JP5864162B2 - 筍の皮抽出物の製造方法、メラニン合成阻害剤の製造方法、及び美白剤の製造方法 - Google Patents
筍の皮抽出物の製造方法、メラニン合成阻害剤の製造方法、及び美白剤の製造方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、筍の皮抽出物、並びにこれを有効成分とするメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤に関する。
従来より、メラニン産生抑制機能を有するメラニン合成阻害剤または美白剤、フリーラジカル消去などの抗酸化作用を有する抗酸化剤または抗老化剤、黄色ブドウ球菌や大腸菌などへの抗菌活性を有する抗菌剤などが種々提案されている（例えば特許文献１参照）。
しかしながら、従来のメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤においては、いずれも、天然素材由来の高い安全性を有し、且つ、高いメラニン合成阻害作用、美白作用、抗酸化作用、抗老化作用、又は抗菌作用を有する物質を低コストで提供することはできなかった。
本発明はこのような従来技術の問題点に着目してなされたものであって、天然素材由来の高い安全性を有し、且つ高いメラニン合成阻害作用、美白作用、抗酸化作用、抗老化作用、又は抗菌作用を発揮できる筍の皮抽出物、このような筍の皮抽出物を含有するメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤を低コストで提供することを目的とする。
本発明者らは、筍の皮の粉砕物または粉末からメタノールまたはエタノールなどの溶媒を用いて抽出された筍の皮抽出物が、メラニン合成阻害作用、美白作用、抗酸化作用、抗老化作用、及び抗菌作用を有していることを新たに発見した。すなわち、本発明者らは、前記筍の皮抽出物がメラニン生合成阻害活性を有していることを新たに発見したが、一般に、皮膚においてはメラニンの過剰な生成や蓄積が皮膚の黒化やシミの原因となっていることからメラニン産生過程を阻害することが肌の美白のために有効であることが知られている。そこで、本発明者らは、前記発見に基づいて、前記のメラニン合成阻害作用を有する筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤および美白剤を発明した。また、本発明者らは、筍の皮抽出物が抗酸化作用を有していることを発見したが、一般に、抗酸化作用を有する物質を例えば皮膚などに投与すると皮膚において過剰に生成された活性酸素によるしわの形成や弾力低下などが抑制されて皮膚の老化防止に有効であること、抗酸化作用を有する物質を経口摂取すると生体内で活性酸素を消去するなどして健康増進効果や老化防止効果を発揮することが知られている。そこで、本発明者らは、前記発見に基づいて、前記筍の皮抽出物を有効成分とする抗酸化剤および抗老化剤を発明した。また、本発明者らは、筍の皮抽出物の拘菌作用の発見に基づいて、前記筍の皮抽出物を有効成分とする抗菌剤を発明した。
すなわち、前述のような課題を解決するための本発明による筍の皮抽出物は、筍の皮からメタノールまたはエタノールなどの溶媒を用いて抽出して成り、メラニン合成阻害作用又は美白作用を有するものである。また、本発明は、前記筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤又は美白剤である。
すなわち、前述のような課題を解決するための本発明による筍の皮抽出物は、筍の皮からメタノールまたはエタノールなどの溶媒を用いて抽出して成り、メラニン合成阻害作用又は美白作用を有するものである。また、本発明は、前記筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤又は美白剤である。
本発明によれば、天然素材である筍の皮を原料とするため安全性が高く、且つ従来は廃棄対象となっていた筍の皮を原料とするため製造コストが低い、メラニン合成阻害作用又は美白作用を有する筍の皮抽出物を得ることができる。また、本発明によれば、前記筍の皮抽出物を有効成分とするため、人体に使用しても安全性の高い、メラニン合成阻害剤又は美白剤を、低コストで生産することができる。
本発明者らは、筍の皮を粉砕等して得られた粉末からｎ−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、その残渣からメタノールまたはエタノールなどにより溶媒抽出物を得た。本発明者らは、この抽出物をジクロロメタン不溶部とジクロロメタン可溶部とに分けて、それぞれの特性を測定したところ、ジクロロメタン不溶部が強い抗酸化活性およびメラニン生合成阻害活性を有していること、及び、ジクロロメタン可溶部が強い抗菌性および抗酸化活性を有していることを新たに発見した。また、一般に、皮膚においてはメラニンの過剰な生成や蓄積が皮膚の黒化やシミの原因となっていることからメラニン産生過程を阻害することが肌の美白のために有効であることが知られている。また、一般に、抗酸化作用を有する物質を例えば皮膚に投与すると皮膚において過剰に生成された活性酸素によるしわの形成や弾力低下などが抑制されて皮膚の老化防止に有効であること、抗酸化作用を有する物質を経口摂取すると生体内で活性酸素を消去するなどして健康増進及び老化防止効果を発揮することが知られている。そこで、本発明者らは、前記の新たな知見に基づいて、筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤を発明した。
