WO2004052383A1

WO2004052383A1 - Composition contenant des saponines triterpenoides extraites de bambou, son procede de preparation et son utilisation

Info

Publication number: WO2004052383A1
Application number: PCT/CN2003/000309
Authority: WO
Inventors: Ying Zhang; Xiaoqin Wu; Zhuoyu Yu; Yunlong Zhu; Lingen Chen; Shenggen Luo
Original assignee: Zhejiang University (Hangzhou) Leaf Bio-Technology Co., Ltd.; Shanghai Yunteng Plant-Extract Science And Technology Development Co., Ltd.
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2004-06-24
Also published as: CN1506373A; US20060148733A1; EP1576958A1; AU2003231499A1; EP1576958A4; US7811997B2; CN1271083C; JP2006512330A; AU2003231499A8

Description

从竹子中提取的三萜总皂甙元组合物、制法及用途

技术领域

本发明涉及一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组合物、方法及其用途。本发明采用超临界 < 0₂流体萃取技术从竹子中提取三萜类化合物，这是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，可作为防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物及保健品，并可应用于日用化妆品领域。

, 背景技术

竹子属禾本科（fo^ w ^ae)的竹亚科

。全世界约有 70多属、

1200多种，竹林面积约 2000万 ha。中国是世界上主要的产竹国之一，约有 40多属 400余种，占世界竹类种质资源的三分之一，竹林面积 400万 ha。刚竹属 {Phyllostachys Sieb. et Zucc)全世界有 50余种，除少数品种外，中国均有出产，其中经济利用价值最高的毛竹林面积约 250万 ha，占世界毛竹总量的 90%以上。

竹子是全世界最具利用价值的天然植物之一。作为森林资源的重要组成部分，不仅以其较高的经济价值，被誉为 "穷人的金子" ，而且具有广泛的生态环境与社会效益。在竹子有效成分及其生物学效应的研究中，以日本和中国所作的工作为主，印度、巴西、美国和韩国等也做过少量研究。各国所研究的竹类对象具有显著的地域特征，一般均选用具有本国资源特色的竹子品种。

日本从 20世纪 70s起对赤竹属（5¾^ Makino et shbata)的赤竹亚属（5"ί/Ζ¾¾ . 6ksa)中华箬竹亚科（5W¾^. 6ksafflorpAs)中的一类草本型竹子 [称竹草，（英） Bamboo grass, 即 Sasa albomarginta Makino & Shibata等品种]进行了系统的研发，并申报了一系列的国内专利。 90s起，也有少量研究涉及到刚竹属的品种。如 Sakai, Wataru 1980 年申报的专利 [Healthful feed containing bamboo extract, JP Patent57074049] , 描述了用溶剂萃取刚竹属竹子的嫩茎，将提取物加入到家禽、家畜、鱼贝类、宠物和实验动物等的饲料中；同年申报的另一项专利 [Healthful food containing bamboo extract, JP Patent 57039753] 描述了以下内容：刚竹属竹子的嫩秆破碎后，用甲醇、乙醇、氯仿、苯或热水在室温下萃取约 2周；或被放入容器中，蒸汽加热至 180°C；，蒸馏后冷却，得到了精油和水的混合物，减压浓缩后的产物可加入多种食品中；还申报了对痔疮有治疗作用的竹提取物，主要使用干馏或蒸汽蒸馏得到提取物，然后用硅胶柱分离得到具有疗痔、降压、放松作用的不同活性部位，其中疗痔部位无论是口服还是外用都具有突出的效应 [Production of bamboo extract having effect for hemorrhoids, JP Patent 57038721]。

Kuboyama, N.等 (1981)报道了竹叶提取物及其木质素的抗肿瘤活性 [Anti tumor activity of bamboo leaf extracts, JPN J PHARMACOL, 1979, 29 (SUPPL. ) : 170 ; Anti tumor activities of bamboo leaf extracts and its lignin, FOLIA PHARMACOL JPN, 1981, 77 (6) : 579-596] ] o Sato, T等 (1986)年报道了一种竹叶提取物溶液用于牙銀的治疗 [The use in periodontal therapy of a bamboo leaf extract solution, Nippon Shishubyo Gakkai Kaishi, 1986, 28 (2) : 752-757。 Kenji, Matsui.等 1990 年申请的专利，用一种或多种有机溶剂,从斑竹、毛竹、金毛竹等刚竹属的竹子中萃取的有效成分能抑制多种头屑生成菌，防治皮肤老化，并能抑制脂质过氧化和稳定产品 [Skin, scalp and hair agent containing component of suppressing growth of dandruff fungus extracted from bamboo, JP Patent 03251518 ]。 Nishina, A. 等 (1991)从毛竹的茎皮中检出了抗菌活性成分 2,6-二甲氧基对苯醌 U of Agric & Food Chem, 1991, 39 (2) : 266- 269]。 Kiyooka, Takatoshi. (1995)年申报的发明专利 "用有机溶剂萃取法从竹皮中制备脱臭剂" [JP Patent 9794290]。 Yamanaka, Satoshi 等（1998)报道了竹子干熘液的抗菌活性及其应用 [Anti-microbial activity of bamboo dry distillate and its application, Gekkan Fudo Kemikaru, 1998， 14 (9)： 57-60] o Makino, Akimitsu (1998)申报了日本发明专利 "竹提取物作为肉类添加剂" [JP Patent 99346719]。 Mie University的 Sakai Koji等 (1999)从笋壳中首次分离出 2种抗氧化成份：苜蓿素 (Tricin)和紫杉叶素 (Taxifolin) ,并用 POV方法检测其抗氧化活性分别为 α-生育酚的 10%和 1% [Isolation of antioxidative compounds from bamboo shoots sheath, Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, 1999, 46 (7) : 491-493] o 中国素有 "竹子王国"之称，竹子在我国有着悠久的食用历史 [胡春水等，竹的药膳史及竹食品开发，竹子研究汇刊， 1999， 18 (1) : 27-31]，也是我国中医药和保健品开发的重要资源，对国家中药现代化建设具有重要意义。《中国中药资源志要》内 12694种中药中，竹类共收集 10属 32种，记入《中国药典》 1990版的竹类植物近 5种。不同竹种的竹叶、竹鞭根、竹茹、竹沥、竹实（米）、竹竿、竹膏、竹黄、竹笋、竹砂仁、竹苓、竹衣、竹精、竹鼠、竹蜂等均有不同疗效 [张佐玉等，竹子在中医药和保健品开发中的潜力，中药现代化， 2000，2 (3) : 54〜56]。

