WO2004005506A2 - Zellaufschluss von bakterien mit der domäne 3 von ef-tu - Google Patents

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WO2004005506A2
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cytoskeleton
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Frank Mayer
Andreas Schwienhorst
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Novologix Gmbh
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms

Definitions

  • the invention relates to the use of substances that bind to the bacterial elongation factor EF-Tu for cell disruption or for the lysis of cells.
  • the invention further relates to a cell disruption system or a cell disruption method.
  • Cells in particular bacterial cells, are frequently used to produce compounds using molecular genetic techniques, for example by homologous or heterologous gene expression and expression of synthetically active enzymes.
  • Peptide compounds, triglycerides, wax esters and PHAs are preferably produced, and in particular those compounds which can be used in biotechnology, medicine, in the pharmaceutical sector or in other fields.
  • heterologous gene expression the compounds formed are non-natural components of the cells or bacteria used.
  • the production of a wide variety of compounds by means of gene expression has been extensively described in the prior art (see, for example, Q. Bi et al., Applied Biochemistry & Biotechnology, 95 (1) (2001) 23-30; D.
  • the production of the compounds produced in the cells generally requires that the cells or bacteria have to be lysed.
  • a Such lysis is always mandatory if the desired compounds cannot be removed from the living cell. In this case, the desired compounds can only be released by lysis and sent for further processing (down-stream processing).
  • enzymes such as lysozyme
  • lysozyme can be added which lyse the cell envelope, whereby lysis could not be achieved by induced lysozyme expression.
  • the cell envelope is destroyed, the cell can be regarded as "unlocked" (TR Hopkins, Bioprocess Technology (New York) 12 (1991), 57-83; JA Asenjo et al., Bioprocess Technology (New York) 9 (1990) 143- 75).
  • Methods can also be used for lysis in which mechanical shear forces come into effect to destroy the cells. An example of such a method is the use of a French press.
  • the object of the present invention was therefore to provide an improved method for cell disruption, in particular a method which can be used advantageously in biotechnological production processes.
  • the bacterial protein EF-Tu contains domains 1, 2 and 3 (H. Song et al., J. Mol. Biol. 285 (1 999) 1 245-1 256).
  • the sequences of the EF-Tu protein and its coding gene have been published for Escherichia coli and a number of other Eu bacteria and are accessible in databases.
  • EF-Tu is a protein that contains three domains.
  • domain 1 includes amino acids 8 to 204, amino acids 172 to 204 forming a connection structure to domain 2.
  • Domain 2 includes amino acids 205 to 298 and domain 3 includes amino acids 299 to 394.
  • EF-Tu is a 3-domain protein, as shown in Figure 1.
  • the protofilaments of the cytoskeleton arise in the living cell in that domains 2 and 3 of EF-Tu proteins (monomer or integrated in a protofilament and only transiently free) with domains 3 and 2 neighboring EF-Tu proteins interact.
  • domains 2 and 3 of EF-Tu proteins monomer or integrated in a protofilament and only transiently free
  • domains 3 and 2 neighboring EF-Tu proteins interact.
  • chains so-called protofilaments, are formed in this way, which combine to form a network (see figure 2).
  • Other factors may be associated with this network, such as FtsZ, MreB and / or M6I.
  • Stability and / or expression of such protofilaments and networks in bacterial cells can be prevented according to the invention, the death of the bacterial cell occurring as a result of lysis.
  • a particularly advantageous procedure of the invention is as follows.
  • the DNA section of the EF-Tu gene from Escherichia coli, which codes for domain 3, is obtained and transferred and expressed in E. coli cells by means of molecular genetic techniques.
  • the cells still have the native EF-Tu gene and can express it.
  • the additionally synthesized domain 3 polypeptides compete with the native EF-Tu proteins for the binding sites for the formation of the protofilaments.
  • a domain 3 polypeptide is incorporated as a chain link instead of a native EF-Tu protein, this leads to chain termination due to the lack of the second binding site (domain 2 is essential for chain formation) on the domain 3 polypeptide.
  • the protofilament stops growing, the cytoskeletal network is weakened and eventually collapses.
  • the cell's cytoplasmic membrane loses its suspension.