なお、本発明の実施形態において、前記のメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤は、前記筍の皮抽出物をそのまま使用するようにしてもよいし、前記筍の皮抽出物を公知の方法で乾燥させて粉末状や顆粒状など製剤化して使用したり、公知の方法で濃縮して液状で使用するようにしてもよい。また、本発明によるメラニン合成阻害剤及び美白剤は、皮膚の美白のための皮膚化粧品または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗酸化剤及び抗老化剤は、飲食品や飼料（ペットフードなど）中に添加して使用してもよいし、健康食品（錠剤などの形態のサプリメントなど）または医薬品（錠剤やカプセルなど）に含有させて経口摂取させるようにしてもよいし、シミ、しわ、たるみなどの皮膚の老化防止などのための皮膚化粧品（例えば軟膏、クリーム、乳液状など）または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗菌剤は、例えば石鹸や洗剤などに含有させるようにしてもよいし、抗菌作用を発揮することが望ましい梱包剤、紙、被服の布、トイレタリー製品、不織布などに塗布または混入させて使用するようにしてもよい。
なお、本発明の実施形態において、前記のメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤は、前記筍の皮抽出物をそのまま使用するようにしてもよいし、前記筍の皮抽出物を公知の方法で乾燥させて粉末状や顆粒状など製剤化して使用したり、公知の方法で濃縮して液状で使用するようにしてもよい。また、本発明によるメラニン合成阻害剤及び美白剤は、皮膚の美白のための皮膚化粧品または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗酸化剤及び抗老化剤は、飲食品や飼料（ペットフードなど）中に添加して使用してもよいし、健康食品（錠剤などの形態のサプリメントなど）または医薬品（錠剤やカプセルなど）に含有させて経口摂取させるようにしてもよいし、シミ、しわ、たるみなどの皮膚の老化防止などのための皮膚化粧品（例えば軟膏、クリーム、乳液状など）または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗菌剤は、例えば石鹸や洗剤などに含有させるようにしてもよいし、抗菌作用を発揮することが望ましい梱包剤、紙、被服の布、トイレタリー製品、不織布などに塗布または混入させて使用するようにしてもよい。
以下に、本発明者らの本願発明に係る研究の概略を述べる（一部については以下の実施例で詳述する）。図１Ａは本発明者らによる本研究の全体像を示す図である。すなわち、本発明者らは、筍の皮を粉砕等して得られた粉末からｎ−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、その残渣からメタノールまたはエタノールなどの溶媒により抽出物を得た（なお、本実施形態において前記溶媒抽出に使う溶媒はメタノールまたはエタノールが望ましいがこれらに限られない）。そして、本発明者らは、このメタノール抽出物の特性を測定したところ、抗酸化活性を有していることを新たに発見した。また、本発明者らは、前記メタノール抽出物をジクロロメタン可溶部とジクロロメタン不溶部とに分けて、それぞれの特性を測定したところ、ジクロロメタン可溶部は抗菌性と抗酸化活性を有していること、及び、ジクロロメタン不溶部は抗酸化活性とメラニン生合成阻害活性を有していることを新たに発見した。
図１Ｂに示すように、本発明者らは、前記筍の皮抽出物の抗菌試験を実施し、前記筍の皮抽出物が抗菌性を有していることを発見した（詳細は実施例１に関して詳述する）。
図１Ｃに示すように、本発明者らは、前記ジクロロメタン可溶部のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画を試み、その結果、１６個のフラクションが得られ、収率は９６．６％だった。これらの分画のそれぞれについてＳ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉに対する抗菌活性を測定したところ、Ｆｒ．４についてＳ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉに対する強い抗菌活性を確認できた。そこで、このＦｒ．４に着目して、抗菌活性物質の探索を継続した。そして、Ｆｒ．４−４はこれまで得られた分画物の中でも、Ｅ．ｃｏｌｉとＳ．ａｕｒｅｕｓの両方に抗菌活性を持つ特異なフラクションであったため、Ｆｒ．４−４に着目して、分取ＨＰＬＣによるさらなる分画を試みた。
