JP5864162B2 - 筍の皮抽出物の製造方法、メラニン合成阻害剤の製造方法、及び美白剤の製造方法 - Google Patents
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Description
すなわち、前述のような課題を解決するための本発明による筍の皮抽出物は、筍の皮からメタノールまたはエタノールなどの溶媒を用いて抽出して成り、メラニン合成阻害作用又は美白作用を有するものである。また、本発明は、前記筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤又は美白剤である。
なお、本発明の実施形態において、前記のメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、又は抗菌剤は、前記筍の皮抽出物をそのまま使用するようにしてもよいし、前記筍の皮抽出物を公知の方法で乾燥させて粉末状や顆粒状など製剤化して使用したり、公知の方法で濃縮して液状で使用するようにしてもよい。また、本発明によるメラニン合成阻害剤及び美白剤は、皮膚の美白のための皮膚化粧品または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗酸化剤及び抗老化剤は、飲食品や飼料(ペットフードなど)中に添加して使用してもよいし、健康食品(錠剤などの形態のサプリメントなど)または医薬品(錠剤やカプセルなど)に含有させて経口摂取させるようにしてもよいし、シミ、しわ、たるみなどの皮膚の老化防止などのための皮膚化粧品(例えば軟膏、クリーム、乳液状など)または皮膚外用薬に含有させるようにしてもよい。また、本発明による抗菌剤は、例えば石鹸や洗剤などに含有させるようにしてもよいし、抗菌作用を発揮することが望ましい梱包剤、紙、被服の布、トイレタリー製品、不織布などに塗布または混入させて使用するようにしてもよい。
本研究では、モウソウチク(Phyllostachys pubescens)の筍の皮抽出物から抗菌活性物質を単離・同定し、未利用資源であり、産業廃棄物として大部分が処理されている筍の皮有効利用のための新たな価値を創出することを目的とする。
2.1.筍の皮の抗菌試験
モウソウチクの筍の皮を10×10mmの板状に切り取り、これに70%エタノールを吹き付け消毒した。これを「筍の皮(未処理)」とした。一方、筍の皮(10g,10×10mm)を各100mLのn−ヘキサン、ジクロロメタン、メタノール、水を用いて、順次180rpmで24時間振とう抽出し、この抽出残渣の筍の皮を「筍の皮(抽出後)」とした。
抽出物の抗菌試験を行うため、筍の皮の乾燥粉末17.8kgからn−ヘキサン、メタノールを用いて逐次抽出を行い、各々の抽出物を濃縮してn−ヘキサン抽出物(40.1g)とメタノール抽出物(192.5g)を得た。さらに、メタノール抽出物にジクロロメタンを加え、ジクロロメタン可溶部(38.8g)と不溶部(153.7g)に分けた。図2Bはこの逐次抽出の手順を示すものである。
96ウェルプレートの1ウェルあたりに、NB培地を89μL、菌液(104CFU/mL)を10μL、DMSOまたはDMF(N,N−ジメチルホルムアミド)に溶解させた抽出物を1μL加え、37℃、1150rpmで12時間培養後、630nmにおける濁度を測定し、菌の増殖の指標とした。
抽出物の抗菌試験を行った結果、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部にS.aureusに対する抗菌活性が確認された。そこで、ジクロロメタン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−Hexane:EtOAc=10:0〜0:10→MeOH100%)、分取HPLC(Inertsil PREP−ODS,10mL/min,MeOH)、リサイクル分取HPLC(JAIGEL−GS310,5mL/min,MeOH)を用いて分画し、活性物質の単離を試みた。
図2Cは、筍の皮自体のS.aureusに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。それぞれの値は平均値±標準偏差(n=3)で表す。異なる文字(a,b,c)はチューキー検定により有意差(P<0.01)があったことを示す。図2Cに示すように、筍の皮(未処理)と筍の皮(抽出後)の濁度は、コントロールの濁度より有意に低かった。この結果より、筍の皮自体にS.aureusに対する抗菌活性があることが分かった。また、筍の皮(未処理)の濁度は筍の皮(抽出後)の濁度より低かった。これは、筍の皮(未処理)が筍の皮(抽出後)よりS.aureusの増殖を強く阻害していることを示す。抽出後の方が抗菌活性が低下している原因は、溶媒抽出により筍の皮中に含まれる抗菌活性物質が減少したためと考えられる。また、E.coliに対しても同様の実験を行ったが、有意な増殖阻害は見られなかった。
1.試料
・筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物
2.実験方法
(1)菌の前培養
シャーレ上に培養した菌のコロニーから1つをとり、20mLのNutrient Broth(NB)培地を加えた100ml容三角フラスコに添加した。これを,160rpmで8時間振とう培養した。最後に培養液の660nmにおける吸光度を分光光度計で測定し、菌の濃度が104CFU/mLになるようNB培地を添加して希釈した。
(2)抽出物の調製