  • the cytoplasmic membrane is suspended from the cytoskeleton. This destroys the cell wall, which is positioned and supported in the living bacterial cell by the cytoplasmic membrane (see FIG. 5). Loss of cell wall and cytoplasmic membrane means an exposure of the cell contents so that the cell is lysed (see FIGS. 5 and 6). The cell content can thus be obtained without further cell disruption.
  • Cells which are used for biotechnological production processes, such as heterologous expression, production of proteins, in particular for biotechnological or medical purposes, can thus be disrupted by introducing a sequence into them prior to their use in production which Species corresponding domain of the EF-Tu coded.
  • the substances used for cell disruption contain fractions which bind to EF-Tu in the region of amino acids 218 to 224 of domain 2 and / or in the region of amino acids 317 to 328 or / and 343 to 354 of domain 3.
  • Different secondary structures occur within domains 2 and 3.
  • intracellularly expressed peptide substances are used which are based on oligopeptides which bind to EF-Tu, preferably in the region of the matching sites of domains 2 or / and 3.
  • oligopeptides can contain sections of the amino acid sequences of domains 2 or / and 3 with a length of preferably 4 to preferably 20 amino acids, particularly preferably 5 to 15 amino acids and particularly preferably with a length of 6 to 12 amino acids.
  • the substances contain partial sections or the total range of the amino acid sequences from domain 3 with a length of at least 4 and in particular at least 5 amino acids and which at the same time does not correspond to any section of the amino acid sequences from domain 2.
  • intracellularly expressed peptidic compounds In addition to intracellularly expressed peptidic compounds, intracellularly expressed peptidomimetics can also be used advantageously.
  • Another object of the invention is a method for disrupting cells, in which components of the cytoskeleton are destabilized in the cells.
  • Cytoskeletal elements that can be altered to weaken the cytoskeleton include, for example, FtsZ, MReB, Mbl, and contractile proteins, and particularly EF-Tu.
  • substances which bind to constituents of the cytoskeleton, in particular to EF-Tu, and which have been explained above, are particularly preferably used.
  • a construct is introduced into the cells which, in addition to the gene for the destabilizing substance, contains further coding sequences which make it possible to induce the start of the synthesis of the substance, for example the domain 3 polypeptide, from the outside. In this way it is possible to precisely control the time of cell lysis in the cell culture from the outside.
  • Induction by a quorum-coupled or / and cell culture-self-sufficient process is another suitable form for initiating cell lysis.
  • the invention further comprises a construct comprising a sequence which codes for a constituent of the substance destabilizing the cytoskeleton of cells.
  • This construct preferably further comprises at least one gene segment which allows the induction of the synthesis of the substance destabilizing the cytoskeleton.
  • FIG. 7 Advantageous designs of the construct are shown in FIG. 7. As soon as the induction has taken place, the lysis of the cells is brought about within a cell generation by the interaction of EF-Tu, domain 3 polypeptide, cytoplasmic membrane and cell wall.
  • Fig. 1 a EF-Tu (GDP form from E. coli; result of an X-ray structure analysis; figure taken from the literature and modified).
  • the 3 domains of the protein molecule are marked.
  • a 'and b denote connection sequences b) Like a), but different form of representation.
  • the numbers mark the positions of the amino acid residues; N-terminus and C-terminus are given.
  • Gold markers used for marking purposes.
  • EF-Tu-GFP-His fusion clones are to be generated.
  • the ideal fusion point for EF-Tu is the C-terminus, which protrudes between domains 2 and 3 (Song et al., 1 999).
  • the same fusion point can also be chosen for a domain-3 fusion construct.
  • the domain 3 fusion construct can be used for in vivo competition experiments. It seems sensible to introduce a C-terminal cysteine (the only one in domain 3) for chemical labeling alternatives.
  • the starting point is genomic DNA from an E. coli K-12 strain. in the
  • Tu was expressed in addition to the cell's own EF-Tu;
  • Lad Repressor p u ac o- ⁇ modified Lac promoter (according to LUTZ and BUJARD, 1 997)
  • the promoters ara, T7 or bdA (quorum sensing) can also be used as alternatives to the specified promoter.