図１Ｄに示すように、本発明者らは、前記筍の皮抽出物であるＦｒ．４−４中のＦｒ．４−４−２−ＡとＦｒ．４−４−２−ＢのＳ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉに対する抗菌活性を確認した（詳細は実施例１に関して詳述する）。
また、本発明者らの研究により、前記筍の皮抽出物であるＦｒ．４−４−２−ＡがＳｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌであること、及び、同Ｆｒ．４−４−２−ＢがＤｉｈｙｄｒｏｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌであることが判明した（図１Ｅ参照）。
また、本発明者らは、図１Ｆに示すような前記筍の皮抽出物のメラニン生合成阻害試験を行い、前記筍の皮抽出物のジクロロメタン不溶部に強いメラニン生合成阻害活性を確認した（図１Ｇ参照。詳細は実施例４に関して詳述する）。
また、本発明者らは、前記筍の皮抽出物のＯＲＡＣ法による抗酸化活性の測定を行なった（図１Ｈ参照。詳細は実施例３において詳述する）。その結果、前記筍の皮抽出物のジクロロメタン可溶部およびジクロロメタン不溶部ともに高いＯＲＡＣ値を確認し、強い抗酸化活性を確認した（図１Ｉ参照。詳細は実施例４に関して詳述する）。
１．モウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）の筍の皮に含まれる抗菌活性物質の探索
本研究では、モウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）の筍の皮抽出物から抗菌活性物質を単離・同定し、未利用資源であり、産業廃棄物として大部分が処理されている筍の皮有効利用のための新たな価値を創出することを目的とする。
本研究では、モウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）の筍の皮抽出物から抗菌活性物質を単離・同定し、未利用資源であり、産業廃棄物として大部分が処理されている筍の皮有効利用のための新たな価値を創出することを目的とする。
２．試験方法
２．１．筍の皮の抗菌試験
モウソウチクの筍の皮を１０×１０ｍｍの板状に切り取り、これに７０％エタノールを吹き付け消毒した。これを「筍の皮（未処理）」とした。一方、筍の皮（１０ｇ，１０×１０ｍｍ）を各１００ｍＬのｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、メタノール、水を用いて、順次１８０ｒｐｍで２４時間振とう抽出し、この抽出残渣の筍の皮を「筍の皮（抽出後）」とした。
２．１．筍の皮の抗菌試験
モウソウチクの筍の皮を１０×１０ｍｍの板状に切り取り、これに７０％エタノールを吹き付け消毒した。これを「筍の皮（未処理）」とした。一方、筍の皮（１０ｇ，１０×１０ｍｍ）を各１００ｍＬのｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、メタノール、水を用いて、順次１８０ｒｐｍで２４時間振とう抽出し、この抽出残渣の筍の皮を「筍の皮（抽出後）」とした。
供試菌株として、代表的な食中毒菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＮＢＲＣ１３２７６）と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ＮＢＲＣ３３０１）を用いた。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地上に培養したＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニーを取り、２０ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地に接種し、１６０ｒｐｍ、３７℃で菌濃度が１０９ＣＦＵ／ｍＬになるまで９時間振とう培養した。この菌液をＮＢ培地で希釈し、菌濃度を１０５ＣＦＵ／ｍＬに調製した。
５ｍＬのＮＢ培地と５０μＬの菌液（１０５ＣＦＵ／ｍＬ）および１０×１０ｍｍの筍の皮一枚を５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れ、３７℃、２００ｒｐｍで９時間振とう培養した。その後、筍の皮を取り除き、分光光度計で６３０ｎｍにおける吸光度を測定し菌の増殖の指標とした。図２Ａはこの試験の概略図である。
