CN103103175A - 新型腈水合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的为提供一种具有新型突变位点的腈水合酶的氨基酸序列及其基因的碱基序列，另外本发明的目的还在于提供一种对具有腈水合酶活性的酶进行修饰的方法。作为解决目前问题的方法，提供了在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095、由2种异源亚单位构成的腈水合酶中引入新型突变而得到的突变体的氨基酸序列及其基因的碱基序列。而且，通过确定腈水合酶的立体结构/氨基酸序列中作为修饰对象的区域，并对与形成所述区域的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、缺失等改变从而修饰腈水合酶。通过本发明，能够比现有技术更高效率地将腈化合物转化为对应的酰胺化合物。

Description

新型腈水合酶
本申请是申请日为2003年12月15日、申请号为200380106993.0(国际申请号为PCT/JP2003/016014)、发明名称为“新型腈水合酶”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种新型腈水合酶及编码其的基因、含有该基因的质粒、经该质粒转化了的细胞株、及用所述细胞株生产腈水合酶的方法、以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
另外，本发明还涉及一种改变具有腈水合酶活性的酶的性质的方法。此外，本发明还涉及一种改变了性质的酶及编码其的基因、含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株、用所述细胞株生产腈水合酶的方法，以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。本发明可有效用于利用生物催化剂的物质生产领域中。
背景技术
已经发现了作为具有腈水合活性的酶的腈水合酶，该酶能够通过水合作用将各种化合物的腈基转换成酰胺基，并且公开了多种生产该酶的微生物株。为了在工业上利用腈水合酶从腈化合物制造酰胺化合物，降低该酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤显重要。具体而言，必须提高每单位重量酶制备物中该酶的含量。因此为了利用所述酶的基因通过基因工程学方法大量表达所述酶，尝试对所述酶的基因进行克隆的方法。
作为具有腈水合酶活性的微生物，有紫红红球菌J-1株(根据布达佩斯条约，保藏在茨城县筑波市东1-1-1号中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERMBP-1478)、嗜热假诺卡氏菌(本菌株保藏在理化学研究所微生物系统保存处(埼玉县和光市广泽2-1)，保藏编号为JCM3095，任何人都可经申请获得；另外，根据布达佩斯条约，保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-7379。)(参照专利文献1及3)。
另外，从上述菌株中分离出了腈水合酶，已经确认了该酶一般以称为α亚单位及β亚单位的2种多肽为构成要素。并且，从上述菌株中分离出了腈水合酶基因，确定了其氨基酸序列和碱基序列。进而，制备了可使上述腈水合酶在转化子内表达的质粒及经所述质粒转化了的细胞株(例如，TG1/pNHJ10H及MT-10822：根据布达佩斯条约，前者保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-2777；后者于1996年2月7日保藏在茨城县筑波市东1-1-1号中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-5785)。除此之外，能够经上述细胞株生产腈水合酶、以及通过使所述细胞株或者由其制得的腈水合酶与腈化合物接触以制备对应的酰胺化合物(参照专利文献2、4，非专利文献1)。
另外，也进行了分析腈水合酶的立体结构的尝试，分析结果以PDB编号1AHJ、2AHJ、1IRE被公开。已知所述酶的基本结构单位为α亚单位及β亚单位结合而成的2聚体，该2聚体进一步结合形成4聚体、8聚体、12聚体(根据来源的生物种而不同)而发挥活性。另外，形成活性中心的区域、结构也已明确，活性中心并非表露于与反应溶剂直接接触的酶外侧的位置，而是包埋于酶的内部。也清楚发挥活性所必须的金属原子(钴原子或者铁原子：根据来源的生物种而不同)在活性中心的配位形态，并已知作为伴随金属原子配位发生的现象，形成活性中心区域的氨基酸序列中半胱氨酸残基在翻译后发生氧化。具体而言，α亚单位的氨基酸序列中序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示丝氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)表示的区域为构成金属原子在活性中心进行配位的区域(参照非专利文献2～4)。
但是，还没有任何发明公开关于在不影响腈水合酶自身活性的情况下，改变其活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质的具体方法。特别是着眼于腈水合酶的立体结构、通过改变结构而改变上述性质的方法还未作任何尝试。
另外，专利文献5中公开了使编码腈水合酶的基因在宿主细胞中表达而生产具有酶活性的腈水合酶时，存在一种参与激活所述酶的蛋白质。
专利文献1：特开平2-470号公报
专利文献2：特开平4-211379号公报
专利文献3：特开平8-56684号公报
专利文献4：特开平9-275978号公报
专利文献5：特开平11-253168号公报
非专利文献1：Kobayashi M，Nishiyama M，Nagasawa T，Horinouchi S，Beppu T，Yamada H.Cloning，nucleotide sequence and expression inEscherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes fromRhodococcus rhodochrous J1.Biochim Biophys Acta.1991 Dec 2；1129(1)：23-33.
非专利文献2：Huang W，Jia J，Cummings J，Nelson M，Schneider G，Lindqvist Y.Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centrein a novel fold.Structure.1997May 15；5(5)：691-9.
非专利文献3：Nagashima S，Nakasako M，Dohmae N，Tsujimura M，Takio K，Odaka M，Yohda M，Kamiya N，Endo I.Novel non-heme ironcenter of nitrile hydratase with a claw setting of oxygen atoms.Nat StructBiol.1998 May；5(5)：347-51.
非专利文献4：Miyanaga，A.，Fushinobu，S.，Ito，K.，and Wakagi，T.Crystal structure of cobalt-containing nitrile hydratase.Biochem.Biochem Biophys Res Commun.2001 Nov16；288(5)：1169-74.
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有新型置换突变位点但功能无实质变化的腈水合酶的氨基酸序列和该基因的碱基序列，还提供一种含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株、及用所述细胞株生产所述酶的方法，以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
本发明的其它目的在于提供一种在不损害腈水合酶自身活性的情况下，改变其活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质中的一种或一种以上的具体方法。具体而言，提供一种通过在腈水合酶基因中引入导致腈水合酶立体结构发生变化的突变而改变上述性质的方法，进而，提供一种经修饰方法得到的腈水合酶、编码所述腈水合酶的基因、含有所述基因的质粒、经所述基因或所述质粒转化了的细胞株、用所述细胞株生产所述腈水合酶的方法、以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
本发明人等基于上述情况，在特开平9-275978号公报(专利文献4)中公开的腈水合酶基因中引入了未在该文献中公开的新型置换突变位点，并确定了导入所述突变后所述基因的碱基序列。进而制备出了含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株。另外，通过反复深入地研究了利用所述细胞株生产所述酶、或利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备出对应的酰胺化合物，从而完成了本发明。
本发明的腈水合酶的α亚单位的特征为，其氨基酸序列具有下述突变，即，在序列号1表示的α亚单位的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任何一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
本发明的腈水合酶的β亚单位的特征为，其氨基酸序列具有下述突变，即，在序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任何一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
本发明的腈水合酶的特征为，具有α亚单位和β亚单位，上述亚单位中至少一方存在上述突变。
编码本发明腈水合酶的α亚单位的基因的特征为，其负责编码存在于上述α亚单位中的突变的氨基酸序列；编码本发明腈水合酶的β亚单位的基因的特征为，其负责编码存在于上述β亚单位中的突变的氨基酸序列。
编码本发明腈水合酶的基因的特征为，包含编码α亚单位的基因和编码β亚单位的基因，上述亚单位中至少一方存在上述突变。
本发明的质粒的特征为，具有上述的任一种基因。
本发明的转化子的特征为，通过利用上述质粒转化宿主细胞而得到。
本发明中腈水合酶的制备方法特征为，其包含从上述转化子、上述转化子的培养液、或者上述转化子或上述培养液的处理物中回收腈水合酶的步骤。
本发明的酰胺化合物的制备方法的特征为包含下述步骤：在水性介质中使腈化合物与上述腈水合酶接触，从而将所述腈化合物转化为对应的酰胺化合物的步骤。
另外，本发明人等鉴于上述情况，以专利文献2、专利文献4中公开的腈水合酶基因为例，基于新观点规定了作为突变对象的区域，并实施对腈水合酶进行修饰的方法，即对形成该区域的氨基酸残基所对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、或缺失等改变而修饰腈水合酶。具体而言，参照非专利文献2、3、4、及以PDB号：1AHJ、2AHJ、1IRE中公开的腈水合酶的立体结构，经深入分析研究，确定了符合要求的修饰对象区域。更具体而言，通过解析立体结构，确定了形成孔穴的区域、以及形成界面的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，所述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间结合的界面及参与2聚体之间相互结合的界面。对氨基酸序列进行置换、插入、缺失等修饰的方法没有特别的限制，可以举出例如采用基因重组手段引入突变的方法。
进一步确定了经所述修饰后该基因的碱基序列，制备了含有所述基因的质粒、经所述基因或质粒转化了的细胞株，用所述细胞株生产所述酶或利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物，从而观察了修饰方法对腈水合酶的性质造成了何种改变。经过反复深入研究构成作为修饰对象的腈水合酶的氨基酸序列中各位点的改变及由此得到的各种修饰酶，从而完成了本发明。
即，除了上述特征，本发明还涉及下述[1]～[22]中所述内容。
[1].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变该酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中的任何1种或1种以上的性质，这些步骤为：
(a)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表中序列号98记载的氨基酸序列及序列表中序列号99记载的氨基酸序列进行对比；
(b)根据对比的结果确定与下述区域对应的氨基酸残基，所述区域为，序列表中序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表中序列号99记载的氨基酸序列中从第31位的赖氨酸到第51位的苯丙氨酸的区域、以及从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域；
(c)对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[2].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中的1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何1种或1种以上性质，这些步骤为：
(d)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表中序列号98记载的氨基酸序列及序列表中序列号99记载的氨基酸序列进行对比；
(e)根据对比的结果确定与序列表中序列号98记载的氨基酸序列中第36、48、71、148、188、204位对应的氨基酸残基、与序列表中序列号99记载的氨基酸序列中第10、32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218位对应的氨基酸残基；
(f)对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[3].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中的1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何1种或1种以上性质，
(g)基于PDB(Protein Data Bank)号：1IRE记载的腈水合酶的立体结构和与氨基酸序列进行对比的结果推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；
(h)根据推定的立体结构确定与PDB号：1IRE记载的腈水合酶立体结构的A链(Chain 1IRE：A)中从N末端算起的第2个螺旋对应的区域的氨基酸残基；以及与B链(Chain 1IRE：B)中从N末端算起的第1个螺旋、第2个螺旋、及夹在其间的环状部分、和从C末端算起的第3个螺旋对应的区域的氨基酸残基；
(i)对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[4].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何1种或1种以上性质，
(j)基于PDB号：1IRE记载的腈水合酶的立体结构和与氨基酸序列进行对比的结果推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；
(k)根据推定的立体结构确定与PDB号：1IRE记载的腈水合酶立体结构的A链中从N末端算起作为第89位氨基酸残基的谷氨酰胺、作为第165位氨基酸残基的谷氨酸、以及从B链N末端算起作为第37位氨基酸残基的苯丙氨酸、作为第48位氨基酸的亮氨酸对应的4个氨基酸残基；
(1)确定下述氨基酸残基，所述氨基酸残基的侧链前端重原子位于立体结构中半径为
Figure BSA00000831225700081
的范围内，该立体结构分别以上述确定的4个氨基酸残基的侧链前端重原子为其中心点；
(m)对上述1中确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[5].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任1种或1种以上的性质，
(n)基于PDB号：1IRE记载的腈水合酶的立体结构和氨基酸序列进行对比，根据对比结果来推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；
(o)根据推定的立体结构确定形成下述孔穴的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴；
(p)在构成确定的区域的氨基酸残基中确定如下的氨基酸残基，这些氨基酸残基的改变使孔穴尺寸发生变化，进而可控制底物/产物通过的难易程度；
(q)对上述p中确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[6].一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任1种或1种以上性质，
(r)基于PDB号：1IRE记载的腈水合酶的立体结构和氨基酸序列进行对比，根据对比结果来推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；
(s)根据推定的立体结构确定以下共计4个氨基酸残基，该氨基酸残基为与PDB号：1IRE记载的腈水合酶立体结构中从A链的N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)对应的氨基酸残基，以及与从B链的N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、作为第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)对应的氨基酸残基；
(t)规定对应于A165E的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d1，对应于A89Q的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d2，对应于B37F的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d3，确定使d1～d3中的1项或1项以上发生变化的氨基酸残基；
(u)对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[7].在[6]记载的修饰方法中，(t)的步骤如下述(t’)所述，
(t’)规定对应于A165E的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d1，对应于A89Q的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d2，对应于B37F的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d3，对应于A165E的氨基酸残基和对应于B37F的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d4，对应于A89Q的氨基酸残基与对应于B37F的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d5，确定使d1～d5中的1项或1项以上发生变化的氨基酸残基。
[8].如[1]～[7]中任一项所述的修饰方法，其特征为，修饰前的具有腈水合酶活性的酶含有下述[A]和[B]所述的2种多肽：
[A]由与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽；
[B]由与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。
[9].如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[C]所述的多肽，[B]所述的多肽为下述[D]所述的多肽，
[C]由下述任一种氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号98记载的氨基酸序列；对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中的至少1个位点进行置换、插入、或缺失处理而得到的氨基酸序列；将序列表的序列号98记载的氨基酸序列中的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的至少1个氨基酸置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
[D]由下述任一种氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表中序列号99记载的氨基酸序列；对序列表的序列号99记载的氨基酸序列中的至少1个位点进行置换、插入、或缺失处理而得到的氨基酸序列；将序列表的序列号99记载的氨基酸序列中的第20、21、108、200、212位氨基酸中的至少1个氨基酸置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
[10].如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[E]所述的多肽，[B]所述的多肽为下述[F]所述的多肽。
[E]由与下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704位到第1315位碱基形成的ORF(Open Reading Frame，开放读码框)所编码的氨基酸序列。
[F]由与下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1位到第680位碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列。
[11].一种修饰前具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中的任何1种或1种以上性质，其特征为，所述修饰前具有腈水合酶活性的酶中作为构成要素含有的2种多肽中，一种为[10]中的[E]记载的多肽，另一种为[10]中的[F]记载的多肽，
(d’)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表的序列号99记载的氨基酸序列进行对比，
(e’)根据对比的结果确定与序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第48、51位对应的氨基酸残基，
(f’)对确定的氨基酸残基中的1个或1个以上位点进行置换、插入或缺失处理。
[12].如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[G]所述的多肽，
[G]含有氨基酸序列为X1CXLC1SC2X2X3X4X5的区域的多肽(其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示丝氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenic acid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)。
[13].如[12]所述的修饰方法，其特征为，所述序列中X1表示缬氨酸，X4表示色氨酸，X5表示脯氨酸。
[14].如[13]所述的修饰方法，其特征为，所述序列中X2表示酪氨酸，X3表示脯氨酸。
[15].如[12]～[14]中任一项所述的修饰方法，其特征为，通过X1CXLC1SC2X2X3X4X5序列表示的区域与金属原子结合。
[16].如[15]所述的修饰方法，其特征为，所述金属原子为钴原子。
[17].一种修饰酶，其特征为，所述酶是利用[1]～[16]中任一项所述的修饰方法而得到的。
[18].一种基因，其特征为，所述基因是编码[17]所述修饰酶的基因。
[19].一种质粒，其特征为，所述质粒含有[18]所述的基因。
[20].一种转化子，其特征为，所述转化子是利用[18]所述基因或[19]所述质粒转化微生物而得到的。
[21].一种制备修饰酶的方法，其特征为，所述方法包含从培养[20]所述的转化子而得到的培养液、细胞、或其处理物中回收修饰酶的步骤。
[22].一种制备酰胺化合物的方法，其特征为，所述方法包含以下步骤：在溶剂中，使培养[20]所述的转化子而得到的培养液、细胞、或其处理物、或者经[21]所述的制备方法得到的修饰酶与腈化合物接触，从而将该腈化合物转化为对应的酰胺化合物。
本发明提供一种腈水合酶的氨基酸序列及所述基因的碱基序列，所述腈水合酶来源于嗜热假诺卡氏菌，具有新型突变位点，但其本质功能未发生变化。本发明进一步提供一种含有所述基因的质粒、含有所述质粒的转化子、用所述转化子生产所述酶的方法、以及利用所述转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
本发明还提供一种酶的修饰方法，其采用以改变具有腈水合酶活性的酶的立体结构为特征的方法来修饰在修饰前具有腈水合酶活性的酶。作为采用上述方法的修饰方法可获得的效果的特征可以举出，能够改变活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质中的1种或1种以上性质。另外本发明提供一种具有新型突变位点的腈水合酶、及编码构成所述酶的多肽链的基因。还可以提供一种含有所述基因的质粒、含有所述基因或所述质粒的转化子、利用所述转化子生产所述酶的方法，以及利用所述转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
附图说明
图1表示从MT10822提取的质粒pPT-DB1的限制性核酸内切酶的酶切图。(参考例1、实施例1、83)
图2表示用于表达具有活性的来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶而构建的质粒pJ1H-DB1的限制性核酸内切酶的酶切图。(实施例84)
图1及图2中使用的省略符号的含义如下：
bla表示编码β-内酰胺酶的ORF。
Col E1-ori表示Col E1系统的复制起始位点。
lacZ表示来源于pUC 18的乳糖操纵子中的启动子和操纵基因区域。
NHα表示编码来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚单位的ORF。
NHβ表示编码来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β亚单位的ORF。
P16表示编码下述蛋白质的ORF，所述蛋白质的特征为，其参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的激活。
nhhA表示编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的α亚单位的ORF。
nhhB表示编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的β亚单位的ORF。
具体实施方式
下面更详细地说明本发明。
本发明的腈水合酶是在具有腈水合酶活性的酶中引入突变而得到的，例如，在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到。具体而言，其基本上可通过序列表的序列号1及2表示的氨基酸序列中至少1个或1个以上特定位点的氨基酸经其它氨基酸置换而构成。即，本发明包含以下腈水合酶：以序列表的序列号1中的205个氨基酸的序列所表示的α亚单位内至少1个或1个以上氨基酸被其它氨基酸置换而得到的序列为构成要素的腈水合酶、以序列表的序列号2中的233个氨基酸的序列所表示的β亚单位中至少1个或1个以上氨基酸被其它氨基酸置换而得到的序列为构成要素的腈水合酶、以及同时以上述两种序列为构成要素的腈水合酶。
本发明中在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶中所使用的具体氨基酸序列中包括以下序列：
(a-0)序列号1表示的α亚单位的氨基酸序列，
(a-1)具有突变的氨基酸序列，即，序列号1表示的α亚单位的氨基酸序列中第36、71、148、204位氨基酸中的任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
(a-2)具有突变的氨基酸序列，即，序列表中序列号1表示的α亚单位的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
(b-0)序列表中序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列，
(b-1)具有突变的氨基酸序列，即，序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、217位氨基酸中的任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
(b-2)具有突变的氨基酸序列，即，序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。
上述各突变至少能够维持突变前的腈水合酶的活性。
本发明在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶由以下构成要素形成，所述构成要素具有选自上述(a-0)～(b-2)的氨基酸序列。
(A-1)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)所述突变的氨基酸序列。
(A-2)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列。
(B-1)腈水合酶的β亚单位具有包含上述(b-1)所述突变的氨基酸序列。
(B-2)腈水合酶的β亚单位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(A-3)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有上述(b-0)所述氨基酸序列。
(A-4)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)所述突变的氨基酸序列。
(A-5)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(A-6)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(A-7)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有上述(b-0)所述氨基酸序列。
(A-8)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)所述突变的氨基酸序列。
(A-9)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(A-10)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(B-3)腈水合酶的α亚单位具有上述(a-0)所述氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)的突变的氨基酸序列。
(B-4)腈水合酶的α亚单位具有上述(a-0)所述氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(B-5)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
另外，对于上述确定的突变位点以外的氨基酸，只要在不损害经上述特定位点突变而得到的目标腈水合酶活性的范围内，也可以进行氨基酸的置换、插入、缺失处理。
本发明在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶基因包括编码腈水合酶的α亚单位的基因和编码腈水合酶的β亚单位的基因。
作为本发明所述基因的一族，可以举出在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶基因中实施引入突变处理而得到的基因，其中包括编码α亚单位的氨基酸序列的基因、编码β亚单位的基因、以及同时含有编码α亚单位的基因和编码β亚单位的基因的腈水合酶基因。
具体可以举出以下基因。
(G-1)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(a-1)所述突变的氨基酸序列。
(G-2)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列。
(G-3)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(b-1)所述突变的氨基酸序列。
(G-4)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(G-5)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码上述(A-1)～(B-4)所述的任一腈水合酶。
编码作为上述突变基础的序列号1所述的α亚单位的氨基酸序列的碱基序列优选为序列号3所述的碱基序列。编码作为上述突变基础的序列号2所述的β亚单位的氨基酸序列的碱基序列优选为序列号4所述的碱基序列。