  • Clones are plated on selection agar (here: LB / ampicillin) and grown overnight at 37 ° C

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Elongationsfaktor EF-Tu binden zum Zeltaufschluss bzw. zur Lyse von Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zellaufschlusssystem bzw. ein Zellaufschlussverfahren.

Description

Zellaufschluss von Bakterien
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Elongationsfaktor EF-Tu binden zum Zellaufschluss bzw. zur Lyse von Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zeilaufschlusssystem bzw. ein Zeilaufschlussverfahren.
Zellen, insbesondere Bakterienzellen, werden häufig eingesetzt, um unter Anwendung molekulargenetischer Techniken, beispielsweise durch homologe oder heterologe Genexpression und Expression synthetisch wirksamer Enzyme, Verbindungen zu produzieren. Bevorzugt werden peptidische Verbindungen, Triglyceride, Wachsester und PHAs produziert und insbesondere solche Verbindungen, welche in der Biotechnologie, der Medizin, auf dem Pharmasektor oder in anderen Bereichen Anwendung finden können. Im Falle der heterologen Genexpression sind die gebildeten Verbindungen nicht-natürliche Komponenten der verwendeten Zellen bzw. der verwendeten Bakterien. Die Herstellung von verschiedensten Verbindungen mittels Genexpression ist im Stand der Technik umfangreich beschrieben (siehe z.B. Q. Bi et al., Applied Biochemistry & Biotechnology, 95(1 ) (2001 ) 23-30; D. Macmillan et al., Chemistry & Biology, 8(2) (2001 ) 133-45; J.E. de Oliveira et al., Journal of Chromatography, A, 852(2) (1999) 441 -50 und M. Schmidt et al., Journal of Biotechnology, 68(1 ) (1999), 71 -83). Auf diese Weise wurde beispielsweise rekombinantes humanes Erythropoietin, rekombinates humanes Insulin sowie rekombinantes humanes Wachstumshormon hergestellt.
Die Gewinnung der in den Zellen produzierten Verbindungen, insbesondere wenn es sich um intrazellulär synthetisierte Substanzen handelt, bedingt in der Regel, dass die Zellen bzw. Bakterien lysiert werden müssen. Eine solche Lyse ist immer dann zwingend, wenn die gewünschten Verbindungen nicht aus der lebenden Zelle ausgeschleust werden können. In diesem Fall können die gewünschten Verbindungen nur durch Lyse freigesetzt und der weiteren Verarbeitung (down-stream processing) zugeführt werden.
Um eine Lyse der Zellen zu bewirken, können beispielsweise Enzyme, wie etwa Lysozym, zugesetzt werden, welche die Zellhülle lysieren, wobei eine Lyse durch induzierte Lysozym-Expression nicht erreicht werden konnte. Ist die Zellhülle zerstört, kann die Zelle als "aufgeschlossen" gelten (T. R. Hopkins, Bioprocess Technology (New York) 12 (1991 ), 57-83; J.A. Asenjo et al., Bioprocess Technology (New York) 9 (1990) 143-75). Zur Lyse können auch Verfahren eingesetzt werden, bei denen mechanische Scherkräfte zur Zerstörung der Zellen zur Wirkung kommen. Ein Beispiel für ein solches Verfahren ist die Verwendung einer French Press.
Der Aufschluss von Bakterien in biotechnologischen Produktionsprozessen stellt einen erheblichen Kostenfaktor dar. Zudem treten bei den bekannten Zellaufschlussverfahren oftmals störende Nebeneffekte auf, wie beispielsweise starke Proteolyse oder das überstarke Vorhandensein von Zelltrümmern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein verbessertes Verfahren für einen Zellaufschluss bereitzustellen, insbesondere ein Verfahren, welches in biotechnologischen Produktionsprozessen vorteilhaft eingesetzt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Substanzen, die an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden zum Zellaufschluss. Die Entdeckung der Existenz eines bakteriellen Cytoskeletts und die Charakterisierung von Bestandteilen davon, insbesondere die Charakterisierung des Elongationsfaktors EF-Tu als einem strukturell bedeutsamen Protein für dieses Cytoskelett öffnen den Weg für ein neues System für den Zellaufschluss, insbesondere den Zellaufschluss von Bakterien. Damit wird erfindungsgemäß eine Alternative zu konventionellen Zellaufschlussverfahren bereitgestellt. Durch Destabilisierung des Cytoskeletts kann die Zellhülle zerstört und somit eine Lyse der Zellen bewirkt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden zur Destabilisierung des Cytoskeletts Substanzen verwendet, die an EF-Tu binden.
