WO2003102194A1

WO2003102194A1 - Chondroitine synthetase et codage de l'adn pour l'enzyme

Info

Publication number: WO2003102194A1
Application number: PCT/JP2003/006881
Authority: WO
Inventors: Hisashi Narimatsu; Koji Kimata; Toshikazu Yada; Takashi Sato; Masanori Goto
Original assignee: Seikagaku Corporation; National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2003-12-11
Also published as: EP1514940A4; US20060052335A1; EP1514940A1; AU2003241687A1; EP1514940B1; JP4333880B2; AU2003241687A8; US7273729B2; JPWO2003102194A1; DE60324797D1; ATE414774T1

Description

明細書コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードする DNA 技術分野

本発明はコンドロイチン/コンドロイチン硫酸の糖鎖骨格（基本骨格：コンドロイチン骨格とも記載する）を合成する酵素及びそれをコードする DNAに関するものである。より詳細にはコンドロイチン骨格の非還元末端に N-ァセチル- D -ガラクトサミン残基が存在する際には当該 N-ァセチル- D -ダルコサミン残基に D-ダルク口ン酸残基を転移し、非還元末端に D-ダルク口ン酸残基が存在する場合には当該 D-グルクロン酸残基に N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有する酵素及びそれをコードする DNAに関する。背景技術

以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべて D体を示すものとする。

コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンは D -ダルク口ン酸残基（以下単に「グルクロン酸」又は「GlcUA」とも記載する）と N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基（以下単に「N-ァセチルガラクトサミン」又は「GalNAc」とも記載する）の二糖の繰り返し構造（すなわち、 _[GlcUA i3 (1, 3) - GalNAc ]3 (l, 4) -]_n： n は 2以上の整数を示す）を基本骨格とするダリコサミノダリカンの一種である。従来ダリコサミノダリカン、特にコンドロイチンやコンドロイチン硫酸は動物の軟骨、臓器等から抽出 '精製されていた。しかし、近年は原料の不足からコンドロイチンやコンドロイチン硫酸に共通するコンドロイチン骨格を人工的に合成する手法が模索されている。特に、ヒト由来の酵素を用いる方法であれば、人工的に合成したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混入していても、抗原抗体反応などの生体防御機構が強く作用することもないため好ましい。現時点においてこのようなコンドロイチン骨格を合成するための酵素、その中でも特にヒト由来であって GlcUA転移活性を有しており、且つ GalNAc転移活性も有している酵素は 1種類しか得られていない（J. Biol. Chem. , 276, 38721-38726 (2001) ) 。コンドロイチン骨格の合成を行うためには酵素を数種類含むカクテル形式で行うことが好ましいと考えられている。各々の酵素の至適反応条件が異なることから反応系全体での反応条件を緩和することが可能となるからである。しかし、現時点において、 GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性の両者を有するヒト由来の酵素としては上述の酵素が知られているのみであり、条件の厳密なコントロールが困難であることからコンドロイチン骨格の合成の検討が不十分な状況だった。

そこで、コンドロイチン骨格を合成するための酵素であって、 GlcUA転移活性を有しており、且つ GalNAc転移活性も有しているヒト由来の新たな酵素が期待されていた。発明の開示

本発明は、以下の（1 ) 〜（1 4 ) に関する。

( 1 ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸番号 97 〜755からなるアミノ酸配列からなるポリべプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリぺプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。

( 2 ) N -ァセチル -D-ガラクトサミン残基を N-ァセチル -D-ガラクトサミン受容体に対して転移する酵素活性又は D -ダルク口ン酸残基を D -ダルク口ン酸受容体に対して転移する酵素活性を有すると共に、配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列のうち 1〜131個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び/又は転移を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含むことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。

( 3 ) 非還元末端に D-グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該 D-グルク口ン酸残基に対して N-ァセチル- D-ガラクトサミン供与体から N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、非還元末端に N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基を有するコンドロイチンの当該 N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基に対して D -ダルク口ン酸供与体から D -ダルク口ン酸残基を転移する酵素活性を有することを特徴とする（2 ) 記載のコンドロイチン合成酵

