトリル化合物を対応するアミド化合に変 換する工程を有することを特徴とする。
'そして更に本発明者らはかかる状況の下、 特許文献 2、 特許文献 4に開示され ている二トリルヒドラターゼ遺伝子を例として、 新規な観点に基づいて変 Sの対 象となる領域を特定し、 該領域を形成するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列 中のアミノ酸に、 置換、 挿入又は削除等の変更を加える事によって二トリルヒド ラタ一ゼの改変方法を実施した。 具体的には、 非特許文献 2、 3、 4及び P D B 番号 1 AH J · 2 AH J · 1 I R Eとして公開されている二トリルヒドラ夕ーゼ の立体構造を参照し、 鋭意解析を実施する事によって、 目的に適う変更対象領域 を特定した。 より具体的には、 立体構造の解析により、 基質が酵素外部から活性 中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形 成する領域、 及び 2量体形成に関与する サブュニットと ]3サブュニッ卜間の会 合界面や 2量体同士の会合に関与する界面を形成する領域を特定した。 アミノ酸 配列に置換、 挿入又は削除等の変更を加える方法としては、 特に限定されないが 、 遺伝子組換えの技法を用いた変異導入法を、 その例として挙げる事が出来る。 更に、 該変更後の該遺伝子の塩基配列を決定し、 該遺伝子を含むプラスミド、 該遺伝子乃至該プラスミドにより形質転換された細胞株を作製し、 該細胞株を用 いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られる培養液 ·細胞 ·細胞処理物を用 いた二トリル化合物からの対応アミド化合物の製造を実施する事によって改変方 法が二トリルヒドラタ一ゼの性質にいかなる変化を及ぼしているかを観察した。 改変対象となる二卜リルヒドラターゼを構成するアミノ酸配列の様々な位置への 3016014
変更及びそれによつて得られた様々な改変酵素に関して鋭意検討を重ねた結果、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 上述した特徴に加え下記 〔1〕 から 〔22〕 に示す通り である。
〔1〕 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 - Vmax - Km- 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、
(a) 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配列 表の配列番号 98記載のァミノ酸配列及び配列表の配列番号 99記載のアミノ酸 配列とアラインメントする、
(b) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36番目スレオニンより 48番目ァスパラギンに至る領域、 配列表の配列番号 9 9記載のアミノ酸配列中の 31番目リジンより 51番目フエ二ルァラニンに至る 領域、 及び 112番目リジンより 127番目ロイシンに至る領域に相当するアミ ノ酸残基を特定する、
(c) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う、 〔2〕 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換' 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 - Vmax - Km- 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、
(d) 改変前の二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配列 表の配列番号 98記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号 99記載のアミノ酸 配列とアラインメントする、
(e) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36 · 48 · 71 · 148 · 188 · 204番目に相当するアミノ酸残基、 配列 表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中の' 10 · 32 · 33 · 37 · 40 · 41 2003/016014
· 46 · 48 · 51 · 61 · 72 · 112 · 118 · 127 · 146 · 150 · 160 · 168 · 171 · 176 · 186 ' 217 · 218番目に相当するアミ ノ酸残基を特定する、
(f ) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う、 〔3〕 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vma X · Km · 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、
(g) 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素の立体構造を、 PDB ( Protein Data Bank) 番号 1 I RE記載の二トリルヒドラ夕一ゼ立体構造と、 ァ ミノ酸配列に基づ
いたァラインメントを行う事により推定する、
(h) 推定された立体構造に基づき、 PDB番号 1 I RE記載の二トリルヒドラ ターゼ立体構造中の A鎖 （Chain 1IRE:A) における N末から数えて 2番目のヘリ ックス、 及び B鎖 （Chain 1IRE:B) における N末から数えて 1番目のへリックス 、 2番目のへリックス、 及びそれらにはさまれたル一プ部分と C末から数えて 3 番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
(i) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う、 〔4〕 二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vma X · Km · 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、 ―
(j) 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素の立体構造を、 PDB番 号 1 I RE記載の二トリルヒドラ夕一ゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
(k) 推定された立体構造に基づき、 PDB番号 1 I RE記載の二トリルヒドラ ターゼ立体構造中の A鎖における N末から 89番目のアミノ酸残基であるダル夕 ミン、 1 6 5番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 3 7番目のアミノ酸残基であるフエ二ルァラニン、 4 8番目 のアミノ酸であるロイシンに相当する 4つのアミノ酸残基を特定する、
( 1 ) 特定された 4つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体 構造上半径 5 A内の範囲に側鎖先端重原子力含まれるアミノ酸残基を特定する、
(m) 上記 1で特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除 を行う、
〔5〕 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a x · Km · 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、
(n ) 改変前の二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素の立体構造を、 P D B番 号 1 I R E記載の二トリルヒドラタ一ゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
( o ) 推定された立体構造に基づき、 基質が酵素外部から活性中心に向かう際や 生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定 する、
( P ) 特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、 それを変更する事が空洞の 大きさを変化させ、 延いては基質/生成物の通過し易さ Zし難さを制御するアミ ノ酸残基を特定する、
( q ) 上記 pで特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除 を行う、
〔6〕 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により 特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換 、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 - Vm a x - Km - 熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質 を変化させる改変方法、
( r ) 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、 P D B番 号 1 I RE記載の二トリルヒドラターゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
(s) 推定された立体構造に基づき、 ？08番号1 I RE記載の二トリルヒドラ 夕一ゼ立体構造中の A鎖における N末から 89番目のアミノ酸であるグルタミン (A89Q) 、 165番目のアミノ酸であるグルタミン酸 （A165E) に相当 するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 37番目のアミノ酸であるフエ二ルァラ ニン （B37F) 、 48番目のアミノ酸であるロイシン （B48L) に相当する ァミノ酸残基の 4つのアミノ酸残基を特定する、
(t) A165 Eに相当するアミノ酸残基と B 48 Lに相当するアミノ酸残基と の最短重原子間距離を d 1、 A 89 Qに相当するアミノ酸残基と B 48 Lに相当 するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 2、 B 37 Fに相当するアミノ酸残 基と B 48 Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 3と規定し、 d 1力、ら 3の 1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
(u) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う、 〔7〕 (t) の工程が以下の （ ) のとおりである 〔6〕 に記載の改変方 法、
(f ) A165 Eに相当するアミノ酸残基と B48Lに相当するアミノ酸残基 との最短重原子間距離を d 1、 A89 Qに相当するアミノ酸残基と B 48 Lに相 当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 2、 B37 Fに相当するアミノ酸 残基と B48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 3、 A165 Eに相当するアミノ酸残基と B 37 Fに相当するアミノ酸残基との最短重原子間 距離を d4、 A89 Qに相当するアミノ酸残基と B 37 Fに相当するアミノ酸残 基との最短重原子間距離を d 5と規定し、 d 1から 5の 1つ以上を変化させるァ ミノ酸残基を特定する、
〔8〕 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素が下記の [A] と [ B] の 2種類のポリペプチドを含む事を特徴とする 〔1〕 から 〔7〕 の何れか一 項記載の改変方法、
[A] 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列と 40%以上の相同性を示すァ ミノ酸配列から成るポリぺプチド、 [B] 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列と 25%以上の相同性を示すァ ミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔9〕 [A] のポリペプチドが下記 [C] のポリペプチドであり、 [B] の ポリペプチドが下記 [D] ポリペプチドである事を特徴とする 〔8〕 記載の改変 方法、
[C] 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列、 配列表の配列番号 98記載の ァミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除を行つたアミノ酸 配列、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列の 6 · 19 · 38 · 77 · 90
· 102 · 106 · 126 · 130 · 142 · 146 · 187 · 194 · 203 番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のァミノ酸に置換したアミノ酸 配列、 の何れかのァミノ酸配列から成るポリぺプチド、
[D] 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列、 配列表の配列番号 99記載の アミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除を行ったアミノ酸 配列、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列の 20 - 21 - 108 - 200
• 212番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した ァミノ酸配列、 の何れかのァミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔10〕 [Α] のポリペプチドが下記 [Ε] のポリペプチドであり、 [Β] のポリペプチドが下記 [F] のポリペプチドである事を特徴とする 〔8〕 記載の 改変方法、
[Ε] 配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 704番目力、ら 1315番目に よって成る〇RF (オープンリーディングフレーム） がコードするアミノ酸配列 と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[F] 配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 1番目から 680番目によって 成る ORFがコードするァミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリべ プチド、
〔11〕 改変前の二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素が構成要素として 含む 2種のポリペプチドの内、 1つが 〔10〕 記載の [E] のポリペプチドであ り、 もう 1つのロリペプチドが 〔10〕 記載の [F] のポリペプチドである事を 特徴とし、 且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミ ノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行うことにより、 該酵素の活 性、 基質特異性、 Vmax、 Km、 熱安定性、 基質に対する安定性、 生成物に対 する安定性の何れか 1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(d' ) 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配 列表の配列番号 99記載のァミノ酸配列とアラインメントする、
(e' ) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中 の 48 · 51番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f ' ) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う
〔12〕 [A] のポリペプチドが下記 [G] のポリペプチドである事を特徴 とする 〔8〕 記載の改変方法、 '
[G] アミノ酸配列 XiCXLCi SC2X2X3X4X5で表される領域を含むポ リペプチド -
(ここにおいて、 Cはシスティンを、 Xはセリン又はスレオニンを、 Lは口イシ ンを、 はシステインスルフィン酸 （CYSTEINE SULFINIC ACID · 3 - SULFINOALANINE) を、 Sはセリンを、 C 2はシステインスルフェン酸 （CYSTEINE SULFENIC ACID · S-HYMOXY- CYSTEINE) を、 Xx · X2 · X3 · X4 · X5は任意の アミノ酸を示す。 ） 、
〔13〕 Χ^Λ'リン、 Χ4がトリブトファン、 Χ5がプロリンである事を特 徴とする 〔12〕 記載の改変方法、
〔14〕 Χ2がチロシン、 Χ3がプロリンである事を特徴とする 〔13〕 記載 の改変方法、
〔15〕 XiCXLCiS C2X2X3X4X5で表される領域を介して金属原子 と結合している事を特徴とする 〔12〕 から 〔14〕 の何れか一項記載の改変方 法、
〔16〕 金属原子がコバルト原子である事を特徵とする 〔15〕 記載の改変 方法、
〔17〕 〔1〕 から 〔16〕 の何れか一項記載の改変方法により得られる事 を特徴とする改変酵素、 〔1 8〕 〔1 7〕 記載の改変酵素をコードする遺伝子、
〔1 9〕 〔1 8〕 記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド、
〔2 0〕 微生物を 〔1 8〕 記載の遺伝子又は 〔1 9〕 記載のプラスミドを用 いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体、
〔2 1〕 [ 2 0〕 記載の形質転換体を培養して得られる培養液、 細胞、 又は それらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調 製方法、
〔2 2〕 〔2 0〕 記載の形質転換体を培養して得られる培養液、 細胞、 又は それらの処理物、 又は 〔2 1〕，記載の調製方法により得られる改変酵素を二トリ ル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニ卜リル化合物を対応するアミド化合 物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法、
本発明により、 シュ一ドノカルディア ·サ一モフイラ由来の二トリルヒドラタ ーゼの本質的な機能を変化させる事の無い新規な変異点を有する二卜リルヒドラ 夕一ゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列が提供される。 さらに、 該遺伝子 を含むプラスミド、 該プラスミドを含む形質転換体、 該形質転換体を用いた該酵 素の産生方法、 及び該形質転換体を用いた二トリル化合物からの対応するアミド 化合物の製造方法が提供される。
また本発明により、 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素の立体構造を変化 させる事を特徴とする手法を用いて、 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有す る酵素を改変する方法が提供される。 この方法を用いる改変方法としては、 活性
•基質特異性 · Vm a X · Km ·熱安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対す る安定性等といった性質のうちの一つ以上が改変される事を特徴とする効果が得 られる事がその効果として挙げられる。 また本発明により、 新規な変異点を有す る二トリルヒドラ夕一ゼ、 該酵素を構成するポリべプチド鎖をコードする遺伝子 が提供される。 更に、 該遺伝子を含むプラスミド、 該遺伝子乃至該プラスミドを 含む形質転換体、 該形質転換体を用いた該酵素の産生方法、 及ぴ該形質転換体を 用いた二トリル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法が提供される。 図面の簡単な説明 図 1は MT10822より抽出したプラスミド pPT— DB 1の制限酵素切断 点地図である。 （参考例 1、 実施例 1、 83)
図 2はロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラタ一ゼを活 性発現させる為に構築したプラスミド p J 1 H-DB 1の制限酵素切断点地図で ある。 （実施例 84)
図 1及び図 2中で使用される略号は以下の意味を表す。
b 1 a ： /3—ラクタマ一ゼをコードする ORFを示す。
Co 1 E l-o r i ： Co 1 E 1系の複製開始部位を示す。
1 a c Z ： p U C 18由来のラク I ^一スォペロンのプロモーターおよびオペレー ター領域を示す。
ΝΗα：シュ一ドノカルディア サ一モフイラ由来の二トリルヒドラターゼの α サブュニットをコードする OR Fを示す。
NH 3 ：シュ一ドノカルディア サーモフイラ由来の二トリルヒドラ夕一ゼの /3 サブュニットをコードする OR Fを示す。
P 16 ：シュ一ドノカルディア サ一モフイラ由来の二トリルヒドラターゼの活 性化に関与する事を特徴とする蛋白質をコードする OR Fを示す。
nhhA :ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラ夕ーゼの サブュニットをコ一ドする OR Fを示す。
nhhB :ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラターゼの j3サブュニットをコードする OR Fを示す。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明について更に詳細に説明する。
本発明の二トリルヒドラ夕ーゼは、 二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素 に変異を導入して得られるものであり、 たとえばシユードノカルディア ·サーモ フイラ由来の二トリルヒドラターゼに変異を導入して得られたものである。 その ようなものは具体的には、 配列表の配列番号： 1及び 2に示すアミノ酸配列の所 定の部位の少なくとも 1つ以上におけるアミノ酸を他のアミノ酸で置換したもの により基本的に構成される。 すなわち、 本発明は、 配列表の配列番号： 1に示さ れる 205個のアミノ酸の配列により表される サブュニットの内の少なくとも 1個以上を他のァミノ酸で置換したものを構成要素とする二トリルヒドラタ一ゼ 、 配列表の配列番号： 2に示される 233個のアミノ酸の配列により表される β サブュニットの構成アミノ酸計 438個の内の少なくとも 1個以上を他のアミノ 酸で置換したものを構成要素とする二卜リルヒドラターゼ及びその両方を構成要 素とする二トリルヒドラターゼを含んでいる。
本発明における、 シュ一ドノカルディア ·サ一モフィラ由来の二トリルヒドラ 夕ーゼに変異を導入して得られた二トリルヒドラ夕一ゼに用いられる具体的なァ ミノ酸配列には、 以下のものが含まれる。
( a— 0 ) 配列番号： 1の αサブュニッ卜のアミノ酸配列
(a- 1) 配列番号： 1に示される サブユニットのアミノ酸配列の 36番目 、 71番目、 148番目、 及び 204番目のアミノ酸の何れか一つ以上のァミノ 酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列
( a— 2) 配列表の配列番号： 1に示される αサブュニットのアミノ酸配列の 6番目、 19番目、 38番目、 77番目、 9 Q番目、 102番目、 106番目、 126番目、 130番目、 142番目、 146番目、 187番目、 194番目、 及び 203番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換し た変異を有するアミノ酸配列
(b— 0) 配列表の配列番号： 2に示される y8サブュニットのアミノ酸配列 (b- 1) 配列表の配列番号： 2に示す )3サブュニットのアミノ酸配列の 10 番目、 32番目、 37番目、 41番目、 46番目、 48番目、 51番目、 72番 目、 1 18番目、 127番目、 146番目、 160番目、 186番目及び 217 番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有 するアミノ酸配列
(b-2) 配列表の配列番号： 2に示す; Sサブュニットのアミノ酸配列の 20 番目、 21番目、 108番目、 200番目、 及び 212番目のアミノ酸の何れか 一つ以上のァミノ酸を他のァミノ酸に置換した変異を有するァミノ酸配列 上記の各変異は、 変異前の二トリルヒドラ夕一ゼ活性を少なくとも維持し得る ものである。
本発明における、 シユードノカルディア ·サーモフィラ由来の二トリルヒドラ 夕ーゼに変異を導入して得られた二トリルヒドラターゼは、 上記の （a— 0) 〜 (b-2) から選択されたアミノ酸配列を有する以下の構成要素からなる。 (A— 1) αサブユニットが上記の （a— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 する二トリルヒドラ夕一ゼ
(A— 2) サブユニットが上記の （a— 1) 及び （a— 2) の変異を含むァ ミノ酸配列を有する二卜リルヒドラターゼ
(B- 1) ^サブユニットが上記の （b— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 する二卜リルヒドラ夕ーゼ
(B-2) ^サブユニットが上記の （b— 1) 及び （b— 2) の変異を含むァ ミノ酸配列を有する二トリルヒドラ夕一ゼ
(A— 3) αサブユニットが上記の （a— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 し、 ；8サブユニットが上記の （b— 0) のアミノ酸配列を有する二トリルヒドラ タ一ゼ
(A-4) サブユニットが上記の （a— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 し、 ；8サブユニットが上記の （b— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有するニト リルヒドラ夕一ゼ
(A— 5) サブユニットが上記の （a— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 し、 ；3サブユニットが上記の （b— 2) の変異を含むアミノ酸配列を有する二卜 リルヒドラターゼ
(A-6) αサブユニットが上記の （a— 1) の変異を含むアミノ酸配列を有 し、 ^サブユニットが上記の （b— 1) 及び （b— 2) の変異を含むアミノ酸配 列を有する二トリルヒドラ夕一ゼ
(A- 7) aサブュニットが上記の （ a— 1 ) 及び （ a— 2 ) の変異を含むァ ミノ酸配列を有し、 Sサブユニットが上記の （b— 0) のアミノ酸配列を有する 二トリ レヒドラターゼ
(A-8) αサブユニットが上記の （a— 1) 及び （a_2) の変異を含むァ ミノ酸配列を有し、 サブユニットが上記の （b— 1) の変異を含むアミノ酸配 列を有する二トリルヒドラターゼ
(A— 9) サブユニットが上記の （a— 1) 及び （a— 2) の変異を含むァ ミノ酸配列を有し、 ^サブユニットが上記の （b— 2) の変異を含むアミノ酸配 列を有する二トリルヒドラ夕一ゼ
(A— 10) 1 サブユニットが上記の （a— 1) 及び （a— 2) の変異を含む アミノ酸配列を有し、 ；5サブユニットが上記の （b— 1) 及び （b— 2) の変異 を含むアミノ酸配列を有する二トリルヒドラターゼ
(B— 3) サブユニットが上記の （a— 0) のアミノ酸配列を有し、 βサブ ユニットが上記の （b_l) のアミノ酸配列を有する二卜リルヒドラターゼ
(B-4) サブユニットが上記の （a— 0) のアミノ酸配列を有し、 βサブ ユニットが上記の （b— 1) 及び （b— 2) の変異を含むアミノ酸配列を有する 二トリルヒドラ夕ーゼ
(B— 5) サブユニットが上記の （a— 2) の変異を含むアミノ酸配列を有 し、 ；8サブユニットが上記の （b— 1) 及び （b— 2) の変異を含むアミノ酸配 列を有する二トリルヒドラターゼ
なお、 上記の特定された変異部位以外のアミノ酸については、 上記の特定部位 の変異による目的とする二トリルヒドラターゼ活性を損なわない範囲内で、 アミ ノ酸の置換、 挿入、 欠失が生じてもよい。
本発明において、 シユードノカルディア ·サーモフィラ由来の二トリルヒドラ 夕一ゼに変異を導入して得られた二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子には、 二トリルヒ ドラ夕—ゼの サブュニットをコードする遺伝子及び二トリルヒドラターゼの サブュニットをコードする遺伝子力含まれる。
本発明にかかる遺伝子の一群としては、 シユードノカルディア 'サ一モフィラ 由来の二卜リルヒドラ夕ーゼ遺伝子に変異導入を施したものが挙げられ、 これに は、 サブュニッ卜のアミノ酸配列をコードする遺伝子； ^サブュニットをコ一 ドする遺伝子；及び αサブュニットをコードする遺伝子と サブュニットをコ一 ドする遺伝子の両方を有する二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子が含まれる。
具体的には、 以下のものを挙げることができる。 (G-l) 先に挙げた （a— 1) の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩 基配列を有する遺伝子；
(G-2) 先に挙げた （a— 1) 及び （a— 2) の変異を有するアミノ酸配列 をコ一ドする塩基配列を有する遺伝子；
(G— 3) 先に挙げた （b— 1) の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩 基配列を有する遺伝子；
(G-4) 先に挙げた （b— 1) 及び （b— 2) の変異を有するアミノ酸配列 をコードする塩基配列を有する遺伝子；及び
(G— 3) 先に挙げた （A— 1) 〜 （B— 4) のいずれかの二トリルヒドラタ —ゼをコ一ドする塩基配列を有する遺伝子。
上記の変異の基礎となる配列番号： 1の αサブュニッ卜のアミノ酸配列をコー ドする塩基配列としては、 配列番号： 3の塩基配列が好ましい。 また、 上記変異 の基礎となる配列番号： 2の； δサブュニットのアミノ酸配列をコードする塩基配 列としては、 配列番号： 4の塩基配列が好ましい。
例えば、 配列番号： 3を基礎とした場合の上記 （a— 1) の変異は、 配列番号
： 3の塩基配列の 106番目から 108番目、 21 1番目から 213番目、 44 2番目から 444番目、 及び 610番目から 6 12番目の何れか一つ以上の塩基 配列を他の塩基配列に置換して得ることができる。
また、 配列番号： 3を基礎とした場合の上記 （a— 2) の変異は、 配列番号： 3の塩基配列の 16番目から 18番目、 55番目から 57番目、 1 12番目から 1 14番目、 229番目から 231番目、 268番目から 270番目、 304番 目から 306番目、 316番目から 318番目、 376番目から 378番目、 3 88番目から 390番目、 424番目から 426番目、 436番目から 438番 目、 559番目から 561番目、 580番目から 582番目、 及び 607番目か ら 609番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換した塩基配列の 一部を置換して得ることができる。
一方、 配列番号： 4を基礎とした場合の上記 （b— 1) の変異は、 配列番号： 4の塩基配列の 28番目から 30番目、 94番目から 96番目、 109番目から 1 1 1番目、 121番目から 123番目、 136番目から 138番目、 142番 目から 1 4 4番目、 1 5 1番目から 1 5 3番目、 2 1 4番目から 2 1 6番目、 3 5 2番目から 3 5 4番目、 3 7 9番目から 3 8 1番目、 4 3 6番目から 4 3 8番 目、 4 7 8番目から 4 8 0番目、 5 5 6番目から 5 5 8番目、 及び 6 4 9番目か ら 6 5 1番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得ることが できる。
また、 配列番号： 4を基礎とした場合の上記 （b— 2 ) の変異は、 配列番号： 4の塩基配列の 5 8番目から 6 0番目、 6 1番目から 6 3番目、 3 2 2番目から 3 2 4番目、 5 9 8番目から 6 0 0番目、 及び 6 3 4番目から 6 3 6番目の何れ か一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換した塩基配列の一部を置換して得る ことができる。
これらの置換は、 各遺伝子がコードする 及び^サブュニットの少なくとも一 方が組み込まれた二トリルヒドラタ一ゼの活性が置換前の状態を維持、 またはそ れよりも向上するような範囲内で行われる。 なお、 変異導入手段に関しては特に 限定されない。
本発明の二トリルヒドラターゼ遺伝子における上記の （a _ l ) 、 ( a - 2 ) 、 （b— 1 ) 及び （b— 2 ) の変異部位以外の部位については、 それが二トリル ヒドラ夕一ゼ活性を有するタンパク質の铸型として機能できる範囲内で、 塩基の 置換、 挿入または削除による更なる変異を有するものでもよい。
このような更なる変異については以下のような例をあげることができる。 ある 一定の塩基配列を有する遺伝子を铸型として転写 ·翻訳された場合であっても、 それを導入する宿主細胞の種類や培養に使用する栄養培地の成分や組成若しくは 培養時の温度や P H等によっては、 遺伝子発現後の宿主細胞内酵素による修飾な どにより、 所期の酵素作用は保持しているものの配列表における N末端付近のァ ミノ酸の 1個又は 2個以上が欠失したり、 N末端に 1個又は 2個以上のアミノ酸 が新たに付加した異型体を産生する事があり得る。 その為、 そのような異型な二 トリルヒドラターゼも本発明に含まれるものとする。
一方、 本発明の二トリルヒドラ夕一ゼ生産用のプラスミドは上記の二トリルヒ ドラ夕—ゼ遺伝子を用いて調製することができる。 具体例としては以下のものを 挙げるこのができる。 (P— 1) 先に挙げた （a— 1) の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩 基配刿を有するプラスミ.ド；
(P-2) 先に挙げた （a— 1) 及び （a— 2) の変異を有するアミノ酸配列 をコードする塩基配列を有するプラスミド；
(P- 3) 先に挙げた （b— 1) の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩 基配列を有するプラスミド；
(P— 4) 先に挙げた （b— 1) 及び （b— 2) の変異を有するアミノ酸配列 をコードする塩基配列を有するプラスミド；及び
(P- 3) 先に挙げた （A— 1) 〜 （B— 4) のいずれかの二トリルヒドラ夕 ーゼをコードする塩基配列を有するプラスミド。
また、 本発明にかかる形質転換体または細胞株は、 このプラスミドを用いて任 意の宿主細胞を形質転換して得られたものである。 本発明の二トリルヒドラ夕一 ゼの生産方法は、 上記の形質転換体や細胞株を培養して二トリルヒドラターゼを 産生させる工程を有する。 また、 本発明のアミド化合物の製造方法は、 このよう な二卜リルヒドラ夕一ゼを産生する形質転換体や細胞株を培養して得られる培養 液、 細胞または細胞処理物を媒体中にて二トリル化合物と接触させて対応するァ ミド化合物を製造させる工程を有する。 以下、 本発明の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法について詳 細に説明する。
本発明において、 二トリルヒドラタ一ゼ活性とは、 二卜リル化合物を対応する アミド化合物に水和する活性を言う。 該活性を有する酵素とは、 一般的には サ ブュニット、 j3サブユニットと称される 2種のポリペプチド鎖を構成要素とする 事を特徴とし、 二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子とは、 これら 2種のポリペプチド鎖 を形成する事を特徴とする 2つのアミノ酸配列乃至それらをコードする事を特徴 とする 2つの ORF (オープンリーディングフレーム） を成す塩基配列を指す。 シユードノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕 ーゼ （配列表の配列番号 98及び 99、 特許文献 3、 非特許文献 4、 PDB番号 ： 1 I RE参照） を例にして具体的に述べると、 配列表の配列番号 98記載のァ ミノ酸配列から成るポリペプチド及び P D B番号 1 I R E記載の二トリルヒドラ タ一ゼ立体構造中の A鎖が αサブュニッ卜、 配列表の配列番号 9 9記載のァミノ 酸配列から成るポリペプチド及び P D B番号 1 I R E記載の二トリルヒドラ夕一 ゼ立体構造中の Β鎖が /3サブユニットである。 また、 配列表の配列番号 1 0 0記 載の塩基配列から成る O R Fと配列表の配列番号 1 0 1記載の塩基配列から成る 〇R Fとを二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子と言う。
また、 ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラターゼ （配 列表の配列番号 1 0 4、 特許文献 2、 非特許文献 1参照） の場合、 配列表の配列 番号 1 0 4記載の塩基配列の 7 0 4番目から 1 3 1 5番目によって成る O R Fが コードするァミノ酸配列から成るポリべプチドがひサブュニット、 配列表の配列 番号 1 0 4記載の塩基配列の 1番目から 6 9 0番目によって成る O R Fがコード するアミノ酸配列から成るポリペプチドが 3サブユニットである。 また、 配列表 の配列番号 1 0 4記載の塩基配列がコードする 2つの O R Fを二トリルヒドラタ —ゼ遺伝子と言う。
本発明における改変方法とは、 二トリルヒドラ夕ーゼ本来の活性は損なう事無 く、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a X · Km ·熱安定性 ·基質に対する安定 性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を変化させる目的の下、 改変 前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を変化させる事を志向す る手法であり、 その特徴として、 立体構造の解析により、 基質が酵素外部から活 性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を 形成する領域、 及び Z又は、 2量体形成に関与する αサブュニットと /3サブュニ ット間の会合界面や 2量体同士の会合に閧与する界面を形成する領域を特定し、 該領域に存在するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか 1 箇所以上に、 置換、 挿入又は削除等の変更を加える工程を含む事が挙げられる。 シュ一ドノカルディアサーモフイラ J CM 3 0 9 5由来の二トリルヒドラ夕 ーゼ （配列表の配列番号 9 8及び 9 9 ·特許文献 3 ·非特許文献 4 · P D B番号 ： 1 I R E参照） を例にして具体的に述べると、 基質が酵素外部から活性中心に 向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する 領域に存在するアミノ酸残基に相当するのは、 P D B番号 1 I R E記載の二トリ ルヒドラ夕一ゼ立体構造中の B鎖における N末から数えて 1番目のへリックス · 2番目のヘリックス ·それらにはさまれたループ部分に相当する領域を形成する アミノ酸残基、 PDB番号 1 I RE記載の二トリルヒドラタ一ゼ立体構造中の A 鎖における N末から 89番目のアミノ酸残基であるグルタミン · 165番目のァ ミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 3 7番目のアミノ酸残基であるフエ二ルァラニン · 48番目のアミノ酸であるロイ シンに相当する 4つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構 造上半径 5 A内の領域に側鎖先端重原子が含まれるァミノ酸残基、 配列表の配列 番号 98記載のアミノ酸配列中の 36番目スレオニンより 48番目ァスパラギン に至る領域、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中の 31番目リジンより 51番目フエ二ルァラニンに至る領域、 及び 112番目リジンより 127番目口 イシンに至る領域に相当するアミノ酸残基、 配列表の配列番号 99記載のァミノ 酸配列中の 37 · 40 · 41 · 46 · 48 · 51 · ,61 · 72 · 112 · 118 • 127番目に相当するアミノ酸残基等が挙げられる。
また、 2量体形成に関与する サブユニットと ]3サブュニット間の会合界面や 2量体同士の会合に関与する界面を形成する領域に存在するアミノ酸残基に相当 するのは、 PDB番号 1 I RE記載の二トリルヒドラ夕ーゼ立体構造中の Α鎖に おける N末から数えて 2番目のヘリックス、 B鎖における N末から数えて 2番目 のへリックス、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36番目スレオニ ンより 48番目ァスパラギンに至る領域、 配列表の配列番号 99記載の 112番 目リジンより 127番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基、 配列表の 配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36 - 71 - 148 - 188 - 204番目 に相当するアミノ酸残基、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中の 10 · 32 · 33 · 112 · 118 · 127 · 146 · 150 · 160 · 168 · 17 1 · 176 · 186 · 217 · 218番目に相当するアミノ酸残基等が挙げられ る。
更に、 基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外 部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を構成するアミノ酸残基の内、 それ を変更する事が空洞の大きさを変化させ、 延いては基質/生成物の通過し易さ Ζ し難さを制御するアミノ酸残基を特定する方法としては、 PDB番号 1 I RE記 載の二トリルヒドラタ一ゼ立体構造中の A鎖における N末から 89番目のァミノ 酸であるグルタミン （A89Q) 、 165番目のアミノ酸であるグルタミン酸 （ A165E) に相当するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 37番目のアミノ酸 であるフエ二ルァラニン （B 37F) 、 48番目のアミノ酸であるロイシン （B 48L) に相当する 4つのアミノ酸残基を特定し、 A165Eと B48Lとの最 短重原子間距離を d l、 A89Qと B48Lとの最短重原子間距離を d 2、 B 3 7 Fと B 48 Lとの最短重原子間距離を d3、 A165Eと B37Fとの最短重 原子間距離を d4、 A89Qと B37Fとの最短重原子間距離を d 5と規定し、 d 1から 5の 1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、 該 d 1から 3の 1 つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する等が挙げられる。
従って、 対象となる二トリルヒドラ夕ーゼ （シユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来のものをその代表例として挙げる事が出来る。 ） に対 して、 上記の様にして特定した何れか 1つ以上のアミノ酸残基に相当するァミノ 酸配列中のアミノ酸に、 置換、 挿入又は削除等の変更を加える工程から成る改変 方法は、 本発明に含まれる。
また、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095以外の生物種由来 の二トリルヒドラ夕一ゼ （例えばロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二 トリルヒドラ夕一ゼ) をシュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由 来の二トリルヒドラタ一ゼの立体構造やアミノ酸配列とァラインメントし、 上記 のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を見出し、 相当するアミノ酸配列中のァ ミノ酸を変更する事による改変方法も本発明に含まれる。
以上に列挙した内容を実施するに当って、 立体構造乃至アミノ酸配列に基づい たアラインメントを行うに際して、 それに用いる手段は特に限定されないが、 ァ ミノ酸配列のアラインメントの手段としては日立ソフト社製の DNAS I Sゃフ リーソフトの CLUSTALWや BLAS T等の遺伝子配列解析ソフトが、 ァミ ノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングの手段としてはァクセ ルリス社製のモデラ一ゃホモロジ一等の蛋白質立体構造予測ソフトが、 各々例と して挙げられる。 一例を述べると、 ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラ ターゼ （配列表の配列番号 1 0 4 ·特許文献 2 ·非特許文献 1参照） の場合、 ァ ラインメントの結果、 配列表の配列番号 9 9記載のアミノ酸配列中の 4 8番目に 相当するアミノ酸残基： L e uに相当するアミノ酸残基は、 配列表の配列番号 1 0 4記載の塩基配列の 1番目から 6 9 0番目によって成る O R Fがコードするァ ミノ酸配列の 4 8番目に相当するアミノ酸残基： T r pであり、 配列表の配列番 号 9 9記載のアミノ酸配列中の 5 1番目に相当するアミノ酸残基： P h eに相当 するアミノ酸残基は、 配列表の配列番号 1 0 4記載の塩基配列の 1番目から 6 9 0番目によって成る O R Fがコードするアミノ酸配列の 5 1番目に相当するアミ ノ酸残基： S e rである。 これは、 アミノ酸配列に基づいたアラインメントと立 体構造に基づいたアラインメントとで一致する結果である。 この 2つのアミノ酸 残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか一方又は両方を変更する事に よる改変方法も本発明に含まれる。
尚、 以上の改変方法を実施するに当って、 アミノ酸残基に相当するアミノ酸配 列中のアミノ酸を変更する為の変異導入手段に関しては、 特に限定されないが、 遺伝子組換えの技法を用いてアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換す る変異導入法を、 その例として挙げる事が出来る。
また、 意図して導入した変異以外に副次的に導入される変異によるアミノ酸配 列や塩基配列の変化については、 意図した変異導入による目的の二トリルヒドラ 夕ーゼ活性を損なわない範囲内で、 アミノ酸や塩基の置換、 挿入又は削除が生じ てもよい。
この様な副次的に導入される変異については以下の様な例を挙げる事が出来る 。 ある一定の塩基配列を有する遺伝子を铸型として転写 ·翻訳された場合であつ ても、 それを導入する宿主細胞の種類や培養に使用する栄養培地の成分や組成又 は培養時の温度や p H等によっては、 遺伝子発現後の宿主細胞内酵素による修飾 などにより、 初期の酵素作用は保持しているものの配列表における N末端付近の アミノ酸の 1個又は 2個以上が欠失したり、 N末端に 1個又は 2個以上のアミノ 酸が新たに付加した異型体を産生する事があり得る。 その為、 そのような異型な 二トリルヒドラ夕一ゼをもたらす改変方法も本発明に含まれる。' 本発明における改変方法の対象となる、 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼの例と しては、 ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラ夕一ゼとシ ユードノカルディアサ一モフィラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕ーゼ とを挙げる事が出来る。 具体的には、 配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 1番目から 690番目によって成る ORFがコードするアミノ酸配列と相同であ るアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖と配列表の配列番^ 104記 載の塩基配列の 704番目から 1315番目によって成る ORFがコードするァ ミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖とを構 成要素とする二トリルヒドラタ一ゼと、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配 列によつて形成されるポリペプチド鎖と配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配 列によって形成されるポリペプチド鎖とを構成要素とする二トリルヒドラ夕一ゼ と、 を挙げる事が出来る。
本発明における改変方法の対象となる、 改変前の二トリルヒドラタ一ゼには、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列と 40%以上の相同性を示すアミノ酸 配列から成るポリペプチドと配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列と 25% 以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリぺプチドとを構成要素とする二ト リルヒドラ夕一ゼも含まれる。
配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列と 40%以上の相同性を示すアミノ 酸配列から成るポリペプチドの例としては、 配列表の配列番号 98記載のァミノ 酸配列から成るポリペプチド、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列の少な くとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列 から成るポリペプチド、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列の 6 · 19 · 38 · 77 · 90 · 102 · 106 · 126 · 130 · 142 · 146 · 187 • 194 - 203番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に 置換したアミノ酸配列から成るポリペプチド、 配列表の配列番号 104記載の塩 基配列の 704番目から 1315番目によって成る ORFがコードするアミノ酸 配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド等を挙げる事が出来る。 また、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列と 40%以上の相同性を示す アミノ酸配列から成るポリペプチドは、 その配列中
Figure imgf000026_0001
4
X4X5 (ここにおいて、 Cはシスティンを、 Xはセリン又はスレオニンを、 L はロイシンを、 はシステインスルフィン酸 (CYSTEINE SULFINIC ACID - 3- SULFINOALANINE) を、 Sはセリンを、 C 2はシステインスルフェン酸 （CYSTEINE SULFENIC ACID ' S- HYDROXY- CYSTEINE) を、 丄 · X2 · X3 · X4 · X5は任意の アミノ酸を示す。 ） で表される領域を含むポリペプチドである事を特徴とする場 合がある。 加えて、 Χ パリン、 X4がトリブトファン、 X5がプロリンである ポリペプチドである事を特徴とする場合がある。 更に加えて、 X2がチロシン、 X 3がプロリンであるポリペプチドである事を特徴とする場合がある。
上記の場合、 X CXLCiSCsXsXgXaXsで表される領域を介して金属 原子と結合している事を特徴とする場合がある。 加えて、 該金属がコバルトであ る事を特徴とする場合がある。
配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列と 25%以上の相同性を示すアミノ 酸配列から成るポリペプチドの例としては、 配列表の配列番号 99記載のァミノ 酸配列から成るポリペプチド、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列の少な くとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列 から成るポリペプチド、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列の 20 · 21 • 108 - 200 - 212番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のァ ミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリ'ペプチド、 配列表の配列番号 104 記載の塩基配列の 1番目から 690番目によって成る OR Fがコードするァミノ 酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド等を挙げる事が出来る。
—例を述べると、 ロドコッカス ロドクロウス J— 1株由来の二トリルヒドラ 夕ーゼの場合、 配列表の配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 704番目か ら 1315番目によって成る ORFがコードするアミノ酸配列から成るポリぺプ チドと配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 1番目から 690番目によって 成る OR Fがコードするアミノ酸配列から成るポリペプチドとを構成要素とする 二トリルヒドラターゼであるので、 本発明における改変方法の対象となる、 改変 前の二トリルヒドラ夕一ゼに含まれる。
また、 シユードノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒ ドラ夕一ゼは、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド と配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列から成るポリぺプチドとを構成要素 とする二トリルヒドラ夕ーゼであるので、 本発明における改変方法の対象となる 、 改変前の二トリルヒドラターゼに含まれる。