例如，以序列号3为基础时，上述(a-1)所述突变可通过将序列号3的碱基序列中的下述任何1个或1个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到：第106到第108位、从第211到第213位、从第442到第444位、及从第610到第612位。
另外，以序列号3为基础时，上述(a-2)所述突变可通过将序列号3的碱基序列中的下述任何1个或1个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到：第16到第18位、从第55到第57位、从第112到第114位、从第229到第231位、从第268到第270位、从第304到第306位、从第316到第318位、从第376到第378位、从第388到第390位、从第424到第426位、从第436到第438位、从第559到第561位、从第580到第582位、从第607到第609位。
以序列号4为基础时，上述(b-1)所述突变可通过将序列号4的碱基序列中的下述任何1个或1个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到：第28到第30位、从第94到第96位、从第109到第111位、从第121到第123位、从第136到第138位、从第142到第144位、从第151到第153位、从第214到第216位、从第352到第354位、从第379到第381位、从第436到第438位、从第478到第480位、从第556到第558位、从第649到第651位。
另外，以序列号4为基础时，上述(b-2)所述突变可通过将序列号4的碱基序列中的下述任何1个或1个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到：第58到第60位、从第61到第63位、从第322到第324位、从第598到第600位、以及从第634到第636位。
上述置换在将腈水合酶的活性保持置换前的状态、或者较之有所提高的范围内进行，所述腈水合酶中具有由各基因编码的α及β亚单位中的至少其一。另外，引入突变的方式没有特别的限制。
对于本发明的腈水合酶基因中(a-1)、(a-2)、(b-1)、及(b-2)所述突变位点之外的位点，在能够作为具有腈水合酶活性的蛋白质模型而发挥功能的范围内，也可具有经碱基的置换、插入、或缺失处理产生的附加突变。
上述附加突变可以举出以下例子。即使在以具有某种特定的碱基序列的基因作为模板进行转录、翻译时，因其导入的宿主细胞的种类、或培养时使用的培养基的成分或组成、或培养时的温度、pH等因素的不同，在经基因表达后宿主细胞内酶的修饰后，在保留所期望的酶活性的情况下，仍可能出现以下的突变体，即在酶的序列表中N-末端附近的1个、2个或2个以上氨基酸发生缺失、或在N-末端插入1个、2个或2个以上氨基酸而得到的突变体。因此此类突变的腈水合酶也包含在本发明的范围之内。
本发明的腈水合酶生产用质粒可以利用上述腈水合酶基因进行制备，可以举出以下具体例。
(P-1)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(a-1)所述突变的氨基酸序列。
(P-2)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(a-1)和(a-2)所述突变的氨基酸序列。
(P-3)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(b-1)所述突变的氨基酸序列。
(P-4)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(b-1)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。
(P-5)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码上述(A-1)～(B-4)中所述的任一腈水合酶。
本发明的转化子或细胞株是利用上述质粒转化任意宿主细胞而得到的。本发明的腈水合酶的生产方法包括培养上述转化子、细胞株以生产腈水合酶的步骤。另外，本发明的酰胺化合物的制备方法包括下述步骤：使培养用于生产上述腈水合酶的转化子、细胞株而得到的培养液、细胞或细胞处理物在溶媒中与腈化合物接触而制备对应的酰胺化合物。
下面对本发明中具有腈水合酶活性的酶的修饰方法进行详细说明。
本发明的腈水合酶活性是指将腈化合物水合成为对应的酰胺化合物的水合活性。一般而言，具有所述活性的酶的特征为，以称为α亚单位、β亚单位的2种多肽链作为构成要素，腈水合酶基因是指以形成上述两种多肽链为特征的两个氨基酸序列，或构成下述两个ORF(开放读码框)的碱基序列，所述ORF的特征为编码上述两个氨基酸序列。
以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶(参照序列表的序列号98及99、专利文献3、非专利文献4、PDB号：1IRE)为例进行具体说明，由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽及PDB号：1IRE记载的腈水合酶立体结构中的A链为α亚单位；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽及PDB号：1IRE记载的腈水合酶立体结构中的B链为β亚单位。而由序列表的序列号100记载的碱基序列形成的ORF和由序列表的序列号101记载的碱基序列形成的ORF称为腈水合酶基因。
另外，对于来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶(参照序列表中序列号104、专利文献2、非专利文献1)而言，由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704位到第1315位形成的ORF编码的氨基酸序列形成的多肽为α亚单位；由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1位到第690位形成的ORF编码的氨基酸序列形成的多肽为β亚单位。另外，序列表的序列号104记载的碱基序列编码的两个ORF称为腈水合酶基因。
本发明的修饰方法是指，改变修饰前具有腈水合酶活性的酶的立体结构的方法，其目的为在不损害腈水合酶本来的活性的前提下，改变该酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何一种或一种以上的性质，该方法的特征为包括以下步骤：通过解析立体结构，确定形成下述孔穴的区域和/或形成下述界面的区域，并对与该区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸中的任一或一个以上位点进行置换、插入、缺失等修饰；上述孔穴指底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，上述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面；
以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶(参照序列表的序列号98及99、专利文献3、非专利文献4、PDB号：1IRE)为例进行具体说明，与形成底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴的区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸残基可以举出，形成对应于PDB号1IRE记载的腈水合酶立体结构中的B链从N末端算起第1个螺旋、第2个螺旋、以及夹在其间的环状部分的区域的氨基酸残基；侧链前端重原子位于以下述4个氨基酸残基的侧链前端重原子为各自中心点的立体结构中半径
Figure BSA00000831225700201
的区域以内的氨基酸残基，上述4个氨基酸残基为，PDB号1IRE记载的腈水合酶立体结构中的从A链N末端算起第89位氨基酸残基的谷氨酰胺、第165位氨基酸残基的谷氨酸、以及从B链N末端算起第37位氨基酸残基的苯丙氨酸、第48位氨基酸的亮氨酸所对应的4个氨基酸残基；序列表的序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表的序列号99记载的氨基酸序列中从第31位的赖氨酸到第51位的苯丙氨酸的区域、以及从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域所对应的氨基酸残基；序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位所对应的氨基酸残基等。
另外，作为存在于参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面的区域中的氨基酸残基所对应的氨基酸残基，可以举出对应于下述区域的氨基酸残基，所述区域为PDB号1IRE记载的腈水合酶立体结构中从A链N末端算起第2个螺旋、从B链N末端算起第2个螺旋、序列表的序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表的序列号99记载的从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域；以及与序列表的序列号98记载的氨基酸序列中第36、71、148、188、204位、与序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第10、32、33、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218位对应的氨基酸残基等。
在构成底物从酶外部进入活性中心、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴的形成区域的氨基酸残基中，对通过修饰可改变孔穴的大小从而控制底物/产物通过的难易程度的氨基酸残基加以确定的方法可以举出，确定PDB号1IRE记载的腈水合酶立体结构中从A链N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)对应的氨基酸残基，以及从B链N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)所对应的4个氨基酸残基，规定A165E和B48L之间的最短重原子间距为d1，A89Q和B48L之间的最短重原子间距为d2，B37F和B48L之间的最短重原子间距为d3，A165E和B37F之间的最短重原子间距为d4，A89Q和B37F之间的最短重原子间距为d5，确定使d1～d5中的1项或1项以上发生变化的氨基酸残基，或确定使d1～d3中的1项或1项以上发生变化的氨基酸残基。
因此，由下述步骤构成的修饰方法也包含在本发明的范围之内，即，对于作为对象的腈水合酶(以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶为代表例)中与上述确定的任何一种或一种以上氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、或缺失等修饰的步骤。
另外，本发明也包含下述修饰方法，即，将来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095以外的生物种的腈水合酶(例如，来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶)与来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的立体结构、氨基酸序列进行对比，从而找出与上述氨基酸残基对应的氨基酸残基，并修饰对应的氨基酸序列中的氨基酸。
实施上述例举的修饰方法时，在基于立体结构或氨基酸序列进行的对比中使用的装置没有特别的限制，作为氨基酸序列的对比装置可以举出日立Soft社制的DNASIS、Free-Soft的CLUSTALW或BLAST等基因序列分析软件；而作为基于氨基酸序列的对比结果的立体结构模拟装置可以举出Accelrys社制的Modeler或Homology等蛋白质立体结构预测软件。
举一例而言，对于来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶(参照序列表的序列号104、专利文献2、非专利文献1)，对比的结果为，对应于序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第48位的氨基酸残基Leu的氨基酸残基为Trp，该Trp与由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列中第48位对应；对应于序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第51位的氨基酸残基Phe的氨基酸残基为Ser，该Ser与由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列中第51位对应。上述结果与基于氨基酸序列的对比和基于立体结构的对比结果相一致。本发明也包含改变上述两个氨基酸残基所对应的氨基酸序列的氨基酸中的任一方或双方的修饰方法。
需要说明的是，在实施上述修饰方法时，用于改变氨基酸残基所对应的氨基酸序列中氨基酸的引入突变的方法没有特别的限制，可以举出利用基因重组技术将氨基酸序列中的氨基酸置换为其它氨基酸的突变引入法。
另外，对于计划引入的突变之外的附加引入的突变所引起的氨基酸序列或碱基序列的变化而言，在不影响计划突变引入得到的目标腈水合酶的活性的范围内，也可发生氨基酸或碱基的置换、插入或缺失。
上述附加导入的突变可以举例如下：即使使用特定碱基序列的基因作为模板进行转录、翻译时，根据导入其的宿主细胞的种类、培养时使用的培养基的成分或组成、培养时的温度、或pH等因素的不同，经基因表达后宿主细胞内酶的修饰等作用，在保留最初酶活性的情况下，仍可能出现以下突变体，即序列表中N-末端附近的氨基酸中的1个、2个或2个以上发生缺失、或N-末端中插入1个、2个或2个以上氨基酸。因此产生上述突变的腈水合酶修饰方法也包含在本发明的范围之内。
作为本发明修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶，可以举出例如来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶和来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶。具体可以举出下述两种腈水合酶，其中一种为，以下述两个多肽链为构成要素的腈水合酶，所述的两个多肽链分别由与下述两个氨基酸序列相同的氨基酸序列形成，即由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列和由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704个到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列；另一种腈水合酶以下述两个多肽链为构成要素，即，以由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽链和由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽链为构成要素。
作为本发明修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶，也包括以下述两种多肽为构成要素的腈水合酶，所述两种多肽的其中一种为，与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，另一种为与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。
作为与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以举出序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽、对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一种修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽、序列表的序列号98记载的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一个氨基酸被其它氨基酸置换后得到的氨基酸序列形成的多肽、与序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。
另外，由与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽可以具有如下特征，即，其序列中含有X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示丝氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)结构的区域。除此之外，其还可以具有下述特征，即，上述区域中X1为缬氨酸，X4为色氨酸，X5为脯氨酸。另外，其也可以具有下述特征，即，上述区域中X2为酪氨酸，X3为脯氨酸。
在上述情况下，其特征也可以为通过X1CXLC1SC2X2X3X4X5结构的区域与金属原子结合。另外，其特征还可为所述金属为钴。
作为由与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以举出由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列中至少一个位点经置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一个氨基酸被其它氨基酸置换后得到的氨基酸序列形成的多肽；由与序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。
举一例而言，来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶以下述多肽为构成要素，所述多肽为由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列形成的多肽，因此，本发明中作为修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶中包括上述腈水合酶。
另外，来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶以由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽为构成要素，因此，其也包含在本发明中作为修饰方法的对象的修改前的腈水合酶的范围内。
另外，作为从来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶，可以举出满足下述两种条件中任一方或双方的腈水合酶。第一种条件为，在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的构成要素中，由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽被下述两种多肽之一置换而得到的酶，所述两种多肽为，由对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列号98记载的氨基酸序列的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一个氨基酸被置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列形成的多肽；第二种条件为，在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的构成要素中，由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽被下述两种多肽之一置换而得到的酶，所述两种多肽为，由对序列表的序列号99记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列号99记载的氨基酸序列的第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一个氨基酸被置换为其它氨基酸后的氨基酸序列形成的多肽。
作为本发明修饰方法的对象的修改前的腈水合酶也包括由来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶。
本发明中修饰酶是指，以具有腈水合酶活性的酶为对象进行修饰后得到的腈水合酶。例如可以举出具有如下特征的修饰酶，即，该修饰酶是采用上述修饰方法改变修饰前的腈水合酶的特性而得到的。
与修饰前的腈水合酶相比较，作为特性的改变可以举出底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物(可以举出例如以该酶作为催化剂时，能够转化为对应的酰胺化合物的任意腈化合物)稳定性、产物(可以举出例如以该酶作为催化剂时，转化任意腈化合物而得到的对应酰胺化合物)稳定性等性质中的任一种或一种以上性质发生的改变。具体可以举出以下8种改变等，
1)相对而言，空间体积更大的腈化合物容易成为底物。
2)相对而言，空间体积更小的腈化合物容易成为底物。
3)以任意腈化合物作为底物时，Vmax增大。
4)以任意腈化合物作为底物时，Km减小。
5)将酶暴露于任意热量中时，其不可逆失活率降低。
6)将酶暴露于任意浓度的底物中时，其不可逆失活率降低。
7)因反应中存在任意浓度产物所引起的反应抑制率降低。
8)将酶暴露于任意浓度的产物中时，其不可逆失活率降低。
作为本发明中以修饰前的腈水合酶为对象的修饰方法所产生的特性改变的指标，可以以底物特异性的变化作为其代表例之一。当经本发明的修饰方法得到的修饰酶为改变了底物特异性的酶时，该修饰酶也包含在本发明的修饰酶的范围中。
作为得到的修饰酶的底物特异性变化的观察方法，可以举出如下方法：以空间体积不同的多种腈化合物作为底物进行反应，测定生成的对应酰胺化合物的量的差异。例如，比较以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺与以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比的方法。此时，与修饰前的对象相比较，可以认为[生成的甲基丙烯酰胺的摩尔量]÷[生成的丙烯酰胺的摩尔量]的值向增大的方向变化的修饰酶表现出使空间体积更大的腈化合物容易成为底物的特性变化；上述值向减小的方向变化的修饰酶表现出使空间体积更小的腈化合物容易成为底物的特性变化。
以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶、以及从来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶为对象的例子中，实施包括下述步骤的修饰方法时，与修饰前的对象比较，得到了以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺与以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比发生变化的修饰酶，该步骤为：通过解析立体结构，确定形成下述孔穴的区域和/或形成下述界面的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，所述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面；并对与所述区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸的任一或一个以上位点进行置换、插入、缺失等修饰的步骤。上述性质可称为底物特异性，即，特性改变的产物，因此得到的修饰酶包含在本发明的修饰酶范围内。
在以来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶为对象的例子中，序列表的序列号104记载的碱基序列中从第1个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列的第48位所对应的氨基酸残基Trp被变更为其它氨基酸残基，采用上述修饰方法时，与修饰前的对象相比较，显示出空间体积更大的腈化合物易作为底物的特性变化。因此，获得的表现出特性改变的蛋白质也包含在本发明的修饰酶范围内。
另外，容易推测，通过组合得到的修饰酶的突变位点，可获得附加的特性改变。因此，上述经突变位点组合而得到的修饰酶也包含在本发明的修饰酶范围之内。
本发明中编码修饰酶的基因是指，以形成构成修饰酶的2种多肽链为特征的2个氨基酸序列，或形成以编码上述2个氨基酸序列为特征的2个ORF的碱基序列。
本发明中以含有基因为特征的质粒是指具有下述特征的质粒，即，该质粒的序列中含有形成下述2个ORF的碱基序列，所述2个ORF的特征为编码下述2个氨基酸序列，而所述2个氨基酸序列的特征为形成构成修饰酶的2种多肽链。
上述质粒除本发明的基因之外，还可具有能够通过转化任意宿主细胞得到的转化子或细胞株生产修饰酶的所需的结构，如各基因表达中必需的控制区域及自我复制的必需区域等。此处所谓任意的宿主细胞，例如为下述实施例中举出的大肠杆菌，但并不限定于此，也可以使用枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌、酵母菌或链霉菌属等其它微生物。
作为表达中必需的控制区域，可以举出启动子序列(含有控制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。
具体的启动子序列，可以举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的Trp启动子、乳糖操纵子的Lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子和PR启动子；以及来源于枯草芽胞杆菌的葡糖醛酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)和α-淀粉酶启动子(amy)等。另外也可以利用人为设计、改良的序列，如tac启动子或trc启动子。
作为核糖体结合序列可以举出来源于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的序列或红球菌属/假诺卡氏菌属固有的序列，只要是能在诸如大肠杆菌或枯草芽胞杆菌等所希望的宿主细胞中起作用的序列即可，没有特别的限制。例如，可以利用由DNA合成制备的下述共有序列，所述共有序列由4个或4个以上连续碱基组成，并可与16S核糖体RNA的3’-末端区互补。转录终止序列不是必须的，然而，可以利用ρ-因子非依赖性序列，例如，脂蛋白终止子或trp操纵子终止子等。上述控制区域在质粒上的序列顺序优选为，启动子序列和核糖体结合序列位于靠近5’-末端侧本发明基因的上游位置，转录终止序列位于靠近3’-末端侧本发明基因的下游的位置。编码构成本发明基因的各种ORF的碱基序列可以通过上述控制区域以各自独立的顺反子形式进行表达，也可以通过共同的控制区域以多顺反子形式进行表达。
作为满足上述要求的质粒载体实例，可以举出在大肠杆菌中具有可自我复制的区域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101；在枯草芽胞杆菌中具有可自我复制的区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等。另外，作为可在2种或2种以上宿主细胞中进行自我复制的质粒载休实例可以举出，pHV14、TRp7、YEp7和pBS7。
本发明中表达基因以生产具有所期望的活性的腈水合酶时，有时需要参与腈水合酶激活的蛋白质。
参与腈水合酶激活的蛋白质是具有下述性质的蛋白质，即，所述蛋白质表达与否直接影响腈水合酶的激活，可以举出专利文献4中记载的参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶激活的蛋白质(腈水合酶激活蛋白质)。具体而言，作为腈水合酶激活蛋白质可以举出由序列号102的氨基酸序列所表示的144个氨基酸的序列构成的蛋白质。另外，将序列号102的氨基酸序列的一部分氨基酸置换、插入或缺失等得到的突变蛋白质只要参与腈水合酶的激活，则也包含在腈水合酶激活蛋白质的范畴内。作为上述突变蛋白质，可以举出具有对序列号102的氨基酸序列中一个或一个以上氨基酸进行置换、插入或缺失等处理而得到的突变并保持参与腈水合酶激活的性质的蛋白质。
作为编码腈水合酶激活蛋白质的基因，只要是编码腈水合酶激活蛋白质的基因即可，并无特别的限制。作为上述基因，可以举出具有编码上述序列号102的氨基酸序列的碱基序列的基因、及编码上述突变蛋白质的基因。另外，作为编码上述腈水合酶激活蛋白质的基因的优选例，可以举出具有序列号103的碱基序列的基因。编码腈水合酶激活蛋白质的基因中，即使是对序列号103记载的碱基序列中的1个、2个或2个以上碱基进行置换、插入、缺失而得到的序列，只要其能够作为编码腈水合酶激活蛋白质的基因而发挥作用，则也包含在编码腈水合酶激活蛋白质的基因的范围之内。
在使用编码腈水合酶激活蛋白质的基因时，可以举出例如将其ORF与本发明中形成基因的2个ORF共同包含在本发明的质粒中。此时，上述ORF在质粒上的顺序没有特别的限制，另外，可以是3个ORF被同一个控制区域控制；也可以是2个ORF被同一个控制区域控制、而剩余1个ORF被不同于前2个ORF的控制区域的控制区域控制；还可以是3个ORF各自被不同的控制区域控制。
如上所述，将本发明的基因与本发明中修饰酶的活性表达所必需的区域一同插入上述质粒载体中，从而构建本发明的质粒的方法、或利用所述质粒将所希望的宿主细胞转化的方法、以及在上述转化子内生产腈水合酶的方法，可以利用例如“《分子克隆第三版》(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)”等记载的分子生物学、生物工程学和基因工程学领域中公知的普通方法和宿主细胞。
本发明中以通过转化而获得为特征的转化子中，包含利用本发明的基因或质粒转化宿主细胞而得到的转化子。作为培养所述转化子的例子，可以举出以下述步骤特征的方法：将其接种到培养基中之后，在适当的培养温度(一般而言为20℃～50℃)下进行培养。
需要说明的是，当宿主细胞为微生物时，一般使用LB培养基或M9培养基等作为培养上述转化子的培养基，但也可以在上述培养基成分中添加金属离子。作为添加的金属离子可以举出Fe离子及Co离子。添加量例如为0.1μg/mL或0.1μg/mL以上。
本发明中修饰酶的制备方法以下述步骤为特征：从培养转化子得到的培养液、细胞、或其处理物中回收修饰酶，可以举出具有如下特征的方法，即，该方法包含从上述转化子、所述转化子的培养液、或者所述转化子或培养液的处理物中回收活性腈水合酶的步骤。
本发明中以包含将腈化合物转化为对应酰胺化合物的步骤为特征的酰胺化合物制备方法，可以举出以含有下述转化步骤为特征的方法，所述步骤为使用上述转化子、所述转化子的培养液、或所述转化子或所述培养液的处理物、或经上述制备方法回收的活性腈水合酶作为催化剂，从而将腈化合物转化为对应的酰胺化合物的步骤。
本发明中作为利用修饰酶或具有该酶活性的转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的例子，可以举出包含下述步骤的方法，即，将所希望的腈化合物与所述酶的精制物或酶的粗产物、本发明中转化子的培养液、从培养液得到的转化子、或者转化子的处理物在溶剂中接触的步骤。此处所谓处理物包括从所述转化子得到的提取物、粉碎物；分离上述提取物或粉碎物中腈水合酶活性成分而得到的酶粗产物；进一步精制而得到的酶精制物等后分离物；以及将所述转化子或所述转化子的提取物、粉碎物或后分离物用适当的方法固定化而得到的固定化物。接触温度没有特别的限制，优选在所述腈水合酶不失活的温度范围内，更优选为凝固点或凝固点以上，60℃或60℃以下。
作为腈化合物，只要是能够作为本发明的改良酶的底物发挥作用的化合物即可，可以举出碳原子为2～4的腈化合物，例如，乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈和α-羟基异丁腈等。所述腈化合物在溶剂中的浓度没有特别的限定，另外，反应温度也无特别的限定，但优选在所述腈水合酶不失活的温度范围内，更优选为凝固点或凝固点以上，50℃或50℃以下。
下面通过实施例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不受到下述实施例的任何限定。应予说明，各实施例及比较例中的HPLC分析使用日本分光制的Finepak SIL C18-5(250×4.6φmm)作为色谱柱，并以含有4体积％乙腈的10mM磷酸水溶液为流动相。利用210nm处的吸光度检测丙烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸。
[参考例1]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(1)
为了将α亚单位中的第6位的Leu置换为Met，使用宝酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”引入位点特异性突变。下文中“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”简称为试剂盒。在以下参考例中基本按照试剂盒的原理和操作方法来进行。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并通过高压灭菌锅进行121℃、20分钟的灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100μg/ml后，使用铂金接菌环将MT-10822接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法由该菌体制备质粒pPT-DB1。