( 4 ) ( 1 ) 〜（3 ) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素をコードする核酸。 (5) (4) 記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。

( 6 ) 発現べクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とする

(5) 記載の発現ベクター。

(7) (5) 又は（6) 記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。

(8) (7) 記載の形質転換体を生育させ、生育物にコンドロイチン合成酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を単離することを特徴とするコンドロィチン合成酵素の製造方法。

(9) (1) 〜（3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（1) で示される構造を有する N-ァセチル -D-ガラクトサミン受容体及び N-ァセチル- D-ガラクトサミン供与体に対して作用させて、 N-ァセチル- D-ガラクトサミン受容体に N-ァセチル -D -ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。

(GlcUA-GalNAc)_n- (GlcUA)_m (1)

GalNAc- (GlcUA-GalNAc)_n- (GlcUA)_m (2) 式（1)及び（2)中、「GalNAc」は N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D_ダルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

(10) (1) 〜（3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式 (3)で示される構造を有する D-ダルク口ン酸受容体及び D-ダルク口ン酸供与体に対して作用させて、 D-ダルク口ン酸受容体に D-ダルク口ン酸残基を転移することを特徴とする、下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。

(GalNAc-GlcUA)_n- (GalNAc) _ra (3)

GlcUA- (GalNAc -GlcUA)_n- (GalNAc) _m (4) 式（3)及び（4)中、「GalNAc」は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。 (1 1) 下記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル -D-ガラクトサミン受容体の非還元末端に存在する D-グルクロン酸残基に対して、 N -ァセチル -D-ガラタトサミン残基を転移して下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、（1) 〜（3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。

(GlcUA-GalNAc)_n- (GlcUA)_m (1)

GalNAc- (GlcUA-GalNAc)_n- (GlcUA)_m (2) 式（1)及び（2)中、「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D -グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

(1 2) 下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体の非還元末端に存在する N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基に对して、 D-グルクロン酸残基を転移して下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、

(1) 〜（3) いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。

(GalNAc-GlcUA)_n- (GalNAc) _m (3)

GlcUA- (GalNAc -GlcUA)_n- (GalNAc) _m (4) 式（3)及び（4)中、「GalNAc」は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

(13) (1) 〜（3) いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性調節剤。

(14) (13) の活性調節剤を有効成分として含む（1) 〜（3) のいずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明酵素の GalNAc転移活性による奇数糖の合成を示すク口マトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トであり、黒丸はコンドロイチンに对する GalNAc 転移活性を示すチャートである。白三角はコンドロイチン硫酸 10糖に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トであり、黒三角はコンドロイチン 10糖に対する GalNAc転移活性を示すチヤ一トである。

第 2図は、本発明酵素の GalNAc転移活性により調製された 11糖とそのコンド口イチナーゼ ACII消化物のクロマトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼ ACII未消化の 11糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼ ACII消化後の消化産物のチャートを示す。

第 3図は、本発明酵素の GlcUA転移活性による偶数糖の合成を示すクロマトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対する GlcUA転移活性を示すチヤ一トであり、黒丸はコンドロイチンに対する GlcUA転移活性を示すチヤ一トである。白三角はコンドロイチン硫酸 11糖に対する GlcUA転移活性を示すチヤ一トであり、黒三角はコンドロイチン 11糖に対する GlcUA転移活性を示すチャートである。

第 4図は、本発明酵素の GlcUA転移活性により調製された 12糖とそのコンド口イチナーゼ ACII消化物のクロマトグラフィ一のチヤ一トを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼ ACII未消化の 12糖のチャートを示し、黒丸はコンドロィチナーゼ ACII消化後の消化産物のチヤ一トを示す。

第 5図は、本発明酵素の GlcUA転移活性の至適 pHを示す図である。白丸は酢酸緩衝液を示し、黒丸は MES緩衝液を示し、白三角はイミダゾール緩衝液を示し、黒三角は Tris緩衝液を示す。