更に、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒ ドラタ一ゼから派生した二トリルヒドラ夕一ゼの例として、 シュ一ドノカルディ ァ サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼの構成要素の内、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、 配列表の配 列番号 98記載のアミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除 の何れかの変更を施したアミノ酸配列から成るポリぺプチド、 或いは配列表の配 列番号 98記載のアミノ酸配列の 6 · 19 · 38 · 77 · 90 · 102 · 106 • 126 · 130 · 142 · 146 · 187 · 194 · 203番目のアミノ酸の 少なくとも 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリ ぺプチドに置き換わった二トリルヒドラターゼである事、 及び配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、 配列表の配列番号 99記載の アミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除の何れかの変更を 施したアミノ酸配列から成るポリペプチド、 或いは配列表の配列番号 99記載の アミノ酸配列の 20 · 21 · 108 · 200 · 212番目のアミノ酸の少なくと も 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したァミノ酸配列から成るポリペプチド に置き換わった二トリルヒドラタ一ゼである事の、 何れか一方又は両方の条件を 満たす二トリルヒドラタ一ゼを挙げる事が出来る。
シユードノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕 ーゼから派生した二トリルヒドラ夕ーゼも、 本発明における改変方法の対象とな る、 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼに含まれる。
本発明において、 改変酵素とは、 二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素を対 象として改変方法を実施する事によって得られる二トリルヒドラ夕一ゼを言う。 その例としては、 上述の改変方法を用いて改変前の二トリルヒドラ夕ーゼの形質 を変化させて得られる事を特徴とする改変酵素を、 その例として挙げる事が出来 る。
形質の変化としては、 改変前の二卜リルヒドラ夕ーゼと比較した場合、 基質特 P T/JP2003/016014
異性 · Vm a x · Km ·熱安定性 ·基質 （：該酵素が触媒として機能し、 対応す るアミド化合物に変換する事が可能な任意の二トリル化合物が例として挙げられ る。 ） に対する安定性 ·生成物 （：該酵素が触媒として機能し、 任意の二トリル 化合物を変換する事で得られる対応するアミド化合物が例として挙げられる。 ) に対する安定性等といった性質の何れか 1つ以上の性質に関する変化を挙げる事 が出来る。 具体的な例としては、
1 ) 相対的に、 より嵩高い二トリル化合物を基質とし易くなる。
2 ) 相対的に、 より嵩の小さい二トリル化合物を基質とし易くなる。
3 ) 任意の二トリル化合物を基質とする場合の Vm a xが向上する。
4 ) 任意の二トリル化合物を基質とする場合の Kmが低減する。
5 ) 酵素を任意の熱量に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
6 ) 酵素を任意濃度の基質に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
7 ) 反応中に任意濃度の生成物が存在する事による反応阻害率が軽減する。
8 ) 酵素を任意濃度の生成物に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
等を挙げる事が出来る。
本発明における改変前の二トリルヒドラ夕ーゼを対象とした改変方法がもたら す形質変化の指標としては、 基質特異性の変化をその代表例の 1つに挙げる事が 出来る。 本発明における改変方法によって得られる改変酵素が、 基質特異性の変 化したものである場合、 その改変酵素は、 本発明における改変酵素に含まれる。 得られる改変酵素の基質特異性の変化を観察する方法としては、 嵩高さの異な る複数種の二トリル化合物を基質とする反応を行い、 生成する対応アミド化合物 量の違いを測定する方法が挙げられる。 その一例としては、 アクリロニトリルを 基質とする反応で生成するァクリルアミドとメタクリルニトリルを基質とする反 応で生成するメ夕クリルアミドとのモル比を比較する方法がある。 この場合、 改 変前の対象と比較して [生成するメタクリルアミドのモル量] ÷ [生成するァク リルアミドのモル量] の値が大きくなる方向に変化した改変酵素は、 より嵩高い 二トリル化合物を基質とし易くなる形質の変化を示したと言え、 その値が小さく なる方向に変化した改変酵素は、 より嵩の小さい二トリル化合物を基質とし易く なる形質の変化を示したと言える。 16014
シユードノカルディア サ一モフィラ J CM 3 0 9 5由来の二トリルヒドラ夕 ーゼ、 及びシュ一ドノカルディア サーモフイラ J C M 3 0 9 5由来の二トリル ヒドラ夕ーゼから派生した二トリルヒドラ夕一ゼを対象とした例においては、 立 体構造の解析により、 基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中 心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域、 及び/又は、 2量体 形成に関与する サブュニッ卜と 3サブュニット間の会合界面や 2量体同士の会 合に関与する界面を形成する領域を特定し、 該領域に存在するアミノ酸残基に相 当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか 1箇所以上に、 置換、 挿入又は削除等 の変更を加える工程を含む改変方法を実施した場合、 改変前の対象と比較して、 ァクリロニトリルを基質とする反応で生成するァクリルアミドとメタクリルニト リルを基質とする反応で生成するメタクリルアミドとのモル比が変化した改変酵 素が得られた。 この事は基質特異性すなわち形質の変化したものであると言える ので、 得られた改変酵素は、 本発明における改変酵素に含まれる。
ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラ夕一ゼを対象とし 'た例においては、 配列表の配列番号 1 0 4記載の塩基配列の 1番目から 6 9 0番 目によって成る O R Fがコードするアミノ酸配列の 4 8番目に相当するアミノ酸 残基： T r pを他のアミノ酸残基に変更する事による改変方法を実施した場合、 改変前の対象と比較して、 より嵩高い二トリル化合物を基質とし易くなる形質の 変化を示した。 従って、 獲得した形質変化を示す蛋白質は、 本発明における改変 酵素に含まれる。
尚、 得られる改変酵素が有する変異部位を組み合せる事によって、 更なる形質 の変化がもたらされる事は容易に類推される。 従って、 その様な変異部位の組み 合せによって得られる改変酵素も、 本発明における改変酵素に含まれる。
本発明において、 改変酵素をコードする遺伝子とは、 改変酵素を構成する 2種 のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする 2つのアミノ酸配列乃至それらをコ 一ドする事を特徴とする 2つの O R Fを成す塩基配列を指す。
本発明において、 遺伝子を含む事を特徴とするプラスミドとは、 改変酵素を構 成する 2種のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする 2つのアミノ酸配列をコ 一ドする事を特徴とする 2つの O R Fを成す塩基配列をその配列中に含有する事 を特徴とするプラスミドを指す。
上記のプラスミドは、 本発明における遺伝子に加え、 各遺伝子の発現に必要な 制御領域及び自律複製に必要な領域等の、 任意の宿主細胞を形質転換して得られ る形質転換体や細胞株による改変酵素の産生を可能せしめる構成を有する事が出 来る。 ここでいう任意の宿主細胞とは、 後述の実施例の様にその一例として大腸 菌が挙げられるが、 これに限定されるのものではなく、 枯草菌等のバチルス属菌 、 酵母や放線菌等の他の微生物も用いる事が出来る。
発現に必要な制御領域としては、 プロモーター配列 （転写を制御するオペレー ター配列を含む。 ） 、 リボゾーム結合配列 （S D配列） 、 転写終結配列等を挙げ る事が出来る。 ,
具体的なプロモーター配列の例としては、 大腸菌由来のトリブトファンオペ口 ンの t r pプロモーター ·ラク 1 ^一スォペロンの 1 a cプロモ一夕一 ·ラムダフ ァージ由来の P Lプロモーター及び P Rプロモーターや、 枯草菌由来のダルコン 酸合成酵素プロモーター （g n t ) 、 アルカリプロテア一ゼプロモー夕一 （a p r ) 、 中性プロテアーゼプロモーター （n p r ) 、 ·α—アミラーゼプロモ一ター ( a my) 等が挙げられる。 また、 t a cプロモータ一や t r cプロモーターの ように人為的に設計 ·改良された配列も利用出来る。
リボゾーム結合配列としては、 大腸菌由来や枯草菌由来又は口ドコッカスゃシ ユードノカルディァ本来の配列が挙げられるが、 大腸菌や枯草菌等の所望の宿主 細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。 例えば、 1 6 Sリ ポゾーム R NAの 3 ' 末端領域に相補的な配列が 4塩基以上連続したコンセンサ ス配列を D NA合成により作成してこれを利用してもよい。 転写終結配列は必ず しも必要ではないが、 p因子非依存性のもの、 例えばリポプロテイン夕一ミネ一 ター ' t r pオペロン夕一ミネ一夕一等が利用出来る。 これら制御領域のプラス ミド上での配列順序は、 プロモーター配列とリボゾーム結合配列は本発明におけ る遺伝子より 5 ' 末端側上流に位置する事が望ましく、 転写終結配列は本発明に おける遺伝子より 3 '末端側下流に位置する事が望ましい。 また、 その様な制御 領域により本発明における遺伝子を構成する各々の O R Fをコードする塩基配列 が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、 共通の制御領域によりポリ P T/JP2003/016014
シストロンとして発現されてもよい。
以上の要件を満たしているプラスミドベクタ一の例としては、 大腸菌中での自 律複製可能な領域を有している PBR 322、 pUC 18、 pB l ue s c r i p t、 pKK223— 3、 pSCl O lや、 枯草菌中での自律複製可能な領域を 有している pUB110、 pTZ4、 pC194、 ρ 11、 φ 1、 φ 105等を 挙げる事が出来る。 また、 2種類以上の宿主細胞内での自律複製が可能なプラス ミドベクタ一の例として、 pHV14、 TRp 7、 YEp 7、 p B S 7を挙げる 事が出来る。
本発明における遺伝子を発現させて所望の活性を有する二トリルヒドラタ一ゼ を生産するに際しては、 二トリルヒドラ夕ーゼの活性化に関与する蛋白質が必要 となる場合がある。
二トリルヒドラ夕ーゼの活性化に関与する蛋白質とは、 該蛋白質の発現の有無 が、 二トリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質を有している蛋白質の事 であり、 特許文献 4に記載されるシユードノカルディア サ一モフイラ由来の二 トリルヒドラ夕ーゼ活性化に関与する蛋白質 （二トリルヒドラ夕一ゼ活性化蛋白 質） をその例として挙げる事が出来る。 具体的には、 二トリルヒドラターゼ活性 化蛋白質としては、 配列番号 102のアミノ酸配列に示される 144個のアミノ 酸の配列により構成されるものをその例として挙げる事が出来る。 また、 配列番 号 102のアミノ酸配列の一部でのアミノ酸の置換、 挿入又は削除等により得ら れた異型蛋白質も、 二トリルヒドラ夕ーゼの活性化に関与するものであれば、 二 トリルヒドラタ一ゼ活性化蛋白質に含まれるものとする。 この異型蛋白質として は、 配列番号 102のアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸の置換、 挿入又 は削除等による変異を有し、 二トリルヒドラ夕一ゼの活性化に関与する性質を維 持しているものを挙げる事が出来る。
二トリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子としては、 二トリルヒ ドラ夕ーゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではな レ^ この遺伝子としては、 上記の配列番号 102のアミノ酸配列をコ一ドする塩 基配列を有する遺伝子及び上記の異型蛋白質をコードする遺伝子を挙げる事が出 来る。 更に、 この二トリルヒドラ夕一ゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子の好ま しい例としては、 配列番号 103の塩基配列を有する遺伝子を挙げる事が出来る 。 更に、 二トリルヒドラタ一ゼ活性ィ匕蛋白質をコードする遺伝子には、 配列番号 103に記載の塩基配列配列の 1個または 2個以上について塩基の置換 ·挿入 · 削除が行われた配列であっても、 それが二トリルヒドラ夕ーゼ活性化蛋白質をコ —ドする遺伝子として機能する場合には、 二卜リルヒドラタ一ゼ活性化蛋白質を コードする遺伝子の範囲に含まれるものとする。
二トリルヒドラ夕一ゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合としては 、 その OR Fを本発明における遺伝子を成す 2つの OR Fと共に、 本発明におけ るプラスミド中に含める例を挙げる事が出来る。 その場合、 これら ORFのブラ スミド上における順序は特に限定されず、 また、 3つの〇RFが同一の制御領域 により制御されてもよく、 2つの OR Fが同一の制御領域により制御され、 残る 1つの O R Fが他の 2つとは異なる制御領域により制御されてもよく、 3つの O R Fが各々異なる制御領域 より制御されてもよい。
この様なベクタ一プラスミドに本発明における遺伝子を本発明における改変酵 素の活性発現に必要な領域と共に挿入して本発明のプラスミドを構築する方法や 該プラスミドを所望の宿主細胞に形質転換する方法及び該形質転換体内で二トリ ルヒドラ夕一ゼを産生させる方法には、 例えば 「Mo l e c u l a r C 1 on i ng 3 r d Ed i t i onJ (J. S amb r ookら； Co l d S p r i n g Ha r bo r Labo r a t o ry P r e s s、 2001) 等に記載 されている分子生物学 .生物工学 .遺伝子工学の分野において公知の一般的な方 法と宿主細胞が利用出来る。
本発明において、 形質転換により得られる事を特徴とする形質転換体としては 、 本発明における遺伝子乃至プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換する事によ り得られたものを含む。 該形質転換体を培養する例としては、 培養用の培地に植 えた後、 適当な培養温度 （一般的には、 20°C〜50°C) で生育させる事を特徴 とする方法が挙げられる。
尚、 宿主細胞が微生物の場合、 上記の形質転換体を培養する培地として LB培 地や M 9培地などが一般的に用いられるが、 そのような培地成分に金属ィオンを 添加しても良い。 添加する金属イオンとしては、 Feイオン及び Coイオンが挙 4
げられる。 また、 添加量としては、 0 . 1 gZmL以上の添加が例として挙げ られる。
本発明において、 形質転換体を培養して得られる培養液、 細胞、 又はそれらの 処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法と しては、 上記の形質転換体、 該形質転換体の培養液、 又は該形質転換体ゃ該培養 液の処理物から二トリルヒドラターゼ活性を回収する工程を有する特徴のある例 を挙げる事が出来る。
本発明において、 二トリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程 を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法としては、 上記の形質転換体、 該形 質転換体の培養液、 または該形質転換体ゃ該培養液の処理物、 又 上記調製方法 によって回収した二トリルヒドラターゼ活性を触媒として用いて、 二トリル化合 物を対応するアミド化合に変換する工程を有する特徴のある例を挙げる事が出来 る。
本発明における改変酵素又は該酵素活性を有する形質転換体を利用して、 二ト リル化合物から対応するアミド化合物を製造する例としては、 所望の二トリルイ匕 合物を、 該酵素精製物や粗酵素調製物、 本発明における形質転換体の培養液、 培 養液から得られる形質転換体、 又は形質転換体の処理物と溶媒中で接触させるェ 程を含む方法が挙げられる。 ここでいう処理物とは、 該形質転換体からの抽出物 ゃ磨碎物、 これらの抽出物や磨砕物の二卜リルヒドラ夕一ゼ活性画分を分離して 得られる粗酵素調製物、 更に精製して得られる酵素精製物などの後分離物、 該形 質転換体ゃ該形質転換体の抽出物、 磨砕物または後分離物を適当な手段を用いて 固定化した固定化物を含む。 接触させる温度は特に限定されないが、 好ましくは 該ニトリルヒドラ夕一ゼが失活しない温度範囲内であり、 より好ましくは氷点以 上 6 0 °C以下である。
二トリル化合物としては、 本発明の改良酵素が基質として作用できる化合物で あれば特に限定されないが、 ァセトニトリル ·プロピオ二トリル ·ァクリロ二卜 リル ·メタクリロニトリル · n—プチロニトリル ·イソプチロニトリル ·クロ卜 ノニトリル. ひーヒドロキシイソプチロニトリル等といった炭素数 2〜4のニト リル化合物がその例として挙げられる。 該ニトリル化合物の溶媒中での濃度は、 特に限定されるものではなく、 また、 反応温度も特に限定されないが、 好ましく は該ニトリルヒドラタ一ゼが失活しない温度範囲内であり、 より好ましくは氷点 以上 50°C以下である。
以下に記載する実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は以下 の実施例によって何等限定されるものではない。 尚、 各実施例及び比較例におけ る HPLC分析は、 カラムとして日本分光製の F i n e p a k S I L C I 8— 5 (250 X4. 6 πιπι) を用い、 4体積％のァセトニトリルを含む 10 mM リン酸水溶液を展開液として使用した。 また、 アクリルアミド、 ァクリロ二トリ ル 'アクリル酸 ·メ夕クリルアミド ·メタクリロニトリル ·メタクリル酸は 21 0 nmの吸光度により検出した。
[参考例 1] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1) αサブユニットの 6番目の L e uを Me tに置換するために、 宝酒造社製の 「 LA PCR i n v i t r o mu t agene s i s K i t」 を用いた部位 特異的な変異導入を行った。 以後、 「LA PGR i n V i t r o mu t ag ene s i s K i t」 を単にキットと呼ぶ。 以下の参考例では、 基本的にキッ 卜の原理及び操作方法を踏襲した。
3 OmLの試験管に 10 mLの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mLとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 MT— 10822を一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 1 mLを適当な遠心チューブに 分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） により該菌体を分離した。 続 いてアル力 USDS抽出法により該菌体よりプラスミド p P T— D B 1を調製し た。
各々 10 n gの p PT— DB 1を鍀型として 2種類の P CR反応を行った。 P CR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 7記載のプライマー及び Ml 3プライ マ一 M4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 5 0 iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件を 25サイ クル繰り返す事により行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配 列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番 号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ トに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作により行った。 P CR反応 No. 1及び No. 2の反応終了液各 5〃 Lを用いたァガロース電気泳 動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ 、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 M i c r o c on l O O (宝酒造社製） を用いてそれぞれの P C R反応終了液より過剰なプライマ一及び d NT Pを除去 した後、 TEを加えて各々 50 Lの溶液を調製した。 該 TE溶液を各 0. 5 u Lずつ含む全量 47. 5 Lのァ二一リング溶液 （組成はキッ卜に記載の条件に よる） を調製し、 熱変性処理 （98°C) を 10分間行った後、 37°Cまで 60分 間かけて一定の速度で冷却を行い、 続いて 37 °Cで 15分間保持することによつ てアニーリング処理を行った。 アニーリング処理液に TaKaRa LA Taq を 0. 5 t L加えて 72 °Cで 3分間加熱処理を行い、 ヘテロ 2本鎖を完成させた 。 これに Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1 加えて全量を 50〃Lとした後、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55 °C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことに よる PCR反応 No. 3を行った。 PCR反応 No. 3の反応終了液 5〃 Lを用 いたァガロース電気泳動 （シグマ社製タイプ V I I低融点ァガロース使用；ァガ ロース濃度 0. 8重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 約 2 k bの増幅 DNA産物の存在が確認できた。 続いて、 ァガロースゲルから約 2 Kb の DNA断片のみを切り出し、 該ァガロース片 （約 0. 1 g) を細かく粉砕し 1 mLの TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させ た。 この融解液に対してフエノ一ル /クロロホルム抽出とエタノ一ル沈澱を行つ て該 DNA断片を精製し、 最終的に 10 Lの TEに溶解した。 精製した約 2 k bの増幅 DNA断片を制限酵素 Ec oRI及び H i n d IIIにより切断した後、 こ の制限酵素処理液に対してフエノール/クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行 つて該 DNA断片を精製し、 最終的に 10 juLの TEに溶解した。 同様に、 Ec oRI及び H i 11 1111にょり ？丁— 081を切断し、 ァガロースゲル電気泳動 16014
(シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を 行い、 ァガロースゲルから約 2. 7 Kbの DNA断片のみを切り出した。 切りだ したァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉碎し lmLの TE溶液に懸濁後、 5 5 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエ ノール Zクロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って該 DNA断片を精製し、 最 終的に 10〃Lの TEに溶解した。 この様にして得られた約 2 kbと約 2. 7K bの DNA断片を DNAライゲーシヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結させ た後、 大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換し、 形 質転換体 No. 1を得た。
得られた形質転換体を用いたアミド化合物の製造における転化率及び選択率を 以下の方法により求めた。
50 OmLのバッフル付三角フラスコに 40 μ g/mLの硫酸第二鉄 ·七水和 物及び 10 μ gZmLの塩化コバルト ·二水和物を含む 100111しの 8液体培 地を調製し、 121°C' 20分間のォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に 終濃度が 100 g Zm Lとなるようにアンピシリンを添加した後、 形質転換体 No. 1を一白金耳植菌し、 37 °C · 130 r pmにて約 20時間培養した。 言亥 培養終了液から遠心分離 （5000GX 15分） により菌体を分離した。 続いて 、 分離した該菌体を 5 OmLの生理食塩水に再懸濁した後に、 再度遠心分離 （5 000 GX 1 5分） により菌体を分離した。 該菌体 0. l gを 2 OmLの 50m Mリン酸カリウム水溶液 （pH7. 0) に懸濁し、 これに lmLのァクリロニト リル又はメタァクリロニトリルを添加して 10 °Cで緩やかに攪拌しながら 1時間 反応させた。 反応終了後、 HP LCを用いて反応液の分析を行った結果、 反応液 中には添加した二トリル化合物 (ァクリロ二卜リル又はメタァクリロニトリル） に相当するモル量のアミド化合物 （アクリルアミド又はメタアクリルアミド） の みが存在しており、 二トリル化合物 (アクリロニトリル又はメタァクリロ二トリ ル） 及び対応する有機酸 （アクリル酸又はメタアクリル酸） の存在は認められな かった。 すなわち、 転化率及び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 1に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの αサブ ユニットの 6番目の L e uが Me tに置換されていた。
[表 1]
Figure imgf000038_0001
[参考例 2] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 (2) αサブュニットの 6番目の L e uを Th rに置換するために、 p PT— DB 1 プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変異 導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 11記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjuLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 j! Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 PCR反応 No. 2を含む参考例 1における操作と全く同じ操作により 、 形質転換体 No. 2を得た。 次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 100% であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 2に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの αサブ ュニットの 6番目の L e uが Th rに置換されていた。
[表 2]
表 2
Figure imgf000039_0001
[参考例 3] 二卜リルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3) αサブュニットの 6番目の L e uを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1 プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変異 導入を行った。
参考例 1で調製した ρ ΡΤ— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々錡型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 12記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1, 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 3を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 3に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ユニットの 6番目の L e uが A 1 aに置換されていた。
[表 3]
表 3
Figure imgf000040_0001
[参考例 4] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （4) サブュニッ卜の 6番目の L e uを Va 1に置換するために、 p PT— DB 1 プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変異 導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNAl Ongを各々錡型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 13記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全暈 5 OjuLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 4を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 ぴ選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 4に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 6番目の L e uが Va 1に置換されていた。
4]
表 4
Figure imgf000041_0001
[参考例 5] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5) サブュニットの 19番目の A 1 aを V a 1に置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
参考例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 14記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 jt Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 5を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 5に示したクロ一ンにおいて二卜リルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 19番目の A 1 aが Va 1に置換されていた。
[表 5] '
表 5
Figure imgf000042_0001
[参考例 6] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6) サブュニットの 38番目の Me tを L e uに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
参考例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と 2003/016014
して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 15記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50juLの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No., 1及び No. 2の反応 終了液各 5 / Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 6を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 6に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 38番目の Me tが L e uに置換されていた。
[表 6]
表 6
Figure imgf000043_0001
[参考例 7] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7) サブュニットの 77番目の Th rを S e rに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 16記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C> 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjuLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 < Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 7を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 37 3 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 7に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの αサブ ュニットの 77番目の Th rが S e rに置換されていた。
7]
表 7
Figure imgf000045_0001
[参考例 8] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8) サブユニットの 90番目の G 1 yを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNAl O ngを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 17記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50〃Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 / Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 8を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 8に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 90番目の G 1 yが A 1 aに置換されていた。
[表 8]
表 8
Figure imgf000046_0001
[参考例 9] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9) サブュニットの 102番目の V a 1を A 1 aに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 18記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 jt Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 9を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 9に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サブ ュニッ卜の 102番目の V a 1が A 1 aに置換されていた。
[表 9]
表 9
Figure imgf000047_0001
[参考例 10] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 0)
サブュニットの 106番目の V a 1を I 1 eに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 19記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 14
終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 10を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一卜シークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 10に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの サ ブュニットの 106番目の Va 1が I 1 eに置換されていた。
[表 10]
表 10
Figure imgf000048_0001
[参考例 1 1] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 1)
サブュニッ卜の 126番目の Pheを Ty rに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 20記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D NA増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 11を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 1 1に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 126番目の Pheが Ty rに置換されていた。
[表 11]
表 11
Figure imgf000049_0001
[参考例 12] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1' 2)
サブュニットの 130番目の G 1 nを G 1 uに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： TJP2003/016014
21記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 12を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 12に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 130番目の G 1 nが G 1 uに置換されていた。
[表 12]
表 12
Figure imgf000050_0001
[参考例 13] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 3)
サブュニッ卜の 142番目の Leuを V a 1に置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 22記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 iLを用いたァガロース電気泳動 （ァガ口一ス濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 13を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 13に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ プュニットの 142番目の L e uが Va 1に置換されていた。
[表 13]
表 13
Figure imgf000052_0001
[参考例 14] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 4)
サブュニットの 146番目の G 1 uを As pに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No., 1は、 配列表の配列番号： 23記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （ 72 °C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行つた。 P C R 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jULを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 14を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 14に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニットの 146番目の G 1 uが As pに置換されていた。
[表 14]
表 14
Figure imgf000053_0001
[参考例 1 5] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 5)
サブュニッ卜の 187番目の A 1 aを Th rに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々銬型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 24記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5;/ Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 15を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 15に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼのひサ ブュニットの 187番目の A 1 aが Th rに置換されていた。
[表 15]
表 15
Figure imgf000054_0001
[参考例 16] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 6)
サブュニットの 194番目の S e rを L e uに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 25記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72。C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 16を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 16に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 194番目の S e rが L e uに置換されていた。
[表 16]
表 16
Figure imgf000055_0001
[参考例 17] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 7)
サブュニットの 203番目の A 1 aを G 1 uに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを錶型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 26記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒、 アニーリング （5 5°C) 30秒、 伸長反 応 （7 2°C) 1 20秒の条件を 2 5サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマー R V (配列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 1 7を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 3 7 3 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 1 7に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 20 3番目の A 1 aが G 1 uに置換されていた。
[表 1 7]
表 17
Figure imgf000056_0001
[参考例 1 8] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 8)
βサブュニットの 20番目の A 1 aを Va 1に置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。 3016014
参考例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 27記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 j«Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガ口一ス濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 18を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 18に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの ^サ ブユニットの 20番目の A 1 aが Va 1に変換されていた。
[表 18]
表 18
Figure imgf000057_0001
[参考例 1 9] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 9)
サブュニットの 21番目の As pを As nに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT_DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 28記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 jt Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 19を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 19に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの; 8サ ブュニットの 21番目の As pが As nに置換されていた。 [表 19]
表 19
Figure imgf000059_0001
[参考例 20] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 0) .
βサプュニットの 108番目の G 1 uを As pに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 29記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72。C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 (配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 t Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 20を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 20に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの) 8サ ブユニットの 108番目の G 1 uが As pに置換されていた。
20]
表 20
Figure imgf000060_0001
[参考例 21] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 1)
βサブュニッ卜の 108番目の G 1 uを P r oに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々錶型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 30記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjuLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 21を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 21に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの iSサ ブュニッ卜の 108番目の G 1 uが P r oに置換されていた。
[表 21]
表 21
Figure imgf000061_0001
[参考例 22] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 2)
Sサブュニットの 108番目の G 1 uを S e rに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同 の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 3 1記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. ' 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 22を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選 率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 22に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ ブュニットの 108番目の G 1 uが S e rに置換されていた。 ' [表 22]
表 22
Figure imgf000062_0001
[参考例 23] 二卜リルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 3)
;8サブュニッ卜の 108番目の G 1 uを Ar gに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを鍀型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 32記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ; Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 23を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によってニトリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 23に示したクローンにおいて二トリルヒド ターゼの ^サ ブュニットの 108番目の G 1 uが Ar gに置換されていた。
[表 23]
表 23
Figure imgf000063_0001
[参考例 24] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 4)
サブュニッ卜の 108番目の G 1 uを Cy sに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。 参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 33記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃 Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 24を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 24に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの) 8サ ブュニッ卜の 108番目の G 1 uが Cy sに置換されていた。
24]
表 24
Figure imgf000064_0001
[参考例 25] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 5)
βサブュニットの 108番目の G 1 uを L e uに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 34記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 ァニ一リング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 25を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 25に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ ブュニットの 108番目の G 1 uが L e uに置換されていた。 [表 25]
表 25
Figure imgf000066_0001
[参考例 26] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 6)
βサブュニッ卜の 108番目の G 1 uを Th rに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 35記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 26を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 26に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの) δサ ブュニットの 108番目の G 1 uが Th rに置換されていた。
[表 26]
表 26
Figure imgf000067_0001
[参考例 27] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 7)
