KR20170040859A - 고염 미생물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고염 미생물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

고염 미생물을 포함하는 화장료 조성물 {A cosmetic composition comprising halophilic microorganism}

본 발명은 고염 미생물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

자외선은 태양에서 발산되는 400 nm이하의 파장을 가지는 광선으로 장파자외선(UV-A; 320-400 nm), 중파자외선(UV-B; 280-320 nm), 단파자외선(UV-C; 200-280 nm)으로 나누어지며 이들은 피부에 광생물학적 반응을 일으켜 일광화상, 색소침착, 광노화, 피부암 등을 유발하며 파장에 따라 다양한 피부손상을 유발한다.

단파자외선(UV-C)은 살균작용 및 세포사멸을 일으키나 대부분 오존층에서 흡수되어 피부에 도달하기 어렵고 중파자외선(UV-B)은 표피 기저층과 진피 상부까지 도달하여 피부각화를 지속시키고 홍반, 수포 등의 일광화상과 색소 침착을 유발하며 세포막손상, 피부암을 유발한다. 특히 장파자외선(UV-A)은 진피까지 도달함으로써 즉각적인 색소침착과 지연홍반, 광독성, 광알레르기반응, 유리기(Free radical)생성으로 인한 만성적 광노화, 진피의 탄력섬유와 교원섬유를 변성시켜 피부의 탄력을 감소시키고 주름, 피부위축 현상을 유발한다. 따라서 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해서는 자외선 차단제의 사용이 필수적이다.

종래의 자외선 차단제는 크게 화학적 차단제인 자외선 흡수제와 물리적 차단제인 자외선 산란제로 나누어진다.

자외선 흡수제는 자외선을 흡수하여 피부에 자외선이 직접 조사되는 것을 억제하는 작용을 하며, 벤조페논, 메틸안트라닐산염, 파라아미노안식향산 유도체, 파라메톡시계피산 유도체, 살리실산 유도체 등과 같은 합성 흡수제가 사용되며, 이러한 합성 흡수제는 피부자극 및 피부독성의 부작용이 크다.

자외선 산란제는 피부 표면에서 자외선을 산란, 반사시켜 피부 내로 자외선이 침투되지 못하게 차단하는 작용을 하며 이산화티탄, 산화아연, 마이카, 탈크, 카올린 등의 분말형태가 이용되고 있다. 이러한 자외선 산란제의 경우 피부에 잔류하여 피부에 자극을 일으키고 제형 내에서 분산 및 용해가 어려워 피부에 도포시 하얗게 자국이 남는 백탁현상이 나타나게 된다. 또한, 피부 도포시 사용감이 나쁜 단점이 있다.

이러한 자외선 차단제들은 대부분이 화학합성물질로 피부자극과 부작용이 매우 크기 때문에 피부자극과 부작용이 적은 천연 자외선 차단제의 필요성이 절실하다.

한편 천연물로부터 분리된 자외선 차단 물질들이 다수 연구되고 있는데, 대한민국 공개특허공보 제10-2006-0088347에는 녹차 및 회향추출물을 포함하여 자외선 흡수성 화장료 조성물이 개시된 바 있었다. 하지만 종래의 천연 자외선 차단제는 그 종류가 적고 효과가 미미하여 화장품에 응용되는 예는 많지 않았다.

또한, 높은 수치의 SPF 제품에 대한 수요가 높으나, 유기화합물은 피부 유해성 문제 등의 이슈가 대두되어, 유기화합물을 대체할 수 있는 안전성이 확보된 친환경적 소재의 필요성이 대두되고 있다.

한편 미생물을 유효성분으로 포함하는 화장품 소재와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2015-0020521호는 락토바실러스 파라카제이 균주를 유효성분으로 함유하는 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0048246호는 누에 생실샘의 용해물을 함유하는 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나 UV 차단, 자외선으로 인한 피부손상을 억제하는 미생물의 화장품 소재로의 이용은 용이하지 않은 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 안정성, 피부 안전성, 효능이 우수한 화장품 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 고염 미생물이 항당화 또는 피부 노화 예방, 항염, 피부 트러블 완화, 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선, 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선, 또는 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 포함하는 항당화 또는 피부 노화 예방, 항염, 피부 트러블 완화, 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선, 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선, 또는 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

종래 화장료 조성물의 안정성, 피부 안전성, 효능 저하 문제를 극복하기 위하여 화장품 소재를 탐색한 결과, 고농도 염분의 극한 환경에서 UV를 흡수하여 생장하는 고염 미생물이 항당화, 항염, 피부 트러블 완화, 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선, 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선, 또는 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습효과가 있음을 확인하였다. 따라서 고염 미생물 또는 그의 분획물은 의약품, 화장품의 용도로 효과적으로 사용될 수 있다. 종래 UV에 의한 DNA 손상 억제효과, SPF 부스팅 효능을 동시에 갖는 미생물은 보고된 바 없다.

이하, 본 발명에서의 고염 미생물 또는 그의 분획물을 포함하는 조성물을 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서 고염(high-salt) 미생물은 호염(halophilic) 미생물 또는 내염성 미생물과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

고염 미생물은 6가지 유형의 로돕신 단백질(rhodopsin protein)을 가지고 있으며, 그 중 2가지 유형에 대한 매카니즘이 밝혀졌다. 밝혀진 첫 번째 유형의 로돕신 단백질은 세포막에 존재하며 이온농도를 맞추기 위해서 안으로 들어오는 Cl-를 밖으로 내보내주는 펌프 역할을 한다. 따라서 고염 미생물은 고염 환경에서 생존할 수 있다. 또한 밝혀진 두 번째 유형의 로돕신 단백질은 빛 조사 시, 수소이온을 발생시켜 세포막 밖으로 수소이온을 보내는 동시에 ATP을 합성한다. 따라서 고염 미생물은 UV 조사 시 더 잘 자라는 것으로 보인다.