Das bakterielle Protein EF-Tu enthält die Domänen 1 , 2 und 3 (H. Song et al., J. Mol. Biol. 285 (1 999) 1 245-1 256). Die Sequenzen des Proteins EF- Tu und seines codierenden Gens sind für Escherichia coli und eine Reihe anderer Eu-Bakterien publiziert und in Datenbanken zugänglich. EF-Tu ist ein Protein, welches drei Domänen enthält. Von den 394 Aminosäuren, welche EF-Tu (von E.coli) umfasst, gehören zur Domäne 1 die Aminosäuren 8 bis 204, wobei die Aminosäuren 172 bis 204 eine Verbindungsstruktur zur Domäne 2 bilden. Zur Domäne 2 gehören die Aminosäuren 205 bis 298 und zur Domäne 3 gehören die Aminosäuren 299 bis 394.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass man beim bakteriellen Cytoskelett durch Hemmung des Self-Assembly von EF-Tu- Fibrillen eine Destabilisierung und in der Folge eine Lyse der Zellen erreichen kann.
EF-Tu ist ein 3-Domänen-Protein, wie in Figur 1 dargestellt. Die Protofilamente des Cytoskeletts entstehen in der lebenden Zelle dadurch, dass die Domänen 2 und 3 von EF-Tu-Proteinen (Monomer oder integriert in ein Protofilament und nur transient frei) mit den Domänen 3 und 2 benachbarter EF-Tu-Proteine wechselwirken. Durch Ausbildung spezifischer nicht-kovalenter Bindungen, wobei Domäne 2 des einen EF-Tu mit Domäne 3 des benachbarten EF-Tu wechselwirkt, während eines seif assembly Prozesses entstehen auf diese Weise Ketten, sogenannte Protofilamente, welche sich zu einem Netzwerk verbinden (vgl. Figur 2). Mit diesem Netzwerk können weitere Faktoren assoziiert sein, wie z.B. FtsZ, MreB oder/und M6I.
Stabilität und/oder Ausprägung solcher Protofilamente und Netzwerke in Bakterienzellen können erfindungsgemäß unterbunden werden, wobei als Folge der Tod der Bakterienzelle durch Lyse eintritt.
Eine besonders vorteilhafte Vorgehensweise der Erfindung ist wie folgt. Der DNA-Abschnitt des EF-Tu-Gens von Escherichia coli, welcher für die Domäne 3 codiert, wird gewonnen und mittels molekulargenetischer Techniken in E.coli-Zellen transferiert und exprimiert. Neben diesem rekombinanten Abschnitt, welcher ausschließlich die Domäne 3, nicht aber die Domänen 1 und 2 von EF-Tu enthält, verfügen die Zellen nach wie vor über das native EF-Tu-Gen und können es exprimieren. Die zusätzlich synthetisierten Domäne 3-Polypeptide konkurrieren jedoch mit den nativen EF-Tu-Proteinen um die Bindungsplätze für die Ausbildung der Protofilamente. Wird ein Domäne-3-Polypeptid anstelle eines nativen EF-Tu-Proteins als Kettenglied eingebaut, führt dies aufgrund des Fehlens der zweiten Bindestelle (die Domäne 2 ist für die Kettenbildung unabdingbar) am Domäne-3-Polypeptid zum Kettenabbruch. Das Protofilament wächst nicht weiter, das cytoskelettale Netzwerk wird geschwächt und kollabiert schließlich. Als Folge des Verlustes der Integrität des Cytoskelettes verliert die cytoplasmatische Membran der Zelle ihre Aufhängung. Die cytoplasma- tische Membran ist, wie aus Figur 4 ersichtlich, am Cytoskelett aufge- hängt. Dadurch wird die Zellwand, die in der lebenden Bakterienzelle durch die cytoplasmatische Membran positioniert und gestützt wird, zerstört (siehe Figur 5). Der Verlust von Zellwand und cytoplasmatischer Membran bedeutet eine Exposition des Zellinhalts, sodass die Zelle lysiert ist (vgl. Figuren 5 und 6). Der Zellinhalt kann somit ohne weiteren Zellaufschluss gewonnen werden.