サブユエットの 200番目の A 1 aを As pに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 36記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー (配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 27を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 27に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの サ ブュニットの 200番目の A 1 aが As pに置換されていた。
[表 27]
表 27
Figure imgf000068_0001
[参考例 28] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 8)
βサブュニッ卜の 200番目の A 1 aを I 1 eに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 37記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 28を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 28に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 200番目の A 1 aが I 1 eに置換されていた。
[表 28]
表 28
Figure imgf000069_0001
[参考例 29] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （2 9)
^サブュニットの 200番目の A 1 aを Va 1に置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを錡型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 38記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 29を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 29に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ySサ ブュニッ卜の 200番目の A 1 aが Va 1に置換されていた。
[表 29]
表 29
Figure imgf000070_0001
[参考例 30] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 0)
^サブュニットの 200番目の A 1 aを G 1 uに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。 参考例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 39記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） R び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 30を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 30に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブュニッ卜の 200番目の A 1 aが G 1 uに置換されていた。
[表 30]
表 30
Figure imgf000071_0001
[参考例 31] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 1)
サブュニットの 212番目の S e rを Ty rに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 参考例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
参考例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列審号： 40記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 O jt Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 31を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 31に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの) δサ ブユニットの 21 2番目の S e rが Ty rに置換されていた。 ほ 31]
表 3
Figure imgf000073_0001
[参考例 32] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 2)
クロ一ン No. 5のアミノ酸変異 （ サブュニットの 19番目： A 1 aが Va 1 ) とクローン No. 1 1のアミノ酸変異 （ひサブユニットの 126番目： Ph eが Ty r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラタ一ゼ 活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの LB液体培地を調製し、 121°C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100〃 gZmlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 1 1で得られたクローン No. 1 1を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （1 5000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力 U SDS抽出法により該菌体よりクローン N o . 1 1のプラスミド DNAを調製した。
クローン No. 1 1のプラスミド DNA1 u gを铸型として 2種類の PC R反 応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 14記載のプライマー 及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （ 98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒 の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MU T4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 μ 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操 作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用 いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物 の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 参考例 1と 全く同じ操作により、 形質転換体 No. 32を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 32に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニッ卜の 19番目の A 1 aが Va 1に、 サブュニットの 126番目の Ph e が Ty rにそれぞれ置換されていた。
[表 32]
表 32
Figure imgf000074_0001
[参考例 33] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得' ( 3 3)
クロ一ン No. 1のアミノ酸変異 （ サブュニッ卜の 6番目： L e uが Me t ) とクローン No. 32のアミノ酸変異 （ サブユニットの 19番目の A 1 aが Va 1 ； サブユニットの 126番目の Ph eが Ty r) を共に有しているアミ ノ酸置換体においても二トリルヒドラタ一ゼ活性が保持されていることを確認し た。 30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレ一ブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 32で得られたクロ一ン No. 32を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクロ一ン No . 32のプラスミド DNAを調製した。
クローン No. 32のプラスミド DNA1 μ gを錡型として 2種類の P CR反 応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 7記載のプライマー及 び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pm o 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （9 8°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の 条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV
(配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 u 1 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作 により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用い たァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の 分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 参考例 1と全 く同じ操作により、 形質転換体 N o. 33を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 33に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 6番目の L e uが Me tに、 サブュニットの 19番目の A 1 aが V a 1に、 サブュニットの 126番目の Pheが Ty rにそれぞれ置換されてい た。 [表 33]
表 33
Figure imgf000076_0001
[参考例 34] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 4)
クローン No. 2のアミノ酸変異 （ サブュニットの 6番目： L e uが Th r ) とクローン No. 32のアミノ酸変異 （ サブユニットの 19番目の A 1 aが Va 1 ； αサブユニットの 126番目の Ph eが Ty r) を共に有しているアミ ノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認し た。
参考例 33で調製したクローン No. 32のプラスミド DNA1 gを铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 1 1記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 / 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反 応終了液各 5 1を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DNA産物の存在が確認でき た。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 34を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 34に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの αサブ ュニッ卜の 6番目の L e uが Th rに、 サブュニッ卜の 19番目の A 1 aが V a 1に、 αサブュニッ卜の 126番目の Ph eが Ty rにそれぞれ置換されてい た。
34]
表 34
Figure imgf000077_0001
[参考例 35] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 5)
クロ一ン No. 3のアミノ酸変異 （ サブュニッ卜の 6番目： L e uが A 1 a ) とクローン No. 32のアミノ酸変異 （ サブユニットの 19番目の A 1 aが Va 1 ； サブユニットの 126番目の Ph eが Ty r) を共に有しているアミ ノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕ーゼ活性が保持されていることを確認し た。 '
参考例 33で調製したクローン No. 32のプラスミド DNA1 gを铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 12記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反 応終了液各 5 1を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 DN A産物の存在が確認でき た。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 35を得た。 次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 35に示したように野生型の二卜リルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 6番目の L e uが A 1 aに、 サブュニットの 19番目の A 1 aが V a 1に、 ひサブュニッ卜の 126番目の Ph eが Ty rにそれぞれ置換されてい た。
[表 35]
表 35
Figure imgf000079_0001
[参考例 36] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 6)
クローン No. 20のアミノ酸変異 （Sサブュニッ卜の 108番目： G 1 uが As p) とクローン No. 31のアミノ酸変異 （^サブュニットの 212番目： S e rが Ty r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 —ゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの LB液体培地を調製し、 121。C · 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 31で得られたクローン No. 31を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力リ S D S抽出法により該菌体よりクロ一ン N o . 31のプラスミド DN Aを調製した。
クロ一ン No. 31のプラスミド DNA1 u gを铸型として 2種類の P CR反 応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 29記載のプライマー 及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 / 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （ 98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒 の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MU T 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載）''及び Ml R
V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 μ 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操 作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用 いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DN A増幅産物 の分析を行ったところ、 増幅 DNA産物の存在が確認できた。 以後、 参考例 1と 全く同じ操作により、 形質転換体 No. 36を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 36に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼのSサブ ュニットの 108番目の G 1 uが As pに、 サブュニットの 212番目の S e rが T y rにそれぞれ置換されていた。
[表 36]
表 36
Figure imgf000080_0001
[参考例 37] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 7)
クローン No. 23のアミノ酸変異 （jSサブュニッ卜の 108番目： G 1 uが Ar g) とクローン No. 31のアミノ酸変異 (βサブュニットの 212番目： S e rが Tv r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラタ ーゼ活性が保持されていることを確認した。
参考例 36で調製したクローン No. 31のプラスミド DNA1〃 gを錶型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 32記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反 応終了液各 5 1を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認でき た。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 37を得た。 次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 37に示したように野生型の二卜リルヒドラ夕ーゼの ySサブ ュニットの 108番目の G 1 uが A r gに、 βサプュニッ卜の 212番目の S e rが T y rにそれぞれ置換されていた。
[表 37]
表 37
Figure imgf000082_0001
[参考例 38] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3
,8)
クローン No. 27のアミノ酸変異 （；8サブュニッ卜の 200番目： A 1 aが As p) とクローン No. 31のアミノ酸変異 （8サブュニットの 212番目： S e rが Ty r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 —ゼ活性が保持されていることを確認した。
参考例 36で調製したクローン No. 31のプラスミド DNA1 gを铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 36記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反 応終了液各 5 / 1を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったとこ^)、 増幅 DN A産物の存在が確認でき た。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 38を得た。 次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 3 8に示したように野生型の二トリルヒドラ夕ーゼの Sサブ ュニッ卜の 200番目の A 1 aが As pに、 βサブュニッ卜の 2 1 2番目の S e rが T y rにそれぞれ置換されていた。
[¾3 8]
表 38
Figure imgf000083_0001
[参考例 3 9] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （3 9)
クローン No. 30のアミノ酸変異 (βサプュニットの 200番目： A 1 aが G 1 u) とクローン No. 3 1のアミノ酸変異 （jSサブユニットの 2 1 2番目： S e rが Ty r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 ーゼ活性が保持されていることを確認した。
参考例 3 6で調製したクローン No. 3 1のプラスミド DNA1 gを铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番 39 記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記 載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件によ る） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒、 アニーリング （5 5°C) 3 0秒、 伸長反応 （ 7 2°C) 1 20秒の条件を 2 5サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び M 1 3プライマ一 R V (配列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 P CR反応 N o. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終 了液各 5 1を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) によ り DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 参考例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 3 9を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とォ一トシ一クェンサ一 3 7 3 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 39に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの サブ ュニッ卜の 200番目の A 1 aが G 1 uに、 βサブュニッ卜の 2 1 2番目の S e rが T y rにそれぞれ置換されていた。
[表 3 9]
表 39
Figure imgf000084_0001
[実施例 1] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （40
)
サブュニットの 36番目の Th rを Me tに置換するために、 宝酒造社製の 「LA PCR i n v i t r o mu t a g e n e s i s K i t；」 を用いた部 位特異的な変異導入を行った。 以後、 「LA PCR i n v i t r o mu t a g e n e s i s K i t」 を単にキットと呼ぶ。 以下の実施例では、 基本的にキ ッ卜の原.理及び操作方法を踏襲した。
3 OmLの試験管に 10 mLの L B液体培地を調製し、 121 °C . 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 gZmLとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 MT- 108' 22を一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 1 mLを適当な遠心チューブに 分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） により該菌体を分離した。 続 いてアル力 U SDS抽出法により該菌体よりプラスミド p P T— D B 1を調製し た。
各々 10 ngの ρ,ΡΤ— DB 1を铸型として 2種類の P C R反応を行った。 Ρ C R反応 Ν ο . 1は、 配列表の配列番号： 41記載のプライマー及び Μ 13ブラ イマ一 Μ4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 、 ァニ一リング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件を 25サ ィクル繰り返す事により行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プライマー （ 配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列 番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキ ットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応終了液各 5 juLを用いたァガロース電気 泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったとこ ろ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 M i c r o c on l O O (宝酒造社製 ) を用いてそれぞれの P C R反応終了液より過剰なプライマー及び d N T Pを除 去した後、 TEを加えて各々 5 の溶液を調製した。 該 TE溶液を各 0. 5
U Lずつ含む全量 47. 5 Lのァ二一リング溶液 （組成はキットに記載の条件 による） を調製し、 熱変性処理 （98°C) を 10分間行った後、 37°Cまで 60 分間かけて一定の速度で冷却を行い、 続いて 37°Cで 15分間保持することによ つてアニーリング処理を行った。 アニーリング処理液に TaKaRa LA Ta Qを 0. 5 L加えて 72 °Cで 3分間加熱処理を行い、 ヘテロ 2本鎖を完成させ た。 これに Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） 及び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1加えて全量を 50 juLとした後、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （5 5°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すこと による PC R反応 No. 3を行った。 PCR反応 No. 3の反応終了液 5 juLを 用いたァガロース電気泳動 （シグマ社製タイプ V I I低融点ァガロース使用；ァ ガロース濃度 0. 8重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 約 2 k bの増幅 D N A産物の存在が確認できた。 続いて、 ァガロースゲルから約 2 K bの DNA断片のみを切り出し、 該ァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉碎し 1 mLの TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解さ せた。 この融解液に対してフエノール /ク口口ホルム抽出とエタノール沈澱を行 つて該 DNA断片を精製し、 最終的に 10〃Lの TEに溶解した。 精製した約 2 kbの増幅 DNA断片を制限酵素 Ec oRI及び H i n d IIIにより切断した後、 この制限酵素処理液に対してフエノール Zクロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を 行って該 DNA断片を精製し、 最終的に 10 Lの TEに溶解した。 同様に、 E c oRI及び H i ndlllにより pPT— DB 1を切断し、 ァガロースゲル電気泳 動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガロースゲルから約 2. 7Kbの DNA断片のみを切り出した。 切り だしたァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉碎し lmLの TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフ ェノ一ル /ク口口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って該 D N A断片を精製し、 最終的に 10 Lの TEに溶解した。 この様にして得られた約 2 k bと約 2. 7 Kbの DNA断片を DNAライゲーシヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結さ せた後、 大腸菌 HB 101のコンビテン卜セル （東洋紡績社製） を形質転換し、 形質転換体 No. 40を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 40に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの サ ブュニットの 36番目の Th rが Me tに置換されている事を確認した c 40] ' 表 40
Figure imgf000087_0001
[実施例 2] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （41
)
サブュニットの 71番目の Ar gを H i sに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを踌型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 42記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 41を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 41に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 71番目の Ar gが H i sに置換されている事を確認した。
[表 41] ' 表 41
Figure imgf000088_0001
[実施例 3 ] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （ 42
)
サブュニットの 148番目の G 1 yを As pに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 43記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 42を得た。 次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 42に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニッ卜の 148番目の G 1 yが As pに置換されている事を確認した。
[表 42] 表 42
Figure imgf000089_0001
[実施例 4] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （43
)
サブュニットの 204番目の V a 1を Ar gに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々錶型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 44記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50pmo 1含む全量 50 /Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 43を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 43に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 204番目の V a 1が Ar gに置換されている事を確認した。
[表 43]
表 43
Figure imgf000090_0001
[実施例 5] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （44
)
αサブュニットの 204番目の V a 1を Ly sに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを錡型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 卩01^反応^^0. 1は、 配列表の配列番号： 45記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 < Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt/Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 44を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転ィ匕率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 44に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの サ ブュニッ卜の 204番目の V a 1が Ly sに置換されている事を確認した。
[表 44] 表 44
Figure imgf000091_0001
[実施 f!)6] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （45
)
aサブュニットの 204番目の V a 1を Tr pに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 46記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50〃 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 jwLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 45を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 45に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニッ卜の 204番目の V a 1が Tr pに置換されている事を確認した。
45]
表 45
Figure imgf000092_0001
[実施例 7] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （46
)
サブュニッ卜の 204番目の V a 1を Th rに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 47記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 46を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 46に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニットの 204番目の V a 1が Th rに置換されている事を確認した。
[表 46]
表 46
Figure imgf000093_0001
[実施例 8] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （47
)
j8サブュニッ卜の 10番目の Th rを As pに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを鍀型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 48記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー (配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjtiLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jwLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 47を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 47に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ySサ ブユニットの 10番目の Th rが As pに置換されている事を確認した。
[表 47] 表 47 変異箇所 アミノ酸酉 3列の変化 塩 fedB歹の変化 クローン番号
(/3サフ'ュ：: 'ノト内） 置換前 置換後 置換前 置換後
No. 47 0— 10番目 Th r As p ACC GAC [実施例 9] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （48
)
サブュニットの 10番目の Th rを G 1 uに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 49記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 mo 1含む全量 50〃 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M Γ 3プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 O / Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 48を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 48に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブュニッ卜の 10番目の Th rが G 1 uに置換されている事を確認した。 [¾48] 表 48
Figure imgf000096_0001
[実施例 1 0] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （4 9)
βサブュニットの 1 0番目の Th rを T r ρに置換するために、 ρ ΡΤ— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した Ρ ΡΤ— DB 1のプラスミド DNA1 O n gを各々錶型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 50記載のプライマー及び M 1 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （7 2°C) 1 2 0秒の条件を 2 5サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jw Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 49を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 37 3 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 49に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニットの 10番目の Th rが Tr pに置換されている事を確認した。
49] 表 49
Figure imgf000097_0001
[実施例 1 1] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 0)
βサブュニットの 10番目の Th rを G 1 yに置換するために、， p PT-DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 51記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 «Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 50を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 50に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ ブュニットの 10番目の Th rが G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 50] 表 50
Figure imgf000098_0001
[実施例 12] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 1)
サブュニットの 10番目の Th rを Ty rに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。 ，
実施例 1で調製した pPT— DB lのプラスミド DNAl O ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 52記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 51を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 51に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 10番目の Th rが Ty rに置換されている事を確認した。
51] 表 51
Figure imgf000099_0001
[実施例 13] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 2)
βサブュニッ卜の 10番目の Th rを Cy sに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により咅 15位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 53記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 ϋ mo 1含む全量 50j«Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 '以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 52を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 52に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの Sサ ブュニットの 10番目の Th rが Cy sに置換されている事を確認した。
[表 52] 表 52
Figure imgf000100_0001
[実施例 14] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 3)
サブュニットの 32番目の V a 1を G 1 yに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを鍀型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 54記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 53を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 53に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブュニッ卜の 32番目の V a 1が G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 53] 表 53
Figure imgf000101_0001
[実施例 15] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 4)
βサブュニッ卜の 37番目の Pheを Th rに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 55記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 P CR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 ;uLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 54を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 54に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ySサ ブュニットの 37番目の Ph eが Th rに置換されている事を確認した。
[表 54] 表 54
Figure imgf000102_0001
[実施例 16] 二卜リルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 5)
サブュニットの 37番目の P heを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 56記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 55を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。 ， また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 55に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの) 8サ ブユニットの 37番目の P heが A 1 aに置換されている事を確認した。
[表 55] 表 55
Figure imgf000103_0001
[実施例 17] 二卜リルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 6)
^サブユニットの 37番目の P heを Leuに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々鍀型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 57記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 56を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 56に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの) 8サ ブュニットの 37番目の Ph eが L e uに置換されている事を確認した。 56] 表 56
Figure imgf000105_0001
[実施例 1 8] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 7)
サブュニッ卜の 37番目の P heを I 1 eに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 58記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 57を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 57に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの^サ ブユニットの 37番目の Ph eが I 1 eに置換されている事を確認した。
[¾57] 表 57
Figure imgf000106_0001
[実施例 19] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 8)
βサブュニッ卜の 37番目の Pheを Va 1に置換するために、 pPT— DB 1プラスミド D Ν Αを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 59記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 .熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 5 O p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 58を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 58に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの y8サ ブュニットの 37番目の Ph eが Va 1に置換されている事を確認した。
[表 58] 表 58
Figure imgf000107_0001
[実施例 20] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （5 9)
サブユニットの 41番目の P heを G 1 uに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド D Ν Αを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 60記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： &に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 59を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 59に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの )8サ ブュニッ卜の 41番目の Ph eが G 1 uに置換されている事を確認した。
[表 59]
表 59
Figure imgf000108_0001
[実施例 21] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 0)
βサブュニットの 41番目の Pheを Th rに置換するために、 pPT_DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 61記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1· 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 60を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 60に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの ;3サ ブュニッ卜の 41番目の Ph e'が Th rに置換されている事を確認した。
[表 60]
表 60
Figure imgf000109_0001
[実施例 22] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 1)
サブユニットの 41番目の P heを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNAl O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 62記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 4
応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 ju Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 61を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、.表 61に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの ySサ ブユニットの 41番目の Ph eが A 1 aに置換されている事を確認した。 ' [表 61] 表 61
Figure imgf000110_0001
[実施例 23] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 2)
βサブュニットの 41番目の Ph eを L e uに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 63記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5' Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 62を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 62に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの サ ブュニッ卜の 41番目の P heが Leuに置換されている事を確認した。
62]
表 62
Figure imgf000111_0001
[実施例 24] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 3)
サブユニットの 41番目の Pheを I 1 eに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを鍀型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。 · ' 実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 6 記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο/iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 iLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 63を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 63に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブユニットの 41番目の ΡΙΊ eが I 1 eに置換されている事を確認した。
[表 63]
表 63
Figure imgf000112_0001
[実施例 25] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 4)