한편, 강한 UV를 조사할 경우 일반 미생물의 경우 DNA 손상이 있으나, 호염 미생물의 경우에는 DNA 회복 시스템이 발달되어 UV에 의한 DNA 손상이 일반 미생물에 비해 적은 것으로 보인다. 구체적으로, 자외선(UV)조사 후, DNA 회복 시스템이 활성화되고, 포토리아제(Photolyase) 효소에 의해 RNA 손상이 복구된다(S. Leuko et al., Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 102 (2011) 140-145).

상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 속(Haloarcula sp.), 할로바실러스 속(Halobacillus sp.), 할로모나스 속(Halomonas sp.), 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.), 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis)일 수 있다.

"할로아르쿨라 발리스모르티스"는 호염 또는 고염 미생물의 일종으로, 본 발명에서 할로아르쿨라 발리스모르티스는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 또는 자연계에서 재배 또는 채취한 것을 사용할 수 있다. 상기 할로아르쿨라 발리스모르티스를 천연 물질로부터 분리하는 경우에는 상기 할로아르쿨라 발리스모르티스를 포함하는 건조물, 가공물, 용해물(lysate), 추출물, 희석액, 농축액, 배양액, 또는 이의 정제물을 모두 포함하는 개념일 수 있으며, 이들은 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 제조방법으로 제조될 수 있다.

예를 들어 상기 할로아르쿨라 발리스모르티스는 수탁번호 KCTC 12830BP의 미생물을 사용할 수 있다. 본 발명자들은 염전에서 분리한 미생물의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 할로아르쿨라 발리스모르티스 와 99.84%의 상동성을 나타내어, 이를 Haloarcula vallismortis LG halophilic microorganism 으로 명명하고, 2015년 6 월 3 일자로 KCTC(한국생명공학연구원)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12830BP를 부여 받았다.

본 발명에서 "고염 미생물의 분획물"은 상기 고염 미생물의 건조물, 가공물, 용해물, 추출물, 희석액, 농축액, 배양액, 또는 그의 정제물 등을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

상기 고염 미생물의 분획물은 할로아르쿨라 속(Haloarcula sp.) 분획물, 할로바실러스 속(Halobacillus sp.) 분획물, 할로모나스 속(Halomonas sp.) 분획물, 또는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 분획물 군에서 포함되는 1종 또는 2종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 고염 미생물의 분획물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis) 분획물일 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 일 예로 상기 분획물은 할로아르쿨라 발리스모르티스의 용해물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 및 그의 조합으로부터 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 용매로 분획한 것일 수 있다.

상기 분획물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명자들은 상기 고염 미생물의 IC50 값이 0.28%W/V로, 세포독성이 낮아 인체에 적용하여도 부작용을 유발함이 없이 안전함을 확인하였다(표 1 및 도 1).

본 발명의 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 고염 미생물 또는 그의 분획물은, 화장료 조성물, 약학 조성물, 또는 의약외품의 총 중량을 기준으로 바람직하게는 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 함유될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 함유될 수 있다. 상기 함량 범위 내에서, 상기 고염 미생물 또는 그의 분획물을 적절한 양으로 사용하여 경제적이면서도 그의 효과가 충분히 발휘되어 본 발명의 목적을 달성하기에 보다 적합해지는 이점이 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 바람직하게는 외용 연고, 로션 등과 같은 반고형 제제로 제조될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항염 또는 피부 트러블 완화용 화장료 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

일 실시예에서, 고염 미생물의 용해물은 대표적인 항염 물질인 L-NMMA와 비교하였을 때, 천연물질임에도 불구하고 우수한 NO 억제 활성을 나타내어 항염 효과가 우수함을 확인하였다(표 3 및 도 3). 이러한 항염 효과는 환경 변화 조건(일광, UV 조건) 및 고온 조건(50 ℃, 80 ℃) 하에서도 안정적으로 유지되어 나타났다(표 5, 도 4, 및 도 5).

한편, 피부 트러블이란 염증 또는 피부 장벽기능 약화, 자외선에 의하여 발생하는 습진 또는 피부염을 의미할 수 있다. 고염 미생물 및 그의 분획물은 대표적인 항염 물질인 L-NMMA와 비교하였을 때, 천연물질임에도 불구하고 우수한 NO 억제 활성을 나타내어 항염 효과가 우수하며, 피부 보습 및 피부 장벽기능 개선에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3, 인볼루크린, 필라그린의 발현을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였는바, 이러한 결과는 피부 염증, 피부 장벽기능 약화로 인하여 발생하는 피부 트러블의 완화 또는 개선에 고염 미생물 또는 그의 분획물이 효과를 나타냄을 시사하는 것이다.

일 예로, 상기 분획물은 고염 미생물을 에틸아세테이트, 염화메틸렌, 부탄올, 또는 그의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 용매로 분획한 분획물을 의미할 수 있다. 일 실시예에서 에틸아세테이트 분획물에 가장 많은 항염 성분이 포함되어 있음을 확인하였으며, 또한 염화메틸렌 및 부탄올 분획에도 항염성분이 다수 포함되어 있음을 확인하였다(도 9).

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

일 실시예에서 고염 미생물의 용해물은 아무 처리를 하지 않은 군(SF)에 비하여 UV에 의해 생기는 대표적인　DNA 손상 마커인 CPD의 생성을 약 61.8% 억제하는 우수한 DNA 손상 억제 효과가 나타남을 확인하였다(표 6 및 도 6).

상기 조성물은 자외선 B (UVB)를 흡수하는 것일 수 있다. 예를 들어 240-300nm 사이의 자외선 파장에서는 자외선 투과를 50% 이상 억제할 수 있다(도 7).

다른 일 실시예에 따르면, 피부와 유사한 vitroskin에 고염 미생물의 용해물을 포함하는 조성물을 도포한 결과, 상기 용해물을 포함하지 않은 조성물에 비하여 SPF 수치가 약 8% 증가하였으며, PA 수치는 약 4% 증가한 것으로 나타났다(표 8).