Zellen, welche für biotechnologische Produktionsprozesse eingesetzt werden, wie etwa heterologe Expression, Produktion von Proteinen, insbesondere für biotechnologische oder medizinische Zwecke, können somit aufgeschlossen werden, indem man in sie vor ihrem Einsatz für die Produktion eine Sequenz einbringt, welche für die der Zellen-Species entsprechende Domäne des EF-Tu codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die zum Zellaufschluss verwendeten Substanzen Anteile, die im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 und/oder im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3 an EF-Tu binden. Innerhalb der Domänen 2 und 3 treten unterschiedliche Sekundärstrukturen auf. Von besonderem Interesse sind dabei die Aminosäuresequenzen von 317 bis 328 und von 343 bis 354, welche in Domäne 3 liegen und Schleifen bilden, die frei in den Raum ragen und Kandidatensequenzen für eine Wechselwirkung mit Aminosäuresequenzen sind, welche in einer entsprechend positionierten Eindellung an der Peripherie von Domäne 2 liegen, wobei diese Sequenzen von Aminosäuren 218 bis 224 reichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden intrazellulär exprimierte peptidische Substanzen eingesetzt, welche auf Oligopeptiden basieren, welche an EF-Tu, vorzugsweise im Bereich der Passungsstellen der Domänen 2 oder/und 3 binden. Diese Oligopeptide können Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen der Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von vorzugsweise 4 bis vorzugsweise 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 5 bis 15 Aminosäuren und insbesondere bevorzugt mit einer Länge von 6 bis 12 Aminosäuren enthalten. ln einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die Substanzen Teilabschnitte oder den Gesamtbereich der Aminosäuresequenzen aus der Domäne 3 mit einer Länge von mindestens 4 und insbesondere mindestens 5 Aminosäuren und der gleichzeitig keinem Abschnitt der Aminosäuresequenzen aus der Domäne 2 entspricht.
Neben intrazellulär exprimierten peptidischen Verbindungen können auch intrazellulär exprimierte Peptidomimetika vorteilhafterweise eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Aufschluss von Zellen, bei dem man in den Zellen Bestandteile des Cytoskeletts destabilisiert. Cytoskelettale Elemente, die verändert werden können, um eine Schwächung des Cytoskeletts zu bewirken, umfassen beispielsweise FtsZ, MReB, Mbl und kontraktile Proteine und insbesondere EF-Tu.
Besonders bevorzugt werden bei diesem Verfahren Substanzen eingesetzt, welche an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden und hierin zuvor erläutert sind.
Die Erfindung kann besonders vorteilhaft angewendet werden in einem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, beispielsweise eines Proteins, indem man Zellen verwendet, in welchen dieses Protein, beispielsweise durch einen biotechnologischen Produktionsprozess exprimiert wird und indem man in diese Zellen zuvor eine Sequenz einbringt, die für eine Substanz codiert, welche Bestandteile des Cytoskeletts der Zellen destabilisiert. Die bei einer herkömmlichen biotechnologischen Prozessführung zur Gewinnung der gebildeten Verbindungen in gentechnisch manipulierten Bakterien üblicherweise erforderliche Lyse kann hier mit dem hierin beschriebenen Zellaufschluss durchgeführt werden. Vorteilhaft ist, dass der Zellaufschluss zu einem genau definierten Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Ein Indikator hierfür kann das Erreichen der gewünschten Zelldichte (quorum sensing) sein. Eine Induktion der Lyse durch quorum sensing erfolgt dadurch, dass die Zellkultur in ihrem Wuchsverhalten kontrolliert wird und bei Feststellung, dass der gewünschte Zustand der Zellkultur erreicht ist, das eingebrachte Gen exprimiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in die Zellen ein Konstrukt eingebracht, welches neben dem Gen für die destabilisierende Substanz weitere codierende Sequenzen enthält, die es erlauben, den Beginn der Synthese der Substanz, beispielsweise des Domäne-3-Polypeptids von außen zu induzieren. Auf diese Weise ist es möglich, den Zeitpunkt der Zell-Lyse in der Zellkultur von außen exakt zu steuern.