分别以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过下述步骤完成：在分别含有50pmol序列表的序列号7记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过下述步骤完成：在分别含有50pmol MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在扩增DNA产物。使用Microcon 100(宝酒造社制)从各PCR最终反应液中除去过量的引物和dNTP后，加入TE分别配制成50μl的溶液。配制总计47.5μl的分别含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(组成遵照试剂盒中记载的条件)，实施10分钟热变性处理(98℃)后，经60分钟以恒定的速度冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟进行退火处理。将0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火处理液中，并在72℃下加热处理3分钟，由此形成了异源双链。使其进行PCR反应No.3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)及M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol，使总量达到50μl后，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。取5μl PCR反应No.3的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约2kbp的扩增DNA产物。接着从琼脂糖凝胶中仅切出约2kbp的DNA片段，将该琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml的TE溶液中，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对所得熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割上述纯化后的约2kbp的扩增DNA片段，然后对该限制性核酸内切酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段，最终使其溶于10μl的TE中。同样用EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7％)，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml TE溶液中，将其在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化该DNA片段，使该片段最终溶于10μl的TE中。用DNAligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的约2kbp及约2.7kbp的DNA片段进行连接后，转化大肠杆菌HB 101感受态细胞(东洋纺绩社制)，得到转化子No.1。
利用下述方法求出用得到的转化子制备酰胺化合物时的转化率和选择率。
在500ml装有挡板的三角烧瓶中配制含有40μg/ml硫酸铁·七水合物和10μg/ml氯化钴·二水合物的LB液体培养基100ml，并通过高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向该培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100μg/ml。然后使用铂金接菌环将转化子No.1接种在培养基上，并在37℃、130rpm下培养约20小时。通过离心分离(5000G×15分钟)从该最终培养液中分离出菌体，接着将上述分离后的菌体重悬在50ml的生理盐水中，并再次离心分离(5000G×15分钟)出菌体。将0.1g该菌体混悬在20ml、50mM的磷酸钾水溶液(pH7.0)中，向其中加入1ml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在10℃下边缓慢地搅拌边使其反应1小时。反应结束后，用HPLC分析反应液，结果确认了在反应液中仅存在与反应液中添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相当摩尔量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及对应的有机酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，转化率和选择率都是100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表1所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Met。
表1
Figure BSA00000831225700331
[参考例2]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(2)
为了将α亚单位中的第6位的Leu置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过下述步骤而完成：在含有序列表中序列号11记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(以试剂盒中记载的条件组合)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过下述步骤而完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。使用PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在扩增DNA产物。然后，通过进行与包含PCR反应No.2的参考例1完全相同的操作而得到转化子No.2。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果为100％。
然后，利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表2所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr。
表2
[参考例3]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(3)
为了将α亚单位中的第6位的Leu置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过下述步骤完成：在含有序列表中序列号12记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过下述步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.3。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表3所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Ala。
表3
Figure BSA00000831225700351
[参考例4]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(4)
为了将α亚单位中的第6位的Leu置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号13记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.4。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表4所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Val。
表4
Figure BSA00000831225700361
[参考例5]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(5)
为了将α亚单位中的第19位的Ala置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号14记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μL的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μ1进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.5。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表5所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第19位的Ala被置换为Val。
表5
Figure BSA00000831225700371
[参考例6]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(6)
为了将α亚单位中的第38位的Met置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号15记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.6。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表6所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第38位的Met被置换为Leu。
表6
[参考例7]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(7)
为了将α亚单位中第77位的Thr置换为Ser，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号16记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.7。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表7所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第77位的Thr被置换为Ser。
表7
Figure BSA00000831225700391
[参考例8]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(8)
为了将α亚单位中第90位的Gly置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号17记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.8。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表8所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第90位的Gly被置换为Ala。
表8
Figure BSA00000831225700401
[参考例9]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(9)
为了将α亚单位中第102位的Val置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号18记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.9。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表9所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第102位的Val被置换为Ala。
表9
Figure BSA00000831225700411
[参考例10]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(10)
为了将α亚单位中第106位的Val置换为Ile，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过在含有序列表中序列号19记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.10。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表10所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第106位的Val被置换为Ile。
表10
Figure BSA00000831225700421
[参考例11]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(11)
为了将α亚单位中第126位的Phe置换为Tyr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号20记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.11。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表11所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表11
[参考例12]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(12)
为了将α亚单位中第130位的Gln置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号21记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.12。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表12所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第130位的Gln被置换为Glu。
表12
[参考例13]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(13)
为了将α亚单位中第142位的Leu置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号22记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.13。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表13所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第142位的Leu被置换为Val。
表13
Figure BSA00000831225700451
[参考例14]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(14)
为了将α亚单位中第146位的Glu置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号23记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.14。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表14所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第146位的Glu被置换为Asp。
表14
[参考例15]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(15)
为了将α亚单位中第187位的Ala置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号24记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.15。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表15所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第187位的Ala被置换为Thr。
表15
Figure BSA00000831225700471
[参考例16]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(16)
为了将α亚单位中第194位的Ser置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号25记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2以下步骤完成：通过在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.16。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表16所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第194位的Ser被置换为Leu。
表16
Figure BSA00000831225700481
[参考例17]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(17)
为了将α亚单位中第203位的Ala置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号26记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.17。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表17所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第203位的Ala被置换为Glu。
表17
Figure BSA00000831225700491
[参考例18]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(18)
为了将β亚单位中第20位的Ala置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号27记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环而完成，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2以下步骤完成：通过在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作而完成。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.18。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表18所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第20位的Ala被置换为Val。
表18
Figure BSA00000831225700501
[参考例19]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(19)
为了将β亚单位中第21位的Asp置换为Asn，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号28记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.19。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表19所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第21位的Asp被置换为Asn。
表19
Figure BSA00000831225700511
[参考例20]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(20)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号29记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作而完成。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.20。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表20所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp。
表20
Figure BSA00000831225700521
[参考例21]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(21)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Pro，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号30记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.21。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表21所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Pro。
表21
Figure BSA00000831225700531
[参考例22]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(22)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Ser，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号31记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.22。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表22所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Ser。
表22
Figure BSA00000831225700541
[参考例23]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(23)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Arg，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号32记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.23。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表23所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg。
表23
Figure BSA00000831225700551
[参考例24]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(24)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Cys，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号33记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.24。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表24所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Cys。
表24
Figure BSA00000831225700561
[参考例25]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(25)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号34记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.25。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表25所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Leu。
表25
[参考例26]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(26)
为了将β亚单位中第108位的Glu置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号35记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.26。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表26所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Thr。
表26
Figure BSA00000831225700581
[参考例27]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(27)
为了将β亚单位中第200位的Ala置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号36记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.27。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表27所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Asp。
表27
[参考例28]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(28)
为了将β亚单位中第200位的Ala置换为Ile，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号37记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.28。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表28所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Ile。
表28
Figure BSA00000831225700601
[参考例29]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(29)
为了将β亚单位中第200位的Ala置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号38记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.29。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表29所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Val。
表29
[参考例30]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(30)
为了将β亚单位中第200位的Ala置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号39记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.30。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表30所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表30
Figure BSA00000831225700621
[参考例31]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(31)
为了将β亚单位中第212位的Ser置换为Tyr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与参考例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng参考例1制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号40记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.31。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表31所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表31
Figure BSA00000831225700631
[参考例32]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(32)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.5的氨基酸突变(α亚单位中第19位的Ala变为Val)和克隆No.11的氨基酸突变(α亚单位中第126位的Phe变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例11得到的克隆No.11接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备克隆No.11的质粒DNA。
以1μg克隆No.11的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号14记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.32。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表32所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表32
Figure BSA00000831225700641
[参考例33]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(33)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.1的氨基酸突变(α亚单位的第6位的Leu变为Met)和克隆No.32的氨基酸突变(α亚单位的第19位的Ala变为Val、α亚单位的第126位的Phe变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例32得到的克隆No.32接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备克隆No.32的质粒DNA。
以1μg克隆No.32的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号7记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.33。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表33所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Met、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表33
Figure BSA00000831225700651
[参考例34]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(34)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.2的氨基酸突变(α亚单位的第6位的Leu变为Thr)和克隆No.32的氨基酸突变(α亚单位的第19位的Ala变为Val、α亚单位的第126位的Phe变为Tyr)。
以1μg参考例33中制备的克隆No.33的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号11记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.34。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表34所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表34