我国在竹子成分研究及生物利用上做过大量的工作，其中尤以申请者在竹叶黄酮方面所做的工作较为系统和深入。竹叶提取物（Extract of Bamboo Leaves, Ebl₉₇₁)是申请者近年来从我国资源量最为丰富的刚竹属竹种中开发的一种天然生物黄酮类制剂，以碳苷黄酮为主，其中四种主要的黄酮碳苷分别是荭草苷 (Orientin) 、异荭草苷 (Homoorientin) 、牡荆苷 (Vitexin)和异牡荆苷 (Isovitexin) [张英，天然功能性竹叶提取物一一竹叶黄酮，中国食品添加剂， 2002,(3)： 54〜58,66]。 Ebl₉₇₁具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效 [张英等，竹叶有效成分和抗活性氧自由基效能的研究，竹子研究汇刊， 1996， 15 (3) : 17-24 ; 张英等，毛金竹叶提取物抗衰老作用的实验研究，竹子研究汇刊 1997, 16 (4) : 62-67 ; 张英，竹叶提取物类 S0D活性的邻苯三酚法测定，食品科学， 1997, 18 (5) 47-49 ; Ying Z. et al, The Bio-ant ioxi dative Activity of Functional Factors in Bamboo Leaves, in : Proceedings of The 3^rd International Conference of Food Science and Technology, October 19-23, 1997， Davi s, U. S. A. Ed. J. R. Whitaker, Food and Nutrition Press, 1998 pp266- 273；张英，竹叶提取物类 SOD活性的综合考察，中国食品学报 1998， 2 (2) : 62-66 ; 张英等，黄酮类化合物清除活性氧自由基效能的比较研究，天然产物研究与开发 1998， 10 (4) : 26-33；张英等，竹叶功能因子生物抗氧化活性的研究，营养学报， 1998, 20 (3) : 367-371； Chun Hu, Ying Zhang, and David D. Kitts, Evaluation of antioxidant and Prooxidant Activities of Bamboo Phyllostachys nigra Var. Hen on is Leaf Extract in vitro, J. Agric Food Chem. , 2000, 48, 3170-3176. ]。 Ebl₉₇₁ 以其丰富的原料来源、明确的功能因子、良好的食用安全性（属实际无毒）、高效稳定的制剂品质（耐水、热、酸解等）和清新甜香的竹子风味，近年来在天然功能性食品添加剂和医药保健品领域崭露头角。 2000年和 2001年国家专利局分别授权了申请者于 1998年申请的 2项发明专利 [张英，从竹叶中提取黄酮类化合物浸膏或粉剂的生产方法，中国专利 ZL 98 1 04564.2；张英，一种添加竹叶黄酮提取物的保健啤酒，中国专利 ZL 98 1 04563.4]。我国的研究工作基本上都是围绕刚竹属的竹种，尤其是金毛竹、毛竹和桂竹展开的。

印度在竹子方面的工作涉及到竹米营养、竹笋加工、竹纤维制作以及竹叶作为词料等方面，研究的对象是具有本土资源特色的箣竹属和牡竹属的品种。

巴西位于南美竹区，以箣竹属和牡竹属的丛生竹为主。巴西曾在牡竹属的龙竹

{Dendrocalamus giganteus Munro)中检出了致癌物质。 Ferreira, V. L. P.等（1992) 报道了用不同的加工方法除去龙竹笋中的致癌物质 [Elimination of cyanogenic compounds of bamboo shoots Dendrocalamus-Gigan teus Munro by different processes, REV ESP CIENC TECNOL ALIMENTOS, 1992, 32 (2)： 175-184]。

美国本土上基本无竹子，但随着近年来对竹类产品保健作用的不断认识，也有一些研究机构开始了对竹笋等的研究。 Purdue大学食品和营养系的 Story，J.A.等 1992在加州 Anaheim召开的美国实验生物学联邦会议上报告了竹笋降低大鼠血清胆固醇的效应 [Bamboo shoots lower serum cholesterol in rats, FASEB (FED AM SOC EXP BIOL) J, 1992, 6 (5)： A1653]。 Rutgers大学 He YiHui的博士论文对竹笋在体内外的降胆固醇作用进行了较为系统的研究，认为主要是植物甾醇在起作用 [The hypocholestolemic effect of bamboo shoot in vivo and in vitro (Phyllostachys edulis, Phytosterols) 1998]。

纵观世界各国目前在竹子提取物中所做的工作，其提取手段不外乎水提、有机溶剂萃取和蒸汽蒸熘法几种，对有效成分的化学研究以及与生理和药理活性之间构效关系的研究相当欠缺。

本发明所涉及的植物来源可以是竹子的全株 (包括茎、根、叶、枝、笋），但主要是指竹子的外表皮 (Bamboo bark) , 所取部位与《中药辞海》（第一卷） [中国医药科技出版社 1993 , ρρ2137〜2139]中所载的竹茹基本相同；涵盖的竹种来源及范围也与其相似，并以刚竹属的竹种为主。