나아가, 다른 일 실시예에 따르면, 고염 미생물의 용해물은 상기와 같이 자외선 흡수, 차단, DNA 손상 억제 효과를 보유함과 동시에, PIF가 1로 나타나 광독성 유발 가능성 또한 없는 것으로 나타났다(표 2 및 도 2a).

따라서 고염 미생물 또는 그의 분획물은 자외선 차단용 화장료 조성물에 효과적으로 사용될 수 있으며, 자외선을 차단함과 동시에 UV에 의해 생기는 대표적인　DNA 손상 마커인 CPD의 생성을 억제시키므로(표 6) 자외선으로 인한 피부손상 또한 예방 또는 개선할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항당화 또는 피부 노화 예방용 화장료 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

본 발명에서 "항당화" 또는 "당화 저해(anti-glycation) 효과"는 당이 체내 단백질과 결합하여 최종 당산화물(AGE; Advanced Glycation End product)을 형성하는 작용을 저해하는 것으로, 최근 당화가 피부 탄력, 피부 노화와 관련이 있다는 연구 결과가 다수 보고됨에 따라, 항당화가 피부 노화 예방(안티에이징) 분야에서 주목받고 있다. 일 실시예에서 본 발명의 조성물은 당화를 약 58.5% 억제하므로, 천연물질이라는 점을 고려할 때에서 항당화 효과 및 이로 인한 피부 노화 예방 효과가 우수한 것으로 나타났다. 또한 상기 조성물에 의하여 미백 또는 자외선 차단 등의 효능이 발휘될 때 항당화 효과가 보조적인 역할로 작용하여 상승효과를 기대할 수 있다(표 10).

상기 "피부 노화"란 피부가 나이가 들어감에 따라 피부 탄력손실, 각질화, 주름 생성, 피부 위축 등의 현상이 나타나는 것을 의미하며, 연령이 증가함에 따라 발생하는 내인성 노화(intrinsicaging)와 내인성 노화에 외부인자, 특히 자외선에 의한 손상이 덧붙여져서 발생하는 광노화(photoaging)를 포함한다. 본 발명의 조성물은 항당화능을 토대로 내인성 노화를 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선 차단, 자외선으로 인한 피부손상을 예방하여 광노화 또한 예방할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

미백 물질로 알려진 selina와 비교할 때, 상기 조성물은 적은 농도(20ppm)에서도 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 비교적 적은 멜라닌 총량을 나타내었다(표 9 및 도 8). 이러한 결과는 천연물인 점을 고려했을 때, 고염 미생물의 용해물의 미백 효과가 우수함을 나타내는 것이다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선용도로 효과적으로 사용될 수 있으며, 멜라닌 생성 억제로 인하여 색소 침착 질환의 일종인 흑색종의 예방, 개선, 또는 치료에도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

상기 "피부 장벽(skin barrier)"은 피부의 외측에 존재하는 표피 중에서도 가장 외측에 존재하는 각질층 (stratum corneum; SC)에 존재하는 각질세포 (corneocyte 또는 horny cell), 각질세포사이를 둘러싸는 각질세포간 지질막 (SC intercellular lipid lamellae), 각질세포를 연결하는 교소체 (corneodesmosome)에 의하여 이루어진다.

"피부 장벽 기능"이란 피부, 특히 표피의 각질층이 외부로의 수분 유출을 방지하고 외부로부터의 물질 출입을 통제하는 등 외부와의 차단층 역할을 수행하는 기능을 의미한다. 피부는 인체의 가장 외부에 존재하는 기관으로 체내 수분을 보호하고 외부 침입 인자(항원, 감염원 등)의 내부 침입을 보호하는 필수적인 장벽 기능을 수행하고 있다.

"피부 장벽 기능 이상"은 상기 피부 장벽 기능이 저하되거나 손상된 상태뿐 아니라 저하되거나 손상될 가능성이 있거나 이를 예방할 필요가 있는 모든 상태를 의미한다.

피부에서 수분의 유출을 방지하고 물질의 출입을 통제하는 등의 장벽기능을 수행하는 각질층에서 일어나는 변화가 건조피부의 중요한 원인으로 생각되고 있다(이승헌, 건조피부와 피부장벽(노화/아토피피부염), 메디팜스투데이, 2010.01.26). 장벽기능의 훼손에 따라 각질층 내에 수분이 감소하면 각질세포의 유연성이 감소하고 각질의 정상적인 탈락을 매개하는 각질교소체 분해 효소들이 정상적인 활동을 할 수 없어 각질층 최상부의 각질이 축적되고 부분적으로 덩어리째 탈락되는 현상이 생기게 된다. 따라서 피부 장벽 기능에 이상이 나타날 경우 피부가 거칠어지고 투명성을 잃게 된다.

상기 피부 장벽 기능 강화는 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 또는 피부 건조증을 개선하는 것을 포함하는 의미일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 피부 장벽 기능의 이상에 따라 나타나는 증상 또는 질환을 모두 포함하는 의미일 수 있다.

상기 "아토피 피부염"은 건조증, 소양증, 홍반성 습진을 특징으로 하는 만성 염증성 피부질환으로, 피부 장벽 기능 이상도 주요 발병 원인으로 보고되고 있다. 구체적으로 경피수분손실(transepidermal water loss)의 증가, 각질층 내 수분량의 감소, 피부 표면 pH의 증가와 같은 장벽 기능의 이상이 관찰되면, 이러한 이상이 병변의 중증도와 연관이 있다는 결과가 지속적으로 보고되고 있다 (Allergy Asthma Respir Dis 1(1):20-28, March 2013). 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 필라그린(filaggrin)의 발현을 효과적으로 촉진함을 확인하였는바, 본 발명은 피부 장벽 기능 강화 및 아토피 피부염 예방에 우수한 효과가 있다.