^サブユニットの 41番目の Pheを Va 1に置換するために、 pPT— DB 1プラスミド D Ν Αを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 65記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No..64を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 64に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼのSサ ブュニッ卜の 41番目の Ph eが Va 1に置換されている事を確認した。 [表 64] 表 64
Figure imgf000114_0001
[実施例 26] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 5)
サブュニットの 46番目の Me tを G 1 yに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 〇 反応1^0. 1は、 配列表の配列番号： 66記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 jwLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 65を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 65に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ ブュニットの 46番目の Me tが G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 65 ] 表 65
Figure imgf000115_0001
[実施例 27] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 6)
βサブュニッ卜の 46番目の Me tを Ty rに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 67記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 /Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 66を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 3 7 3 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 66に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの Sサ ブュニッ卜の 46番目の Me tが Ty rに置換されている事を確認した。
[表 66] 表 66 ·
Figure imgf000116_0001
[実施例 2 8] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 7)
βサブュニットの 46番目の Me tを L e uに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 O n gを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行った。 P C R反応 N o . 1は、 配列表の配列番号： 6 8記載のプライマー及び M 1 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 5 0 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （7 2°C) 1 2 0秒の条件を 2 5サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο i Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 67を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。 '
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 67に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの3サ ブュニットの 46番目の Me tが L e uに置換されている事を確認した。
[表 67] 表 67
Figure imgf000117_0001
[実施例 29] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 8)
βサプュニットの 46番目の Me tを Ly sに置換するために、 ρ PT— DB 1プラスミド DNAを踌型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 69記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 68を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 68に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの サ ブュニットの 46番目の Me tが Ly sに置換されている事を確認した。
[表 68] 表 68
Figure imgf000118_0001
[実施例 30] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （6 9)
βサプュニッ卜の 46番目の Me tを As pに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DN Aを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNAl Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 70記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55。C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 69を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 69に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの j8サ ブュニッ卜の 46番目の Me tが As pに置換されている事を確認した。
[表 69] 表 69
Figure imgf000119_0001
[実施例 31] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 0)
サブュニッ卜の 48番目の L e uを G 1 yに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 71記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガ口一ス濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 70を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 70に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 48番目の Le uが G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 70] 表 70
Figure imgf000120_0001
[実施例 32] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 1)
サブユニットの 48番目の L e uを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNAl O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 72記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 (配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5; Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 7 1を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 71に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの サ ブュニッ卜の 48番目の L e uが A 1 aに置換されている事を確認した。
[表 71]
表 71
Figure imgf000121_0001
[実施例 33] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 (7 2)
;5サブュニッ卜の 48番目の L e uを Va 1に置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを銬型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した; PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々鍀型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 73記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 72を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 72に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの ;3サ ブュニットの 48番目の L e uが Va 1に置換されている事を確認した。 . [表.72] 表 72
Figure imgf000123_0001
[実施例 34] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 3) .
βサブュニットの 48番目の L e uを S e rに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 74記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 73を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 73に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの^サ ブュニットの 48番目の Leuが S e rに置換されている事を確認した。
[表 73] 表 73
Figure imgf000124_0001
[実施例 35] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 4)
;8サブュニッ卜の 48番目の L e uを Th rに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを鍀型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々踌型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 75記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50〃Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 74を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 74に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの サ ブュニッ卜の 48番目の L e uが Th rに置換されている事を確認した。
[表 74] 表 74
Figure imgf000125_0001
[実施例 36] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 5)
βサブュニットの 48番目の L e uを A r gに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。 '
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 76記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認、できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 75を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 75に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕ーゼの ;8サ ブュニッ卜の 48番目の Le uが Ar gに置換されている事を確認した。
[表 75] 表 75
Figure imgf000126_0001
[実施例 37] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 6)
βサブュニットの 51番目の Pheを A 1 aに置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA1 O ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号：' 77記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 'による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 / Lを用いたァガ口一ス電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 76を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキ，ン法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 76に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの；8サ プユニットの 51番目の Pheが A l aに置換されている事を確認した。
ほ 76]
表 76
Figure imgf000127_0001
[実施例 38] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 7)
βサブュニッ卜の 51番目の Pheを V a 1に置換するために、 pPT— DB 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々錶型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 78記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 77を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 77に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの) Sサ ブュニットの 51番目の Pheが Va 1に置換されている事を確認した。
[表 77] 表 77
Figure imgf000128_0001
[実施例 39] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 8)
βサプュニットの 72番目の T r ρを Ph eに置換するために、 p PT— DB 1プラスミド DNAを錶型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な変 異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行った。 P C R反応 N o . 1は、 配列表の配列番号： 79記載のプライマー及び M 13プライマ一 M (配列表の配列番号： '8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjwLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 78を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 78に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの jSサ ブュニットの 72番目の T r pが P heに置換されている事を確認した。
[表 78] 表 78
Figure imgf000129_0001
[実施例 40] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （7 9)
βサブュニッ卜の 118番目の P heを A 1 aに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々銬型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 80記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング (55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 79を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 79に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの j8サ ブユニットの 118番目の P heが A 1 aに置換されている事を確認した。
[表 79] 表 79
Figure imgf000130_0001
[実施例 41] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 0)
^サブュニットの 1 18番目の Ph eを L e uに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々鐯型と して 2種類の P C R反応を行った。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 81記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 1 3プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 80を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 80に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの Sサ ブユニットの 1 18番目の Ph eが L e uに置換されている事を確認した。 [表 80] 表 80
Figure imgf000132_0001
[実施例 42] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 1)
サブユニットの 118番目の Pheを I 1 eに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 82記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 ァ'二一リング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガ口一ス濃虔 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 81を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 81に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ;3サ ブュニッ卜の 118番目の P heが I 1 eに置換されている事を確認した。
[表 81] 表 81
Figure imgf000133_0001
[実施例 43] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 2)
サブュニッ卜の 118番目の Ph eを Va 1に置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 83記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50； Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5〃 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 82を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 82に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの; 8サ ブユニットの 118番目の P heが V a 1に置換されている事を確認した。
82] 表 82
Figure imgf000134_0001
[実施例 44] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 3)
サブュニットの 127番目の Le uを A 1 aに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 84記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 (配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 83を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 83に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの) δサ ブユニットの 127番目の Leuが A 1 aに置換されている事を確認した。
[表 83] 表 83
Figure imgf000135_0001
[実施例 45] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 4)
βサプュニットの 127番目の L e uを Va 1に置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列衾の配列番号： 85記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 84を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 84に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの) 3サ ブュニッ卜の 127番目の L e uが Va 1に置換されている事を確認した。
84] 表 84
Figure imgf000136_0001
[実施例 46] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 5)
ySサブュニットの 127番目の L e uを S e rに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 86記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 85を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 85に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ プュニッ卜の 127番目の Le uが S e rに置換されている事を確認した。
[表 85] 表 85
Figure imgf000137_0001
[実施例 47] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 6)
^サブュニットの 146番目の Ar gを G 1 yに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 87記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 P CR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DNA増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 86を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 86に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの ^サ ブュニッ卜の 146番目の A r gが G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 86]
表 86
Figure imgf000138_0001
[実施例 48] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 7)
；8サブュニットの 160番目の Ar gを Le uに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを鍀型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。'
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々鍀型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 88記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50〃 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行.つた。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 しを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 87を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 87に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの) 8サ ブュニッ卜の 160番目の Ar gが L e uに置換されている事を確認した。
[表 87]
表 87
Figure imgf000139_0001
[実施例 49] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 8)
サブュニットの 160番目の Ar gを Tr pに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した p PT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 89記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 88を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 88に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの ;3サ ブュニッ卜の 160番目の Ar gが T r pに置換されている事を確認した。 [表 88] 表 88
Figure imgf000141_0001
[実施例 50] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （8 9)
サブュニットの 186番目の Leuを G 1 uに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA1 Ongを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 90記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ju Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 OjuLの系 （組成はキッ に記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 89を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 89に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラターゼの )8サ プュニッ卜の 186番目の Le uが G 1 uに置換されている事を確認した。
[¾89] 表 89
Figure imgf000142_0001
[実施例 51] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 0)
βサプュニッ卜の 186番目の Leuを As pに置換するために、 pPT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 91記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 5 Ο/iLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 90を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 9ひに示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの y8サ ブュニットの 186番目の L e uが As pに置換されている事を確認した。
90] 表 90
Figure imgf000143_0001
[実施例 52] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 1)
サブュニットの 186番目の Leuを Ly sに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 92記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 N o. 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 を用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 91を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 91に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの^サ ブュニットの 186番目の Le uが Ly sに置換されている事を確認した。
[表 91]
表 91
Figure imgf000144_0001
[実施例 53] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 2)
βサブュニットの 186番目の Leuを A r gに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 93記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 1 5秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50;t/Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 juLを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 92を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 92に示したクロ一ンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの 8サ ブュニッ卜の 186番目の Leuが A r gに置換されている事を確認した。
[表 92] 表 92
Figure imgf000145_0001
[実施例 54] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 3)
サブュニットの 186番目の L e uを As nに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々鍀型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 94記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 93を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によつャニトリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 93に示したクローンにおいて二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブュニッ卜の 186番目の L e uが As nに置換されている事を確認した。
93] 表 93
Figure imgf000146_0001
[実施例 55] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 4)
βサブュニッ卜の 186番目の L e uを S e rに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した P PT— DB 1のプラスミド DNA10 ngを各々铸型と して 2種類の PC R反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 95記載のプライマー及び M 13プライマー M4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より DN A増幅産物の分析を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 94を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により'添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 94に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの ^サ ブュニットの 186番目の L e uが S e rに置換されている事を確認した。
[表 94]
表 94
Figure imgf000147_0001
[実施例 56] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 5)
βサブュニッ卜の 186番目の L e uを G 1 yに置換するために、 pPT— D Β 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した PPT— DB 1のプラスミド DNAl O ngを各々铸型と して 2種類の P C R反応を行つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 96記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 juLの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー RV (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 5 O p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. 95を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 95に示したクローンにおいて二トリルヒドラターゼの ^サ ブュニットの 186番目の L e uが G 1 yに置換されている事を確認した。
[表 95] 表 95
Figure imgf000148_0001
[実施例 57] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 6)
βサブュニットの 217番目の As pを G 1 yに置換するために、 p PT— D B 1プラスミド DNAを铸型として、 実施例 1と同様の操作により部位特異的な 変異導入を行った。
実施例 1で調製した pPT— DB 1のプラスミド DNA10 n gを各々铸型と して 2種類の PCR反応を行った。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 97記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列 を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条件 による） で、 熱変性 （98°C) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反 応 （72°C) 120秒の条件を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR 反応 No. 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及 び M 13プライマー R V (配列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 p mo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反 応 No. 1と同様の操作により行った。 PCR反応 No. 1及び No. 2の反応 終了液各 5 jt Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) に より D N A増幅産物の分析を行つたところ、 増幅 D N A産物の存在が確認できた 。 以後、 実施例 1と全く同じ操作により、 形質転換体 No. を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 96に示したクローンにおいて二トリルヒドラタ一ゼの ^サ ブュニッ卜の 217番目の As pが G 1 yに置換されている事を確認した。 [表 96] 表 96
Figure imgf000150_0001
[実施例 5 8] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 7)
クロ一ン No. 40のアミノ酸変異 （ サブュニットの 36番目： Th rが M e t) とクローン No. 1 1のアミノ酸変異 （αサブユニットの 1 26番目： P h eが Ty r) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一 ゼ活性が保持されていることを確認した。
30m lの試験管に 1 0m lの L B液体培地を調製し、 1 2 1 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 1 00 i g/m lとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 1 1で得られたクローン No. 1 1を一 白金耳植菌し、 3 7°C · 300 r pmにて約 2 0時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （1 5000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力 U SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。
調製したプラスミド DNA1 0 n gを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 41記載のプライマ一及び M 1 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 5 0 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （9 8°C ) 1 5秒、 アニーリング （5 5°C) 30秒、 伸長反応 （7 2°C) 1 20秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 5 0 pmo 1含む全量 50 j« 1の系
(組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 97を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 97に示したように野生型の二卜リルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 36番目の Th rが Me tに、 サブュニットの 126番目の Ph e が Ty rにそれぞれ置換されていた。
[表 97]
表 97
Figure imgf000151_0001
[実施例 59] 二卜リルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 8)
クローン No. 42のアミノ酸変異 （aサブュニットの 148番目： G 1 yが As p) とクローン No. 43のアミノ酸変異 （ サブユニットの 204番目： Va 1が Ar g) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 ーゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 4で得られたクローン No. 43を一白 金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を 適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） により 菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド DN Aを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 43記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系
(組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DN A増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 98を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一37.3 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 98に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サブ ュニットの 14番目の G 1 y力 s、As pに、 サブュニットの 204番目の V a 1 が A r gにそれぞれ置換されていた。
[表 98] 表 98
Figure imgf000153_0001
[実施例 60] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （9 9)
クロ一ン No. 77のアミノ酸変異 （)8サブュニットの 51番目： 116が¥ a 1 ) とクローン No. 20のアミノ酸変異 （/5サブユニットの 108番目： G 1 u力 ^As p) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一 ゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 /m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 20で得られたクローン No. 20を一 白金耳植菌し： 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。
調製したプラスミド DN A 10 n gを各々銬型として 2種類の P C R反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 78記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系
(組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 99を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 99に示したように野生型の二トリルヒドラ夕ーゼの ySサブ ュニットの 51番目の Pheが Va 1に、 ^サブュニットの 108番目の G 1 u が A s pにそれぞれ置換されていた。
[表 99]
表 99
Figure imgf000154_0001
[参考例 40] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 00)
クローン No. 20のアミノ酸変異 （ サブュニットの 108番目： G 1 uが As p) とクロ一ン No. 30のアミノ酸変異 （ サブユニットの 200番目： A 1 aが G l u) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 ーゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 10 g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 30で得られたクローン No. 30を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力 USDS抽出法により該菌体よりプラスミド D N Aを調製した。
調製したプラスミド DNA1 Ongを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 29記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 100を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 100に示したように野生型の二トリルヒドラ夕ーゼのSサ ブュニットの 108番目の G 1 uが As pに、 βサプュニットの 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換されていた。 [表 100]
表 100
Figure imgf000156_0001
[実施例 61] 二卜リルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 01)
クロ一ン No. 82のアミノ酸変異 （^サブュニッ卜の 118番目： Ph e力 Va 1 ) とクローン No. 30のアミノ酸変異 （ySサブュニッ卜の 200番目： A 1 aが G l u) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラタ ーゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 30で得られたクロ一ン No. 30を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。 '
調製したプラスミド DNA10 n gを各々铸¾ ^として 2種類の PC R反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 83記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は > MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号'： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系
(組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 P CR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 101を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 101に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの； Sサ ブュニッ卜の 118番目の P heが V a 1に、 βサブュニッ卜の 200番目の A
1 aが G 1 uにそれぞれ置換されていた。
[表 101]
表 101
Figure imgf000157_0001
[実施例 62] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 02)
クローン No. 88のアミノ酸変異 （ サブュニットの 160番目： Ar gが Tr p) とクローン No. 92のアミノ酸変異 （； δサブユニットの 186番目： 6 11が八 8) を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕 ーゼ活性が保持されていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100〃 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 53で得られたクローン No. 92を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 89記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 102を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 102に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの y3サ ブュニッ卜の 160番目の Ar gが Tr pに、 ；3サブュニッ卜の 186番目の L e uが A r gにそれぞれ置換されていた。 [表 102]
表 102
Figure imgf000159_0001
[実施例 63] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 03)
クロ一ン No. 2のアミノ酸変異 （ サブユニットの 6番目： L e uが Th r ) とクローン No. 97のアミノ酸変異 （ サブユニットの 36番目： Th rが M,e t ； サブユニットの 126番目 ·· Ph eが Ty r) を共に有しているアミ ノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認し た。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 μ gZm 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 58で得られたクローン No. 97を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D N Aを調製した。
調製したプラスミド DNA10 n gを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 11記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50〃 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキッ卜に記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 ju 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 103を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 103に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼのひサ ブュニットの 6番目の L e uが Th rに、 サブュニッ卜の 36番目の Th rが Me tに、 サブュニットの 126番目の P h eが Ty rにそれぞれ置換されて いた。
[表 103]
表 103
Figure imgf000160_0001
[実施例 64] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1
04)
クローン No. 41のアミノ酸変異 （α?サブュニッ卜の 71番目 ·· Ar gが H
1 s) とクローン No. 32のアミノ酸変異 （ サブュニッ卜の 19番目： A 1 aが Va l ； orサブユニットの 126番目： Pheが Ty r) を共に有している アミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕ーゼ活性が保持されていることを確 認した。 30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100/ gZmlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 32で得られたクローン No. 32を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D N Aを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々铸型として 2種類の PC R反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 42記載のプライマー及び M 13プライマ一 M4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用いたァ ガロース電気泳動.（ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 104を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 104に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの Ofサ プュニッ卜の 19番目の A 1 aが V a 1に、 サブュニットの 71番目の Ar g が H i sに、 サブュニットの 126番目の Pheが Ty rにそれぞれ置換され ていた。 [表 104]
表 104
Figure imgf000162_0001
[実施例 65] 二トリルヒドラタ一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 05)
クローン No. 40のアミノ酸変異 （ サブユニットの 36番目： Th rが M e t) とクローン No. 98のアミノ酸変異 （ サブュニットの 148番目： G 1 yが As p ； αサブュニッ卜の 204番目： V a 1が A r g) を共に有してい るアミノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されていることを 確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 jt g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 59で得られたクローン No. 98を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D N Aを調製した。