《中药辞海》中记载的竹茹 [Bamboo Shavings] , 异名：竹皮（《金匮要略》）、青竹茹（《神农本草经集注》）、淡竹皮茹（《别录》）、淡竹茹（《食疗本草》）、麻巴（《草木便方》）、竹二青（《上海常用中草药》），为禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属中一些竹种的茎秆所刮下的外皮层或其次一层。正品竹茹一般为 2种- Phyllostachys nigra var. henonis (Bean) Stapf ( P. henryi Rendle) , 又名甘竹（《广群芳谱》）、白竹（江苏）、毛金竹（浙江）；人面竹 aurea Carr. ex A. & C. Riviere, 又名布袋竹（《台湾植物志》）。另有数种也较广泛地作为竹茹引用：粉绿竹 glauca McClure, 又名淡竹（江苏）；桂竹 Z⁷. makinoi ayata ; 篌竹尸. nidularia Munro, 又名花竹（贵州）、枪刀竹（浙江）、笔笋竹（广东）；刚竹尸. viridis (Young) McClure； Wff†t B ambus a tuldoides Munro ; 撑篙竹 . pervariabilis McClure；粉单竹 B. chungii McClure [Lingnania chungi i (McClure) McClure]；大头典竹 Dendroclamopsis beecheyana (Munro) Keng f .

Var. Pubescens (P. F. Li) Keng (Sinocalamus beecheyana Var. pubescens P. F. Li) , 又名大头甜竹（《中国竹类植物志略》）；竹 Dendrocalamus aff inis Rendle ( Sinicalamus affinis (Rendle) McClure)。根据所用竹种分布情况来推断，长江流域以散生竹中的淡竹为主，次为人面竹、桂竹、篌竹、粉绿竹、刚竹等，华南与西南地区以丛生竹种中的青秆竹为主，其次有大头典竹、粉单竹、撑篙竹、慈竹等。

竹茹为临床常用中药之一，多用于胃热呕吐、胸膈烦闷等症。竹茹的传统炮制方法是除去杂质，切段或揉成小团经姜汁炒黄后供调配用。始载于（《神农本草经集注》）。历代本草均有记载其功效。如《纲目》谓可治： "伤寒劳复，小儿热痈，妇人胎动。 " 张璐《本经逢原》： "竹茹专清胃腑之热，为虚烦烦渴，胃虚呕逆之要药；咳逆唾血，产后虚烦，无不宜之。《金匮》治产后虚烦呕逆有竹皮大丸。《千金方》治产后内虚，烦热短气，有甘竹茹汤；产后虚烦头疼、短气、闷乱不解，有淡竹茹汤。内虚用甘以安中，闷乱用淡以清胃，各有至理存焉。其性虽寒而滑能利窍，可无郁遏客邪之虑。 "贾所学《药品化义》："竹茹，轻可去实，凉能去热，苦能降下，专清热痰，为宁神开郁佳品。主治胃热噎膈，胃虚干吐，热呃咳逆，痰热恶心，酒伤呕吐，痰涎酸水， '惊悸怔忡，心烦躁乱，睡卧不宁，此皆胆胃热痰之症，悉能奏效"。清黄宫绣《本草求真》： "竹茹味甘而淡，气寒而滑，凡因邪热客肺，肺金失养，而致烦渴不宁，膈噎呕逆，恶阻呕吐、吐血、衄血等症者皆当服此"。

《中国药典 2002版》指明竹茹源自 "淡竹、青秆竹和大头典竹" ，性味甘、微寒，归肺、胃经。功能与主治：清热化痰，除烦止呕。用于痰热咳嗽，胆火挟痰，烦热呕吐，惊悸失眠，中风痰迷，舌强不语，胃热呕吐，妊娠恶阻，胎动不安。然而，中医药对竹茹的成分和药理的研究十分贫乏，导致长期以来竹茹的成分不详、药理不详。仅在《中药辞海》（第一卷） [中国医药科技出版社 1993，pp2138] 提及竹茹中含有 cAMP磷酸二脂酶抑制作用的成分，为 2, 5-二甲氧基 -P-苯醌 (2, 5-Dimethoxy p-benzoquinone) > p -轻基苯甲醛 (p- Hydroxy benzoaldehyde)、丁香醛（Syringaaldehyde)等。未见有文献提到过竹茹中三萜类化合物的存在。

相反，在我国民间常用的"中药淡竹叶" [Herba Loophatheri, (英） Common Lopatherum Herb] 的成分描述中提到了三萜类物质。然而，此处的 "淡竹叶"是指禾本科植物淡竹叶

rsciJe Brongn 的茎叶（为多年生草本，不属于竹亚科），产于浙江、江苏、湖南、湖北等地。味甘淡，性寒，入心、肾两经。具有清热除烦、生津利尿之功效，可用于热病烦渴，小便赤湮，淋浊，口糜舌疮，牙龈肿痛。据载：淡竹叶茎叶主要含有三萜化合物和留类物质：芦竹素

(Arundoin)、印白茅素（Cylindrin)、蒲公英赛醇（Taraxerol)、无羁萜（Friedelin) 及 β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇等，其地上部分含酚类物质、氨基酸、有机酸和糖类。然而，最近沈阳药科大学的陈泉等人对淡竹叶的成分进行了较为系统的研究 [陈泉等，中药淡竹叶的化学成分研究，沈阳药科大学学报， 2002， 19 (1) : 23-24 ;和 2002， 19 (4)： 257- 258 ]，前后分离鉴定了 8个化合物： 3, 5_ 二甲氧基 -4-羟基苯甲醛、反式对羟基桂皮酸、苜蓿素、苜蓿素 -7-0- β-D-葡萄糖苷、牡荆素、香草醛、胸腺嘧啶和腺嘌呤，没有提到三萜类物质。