상기 "피부 건조증"은 피부의 수분이 부족하여 피부가 건조해짐으로 인해 발생하는 모든 증상을 의미한다.

고염 미생물 용해물을 HaCaT 각질세포에 처리 했을 때 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3의 발현이 대조군에 비해 34% 증가되었으며(표 11), 피부 장벽기능과 보습에 중요한 역할을 하는 인볼루크린의 발현이 대조군에 비해 49% 증가된 것을 확인하였는바(표 12), 본 발명의 조성물은 피부 장벽 기능 강화 및 피부 보습에 우수한 효과가 있다(표 13).

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

본 발명에서, "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 발생을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

고염 미생물 및 그의 분획물은 대표적인 항염 물질인 L-NMMA와 비교하였을 때, 천연물질임에도 불구하고 우수한 NO 억제 활성을 나타내어 항염 효과가 우수함을 확인하였는바(표 3 및 도 3), 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

고염 미생물 및 그의 분획물은 자외선 B (UVB)를 흡수하고(도 7), UV에 의해 생기는 대표적인　DNA 손상 마커인 CPD의 생성을 억제시키며(표 6), SPF 차단 효과가 우수하고(표 8), 멜라닌 생성 억제에 우수한 효과를 나타내는바(표 9 및 도 8), 색소 침착, 흑색종 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

고염 미생물 및 그의 분획물은 피부 보습 및 피부 장벽기능 개선에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3, 인볼루크린, 필라그린의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는바(표 11 내지 표 13), 피부 보습 부족 및 피부 장벽기능 이상으로 발생하는 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 또는 피부 건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

고염 미생물 및 그의 분획물은 자외선 B (UVB)를 흡수하고(도 7), UV에 의해 생기는 대표적인　DNA 손상 마커인 CPD의 생성을 억제시키며(표 6), SPF 차단 효과가 우수하므로(표 8), 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 상기 질환들의 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 고염 미생물 또는 그의 분획물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "도포"는 임의의 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명의 조성물을 접촉시키는 것을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다. 상기 화장료 조성물을 개체의 피부에 도포하는 도포량은 상기에서 설명한 약학 조성물에 대한 투여량의 내용으로 갈음한다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

본 발명에서, "개체"란, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상이 발생하였거나 발생할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상이 발생하였거나 발생할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다. 일 예로, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스일 수 있다.

본 발명에서, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적을 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미할 수 있다. 또한 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 상기 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용 할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 항염, 피부 트러블 완화, 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선, 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선, 또는 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습 효과가 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체의 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.

도 1은 고염 미생물의 용해물의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 광독성 평가 결과로, 도 2a는 고염(호염) 미생물 용해물의 광독성 평가 결과를, 도 2b는 양성대조군인 클로로프로마진에 대한 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 고염 미생물의 용해물의 일반조건에서의 항염 효능을, 도 4는 일광, UV 조건하에서 항염 효능을, 도 5는 고온 조건하에서의 항염 효능을 평가(NO assay)하여 나타낸 것이다.
도 6은 고염 미생물 용해물의 DNA 손상 억제능 평가(CPD assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 자외선 B(UVB) 흡수능을 평가하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 고염 미생물 용해물의 미백 효능 평가 결과(멜라닌 함량, %)를 나타낸 것이다.
도 9는 고염 미생물 용해물의 분획물 종류에 따른 항염 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 고염 미생물 Haloarcula vallismortis 의 용해물의 제조

1-1. 미생물의 분리 동정

신안 염전에서 고농축 염전물을 채취하고, 호염미생물을 찾기 위하여 하기 조성의 특수 배지(Halophilic archaeal medium; 1L 당 Yeast extract 5.00g, casamino acids 5.00g, Na-glutamate 1.00g, KCl 2.00g, Na₃-citrate 3.00g, MgSO₄·7H₂O 20.00g, NaCl 200.00g, FeCl₂·4H₂O 36.00mg, MnCl₂·4H₂O 0.36mg, Agar 20.00g) 를 사용하였다.

각각 도말하여 35~40℃에서 5일간 배양하였다. 본 연구에 사용된 미생물 배양에 이용된 배지들은 모두 DIFCO Co.(USA)에서 구입하였다. 배양 후 형성된 집락(colony)은 크기, 모양과 색 등의 형태학적 특성에 따라 분류, 무작위로 다수의 콜로니를 선택하였으며, 3회의 계대 배양을 통해 미생물을 순수 분리하였다.

이후 배양된 미생물을 분리하여 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, Haloarcula vallismortis 와 99.84%의 상동성을 나타내어, 이를 Haloarcula vallismortis LG halophilic microorganism 으로 명명하고, 2015년 6 월 3 일자로 KCTC(한국생명공학연구원)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12830BP를 부여 받았다.

1-2. 고염 미생물의 용해물 제조

상기 1-1에서 배지를 제거하고 상온의 1% PBS로 두 번 헹군 후, 10cm 플레이트(플레이트) 당 1mM PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride)가 포함된 차가운 1 x Cell Lysis Buffer 500 μl를 첨가하였다. 그 후, 세포를 긁어 모아 튜브에 옮긴 후, 얼음에서 음파처리(sonication)하였다. 그 후, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하여 세포 용해물(sup)을 새로운 튜브에 옮기고, -20℃에서 48시간 동안 동결 건조하여 고염 미생물의 용해물을 제조하였다.

실험예 1. 세포 독성 및 알러지 평가

1-1. 세포 독성 평가

상기 실시예 1에서 제조한 고염 미생물의 용해물의 세포 독성을 평가하기 위하여, 하기의 실험을 진행하였다.

먼저, V79-4 세포(Chinese Hamster, CCL of lung tissue fibroblast)를 24시간 동안 배양하였다. 그 후 3% FBS 배지로 상기 고염 미생물의 용해물을 1%로 희석하고, 이를 이용하여 상기 V79-4 세포를 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 MTT 시약을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다. 대조군으로는 SLS(Sodium lauryl sulphate)를 사용하였다.