抽出物をそれぞれDimethylsulfoxide(DMSO)に溶解させサンプルとした。
(3)抗菌活性の測定
96well plateの1wellにNB培地89μL、菌体懸濁液10μL(104CFU/mL)、サンプル溶液1μLを添加した。その後、1150rpm、37で12時間振とう培養し、培養後の630nmにおける濁度をマイクロプレートリーダーで測定した。
図3は筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物のS.aureusに対する抗菌活性の測定結果を示すグラフである。図3において、()内はサンプル最終濃度(μg/mL)を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はt検定により判定した(*P<0.05、**P<0.01)。
以上のように、筍の皮粉砕物からのエタノール抽出物の抗菌試験においても、前記実施例1に関して説明した筍の皮粉砕物からのメタノール抽出物の抗菌試験と同様の結果が得られた。
モウソウチクの粗抽出物(水、n−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部)を用いて、メラニン生合成抑制試験を行った。
(1)細胞の前培養
シャーレ上に培養したB16メラノーマ細胞培養液を血球計測板に10μL添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にMinimum Essential Medium Alpha(EMEM)培地を加え、細胞濃度を1.0×105cells/mLとなるよう調製した。これを24well plateの各wellに1mLずつ播種し、5%CO2,37℃で24時間静置培養した。
(2)サンプル溶液の調製
モウソウチクの粗抽出物(水、n−ヘキサン、メタノール抽出物のジクロロメタン可溶部・不溶部)をDMFに溶解させ、20mg/mLに調製した。ポジティブコントロールとして、50mg/mLのアルブチンを用いた。また、コントロールとしてDMFを用いた。
(3)サンプルの添加
前培養した24well plateの培地を除去し、新たにEMEM培地998μLとサンプル溶液2μLを添加した。これを5%CO2,37℃で48時間静置培養した。この後、再び培地を除去し、EMEM培地998μLとサンプル溶液2μLを添加し、5%CO2,37℃で24時間静置培養した。系内の各サンプルの最終濃度は、粗抽出物が40μg/mL、ポジティブコントロールのアルブチンが100μg/mL、コントロールのDMFが0.2%とした。
(4)MTT法による細胞生存率の測定
24well plateの1well当たりMTT染色液(5mg/mL PBS)を50μL添加し、5%CO2,37℃で4時間静置培養した。培地を除去し、各wellに塩酸−イソプロパノール溶液を1mLずつ加え、遮光し、4時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで570nmにおける吸光度を測定し、細胞数の指標とした。
(5)メラニン生成量の測定
培地を除去し、各wellに300μLのPBSを加えて洗浄した。PBSを除去し、各wellに1N NaOHを1mLずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、4時間放置した。マイクロプレートリーダーで405nmにおける吸光度を測定し、メラニン生成量の指標とした。
エッペンチューブに48nM fluorescein−2Na(FL)溶液1.8mL、トロロックス標準溶液300μLを添加し混合する。この混合溶液と43mM AAPH溶液を、それぞれ37℃で遮光しながら15分間プレインキュベートする。インキュベート終了後、混合溶液に対して43mM AAPH溶液900μLを添加し、10秒間撹拌、その後溶液を石英セルに移し、37℃で撹拌しながら40分間蛍光強度を測定した。
設定条件は以下の通りである。
励起バンド幅 :5nm
蛍光バンド幅 :3nm
レスポンス :2sec
感 度 :medium
励起波長 :485nm
蛍光波長 :520nm
測定時間 :0〜2400sec(0〜40min)
データ取込間隔:5sec
得られた蛍光強度をもとに、次の計算式から各サンプルのAUCを求めた。
任意の濃度に作成した酸化防止剤サンプル溶液のnetAUCがトロロックスの一次回帰式のnetAUCの最大値以内に収まるように必要な場合は調製し直した。
次式により相対ORAC値(活性酸素吸収能力値)を算出した。
Claims (4)
- 筍の皮を粉砕して得られた粉砕物又は粉末からn−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、この残渣からメタノール又はエタノールを用いて抽出した抽出物を得て、この抽出物からジクロロメタン不溶部を得る、筍の皮抽出物の製造方法。
- 筍の皮を粉砕して得られた粉砕物又は粉末からn−ヘキサン抽出物を除いた残渣を得て、この残渣からメタノールを用いて抽出した抽出物を得て、この抽出物からジクロロメタン不溶部を得る、筍の皮抽出物の製造方法。
- 請求項1又は2の方法で製造された筍の皮抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤の製造方法。
- 請求項1又は2の方法で製造された筍の皮抽出物を有効成分とする美白剤の製造方法。
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