調製したプラスミド DNA1 Ongを各々鎳型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 41記載のプライマー及び M 13プライマ一 M4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 03016014
列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 ju 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 105を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 105に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 36番目の Th rが Me tに、 サブュニットの 148番目の G 1 yが A s pに、 αサブュニットの 204番目の V a 1が A r gにそれぞれ置換さ れていた。
105]
表 105
Figure imgf000163_0001
[実施例 66] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 06)
クロ一ン No. 47のアミノ酸変異 （ySサブュニッ卜の 10番目： Th rが A s p) とクローン No. 101のアミノ酸変異 (βサブュニットの 118番目： P h eが Va 1 ；；8サブュニットの 200番目： A 1 aが G 1 u) を共に有して いるアミノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されていること を確認した。
30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の ォ—トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 10 Oju gZmlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 61で得られたクローン No. 101を 一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 1 m 1を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） に より菌体を分離した。 続いてアル力 USDS抽出法により該菌体よりプラスミド DN Aを調製した。
調製したプラスミド DNA1 Ongを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 48記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 106を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 106に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの j8サ ブュニッ卜の 10番目の Th rが As pに、 βサブュニットの 118番目の Ph eが Va 1に、 ^サブュニッ卜の 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換さ れていた。
[表 106]
表 106
Figure imgf000165_0001
[実施例 67] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 07)
クローン No. 56のアミノ酸変異 （Sサブュニッ卜の 37番目： Ph eが L e u) とクローン No. 100のアミノ酸変異 （ サブユニットの 108番目： G 1 uが As p ； サブュニットの 200番目： A 1 aが G 1 u) を共に有して いるアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持されていること を確認した。
30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/m 1となる ようにアンピシリンを添加した後、 参考例 40で得られたクローン No. 100 を一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 1 m 1を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） により菌体を分離した。 続いてアル力リ S D S抽出法により該菌体よりプラスミ ド DN Aを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 57記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 jt 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 107を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 107に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの 3サ ブュニットの 37番目の P h eが L e uに、 サブュニットの 108番目の G 1 uが As pに、 βサブュニッ卜の 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換さ れていた。
[表 107]
表 107
Figure imgf000166_0001
[実施例 68] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 08)
クローン No. 58のアミノ酸変異 (βサブュニッ卜の 37番目： Ph eが V a 1) とクローン No. 100のアミノ酸変異 （ サブュニットの 108番目： G 1 uが As p ； Sサブュニッ卜の 200番目： A 1 aが G 1 u) を共に有して いるアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持されていること を確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 40で得られたクローン No. 100を 一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） に より菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド DNAを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々銬型として 2種類の PCR反応を行 つた。 P C R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 59記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 ju 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 108を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 108に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニッ卜の 37番目の Ph eが Va 1に、 βサブュニットの 108番目の G 1 uが A s pに βサプュニットの 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換さ れていた。
[表 108]
表 108
Figure imgf000168_0001
[実施例 69] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 09)
クローン No. 63のアミノ酸変異 (βサプュニットの 41番目： Ph eが I 1 e) とクロ一ン No. 99のアミノ酸変異 （ サブユニットの 51番目 ·· Ph eが Va l ； サブユニットの 108番目： G 1 uが As p) を共に有している アミノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確 認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 10 O jtz g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 60で得られたクローン No. 99を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド D N Aを調製した。
調製したプラスミド DNA10 n gを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 64言 3載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 1.0に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DN A増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 N o. 109を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 109に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの ^サ ブユニットの 41番目の Pheが I 1 eに、 ；5サブユニットの 51番目の Phe が V a 1に、 βサブュニットの 108番目の G 1 uが A s ρにそれぞれ置換され ていた。
[表 109]
表 109
Figure imgf000169_0001
[実施例 70] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 10)
クローン No. 68のアミノ酸変異 （ サブュニットの 46番目： Me tが L y s) とクローン No. 37のアミノ酸変異 （ySサブユニットの 108番目： G 1 uが Ar g ； j8サブュニットの 212番目： S e rが Ty r) を共に有してい るァミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持されていることを 確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 ju g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 37で得られたクローン No. 37を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力 USDS抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。
調製したプラスミド DNA10 ngを各々铸型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PC R反応 N o. 1は、 配列表の配列番号： 69記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DN A増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 110を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 110に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの ;3サ 4
ブュニットの 46番目の Me tが Ly sに、 ^サブュニットの 108番目の G 1 uが Ar gに、 ；8サブュニットの 212番目の S e rが T y rにそれぞれ置換さ れていた。
.10]
Figure imgf000171_0001
[実施例 71] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 1 1)
クローン No. 72のアミノ酸変異 （ サブュニットの 48番目： L e uが V a 1 ) とクローン No. 37のアミノ酸変異 （j8サブュニットの 108番目： G 1 uが Ar g ； サブュニッ卜の 212番目： S e rが Ty r) を共に有してい るァミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持されていることを 確 5忍しに。
30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 12 1 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100〃 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 3 '7で得られたクローン No. 37を一 白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1 を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によ り菌体を分離した。 続いてアル力リ S D S抽出法により該菌体よりプラスミド D NAを調製した。
調製したプラスミド DNA1 Ongを各々鍀型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 73記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 1 5秒、 アニーリング （5 5°C) 30秒、 伸長反応 （7 2°C) 1 20秒の条件 を 2 5サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマー （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配 列表の配列番号： 1 0に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. I l lを得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 1 00 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一卜シークェンサ一37 3 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 1 1 1に示したように野生型の二卜リルヒドラ夕一ゼの^サ ブュニットの 48番目の L e uが Va 1に、 βサ ュニッ卜の 1 0 8番目の G 1 uが A r gに、 βサブュニットの 2 1 2番目の S e rが Ty rにそれぞれ置換さ れていた。
1 1]
Figure imgf000172_0001
[実施例 7 2] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 1 2)
クローン No. 85のアミノ酸変異 (βサブュニットの 1 2 7番目： L e uが 14
S e r) と クローン No. 102のアミノ酸変異 （^サブユニットの 160番 目： A r gが T r p ； )8サブュニットの 186番目： L e uが A r g) を共に有 しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持されている ことを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 ju g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 62で得られたクローン No. 102を 一白金耳植菌し、 37°C · 300 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） に より菌体を分離した。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりプラスミド DNAを調製した。
調製したプラスミド DNA10 n gを各々鍀型として 2種類の PCR反応を行 つた。 PCR反応 No. 1は、 配列表の配列番号： 86記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号： 8に配列を記載） を各々 50 pmo 1 含む全量 50 ju 1の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C ) 15秒、 アニーリング （55°C) 30秒、 伸長反応 （72°C) 120秒の条件 を 25サイクル繰り返すことにより行った。 PCR反応 No. 2は、 MUT4プ ライマ一 （配列表の配列番号： 9に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配 列表の配列番号： 10に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 1の系 (組成はキットに記載の条件による） で、 PCR反応 No. 1と同様の操作によ り行った。 PCR反応 No. 1および No. 2の反応終了液各 5〃 1を用いたァ ガロース電気泳動 （ァガロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析 を行ったところ、 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 以後、 実施例 1と全く同 じ操作により、 形質転換体 No. 112を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 6014
した。 その結果、 表 112に示したように野生型の二トリルヒドラターゼの) Sサ ブュニットの 127番目の L e uが S e rに、 βサプュニッ卜の 160番目の A r gが T r ρに、 βサブュニットの 186番目の Leuが A r gにそれぞれ置換 されていた。
12]
Figure imgf000174_0001
[実施例 73] 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 13)
クローン No. 34のアミノ酸変異とクロ一ン No. 110のアミノ酸変異を 共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラタ一ゼ活性が保持され ていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 34で得られたクローン No. 34およ び実施例 70で得られたクローン No. 110を一白金耳植菌し、 37°C， 30 0 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 1mlを適当な遠心チューブに分取 した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離した 。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 34及びクロー ン No. 110のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 110のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって 切断した後、 ァガロースゲル竃気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガロース濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b の DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 34のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 1によって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社 製タイプ V I. I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガ ロースゲルから約 3. 8 kb pの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ口 —ス片 （約 0. l g) を細かく粉砕し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノ ール /クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 D N A断片を精製し、 最終 的に 10 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクローン No. 110由来の約 770 b pの DNA断片 とクローン No. 34由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲーショ ンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このプラス ミドにより大腸菌 HB 101のコンピテン卜セル （東洋紡績社製） を形質転換し 、 形質転換体 No. 113を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。 - また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 113に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの αサ ブュニットの 6番目の Leuが Th rに、 サブュニットの 19番目の A 1 aが Va lに、 サブユニットの 126番目の Ph eが Ty rに、 iSサブユニットの 46番目の Me tが Ly sに、 βサプュニットの 108番目の G 1 uが Ar gに 、 ^サブュニッ卜の 212番目の S e rが Ty rにそれぞれ置換されていた。 [表 113]
表 113
Figure imgf000176_0001
[実施例 74] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 14)
クロ一ン No. 34のアミノ酸変異とクローン No. I l lのアミノ酸変異を 共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラターゼ活性が保持され ていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 i g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 34で得られたクローン No. 34およ び実施例 71で得られたクロ一ン No. 111を一白金耳植菌し、 37°C' 30 0 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分取 した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離した 。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 34及びクロ一 ン No. 111のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. I l lのプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガロース濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 bpの DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 34のプラスミド DNAを E c oRIおよび No tlによって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社 製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガ ロースゲルから約 3. 8 kb pの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ口 ース片 （約 0. l g) を細かく粉碎し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフェノ —ル/クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 DNA断片を精製し、 最終 的に 10 1の T Eに溶解した。
この様にして得られたクローン No. 111由来の約 770 b pの DNA断片 とクローン No. 34由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲーショ ンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このプラス ミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換し 、 形質転換体 No. 114を得た。 '
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 114に示したように野生型の二トリルヒドラ夕ーゼの αサ ブュニットの 6番目の L e uが Th rに、 サブュニットの 19番目の A 1 aが Va lに、 サブユニットの 126番目の P h eが Ty rに、 サブユニットの 48番目の Leuが V a 1に、 ）8サブュニットの 108番目の G 1 uが Ar gに 、 ；8サブユニットの 212番目の Se rが Ty rにそれぞれ置換されていた。
[表 114]
表 114
Figure imgf000177_0001
[実施例 75] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 00雇 6014
15)
クローン No. 35のアミノ酸変異とクローン No. 112のアミノ酸変異を 共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕ーゼ活性が保持され ていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 参考例 35で得られたクローン No. 35およ び実施例 72で得られたクローン No. 112を一白金耳植菌し、 37°C' 30 0 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lmlを適当な遠心チューブに分取 した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離した 。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 35及びクロ一 ン No. 112のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 112のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガ口一ス濃度 1. 0%) を行い、 ァガ口一スゲルから約 770 b pの DNA断片を切り出した。 同様に、 クロ一ン No. 35のプラスミド DNAを E c oRIおよび No tlによって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社 製タイプ V I I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガ ロースゲルから約 3. 8 kb pの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ口 ース片 (約 0. 1 g) を細かく粉砕し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノ —ル /クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 DNA断片を精製し、 最終 的に 10 μ 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクロ一 No. 112由来の約 770 b pの DNA断片 とクローン No. 35由来の約 3. 8Kbpの DNA断片を DNAライゲ一ショ ンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このプラス ミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換し 、 形質転換体 No. 115を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 115に示したように野生型の二トリルヒドラ夕ーゼの αサ ブュニッ卜の 6番目の L e uが A 1 aに、 サブュニットの 19番目の A 1 aが Va lに、 サブユニットの 126番目の Ph eが Ty rに、 Sサブユニットの 127番目の L e uが S e rに、 サブュニットの 160番目の A r gが T r p に、 サブュニッ卜の 186番目の Le uが Ar gにそれぞれ置換されていた。
15]
表 1 1 5
Figure imgf000179_0001
[実施例 76] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 16)
クローン No. 103のアミノ酸変異とクローン No. 106のアミノ酸変異 を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持さ れていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 i gZmlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 63で得られたクローン No. 103お よび実施例 66で得られたクロ一ン No. 106を一白金耳植菌し、 37°C' 3 00 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分 取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離し た。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 103及びク ローン No. 106のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 106のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 1によって 切断した後、 ァガ口一スゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガロース濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b pの DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 103のプラスミド DNAを Ec oRIおよび No tlによって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ 社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァ ガロ一スゲルから約 3. 8 kbpの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ ロース片 （約 0. 1 g) を細かく粉砕し 1 m 1の T E溶液にそれぞれ懸濁後、 5 5 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエ ノール /クロロホルム抽出とエタノ一ル沈澱を行って各 D N A断片を精製し、 最 終的に 10 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクロ一ン No. 106由来の約 770 b pの DNA断片 とクローン No. 103由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲ一シ ヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このブラ スミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換体 No. 116を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 116に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの αサ ブュニッ卜の 6番目の L e uが Th rに、 サブュニットの 36番目の Th rが Me tに、 サブユニットの 126番目の P h eが Ty rに、 /3サブユニットの 10番自の Th rが A s pに、 サブュニッ卜の 118番目の P h eが Va 1に 、 ；5サブュニッ卜の 200番目の A 1 aが G ί uにそれぞれ置換されていた。 [表 116]
表 116
Figure imgf000181_0001
[実施例 77] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 17)
クローン No. 104のアミノ酸変異とクローン No. 107のアミノ酸変異 を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕ーゼ活性が保持さ れていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 64で得られたクローン No. 104お よび実施例 67で得られたクロ一ン No. 107を一白金耳植菌し、 37°C' 3 00 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分 取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離し た。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 104及びク ローン No. 107のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 107のプラスミド DNAを Ec oRIおよび No 1によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガロース濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b pの DNA断片を切り出した。 同様に、 クロ一ン No. 104のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ 社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァ ガロースゲルから約 3. 8 kbpの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ 口一ス片 （約 0 · 1 g ) を細かく粉砕し 1 m 1の T E溶液にそれぞれ懸濁後、 5 5°Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエ ノ一ル Zク口口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 D N A断片を精製し、 最 終的に 10〃 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクローン No. 107由来の約 770 b pの DNA断片 とクローン No. 104由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲ一シ ヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このブラ スミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換体 No. 117を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 117に示したように野生型の二ト ルヒドラタ一ゼの サ ブュニットの 19番目の A 1 aが Va 1に、 サブュニットの 71番目の Ar g が H i sに、 サブユニットの 126番目の P h eが Ty rに、 サブユニット の 37番目の P h eが L e uに、 βサプュニットの 108番目の G 1 uが As p に、 j8サブュニットの 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換されていた。
[表 117]
表 1 17
Figure imgf000182_0001
[実施例 78] 二トリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （ 18)
クローン No. 104のアミノ酸変異とクローン No. 108のアミノ酸変異 を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラ夕一ゼ活性が保持さ れていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの LB液体培地を調製し、 12,1°C' 20分間の ォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 gZm 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 64で得られたクローン No. 104お よび実施例 68で得られたクローン No. 108を一白金耳植菌し、 37°C' 3 00 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分 取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離し た。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 104及びク ローン No. 108めプラスミド DNAをそれぞれ調製した。
クローン No. 108のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガ口一ス濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b pの DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 104のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 1によって切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ 社製タイプ V I I低融点ァガロース使用；ァガ口一ス濃度 0. 7%) を行い、 ァ ガロースゲルから約 3. 8 kb pの DNA断片を切り出した。.切りだした両ァガ ロース片 （約 0. 1 g) を細かく粉砕し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 5 5°Cで 1時間保温してァガ口一スを完全に融解させた。 この融解液に対してフエ ノール Zク口口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 D N A断片を精製し、 最 終的に 10〃 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクローン No. 108由来の約 770 bpの DNA断片 とクローン No. 104由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲーシ ヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このブラ スミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換体 No. 118を得た。 ·
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100%であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二トリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 118に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの サ ブュニットの 19番目の A 1 aが Va 1に、 αサブュニッ卜の 71番目の A r g が H i sに、 αサブユニットの 126番目の Pheが Ty rに、 ；8サブユニット の 37番目の Ph eが Va 1に、 βサブ：！ニッ卜の 108番目の G 1 uが As p に、 サブュニッ卜の 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換されていた。
[表 118]
表 1 18
Figure imgf000184_0001
[実施例 79] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 (1 19) '
クローン No. 105のアミノ酸変異とクローン No. 109のアミノ酸変異 を共に有しているアミノ酸置換体においても二トリルヒドラタ一ゼ活性が保持さ れていることを確認した。
30mlの試験管に 10mlの L B液体培地を調製し、 121 °C · 20分間の オートクレ一ブにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 i g/mlとなるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 65で得られたクローン No. 105お よび実施例 69で得られたクローン No. 109を一白金耳植菌し、 37°C' 3 00 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分 取した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離し た。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクローン No. 105及びク ローン No. 109のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 109のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロー ス使用；ァガロース濃度 1. 0 %) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b pの DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 105のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 11によって切断した後、 ァガ口一スゲル電気泳動 （シグマ 社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァ ガロースゲルから約 3. 8 kb pの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ ロース片 （約 0. l g) を細かく粉砕し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 5 5 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエ ノール/クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 DNA断片を精製し、 最 終的に 10 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクローン No. 109由来の約 770 bpの DNA断片 とクロ一ン No. 105由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲ一シ ヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このブラ スミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換体 No. 119を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサー 373 Aを用 いたダイデォキシ法によつて二トリルヒドラタ一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 119に示したように野生型の二トリルヒドラタ一ゼの サ ブュニットの 36番目の Th rが Me tに、 サブュニットの 148番目の G 1 yが As pに、 サブユニットの 204番目の V a 1が A r gに、 サブュニッ トの 41番目の Ph eが I 1 eに、 サブュニッ卜の 51番目の Ph eが Va 1 に、 ^サブュニットの 108番目の G 1 uが As pにそれぞれ置換されていた。 [表 119]
Figure imgf000186_0001
[実施例 80] 二トリルヒドラ夕一ゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得 （1 20)
クローン No. 98のアミノ酸変異とクローン No. 100のアミノ酸変異を 共に有しているアミノ酸置換体においても二卜リルヒドラターゼ活性が保持され ていることを確認した。
30mlの試験管に 10 m 1の L B液体培地を調製し、 121 °C · 20 ^間の オートクレープにより滅菌した。 この培地に終濃度が 100 g/m 1となるよ うにアンピシリンを添加した後、 実施例 59で得られたクローン No. 98およ び参考例 40で得られたクローン No. 100を一白金耳植菌し、 37°C' 30 0 r pmにて約 20時間培養した。 該培養液 lm 1を適当な遠心チューブに分取 した後、 遠心分離 （15000 r pmx 5分） によりそれぞれの菌体を分離した 。 続いてアルカリ SDS抽出法により該菌体よりクロ一ン No. 98及びクロー ン No. 100のプラスミド DN Aをそれぞれ調製した。
クローン No. 100のプラスミド DNAを E c oRIおよび No 1によって 切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガ口一 ス使用；ァガロース濃度 1. 0%) を行い、 ァガロースゲルから約 770 b の DNA断片を切り出した。 同様に、 クローン No. 98のプラスミド DNAを E c o R Iおよび N o 11によって切断した後、 ァガロ一スゲル電気泳動 （シダマ社 製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガ ロースゲルから約 3. 8 kbpの DNA断片を切り出した。 切りだした両ァガ口 ース片 （約 0· 1 g) を細かく粉砕し lmlの TE溶液にそれぞれ懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノ ール /クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って各 DNA断片を精製し、 最終 的に 10 μ 1の TEに溶解した。
この様にして得られたクロ一ン No. 100由来の約 770 b pの DNA断片 とクロ一ン No. 98由来の約 3. 8Kb pの DNA断片を DNAライゲーショ ンキット （宝酒造社製） を用いて連結させてプラスミドを構築した。 このプラス ミドにより大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質転換し 、 形質転換体 N o. 120を得た。
次に、 参考例 1と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、 転化率及 び選択率は 100 %であった。
また、 上記菌体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調製した。 続い て、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用 いたダイデォキシ法によって二卜リルヒドラ夕一ゼ遺伝子部分の塩基配列を決定 した。 その結果、 表 120に示したように野生型の二トリルヒドラ夕一ゼの サ ブュニットの 148番目の G 1 yが As pに、 サブュニットの 204番目の V & 1が八 8に、 y8サブユニットの 108番目の G 1 uが As pに、 ；6サブュニ ットの 200番目の A 1 aが G 1 uにそれぞれ置換されていた。
[表 120]
表 120
Figure imgf000187_0001
[実施例 81] ロドコッカス ロドクロウス J一 1株からのゲノム DNA調製 500mlのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地 100mlを調製し 121 °C · 20分間のオートクレープにより滅菌した。 培地組成；
グルコース： 10. O gZL リン酸二水素一カリウム： 0. 5 gZL、 リン酸 一水素二カリウム： 0. 5 g/L、 硫酸マグネシウム ·七水和物： 0. 5 g/L 、 酵母エキストラクト： 1. O gZL、 ペプトン： 7. 5 g/L, 尿素： 7. 5 gZL、 塩化コバルト '六水和物： 10. 0mgZL、 pH7. 2 1 この培地に特許文献 1記載の口ドコッカス ·ロドクロウス J一 1株 （FERM B P— 1478として、 前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブダぺスト条約に基づいて寄託されており、 万人に対し請求により 分譲される） を一白菌耳植菌し、 30°C · 130 r pmにて 72時間培養した。 遠心分離 （1500 OGX 15分間） により菌体のみを培養液より分離し、 続い て、 50mlの生理食塩水に該菌体を 懸濁した後に、 再度遠心分離を行って湿 菌体を得た。
上記で得た湿菌体 2 gに 0. 15 Mの N a C 1を含む 50 mMの E D T A · 2 N a水溶液 （pH8. 0) を 40ml加えて菌体を懸濁し、 90 °Cで 10分間煮 沸処理した。 該処理液を 37 °Cまで冷却した後に、 卵白リゾチームを 10 Omg 加えて 37でで 1時間保温した。 次に 20000 U/m gのザィモリレースを 3 Omg加えて 37°Cで 1時間保温した。 続いて 20 U/mgのプロティネース K を 5 m g加えて 37 °Cで 1時間保温した。 更に、 10 % S D S溶液を 2 m 1添加 して 65°Cで 1時間保温した後、 直ちにフエノールノクロ口ホルム抽出を行った 。 まず、 TE (1011^の£07八 ' 2Naを含む10mMのトリス塩酸水溶液； pH8. 0) で飽和させたフエノール液 42m 1を加え緩やかに攪拌した。 遠心 分離 （3000 r pm · 10分間） により水相と有機相を分離し、 水相のみを分 取した。 この水相に上記の TE飽和フエノール液 2 lmlとクロ口ホルム 21 m 1を加えて再び緩やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） に より水相と有機相を再度分離し、 水相のみを再分取した。 この水相にクロ口ホル ム 42m 1を加えて再び緩やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10 分間） により水相と有機相を再度分離し、 水相のみを分取した。 この水相に 1. lMのNaC 1を含む TE溶液 4mlとエタノール 92mlを加えてしばらく室 温で放置した後、 析出した糸状の DNAをガラス棒を用いて巻取った。 70% · 80% · 90%のエタノール水溶液で順次脱水を行った後に風乾させた該 DNA を 40m 1の TE溶液に再溶解させた。 RNa s e Aを 30 g加えて 37 で 1時間保温した後、 制限酵素 BamHIにより部分切断した。 フエノール抽出/ クロ口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて部分切断された該 D N Aを再精製 し、 最終的に 1. O/igノ mlとなるように TE溶液に溶解させた。
[実施例 82] PCRを用いたロドコッカス ロドクロウス J一 1株ゲノム DN Aからの二トリルヒドラ夕ーゼ遺伝子の調製
特許文献 2及び非特許文献 1において明らかになつている二トリルヒドラ夕一 ゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、 配列表の配列番号 105及び 106記載のブラ イマ一を合成した。 実施例 81にて調製した部分切断された染色体 DNA3 g を铸型として PCRを行った。 PCR反応では、 各プライマ一を各々 200 n g と K〇Dポリメラ一ゼ （東洋紡績社製） を 1Uを含む全量 50 1の系で、 熱変 性 （98°C) 15秒 ·アニーリング （58°C) 15秒 '伸長反応 （68°C) 2分 間のサイクルを 40回繰り返した。 PCR反応の終了液をァガロース電気泳動 （ シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガ口一ス濃度 0. 8重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 約 1. 3 kbpの増幅 DNA産物 の存在が確認できた。
続いて、 ァガ口一スゲルから約 1. 3 kb pの DNA断片のみを切り出し、 該 ァガロース片 （約 0. 1 g) を細かく粉碎し lmlの TE溶液に懸濁後、 55°C で 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノー ル /クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行った。 まず、 TE (ImMの EDT A · 2Naを含む 10 mMのトリス塩酸水溶液； p H 8. 0 ) で飽和させたフエ ノール液 lm 1を加え緩やかに攪拌した。 遠心分離 （3000 r pm · 10分間 ) により水相と有機相を分離し、 水相のみを分取した。 この操作を 3回繰り返し た後、 得られた水相に上記の T E飽和フエノ一ル液 0. 4 m 1とクロ口ホルム 0 . 4m 1を加えて再び緩やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10分 間） により水相と有機相を再度分離し、 水相のみを再分取した。 この水相にクロ 口ホルム 0. 8mlを加えて再び緩やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r p m- 10分間） により水相と有機相を再度分離し、 水相のみを分取した。 この水 相に 1. 1Mの NaC 1を含む TE溶液 80 1とエタノール 1. 7mlを加え て— 80°Cで 30分間放置した後、 遠心分離 （15000 r pm · 20分間 · 4 °C) により DNA断片の沈殿を回収した。 該 DNA断片を風乾後、 最終的に 10 ^ 1の丁£に溶解した。 .