시료	IC50( %,W /V)	CTI
SLS (표준 대조군)	0.007	높음
고염 미생물의 용해물	0.28	낮음

그 결과, 상기 표 1 및 도 1과 같이 고염 미생물의 용해물은 IC50 값이 0.28%W/V로 세포독성이 낮아, 안전한 천연 소재임을 확인하였다.

1-2. 광독성 평가

2개군(UV 조사군(UV+) 및 UV 비조사군(UV-))의 96 웰 플레이트에 섬유아 세포를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 고염 미생물 용해물을 포함하는 완충액을 각 웰에 첨가하고, 5% CO₂ 배양기에서 45분 동안 배양하였다. 양성 대조군에는 광독성 물질로 알려진 클로로프로마진(Chlorpromazine)을 고염 미생물 용해물 대신 첨가하였다.

그 후 UV 조사군(UV+)의 플레이트는 UV(UVA)를 5J/cm² 로 50분 동안 조사하였고, 비조사군(UV-)의 플레이트는 암소에 방치하였다. 자외선 조사가 끝나면 상기 완충액을 제거하고 PBS로 세척한 후 배지를 교환하고 20시간 동안 배양하였다.

이후 Neutral red(NR) 용액을 처리하고 5 % CO₂, 37℃ 의 항온조에서 3시간 동안 배양하고, NR 용액을 제거하고 PBS로 수세한 후, 540nm에서 NR 의 흡광도를 측정하였다.

시험 물질	IC50(UV+)	IC50(UV-)	PIF값	MPE값	광독성 유무
고염(호염) 미생물 용해물	>14mg/ml	>14mg/ml	1.000	0.072	광독성 없음
클로로프로마진 (양성대조군)	1μg/ml	44ug/ml	36.11	0.582	광독성 있음

IC50 값은 NR 의 세포 내 흡수를 50 % 저해하는 시험물질의 농도로, 적절한 non-linear regression procedure (hill function or logistic regression)로 측정하였다.

PIF(photo irritation factor) 값은 UV 조사군(UV+)과 비조사군(UV-)의 IC50 값을 측정하고, [ IC50(UV-) / IC50(UV+) ] 으로 계산하였다. 참고로, PIF값이 5 미만이면 광독성 유발 가능성이 없는 것으로 판단하고, PIF가 5 이상일 때는 광독성 유발 가능성이 있는 것으로 판단한다.

MPE(mean photo effect) 값은 농도 반응 곡선의 차이를 기초로 하며, n개의 PE값 가중평균으로 정의된다(식품의약품안전청, 화장품 독성시험 동물대체시험법 가이드라인(I) 참고). PIF값 및 MPE값은 소프트웨어(Phototox 2.0, ZEBET at the BfR, Berlin Germany)를 사용하여 계산할 수 있다.

그 결과, 상기 표 2 및 도 2a에 나타난 것과 같이 고염 미생물 용해물은 (UV+)와 (UV-) 에서의 IC50값이 얻어지지 않아 PIF가 1로 나타났는바, 광독성 유발 가능성이 없음을 확인하였다. 또한 MPE 값도 0.1 이하로 나타났으므로 광독성이 없음을 확인하였다(No phototoxicity).

실험예 2. 고염 미생물의 항염증 효능 평가

2-1. 일반조건에서의 항염 효과 확인 (NO assay)

고염 미생물 용해물의 항염증 효과 및 피부트러블 완화 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7 세포주 (ATCC number: CRL-2278)를 이용한 GRIESS 법으로 Nitric oxide(NO) 형성 억제력을 평가하였다.

구체적으로, 생쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 수차례 계대배양하고, 웰 하나에 3×10⁵ 개씩 들어가도록 24-웰 플레이트에 넣은 후, 24 시간 동안 배양시켰다. 그 후 상기 플레이트의 배지를, 최종농도 1, 10, 100ppm의 농도로 고염 미생물 용해물을 희석한 배지로 교체하였다. 이 때, NO-생성 억제물질인 L-NMMA(L-NG-Monomethylarginine)을 양성 대조군으로 함께 처리하여 30분 동안 배양하였고, 자극원으로 LPS(Lipopolysaccharide)를 1 μg씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

이후, 상층액을 100 μl씩 취해 96-웰 플레이트에 옮기고, GRIESS 용액을 100 μl씩 가해 상온에서 10분간 반응시키고, 540nm에서의 흡광도를 측정함으로써 시료의 NO 억제 효과를 판단하고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

시료	NO 생성 억제율( % )
L-NMMA (양성 대조군, 10 ppm)	34.97
고염 미생물 용해물 (1 ppm)	6.91
고염 미생물 용해물 (10 ppm)	9.39
고염 미생물 용해물 (100 ppm)	17.40
고염 미생물 용해물 (1000 ppm)	48.12

그 결과, 대표적인 항염 물질인 L-NMMA와 비교하였을 때, 고염 미생물 용해물은 천연물질임에도 불구하고 우수한 NO 억제 활성을 나타내어 항염 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서, 미백, 주름 개선 또는 피부 트러블 개선에 있어, 항염 효과가 보조적인 역할로 작용하여 그 상승효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.

한편, 동일한 실험 결과, 하기 표 4와 같이, YPD 용해물의 경우 0.1%의 농도에서도 NO 생성 억제율이 4.42%로 매우 낮게 나타났다.

YPD 용해물 농도	NO 생성 억제율 ( % , 평균)	STDEV
0.0001%	-0.06	1.01
0.001%	-4.42	2.30
0.01%	-15.98	3.46
0.1%	4.42	2.87

2-2. 일광, UV 조건하에서 항염효과 확인

상기 2-1의 실험을 상온 1주, 일광 1주일, UV 4시간 조건에서 동일하게 진행하였다.