２．２．抽出物の調製
抽出物の抗菌試験を行うため、筍の皮の乾燥粉末１７．８ｋｇからｎ−ヘキサン、メタノールを用いて逐次抽出を行い、各々の抽出物を濃縮してｎ−ヘキサン抽出物（４０．１ｇ）とメタノール抽出物（１９２．５ｇ）を得た。さらに、メタノール抽出物にジクロロメタンを加え、ジクロロメタン可溶部（３８．８ｇ）と不溶部（１５３．７ｇ）に分けた。図２Ｂはこの逐次抽出の手順を示すものである。
抽出物の抗菌試験を行うため、筍の皮の乾燥粉末１７．８ｋｇからｎ−ヘキサン、メタノールを用いて逐次抽出を行い、各々の抽出物を濃縮してｎ−ヘキサン抽出物（４０．１ｇ）とメタノール抽出物（１９２．５ｇ）を得た。さらに、メタノール抽出物にジクロロメタンを加え、ジクロロメタン可溶部（３８．８ｇ）と不溶部（１５３．７ｇ）に分けた。図２Ｂはこの逐次抽出の手順を示すものである。
２．３．抗菌試験
９６ウェルプレートの１ウェルあたりに、ＮＢ培地を８９μＬ、菌液（１０４ＣＦＵ／ｍＬ）を１０μＬ、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解させた抽出物を１μＬ加え、３７℃、１１５０ｒｐｍで１２時間培養後、６３０ｎｍにおける濁度を測定し、菌の増殖の指標とした。
９６ウェルプレートの１ウェルあたりに、ＮＢ培地を８９μＬ、菌液（１０４ＣＦＵ／ｍＬ）を１０μＬ、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解させた抽出物を１μＬ加え、３７℃、１１５０ｒｐｍで１２時間培養後、６３０ｎｍにおける濁度を測定し、菌の増殖の指標とした。
２．４．ジクロロメタン可溶部の分画
抽出物の抗菌試験を行った結果、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部にＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性が確認された。そこで、ジクロロメタン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：０〜０：１０→ＭｅＯＨ１００％）、分取ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ−ＯＤＳ，１０ｍＬ／ｍｉｎ，ＭｅＯＨ）、リサイクル分取ＨＰＬＣ（ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０，５ｍＬ／ｍｉｎ，ＭｅＯＨ）を用いて分画し、活性物質の単離を試みた。
抽出物の抗菌試験を行った結果、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部にＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性が確認された。そこで、ジクロロメタン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：０〜０：１０→ＭｅＯＨ１００％）、分取ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ−ＯＤＳ，１０ｍＬ／ｍｉｎ，ＭｅＯＨ）、リサイクル分取ＨＰＬＣ（ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０，５ｍＬ／ｍｉｎ，ＭｅＯＨ）を用いて分画し、活性物質の単離を試みた。
３．結果と考察
図２Ｃは、筍の皮自体のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。それぞれの値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。異なる文字（ａ，ｂ，ｃ）はチューキー検定により有意差（Ｐ＜０．０１）があったことを示す。図２Ｃに示すように、筍の皮（未処理）と筍の皮（抽出後）の濁度は、コントロールの濁度より有意に低かった。この結果より、筍の皮自体にＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性があることが分かった。また、筍の皮（未処理）の濁度は筍の皮（抽出後）の濁度より低かった。これは、筍の皮（未処理）が筍の皮（抽出後）よりＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を強く阻害していることを示す。抽出後の方が抗菌活性が低下している原因は、溶媒抽出により筍の皮中に含まれる抗菌活性物質が減少したためと考えられる。また、Ｅ．ｃｏｌｉに対しても同様の実験を行ったが、有意な増殖阻害は見られなかった。