Figure BSA00000831225700661
[参考例35]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(35)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.3的氨基酸突变(α亚单位的第6位的Leu变为Ala)和克隆No.32的氨基酸突变(α亚单位的第19位的Ala变为Val、α亚单位的第126位的Phe变为Tyr)。
以1μg参考例33中制备的克隆No.33的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号12记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作而完成。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.35。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表35所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Ala、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表35
Figure BSA00000831225700681
[参考例36]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(36)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.20的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Asp)和克隆No.31的氨基酸突变(β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例31得到的克隆No.31接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备克隆No.31的质粒DNA。
以1μg克隆No.31的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号29记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.36。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表36所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表36
Figure BSA00000831225700691
[参考例37]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(37)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.23的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Arg)和克隆No.31的氨基酸突变(β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
以1μg参考例36中制备的克隆No.36的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号32记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.37。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表37所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表37
Figure BSA00000831225700701
[参考例38]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(38)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.27的氨基酸突变(β亚单位的第200位的Ala变为Asp)和克隆No.31的氨基酸突变(β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
以1μg参考例36中制备的克隆No.36的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号36记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.38。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表38所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Asp、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表38
Figure BSA00000831225700711
[参考例39]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(39)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.30的氨基酸突变(β亚单位的第200位的Ala变为Glu)和克隆No.31的氨基酸突变(β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
以1μg参考例36中制备的克隆No.36的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号39记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作而完成。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与参考例1完全相同的操作而得到转化子No.39。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表39所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表39
Figure BSA00000831225700721
[实施例1]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(40)
为了将α亚单位中第36位的Thr置换为Met，使用宝酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”引入位点特异性突变。下文中“LAPCR in vitro mutagenesis Kit”简称为试剂盒。在以下实施例中基本按照试剂盒的原理和操作方法来进行。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml。使用铂金及菌环将MT-10822接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，以碱性SDS提取法利用该菌体制备质粒pPT-DB1。
分别以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号41记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μ1的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。使用Microcon 100(宝酒造社制)从各种PCR最终反应液中除去过量的引物和dNTP后，加入TE分别配制成50μl的溶液。配制总计47.5μl的分别含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(组成遵照试剂盒中记载的条件)，实施10分钟热变性处理(98℃)后，以恒定的速度经60分钟冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟进行退火处理。将0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火处理液中，并在72℃下加热处理3分钟，由此完成了异源双链的形成。通过以下步骤进行PCR反应No.3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)及M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol使总量达到50μl后，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。用5μl PCR反应No.3的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约2kbp的扩增DNA产物。接着从琼脂糖凝胶中仅切出约2kbp的DNA片段，将该琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml的TE溶液中，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将所得熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割上述纯化后的约2kbp的扩增DNA片段，然后对该限制性核酸内切酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μl TE中。同样用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7％)，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml TE溶液中，将其在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化该DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的约2kbp及约2.7kbp的DNA片段进行连接后，对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.40。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表40所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第36位的Thr被置换为Met。
表40
[实施例2]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(41)
为了将α亚单位中第71位的Arg置换为His，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号42记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.41。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表41所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第71位的Arg被置换为His。
表41
Figure BSA00000831225700751
[实施例3]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(42)
为了将α亚单位中第148位的Gly置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号43记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.42。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表42所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第148位的Gly被置换为Asp。
表42
[实施例4]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(43)
为了将α亚单位中第204位的Val置换为Arg，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号44记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μ1的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.43。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表43所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第204位的Val被置换为Arg。
表43
Figure BSA00000831225700771
[实施例5]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(44)
为了将α亚单位中第204位的Val置换为Lys，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号45记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.44。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表44所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第204位的Val被置换为Lys。
表44
Figure BSA00000831225700781
[实施例6]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(45)
为了将α亚单位中第204位的Val置换为Trp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号46记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.45。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表45所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第204位的Val被置换为Trp。
表45
Figure BSA00000831225700791
[实施例7]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(46)
为了将α亚单位中第204位的Val置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号47记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.46。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表46所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第204位的Val被置换为Thr。
表46
Figure BSA00000831225700801
[实施例8]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(47)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号48记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μ1的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.47。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表47所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Asp。
表47
Figure BSA00000831225700811
[实施例9]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(48)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号49记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列、)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.48。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表48所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Glu。
表48
[实施例10]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(49)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Trp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号50记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.49。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表49所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Trp。
表49
Figure BSA00000831225700831
[实施例11]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(50)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号51记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.50。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表50所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Gly。
表50
Figure BSA00000831225700841
[实施例12]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(51)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Tyr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号52记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.51。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表51所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Tyr。
表51
[实施例13]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(52)
为了将β亚单位中第10位的Thr置换为Cys，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号53记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.52。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表52所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Cys。
表52
Figure BSA00000831225700861
[实施例14]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(53)
为了将β亚单位中第32位的Val置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号54记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μ1的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.53。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表53所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第32位的Val被置换为Gly。
表53
[实施例15]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(54)
为了将β亚单位中第37位的Phe置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号55记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.54。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表54所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Thr。
表54
Figure BSA00000831225700881
[实施例16]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(55)
为了将β亚单位中第37位的Phe置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号56记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.55。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表55所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Ala。
表55
Figure BSA00000831225700891
[实施例17]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(56)
为了将β亚单位中第37位的Phe置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号57记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环而完成，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.56。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表56所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Leu。
表56
Figure BSA00000831225700901
[实施例18]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(57)
为了将β亚单位中第37位的Phe置换为Ile，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号58记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环而完成，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.57。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表57所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Ile。
表57
[实施例19]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(58)
为了将β亚单位中第37位的Phe置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号59记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.58。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表58所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Val。
表58
Figure BSA00000831225700921
[实施例20]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(59)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号60记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.59。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表59所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Glu。
表59
Figure BSA00000831225700931
[实施例21]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(60)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号61记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.60。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表60所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Thr。
表60
Figure BSA00000831225700941
[实施例22]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(61)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Ala，以pPT-DBl质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号62记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环而完成，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.61。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表61所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Ala。
表61
Figure BSA00000831225700951
[实施例23]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(62)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号63记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.62。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表62所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Leu。
表62
Figure BSA00000831225700961
[实施例24]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(63)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Ile，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号64记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.63。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表63所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Ile。
表63
[实施例25]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(64)
为了将β亚单位中第41位的Phe置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号65记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.64。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表64所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Val。
表64
[实施例26]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(65)
为了将β亚单位中第46位的Met置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号66记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.65。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表65所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Gly。
表65
[实施例27]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(66)
为了将β亚单位中第46位的Met置换为Tyr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号67记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.66。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表66所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Tyr。
表66
[实施例28]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(67)
为了将β亚单位中第46位的Met置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DBl质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号68记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.67。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表67所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Leu。
表67
Figure BSA00000831225701011
[实施例29]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(68)
为了将β亚单位中第46位的Met置换为Lys，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号69记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol MUT4引物的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.68。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表68所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Lys。
表68
Figure BSA00000831225701021
[实施例30]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(69)