多数三萜（triterpenoids)是由 30个碳原子组成的萜类化合物，被认为是由 6 个异戊二烯缩合而成的。三萜及其皂甙广泛存在于自然界，是一类重要的生物活性成分，根据化学结构可分为三萜皂甙和留体皂甙两大类。近 30年来，随着有机化合物研究手段的不断进步，很多重要的中草药如人参、三七、绞股蓝、柴胡、黄芪、远志、商陆、桔梗、知母等所含的皂甙得到了系统的研究，其生物活性和药用价值也逐渐地被认识和日益受到重视。该类物质具有多种生物活性，如抗菌、抗病毒、抗癌、抗生育、抗炎、降血脂、降血压、降血糖、免疫调节等，对心血管系统、神经系统、肾上腺皮质系统和酶活性方面都有生理活性，已成为天然药物研究中的一个重要领域 [姚新生主编，天然药物化学 (第三版),人民卫生出版社 2001,257-294;吴寿金等，近年来皂甙药理活性的研究概况，国外医药.植物药分册， 1994，9(6)： 246-252]。

三萜类化合物中五环三萜（pentacyclic triterperoids)类型数目较多，主要的类型为齐墩果烷型、乌苏垸型、羽扇豆烷型和木栓烷型。其中木栓烷 (friedelane) 在生源上是由齐墩果烯羟甲基移位而演变来的。繁 Tripterygium wilfordii) 为卫茅科植物,在我国作为民间用药有很长历史,近几年临床应用日趋广泛，特别是对类风湿疾病有独特疗效，引起国内外广泛重视,从中已分离得到多种三萜,有一类为木栓烷类三萜。如雷公藤酮 (triptergone)是由雷公藤去皮根中心分离出的三萜化合物，化学名为 3- hydroxy- 25- nor- friede:L-3， 1 (10) _dien- 2- one- 30- oic acid, 是失去 25位甲基的木栓垸型衍生物。从卫茅科植物 ^^«3 zey ics已分离鉴定的木栓烷类化合物或其降解产物有 20余个， Leslie等从该植物茎皮得到 11个化合物，均为木栓烷 -3-酮类化合物。

三萜化合物的提取与分离方法大致分为四类：一是用乙醇或甲醇提取，提取物直接进行分离；二是用醇类溶剂提取后，提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶剂进行分部提取，然后进一步分离，三萜成分主要从氯仿部位中获得；三是制备成衍生物再作分离，即将提取物先用乙醚萃提取，用重氮甲烷甲基化，制成甲酯衍生物，或将提取物按常法进行乙酰化制成乙酰衍生物，然后进行分离；四是有许多三萜化合物在植物体中是以皂苷形式存在，可在三萜皂苷水解后获得，即将三萜皂苷进行水解，水解产物用氯仿等溶剂萃取，然后进行分离。用化学溶剂提取，不但工艺流程长，溶剂消耗大，操作环境差，更重要的是提取物的产品质量不稳定，容易出现重金属和农残含量偏高，且提取的收率较低。发明内容

本发明的目的是提供一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组合物、方法及其用途。在本发明的第一方面，提供了一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组合物，该组合物用香草醛〜高氯酸比色法，以木栓酮为标准品，测得其三萜总皂甙元的含量为 10〜90%，用 GC- MS联用技术检测其中木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为 5〜35%和 1%〜； 10%。

在一优选例中，所说三萜总皂甙元的含量为 40〜80%，木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为 15〜25%和 3〜6%。

在另一优选例中，所说三萜总皂甙元是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，外观为黄色或黄绿色的粉末，熔点在 74〜79 C之间；经溴化钾压片后的红外光谱图显示，该混合物在 2917、 2849、 1716、 1463、 1382 和 720cm- 1处有特征性吸收峰；将三萜总皂甙元溶于光谱纯的二氯甲垸后，在 300〜 700nm的波长范围内进行扫描，显示在 412nm处有强吸收，在 665nm处有次强吸收，还分别在 505、 535和 605皿附近有弱吸收。

在本发明的第二方面，提供了一种从竹子中提取三萜总皂甙元的方法，包括步骤: (a)以禾本科竹子的竹竿、竹枝、竹叶、笋、笋壳、竹根或其混合物为原料，将所述原料与超临界二氧化碳流体混合进行萃取，从而使竹子中的游离三萜等低极性物质溶解于二氧化碳，其中，萃取温度为 50-65Γ , 萃取压力为 25-35Mpa;

(b)改变上述溶解有游离三萜的二氧化碳流体的压力，使二氧化碳气化分离，从而得到析出的三萜总皂甙元，其中分离温度为 35-45°C，分离压力为 5-10Mpa。

在一优选例中，所述的原料是 10〜20目粒度的竹粉末，且在步骤 (a)中使用夹带剂，夹带剂的体积用量为 C02量的 5〜15%，且二氧化碳气体被循环利用，循环动态萃取中时间为 2〜5小时。

在另一优选例中，所述的夹带剂选自下组：甲醇、乙醇、丙酮或其混合物。在另一优选例中，所述的竹子选自下组：刚竹属、箣竹属和牡竹属。

在本发明的第三方面，提供了本发明三萜总皂甙元组合物的以下用途：三萜总皂甙元及其木栓酮单体用于制备降血压、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗老年性痴呆和抗肿瘤的新药、中西药复方制剂，以及防治心脑血管疾病和抗肿瘤的保健品、复方制剂。