図２Ｃは、筍の皮自体のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。それぞれの値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。異なる文字（ａ，ｂ，ｃ）はチューキー検定により有意差（Ｐ＜０．０１）があったことを示す。図２Ｃに示すように、筍の皮（未処理）と筍の皮（抽出後）の濁度は、コントロールの濁度より有意に低かった。この結果より、筍の皮自体にＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性があることが分かった。また、筍の皮（未処理）の濁度は筍の皮（抽出後）の濁度より低かった。これは、筍の皮（未処理）が筍の皮（抽出後）よりＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を強く阻害していることを示す。抽出後の方が抗菌活性が低下している原因は、溶媒抽出により筍の皮中に含まれる抗菌活性物質が減少したためと考えられる。また、Ｅ．ｃｏｌｉに対しても同様の実験を行ったが、有意な増殖阻害は見られなかった。
続いて、筍の皮抽出物（ｎ−ヘキサン、メタノール、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部）の抗菌試験を行ったところ、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部にＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性が確認された。図２Ｄは前記筍の皮抽出物の抗菌試験の結果を示すものである。筍の皮抽出物を加えた状態でのＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を培養０，２，４，６，１２および２４時間目で測定した。ジクロロメタン抽出物を添加した場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖が培養１２時間目まで有意（Ｐ＜０．０５：２，４時間目、Ｐ＜０．０１：６，１２時間目）に阻害されていることが分かった。ジクロロメタン抽出物は培養１２時間目まで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖をほぼ完全に阻害していた。一方、ｎ−ヘキサン、メタノール、水抽出物については有意な阻害は見られなかった。この結果より、ジクロロメタン抽出物が抗菌活性物質を含んでいると考えられる。一方、Ｅ．ｃｏｌｉに対しても同様の実験を行ったが、有意な増殖阻害は見られなかった。なお、図２Ｄにおいて、それぞれの値は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。コントロールと各抽出物間の有意差はスチューデントのｔ検定により検出し、Ｐ＜０．０５を有意とした。（）内は各抽出物の系内最終濃度を示す。ジクロロメタン抽出物が培養１２時間目までＳ．ａｕｒｅｕｓの生育を阻害していることが確認できた。
本発明者は、以上の結果から、ジクロロメタン可溶部に注目し、さらなる分画を行った。ジクロロメタン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ、リサイクル分取ＨＰＬＣを用いて分画し、Ｆｒ．４−４−２−ＡとＦｒ．４−４−２−Ｂを得た。ＧＣ／ＭＳおよびＮＭＲの結果から、これら２つのフラクションはほぼ単一の物質であると考えられ、構造解析したところ、Ｆｒ．４−４−２−Ａは、Ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌであり、Ｆｒ．４−４−２−Ｂは、Ｄｉｈｙｄｒｏｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌであった。図２Ｅ（ａ）はＳｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌの化学構造、同（ｂ）はＤｉｈｙｄｒｏｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌの化学構造を示す。
図２Ｆは、前記Ｆｒ．４−４−２−ＡおよびＦｒ．４−４−２−ＢなどのＥ．ｃｏｌｉとＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性を示すグラフである。図２Ｆにおいて、それぞれの値は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。コントロールと各分画物間の有意差はスチューデントのｔ検定により検出した（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）。（）内は各分画物の系内最終濃度を示す。図２Ｆに示すように、Ｆｒ．４−４−２−Ａ、Ｆｒ．４−４−２−Ｂともにコントロールである１％ＤＭＳＯより低い濁度を示し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉに対する抗菌活性が確認された。