그 결과 하기 표 5 및 도 4에 나타난 것과 같이, 고염 미생물의 용해물은 상온은 물론 일광 1주일, UV 4시간 조건 하에서도 항염 효과가 우수하며, 환경변화에도 불구하고 그 효과가 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.

			average	STDEV
L-NMMA 0.001%(10 ppm)			36.72	0.69
고염 미생물 용해물	상온	0.0001%	8.95	1.23
		0.001%	21.73	0.45
		0.01%	44.8	3.66
		0.1%	51.6	2.87
	일광	0.0001%	6.8	2.43
		0.001%	11.8	1.12
		0.01%	41.89	1.4
		0.1%	63.28	1.62
	UV(4hr)	0.0001%	8.13	2.88
		0.001%	17.32	2.09
		0.01%	47.12	0.48
		0.1%	52.41	1.46

2-3. 고온 조건하에서 항염효과 확인

50 ℃, 80 ℃ 온도조건으로 4시간(hr) 또는 8시간(hr) 동안 상기 실험예 2-1의 실험을 동일하게 진행하였다.

그 결과 도 5에 나타난 것과 같이, 고염 미생물의 용해물은 상온은 물론 50 ℃(도), 80 ℃(도)의 고온 조건 하에서도 항염 효과가 우수하게 유지됨을 확인하였다.

즉, 상기 실험예 2의 결과로부터 고염 미생물의 용해물이 일반 조건, 환경 변화 조건(UV, 일광), 고온 조건 하에서도 효능을 우수하게 유지함을 알 수 있다.

실험예 3. 자외선 차단 및 자외선으로부터의 피부 보호 효과

3-1. DNA 손상 억제능 평가 ( CPD assay)

각질세포(Keratinocyte)를 2x10⁵ cells씩 35mm 세포 배양 접시에 접종하고, 고염 미생물 용해물을 각각 0.1, 1, 10ppm으로 처리하였다. 6시간 후 처리한 물질을 제거하고, 600 μl의 PBS를 첨가한 후, UV-B를 20mJ으로 처리하였다. 자외선 조사가 종료된 후 상기 시료를 다시 0.1, 1, 10ppm으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 DNA 손상을 억제하는 것으로 알려진 아미그달린(Amygdalin), 항염물질인 테트라메틸피라진(2,3,5,6-tetramethyl pyrazine)을 사용하였다.

그 후 세포를 수득하고 DNA를 분리하여 OxiSelect™ UV-Induced DNA Damage ELISA Kit(Cell bilolabs, STA-322)를 이용하여 UV-B에 의해 생긴 DNA상의 CPD(cyclobutane pyrimidine dimer)양을 정량하였다.

CPD는 UV에 의해 생기는 대표적인　DNA 손상 마커로, UV-B에 의해 DNA상의 피리미딘(Pyrimidine)은 서로 이량체(dimer)를 형성하며 CPD를 만들게 된다. 이는 자연적으로 일정 수준 복구가 가능하지만, 계속해서 손상이 축적되면 세포는 자연사멸하게 되며, 이에 따라 피부 구성인자의 합성 또한 저해되는 결과를 초래한다.

상기 정량 결과, 하기 표 6과 같이, 10ppm의 고염 미생물 용해물은 아무 처리를 하지 않은 군(SF)에 비하여 CPD생성을 50% 이상(61.8%) 억제하는 효과가 나타났다. 특히 UV-B조사 전에 상기 용해물을 처리 해준 샘플에서 나타난 효과로 보았을 때, 고염 미생물 용해물 내에 CPD생성, 즉 DNA손상을 상당수준 예방할 수 있는 인자가 있을 것으로 기대할 수 있다.

DNA 손상 저해율(%, 시료 농도 10ppm)

	SF 대비 DNA 손상율 (배수)	SF 대비 감소율 (%)
아미그달린 (Amygdalin)	0.762	23.839
테트라메틸피라진 (2,3,5,6-tetramethylpyrazine)	0.921	7.895
고염 미생물 용해물	0.382	61.765

아울러, 도 6과 같이, 특히 10ppm에서 고염 미생물 용해물의 DNA 손상 억제 효과(DNA damage inhibition)가 우수하게 나타났다.

3-2. 자외선 B ( UVB ) 흡수능 평가

UV/VIS 분광기를 이용하여 자외선 파장 200 nm 내지 400 nm 구간에서 흡광도와 투과도를 측정하여 고염 미생물 용해물의 자외선 B 흡수력을 측정하였다.

구체적으로, 고염미생물의 용해물의 농도가 20ppm이 되도록 정제수로 희석한 후, 자외선 흡수 및 투과 스펙트럼을 측정한 결과, 도 7과 같이 258nm에서 최대흡수력을 보였다. 자외선 투과율의 경우 240-300nm 사이의 자외선 파장에서 고염미생물의 용해물이 자외선 투과를 50% 이상 억제하였다. 이는 본 발명의 유효성분이 미생물의 용해물인 것을 감안할 때 매우 우수한 결과로 판단된다.

3-3. 인비트로 (in vitro) SPF 차단효과

하기 표 7과 같이 SPF 50, PA +++인 제형에 고염 미생물의 용해물을 분말로 3%중량 첨가하여 실시예 2를 제조하였다.