Die Induktion durch einen quorum-gekoppelten oder/und Zellkultur-autarken Prozess ist eine weitere geeignete Form zur Einleitung der Zell-Lyse.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Konstrukt, umfassend eine Sequenz, welche für eine Bestandteile des Cytoskeletts von Zellen destabilisierende Substanz codiert. Dieses Konstrukt umfasst bevorzugt weiterhin mindestens einen Genabschnitt, welcher die Induktion der Synthese der das Cytoskelett destabilisierenden Substanz erlaubt.
Vorteilhafte Auslegungen des Konstrukts sind in Figur 7 dargestellt. Sobald die Induktion erfolgt ist, wird innerhalb einer Zellgeneration durch das Zusammenspiel von EF-Tu, Domäne-3-Polypeptid, cytoplasmatischer Membran und Zellwand die Lyse der Zellen herbeigeführt.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.
In den Figuren zeigt: Fig. 1 a) EF-Tu (GDP-Form aus E.coli; Ergebnis einer Röntgenstrukturanalyse; Abbildung aus der Literatur entnommen und modifiziert). Die 3 Domänen des Proteinmoleküls sind markiert. A' und b bezeichnen Verbindungssequenzen b) Wie a), jedoch andere Form der Darstellung. Die Zahlen markieren die Positionen der Aminosäure-Reste; N-Terminus und C-Terminus sind angegeben.
Fig. 2 a) EF-Tu-Molekül b) und c) Prinzip der "Kettenbildung" (Self-Assembly von EF-Tu-
Monomeren zu Protofilamenten). Die Bindung erfolgt durch Kontakt zwischen den Domänen 2 und 3 benachbarter Moleküle d) Elektronenmikroskopische Abbildung eines solchen Protofilaments, isoliert aus dem Ba kterium Thermoanaerobacterium thermosa ccharolyticum e) Netzwerk, bestehend aus Protofilamenten. Elektronenmikroskopische
Aufnahme eines aus dem Bakterium 77?. Thermosaccharolyticum isolierten Netzwerks. Die schwarzen Punkte sind für
Markierungszwecke eingesetzte Gold-Marker.
Fig.3
Es sollen EF-Tu-GFP-His-Fusionsklone generiert werden. Idealer Fusionspunkt bei EF-Tu ist der C-Terminus, der zwischen Domäne 2 und 3 hervorragt (Song et al., 1 999). Der gleiche Fusionspunkt kann auch für ein Domäne-3-Fusionskonstrukt gewählt werden. Das Domäne-3- Fusionskonstrukt kann für in vivo-Kompetitionsexperimente eingesetzt werden. Dabei scheint es sinnvoll, für chemische Labeling-Alternativen ein C-terminales Cystein (das einzige in Domäne 3) einzuführen. Ausgangspunkt ist genomische DNA eines E.coli-K-12-Stammes. Im
Hinblick auf mögliche, spätere Experimente in vitro erscheint es sinnvoll, alle Konstrukte auch mit His-Tag zu versehen.
(a1 ) Einführung eines His-Tag in die BsrGI/EcoRI-Schnittstellen des Vektors pEGFP
(a2) Einführung des EF-Tu-Gens in die Hindlll/Ncol-Schnittstellen des Vectors pEGFP(His)
(a3) Einführung des Domäne-3-Genabschnitts in die Hindlll/Ncol- Schnittstellen des Vektors pEGFP(His) (b1 ) Basensequenz des Konstruktes pEGFP-EF-Tu-His am Beispiel des Klons HE1 (SEQ ID NO: 1 )
(b2) Basensequenz des Konstruktes pEGFP-Domäne3-His am Beispiel des Klons HD1 (SEQ ID NO:2)
Fig. 4
"Aufhängung" der cytoplasmatischen Membran (CM) bei dem wandlosen
Bakterium Mycoplasma pneumoniae. Elektronenmikroskopische
Aufnahmen. a) Unbehandeltes Bakterium. Der Pfeil deutet auf die CM b), c), d) Nach Ablösen der CM (durch ein Detergenz) wird erkennbar, dass die CM an Stützen ("stalks") aufgehängt war, welche ihrerseits dem peripheren Teil des Cytoskeletts aufsitzen. Wird dieser Teil des Cytoskeletts geschwächt oder zerstört, verlieren die "stalks" ihre feste Verankerung und die CM kollabiert.