＜筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物の抗菌試験＞
１．試料
・筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物
２．実験方法
（１）菌の前培養
シャーレ上に培養した菌のコロニーから１つをとり、２０ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地を加えた１００ｍｌ容三角フラスコに添加した。これを，１６０ｒｐｍで８時間振とう培養した。最後に培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し、菌の濃度が１０４ＣＦＵ／ｍＬになるようＮＢ培地を添加して希釈した。
（２）抽出物の調製
抽出物をそれぞれＤｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解させサンプルとした。
（３）抗菌活性の測定
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌにＮＢ培地８９μＬ、菌体懸濁液１０μＬ（１０４ＣＦＵ／ｍＬ）、サンプル溶液１μＬを添加した。その後、１１５０ｒｐｍ、３７で１２時間振とう培養し、培養後の６３０ｎｍにおける濁度をマイクロプレートリーダーで測定した。
１．試料
・筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物
２．実験方法
（１）菌の前培養
シャーレ上に培養した菌のコロニーから１つをとり、２０ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地を加えた１００ｍｌ容三角フラスコに添加した。これを，１６０ｒｐｍで８時間振とう培養した。最後に培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し、菌の濃度が１０４ＣＦＵ／ｍＬになるようＮＢ培地を添加して希釈した。
（２）抽出物の調製
抽出物をそれぞれＤｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解させサンプルとした。
（３）抗菌活性の測定
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌにＮＢ培地８９μＬ、菌体懸濁液１０μＬ（１０４ＣＦＵ／ｍＬ）、サンプル溶液１μＬを添加した。その後、１１５０ｒｐｍ、３７で１２時間振とう培養し、培養後の６３０ｎｍにおける濁度をマイクロプレートリーダーで測定した。
３．結果
図３は筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。図３において、（）内はサンプル最終濃度（μｇ／ｍＬ）を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
以上のように、筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物の抗菌試験においても、前記実施例１に関して説明した筍の皮粉砕物からのメタノール抽出物の抗菌試験と同様の結果が得られた。
図３は筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。図３において、（）内はサンプル最終濃度（μｇ／ｍＬ）を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
以上のように、筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物の抗菌試験においても、前記実施例１に関して説明した筍の皮粉砕物からのメタノール抽出物の抗菌試験と同様の結果が得られた。
＜筍の粗抽出物のメラニン生合成抑制試験＞
モウソウチクの粗抽出物（水、ｎ−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部）を用いて、メラニン生合成抑制試験を行った。
（１）細胞の前培養
シャーレ上に培養したＢ１６メラノーマ細胞培養液を血球計測板に１０μＬ添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ（ＥＭＥＭ）培地を加え、細胞濃度を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した。これを２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに１ｍＬずつ播種し、５％ＣＯ２，３７℃で２４時間静置培養した。
（２）サンプル溶液の調製
モウソウチクの粗抽出物（水、ｎ−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部）をＤＭＦに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬに調製した。ポジティブコントロールとして、５０ｍｇ／ｍＬのアルブチンを用いた。また、コントロールとしてＤＭＦを用いた。