(단위: %중량)

원료	비교예 1	실시예 2
정제수	54.65	51.65
Tris Ultra Amino PC	1.6	1.6
PARSOL HS	2.75	2.75
글리세린	10	10
PARSOL MC80	6	6
SILICONE D5	9	9
ICEH	5	5
UV M 170	9	9
KF-6017	2	2
고염미생물 용해물	-	3

35 cm²의 Vitroskin을 수화 챔버(hydration chamber; 15% 글리세린 용액으로 수화시킨 desiccator)에서 20시간 동안 수화시켰다. 상기 비교예 1 또는 실시예 2를 각각 70 mg (2 mg/cm²)씩 취하여 Vitroskin 위에 최대한 고르게 도포한 뒤 상온에 10분 방치하였다. 도포는 검지손가락에 일회용 고무 골무를 낀 상태로 실시하였다. 도포되지 않은 Vitroskin을 대조군으로 사용하고, SPF-290S 기기를 이용하여 자외선 파장의 빛의 투과 정도를 통하여 샘플의 SPF와 PA 수치를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 8과 같이, 고염 미생물의 용해물을 포함하는 실시예 2의 SPF 수치가 비교예 1에 비하여 약 8% 증가하였으며, PA 수치는 약 4% 증가한 것으로 나타났다.

Substrate type	Vitroskin
UV type	SPF	PA
비교예 1	57.94±3.02	16.75±2.50
실시예 2	65.76±16.74	20.55±5.87

실험예 4. 미백 효능 평가

Lotan R. & Lotan D (Cancer Res. 40:3345-3350, 1980)의 방법을 참고하여, 고염 미생물의 용해물을 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mouse melanoma cell)의 배양액에 첨가하여 세포 수준에서의 멜라닌 총량을 측정함으로써 미백 효과를 확인하는 하기의 실험을 진행하였다.

먼저, 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 독성을 평가하여 IC50값 0.28%로 독성이 없으면서 실험이 가능한 농도 20ppm을 선정하였다. 시료를 최종 농도가 1 ppm, 10 ppm, 또는 20ppm이 되도록 배양액에 첨가하였으며, 대조군인 selina를 20 ppm으로 포함하는 배지에서 B-16 멜라노마 세포를 3일간 배양하였다. 이후, 세포들을 트립신 (trypsin) 처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후, 멜라닌을 추출하였다. 떼어낸 세포는 수산화나트륨 용액(1N 농도) 1 ml를 가한 후 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고, 분광 광도계로 400 nm에서 흡광도를 측정하여, 생성된 멜라닌의 양을 측정하였다.

시료	멜라닌 생성량 (abs)	멜라닌 함량 ( % )
대조군(무첨가)	0.14	100
Selina 20ppm	0.077	55.00
고염 미생물 용해물 20ppm	0.114	81.43

상기 표 9에서 "멜라닌 생성량(abs)"은 단위 세포수 당(1x10⁶ cell)의 흡광도로 나타내었고, "멜라닌 함량(%)"은 대조군 대비 상대적인 멜라닌 양을 나타낸 것이다.

상기 표 9 및 도 8(멜라닌 함량, Melanin content)의 결과에서 볼 수 있듯이, 고염 미생물의 용해물은 미백 물질로 알려진 selina와 비교할 때, 적은 농도(20ppm)에서도 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 비교적 적은 멜라닌 총량을 나타낸다. 이러한 결과는 천연물인 점을 고려했을 때, 고염 미생물의 용해물의 미백 효과가 우수함을 나타내는 것이다.

실험예 5. 당화 저해 (anti- glycation ) 효과

당화 저해 효과를 확인하기 위하여, L-아르기닌과 포도당을 이용하여 하기와 같이 당화 저해 활성을 테스트하였다.

먼저, 1M L-아르기닌과 1M 인산 완충용액(pH 7.4)을 1:4의 부피비로 혼합한 다음 96-웰 플레이트에 80 μl씩 분주하였다. 여기에 1M 인산 완충용액을 이용하여 고염 미생물의 용해물을 각각 50, 100ppm으로 희석한 용액을 100μl씩 웰에 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 양성 대조군으로는 항당화 물질로 알려진 O.OlM 아미노구아니딘(aminoguanidin) 100 μl를 사용하였다.

이후, 포도당의 최종농도가 0.1M가 되도록 1M 인산 완충용액으로 희석한 포도당 용액을 각 웰에 첨가한 후, 70℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 분광 광도계로 420nm에서 96-웰 플레이트의 흡광도를 측정하고, 하기 식으로 당화 저해율을 계산하였다.

상기 "Glycation 실험군"은 1M L-아르기닌과 1M 포도당을 넣어 당화를 유발시킨 실험군을 의미한다. "반응 전 시료"는 포도당을 넣기 전의 시료를 의미한다.

그 결과, 하기 표 10과 같이 고염 미생물의 용해물이 당화를 약 58.5% 억제하므로, 천연물질이라는 점을 고려할 때에서 항당화 효과가 우수한 것으로 나타났다. 따라서 고염 미생물의 용해물에 의하여 미백 또는 자외선 차단 등의 효능이 발휘될 때 항당화 효과가 보조적인 역할로 작용하여 상승효과를 기대할 수 있다.

시료	양성대조군 대비 당화억제효과 ( % )
고염 미생물의 용해물 (1%)	58.53
아미노구아니딘 (1mM)	100.00

양성대조군인 아미노구아니딘의 효능은 월등이 좋기 때문에 유의적 차이가 나는 상기 시료농도를 결정하였다.

실험예 7. 피부 장벽기능 강화 및 보습 효능 확인

7-1. 인볼루크린 및 아쿠아포린 -3 합성 촉진 효능 확인

고염미생물 용해물이 피부세포 장벽 및 보습기능에 중요한 역할을 하는 인볼루크린과 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3의 합성을 증가시키는 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 세포에 고염미생물 용해물을 인간의 각질형성세포 HaCaT 에 처리한 후 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 진행하였다.

먼저, HaCaT를 24시간 동안 배양한 후, 고염미생물 용해물과 양성 대조군인 EGF(epidermal growth factor)를 각각 첨가한 DMEM 배지를 첨가하고, 상기 세포를 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 세포를 회수한 후 파쇄하고 단백질만을 추출하여 -40℃에 보관하였다.