为了将β亚单位中第46位的Met置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号70记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.69。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表69所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Asp。
表69
Figure BSA00000831225701031
[实施例31]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(70)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号71记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.70。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表70所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Gly。
表70
Figure BSA00000831225701041
[实施例32]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(71)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DBl质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号72记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列、)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％、)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.71。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表71所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Ala。
表71
Figure BSA00000831225701051
[实施例33]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(72)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号73记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.72。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表72所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Val。
表72
Figure BSA00000831225701061
[实施例34]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(73)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Ser，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号74记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列、)各50pmol的总计50μ1的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％、)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.73。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表73所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Ser。
表73
Figure BSA00000831225701071
[实施例35]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(74)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Thr，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DBl质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号75记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列、)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％、)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.74。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表74所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Thr。
表74
Figure BSA00000831225701081
[实施例36]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(75)
为了将β亚单位中第48位的Leu置换为Arg，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DBl质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号76记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列、)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％、)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.75。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表75所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Arg。
表75
Figure BSA00000831225701091
[实施例37]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(76)
为了将β亚单位中第51位的Phe置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号77记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.76。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表76所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第51位的Phe被置换为Ala。
表76
Figure BSA00000831225701101
[实施例38]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(77)
为了将β亚单位中第51位的Phe置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号78记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.77。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表77所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第51位的Phe被置换为Val。
表77
Figure BSA00000831225701111
[实施例39]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(78)
为了将β亚单位中第72位的Trp置换为Phe，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号79记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.78。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表78所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第72位的Trp被置换为Phe。
表78
Figure BSA00000831225701121
[实施例40]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(79)
为了将β亚单位中第118位的Phe置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号80记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.79。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表79所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第118位的Phe被置换为Ala。
表79
Figure BSA00000831225701131
[实施例41]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(80)
为了将β亚单位中第118位的Phe置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号81记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.80。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表80所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第118位的Phe被置换为Leu。
表80
Figure BSA00000831225701141
[实施例42]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(81)
为了将β亚单位中第118位的Phe置换为Ile，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号82记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.81。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表81所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第118位的Phe被置换为Ile。
表81
Figure BSA00000831225701151
[实施例43]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(82)
为了将β亚单位中第118位的Phe置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号83记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.82。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表82所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第118位的Phe被置换为Val。
表82
Figure BSA00000831225701161
[实施例44]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(83)
为了将β亚单位中第127位的Leu置换为Ala，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号84记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.83。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表83所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第127位的Leu被置换为Ala。
表83
Figure BSA00000831225701171
[实施例45]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(84)
为了将β亚单位中第127位的Leu置换为Val，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号85记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.84。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表84所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第127位的Leu被置换为Val。
表84
Figure BSA00000831225701181
[实施例46]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(85)
为了将β亚单位中第127位的Leu置换为Ser，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号86记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.85。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表85所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第127位的Leu被置换为Ser。
表85
Figure BSA00000831225701191
[实施例47]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(86)
为了将β亚单位中第146位的Arg置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号87记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.86。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表86所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第146位的Arg被置换为Gly。
表86
Figure BSA00000831225701201
[实施例48]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(87)
为了将β亚单位中第160位的Arg置换为Leu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号88记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.87。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表87所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第160位的Arg被置换为Leu。
表87
Figure BSA00000831225701211
[实施例49]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(88)
为了将β亚单位中第160位的Arg置换为Trp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号89记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.88。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表88所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第160位的Arg被置换为Trp。
表88
Figure BSA00000831225701221
[实施例50]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(89)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Glu，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号90记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.89。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表89所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Glu。
表89
Figure BSA00000831225701231
[实施例51]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(90)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Asp，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号91记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.90。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表90所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Asp。
表90
Figure BSA00000831225701241
[实施例52]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(91)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Lys，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号92记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.91。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表91所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Lys。
表91
Figure BSA00000831225701251
[实施例53]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(92)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Arg，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号93记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.92。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表92所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Arg。
表92
Figure BSA00000831225701261
[实施例54]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(93)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Asn，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号94记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.93。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表93所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Asn。
表93
Figure BSA00000831225701271
[实施例55]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(94)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Ser，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号95记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.94。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表94所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Ser。
表94
Figure BSA00000831225701281
[实施例56]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(95)
为了将β亚单位中第186位的Leu置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号96记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.95。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表95所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第186位的Leu被置换为Gly。
表95
[实施例57]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(96)
为了将β亚单位中第217位的Asp置换为Gly，以pPT-DB1质粒DNA为模板，通过进行与实施例1相同的操作而引入位点特异性突变。
分别以10ng实施例1中制备的pPT-DB1质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号97记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。取PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.96。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果确认了表96所示的克隆中腈水合酶的β亚单位中第217位的Asp被置换为Gly。
表96
Figure BSA00000831225701301
[实施例58]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(97)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.40的氨基酸突变(α亚单位的第36位的Thr变为Met)和克隆No.11的氨基酸突变(α亚单位的第126位的Phe变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例11得到的克隆No.11接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号41记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.97。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表97所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第36位的Thr被置换为Met、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表97
[实施例59]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(98)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.42的氨基酸突变(α亚单位的第148位的Gly变为Asp)和克隆No.43的氨基酸突变(α亚单位的第204位的Val变为Arg)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后将一白金环实施例4得到的克隆No.43接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号43记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.98。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表98所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第148位的Gly被置换为Asp、α亚单位中第204位的Val被置换为Arg。
表98
Figure BSA00000831225701321
[实施例60]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(99)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.77的氨基酸突变(β亚单位的第51位的Phe变为Val)和克隆No.20的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Asp)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例20得到的克隆No.20接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号78记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.99。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表99所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第51位的Phe被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp。
表99
Figure BSA00000831225701331
[参考例40]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(100)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.20的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Asp)和克隆No.30的氨基酸突变(β亚单位的第200位的Ala变为Glu)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例30得到的克隆No.30接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号29记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.100。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表100所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表100
[实施例61]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(101)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.82的氨基酸突变(β亚单位的第118位的Phe变为Val)和克隆No.30的氨基酸突变(β亚单位的第200位的Ala变为Glu)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例30得到的克隆No.30接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号83记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.101。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表101所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第118位的Phe被置换为Val、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表101
Figure BSA00000831225701361
[实施例62]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(102)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.88的氨基酸突变(β亚单位的第160位的Arg变为Trp)和克隆No.92的氨基酸突变(β亚单位的第186位的Leu变为Arg)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例53得到的克隆No.92接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号89记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.102。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表102所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第160位的Arg被置换为Trp、β亚单位中第186位的Leu被置换为Arg。
表102
Figure BSA00000831225701371
[实施例63]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(103)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.2的氨基酸突变(α亚单位的第6位的Leu变为Thr)和克隆No.97的氨基酸突变(α亚单位的第36位的Thr变为Met、α亚单位中第126位的Phe变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将实施例58得到的克隆No.97接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号11记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.103。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表103所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr、α亚单位中第36位的Thr被置换为Met、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表103
Figure BSA00000831225701391
[实施例64]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(104)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.41的氨基酸突变(α亚单位的第71位的Arg变为His)和克隆No.32的氨基酸突变(α亚单位的第19位的Ala变为Val、α亚单位中第126位的Phe变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将参考例32得到的克隆No.32接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号42记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.104。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表104所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第71位的Arg被置换为His、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr。