精製した約 1. 3 k b pの増幅 DNA断片を制限酵素 E c oR I及び S c a I により切断した後、 ァガロース電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロ ース使用；ァガロース濃度 0. 8重量％) により DN A増幅産物の分析を行った ところ、 約 1. 3 kb pの DNAの存在が確認できた。 ァガロースゲルからこの 約 1. 3 kbpの DNA断片を切り出し、 該ァガロース片 （約 0. 1 g) を細か く粉砕し 1 m 1の T E溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロースを完全 に融解させた。 この融解液に対してフエノール Zクロロホルム抽出とエタノール 沈澱を行った。 まず、 TE (ImMの EDTA · 2Naを含む 1 OmMのトリス 塩酸水溶液； p H 8. 0 ) で飽和させたフエノール液 1 m 1を加え緩やかに攪拌 した。 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） により水相と有機相を分離し、 水 相のみを分取した。 この操作を 3回繰り返した後、 得られた水相に上記の TE飽 和フエノール液 0. 4 m 1とクロ口ホルム 0. 4mlを加えて再び緩やかに攪拌 した後、 遠心分離 （3000 r pm* 10分間） により水相と有機相を再度分離 し、 水相のみを再分取した。 この水相にクロ口ホルム 0. 8mlを加えて再び緩 やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） により水相と有機相 を再度分離し、 水相のみを分取した。 この水相に 1. 1Mの NaC lを含む TE 溶液 80 1とエタノール 1. 7mlを加えて— 80でで 30分間放置した後、 遠心分離 （15000 r pm' 20分間 · 4°C) により DNA断片の沈殿を回収 した。 該 DNA断片を風乾後、 最終的に 10 1の TEに溶解した。
[実施例 83] ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリルヒドラ夕一 ゼ遺伝子を発現させる為のプラスミドベクタ一の調製
500mlのバッフル付三角フラスコに下記の組成の 40 n gZmLの硫酸第 二鉄 ·七水和物及び 10 β gZmLの塩化コバルト ·六水和物を含む LB液体培 地を 100ml調製し、 121°C · 20分間のォ一トクレーブにより滅菌した。 培地組成； 酵母エキストラクト： 5. 0 gZL、 ポリペプトン： 10. O gZL、 NaC l : 5. 0 g/L、 塩化コバルト ·六水和物： 10. Omg/L、 硫酸第二鉄'七 水和物： 40. 0mg/L、 pH7. 5
この培地に終濃度が 100 gZmlとなるようにアンピシリンを添加した後 、 特許文献 3記載の MT10822 (FERM BP— 5785) を一白菌耳植 菌し、 37°C · 13 O r pmにて 16時間培養した。 遠心分離 (15000 GX 15分間） により菌体のみを培養液より分離し、 続いて、 5.0mlの生理食塩水 に該菌体を再懸濁した後に、 再度遠心分離を行って湿菌体を得た。 該湿菌体より アルカリ SDS抽出法により p PT— DB 1 (図 1) のプラスミドを調製し、 R Na s 6八を30/28加ぇて37°Cで 1時間保温した後、 フエノール抽出/クロ 口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 a gZ lとなるように TE溶液に溶解させた。
精製したプラスミド 1 xgを制限酵素 Ec oR I及び Ec o47IIIにより切 断した後、 ァガロース電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用 ；ァガロース濃度 0. 8重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 約 3. 3 13 と約1. 3 kb pの DN Aの存在が確認できた。 ァガロースゲル から約 3. 3 kb pの DNA断片のみを切り出し、 該ァガロース片 （約 0. l g ) を細かく粉砕し 1 m 1の TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロー スを完全に融解させた。 この 1解液に対してフエノ一ル Zクロロホルム抽出とェ 夕ノール沈澱を行った。 まず、 TE (ImMの EDTA · 2Naを含む 1 OmM のトリス塩酸水溶液； p H 8. 0 ) で飽和させたフエノール液 1 m 1を加え緩や かに攪拌した。 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） により水相と有機相を分 離し、 水相のみを分取した。 この操作を 3回繰り返した後、 得られた水相に上記 の TE飽和フエノール液 0. 4mlとクロ口ホルム 0. 4mlを加えて再び緩や かに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） により水相と有機相を 再度分離し、 水相のみを再分取した。 この水相にクロ口ホルム 0. 8mlを加え て再び緩やかに攪拌した後、 遠心分離 （3000 r pm · 10分間） により水相 と有機相を再度分離し、 水相のみを分取した。 この水相に 1. lMのNaC lを 含む TE溶液 80 a 1とエタノール 1. 7mlを加えて一 80°Cで 30分間放置 した後、 遠心分離 （15000 r pm' 20分間 · 4°C) により DNA断片の沈 殿を回収した。 該 DNA断片を風乾後、 最終的に 10 β 1の ΤΕに溶解した。
[実施例 84] ロドコッカス ロドクロウス J— 1株由来の二トリルヒドラター ゼを活性発現させる為の形質転換体の構築
実施例 82にて調製した E c o R I及び S c a Iにより切断された約 1. 3 k b pの DNA断片と実施例 83にて調製した Ec o R I及び E c o 47 IIIによ り切断された約 3. 3 kbpの DNA断片とを混合し、 DNA連結反応に供した 。 反応産物により大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質 転換し、 形質転換体 No. 200を得た。
50 OmLのバッフル付三角フラスコに 40 g/mLの硫酸第二鉄 ·七水和 物及び 10 fi gZmLの塩ィ匕コバルト ·六水和物を含む 100111]^のし8液体培 地を調製し、 121°C · 20分間のォ一トクレーブにより滅菌した。 この培地に 終濃度が 10 Ο gZmLとなるようにアンピシリンを添加した後、 形質転換体 No. 200を一白金耳植菌し、 37°C · 130 r pmにて約 20時間培養した 。 該培養終了液から遠心分離 （5000 GX 15分間） により該形質転換体を分 離した。 続いて、 分離した該形質転換体を 5 OmLの生理食塩水に再懸濁した後 に、 再度遠心分離 （5000 GX 15分間） により該形質転換体を分離した。 分離した該形質転換体 0. l gを 20mLの 50mMリン酸カリゥム水溶液 （ pH7. 0) に懸濁し、 これに 0. 5mLのアクリロニトリル又はメタァクリロ 二トリルを添加して 30°Cで緩やかに攪拌しながら 1時間反応させた。 反応終了 後、 HP LCを用いて反応終了液の分析を行った結果、 該液中には、 添加した二 トリル化合物 （アクリロニトリル又はメタアクリロニトリル） に相当するモル量 のアミド化合物 (アクリルアミド又はメ夕クリルアミド） のみが存在しており、 二トリル化合物 （アクリロニトリル又はメタクリロニトリル） 及び対応する有機 酸 （アクリル酸又はメ夕クリル酸） の存在は認められなかった。 すなわち、 転化 率及び選択率は 100%であった。
また、 分離した該形質転換体からアルカリ SDS抽出法によりプラスミドを調 製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37でで 1時間保温した後、 フエノール抽 出 Zクロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g_ i 1となるように TE溶液に溶解させた。 続いて、 AB I社製のシ 一クェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法 によって塩基配列を決定した。 その結果、 該プラスミドはその配列中に配列表の 配列番号 103記載の二トリルヒドラ夕一ゼ活性化蛋白質をコードする ORFと 配列表の配列番号 104記載のロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二卜 リルヒドラターゼをコードする OR Fとを含んでいる事が確認された。 このブラ スミドを P J 1H— DB 1 (図 2) と名付けた。
[実施例 85] 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼからの変異導入標的の抽出 （1) 改変方法の対象として、 ロドコッカス ロドクロウス J一 1株由来の二トリル ヒドラタ一ゼを例として用いた。 請求項 56から 62に記載された変異導入の標 的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、 標的の抽出を行った。 請求項 56、 57記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、 日立ソフト社製の DNAS I Sを用いた。 請求項 58から 62記載の特定方法に おけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、 ァク セルリス社製のモデラ一乃至ホモロジ一を用いた。
その結果、 何れの方法を用いた場合も、 抽出されたアミノ酸残基の中に、 該ニ トリルヒドラターゼを構成する 2種のポリペプチドの 1つである /3サブュニット のアミノ酸配列中の 48番目の Tr pが含まれていた。 そこで、 変異導入標的と して、 ロドコッカス ロドクロウス J— 1株由来の二トリルヒドラターゼの )3サ ブュニッ卜のアミノ酸配列中の 48番目の T r pを例として用いる事とした。
[実施例 86] 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼからの変異導入標的の抽出 （2) 改変方法の対象として、 シユードノカルディア.サ一モフイラ J CM3095 由来の二トリルヒドラターゼを例として用いた。 請求項 56から 62に記載され た変異導入の標的となるァミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、 標的の 抽出を行った。 請求項 56、 57記載の特定方法におけるアミノ酸配列のァライ ンメントには、 日立ソフト社製の DNAS I Sを用いた。 請求項 58から 62記 載の特定方法におけるアミノ酸配列のァラインメントに基づく立体構造のモデリ ングには、 アクセルリス社製のモデラ一乃至ホモロジ一を用いた。
その結果、 基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵 素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域に存在するァミノ酸残基として 抽出されたアミノ酸残基の内、 該ニトリルヒドラターゼを構成する 2種のポリべ プチドの 1つである αサブュニットのアミノ酸配列中の 36番目の Th r、 48 番目の As nを、 もう 1つのポリペプチドある ]3サブュニットのアミノ酸配列中 の 32番目の Va l、 33番目の Al a、 37番目の Phe、 40番目の Th r 、 41番目の Phe、 46番目の Me t、 48番目の Leu、 51番目の Phe 、 61番目の A l a、 72番目の Tr p、 112番目の Ly s、 1 18番目の P he、 127番目の Leuを、 各々変異導入標的の代表例として用いる事とした
[実施例 87] 改変前の二トリルヒドラターゼからの変異導入標的の抽出 （3) 改変方法の対象として、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095 由来の二トリルヒドラターゼを例として用いた。 請求項 56から 62に記載され た変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、 標的の 抽出を行った。 請求項 56、 57記載の特定方法におけるアミノ酸配列のァライ ンメン卜には、 日立ソフト社製の DNAS I Sを用いた。 請求項 58から 62記 載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリ ングには、 アクセルリス社製のモデラ一乃至ホモロジ一を用いた。
その結果、 2量体形成に関与する αサブュニッ卜と /3サブュニット間の会合界 面や 2量体同士の会合に関与する界面を形成する領域に存在するアミノ酸残基と して抽出されたアミノ酸残基の内、 該ニトリルヒドラ夕一ゼを構成する 2種のポ リペプチドの 1つであるひサブュニットのアミノ酸配列中の 36番目の Th r、 148番目の G l y、 188番目の Th r、 204番目の Va lを、 もう 1つの ポリペプチドある )3サブュニットのアミノ酸配列中の 10番目の Th r、 32番 目の Va l、 33番目の A l a、 112番目の Ly s、 118番目の Phe、 1 27番目の Leu、 146番目の Ar g、 150番目の A l a、 160番目の A r g、 168番目の Th r、 171番目の Ly s、 176番目の Ty r、 186 番目の Leu、 217番目の As p、 218番目の C y sを、 各々変異導入標的 の代表例として用いる事とした。
[実施例 88] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 (1) 二トリルヒドラ夕ーゼを構成するポリペプチドのァミノ酸配列に変異を導入す る為に、 宝酒造社製の 「LA PGR i n v i t r o mu t agene s i s K i tj を用いた部位特異的な変異導入を行った。 以後、 「： LA PGR i n' v i t r o mu t agene s i s Ki t」 を単にキットと呼ぶ。 以下の実施 例では、 基本的にキットの原理及び操作方法に従った。
実施例 84にて構築したロドコッカス ロドクロウス J— 1株由来の二トリル ヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプラスミド： p J 1 H-DB 1に、 実施 例 85にて抽出した変異導入標的である /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 48 番目の Tr pを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
10 n gの ρ J 1 H-DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 P C R反応 1は、 配列表の配列番号 110記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 n Lの系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニ 一リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰 り返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番 号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー RV (配列表の配列番号 109に 配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキッ卜に記載の 条件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
PCR反応 1及び 2の反応終了液各 5 iLを用いたァガロース電気泳動 （ァガ ロース濃度 1. 0重量％) により DNA増幅産物の分析を行ったところ、 何れも 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 Mi c r oc on l O O (宝酒造社製） を 用いてそれぞれの P C R反応終了液より過剰なフ。ライマー及び d NT Pを除去し た後、 TEを加えて各々 50 Lの溶液を調製した。 該 TE溶液を各 0.
ずつ含む全量 47. 5 のアニーリング溶液 （組成はキットに記載の条件によ る） を調製し、 熱変性処理 （98°C) を 10分間行った後、 37°Cまで 60分間 かけて一定の速度で冷却を行い、 続いて 37°Cで 15分間保持することによって アニーリング処理を行った。
ァニ一リング処理液に TaKaRa LA Taqを 0. 加えて 72°Cで
3分間加熱処理を行い、 ヘテロ 2本鎖を完成させた。 これに Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表 の配列番号 109に配列を記載） を各々 50 pmo 1加えて全量を 50 x Lとし た後、 熱変性 （98°C) 15秒 'アニーリング （55°C) 30秒'伸長反応 （7 2°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り返すことによる P C R反応 3を行った。
P CR反応 3の反応終了液 5 w Lを用いたァガロース電気泳動 （シグマ社製夕 イブ V I I低融点ァガロース使用；ァガロース濃度 0. 8重量％) により DNA 増幅産物の分析を行つたところ、 約 1. 9 k bの増幅 D N A産物の存在が確認で きた。 続いて、 ァガロースゲルから約 1. 9 kbの DNA断片のみを切り出し、 該ァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉砕し lmLの TE溶液に懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノ ール/クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って該 DNA断片を精製し、 最終 的に 10 /iLの TEに溶解した。
精製した約 1. 9 kbの増幅 DNA断片を制限酵素 Ec oRI及び H i ndlll により切断した後、 この制限酵素処理液に対してフエノール Zク口口ホルム抽出 とエタノール沈澱を行って該 DNA断片を精製し、 最終的に 10 Lの TEに溶 解した。 同様に、 Ec oRI及び H i n dillにより p J 1H— DB 1を切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガ ロース濃度 0. 7%) を行い、 ァガロースゲルから約 2. 7 kbのDNA断片の みを切り出した。 切りだしたァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉砕し lmL の TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガ口一スを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノールノクロロホルム抽出とエタノ一ル沈澱を行って該 DN A断片を精製し、 最終的に 1 O Lの TEに溶解した。
この様にして得られた約 1. 9 kbと約 2. 7 kbの DNA断片を DNA連結 反応に供した後、 大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質 転換し、 複数の形質転換体を得た。 該形質転換体から各々プラスミドを調製し、 RNa s eAを 3 加えて 37 °Cで 1時間保温した後、 フエノール抽出/ク ロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた。 続いて、 AB I社製のシークェ ンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつ て塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 P J 1H-DB 1と比 較して、 ロドコッカス ロドクロウス J— 1株由来の二トリルヒドラタ一ゼの β サブュニットのアミノ酸配列中の 48番目のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列が T r p以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に 変化したものである事が判明した。
下記の （表 121) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩墓配列の変化との対応を示す。
[表 121]
Figure imgf000197_0001
[実施例 89] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （2)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で あるひサブュニットのアミノ酸配列中の 36番目の Th rを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の PCR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 111記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4
(配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 z L の系 （組成はキットに記載 ©条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 /xLの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
PCR反応 1及び 2の反応終了液各 5 Lを用いたァガロース電気泳動 （ァガ ロース濃度 1. 0重量％) により DN A増幅産物の分析を行ったところ、 何れも 増幅 DN A産物の存在が確認できた。 M i c r o c on l O O (宝酒造社製） を 用いてそれぞれの P C R反応終了液より過剰なプライマ一及び d NT Pを除去し た後、 TEを加えて各々 50 _iLの溶液を調製した。 該 TE溶液を各 0. 5 zL ずつ含む全量 47. 5 Lのァニーリング溶液 （組成はキットに記載の条件によ る） を調製し、 熱変性処理 （98°C) を 10分間行った後、 37°Cまで 60分間 かけて一定の速度で冷却を行い、 続いて 37°Cで 15分間保持することによって ァニーリング処理を行った。
アニーリング処理液に TaKaRa LA Taqを 0. 5/xL加えて 72°Cで 3分間加熱処理を行い、 ヘテロ 2本鎖を完成させた。 これに Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表 の配列番号 109に配列を記載） を各々 50 pmo 1加えて全量を 50 Lとし た後、 熱変性 （98°C) 15秒 'アニーリング （55°C) 30秒'伸長反応 （7 2 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り返すことによる P C R反応 3を行つた。
PCR反応 3の反応終了液 5 /xLを用いたァガロース電気泳動 （シグマ社製夕 イブ VI I低融点ァガ口一ス使用；ァガロース濃度 0. 8重量％) により DNA 増幅産物の分析を行つたところ、 約 1. 9 k bの増幅 D N A産物の存在が確認で きた。 続いて、 ァガロースゲルから約 1. 9 kbの DNA断片のみを切り出し、 該ァガ口一ス片 （約 0. l g) を細かく粉砕し lmLの TE溶液に懸濁後、 55 °Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 この融解液に対してフエノ ール Zク口口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って該 D N A断片を精製し、 最終 的に 10 /iLの TEに溶解した。
精製した約 1. 9 kbの増幅 DNA断片を制限酵素 Ec oRI及び H i ndlll により切断した後、 この制限酵素処理液に対してフエノール /クロロホルム抽出 とエタノール沈澱を行って該 DNA斬片を精製し、 最終的に 10 乙の丁£に溶 解した。 同様に、 E c oRI及び H i n dillにより pPT— DB 1を切断し、 ァ 4
ガロースゲル電気泳動 （シグマ社製タイプ VI I低融点ァガロース使用；ァガロ —ス濃度 0. 7%) を行い、 ァガロースゲルから約 2. 7 kbのDNA断片のみ を切り出した。 切りだしたァガ口一ス片 （約 0. 1 g) を細かく粉砕し lmLの TE溶液に懸濁後、 55°Cで 1時間保温してァガロースを完全に融解させた。 こ の融解液に対してフエノール/クロ口ホルム抽出とエタノール沈澱を行って該 D NA断片を精製し、 最終的に 10 Lの TEに溶解した。
この様にして得られた約 1. 9 kbと約 2. 7 kbの DNA断片を DNA連結 反応に供した後、 大腸菌 HB 101のコンビテントセル （東洋紡績社製） を形質 転換し、 複数の形質転換体を得た。 該形質転換体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37 °Cで 1時間保温した後、 フエノール抽出/ク ロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 gZ/ 1となるように TE溶液に溶解させた。 続いて、 AB I社製のシークェ ンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつ て塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼのひサブュニットのアミノ酸配列中の 36番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Th r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 122) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 122 ]
アミノ酸'酉 3列の変化 塩基配 の変化 番号 変異箇所
変異導入前 変異導入後 変異導入前 変異導入後
No. 40 α- 36番目 Th r Me t a c g a t g
No. 40 a α- 6番目 Th r S e r a c g t c g
No. 40 b α-36番目 Th r A 1 a a c g g c g
No. 40 c α-36番目 Th r G 1 y a c g g gg
No. 40 d α- 36番目 Th r T r p a c g t g g [実施例 90] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （3)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕ーゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で あるひサブュニットのアミノ酸配列中の 48番目の As nを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 112記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 fiL の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zクロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. O /igZ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディアサ一乇フイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの αサブュニットのアミノ酸配列中の 48番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が As n以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 123) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 · ¾1基配列の変化との対応を示す。 4
[表 123]
Figure imgf000201_0001
[実施例 91] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （4)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディアサーモフ イラ J CM 3095由来の二トリルヒドラタ一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある αサブュニットのアミノ酸配列中の 71番目の A r gを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
1 Ongの pPT_DB 1を鍀型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 113記載のプライマ一 ¾:び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニ一 リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び] VII 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 / Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 / g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. O ig/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB lと比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 71番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が A r g以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 124) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 124]
Figure imgf000202_0001
[実施例 92] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （5)
実施例 83にて MT 10822より調製したシュ一ドノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラタ一ゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で あるひサブュニットのアミノ酸配列中の 148番目の G 1 yを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
1 Ongの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 114記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 /x L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒*ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー (配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ^iLの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 X g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/クロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 a g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ Jモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの αサブュニッ卜のアミノ酸配列中の 148番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が G 1 y以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 125) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所'.アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
125]
Figure imgf000203_0001
[実施例 93] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （6)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディアサ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： 丁ー081に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある αサブュニットのアミノ酸配列中の 188番目の Th rを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10118の ？丁ー081を铸型として2種類の？。1^反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 115記載のプライマー及び M 13プライマ一 M 4
(配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニ一 リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （7 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 μ Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/ク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 iig/ a \となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼのひサブュニッ卜のアミノ酸配列中の 188畚目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Th r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 126) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
126]
Figure imgf000204_0001
[実施例 94] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （7)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある αサブュニットのアミノ酸配列中の 204番目の V a 1を他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT—DB lを铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 116記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒*ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 t Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 n g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/クロロホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 P PT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの αサブュニットのアミノ酸配列中の 204番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が V a 1以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 127) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 127]
Figure imgf000205_0001
[実施例 95 ] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （ 8 ) 実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二卜リルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 10番目の Th rを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の: P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 117記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ^ L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98で） 15秒*ァニ一 リング （55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの j3サブュニットのアミノ酸配列中の 10番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Th r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 128) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 128]
Figure imgf000207_0001
[実施例 96] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （9)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラタ一ゼをコ一ドする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある 3サブュニットのアミノ酸配列中の 32番目の V a 1を他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 n gの p PT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 118記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4
(配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒*ァニー リング （55 ） 30秒 ·伸長反応 （72 ） 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 xLの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出ノク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 /ig//i 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの 3サブュニットのアミノ酸配列中の 32番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が V a 1以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 129) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
129]
Figure imgf000208_0001
[実施例 97] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （10)
実施例 83にて MT 10822より調製したシ ードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする〇RFを含むプ ラスミド： ？丁ー0：61に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニットのアミノ酸配列中の 33番目の A 1 aを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10ngの pPT—DB lを铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 119記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4
(配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 x L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒*ァニ一 リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの サブュニットのアミノ酸配列中の 33番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が A 1 a以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 130) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 130 ]
Figure imgf000209_0001
[実施例 98] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （11)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕ーゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 37番目の P h eを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 n gの p PT— DB 1を銬型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 120記載のプライマー及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号 1 0 7に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒 ·ァニー リング （ 5 5 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 7 2 °C) 2分間の条件を 2 5サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 1 08に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 1 0 9に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 8 9と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 3 0 g加えて 3 7°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 ii g/β 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一3 7 3 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM30 9 5由来の二トリルヒド ラタ一ゼの j3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 3 7番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Ph e以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 1 3 1) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 1 3 1] アミノ酸酉 3列の変化 塩基配 1Jの変化 番号 変異箇所
変異導入前 変異導入後 変異導入前 変異導入後
No. 54 j8-37番目 Ph e Th r t t c a c c
No. 55 - 37番目 Ph e A 1 a t t c g c c
No. 56 |3-37番目 P h e Le u t t c e t c
No. 57 β - 37番目 Phe I 1 e t t c a t e
No. 58 |8-37番目 Ph e Va 1 t t c g t c [実施例 99] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 (12)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある ]3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 40番目の Th rを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 121記載のプライマー及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニ一 リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。 '
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 zg//i 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製の.シークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM 3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 40番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Th r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 132) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 [表 132]
Figure imgf000212_0001
[実施例 100] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （13)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕ーゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニットのアミノ酸配列中の 41番目の P heを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を錶型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 122記載のプライマー及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 β g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出ノク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。 その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サーモフイラ J CM30 9 5由来の二トリルヒド ラターゼの /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 41番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Ph e以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 1 3 3) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 1 33]