第 6図は、本発明酵素の GalNAc転移活性の至適 pHを示す図である。白丸は酢酸緩衝液を示し、黒丸は MES緩衝液を示し、白三角はイミダゾール緩衝液を示し、黒三角は Tris緩衝液を示す。

第 7図は、本発明酵素の活性に対する二価陽イオンの影響を示す図である。白いバーは GlcUA転移活性を示し、黒いバーは GalNAc転移活性を示す。

第 8図は、本発明酵素の活性に対するマンガンイオンの濃度による影響を示す図である。白丸は本発明酵素の GlcUA転移活性への影響を示し、黒丸は本発明酵素の GalNAc転移活性への影響を示す。

第 9図は、健常人各組織における本発明酵素の発現量の定量値を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、公知のコンドロィチン合成酵素と類似の酵素活性を有する別の酵素が存在することを発見した。そして当該酵素の DNAを取得して酵素を調製することにより本発明を完成させた。

以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。 ( 1 ) 本発明酵素

本発明酵素は配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列からなるポリべプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリべプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素である。

本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端に存在する糖残基に対して、 GalNAc残基を転移する活性及び GlcUA残基を転移する活性（GalNAc残基を転移する活性を「GalNAc転移活性」、 GlcUA残基を転移する活性を「GlcUA転移活性」と記載する）を有する。すなわち、本発明酵素は、コンドロイチン骨格の非還元末端に GlcUA残基が存在する場合には当該 GlcUA残基に対して GalNAc転移活性を示し、非還元末端に GalNAc残基が存在する場合には当該 GalNAc残基に対して GlcUA転移活性を示す。この様な酵素が最もコンドロイチン骨格の合成において利用価値が高いからである。

したがって、本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端に GlcUA残基が存在する GalNAc受容体と、非還元末端に GalNAc残基が存在する GlcUA受容体との両者を糖残基受容体とすることが好ましい。

本発明酵素の GalNAc受容体は例えば下記式（1)で示す構造を含む。

(GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA) _m (1) 式（1)中、「GlcUA」は D_ダルクロン酸残基を示し、「GalNAcJ は N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し、「―」はグリコシド結合を示す。 GalNAc受容体において、上記 nは 2以上であることが好ましく、更に 4以上であることが好ましい。このような範囲であると、より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。

このような式（1)の構造を有する GalNAc受容体としては、例えばコンドロイチン若しくはコンドロイチン硫酸又はこれらを切断して得られる低分子化コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸が例示されるが、これに限定はされない。式（1)で示される構造を有する GalNAc受容体に対して本発明酵素は GalNAc供与体基質から GalNAc残基を転移する。本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成に有用であるため、 GalNAc残基は ]3 1, 4ダリコシド結合で非還元末端の GlcUA残基に転移されることが好ましい。

GalNAc供与体とは、 GalNAc残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸一 N-ァセチルガラクトサミン（ADP- GalNAc) 、ゥリジン二リン酸一 N-ァセチルガラタトサミン（UDP - GalNAc) 、グアノシン二リン酸一N-ァセチルガラクトサミン（GDP- GalNAc) 、シチジン二リン酸一 N-ァセチルガラクトサミン（CDP-GalNAc) 等が例示され、 UDP-GalNAcが最も好ましい。生体内でのコンドロイチン骨格の合成は UDP- GalNAcが GalNAc供与体基質として主に働いているからである。しかし、本発明酵素による GalNAc転移活性に関して GalNAc残基を供給しうる GalNAc供与体であれば特に限定はされない。

上記式（1)で示される構造を有する GalNAc受容体に対して GalNAc残基を本発明酵素により転移すると、下記式 (2)記載の構造を有する糖鎖が得られる。

GalNAc- (GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA) _m (2) 式（2)中、「GlcUA」、「GalNAc」、 n、 m、「一」は式（1)と同義である。