三萜总皂甙元作为护肤、护发因子用于制备日用化妆品：如护肤品、洗发护发品、沐浴液等。

三萜总皂甙元中的五环三萜类化合物用于制备防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物和保健品、及其日用化妆品。附图说明

图 1是 EZR2002的红外谱图（经溴化钾压片）；

图 2是 EZR2002的紫外谱图（溶于光谱纯的二氯甲烷）；

图 3是 EZR2002的 GC-MS谱图（同时示木栓酮的质谱棒图）；

图 4是 EZR2002的 GC-MS谱图（同时示羽扇豆烯酮的质谱棒图）；

图 5是木栓酮标准品的 GC-MS谱图；

图 6是羽扇豆烯酮标准品的 GC- MS谱图。具体实施方式

本发明用超临界 co₂流体萃取技术从从禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属的竹子 (包括竹竿、竹枝、竹叶、竹笋和竹根篼）中、特别是从刚竹属品种的竹茹中提取三萜类化合物的方法。

本发明的一个具体实施方案如下：

将竹粉末（一般控制在 10〜20目的粒度)放入 C0₂超临界萃取釜中，在温度为

50〜65°C、压力为 25〜35兆帕、使用或不使用夹带剂的状态下，循环动态萃取 2〜

5h，得到竹提取物（代号为 EZR_2M2)。使用的夹带剂可以是甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂，用量一般为 C0₂量的 5〜15% (v/v)。

本发明的优点是：提供了一组具有多种生理和药理活性的五环三萜类化合物的竹类来源；采用超临界 co₂流体萃取技术实现了竹中三萜总皂甙元的高效提取，得到了高精度、高质量的产品，并摸清了其主要成份及其含量变化范围；同时对竹子三萜总皂甙元及其代表性化合物 (木栓酮）的降压作用、抗肿瘤活性及其皮肤生理功效进行了系统的研究，表明其在医药、保健品和日用化妆品领域有着广阔的应用前景。以下的优选例对本发明作详细描述，但并不构成对本发明的限制。

实施例 1A 淡竹提取物的制备

将 5.5kg粒度为 20目的刚竹属淡竹 Phyllostachys nigra var. henonis ,又名毛金竹或金毛竹）的竹茹粉末放入萃取釜内，升温到 55°C，开动 C0₂泵，升压到 30兆帕，通过预热器进入萃取釜内；开启夹带剂泵，使 10%体积比的丙酮通过预热器后同时进入萃取釜，在 55°C下进行动态萃取 3h。分离釜 1设定分离压力为 8 兆帕、温度为 45°C，分离釜 2设定分离压力为 5〜6兆帕、温度为 27〜30°C; 从分离釜 1中取出目标产物，经低温干燥、粉碎后，得到 EZR₂。_Q2121克，产率约为 2. 2% ; 并从分离釜 2中回收夹带剂。实施例 1B 毛竹提取物的制备

以刚竹属毛竹（¾j^J₀^a_{C 7}s pubescens, 又称楠竹)的笋壳为原料,干燥粉碎后超临界萃取，除萃取温度为 60°C，压力为 25兆帕，时间为 5h，夹带剂改为 10%体积比的乙醇外，其余条件与实施例 1A相同， EZR₂。。₂的产率约为 0. 98%。实施例 1C 青皮竹提取物的制备

取箣竹属青皮竹

textiles MuClure, 又名篾竹、山青竹）的全株，干燥粉碎后超临界提取。萃取温度为 50°C，压力为 30兆帕，时间为 4h; 不使用夹带剂；分离釜设定分离压力为 6兆帕、温度为 40°C，从中取出目标产物，经低温千燥、粉碎后，得到 EZR_2Q。₂，产率约为 1. 1%。实施例 2 竹提取物的表征

本实施例提供了实施例 1A-1C用超临界 C0₂萃取手段得到的竹提取物（统称为

EZR_2Q()2)的产品特征。（实施例 1A-1C的提取物特征相同）

· EZR_2QQ2是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，外观为黄色或黄绿色的粉末，熔点在 74〜79°C之间。经溴化钾压片后的红外光谱图显示，该混合物在 2917、 2849、 1716、 1463、 1382和

处有特征性吸收峰（见附图 1)。将 EZR_2QQ2溶于光谱纯的二氯甲烷后，在 300〜700脑的波长范围内进行扫描，显示在 412nm处有强吸收，在 665nm处有次强吸收，还分别在 505、 535和 605讓附近有弱吸收（见附图 2) 。

用香草醛〜高氯酸比色法，以木栓酮为标准品，测得 EZR_2M2不同批次间三萜总皂甙元的含量在 55〜75%之间。经 GC-MS联用技术的分析和检测，显示其中主要的游离三萜是木栓酮（friedelin)、木栓醇（friedelan- 3- β- ol)、羽扇豆烯酮 (lupenone)和羽扇豆醇（lupeol)等五环三萜类的化合物。其中 MS- GS联用分析的实验条件如下：

仪器： Agilent公司的 GC 6890〜MS 5973 ;

GC条件：

检测器： FID， 280°C ;

柱： HP5毛细管柱；

载气： _{2 ;}

H₂流速 30ml/min ;

空气流速 200ml/min ;

尾冲气流 50ml/min ;

程序升温：在 100°C下保持 2min后，以 20°C/min的速率上升到 270°C，保持 50min。

进样：不分流进样，进样量 1μ1，温度 280°C。

MS的条件：

柱： HP5- MS毛细管柱；

载气：氦气；

柱流速： lml/min ;