（３）サンプルの添加
前培養した２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの培地を除去し、新たにＥＭＥＭ培地９９８μＬとサンプル溶液２μＬを添加した。これを５％ＣＯ２，３７℃で４８時間静置培養した。この後、再び培地を除去し、ＥＭＥＭ培地９９８μＬとサンプル溶液２μＬを添加し、５％ＣＯ２，３７℃で２４時間静置培養した。系内の各サンプルの最終濃度は、粗抽出物が４０μｇ／ｍＬ、ポジティブコントロールのアルブチンが１００μｇ／ｍＬ、コントロールのＤＭＦが０．２％とした。
（４）ＭＴＴ法による細胞生存率の測定
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌ当たりＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を５０μＬ添加し、５％ＣＯ２，３７℃で４時間静置培養した。培地を除去し、各ｗｅｌｌに塩酸−イソプロパノール溶液を１ｍＬずつ加え、遮光し、４時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞数の指標とした。
（５）メラニン生成量の測定
培地を除去し、各ｗｅｌｌに３００μＬのＰＢＳを加えて洗浄した。ＰＢＳを除去し、各ｗｅｌｌに１Ｎ ＮａＯＨを１ｍＬずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、４時間放置した。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン生成量の指標とした。
モウソウチクの粗抽出物（水、ｎ−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部）を用いて、メラニン生合成抑制試験を行った。
（１）細胞の前培養
シャーレ上に培養したＢ１６メラノーマ細胞培養液を血球計測板に１０μＬ添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ（ＥＭＥＭ）培地を加え、細胞濃度を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した。これを２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに１ｍＬずつ播種し、５％ＣＯ２，３７℃で２４時間静置培養した。
（２）サンプル溶液の調製
モウソウチクの粗抽出物（水、ｎ−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部）をＤＭＦに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬに調製した。ポジティブコントロールとして、５０ｍｇ／ｍＬのアルブチンを用いた。また、コントロールとしてＤＭＦを用いた。
（３）サンプルの添加
前培養した２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの培地を除去し、新たにＥＭＥＭ培地９９８μＬとサンプル溶液２μＬを添加した。これを５％ＣＯ２，３７℃で４８時間静置培養した。この後、再び培地を除去し、ＥＭＥＭ培地９９８μＬとサンプル溶液２μＬを添加し、５％ＣＯ２，３７℃で２４時間静置培養した。系内の各サンプルの最終濃度は、粗抽出物が４０μｇ／ｍＬ、ポジティブコントロールのアルブチンが１００μｇ／ｍＬ、コントロールのＤＭＦが０．２％とした。
（４）ＭＴＴ法による細胞生存率の測定
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌ当たりＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を５０μＬ添加し、５％ＣＯ２，３７℃で４時間静置培養した。培地を除去し、各ｗｅｌｌに塩酸−イソプロパノール溶液を１ｍＬずつ加え、遮光し、４時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞数の指標とした。
（５）メラニン生成量の測定
培地を除去し、各ｗｅｌｌに３００μＬのＰＢＳを加えて洗浄した。ＰＢＳを除去し、各ｗｅｌｌに１Ｎ ＮａＯＨを１ｍＬずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、４時間放置した。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン生成量の指標とした。
前述の図１Ｇはこの筍の皮粗抽出物のメラニン生合成阻害活性の測定結果を示すグラフである。この図１Ｇに示すように、特にジクロロメタン不溶部を添加した場合に細胞生存率に比してメラニン合成が大きく抑制されていることなどから、筍の皮抽出物がメラニン生合成阻害活性を有していることが明らかになった。