なお、 GalNAc受容体は上記（1)で表される構造を有しており、更にその還元末端に更に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質も GalNAc受容体とすることができ、そのような GalNAc受容体に对して GalNAc残基を転移した場合には、上記（2)で表される構造を有しており、力つ更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などを有する化合物が得られる。このような本発明酵素の GalNAc転移活性は例えば本明細書実施例 2 ( 1 ) 記載の方法の様に放射性同位元素で GalNAcを標識しておく手法を用いることで容易に検出 '測定することができる。

本発明酵素の GlcUA受容体は例えば下記式 (3)で示す構造を含む。

(GalNAc -GlcUA) _n- (GalNAc) _B (3) 式（3)中、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、「GalNAc」は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し、

「―」はグリコシド結合を示す。 GlcUA受容体において、上記 nは 2以上であることが好ましく、更に 4以上であることが好ましい。このような範囲であると、より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。

式 (3)で示される構造を有する GlcUA受容体に対して本発明酵素は GlcUA供与体から GlcUAを転移する。本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成に有用であるため、 GlcUA残基は β 1, 3グリコシド結合で GalNAc残基に転移するものであることが好ましい。

GlcUA供与体とは、 GlcUA残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシンニリン酸一 D-ダルク口ン酸（ADP- GlcUA) 、ゥリジン二リン酸一D -グルクロン酸（UDP-GlcUA) 、グアノシンニリン酸一D-ダルク口ン酸（GDP- GlcUA) 、シチジンニリン酸 _ D_ダルク口ン酸 (CDP-GlcUA) 等が例示され、 UDP_GlcUAが最も好ましい。生体内でのコンドロィチン骨格の合成は UDP-GlcUAが GlcUA供与体として主に働いているからである。しかし、本発明酵素による GlcUA転移活性に関して GlcUA残基を供給しうる GlcUA供与体であれば特に限定はされない。

上記式 (3)で示される構造を有する GlcUA受容体に対して GlcUA残基を本発明酵素により転移すると、下記式 (4)記載の構造を有する糖鎖が得られる。

GlcUA- (GalNAc— GlcUA)„— (GalNAc) _m (4) 式（4)中、「GlcUA」、「GalNAc」、 n、 m、「一」は式（3)と同義である。なお、 GlcUA受容体は上記（3)で表される構造を有しており、更にその還元末端に更に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質も GlcUA受容体とすることができ、そのような GlcUA受容体に対して GlcUA残基を転移した場合には、上記 (4)で表される構造を有しており、かつ更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などを有する化合物が得られる。

このような本発明酵素の GlcUA転移活性は例えば本明細書実施例 2 ( 2 ) 記載の方法の様に放射性同位元素で GlcUAを標識しておく手法を用いることで容易に測定することができる。

本発明酵素は配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。この様な範囲のアミノ酸配列を含むポリぺプチドは上述した GalNAc転移活性及ぴ GlcUA転移活性の双方を有するからである（本明細書実施例 2参照）。

一般に酵素は、それを構成するタンパク質に若干数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加及び Z又は転移（これらを総括して以下「アミノ酸変異」と記載する）を有していてもその活性が維持され、このようなアミノ酸変異を有する酵素はバリアントと呼ばれている。一般的に全アミノ酸数の 20%程度のアミノ酸変異であれば、活性中心に係る変異でない限りにおいて酵素活性は十分に維持される。従って、上述の GalNAc転移活性及び GlcUA転移活性を有する限りにおいて、本発明酵素も上記配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列に、若干数のアミノ酸変異を有していてもよい（酵素活性の有無は上述の様に本明細書実施例 2に従って検定することが可能である）。なお、上記した「若干数」とは酵素を構成する全アミノ酸数の 20%以下（配列番号 2のァミノ酸番号 97〜755からなるポリペプチドにおいては 131個以下：すなわち相同性 80%以上）、好ましくは 15%以下（配列番号 2のァミノ酸番号 97〜755からなるポリペプチドにおいては 98個以下：すなわち相同性 85%以上）、最も好ましくは 10%以下（配列番号 2のアミノ酸番号 97〜755からなるポリべプチドにおいては 65個以下：すなわち相同性 90%以上）である。このようなァミノ酸配列の相同性は、 FASTAのような周知のコンピュータソフトウエアを用いて容易に算出することができる。 FASTAのようなソフトウエアはインターネットによっても利用に供されている。なお、配列番号 2記載のアミノ酸配列の全配列からなるポリべプチドによつて構成された酵素も、ァミノ酸番号 97〜755からなるポリぺプチドに若干数の変異が起こって得られるポリべプチドによって構成されていると言うことができ、本発明酵素として好ましいポリぺプチドの範囲内であると言える。