程序升温：在 100°C下保持 3min后，以 20°C/min的速率上升到 270°C，保持 50min。

检测方式：扫描质量范围 18- 500m/z，倍增管电压 1600ev; 数据库为

NIST98。

经与从法国 EXTRASYNTHESE公司购买的木栓酮和羽扇豆烯酮标准品（HPLC纯）的 GC-MS联用技术的对照分析和定量检测， £2 _{)()2不同批次间木栓酮的含量平均为（20. 2±5. 2) %，羽扇豆烯酮的含量平均为（5. 2±1. 5) %。 EZR_2QQ2样品及其木栓酮和羽扇豆烯酮标准品的 GC-MS谱图见附图 3〜附图 6。本发明还同时包括了竹提取物 (代号为 EZR_2QQ2)作为防治心脑血管疾病、抗肿瘤的药物和保健品，及其作为护肤因子在日用化妆品中的用途。实施例 3- 6证实了本发明提取物的各种生理和药理活性。实施例 3 EZR₂₀₀₂的抗自由基活性

采用 Vc-Cu⁺⁺- ¾0₂ -酵母多糖的羟自由基（· 0Η)产生体系，用化学发光法测定 [张英等，竹叶有效成分和抗活性氧自由基效能的研究，竹子研究汇刊， 1996， 15 (3) : 17-24] , 测得 EZR_2QQ2对羟自由基的 IC_5Q为（39. 6±10. 5) g/ml ; 用比色法测得 EZR_2QQ2对 DPPH自由基的 EC_5Q为（300. 4±50. 6μ₈/πι1) ;显示了相当强的清除活性氧自由基的能力，具有作为生物抗氧化剂应用的潜力。实施例 4 EZR₂„_fl2对自发性高血压大鼠的降压作用

4. 1试验原材料

EZR_2W)2用吐温 -80助溶，分别加蒸馏水配制成 20和 60mg/ral的溶液，临用时新鲜配制；对照组给予 20%吐温- 80，体积为 0. 5ml/100g体重。

自发性高血压大鼠（SHR) : 18周龄，雄性，体重在 300〜365克，由中科院上海实验动物中心提供，动物合格证号：沪动合证字 152号。

4. 2实验方法

清醒大鼠血压测定采用 SHR大鼠电子血压仪（北京中日友好医院生产）进行尾动脉间接测压法，将大鼠置于 38°C温箱内加热 15〜20min，同时测定收缩压和心率。

自发性髙血压大鼠 18 只，随机分为三组：对照组给予吐温， EZR_2QD2分设 100mg/kg/d和 300mg/kg/d二个剂量，每组 6只。大鼠在给药前一周开始测压，待血压稳定后开始实验，每天给药一次，连续一周，并分别在给药后的第 1、 4 和 7天测定大鼠血压。在首次给药时，先测定大鼠给药前血压，然后灌胃给药，并分别测定 2、 4、 6h药物对大鼠的降压作用。结果显示 EZR₂。_Q2的降压作用在 4〜 6h到达峰值。在第 4和第 7天实验中，测压的时间定在给药前（即前次给药后 24h) 和给药后 4h进行。

4. 3试验结果 EZR_2W)2100mg/kg/d给药组，实验第一天给药前大鼠的收縮压为 195±8mmHg, 给药后 2h下降至 179±14mmHg, 给药后 h和 6h分别为 169+18和 165±19mmHg，均较给药前明显下降^<0. 05和 <0. 01)。 EZR₂。。₂300mg/kg/d给药组，给药前大鼠的收缩压为 199±7mmHg，给药后 2h下降至 188±12讓¾，给药后 4h和 6h分别为 181+14和 179±6mmHg，均较给药前明显下降（p<0. 05和 p<0. 01)，见表 1。

表 1 £2 不同剂量灌胃给药对自发性高血压大鼠血压的影响（n=6)

*p<0. 05, **p<0. 01，与给药前比较。

EZR₂₀₀₂300mg/kg/d给药组大鼠，测定第四天给药前的血压（相当于前一天给药后 24小时）分别为 193±8和 189±20mmH_g，与对照组大鼠的血压（190±18 mmHg)无明显差别。同样，测定两组大鼠第七天给药前的血压（相当于前一天给药后 24小时）分别为 184±13和 187±18mmHg，与对照组大鼠的血压（187±20mmHg)亦无明显差别。表明 EZR₂。_Q2的降压作用维持时间小于 24小时。见表 2。

EZR_2Q()2对自发性高血压大鼠血压的影响（n=6)

EZR₂₀₀₂100和 300mg/kg/d剂量组的大鼠在给药的 7天中，观察第一天、第四天、第七天的大鼠血压，均显示有明显的降压作用，见表 3。给药期间同时观察大鼠心率，结果显示 EZR_2M2对大鼠的心率没有明显的影响，见表 4。而对照组大鼠在实验期间血压无明显变化，见表 1、表 2和表 3。表 3 £2 不同剂量灌胃给药对自发性高血压大鼠血压的影响（n=6)

*给药后 4小时测定。

4. 4结论竹提取物 (EZR_2QQ2)对自发性高血压大鼠具有明显的降压作用。实施例 5 EZR₂„_Q2及其分离组分的抗肿瘤活性

5.1 2 。。₂的抗肿瘤活性体外筛选

5. 1. 1筛选方法磺酰罗丹 B (sulforhodamine B， SRB)蛋白染色法四氮唑盐（microculture tetrozolium, MTT)还原法 5. 1. 2细胞株 P₃₈₈小鼠白血病； A₅₄₉人肺腺癌。