表104
Figure BSA00000831225701401
[实施例65]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(105)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.40的氨基酸突变(α亚单位的第36位的Thr变为Met)和克隆No.98的氨基酸突变(α亚单位的第148位的Gly变为Asp、α亚单位中第204位的Val变为Arg)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例59得到的克隆No.98接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号41记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.105。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表105所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第36位的Thr被置换为Met、α亚单位中第148位的Gly被置换为Asp、α亚单位中第204位的Val被置换为Arg。
表105
Figure BSA00000831225701411
[实施例66]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(106)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.47的氨基酸突变(β亚单位的第10位的Thr变为Asp)和克隆No.101的氨基酸突变(β亚单位的第118位的Phe变为Val、β亚单位中第200位的Ala变为Glu)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将实施例61得到的克隆No.101接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号48记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.106。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表106所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第10位的Thr被置换为Asp、β亚单位中第118位的Phe被置换为Val、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表106
Figure BSA00000831225701431
[实施例67]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(107)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.56的氨基酸突变(β亚单位的第37位的Phe变为Leu)和克隆No.100的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Asp、β亚单位中第200位的Ala变为Glu)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将参考例40得到的克隆No.100接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号57记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.107。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表107所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Leu、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表107
Figure BSA00000831225701441
[实施例68]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(108)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.58的氨基酸突变(β亚单位的第37位的Phe变为Val)和克隆No.100的氨基酸突变(β亚单位的第108位的Glu变为Asp、β亚单位中第200位的Ala变为Glu)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例40得到的克隆No.100接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号59记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.108。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表108所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第37位的Phe被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表108
Figure BSA00000831225701451
[实施例69]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(109)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.63的氨基酸突变(β亚单位的第41位的Phe变为Ile)和克隆No.99的氨基酸突变(β亚单位中第51位的Phe变为Val、β亚单位的第108位的Glu变为Asp)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例60得到的克隆No.99接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号64记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.109。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表109所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第41位的Phe被置换为Ile、β亚单位中第51位的Phe被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp。
表109
[实施例70]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(110)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.68的氨基酸突变(β亚单位的第46位的Met变为Lys)和克隆No.37的氨基酸突变(β亚单位中第108位的Glu变为Arg、β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例37得到的克隆No.37接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号69记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.110。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表110所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第46位的Met被置换为Lys、β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表110
[实施例71]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(111)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.72的氨基酸突变(β亚单位的第48位的Leu变为Val)和克隆No.37的氨基酸突变(β亚单位中第108位的Glu变为Arg、β亚单位的第212位的Ser变为Tyr)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将参考例37得到的克隆No.37接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号73记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.111。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表111所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第48位的Leu被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表111
[实施例72]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(112)
确认了在下述氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置换体同时具有克隆No.85的氨基酸突变(β亚单位的第127位的Leu变为Ser)和克隆No.102的氨基酸突变(β亚单位中第160位的Arg变为Trp、β亚单位的第186位的Leu变为Arg)。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例62得到的克隆No.102接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体制备质粒DNA。
分别以10ng制备的质粒DNA为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应No.1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号86记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述各反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)120秒。PCR反应No.2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应No.1同样的操作。以PCR反应No.1及No.2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确定扩增DNA产物的存在。然后，通过进行与实施例1完全相同的操作而得到转化子No.112。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表112所示，野生型的腈水合酶的β亚单位中第127位的Leu被置换为Ser、β亚单位中第160位的Arg被置换为Trp、β亚单位中第186位的Leu被置换为Arg。
表112
Figure BSA00000831225701511
[实施例73]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(113)
确认了同时具有克隆No.34的氨基酸突变和克隆No.110的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例34得到的克隆No.34和实施例70得到的克隆No.110接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.34和克隆No.110的质粒DNA。
将克隆No.110的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.34的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.110的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.34的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩社制)，得到转化子No.113。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表113所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第46位的Met被置换为Lys、β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
[表113]
Figure BSA00000831225701521
[实施例74]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(114)
确认了同时具有克隆No.34的氨基酸突变和克隆No.111的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将参考例34得到的克隆No.34和实施例71得到的克隆No.111接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以所述菌体分别制备克隆No.34和克隆No.111的质粒DNA。
将克隆No.111的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.34的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.111的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.34的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB 101的感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.114。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表114所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第48位的Leu被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Arg、β亚单位中第212位的Ser被置换为Tyr。
表114
Figure BSA00000831225701541
[实施例75]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(115)
确认了同时具有克隆No.35的氨基酸突变和克隆No.112的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将一白金环参考例35得到的克隆No.35和实施例72得到的克隆No.112接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.35和克隆No.112的质粒DNA。
将克隆No.112的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.35的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.112的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.35的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.115。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表115所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Ala、α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第127位的Leu被置换为Ser、β亚单位中第160位的Arg被置换为Trp、β亚单位中第186位的Leu被置换为Arg。
[表115]
Figure BSA00000831225701551
[实施例76]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(116)
确认了同时具有克隆No.103的氨基酸突变和克隆No.106的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例63得到的克隆No.103和实施例66得到的克隆No.106接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.103和克隆No.106的质粒DNA。
将克隆No.106的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.103的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.106的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.103的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB 101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.116。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表116所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Thr、α亚单位中第36位的Thr被置换为Met、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第10位的Thr被置换为Asp、β亚单位中第118位的Phe被置换为Val、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表116
Figure BSA00000831225701571
[实施例77]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(117)
确认了同时具有克隆No.104的氨基酸突变和克隆No.107的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金灭菌环将实施例64得到的克隆No.104和实施例67得到的克隆No.107接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.104和克隆No.107的质粒DNA。
将克隆No.107的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.104的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.107的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.104的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB 101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.117。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表117所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第71位的Arg被置换为His、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第37位的Phe被置换为Leu、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表117
Figure BSA00000831225701581
[实施例78]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(118)
确认了同时具有克隆No.104的氨基酸突变和克隆No.108的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例64得到的克隆No.104和实施例68得到的克隆No.108接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.104和克隆No.108的质粒DNA。
将克隆No.108的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.104的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.108的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.104的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB 101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.118。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表118所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第19位的Ala被置换为Val、α亚单位中第71位的Arg被置换为His、α亚单位中第126位的Phe被置换为Tyr、β亚单位中第37位的Phe被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表118
Figure BSA00000831225701601
[实施例79]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(119)
确认了同时具有克隆No.105的氨基酸突变和克隆No.109的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例65得到的克隆No.105和实施例69得到的克隆No.109接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.105和克隆No.109的质粒DNA。
将克隆No.109的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.105的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.109的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.105的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.119。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表119所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第36位的Thr被置换为Met、α亚单位中第148位的Gly被置换为Asp、α亚单位中第204位的Val被置换为Arg、β亚单位中第41位的Phe被置换为Ile、β亚单位中第51位的Phe被置换为Val、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp。
表119
Figure BSA00000831225701611
[实施例80]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(120)
确认了同时具有克隆No.98的氨基酸突变和克隆No.100的氨基酸突变的氨基酸置换体中也保持有腈水合酶活性。
在30ml试管中装入10ml的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml，然后使用铂金接菌环将实施例59得到的克隆No.98和参考例40得到的克隆No.100接种在培养基上，并在37℃、300rpm下培养约20小时。取出1ml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpm×5分钟)出各菌体。接着，利用碱性SDS提取法以该菌体分别制备克隆No.98和克隆No.100的质粒DNA。
将克隆No.100的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为1.0％)，从琼脂糖凝胶中切下约770bp的DNA片段。同样将克隆No.98的质粒DNA用EcoRI和NotI切割后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中切下约3.8kbp的DNA片段。将切下的2份琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并分别混悬在1ml TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的来源于克隆No.100的约770bp的DNA片段和来源于克隆No.98的约3.8kbp的DNA片段进行连接以构建质粒，用该质粒对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到转化子No.120。
利用与参考例1相同的方法求出添加率和选择率，结果转化率和选择率为100％。
然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果如表120所示，野生型的腈水合酶的α亚单位中第148位的Gly被置换为Asp、α亚单位中第204位的Val被置换为Arg、β亚单位中第108位的Glu被置换为Asp、β亚单位中第200位的Ala被置换为Glu。
表120
Figure BSA00000831225701631
[实施例81]从紫红红球菌J-1株制备基因组DNA
在500ml装有挡板的三角烧瓶中配制下述组成的培养基100ml，并进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。
培养基的组成：
葡萄糖：10.0g/L、磷酸二氢钾：0.5g/L、磷酸氢二钾：0.5g/L、硫酸镁·七水合物：0.5g/L、酵母提取物：1.0g/L、蛋白胨：7.5g/L，尿素：7.5g/L，氯化钴·六水合物：10.0mg/L，pH7.2。
使用铂金接菌环将专利文献1记载的紫红红球菌J-1株(基于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约，通过专利手续保藏在上述的保藏机构，保藏编号为FERM BP-1478，经申请任何人都可获得)接种在上述培养基上，并在30℃、130rpm下培养约72小时。通过离心分离(15000G×15分钟)仅将菌体从培养液中分离出来，接着将该菌体重悬在50ml的生理盐水中后，再次离心分离而得到湿菌体。
向上述得到的2g湿菌体中加入40ml含有0.15M NaCl的50mMEDTA·2Na的水溶液(pH8.0)使菌体混悬，在90℃下进行10分钟煮沸处理。将该处理液冷却至37℃，向其中加入100mg蛋白溶菌酶并在37℃下保温1小时。接着向其中加入30mg、20000U/mg的酶解酶(zymolylase)，并在37℃下保温1小时。然后向其中加入5mg、20U/mg的蛋白酶K，并在37℃下保温1小时。进一步向其中加入2ml的10％SDS溶液并在65℃下保温1小时后，立即进行苯酚/氯仿萃取。首先，加入42ml用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)饱和的苯酚液并缓慢搅拌。进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并仅收集水相。向所得水相中加入21ml上述TE饱和的苯酚液和21ml氯仿，并再次进行缓慢搅拌。然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并再次仅收集水相。向所得水相中加入42ml氯仿并再次进行缓慢搅拌，然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，仅收集水相。向该水相中加入4ml含有1.1M NaCl的TE溶液和92ml乙醇并在室温下放置一段时间后，用玻璃棒卷取析出的丝状DNA。以70％、80％、90％的乙醇水溶液依次脱水后，将自然干燥的该DNA再次溶于40ml TE溶液中。向其中加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时。接着以限制性核酸内切酶BamHI进行部分切割。通过苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀将部分切割的该DNA再次纯化，并溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/ml。
[实施例82]利用PCR从紫红红球菌J-1株基因组DNA制备腈水合酶基因
基于专利文献2及非专利文献1中公开的腈水合酶基因的碱基序列合成了序列表的序列号105及106记载的引物。以3μg实施例81中制备的部分切割的染色体DNA为模板进行PCR。PCR反应为：在分别含有200ng各引物和1U KOD聚合酶(东洋纺绩社制)的总计50μl的反应系统中，将下述循环重复40次：热变性(98℃)15秒、退火(58℃)15秒、链延长反应(68℃)2分钟。将PCR反应的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约1.3kbp的扩增DNA产物。
接着从琼脂糖凝胶中仅切出约1.3kbp的DNA片段，将该琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml的TE溶液中，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将所得熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)饱和的苯酚液并缓慢搅拌。进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并仅收集水相。将上述操作重复3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE饱和的苯酚液和0.4ml氯仿，并再次进行缓慢搅拌。然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并再次仅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次进行缓慢搅拌，然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，仅收集水相。向该水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分钟后，离心分离(15000rpm、20分钟、4℃)以回收DNA片段的沉淀。将该DNA片段风干后溶于10μl的TE中。
将纯化的约1.3kbp的扩增DNA片段用限制性核酸内切酶EcoRI和ScaI进行切割后，以琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制的VII型低熔点琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)分析DNA扩增产物时，可以确认存在约1.3kbp的DNA。从琼脂糖凝胶中切下上述约1.3kbp的DNA片段。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1mlTE溶液中，将其在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mMEDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；PH8.0)饱和的苯酚液并缓慢搅拌。进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并仅收集水相。将上述操作重复3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE饱和的苯酚液和0.4ml氯仿，并再次进行缓慢搅拌。然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并再次仅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次进行缓慢搅拌后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，仅收集水相。向该水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分钟后，离心分离(15000rpm、20分钟、4℃)以回收DNA片段的沉淀。将该DNA片段风干后溶于10μl的TE中。