＜筍の粗抽出物の抗酸化活性試験（ＯＲＡＣ）＞
エッペンチューブに４８ｎＭ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−２Ｎａ（ＦＬ）溶液１．８ｍＬ、トロロックス標準溶液３００μＬを添加し混合する。この混合溶液と４３ｍＭ ＡＡＰＨ溶液を、それぞれ３７℃で遮光しながら１５分間プレインキュベートする。インキュベート終了後、混合溶液に対して４３ｍＭ ＡＡＰＨ溶液９００μＬを添加し、１０秒間撹拌、その後溶液を石英セルに移し、３７℃で撹拌しながら４０分間蛍光強度を測定した。
設定条件は以下の通りである。
励起バンド幅 ：５ｎｍ
蛍光バンド幅 ：３ｎｍ
レスポンス ：２ｓｅｃ
感 度 ：ｍｅｄｉｕｍ
励起波長 ：４８５ｎｍ
蛍光波長 ：５２０ｎｍ
測定時間 ：０〜２４００ｓｅｃ（０〜４０ｍｉｎ）
データ取込間隔：５ｓｅｃ
得られた蛍光強度をもとに、次の計算式から各サンプルのＡＵＣを求めた。
エッペンチューブに４８ｎＭ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−２Ｎａ（ＦＬ）溶液１．８ｍＬ、トロロックス標準溶液３００μＬを添加し混合する。この混合溶液と４３ｍＭ ＡＡＰＨ溶液を、それぞれ３７℃で遮光しながら１５分間プレインキュベートする。インキュベート終了後、混合溶液に対して４３ｍＭ ＡＡＰＨ溶液９００μＬを添加し、１０秒間撹拌、その後溶液を石英セルに移し、３７℃で撹拌しながら４０分間蛍光強度を測定した。
設定条件は以下の通りである。
励起バンド幅 ：５ｎｍ
蛍光バンド幅 ：３ｎｍ
レスポンス ：２ｓｅｃ
感 度 ：ｍｅｄｉｕｍ
励起波長 ：４８５ｎｍ
蛍光波長 ：５２０ｎｍ
測定時間 ：０〜２４００ｓｅｃ（０〜４０ｍｉｎ）
データ取込間隔：５ｓｅｃ
得られた蛍光強度をもとに、次の計算式から各サンプルのＡＵＣを求めた。
トロロックス０μＭのデータをブランクとし、トロロックス各標準液濃度（５０，２５，１２．５，６μＭ）で得られたデータのＡＵＣの増加量（ＡＵＣＴｒｏｌｏｘ−ＡＵＣＢｌａｎｋ）をｎｅｔＡＵＣとする。同様の測定を３回行い、Ｘ軸にトロロックスのｎｅｔＡＵＣの平均値、Ｙ軸にトロロックス濃度をとり一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）を作成した。
＜相対ＯＲＡＣ値の算出＞
任意の濃度に作成した酸化防止剤サンプル溶液のｎｅｔＡＵＣがトロロックスの一次回帰式のｎｅｔＡＵＣの最大値以内に収まるように必要な場合は調製し直した。
次式により相対ＯＲＡＣ値（活性酸素吸収能力値）を算出した。
任意の濃度に作成した酸化防止剤サンプル溶液のｎｅｔＡＵＣがトロロックスの一次回帰式のｎｅｔＡＵＣの最大値以内に収まるように必要な場合は調製し直した。
次式により相対ＯＲＡＣ値（活性酸素吸収能力値）を算出した。
同じ濃度で３回蛍光強度測定を行い、その３回の平均値を抗酸化物質のＯＲＡＣ値とした。図４は筍の皮粗抽出物のＯＲＡＣ値を示すグラフである。図４に示すように、ジクロロメタン可溶部およびジクロロメタン不溶部ともに、高いＯＲＡＣ値を示し、筍の皮抽出物が抗酸化作用を有していることが明らかになった。
以上のように、筍の皮の粉砕物または粉末からメタノールまたはエタノールなどの溶媒を用いて抽出した筍の皮抽出物が、メラニン合成阻害作用、美白作用、抗酸化作用、抗老化作用、又は抗菌作用を有することが明らかになった。このような筍の皮抽出物の特性に関する新たな発見により、天然素材である筍の皮を原料とするため安全性が高い、筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤などを低コストで製造することが可能になった。
Claims (4)
- 筍の皮を粉砕して得られた粉砕物又は粉末からｎ−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、この残渣からメタノール又はエタノールを用いて抽出した抽出物を得て、この抽出物からジクロロメタン不溶部を得る、筍の皮抽出物の製造方法。
- 筍の皮を粉砕して得られた粉砕物又は粉末からｎ−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、この残渣からメタノールを用いて抽出した抽出物を得て、この抽出物からジクロロメタン不溶部を得る、筍の皮抽出物の製造方法。
- 請求項１又は２の方法で製造された筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤の製造方法。
- 請求項１又は２の方法で製造された筍の皮抽出物を有効成分とする美白剤の製造方法。
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