Fig. 5
Versuche mit E.coli . Elektronenmikroskopische Aufnahmen, Negativkontrastierung a) Intakte Bakterienzellen, enthaltend ihr Chromosom und zusätzlich einen Leervektor (Plasmid), welcher in weiterführenden Versuchen als Vektor zum Einbringen des Domäne-3-Genabschnitts verwendet wurde. Diese Zellen stellen also Kontrollen dar. b) Zellen einer jungen Kultur. In diese Zellen war vor Beginn der Kultivierung zusätzlich zum eigenen nativen Chromosom (welches ja das Gen enthält, welches intaktes EF-Tu codiert) ein Plasmid eingebracht worden, welches in exprimierbarer Form den Genabschnitt enthält, welcher für Domäne-3 von EF-Tu codiert. Der
Effekt der Expression dieses "truncated" Gens ist deutlich zu sehen: Neben einigen intakt erscheinenden Zellen (sie sind bei genauerer Analyse als bereits in ihrer Zellhülle geschwächt erkennbar), wird das Bild bestimmt durch Zellreste, welche noch die ursprüngliche Zellform erkennen lassen, jedoch weder Wand noch CM besitzen.
Wand und CM haben durch die Destabilisierung des Cytoskeletts ihre Aufhängung verloren. Der Zellinhalt ist exponiert. Ein solcher Zustand wird gemeinhin als "aufgeschlossen" bezeichnet. c) Endstadium der Auflösung der Zellen (alte Kultur). Eine ehemalige Zellform ist nicht mehr erkennbar; die Zellreste bilden unorganisierte
Aggregationen
Fig. 6
Versuche mit E.coli. Elektronenmikroskopische Aufnahmen a) Endstadium der Auflösung der Zellen einer Kultur, in denen Domäne
3 von EF:Tu zusätzlich zum zelleigenen EF-Tu exprimiert wurde;
Ultradünnschnitt (vgl. Abb. 5 b) und c)) b) Kontrolle: Zelle mit Leervektor; die Zelle ist intakt (vgl. Abb. 5 a)) c) Kontrolle: In der Zelle wurde zusätzlich zum zelleigenen EF-Tu noch per genetic engineering eingebrachtes EF-Tu exprimiert; die Zelle ist intakt
Fig. 7
Chromosomale Integration eines möglichen Konstrukts der Domäne 3 von Ef-Tu mit regulierbarem Promotor und Resistenzmarker unter Zuhilfenahme der Attachment sites des Phagen Lambda. Promotor und Resistenz können je nach Bedarf auch in anderen Kombinationen eingesetzt werden. Att attachment sites
Spec R Spektinomycin-Resistenz
Lad Repressor puaco-ι modifizierter Lac-Promotor (nach LUTZ und BUJARD, 1 997)
Als Alternativen zum angegebenen Promotor können beispielsweise auch die Promotoren ara, T7 oder bdA (quorum sensing) eingesetzt werden.
Beispiele Beispiel 1
Ablauf von der Klonierung bis zur Expression und Aufreinigung der Konstrukte EF-Tu-His bzw. Domäne 3-His (schematisiert) :
I . Präparation der genomischen DNA von E.coli XL1 -Blue (K12-Derivat) 2. PCR mit den entsprechenden Primern zur Hochverstärkung der
Volllängenprodukte
3. Identifizierung und Aufreinigung der PCR-Volllängenprodukte
4. Restriktionsverdau der PCR-Produkte und des Zielvektors
5. Ligation der PCR-Produkte in den Zielvektor 6. Elektroporation der ligierten Plasmid-DNA in den Stamm XL1 -Blue
7. Identifizierung der Klone mit dem richtigen Insert durch Restriktionsverdau und Sequenzanalyse
8. Sicherung der Klone als Kryokulturen
9. Ausplattierung der Klone auf Selektionsagar (hier: LB/Ampicillin) und Anzucht über Nacht bei 37 °C
10. Animpfen einer 50 ml LB/Ampicillin-Flüssigkultur, Inkubation über Nacht bei 37 °C
I I . Animpfen einer 1 I LB/Ampicillin-Flüssigkultur, Inkubation bei 37 °C bis zu einer OD600 von ca. 0,5 bis 0,7, Induktion mit IPTG für mindestens 4 h
1 2. Zellernte
1 3. Homogenisierung durch Druck/Ultraschall 14. Abzentrifugieren der Zelltrümmer
15. Aufreinigung des so geklärten Zelllysats über IMAC-Säulen
IPTG Isopropylthiogalaktosid IMAC Ion Metal Affinity Cromatographie

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von Substanzen, die an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden, zum Zellaufschluss.