추출된 단백질을 BCA 어세이로 정량 하였다. 구체적으로, 각 시료의 단백질량을 30 g이 되도록 희석한 후 12% SDS-겔에서 전기영동하고, PVDF membrane으로 이동시켰다. 이를 1차 항체(rabbit anti-aquaporins-3 antibody)와 반응 시킨 후, 남은 항체를 세척하여 제거하고, 다시 2차 항체(rabbit HRP-coupled anti-IgG antibody)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후, 항체와 반응하여 발색 반응을 일으키는 시약(peroxidase substrate and chromogen solution)을 첨가하였다.

발색된 밴드를 이미지 분석(BioRad, Universal Hood, USA)을 통해 측정하고 수치화 하였다. 실험결과는 하기 표 11에 나타내었다.

HaCaT 각질세포의 아쿠아포린-3 발현량 (반복수 = 3)

구분	아쿠아포린-3의 발현량(%)
대조군	100
EGF (50μg/ml)	168
고염미생물 용해물 (50μg/ml)	134

상기 표11에 나타난 바와 같이, 고염미생물 용해물을 HaCaT 각질세포에 처리 했을 때 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3의 발현이 대조군에 비해 34% 증가된 것을 확인하였다.

HaCaT 각질세포의 인볼루크린 발현량 (반복수 = 3)

구분	인볼루크린 발현량(%)
대조군	100
고염미생물 용해물 (50μg/ml)	149

상기 표 12에 나타난 바와 같이, 고염미생물 용해물을 HaCaT 각질세포에 처리 했을 때 피부 장벽기능과 보습에 중요한 역할을 하는 인볼루크린의 발현이 대조군에 비해 49% 증가된 것을 확인할 수 있다. 이상의 실험결과를 통하여 본 발명에서 선택한 고염미생물 용해물은 피부장벽기능과 보습에 뛰어난 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

7-2. 필라그린(Filaggrin)의 발현 촉진 효능 확인

피부장벽에 중요한 역할을 담당하는 단백질인 필라그린(filaggrin)의 발현을 촉진하는 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기의 실험을 진행하였다.

먼저, 각각 6-웰 플레이트에 1x10⁶개의 HaCaT 인간 각질세포주를 생육시키고 고염미생물 용해물을 5 ㎍/mL, 10 ㎍/mL가 되도록 배양배지에 첨가하여 1일간 배양한 후, 세포의 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 뒤 사이버그린(sybr green)염색액으로 Real-time PCR을 수행하였다. RNA농도는 S16 리보솜 RNA로 표준화시켰다.

농도에 따른 필라그린 발현 효과(반복수 = 3)

첨가시료	대조군(무첨가) 대비 필라그린 증가배수
고염 미생물 용해물 (5 ㎍/mL)	38.4
고염 미생물 용해물 (10 ㎍/mL)	52.9

급성 아토피피부염 병변은 정상 부위에 비하여 필라그린의 발현이 감소되는 등 아토피피부염과 필라그린의 선천적, 후천적 결함이 밀접하게 관련되어 있을 것으로 생각된다. 또한 필라그린은 분해되어 자연보습인자인 아미노산 및 PCA, trans-UCA로 대사되므로, 필라그린의 발현 감소는 각질층의 수분 함유 감소로 이어질 수 있다(Allergy Asthma Respir Dis 1(1):20-28, March 2013).

상기 표 13에 나타난 바와 같이, 고염미생물 용해물은 인간 각질세포주 HaCaT 세포의 필라그린 발현 촉진능이 있어, 피부 장벽 기능 강화 및 아토피 피부염 예방에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 8. 분획물 제조 및 유효성분 탐색

상기 실시예 1에서 제조한 고염미생물 용해물을 정제수(D.W)에 200ml로 희석하고 용매를 동량 넣어 혼합하였다. 3시간 정치 후, 용매 부분만 따로 분리하여 질소가스로 용매를 증발시켜 용매에 따른 분획물을 얻었다. 헥산(Hexane), 염화메틸렌(CH2Cl2; methylene chloride), 에틸아세테이트(EA; ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(D.W)의 순서로 분획하여 분획물을 수득하였으며, 실험예 2-1와 같은 방법으로 NO assay를 진행하였다.

도 9의 가로축은 분획물의 농도(%w/v), 세로축은 NO 생성 억제율(%)을 나타낸다. 도 9에 도시된 것과 같이 에틸아세테이트 분획물에 가장 많은 항염 성분이 포함되어 있음을 확인하였다. 또한 염화메틸렌 및 부탄올 분획에도 항염성분이 다수 포함되어 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC12830BP 20150603

Claims (17)

1. 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 속(Haloarcula sp.), 할로바실러스 속(Halobacillus sp.), 할로모나스 속(Halomonas sp.), 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.), 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 인 것인 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis)인 것인, 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 분획물은 할로아르쿨라 발리스모르티스의 용해물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 및 그의 조합으로부터 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 용매로 분획한 것인, 화장료 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 항염 또는 피부 트러블 완화용 화장료 조성물.
   
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단 또는 자외선으로 인한 피부손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 자외선 B (UVB)를 흡수하는 것인, 화장료 조성물.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 항당화(anti-glycation) 또는 피부 노화 예방용 화장료 조성물.
   
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 피부 미백 또는 색소침착 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습용 화장료 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 피부 장벽 기능 강화는 아토피 피부염 또는 피부 건조증을 개선하는 것을 포함하는 것인, 피부 장벽 기능 강화 또는 피부 보습용 화장료 조성물.
    
12. 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis)인 것인, 약학 조성물.
    
14. 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 치료방법.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis)인 것인, 방법.
    
16. 고염 미생물 및 그의 분획물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 염증, 색소 침착, 흑색종, 아토피 피부염, 건성 습진, 건선, 가려움증, 피부 건조증, 또는 자외선으로 인한 피부손상의 예방 또는 개선용 의약외품.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 고염 미생물은 할로아르쿨라 발리스모르티스(Haloarcula vallismortis)인 것인, 의약외품.

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