Figure imgf000213_0001
[実施例 1 0 1] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （14)
実施例 8 3にて MT 1 0822より調製したシュ一ドノカルディアサーモフ イラ J CM30 9 5由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニットのアミノ酸配列中の 46番目の Me tを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
1 0 n gの p PT—DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 1 2 3記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M4 (配列表の配列番号 1 0 7に配列を記載） を各々 5 0 p m o 1含む全量 5 0 L の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒 ·ァニー リング （5 5で） 30秒 ·伸長反応 （7 2°C) 2分間の条件を 2 5サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 /Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/クロロホ ム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 1となるように ΤΕ溶液に溶解させた
。 続いて、 ΑΒ I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一373 Αを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの j3サブュニットのアミノ酸配列中の 46番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Me t以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 134) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 134]
Figure imgf000214_0001
[実施例 102] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （15)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディアサ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で 00雇 6014
ある j3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 48番目の L e uを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 124記載のプライマー及び Ml 3プライマー M4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニ一 リング （55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/ク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g_ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。 '
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディアサ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの /3サブュニットのアミノ酸配列中の 48番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が L e u以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 135) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 P T/JP2003/016014
[表 135]
Figure imgf000216_0001
[実施例 103] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （16)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラタ一ゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 51番目の Ph eを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P C R反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 125記載のプライマ一及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m ο 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'了ニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/ク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. O gZ i 1となるように TE溶液に溶解させた 4
。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 ？下ー081と比較 して、 シュ一ドノカルディアサ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの j3サブュニットのアミノ酸配列中の 51番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が Ph e以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 136) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 136]
Figure imgf000217_0001
[実施例 104] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （17)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB !U;:、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 61番目の A 1 aを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を鍀型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 126記載のプライマ一及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m ο 1含む全量 50 L の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニ一 リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72で） 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー (配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 ALの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37 で 1時間 保温した後、 フエノール抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ii 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの j3サブュニットのアミノ酸配列中の 61番目のアミノ酸をコードする コドンに相当する塩基配列が A 1 a以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 137) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 137]
Figure imgf000218_0001
[実施例 105] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （18)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で JP2003/016014
ある /3サブュニットのアミノ酸配列中の 72番目の T r pを他のアミノ酸に変換 する為の変異導入を施した。
10118の ？丁ー081を錡型として2種類の？。1反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 127記載のプライマ一及び M 13プライマー M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 /2 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 zLの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 ？丁ー081と比較 して、 シュ一ドノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの i3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 72番目のアミノ酸をコードする コドンに.相当する塩基配列が T r p以外のアミノ酸をコードするコドンに相当す る塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 138) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 4
[表 138]
Figure imgf000220_0001
[実施例 106] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （19)
実施例 83にて MT10822より調製したシュ一ドノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコ一ドする OR Fを含むプ ラスミド： 丁ー081に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 112番目の Ly sを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 128記載のプライマー及び Μ 13プライマー Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m ο 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニ一 リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 n g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出ノクロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. O igZ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド P T/JP2003/016014
ラタ一ゼの j8サブュニットのアミノ酸配列中の 112番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Ly s以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 139) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 139]
Figure imgf000221_0001
[実施例 107] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （20)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニットのアミノ酸配列中の 118番目の P heを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を鐯型として 2種類の P C R反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 129記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 ^ L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒*ァニー リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 /2 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/ク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該
DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの /3サブユニットのアミノ酸配列中の 118番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Ph e以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 140) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 140]
Figure imgf000222_0001
[実施例 108] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （21)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある) 3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 127番目の L e uを他のアミノ酸に変 換する為の孪異導入を施した。
1 Ongの pPT— DB 1を錡型として 2種類の P C R反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 130記載のプライマー及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 p m o 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98 ） 15秒*ァニー 16014
リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 /X g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. O g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとォ一トシ一クェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの) 3サブュニットのアミノ酸配列中の 127番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Le u以外のアミノ酸をコ一ドするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 141) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 141]
Figure imgf000223_0001
[実施例 109] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （22)
実施例 83にて MT 10822より調製したシュ一ドノカルディアサ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 146番目の A r gを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
1 O ngの pPT—DB lを錡型として 2種類の PCR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 131記載のプライマー及び Ml 3プライマー M4 (配列表の配列番号 10 Ίに配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニ一 リング （ 55 °C) 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出 Zク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB lと比較 して、 シュ一ドノカルディア サーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの i3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 146番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Ar g以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 142) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 P T/JP2003/016014
[表 142]
Figure imgf000225_0001
[実施例 110] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （23)
実施例 83にて MT 10822より調製したシュ一ドノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 1 50番目の A 1 aを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 132記載のプライマ一及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号 1 0 7に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 5 O L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'了ニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。 ' 以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 /2 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一 3 7 3 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 13 ?丁ー0 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの i3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 150番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が A 1 a以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 143) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 143 ]
Figure imgf000226_0001
[実施例 111] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （24)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： ？丁ー081に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある i8サブュニットのアミノ酸配列中の 160番目の Ar gを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
1 Ongの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 133記載のプライマー及び Μ 13プライマー Μ 4
(配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニ一 リング （55°C) 30秒'伸長反応 （72 ） 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマー R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50/ Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 /X g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/クロロホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該
DNAを精製し、 最終的に 1. 0 ig/ i 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 P PT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの j3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 160番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が A r g以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記め （表 144) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 144]
Figure imgf000227_0001
[実施例 112] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （25)
実施例 83にて MT10822より調製したシユードノカルディアサ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある ]3サブュニットのアミノ酸配列中の 168番目の Th rを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10 ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 134記載のプライマー及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニ一 リング （55 °C) 30秒.伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 10 &に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） -を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/ク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 ig//x 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの 3サブュニットのアミノ酸配列中の 168番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Th r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 145) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 ；
[表 145]
Figure imgf000228_0001
[実施例 113] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （26)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB !U 、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある ]3サブュニットのアミノ酸配列中の 171番目の Ly sを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
1 0 n gの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 1 3 5記載のプライマ一及び Ml 3プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 1 07.に配列を記載） を各々 5 0 pmo 1含む全量 50 /x L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （9 8°C) 1 5秒 ·ァニー リング （5 5°C) 30秒 ·伸長反応 （7 2°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 1 0 8に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 1 0 9に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 8 9と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 w g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出 Zクロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 gZii 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とオートシークェンサ一 3 7 3 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM30 9 5由来の二トリルヒド ラタ一ゼの /3サブユニットのアミノ酸配列中の 1 7 1番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Ly s以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 146) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 1 46] アミノ酸酉己列の変化 塩基配 11の変化 番号 変異箇所
変異導入前 変異導入後 変異導入前 変異導入後
No. 88 d β— 171番目 L y s a a g A 1 a g c g [実施例 114] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （27)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラ夕一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある /3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 176番目の Ty rを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を錡型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 136記載のプライマー及び Ml 3プライマー M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50pmo l含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒 ·ァニー リング （ 55 ） 30秒 ·伸長反応 （ 72 °C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 mo 1含む全量 50 Lの系，（組成はキッ卜に記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Aを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 ブエノ一ル抽出 Zク口口ホルム抽出及びエタノ一ル沈殿によつて該 QNAを精製し、 最終的に 1. 0 /igZ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキッ卜とォ一卜シークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 pPT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディア サ一モフイラ J CM 3095由来の二トリルヒド ラターゼの j8サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 176番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Ty r以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 147) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 [¾147]
Figure imgf000231_0001
[実施例 115] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （28)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディア サ一モフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラタ一ゼをコードする OR Fを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある i3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 186番目の L e uを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P CR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 137記載のプライマー及び Μ 13プライマー Μ 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキッ卜に記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT 4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び M 13プライマ一 R V (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 の系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s eAを 30 n g加えて 3 で 1時間 保温した後、 フエノール抽出 Ζクロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 gZ 1となるように ΤΕ溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によって塩基配列を決定した。 その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフィラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの /3サブュニットのアミノ酸配列中の 186番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が L e u以外のアミノ酸をコ一ドするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 148) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 148]
Figure imgf000232_0001
[実施例 116] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （29)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディア サーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする ORFを含むプ ラスミド： pPT— DB 1に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある ]3サブュニッ卜のアミノ酸配列中の 217番目の As pを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10ngの pPT— DB 1を铸型として 2種類の P C R反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 138記載のプライマ一及び Μ 13プライマ一 Μ 4 (配列表の配列番号 1 0 7に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 L の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55 ） 30秒 ·伸長反応 （72°C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマー （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマー RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作により行った。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s. e Aを 30 n g加えて 37でで 1時間 保温した後、 フエノ一ル抽出/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によつて該 DNAを精製し、 最終的に 1. 0 g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシ一クェンシングキットとオートシークェンサ一 373 Aを用いたダイデオキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 1 ?丁ー081と比較 して、 シュ一ドノカルディア サ一モフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラターゼの /3サプュニッ卜のアミノ酸配列中の 217番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が As p以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 149) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 ·アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。
[表 149] アミノ酸酉 3列の変化 塩基配 1Jの変化 番号 変異箇所
変異導入前 変異導入後 変異導入前 変異導入後
No. 96 /3-217番目 As G 1 y g a c g g c
No. 96 a /3-217番目 As Va 1 g a c g t c
No. 96b - 217番目 As Leu g a c e t c
No. 96 c /3 - 217番目 As Me t g a c a t g
No. 96 d /3-217番目 As p Cy s g a c t g t
No. 96 e β-217番目 As p S e r g a c age
No. 96 f )3-217番目 As Th r g a c a c c
No. 96 g /3-217番目 As p H i s g a c c a c [実施例 117] 改変酵素獲得を目的とした変異導入 （30)
実施例 83にて MT 10822より調製したシユードノカルディアサーモフ イラ J CM3095由来の二トリルヒドラターゼをコードする〇RFを含むプ ラスミド： 丁ー081に、 実施例 86又は 87にて抽出した変異導入標的で ある; 8サブュニットのアミノ酸配列中の 218番目の Cy sを他のアミノ酸に変 換する為の変異導入を施した。
10 n gの p PT— DB 1を铸型として 2種類の PCR反応を行った。 PCR 反応 1は、 配列表の配列番号 139記載のプライマ一及び M 13プライマ一 M 4 (配列表の配列番号 107に配列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 nL の系 （組成はキットに記載の条件による） で、 熱変性 （98°C) 15秒'ァニー リング （55°C) 30秒 ·伸長反応 （72 C) 2分間の条件を 25サイクル繰り 返す事により行った。 PCR反応 2は、 MUT4プライマ一 （配列表の配列番号 108に配列を記載） 及び Ml 3プライマ一 RV (配列表の配列番号 109に配 列を記載） を各々 50 pmo 1含む全量 50 Lの系 （組成はキットに記載の条 件による） で、 PCR反応 1と同様の操作 Jこより行 όた。
以後、 実施例 89と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。 該形質転換 体から各々プラスミドを調製し、 RNa s e Αを 30 g加えて 37°Cで 1時間 保温した後、 フエノール抽出/クロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿によって該 DNAを精製し、 最終的に 1. O g/ 1となるように TE溶液に溶解させた 。 続いて、 AB I社製のシークェンシングキットとオートシークェンサ一373 Aを用いたダイデォキシ法によつて塩基配列を決定した。
その結果、 得られた形質転換体の有するプラスミドは、 p PT— DB 1と比較 して、 シユードノカルディアサーモフイラ J CM3095由来の二トリルヒド ラタ一ゼの i3サブュニットのアミノ酸配列中の 218番目のアミノ酸をコードす るコドンに相当する塩基配列が Cy s以外のアミノ酸をコードするコドンに相当 する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の （表 150) に、 得られた形質転換体の番号と変異箇所 'アミノ酸配列 の変化 ·塩基配列の変化との対応を示す。 [表 150]
Figure imgf000235_0001
[実施例 118] 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼと改変後の改変酵素との形質比 較 (1)
50 OmLのバッフル付三角フラスコに 40 n g/mLの硫酸第二鉄 ·七水和 物及び 10 I gZmLの塩ィ匕コバルト ·六水和物を含む 100111しのし8液体培 地を 5つ調製し、 121°C · 20分間のオートクレープにより滅菌した。 各々の 培地に終濃度が 100 g/mLとなるようにアンピシリンを添加した。
各々の培地に実施例 84にて得られた形質転換体 N o. 200と実施例 88に て得られた形質転換体 No. 201から 204の計 5種類の形質転換体を 1種類 ずつ各々 5つの培地に一白金耳植菌した。 37°C · 130 r pmにて約 20時間 培養した後、 各々の培養終了液から遠心分離 （5000 GX 15分間） により各 形質転換体を分離した。 続いて、 分離した各形質転換体を 5 OmLの生理食塩水 に各々再懸濁した後に、 再度遠心分離 （5000 GX 15分間） により各形質転 換体を分離した。
各形質転換体 0. 1 gを 2 OmLの 5 OmMリン酸カリウム水溶液 （pH7. 0) に各々懸濁した後、 10mLX2本に分注した。 従って各形質転換体当り 2 本、 合計 10本の懸濁液が準備された。 各形質転換体の懸濁液の 1本には 1 mL のアクリロニトリルを、 もう 1本にはメタアクリロニトリルを添加して、 30°C で緩やかに攪拌しながら 10分間反応させた。
反応終了後、 HP LCを用いて各反応終了液の分析を行った結果、 各液中には 反応しきれなかった基質である二トリル化合物 （アタリロニトリル又はメタクリ ロニトリル) と、 反応によって生じた生成物である対応するアミド化合物 (ァク リルアミド又はメタクリルアミド） とが存在していた。 尚、 対応する有機酸 （ァ P T/JP2003/016014
クリル酸又はメタクリル酸） の存在は認められなかった。
各形質転換体ごとに、 ァクリロ二トリルを基質とする反応で生成したアクリル アミドとメタクリロ二トリルを基質とする反応で生成したメ夕クリルアミドとの モル比を比較した結果、 下記の （表 151) に示す様な違レ が観察された。 ァク リロ二トリルとメタクリロニトリルを比較した場合、 メタクリロニトリルの方が 嵩高い二トリル化合物である事から、 この結果は、 より嵩高い基寳を水和し易く なつた改変酵素が得られた事を示している。
[表 151 ]
Figure imgf000236_0001
[実施例 119] 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼと改変後の改変酵素との形質比 較 （2)
500 m Lのバッフル付三角フラスコに 40 g/mLの硫酸第二鉄 ·七水和 物及び 10 gZmLの塩ィ匕コバルト ·六水和物を含む 100011^のし8液体培 地を 57つ調製し、 121°C · 20分間のオートクレープにより滅菌した。 各々 の培地に終濃度が 100 gZmLとなるようにアンピシリンを添加した。
が 100 g/mLとなるようにアンピシリンを添加した。
各々の培地に、 p PT— DB 1により HB 101を形質転換して得られた形質 転換体 No. 0と実施例 89から 117にて得られた形質転換体の内、 No. 4 0、 No. 40 e、 No. 40 f、 No. 42、 No. 42 a, No. 43、 N o. 44、 No. 45、 No. 46、 No. 47、 No. 48、 No. 49、 N o. 50、 No. 51、 No. 52、 No. 54、 No. 55、 No. 56、 N o. 57、 No. 58、 No. 59、 No. 60、 No. 61、 No. 62、 N o. 63、 No. 64、 No. 65、 No. 66、 No. 6.7、 No. 68、 N o. 69、 No. 70、 No. 71、 No. 72、 No. 73、 No. 74、 N o. 75、 No. 76、 No. 77、 No. 78、 No. 79、 No. 80、 N o. 81、 No. 82、 No. 83、 No. 84、 No. 85、 No. 87、 N o. 88、 No. 89、 No. 90、 No. 91、 No. 92、 No. 93、 No. 94、 No. 95の計 56種類の形質転換体を 1種類ずつを各々の培地に一 白金耳植菌した。 37°C · 130 r pmにて約 20時間培養した後、 各々の培養 終了液から遠心分離 （5000 GX 15分間） により各形質転換体を分離した。 続いて、 分離した各形質転換体を 5 OmLの生理食塩水に各々再懸濁した後に、 再度遠心分離 （5000 GX 15分間） により各形質転換体を分離した。
各形質転換体 0. 1 gを 2 OmLの 5 OmMリン酸カリウム水溶液 (pH7. 0) に各々懸濁した後、 1 OmLX 2本に分注した。 従って各形質転換体当り 2 本、 合計 10本の懸濁液が準備された。 各形質転換体の懸濁液の 1本には ImL のアクリロニトリルを、 もう 1本にはメタアクリロニトリルを添加して、 20°C で緩やかに攪拌しながら 10分間反応させた。
反応終了後、 HP LCを用いて各反応終了液の分析を行った結果、 各液中には 反応しきれなかった基質である二卜リル化合物 （ァクリロニトリル又はメタクリ ロニトリル） と、 反応によって生じた生成物である対応するアミド化合物 （ァク リルアミド又はメ夕クリルアミド） とが存在していた。 尚、 対応する有機酸 （ァ クリル酸又はメ夕クリル酸） の存在は認められなかった。
各形質転換体ごとに、 ァクリロ二トリルを基質とする反応で生成したアクリル アミドとメタクリロニトリルを基質とする反応で生成したメタクリルアミドとの モル比を比較した結果、 下記の （表 152) (表 153) (表 154) に示す様 な多様性が観察された。 アクリロニトリルとメタクリロニトリルの嵩高さを比較 した場合、 メタクリロニトリルの方が嵩高い二トリルィヒ合物である。 この結果は 、 改変前の二トリルヒドラ夕一ゼと比較して、 基質特異性の変化した改変酵素が 得られた事を示している。 [表 152] 合] 場合]
Figure imgf000238_0001
1 5 3 ]
Figure imgf000239_0001
[表 1 5 4 ]
Figure imgf000240_0001
産業上の利用可能性 本発明は、 生体触媒を用いた物質生産の分野に於いて有用である。 その例とし ては、 二トリルヒドラターゼと呼称される酵素乃至該酵素を活性発現する生体を 触媒とする二トリル化合物の水和によって対応するアミド化合物に転換する物質 生産を挙げる事が出来る。

Claims

請 求 の 範 囲
1. αサブユニットと) 8サブュニッ卜とを有する二トリルヒドラ夕一ゼにおい て、
前記 サブユニットが、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸配列の 36番目、 7 1番目、 148番目及び 204番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他 のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有することを特徴とする二トリルヒドラ夕 ~~セ
2. 前記 サブユニットのアミノ酸配列の 6番目、 19番目、 38番目、 77 番目、 90番目、 102番目、 106番目、 126番目、 130番目、 142番 目、 146番目、 187番目、 194番目及び 203番目のアミノ酸の何れか一 つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項 1に記載の二トリ ルヒドラ夕一ゼ。
3. 前記 ^サブュニッ卜が配列表の配列番号： 2のアミノ酸配列を有する請求 項 1または 2に記載の二トリルヒドラターゼ。
4. 前記 ySサブユニットのアミノ酸配列の 10番目、 32番目、 37番目、 4 1番目、 46番目、 48番目、 5,1番目、 72番目、 1 18番目、 127番目、 146番目、 160番目、 1 86番目及び 217番目のアミノ酸の何れか一つ以 上のアミノ酸が他のアミノ酸にさらに脣換されている請求項 3に記載の二トリル ヒドラターゼ。
5. 前記Sサブユニットのアミノ酸配列の 20番目、 21番目、 108番目、 200番目及び 212番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ 酸に更に置換されている請求項 4に記載の二トリルヒドラターゼ。
6. 前記；8サブュニット及び前記 αサブュニッ卜の少なくとも一方の有する前 記アミノ酸配列の前記アミノ酸置換位置以外の位置において 1個または数個のァ ミノ酸が、 二トリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、 挿入または削 除されている請求項 1〜 5に記載の二トリルヒドラ夕一ゼ。
7. サブュニットと jSサブュニットとを有する二トリルヒドラ夕一ゼにおい て、 βサブュニットが、 配列表の配列番号： 2のァミノ酸配列の 10番目、 32番 目、 37番目、 41番目、 46番目、 48番目、 51番目、 72番目、 118番 目、 127番目、 146番目、 160番目、 186番目及び 217番目のァミノ 酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する ことを特徴とする二トリルヒドラ夕一ゼ。