5. 1. 3作用时间 48h和 72h

5. 1. 4活性评定指标

无效： 10-⁵mol/L< 85%

弱效： 10-⁵mol/L > 85%或 10 - ⁶mol/L >50%

强效： 10— ⁶mol/L > 85%或 10一 ⁷mol/L >50% ZER₂₀₀₂对肿瘤细胞（P₃₈₈小鼠白血病）生长的抑制作用 *

* MTT还原法；作用时间 48h。

ZER_2DQ2对肿瘤细胞 (A₅₄₉人肺腺癌）生长的抑制作用 *

*SRB蛋白染色法；作用时间 72h。

5. 1. 5实验结果：见表 5和表 6。

5. 1. 6 结论： EZR_2QQ ^ P₃₈₈小鼠白血病和 A₅₄₉人肺腺癌细胞株均显示有抑制作用，具有抗癌活性。

5. 2从 EZR_2QQ2中分离得到的木栓酮的体外抗癌作用

为了进一步评价 EZR_2QQ 抗肿瘤能力，申请者又采用硅胶柱层析和逆流色谱制备技术，从中分离得到了木栓酮单体组分，经 GC- MS分析确认其纯度为 90. 5%。委托沈阳药科大学的国家沈阳新药安全评价研究重点实验室采用 MTT方法，对木栓酮单体试样的体外抗癌活性进行了测定。

5. 2. 1细胞株

本次实验选用 A₃₇₅ (人黑色素瘤）、 L₉₂₉ (小鼠肺上皮癌）、 Hela (人宫颈癌）、 THP- 1 (人巨噬组织瘤）四种细胞株用作活性筛选。其中前三种为贴壁细胞，第四种为悬浮细胞。

5. 2. 2实验材料及培养条件

所用细胞均培养于 RPMI- 1640 培养液中，培养液中含有 10% 胎牛血清、 lOOU/mL青霉素、 lOO g/mL链霉素、 0. 2%NaHC0₃。各成分均用去离子三蒸水配制，溶解后用 0. 22μπι滤膜过滤除菌，胎牛血清使用前 56°C、 30min 灭活。细胞在上述培养液中于 37°C、 5%∞₂浓度的培养箱中培养。 5. 2. 3方法和结果

取对数生长期的 A₃₇₅、 L₉₂₉、 Hela细胞，将细胞密度调至 5 X 10⁴个 /mL，由于 THP- 1较小，其密度调至 1 X 10⁵个 /mL，接种于 96孔版内（ΙΟΟμΙ/well)。悬浮细胞培养 4h后加试样，贴壁细胞培养 12h后加试样。木栓酮试样事先溶于 DMSO，超声波助溶，再溶于培养液中（DMSO不超过 0. 1%)，取 7. 5、 15、 30、 60、 120、 240、 480和 960μιηο1/ί八个试样浓度，每个浓度设四个平行孔，同时设阴性对照。细胞加样后继续培养 24h和 48h后，向细胞液中加入 MTT溶液（浓度为 5mg/mL) Ιδμΐ/ψθΐΐ ο 培养 48h后， 1500rpm离心 5min，吸弃上清，向细胞中加入 DMS0

, 微量震荡器震荡 10min，将结晶完全溶解，酶标仪在 492nm处测定吸光度（0D值）。计算药物对细胞增殖的抑制率，并采用 Bliss法计算木栓酮的半抑制浓度（IC_5D) , 结果见表 7。

5. 2. 4与阳性对照物的比较

本实验采用去甲斑蟊素作为阳性对照，表 8为 12(^mol/L的去甲斑蟊素 24h 和 48h时对 A₃₇₅细胞、 L₉₂₉细胞和 Hela细胞的抑制率，并列出了相对应的木栓酮的数据。

表 Ί 从 EZR₂。_Q2中分离得到的木栓酮试样对四种癌细胞的抑制率和 IC 试样浓度抑制率（％)

(μπιοΐ/ί) A₃₇₅细胞 L₉₂₉细胞 Hela细胞 THP- 1细胞

24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h

7. 5 0 0. 51 5. 42 17. 29 34. 96 19. 99 4. 89 8. 6

15 6. 43 6. 29 10. 36 21. 64 34. 69 17. 18 0 0

30 0. 43 17. 18 13. 15 38. 84 33. 30 24. 6 3. 04 7. 57

60 14. 12 44. 44 22. 74 66. 82 43. 45 41. 38 45. 25 52. 61

120 36. 70 88. 59 37. 57 81. 13 71. 59 85. 96 58. 8 77. 35

240 44. 82 100. 28 52. 26 99. 45 88. 19 99. 53 68. 52 95. 02

480 63. 27 96. 13 48. 13 98. 17 88. 10 97. 99 74. 09 92. 93

960 60. 36 89. 78 38. 87 89. 86 73. 80 91. 98 70. 83 82. 46

IC₅₀ 356. 54 61. 52 665. 42 36. 94 61. 25 64. 69 85. 10 58. 04 表 8 去甲斑蟊素和木栓酮对三种贴壁肿瘤细胞抑制率(%)的比较

*两种受试物的浓度均为 120 mol/L。

5. 2. 5结论

从 EZR_2Q。₂中分离得到的木栓酮单体组分对 A₃₇₅ (人黑色素瘤）、 L₉₂₉ (小鼠肺上皮癌）、 Hela (人宫颈癌）、 THP-1 (人巨噬组织瘤）四种癌细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且其抑制率具有时间和剂量的依赖性。

木栓酮试样在 24h时即对 Hela细胞和 THP-1细胞体现出较为明显的作用，说明木栓酮对上述细胞的敏感性较高，而对 A₃₇₅细胞和 L₉₂₉细胞的敏感性稍差。

与阳性药物（去甲斑蟊素）的抑制效果比较，表明木栓酮具有相当强的抗癌活性，可以作为抗癌药物和保健品加以开发，同时也证明了木栓酮是 EZR_2QQ2中存在的主要抗癌活性成分。实施例 6 EZR₂₀₀₂的皮肤生理活性