また、更にほ乳類由来のタンパク質には糖鎖が結合しているものも多く、本発明酵素は、ポリペプチドのみからなる酵素も、ポリペプチドに糖鎖が結合した酵素もいずれも包含する。

また本発明酵素は、下記の性質を有することが好ましい。

活性の増強： 10瞧 ol/lの二価金属陽イオン（好ましくはマンガンイオン、コバ^^トイオン）を反応系に存在させることにより活性が増強される。具体的には上記金属陽イオンのハロゲン化物（塩化物など）を反応液中に存在させればよい。

活性の阻害： 10隱 ol 濃度のエチレンジァミン四酢酸を反応系に存在させることにより実質的に酵素活性を失う。

至適反応 pH ： GlcUA転移酵素活性は 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES) 緩衝液中で pH5. 7〜6. 7 (好ましくは _PH6. 0〜6. 5) 、 GalNAc転移酵素活性は MES緩衝液中で pH5. 7〜6. 7 (好ましくは pH6. 0〜6. 4)

また、本発明酵素の活性測定系を利用することで、かかる酵素の活性を促進したり阻害したりする働きを有する物質をスクリ一二ングして得ることができる。かかる物質は、本発明酵素の活性調節剤の有効成分として利用することが可能である。更にこの様な活性調節剤は、本発明酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤として利用することができる。

( 2 ) 本発明核酸

本発明核酸は本発明酵素をコードすることを特徴とする。

すなわち、本発明核酸はそれ又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体で本発明酵素を産生させることができる核酸であれば特に限定はされない。また、本発明核酸は DNAであっても RNA であってもかまわないが、安定性の面で極めて優れるため DNAであることが好ましい。本発明核酸の好ましい態様の一つとしては配列番号 1記載の塩基配列のうち、塩基番号 289〜2328からなる DNA、及び配列番号 1記載の全塩基配列からなる DNAが例示される。

ところでタンパク質の生合成においては、遺伝暗号（トリプレット）とアミノ酸は必ずしも 1対 1とはなっておらず、同一のアミノ酸が異なるトリプレツトに対応することがある（遺伝暗号の縮重）。従って上述のような遺伝暗号の縮重によって同一アミノ酸配列に対応する、例示した特定の塩基配列以外の他のトリプレツトを含む核酸も、結果的に同一の本発明酵素を得るために利用可能であることは当業者であれば容易に理解されるところであり、本発明核酸に含まれることは言うまでもない。

また、配列番号 1記載の塩基配列のうち、塩基番号 289〜2328からなる DNA又はそれに相補的な塩基配列からなる DNAにストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする核酸は、例えば本発明核酸の生体内での発現状況などを検査するためのプローブとして使用することができ、試薬として極めて有用である。このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となるため、 500bp〜10kbpが例示され、より好ましくは 600bp〜9kbp、最も好ましくは 700bp〜8kbpが例示される。

なお、ここでストリンジェントな条件下とは、一般にハイブリダイズを使用する手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーシヨン、サザンブロットハイブリダィゼーシヨン）等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは 37. 5%ホルムアミド、 5 X SSPE (塩化ナトリウム/リン酸ナトリウム EDTA (エチレンジァミン四酢酸）緩衝液）、 5 Xデンハルト溶液（Denhardt' s solution) , 0. 5% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での 42°Cで条件が例示される。