[实施例83]使来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶基因得以表达的质粒载体的制备
在500ml装有挡板的三角烧瓶中配制100ml含有40μg/ml硫酸铁·七水合物和10μg/ml氯化钴·六水合物的下述组成的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。
培养基的组成：
酵母提取物：5.0g/L、聚蛋白胨：10.0g/L、NaCl：5.0g/L、氯化钴·六水合物：10.0mg/L、硫酸铁·七水合物：40.0mg/L，pH7.5。
向上述培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml后，使用铂金接菌环将专利文献3记载的MT10822(FERM BP-5785)接种在上述培养基上，并在37℃、130rpm下培养16小时。通过离心分离(15000G×15分钟)仅将菌体从培养液中分离出来，接着将该菌体重悬在50ml的生理盐水中后，再次离心分离而得到湿菌体。利用碱性SDS提取法从该湿菌体制备pPT-DB1(图1)的质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。
将1μg纯化的质粒用限制性核酸内切酶EcoRI和Eco47III进行切割后，以琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制的VII型低熔点琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)分析DNA扩增产物时，可以确认存在约3.3kbp和约1.3kbp的DNA。从琼脂糖凝胶中仅切下约3.3kbp的DNA片段。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml TE溶液中后，将其在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mMEDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)饱和的苯酚液并缓慢搅拌。进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，仅收集水相。将上述操作重复3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE饱和的苯酚液和0.4ml氯仿后再次进行缓慢搅拌。然后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，并再次仅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次进行缓慢搅拌后，再次进行离心(3000rpm、10分钟)以分离水相和有机相，仅收集水相。向该水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分钟后，离心分离(15000rpm、20分钟、4℃)以回收DNA片段的沉淀。将该DNA片段风干后溶于10μl的TE中。
[实施例84]使来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶活性得以表现的转化子的构建
将实施例82中制备的经EcoRI和ScaI切割的约1.3kbp的DNA片段和实施例83中制备的经EcoRI和Eco47III切割的约3.3kbp的DNA片段混合，进行DNA连接反应。用反应产物转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩社制)，得到转化子No.200。
在500ml装有挡板的三角烧瓶中配制100ml含有40μg/ml硫酸铁·七水合物和10μg/ml氯化钴·六水合物的LB液体培养基，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向该培养基中加入氨苄青霉素使最终浓度为100μg/ml后，使用铂金接菌环将转化子No.200接种在上述培养基上，并在37℃、130rpm下培养约20小时。通过离心分离(5000G×15分钟)将该转化子从该最终培养液中分离出来，接着将分离的该转化子重悬在50ml的生理盐水中后，再次离心分离(5000G×15分钟)而分离该转化子。
将0.1g分离的该转化子混悬在20ml、50mM的磷酸钾水溶液(pH7.0)中，向其中加入0.5ml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在30℃下边缓慢地搅拌边使其反应1小时。反应结束后，用HPLC分析最终反应液，结果确认了在最终反应液中仅存在与添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相当摩尔量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及对应的有机酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，转化率和选择率为100％。
利用碱性SDS提取法从分离的该转化子制备质粒，加入30μgRNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。结果确认了该质粒的序列中含有序列表的序列号103记载的编码腈水合酶激活蛋白质的ORF和序列表的序列号104记载的编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的ORF。该质粒取名为pJ1H-DB1(图2)。
[实施例85]从修饰前的腈水合酶中提取将要引入突变的目标(1)
作为修饰方法的对象，以来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶作为例子。以权利要求56～62记载的确定作为将要引入突变的目标的氨基酸残基的方法为例，进行目标的提取。权利要求56、57记载的确定方法中的氨基酸序列对比使用日立SOFT社制的DNASIS。权利要求58～62记载的确定方法中基于氨基酸序列对比的立体结构模拟使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
结果，采用任一方法提取的氨基酸残基中均含有作为构成该腈水合酶的两种多肽之一的β亚单位的氨基酸序列中第48位的Trp。因此，用来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第48位的Trp为例来作为引入突变的目标。
[实施例86]从修饰前的腈水合酶中提取将要引入突变的目标(2)
作为修饰方法的对象，以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶作为例子。以权利要求56～62记载的确定作为将要引入突变的目标的氨基酸残基的方法为例，进行目标的提取。权利要求56、57记载的确定方法中的氨基酸序列对比使用日立SOFT社制的DNASIS。权利要求58～62记载的确定方法中基于氨基酸序列对比的立体结构模拟使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
结果，作为在形成下述孔穴的区域中存在而被提取的氨基酸残基中，以如下氨基酸残基作为各引入突变的目标的代表例，即，作为构成该腈水合酶的两种多肽之一的α亚单位的氨基酸序列中第36位的Thr、第48位的Asn、以及作为另一种多肽的β亚单位的氨基酸序列中第32位的Val、第33位的Ala、第37位的Phe、第40位的Thr、第41位的Phe、第46位的Met、第48位的Leu、第51位的Phe、第61位的Ala、第72位的Trp、第112位的Lys、第118位的Phe、第127位的Leu；上述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴。
[实施例87]从修饰前的腈水合酶中提取将要引入突变的目标(3)
作为修饰方法的对象，以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶作为例子。以权利要求56～62记载的确定作为引入突变的目标的氨基酸残基的方法为例，进行目标的提取。权利要求56、57记载的确定方法中的氨基酸序列对比使用日立SOFT社制的DNASIS。权利要求58～62记载的确定方法中基于氨基酸序列对比的立体结构模拟使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
结果，作为在形成下述界面的区域中存在的氨基酸残基被提取的氨基酸残基中，以下述氨基酸残基作为各引入突变的目标的代表例，即，作为构成该腈水合酶的两种多肽之一的α亚单位的氨基酸序列中第36位的Thr、第148位的Gly、第188位的Thr、第204位的Val、以及作为另一多肽的β亚单位的氨基酸序列中第10位的Thr、第32位的Val、第33位的Ala、第112位的Lys、第118位的Phe、第127位的Leu、第146位的Arg、第150位的Ala、第160位的Arg、第168位的Thr、第171位的Lys、第176位的Tyr、第186位的Leu、第217位的Asp、第218位的Cys；上述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面。
[实施例88]用于获得修饰酶的突变引入(1)
为了将突变引入构成腈水合酶的多肽的氨基酸序列中，使用宝酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”进行位点特异性突变的引入。下文中“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”简称为试剂盒。在以下实施例中基本按照试剂盒的原理和操作方法来进行。
在实施例84中构建的、含有编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的ORF的质粒pJ1H-DB1中，实施下述突变引入处理，即，将实施例85中提取的、作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第48位的Trp转换成其它氨基酸。
以10ng pJ1H-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号110记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的反应。
以PCR反应1及2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认均存在扩增DNA产物。使用Microcon 100(宝酒造社制)从各PCR最终反应液中除去过剩的引物和dNTP后，加入TE分别配制成50μl的溶液。分别配制总计47.5μl的含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(组成遵照试剂盒中记载的条件)，实施10分钟热变性处理(98℃)后，用60分钟以恒定的速度冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟进行退火处理。
将0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火处理液中，并在72℃下加热处理3分钟，由此完成了异源双链的形成。接着对其进行PCR反应3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)及M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol使总量达到50μl后，将下述反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。
用5μl PCR反应3的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约1.9kbp的扩增DNA产物。接着从琼脂糖凝胶中仅切出约1.9kbp的DNA片段，将该琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml的TE溶液中后，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将所得熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。
用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割上述纯化的约1.9kbp的扩增DNA片段，然后对该限制性核酸内切酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶解于10μlTE中。同样用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割pJ1H-DB1后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7％)，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml TE溶液中，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化该DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。
将由此得到的约1.9kbp及约2.7kbp的DNA片段进行DNA连接反应后，对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pJ1H-DB1相比较，编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，变化为编码除Trp以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表121)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表121
Figure BSA00000831225701721
[实施例89]用于获得修饰酶的突变引入(2)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中作为引入突变的目标提取的α亚单位的氨基酸序列中第36位的Thr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号111记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
以PCR反应1及2的最终反应液各5μl进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认均存在扩增DNA产物。使用Microcon 100(宝酒造社制)从各PCR最终反应液中除去过剩的引物和dNTP后，加入TE分别配制成50μl的溶液。配制总计47.5μ1的分别含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(组成遵照试剂盒中记载的条件)，实施10分钟热变性处理(98℃)后，用60分钟以恒定的速度冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟进行退火处理。
将0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火处理液中，并在72℃下加热处理3分钟，由此完成了异源双链的形成。接着对其进行PCR反应3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)及M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol使总量达到50μl后，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。
用5μl PCR反应3的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％)以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约1.9kbp的扩增DNA产物。接着从琼脂糖凝胶中仅切出约1.9kbp的DNA片段，将该琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml的TE溶液中后，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。
用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割上述纯化的约1.9kbp的扩增DNA片段，然后对该限制性核酸内切酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶解于10μlTE中。同样用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7％)，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1ml TE溶液中，在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔化。将该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀从而纯化该DNA片段。最后，将该片段溶于10μl的TE中。
将由此得到的约1.9kbp及约2.7kbp的DNA片段进行DNA连接反应后，对大肠杆菌HB101感受态细胞(东洋纺绩社制)进行转化，得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第36位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Thr以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表122)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表122
Figure BSA00000831225701741
[实施例90]用于获得修饰酶的突变引入(3)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的α亚单位的氨基酸序列中第48位的Asn转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号112记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Asn以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表123)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表123
Figure BSA00000831225701751
[实施例91]用于获得修饰酶的突变引入(4)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的α亚单位的氨基酸序列中第71位的Arg转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号113记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第71位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Arg以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表124)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表124
Figure BSA00000831225701761
[实施例92]用于获得修饰酶的突变引入(5)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的α亚单位的氨基酸序列中第148位的Gly转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号114记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第148位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Gly以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表125)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表125
Figure BSA00000831225701771
[实施例93]用于获得修饰酶的突变引入(6)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的α亚单位的氨基酸序列中第188位的Thr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号115记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第188位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为与编码除Thr以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表126)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表126
Figure BSA00000831225701781
[实施例94]用于获得修饰酶的突变引入(7)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的α亚单位的氨基酸序列中第204位的Val转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号116记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列中第204位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Val以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表127)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表127
[实施例95]用于获得修饰酶的突变引入(8)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第10位的Thr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号117记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第10位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Thr以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表128)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表128
Figure BSA00000831225701811
[实施例96]用于获得修饰酶的突变引入(9)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述突变引入的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第32位的Val转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号118记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第32位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Val以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表129)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表129
Figure BSA00000831225701821
[实施例97]用于获得修饰酶的突变引入(10)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第33位的Ala转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号119记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第33位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Ala以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表130)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表130
Figure BSA00000831225701831
[实施例98]用于获得修饰酶的突变引入(11)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第37位的Phe转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号120记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第37位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Phe以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表131)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表131
Figure BSA00000831225701841
[实施例99]用于获得修饰酶的突变引入(12)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第40位的Thr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号121记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)β0秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第40位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Thr以外氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表132)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表132
[实施例100]用于获得修饰酶的突变引入(13)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第41位的Phe转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号122记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第41位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Phe以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表133)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表133
Figure BSA00000831225701871
[实施例101]用于获得修饰酶的突变引入(14)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第46位的Met转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号123记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第46位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Met以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表134)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表134
Figure BSA00000831225701881
[实施例102]用于获得修饰酶的突变引入(15)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第48位的Leu转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号124记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Leu以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表135)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表135
Figure BSA00000831225701891
[实施例103]用于获得修饰酶的突变引入(16)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第51位的Phe转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号125记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第51位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Phe以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表136)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表136
[实施例104]用于获得修饰酶的突变引入(17)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第61位的Ala转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号126记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第61位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Ala以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表137)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表137
Figure BSA00000831225701921
[实施例105]用于获得修饰酶的突变引入(18)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第72位的Trp转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号127记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第72位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Trp以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表138)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
[表138]
Figure BSA00000831225701931
[实施例106]用于获得修饰酶的突变引入(19)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第112位的Lys转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号128记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，与编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第112位氨基酸的密码子对应的碱基序列转变为与编码Lys以外氨基酸的密码子对应的碱基序列。
以下(表139)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
[表139]
Figure BSA00000831225701941