2. Verwendung nach Anspruch 1 zum Zellaufschluss von Bakterienzellen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, d a d u rch ge ken nzeic h n et, dass die Substanzen im Bereich der Domäne 2 (Aminosäuren 205 bis
298) oder/und der Domäne 3 (Aminosäuren 299 bis 349) an EF-Tu binden.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass die Substanzen im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 oder/und im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3 an EF-Tu binden.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass die Substanzen Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen aus den Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von mindestens vier
Aminosäuren enthalten.
6. Verwendung nach Anspruch 5, d a d u rc h g e ke n n zei c h n et , dass die Teilabschnitte eine Länge von 5 bis 15 Aminosäuren, insbesondere von 6 bis 12 Aminosäuren aufweisen.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d ad u rch g e ken nzeich n et, dass die Substanzen die Domäne 3 von EF-Tu und keine weitere Domäne von EF-Tu enthalten.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rch g e ken nzeich n et, dass die Substanzen ausgewählt werden aus linearen oder cyclischen peptidischen Verbindungen oder Peptidomimetika.
9. Verfahren zum Aufschluss von Zellen, d a d u rch g e ken nzeich n et, dass man in den Zellen Bestandteile des Cytoskeletts destabilisiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, d ad u rc h g e ken nzeic h n et, dass man zur Destabilisierung Substanzen einsetzt, welche an
Bestandteile des Cytoskeletts binden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, d ad u rch g e ken nzeichnet, dass man Substanzen, die an EF-Tu binden einsetzt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass man Substanzen einsetzt, die im Bereich der Domäne 2 (Aminosäuren 205 bis 298) oder/und der Domäne 3 (Aminosäuren 299 bis 394) an EF-Tu binden, insbesondere im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 oder/und im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, d ad urch g eken n zeich n et, dass man Substanzen einsetzt, welche Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen aus den Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von mindestens 4 Aminosäuren, insbesondere von mindestens 5 Aminosäuren enthalten.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, d a d urch g ekennzeich net, dass Nukleinsäuren in die Zellen eingebracht werden, die für die das Cytoskelett destabilisierenden Substanzen codieren.
15. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, dad u rch g e ken nzei ch n et, dass man Zellen verwendet, in welche eine Sequenz eingebracht worden ist, codierend für eine Verbindung, welche Bestandteile des
Cytoskeletts der Zellen destabilisiert, die Zellen kultiviert und so die gewünschte intrazelluläre Verbindung gewinnt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass man die gewünschte Verbindung durch Kultivierung der Zellen intrazellulär produziert und in einem zweiten Schritt eine Lyse der Zellen durch Induktion der Expression der das Cytoskelett destabilisierenden Verbindung bewirkt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 16, d ad u rch g e kennzei ch net, dass die gewünschte Verbindung durch heterologe Expression gebildet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16, d ad u rch g e ken nzeich net, dass die gewünschte Verbindung durch homologe Expression gebildet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dad u rch g e ken n zeich n et, dass die Induktion durch quorum sensing erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, d ad u rc h ge ken nzeich n et, dass die für eine das Cytoskelett der Zellen destabilisierende
Verbindung codierende Sequenz in einem Konstrukt in die Zellen eingebracht wird, wobei das Konstrukt weitere Regionen enthält, die eine Induktion der Synthese der Verbindung erlauben.
21. Konstrukt, umfassend eine Sequenz, welche für eine Bestandteile des Cytoskeletts von Zellen destabilisierende Verbindung codiert.
22. Konstrukt nach Anspruch 21, weiterhin umfassend einen Genabschnitt, welcher die Induktion der Synthese der das Cytoskelett destabilisierenden Verbindung erlaubt.
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