8. 前記 サブユニットのアミノ酸配列の 20番目、 21番目、 108番目、 200番目及び 212番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ 酸に更に置換されている請求項 7に記載の二トリルヒドラ夕ーゼ。
9. 前記 αサブュニットが、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸配列を有する請 求項 7または 8に記載の二トリルヒドラターゼ。
10. 前記 サブユニットの 36番目、 71番目、 148番目及び 204番目 のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている請求項 9に記載の二トリルヒドラターゼ。
11. 前記 サブユニットのアミノ酸配列の 6番目、 19番目、 38番目、 7 7番目、 90番目、 102番目、 106番目、 126番目、 130番目、 142 番目、 146番目、 187番目、 194番目及び 203番目のアミノ酸の何れか —つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項 10に記載の二 トリルヒドラターゼ。
12. 前記 サブュニッ卜及び前記; 8サブュニットの少なくとも一方有する前 記アミノ酸配列の前記アミノ酸置換位置以外の位置において、 1個または数個の アミノ酸が、 二トリルヒドラタ一ゼ活性が損なわれない範囲で置換、 挿入または 削除されている請求項 7〜 11に記載の二トリルヒドラ夕一ゼ。
13. 二トリルヒドラターゼの サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺 伝子において、
前記アミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸配列の 36番目、 71 番目、 148番目及び 204番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他の アミノ酸に置換したアミノ酸配列であることを特徴とする遺伝子。
14. 前記アミノ酸配列の 6番目、 19番目、 38番目、 77番目、 90番目 、 102番目、 106番目、 126番目、 130番目、 142番目、 146番目 、 187番目、 194番目及び 203番目のアミノ酸の何れか一つ以上のァミノ 酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項 13に記載の遺伝子。
15. 前記 サブュニッ卜のアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラターゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 13または 14に記載 の遺伝子。
16. 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 106番目から 108番目、 211 番目から 213番目、 442番目から 444番目及び 610番目から 612番目 の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有す る請求項 13に記載の遺伝子。
17. 前記塩基配列の 16番目から 18番目、 55番目から 57番目； 112 番目から 114番目、 229番目から 231番目、 268番目から 270番目、
304番目から 306番目、 316番目から 318番目、 376番目から 378 番目、 388番目から 390番目、 424番目から 426番目、 436番目から
438番目、 559番目から 561番目、 580番目から 582番目及び 607 番目から 609番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換さ れている請求項 16に記載の遺伝子。
18. 二トリルヒドラタ一ゼの/?サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺 伝子において、
前記アミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 2のアミノ酸配列の 10番目、 32 番目、 37番目、 41番目、 46番目、 48番目、 51番目、 72番目、 118 番目、 127番目、 146番目、 160番目、 186番目及び 217番目のアミ ノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列である 遺伝子。
19. 前記アミノ酸配列の 20番目、 21番目、 108番目、 200番目及び 212番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換さ れている請求項 18に記載の遺伝子。
20. 前記Sサブュニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラ夕ーゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 18または 19に記載 の遺伝子。
21. 配列表の配列番号： 4記載の塩基配列の 28番目から 30番目、 94番 目から 96番目、 109番目から 111番目、 121番目から 123番目、 13 6番目から 138番目、 142番目から 144番目、 151番目から 153番目 、 214番目から 216番目、 352番目から 354番目、 379番目から 38 1番目、 436番目から 438番目、 478番目から 480番目、 556番目か ら 558番目及び 649番目から 651番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の 塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項 18に記載の遺伝子。
22. 前記塩基配列の 58番目から 60番目、 61番目から 63番目、 322 番目から 324番目、 598番目から 600番目及び 634番目から 636番目 の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項 21に 記載の遺伝子。
23. 二トリルヒドラターゼの サブュニットのアミノ酸配列をコードする遺 伝子と )3サブユニットのァミノ酸配列をコードする遺伝子とを有する二トリルヒ ドラターゼをコードする遺伝子において、
前記 サブュニットのアミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸配列 の 36番目、 71番目、 148番目及び 204番目のアミノ酸の何れか一つ以上 のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列であることを特徴とする遺伝 子。
24. 前記 αサブユニットのアミノ酸配列の 6番目、 19番目、 38番目、 7 7番目、 90番目、 102番目、 106番目、 126番目、 130番目； 142 番目、 146番目、 187番目、 194番目及び 203番目のアミノ酸の何れか —つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項 23に記載の遺 伝子。
25. 前記 サブュニッ卜のアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラ夕一ゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 23または 24に記載 の遺伝子。
2 6 . 前記 αサブュニッ卜のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、 配列表の配 列番号： 3の塩基配列の 1 0 6番目から 1 0 8番目、 2 1 1番目から 2 1 3番目 、 4 4 2番目から 4 4 4番目及び 6 1 0番目から 6 1 2番目の何れか一つ以上の 塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項 2 3に記載 の遺伝子。
2 7 . 前記塩基配列の 1 6番目から 1 8番目、 5 5番目から 5 7番目、 1 1 2 番目から 1 1 4番目、 2 2 9番目から 2 3 1番目、 2 6 8番目から 2 7 0番目、
3 0 4番目から 3 0 6番目、 3 1 6番目から 3 1 8番目、 3 7 6番目から 3 7 8 番目、 3 8 8番目から 3 9 0番目、 4 2 4番目から 4 2 6番目、 4 3 6番目から
4 3 8番目、 5 5 9番目から 5 6 1番目、 5 8 0番目から 5 8 2番目及び 6 0 7 番目から 6 0 9番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換さ れている請求項 2 6に記載の遺伝子。
2 8 . 前記 サブュニットのァミノ酸配列が配列表の配列番号： 2のアミノ酸 配列である請求項 2 3〜 2 7のいずれかに記載の遺伝子。
2 9 . 前記^サブュニットのァミノ酸配列が、 前記配列番号： 2のアミノ酸配 列の 1 0番目、 3 2番目、 3 7番目、 4 1番目、 4 6番目、 4 8番目、 5 1番目 、 7 2番目、 1 1 8番目、 1 2 7番目、 1 4 6番目、 1 6 0番目、 1 8 6番目及 び 2 1 7番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した アミノ酸配列である請求項 2 3〜2 7のいずれかに記載の遺伝子。
3 0 . 前記 サブユニットのアミノ酸配列の 2 0番目、 2 1番目、 1 0 8番目 、 2 0 0番目及び 2 1 2番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミ ノ酸に更に置換されている請求項 2 9に記載の遺伝子。
3 1 . 前記 サブュニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラ夕ーゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 2 9または 3 0に記載 の遺伝子。
3 2 . 前記 )8サブュニットのァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子が、 配列表の配 列番号： 4の塩基配列を有する請求項 2 8に記載の遺伝子。
3 3 . 前記8サブュニッ卜のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、 配列表の配 列番号： 4記載の塩基配列の 28番目から 30番目、 94番目から 96番目、 1 09番目から 111番目、 121番目から 123'番目、 136番目から 138番 目、 142番目から 144番目、 151番目から 153番目、 214番目から 2 16番目、 352番目から 354番目、 379番目から 381番目、 436番目 から 438番目、 478番目から 480番目、 556番目から 558番目及び 6 49番目から 651番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して 得られる塩 配列を有する請求項 29に記載の遺伝子。
34. 前記塩基配列の 58番目から 60番目、 61番目から 63番目、 322 番目から 324番目、 598番目から 600番目及び 634番目から 636番目 の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項 33に 記載の遺伝子。
35. 二トリルヒドラタ一ゼの αサブュニットのアミノ酸配列をコードする遺 伝子と ^サブュニットのアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子とを有する二トリルヒ ドラターゼをコードする遺伝子において、
前記 jSサブユニットのアミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 2のアミノ酸配列 の 10番目、 32番目、 37番目、 41番目、 46番目、 48番目、 51番目、 72番目、 118番目、 127番目、 146番目、 160番目、 186番目及び 2ュ 7番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したァ ミノ酸配列であることを特徴とする遺伝子。
36. 前記アミノ酸配列の 20番目、 21番目、 108番目、 200番目及び 212番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換さ れている請求項 35に記載の遺伝子。
37. 前記) 3サブュニッ卜のアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラ夕一ゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 35または 36に記載 の遺伝子。
38. 前記 ySサブュニッ卜のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、 配列表の 配列番号： 4記載の塩基配列の 28番目から 30番目、 94番目から 96番目、 109番目から 111番目、 121番目から 123番目、 136番目から 138 番目、 1 4 2番目から 1 4 4番目、 1 5 1番目から 1 5 3番目、 2 1 4番目から 2 1 6番目、 3 5 2番目から 3 5 4番目、 3 7 9番目から 3 8 1番目、 4 3 6番 目から 4 3 8番目、 4 7 8番目から 4 8 0番目、 5 5 6番目から 5 5 8番目及び 6 4 9番目から 6 5 1番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換し て得られる塩基配列を有する請求項 3 5に記載の遺伝子。
3 9 . 前記塩基配列の 5 8番目から 6 0番目、 6 1番目から 6 3番目、 3 2 2 番目から 3 2 4番目、 5 9 8番目から 6 0 0番目及び 6 3 4番目から 6 3 6番目 の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項 3 8に 記載の遺伝子。
0 . 前記 サブュニットのアミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 1のァミノ 酸配列を有する請求項 3 5〜 3 9のいずれかに記載の遺伝子。
4 1 . 前記ひサブュニットのアミノ酸配列が、 配列表の配列番号： 1のァミノ 酸配列の 3 6番目、 7 1番目、 1 4 8番目及び 2 0 4番目のアミノ酸の何れか一 つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列である請求項 3 5〜 3 9のいずれかに記載の遺伝子。
4 2 . 前記 サブユニットのアミノ酸配列の 6番目、 1 9番目、 3 8番目、 7 7番目、 9 0番目、 1 0 2番目、 1 0 6番目、 1 2 6番目、 1 3 0番目、 1 4 2 番目、 1 4 6番目、 1. 8 7番目、 1 9 4番目及び 2 0 3番目のアミノ酸の何れか 一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項 4 1に記載の遺 伝子。
4 3 . 前記 αサブュニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外 の位置において、 1個または数個のアミノ酸が、 二トリルヒドラ夕ーゼ活性が損 なわれない範囲で置換、 挿入または削除されている請求項 4 1または 4 2に記載 の遺伝子。
4 4. 前記びサブュニッ卜のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、 配列表の配 列番号： 3の塩基配列を有する請求項 4 0に記載の遺伝子。
4 5 . 前記 サブュニットのァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子が、 配列表の配 列番号： 3の塩基配列の 1 0 6番目から 1 0 8番目、 2 1 1番目から 2 1 3番目 、 4 4 2番目から 4 4 4番目及び 6 1 0番目から 6 1 2番目の何れか一つ以上の 塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項 4 1に記載 の遺伝子。
4 6 . 前記塩基配列の 1 6番目から 1 8番目、 5 5番目力、ら 5 7番目、 1 1 2 番目から 1 1 4番目、 2 2 9番目から 2 3 1番目、 2 6 8番目から 2 7 0番目、
3 0 4番目から 3 0 6番目、 3 1 6番目から 3 1 8番目、 3 7 6番目から 3 7 8 番目、 3 8 8番目から 3 9 0番目、 4 2 4番目から 4 2 6番目、 4 3 6番目から
4 3 8番目、 5 5 9番目から 5 6 1番目、 5 8 0番目から 5 8 2番目及び 6 0 7 番目から 6 0 9番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換さ れている請求項 4 5に記載の遺伝子。
4 7 . 請求項 1〜1 2のいずれかに記載の二トリルヒドラターゼをコードする 遺伝子を有することを特徴とするプラスミド。
4 8 . 前記二トリルヒドラターゼの サブュニットをコ一ドする遺伝子が、 配 列番号： 3の塩基配列または請求項 1 3〜1 7のいずれかに記載の遺伝子である 請求項 4 7に記載のプラスミド。
4 9 . 前記二トリルヒドラ夕一ゼの βサブュニットをコ一ドする遺伝子が、 配 列番号： 4の塩基配列または請求項 1 8〜2 2のいずれかに記載の遺伝子である 請求項 4 7または 4 8に記載のプラスミド。
5 0 . 請求項 2 3〜4 6のいずれかに記載の二卜リルヒドラターゼをコードす る遺伝子を有することを特徴とするプラスミド。
5 1 . 前記二トリルヒドラタ一ゼの宿主細胞での発現のための構成を有する請 求項 4 7〜5 0のいずれかに記載のプラスミド。
5 2 . 請求項 5 1に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られ た形質転換体。
5 3 . 二トリルヒドラターゼの生産方法において、
請求項 5 2に記載の形質転換体を培地で培養して、 該形質転換体に前記プラス ミドの有する二卜リルヒドラタ一ゼ遺伝子に基づく二トリルヒドラ夕一ゼを生産 させる工程を有することを特徴とする生産方法。
5 4. 前記培養後の形質転換体、 培養液及びそれらの処理物からニトリルヒド ラターゼを回収する工程を更に有する請求項 5 3に記載の生産方法。
55. 二トリル化合物を水性媒体中で二トリルヒドラターゼを接触させて対応 する二トリル化合物を得る二トリルィ匕合物の製造方法において、
前記二トリルヒドラターゼが請求項 1〜 12のいずれかに記載のものであるこ とを特徴とする製造方法。
56. 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a X · Km ·熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
(a) 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配列 表の配列番号 98記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号 99記載のアミノ酸 配列とアラインメントする、
(b) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36番目スレオニンより 48番目ァスパラギンに至る領域、 配列表の配列番号 9 9記載のアミノ酸配列中の 31番目リジンより 51番目フエ二ルァラニンに至る 領域、 及び 112番目リジンより 127番目ロイシンに至る領域に相当するアミ ノ酸残基を特定する、
(c) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う。
57. 二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vmax · Km ·熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
(d) 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配列 表の配列番号 98記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号 99記載のアミノ酸 配列とアラインメントする、
(e) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列中の 36 · 48 · 71 · 148 · 188 · 204番目に相当するアミノ酸残基、 配列 表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中の 10 · 32 · 33 · 3'7 · 40 · 41 · 46 · 48 · 51 · 61 · 72 · 112 · 118 · 127 · 146 · 150 · 160 · 168 · 171 · 176 · 186 · 217 · 218.番目に相当するアミ ノ酸残基を特定する、
(f ) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う。
58. 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a X · Km '熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
(g) 改変前の二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素の立体構造を、 PDB ( Protein Data Bank) 番号 1 I RE記載の二卜リルヒドラ夕一ゼ立体構造と、 ァ ミノ酸配列に基づいたァラインメントを行う事により推定する、
(h) 推定された立体構造に基づき、 PDB番号 1 I RE記載の二卜リルヒドラ 夕一ゼ立体構造中の A鎖 （Chain 1IRE:A) における N末から数えて 2番目のヘリ ックス、 及び B鎖 （Chain 1IRE:B) におげる N末から数えて 1番目のへリックス 、 2番目のへリックス、 及びそれらにはさまれたループ部分と C末から数えて 3 番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
(i) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う。
59. 二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vma X · Km ·熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
(j ) 改変前の二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素の立体構造を、 PDB番 号 1 I RE記載の二トリルヒドラ夕一ゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
(k) 推定された立体構造に基づき、 PDB番号 1 I RE記載の二トリルヒドラ 夕一ゼ立体構造中の A鎖における N末から 89番目のアミノ酸残基であるダル夕 ミン、 165番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 3 7番目のアミノ酸残基であるフエ二ルァラニン、 4 8番目 のアミノ酸であるロイシンに相当する 4つのアミノ酸残基を特定する、
( 1 ) 特定された 4つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体 構造上半径 5 A内の範囲に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基を特定する、
(m) 上記 1で特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除 を行う。
6 0. 二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a x · Km ·熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
(n ) 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、 P D B番 号 1 I R E記載の二トリルヒドラターゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
( o ) 推定された立体構造に基づき、 基質が酵素外部から活性中心に向かう際や 生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定 する、
( P ) 特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、 それを変更する事が空洞の 大きさを変化させ、 延いては基質/生成物の通過し易さ Zし難さを制御するアミ ノ酸残基を特定する、
( q ) 上記 pで特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除 を行う。
6 1 . 二トリルヒドラタ一ゼ活性を有する酵素において、 以下の工程により特 定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除することにより、 該酵素の活性 ·基質特異性 · Vm a X · Km ·熱 安定性 ·基質に対する安定性 ·生成物に対する安定性の何れか 1つ以上の性質を 変化させる改変方法、
( r ) 改変前の二トリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、 P D B番 号 1 I R E記載の二トリルヒドラ夕ーゼ立体構造と、 アミノ酸配列に基づいたァ ラインメントを行う事により推定する、
(s) 推定された立体構造に基づき、 08番号1 I RE記載の二トリルヒドラ ターゼ立体構造中の A鎖における N末から 89番目のアミノ酸であるグルタミン
(A89Q) 、 165番目のアミノ酸であるグルタミン酸 （A165E) に相当 するアミノ酸残基、 及び B鎖の N末から 37番目のアミノ酸であるフエ二ルァラ ニン （B37F) 、 48番目のアミノ酸であるロイシン （B48L) に相当する アミノ酸残基の 4つのアミノ酸残基を特定する、
(t) A165Eに相当するアミノ酸残基と B48Lに相当するアミノ酸残基と の最短重原子間距離を d 1、 A89Qに相当するアミノ酸残基と B48Lに相当 するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 2、 B 37 Fに相当するアミノ酸残 基と B 48 Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 3と規定し、 d 1力、ら 3の 1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
(u) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う。
62. (t) の工程が以下の （t， ) のとおりである請求項 61に記載の改変 方法、
(t ' ) A165 Eに相当するアミノ酸残基と B 48 Lに相当するアミノ酸残基 との最短重原子間距離を d 1、 A 89 Qに相当するァミノ酸残基と B 48 Lに相 当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 2、 B37 Fに相当するアミノ酸 残基と B48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離を d 3、 A165 Eに相当するァミノ酸残基と B37Fに相当するァミノ酸残基との最短重原子間 距離を d4、 A89Qに相当するアミノ酸残基と B 37 Fに相当するアミノ酸残 基との最短重原子間距離を d 5と規定し、 d 1から 5の 1つ以上を変化させるァ ミノ酸残基を特定する。
63. 改変前の二トリルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素が下記の [A] と [B ] の 2種類のポリペプチドを含む事を特徴とする請求項 56から 62の何れか一 項記載の改変方法、
[A] 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列と 40 %以上の相同性を示すァ ミノ酸配列から成るポリペプチド、
[B] 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列と 25%以上の相同性を示すァ ミノ酸配列から成るポリペプチド。
64. [A] のポリペプチドが下記 [C] のポリペプチドであり、 [B] のポ リペプチドが下記 [D] ポリペプチドである事を特徴とする請求項 63記載の改 変方法、
[C] 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列、 配列表の配列番号 98記載の アミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除を行ったアミノ酸 配列、 配列表の配列番号 98記載のアミノ酸配列の 6 - 19 - 38 - 77 - 90
· 102 · 106 · 126 · 130 · 142 · 146 · 187 · 1.94 - 203 番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸 配列、 の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[D] 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列、 配列表の配列番号 99記載の ァミノ酸配列の少なくとも 1箇所に関して置換、 挿入又は削除を行つたアミノ酸 配列、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列の 20 - 21 - 108 - 200
• 212番目のアミノ酸の少なくとも 1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した ァミノ酸配列、 の何れかのァミノ酸配列から成るポリペプチド。
65. [Α] のポリペプチドが下記 [Ε] のポリペプチドであり、 [Β] のポ リペプチドが下記 [F] のポリペプチドである事を特徴とする請求項 63記載の 改変方法、 '
[Ε] 配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 704番目から 1315番目に よって成る OR F (オープンリーディングフレーム） がコードするアミノ酸配列 と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[F] 配列表の配列番号 104記載の塩基配列の 1番目から 680番目によって 成る OR Fがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリべ プチド。
66. 改変前の二卜リルヒドラ夕ーゼ活性を有する酵素が構成要素として含む 2種のポリペプチドの内、 1つが請求項 65記載の [E] のポリペプチドであり 、 もう 1つのロリペプチドが請求項 65記載の [F] のポリペプチドである事を 特徴とし、 且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、 特定されたアミ ノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行うことにより、 該酵素の活 性、 基質特異性、 Vmax、 Km、 熱安定性、 基質に対する安定性、 生成物に対 する安定性の何れか 1つ以上の性質を変化させる改変方法、' (d' ) 改変前の二 トリルヒドラ夕一ゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、 配列表の配列番号 99 記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(e' ) アラインメント結果から、 配列表の配列番号 99記載のアミノ酸配列中 の 48 · 51番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f ) 特定されたアミノ酸残基の内の 1箇所以上に置換、 挿入又は削除を行う
67. [A] のポリペプチドが下記 [G] のポリペプチドである事を特徴とす る請求項 63記載の改変方法、
[G] アミノ酸配列 XiCXLC
Figure imgf000254_0001
リペプチド
(ここにおいて、 Cはシスティンを、 Xはセリン又はスレオニンを、 Lは口イシ ンを、 はシステインスルフィン酸 （CYSTEINE SULFINIC ACID · 3_
SULFINOALANINE) を、 Sはセリンを、 C 2はシステインスルフェン酸 （CYSTEINE SULFENIC ACID · S-HYDROXY- CYSTEINE) を、 Xx · X2 · X3 · X4 · X5は任意の アミノ酸を示す。 ） 。
68. がバリン、 X4がトリブトファン、 X5がプロリンである事を特徴と する請求項 67記載の改変方法。
69. X2がチロシン、 X3がプロリンである事を特徴とする請求項 68記載 の改変方法。
70.
Figure imgf000254_0002
C2X2X3X4X5で表される領域を介して金属原子と 結合している事を特徴とする請求項 67から 69の何れか一項記載の改変方法。
71. 金属原子がコバルト原子である事を特徴とする請求項 70記載の改変方 法。
72. 請求項 56から 71の何れか一項記載の改変方法により得られる事を特 徴とする改変酵素。
73. 請求項 72記載の改変酵素をコードする遺伝子。
74. 請求項 73記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド。
7 5 . 微生物を請求項 7 3記載の遺伝子又は請求項 7 4記載のプラスミドを用 いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体。
7 6 . 請求項 7 5記載の形質転換体を培養して得られる培養液、 細胞、 又はそ れらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製 方法。
7 7 . 請求項 7 5記載の形質転換体を培養して得られる培養液、 細胞、 又はそ れらの処理物、 又は請求項 7 6記載の調製方法により得られる改変酵素を二トリ ル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニ卜リル化合物を対応するアミド化合 物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005116206A1 (ja) * 2004-05-26 2005-12-08 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ニトリルヒドラターゼ
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP2008253182A (ja) * 2007-04-04 2008-10-23 Mitsubishi Rayon Co Ltd 改良型ニトリルヒドラターゼ
WO2010055666A1 (ja) 2008-11-14 2010-05-20 三井化学株式会社 ニトリルヒドラターゼ変異体
JP2010172295A (ja) * 2009-01-30 2010-08-12 Mitsubishi Rayon Co Ltd 改良型ニトリルヒドラターゼ及びその製造方法
WO2012164933A1 (ja) 2011-05-31 2012-12-06 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
WO2012169203A1 (ja) 2011-06-07 2012-12-13 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
KR20160145183A (ko) 2014-06-06 2016-12-19 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
WO2018124247A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 三井化学株式会社 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法
CN111690675A (zh) * 2019-08-01 2020-09-22 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5492876B2 (ja) * 2009-04-30 2014-05-14 三井化学株式会社 ３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法
CN102517271B (zh) * 2011-12-13 2013-04-03 清华大学 一种突变腈水合酶
CN104725476B (zh) * 2015-03-31 2018-10-16 清华大学 一种钩状结构寡肽及其应用
KR20190049109A (ko) 2017-11-01 2019-05-09 (주)대화정공 풀리 제조방법
KR102146408B1 (ko) 2019-04-08 2020-08-21 (주)대화정공 단류선 개선을 위해 압연롤러를 이용한 자동차 댐퍼풀리 제조방법
KR102068615B1 (ko) 2019-04-08 2020-01-21 (주)대화정공 자동차 댐퍼풀리 제조방법
CN115322981B (zh) * 2020-11-20 2023-07-25 江南大学 一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用
CN112522245A (zh) * 2020-12-09 2021-03-19 江南大学 一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用
CN113151234B (zh) * 2021-04-13 2022-08-12 浙江工业大学 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h2r、编码基因及应用
CN113444714B (zh) * 2021-07-29 2022-06-21 浙江大学杭州国际科创中心 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用
CN114317507A (zh) * 2021-11-30 2022-04-12 清华大学 腈水合酶突变体及其应用
WO2024004661A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 三井化学株式会社 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0790310A2 (en) 1996-02-14 1997-08-20 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Nitrile hydratase, derivatives thereof and methods of producing compounds
JPH09275978A (ja) 1996-02-14 1997-10-28 Mitsui Toatsu Chem Inc 新規なニトリルヒドラターゼ

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX169933B (es) 1987-09-18 1993-08-02 Hideaki Yamada Procedimiento para la produccion biologica de amidas
AU627648B2 (en) 1990-02-28 1992-08-27 Teruhiko Beppu Dna fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
JPH0856684A (ja) 1994-08-16 1996-03-05 Mitsui Toatsu Chem Inc 微生物によるアミド化合物の製造法
JP3408737B2 (ja) 1998-03-16 2003-05-19 三井化学株式会社 ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0790310A2 (en) 1996-02-14 1997-08-20 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Nitrile hydratase, derivatives thereof and methods of producing compounds
JPH09275978A (ja) 1996-02-14 1997-10-28 Mitsui Toatsu Chem Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
US5910432A (en) 1996-02-14 1999-06-08 Mitsui Chemicals, Inc. Nitrile hydratase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1586637A4

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7645605B2 (en) 2004-05-26 2010-01-12 Mitsubishi Rayon Co., Ltd Heat-resistant nitrile hydratase
US7803578B2 (en) 2004-05-26 2010-09-28 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Heat-resistant nitrile hydratase
WO2005116206A1 (ja) * 2004-05-26 2005-12-08 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ニトリルヒドラターゼ
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
EP2261327A2 (en) 2006-04-07 2010-12-15 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP2008253182A (ja) * 2007-04-04 2008-10-23 Mitsubishi Rayon Co Ltd 改良型ニトリルヒドラターゼ
US8871484B2 (en) 2008-11-14 2014-10-28 Mitsui Chemicals, Inc. Nitrile hydratase variant
WO2010055666A1 (ja) 2008-11-14 2010-05-20 三井化学株式会社 ニトリルヒドラターゼ変異体
JP2010172295A (ja) * 2009-01-30 2010-08-12 Mitsubishi Rayon Co Ltd 改良型ニトリルヒドラターゼ及びその製造方法
KR20160108569A (ko) 2011-05-31 2016-09-19 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
US9382528B2 (en) 2011-05-31 2016-07-05 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nitrile hydratase
WO2012164933A1 (ja) 2011-05-31 2012-12-06 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
US9388403B2 (en) 2011-05-31 2016-07-12 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nitrile hydratase
KR20150092767A (ko) 2011-06-07 2015-08-13 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
US10221410B2 (en) 2011-06-07 2019-03-05 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
KR20140002791A (ko) 2011-06-07 2014-01-08 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
KR20150092768A (ko) 2011-06-07 2015-08-13 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
KR20150092770A (ko) 2011-06-07 2015-08-13 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
US9193966B2 (en) 2011-06-07 2015-11-24 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nitrile hydratase
JPWO2012169203A1 (ja) * 2011-06-07 2015-02-23 三菱レイヨン株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
EP2811021A2 (en) 2011-06-07 2014-12-10 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Improved nitrile hydratase
WO2012169203A1 (ja) 2011-06-07 2012-12-13 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
KR20150092769A (ko) 2011-06-07 2015-08-13 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
US9738885B2 (en) 2011-06-07 2017-08-22 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
US10487320B2 (en) 2011-06-07 2019-11-26 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
US10066225B2 (en) 2011-06-07 2018-09-04 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
KR20160145183A (ko) 2014-06-06 2016-12-19 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
US10093912B2 (en) 2014-06-06 2018-10-09 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
WO2018124247A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 三井化学株式会社 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法
US11098299B2 (en) 2016-12-28 2021-08-24 Mitsui Chemicals, Inc. Mutant nitrile hydratase, nucleic acid coding said mutant nitrile hydratase, expression vector and transformant including said nucleic acid, production method for said mutant nitrile hydratase, and production method for amide compound
CN111690675A (zh) * 2019-08-01 2020-09-22 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用

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