为了评价 EZR_2QQ2在日用化妆品领域的应用前景，申请者又委托复旦大学公共卫生学院皮肤生理毒理研究室对 EZR_2QQ 皮肤生理功效进行了测试。

6. 1实验材料与方法

6. 1. 1受试物 £2 ₍₎₍₎₂用 DMS0溶解，经 0. 22μπι滤膜抽滤除菌，以无血清 DMEM稀释为受试浓度，终浓度为 0. 5%、 0. 05%、 0. 005%和 0. 0005%。 - 4°C保存。以无血清 DMEM作为对照。

6. 1. 2 试剂器皿 K- SFM培养基（Gibcol公司， USA)、 DMEM培养基、胰岛素、小牛血清（NBS)、氢化可的松、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、 Ficoll、 96孔板及 24孔板、及 35mm培养皿和 25cm²培养瓶（Corning公司， USA)。

6. 1. 3 仪器酶标仪 (BIO- TEK公司）、 pH计、超净台、培养箱、 722分光光度计。

6. 1. 4皮肤细胞原代培养取出生三天的 SD大鼠背部皮肤，采用 0. 25%胰酶冷消化法制备皮肤表皮角元细胞，以 K- SFM培养基；细胞密度调整至 I X lOVml, 接种于 96孔板、 24孔板。 24h换第一次液，然后每 2〜3天换液。当上述培养细胞生长至 80%融合时，加入受试物。

6. 1. 5 脂质过氧化产物（MDA)和超氧化物歧化酶（SOD)测定 MM测定采用 TBA比色法， SOD测定采用亚硝酸盐还原法，试剂盒由南京建成生物公司提供。

6. 1. 6 安全性评价测试根据 1999年国家卫生部颁布的《化妆品卫生规范》中的评价程序和方法进行。受试物浓度为 10%。皮肤刺激试验：取受试物 0. 2ml 涂于皮肤上每天一次，每次 lh，连续 14天；眼剌激试验：将受试物 0. 1ml 滴入结膜囊中，于染毒后 1、 24、 48、 72h以及第 4天、第 7天对动物眼睛进行检查。

6. 2 结果

6. 2. 1 延缓皮肤衰老的作用 EZR₂。_Q2在 0. 0005%〜0. 005%剂量（§|3 5〜50mg/kg) 范围内使皮肤细胞的 MDA非常显著地低于对照组， SOD活性明显高于对照组，见表 9。

表 9 EZR_2QQ2对皮肤角质形成细胞 MDA生成与 SOD活性的影响

注： * p<0. 05, **p<0. 01，与对照相比。

6. 2. 2 安全性皮肤刺激试验及眼刺激试验结果均为阴性，显示无皮肤及眼剌激性。

6. 3 结论

£2 。。₂在 5〜50mg/kg 的剂量下具有较强的抗氧化损伤作用，能够增强皮肤 SOD的活性，减少氧化产物 MM的生成，具有在护肤、护发等日用化妆品中应用的良好生理学功效。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1. 一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的组合物，其特征在于，用香草醛〜高氯酸比色法，以木栓酮为标准品，测得三萜总皂甙元的含量为 10〜90%，用 GC- MS联用技术检测其中木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为 5〜35%和 1%〜10%。

2. 根据权利要求 1所述的组合物，其特征在于所说三萜总皂甙元的含量为 40〜80%，木栓酮和羽扇豆烯酮的含量分别为 15〜25%和 3〜6%。

3. 根据权利要求 1所述的组合物，其特征在于所说三萜总皂甙元是一组以木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物为主的五环三萜类化合物的混合物，外观为黄色或黄绿色的粉末，熔点在 74〜79°C之间；经溴化钾压片后的红外光谱图显示，该混合物在 2917、 2849、 1716、 1463、 1382和 720cm— ¹处有特征性吸收峰；将三萜总皂甙元溶于光谱纯的二氯甲烷后，在 300〜700nm的波长范围内进行扫描，显示在 412nm处有强吸收，在 665nm处有次强吸收，还分别在 505、 535和 605nm附近有弱吸收。

4. 一种从竹子中提取三萜总皂甙元的方法，其特征在于，包括步骤-

(a)以禾本科竹子的竹竿、竹枝、竹叶、笋、笋壳、竹根或其混合物为原料，将所述原料与超临界二氧化碳流体混合进行萃取，从而使竹子中的游离三萜等低极性物质溶解于二氧化碳，其中，萃取温度为 50_65 °C，萃取压力为 25- 35Mpa;

(b)改变上述溶解有游离三萜的二氧化碳流体的压力，使二氧化碳气化分离，从而得到析出的三萜总皂甙元，其中分离温度为 35-45 °C，分离压力为 5- 10Mpa。

5. 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述的原料是 10〜20目粒度的竹粉末，且在歩骤（a)中使用夹带剂，夹带剂的体积用量为 C0₂量的 5〜： 15%，且二氧化碳气体被循环利用，循环动态萃取中时间为 2〜5小时。

6.根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述的夹带剂选自下组：甲醇、乙醇、丙酮或其混合物。

7.如权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述的竹子选自下组：刚竹属、箣竹属和牡竹属。

8. 如权利要求 1所述的三萜总皂甙元组合物的用途，其特征在于，用于制备降血压、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗老年性痴呆和抗肿瘤的新药、中西药复方制剂，或防治心脑血管疾病和抗肿瘤的保健品、复方制剂。

9.如权利要求 1所述的三萜总皂甙元组合物的用途，其特征在于，作为护肤、护发因子用于制备日用化妆品。

10. 一种从竹子中提取的三萜总皂甙元的用途，其特征在于，三萜总皂甙元中的五环三萜类化合物用于制备防治心脑血管疾病和抗肿瘤的药物和保健品，及日用化妆品。