[实施例107]用于获得修饰酶的突变引入(20)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第118位的Phe转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号129记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第118位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Phe以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表140)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
[表140]
Figure BSA00000831225701951
[实施例108]用于获得修饰酶的突变引入(21)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第127位的Leu转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号130记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作而。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第127位氨基酸的密码子对应的碱基序列，转变为编码除Leu以外氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表141)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表141
Figure BSA00000831225701961
[实施例109]用于获得修饰酶的突变引入(22)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第146位的Arg转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号131记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第146位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Arg以外氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表142)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表142
Figure BSA00000831225701971
[实施例110]用于获得修饰酶的突变引入(23)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第150位的Ala转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号132记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第150位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Ala以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表143)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表143
[实施例111]用于获得修饰酶的突变引入(24)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第160位的Arg转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号133记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第160位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Arg以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表144)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表144
Figure BSA00000831225702001
[实施例112]用于获得修饰酶的突变引入(25)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第168位的Thr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号134记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第168位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Thr以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表145)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表145
Figure BSA00000831225702011
[实施例113]用于获得修饰酶的突变引入(26)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述突变的导入处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第171位的Lys转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号135记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第171位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Lys以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表146)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表146
Figure BSA00000831225702021
[实施例114]用于获得修饰酶的突变引入(27)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第176位的Tyr转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号136记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第176位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Tyr以外氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表147)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表147
Figure BSA00000831225702031
[实施例115]用于获得修饰酶的突变引入(28)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第186位的Leu转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号137记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第186位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Leu以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表148)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表148
Figure BSA00000831225702041
[实施例116]用于获得修饰酶的突变引入(29)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第217位的Asp转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号138记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DB1相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第217位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Asp以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以述(表149)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表149
Figure BSA00000831225702061
[实施例117]用于获得修饰酶的突变引入(30)
在实施例83中以MT10822制备的含有编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的质粒pPT-DB1中实施下述引入突变的处理，所述突变为，将实施例86或87中提取的作为引入突变的目标的β亚单位的氨基酸序列中第218位的Cys转变为其它氨基酸。
以10ng的pPT-DB1为模板进行两种类型的PCR反应，PCR反应1通过以下步骤完成：在含有序列表中序列号139记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号107中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、链延长反应(72℃)2分钟。PCR反应2通过以下步骤完成：在含有MUT4引物(序列表的序列号108中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号109中记载有其序列)各50pmol的总计50μl的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应1同样的操作。
然后进行与实施例89相同的操作而得到多个转化子。从所述转化子制备各质粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保温1小时后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀将该DNA纯化，溶解于TE溶液中使最终浓度为1.0μg/μl。接着利用使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了碱基序列。
结果证明，得到的转化子含有的质粒与pPT-DBl相比较，编码来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列中第218位氨基酸的密码子所对应的碱基序列，转变为编码除Cys以外的氨基酸的密码子所对应的碱基序列。
以下(表150)示出得到的转化子的编号与相应的突变位点、氨基酸序列的变化、碱基序列的变化。
表150
Figure BSA00000831225702071
[实施例118]修饰前的腈水合酶和修饰后的修饰酶的特性比较(1)
在装有挡板的500ml三角烧瓶中配制含有40μg/ml硫酸铁·七水合物和10μg/ml氯化钴·六水合物的100ml LB液体培养基，共配制5份，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向各培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100μg/ml。
使用铂金接菌环，分别在5份培养基中接种实施例84得到的转化子No.200、实施例88中得到的转化子No.201～204共计5种转化子中的一种，在37℃、130rpm下培养约20小时后，通过离心分离(5000G×15分钟)从各最终培养液中分离出各转化子，接着将上述分离后的转化子分别重悬在50ml的生理盐水中后，再次离心分离(5000G×15分钟)出各转化子。
将0.1g各转化子分别混悬在20ml、50mM的磷酸钾水溶液(pH7.0)中之后，分成10ml×2份。从而准备了每种转化子各2份、共计10份悬浊液。在各转化子的其中1份悬浊液中加入1ml丙烯腈、在另一份中加入甲基丙烯腈，在30℃下边缓慢搅拌边使其反应10分钟。
反应结束后，用HPLC分析各最终反应液，结果表明各液中存在有未反应完的作为底物的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)和反应生成的作为产物的对应的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)。需要说明的是，确认了并不存在对应的有机酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。
对于每种转化子，比较以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺和以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比，结果观察出以下(表151)所示的差异。丙烯腈与甲基丙烯腈相比，甲基丙烯腈为空间体积较大的腈化合物，因此上述结果说明得到的修饰酶更易于水合空间体积较大的底物。
表151
Figure BSA00000831225702081
[实施例119]修饰前的腈水合酶和修饰后的修饰酶的特性比较(2)
在装有挡板的500ml三角烧瓶中配制含有40μg/ml硫酸铁·七水合物和10μg/ml氯化钴·六水合物的100ml LB液体培养基，共配制57份，并使用高压灭菌锅进行121℃、20分钟的高压灭菌处理。向各培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100μg/ml。
使用铂金接菌环，分别在各培养基中按顺序接种一种下述转化子，即，以pPT-DB1转化HB101而得到的No.0和实施例89～117中得到的转化子中的共计下述56种转化子：No.40、No.40e、No.40f、No.42、No.42a、No.43、No.44、No.45、No.46、No.47、No.48、No.49、No.50、No.51、No.52、No.54、No.55、No.56、No.57、No.58、No.59、No.60、No.61、No.62、No.63、No.64、No.65、No.66、No.67、No.68、No.69、No.70、No.71、No.72、No.73、No.74、No.75、No.76、No.77、No.78、No.79、No.80、No.81、No.82、No.83、No.84、No.85、No.87、No.88、No.89、No.90、No.91、No.92、No.93、No.94、No.95。在37℃、130rpm下培养约20小时后，通过离心分离(5000G×15分钟)从各最终培养液中分离出各转化子，接着将上述分离的转化子分别重悬在50ml的生理盐水中后，再次离心分离(5000G×15分钟)出各转化子。
将0.1g各转化子分别混悬在20ml、50mM的磷酸钾水溶液(pH7.0)中之后，分成10ml×2份。由此准备了每种转化子各2份、共计114份悬浊液。在各转化子悬浊液的其中1份中加入1ml丙烯腈、在另一份中加入甲基丙烯腈，在20℃下边缓慢搅拌边使其反应10分钟。
反应结束后，用HPLC分析各最终反应液，结果表明各液中存在有未反应完的作为底物的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)和反应生成的作为产物的对应酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)。需要说明的是，确认了并不存在对应的有机酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。
对于每种转化子，比较以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺和以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比，结果观察出以下(表152)(表153)(表154)所示的多样性。丙烯腈与甲基丙烯腈的空间体积相比，甲基丙烯腈为空间体积较大的腈化合物，上述结果示出，与修饰前的腈水合酶相比较，获得了底物特异性改变了的修饰酶。
表152
Figure BSA00000831225702101
表153
表154
Figure BSA00000831225702121
产业实用性
本发明可有效用于使用生物催化剂的物质生产领域中。例如，以称为腈水合酶的酶或表达该酶活性的生物体作为催化剂，使腈化合物经水合而转变为对应的酰胺化合物的物质生产过程。
Figure ISA00000831225900011
Figure ISA00000831225900021
Figure ISA00000831225900031
Figure ISA00000831225900041
Figure ISA00000831225900051
Figure ISA00000831225900081
Figure ISA00000831225900091
Figure ISA00000831225900101
Figure ISA00000831225900141
Figure ISA00000831225900151
Figure ISA00000831225900171
Figure ISA00000831225900181
Figure ISA00000831225900191
Figure ISA00000831225900201
Figure ISA00000831225900211
Figure ISA00000831225900221
Figure ISA00000831225900231
Figure ISA00000831225900241
Figure ISA00000831225900251
Figure ISA00000831225900261
Figure ISA00000831225900281
Figure ISA00000831225900291
Figure ISA00000831225900301
Figure ISA00000831225900311

Claims (23)

1.一种腈水合酶突变体，是具有由序列表1的序列号1的氨基酸序列构成的α亚单位及由序列表1的序列号2的氨基酸序列构成的β亚单位的腈水合酶的至少一个以上的氨基酸置换为其它氨基酸而得到的腈水合酶突变体，其中
所述腈水合酶具有形成参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面的区域，
所述腈水合酶突变体包含下述突变，所述突变是选自由位于所述腈水合酶中所述结合界面或形成所述界面的区域中的、所述序列号1的氨基酸序列的第71、148、188及204位的氨基酸及所述序列号2的氨基酸序列的第10、146、150、160、168、171、176、186、217及218位氨基酸构成的组中的任一氨基酸置换为下述(i)～(xv)所示的其它氨基酸而得到的突变，
(i)所述序列号1的氨基酸序列的第71位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为His，
(ii)所述序列号1的氨基酸序列的第148位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Asp，
(iii)所述序列号1的氨基酸序列的第188位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly，
(iv)所述序列号1的氨基酸序列的第204位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Arg、Lys、Trp或Thr，
(v)所述序列号2的氨基酸序列的第10位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Asp、Glu、Trp、Gly、Tyr或Cys，
(vi)所述序列号2的氨基酸序列的第146位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly，
(vii)所述序列号2的氨基酸序列的第150位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ser或Asn，
(viii)所述序列号2的氨基酸序列的第160位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Leu、Trp、Met或Cys，
(ix)所述序列号2的氨基酸序列的第168位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Glu，
(x)所述序列号2的氨基酸序列的第171位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ala，
(xi)所述序列号2的氨基酸序列的第176位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ala、Met、Cys或Thr，
(xii)所述序列号2的氨基酸序列的第186位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Glu、Asp、Lys、Arg、Asn、Ser或Gly，
(xiii)所述序列号2的氨基酸序列的第217位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly、Val、Leu、Met、Cys、Ser、Thr或His，
(xiv)所述序列号2的氨基酸序列的第218位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Met或Ser。
2.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，
当包含所述(ii)及(iv)的突变时，包含所述序列号1的氨基酸序列第148位和第204位的氨基酸分别置换为Asp和Arg的所述α亚单位，或者
当包含所述(viii)及(xii)的突变时，包含所述序列号2的氨基酸序列第160位和第186位的氨基酸分别置换为Trp和Arg的所述β亚单位。
3.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，
当包含所述(i)的突变时，所述序列号1的氨基酸序列第71位氨基酸置换为His的所述α亚单位进一步包含在第19位和第126位氨基酸处分别成为Val和Tyr的置换，或者
当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述序列号1的氨基酸序列第148位和第204位氨基酸分别置换为Asp和Arg的所述α亚单位进一步包含在第36位氨基酸处成为Met的置换。
4.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，
当包含所述(v)的突变时，所述序列号2的氨基酸序列第10位氨基酸置换为Asp的所述α亚单位进一步包含在第118位和第200位氨基酸处分别成为Val和Glu的置换，或者
当包含所述(vii)及(xii)的突变时，所述序列号2的氨基酸序列第160位和第186位氨基酸分别置换为Trp和Arg的所述β亚单位进一步包含在第127位氨基酸处成为Ser的置换。
5.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于：
当包含所述(v)时，所述突变体具有：包含在所述序列号1的氨基酸序列第6、36及126位氨基酸处分别成为Thr、Met和Tyr的置换的所述α亚单位，及包含在所述序列号2的氨基酸序列第10、118及200位氨基酸处分别成为Asp、Val和Glu的置换的所述β亚单位，或者
当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述突变体具有：包含在所述序列号1的氨基酸序列第36、148及204位氨基酸处分别成为Met、Asp和Arg的置换的所述α亚单位，且包含在所述β亚单位的序列号2的氨基酸序列第41、51及108位氨基酸处分别成为Ile、Val和Asp的置换的所述β亚单位，或者
当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述突变体具有：包含在所述序列号1的氨基酸序列第148及204位氨基酸处分别成为Asp和Arg的置换的所述α亚单位，且包含在所述β亚单位的序列号2的氨基酸序列第108及200位氨基酸处分别成为Asp和Glu的置换的所述β亚单位。
6.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，
当包含所述(viii)及(xii)的突变时，包含在所述α亚单位的所述序列号1的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸处分别成为Ala、Val和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第127、160和186位氨基酸处分别成为Ser、Trp和Arg的置换，或者
当包含所述(i)的突变时，包含在所述α亚单位的所述序列号1的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸处分别成为Val、His和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸处分别成为Leu、Asp和Glu的置换，或者
当包含所述(i)的突变时，包含在所述α亚单位的所述序列号1的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸处分别成为Val、His和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸处分别成为Val、Asp和Glu的置换。
7.一种编码腈水合酶的基因，具有编码腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列的基因与编码腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列的基因，其特征在于，编码如权利要求1或2所述的腈水合酶突变体。
8.如权利要求7所述的基因，其特征在于，
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列：
序列表的序列号3的碱基序列中第211至213位碱基处成为CAT的置换，或
第442至444位成为GAC的置换，或
第562至564位成为GGC的置换，或
第610至612位成为CGC、AAA、TGG或ACC的置换，或
编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列：
序列表的序列号4的碱基序列中第28至第30位碱基处成为GAC、GAA、TGG、GGC、TAC或TGC的置换，或
第436至438位成为GGG的置换，或
第448至450位碱基处成为TCG或AAT的置换，或
第478至480位碱基处成为CTG、TGG、ATG或TGT的置换，或
第502至504位碱基处成为GAG的置换，或
第511至513位碱基处成为GCG的置换，或
第526至528位碱基处成为GCC、ATG、TGC或ACC的置换，或
第556至558位碱基处成为GAG、GAT、AAG、CGG、AAC、TCG或GGG的置换，或
第649至651位碱基处成为GGC、GTC、CTC、ATG、TGT、AGC、ACC或CAC的置换，或
第652至654位碱基处成为ATG或TCC的置换。
9.如权利要求7所述的基因，其特征在于，
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列：序列表的序列号3的碱基序列中第442至444位和第610至612位碱基处分别成为GAC和CGC的置换，或者
编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列：序列表的序列号4的碱基序列中第478至480位和第556至558位碱基处分别成为TGG和CGG的置换。
10.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求3所述的腈水合酶突变体。
11.如权利要求8所述的基因，其特征在于，
具有所述序列号3的碱基序列中第211至213位碱基处置换为CAT的碱基序列的编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第55至57位和第376至378位碱基处成为GTG和TAC的置换的碱基序列，或者
具有所述序列号3的碱基序列中第442至444位碱基和第610至612位碱基处分别置换为GAC和CGC的碱基序列的编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第106至108位碱基处分别成为ATG的置换的碱基序列。
12.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求4所述的腈水合酶突变体。
13.如权利要求8所述的基因，其特征在于，
具有所述序列号4的碱基序列中第28至30位碱基处置换为GAC的碱基序列的编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第352至354位和第598至600位碱基处成为GTC和GAA的置换的碱基序列，或者
具有所述序列号4的碱基序列中第478至480位碱基和第556至558位碱基处分别置换为TGG和CGG的碱基序列的编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第379至381位碱基处分别成为TCG的置换的碱基序列。
14.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求5所述的腈水合酶突变体。
15.如权利要求8所述的基因，其特征在于，
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第16至18位、及第106至108位、及第376至378位碱基处分别成为ACG、ATG和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第28至30位、第352至354位、及第598至600位碱基处分别成为GAC、GTC和GAA的置换的碱基序列，或者
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第106至108位、第442至444位及第610至612位碱基处分别成为ATG、GAC和CGC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第121至123位、第151至153位、及第322至324位碱基处分别成为ATC、GTC和GAT的置换的碱基序列，或者
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第442至444位及第610至612位碱基处分别成为GAC和CGC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为GAT和GAA的置换的碱基序列。
16.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求6所述的腈水合酶突变体。
17.如权利要求8所述的基因，其特征在于，
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第16至18位、第55至57位、及第376至378位碱基处分别成为GCG、GTG和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第379至381位、第478至480位、及第556至558位碱基处分别成为TCG、TGG和CGG的置换的碱基序列，或者
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位碱基处分别成为GTG、CAT和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为CTC、GAT和GAC的置换的碱基序列，或者
编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位碱基处分别成为GTG、CAT和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为GTC、GAT和GAA的置换的碱基序列。
18.一种质粒，其特征在于，含有编码如权利要求7～17中任一项所述的腈水合酶突变体的基因。
19.如权利要求18所述的质粒，其特征为，该质粒具有在宿主细胞内表达所述腈水合酶突变体所需的结构。
20.一种转化子，是利用权利要求19所述的质粒转化宿主细胞而得到的转化子。
21.一种生产腈水合酶的方法，其特征在于含有下述步骤，即，将权利要求20所述的转化子在培养基中培养，基于所述转化子中所述质粒具有的腈水合酶基因生产腈水合酶的步骤。
22.如权利要求21所述的生产方法，其特征为，该方法进一步含有从所述培养后的转化子、培养液、及其处理物中回收腈水合酶的步骤。
23.一种制备酰胺化合物的方法，是通过在水性介质中使腈化合物与腈水合酶接触而得到对应的酰胺化合物的制备方法，其特征为，所述腈水合酶为如权利要求1～6中任一项所述的腈水合酶突变体。
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