( 3 ) 本発明発現ベクター

本発明発現ベクターは本発明核酸を含む発現ベクターである。

本発明発現ベクターは上記本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、ェンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されている。従って本発明発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することで形質転換体が得られる。本発明発現ベクターの基本ベクター（本発明遺伝子を導入する前のベクター）は、発現ベクターを導入する宿主細胞との関係において適宜選択される。例えば宿主細胞として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞など）を使用する場合には、真核細胞用のベクターを基本べクタ一として選択し、原核細胞（大腸菌、枯草菌など）を宿主細胞として選択する場合には、原核細胞用のベクターを基本ベクターとして選択する。ところで本発明酵素はヒト由来の酵素であるため、本発明においては真核細胞を宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した本発明酵素が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、本発明発現ベクターの基本べクタ一は真核細胞、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。

なお、近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離 ·精製する手法が確立されている。本発明発現ベクターはそのような本発明酵素の単離 ·精製 ·検出が容易となるように構築されていることが好ましい。特に本発明酵素を標識べプチドとの融合タンパク質として発現するように構築した本発明ベクターを用いて遺伝子工学的に本発明酵素を調製すると単離 ·精製が比較的容易となるため好ましい。

上記識別べプチドの例としては、目的タンパク質を遺伝子組み換えによって調製する際に、該ぺプチドと目的タンパク質とが結合した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体の生育物から目的タンパク質の分泌 ·分離 ·精製又は検出を容易にすることを可能とするぺプチドである。このような識別べプチドとしては、例えばシグナルぺプチド（多くのタンパク質の N末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している 15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えば 0mpA、 OmpT, Dsb 等）、プロテインキナーゼ、プロテイン A (黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約 42， 000のタンパク質）、ダルタチオン S転移酵素、 Hisタグ（ヒスチジン残基を 6〜10個並べて配した配列）、 mycタグ（cMycタンパク質由来の 13ァミノ酸配列）、 FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、 T7 タグ（genelOタンパク質の最初の 11アミノ酸残基からなる）、 Sタグ（膝臓 RNaseA由来の 15アミノ酸残基からなる）、 HSVタグ、 pelB (大腸菌外膜タンパク質 pelBの 22アミノ酸配列）、 HAタグ（へマダルチュン由来の 10アミノ酸残基からなる）、 Trxタグ（チォレドキシン配列）、 CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、 CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、 CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、 j3 - lac/blu ( ]3ラクタマーゼ）、 ]3 - gal ( j3ガラクトシダ一ゼ）、 luc (ルシフェラーゼ）、 HP- Thio (His- patchチォレドキシン）、 HSP (熱ショックペプチド）、 ίη γ (ラミニン γペプチド）、 Fn (フイブロネクチン部分べプチド）、 GFP (緑色蛍光べプチド）、 YFP (黄色蛍光ぺプチド）、 CFP (シァン蛍光ペプチド）、 BFP (青色蛍光ペプチド）、 DsRed、 DsRed2 (赤色蛍光ぺプチド）、 MBP (マルトース結合ペプチド）、 LacZ (ラクトースオペレーター）、 IgG (免疫グロブリン G) 、アビジン、プロテイン G等のペプチドが挙げられ、何れの識別べプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼ、プロテイン A、ダルタチオン S転移酵素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGペプチド、 T7タグ、 Sタグ、 HSVタグ、 pelB又は HA タグが、遺伝子工学的手法による本発明物質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特に FLAGぺプチドとの融合タンパク質として本発明酵素を得るのが、取扱面が極めて優れるため好ましい。

ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述の FLAGぺプチドとの融合タンパク質として本発明酵素を得ることができる基本ベクターとしては例えば pFLAG- CMV-1 (シグマ社）等が例示されるが、当業者であれば本発明酵素の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本べクタ一を選択することが可能である。

( 4 ) 本発明核酸、本発明発現ベクター、及び形質転換体の調製方法

本発明によって本発明核酸の塩基配列が開示されたため、当業者であれば目的とする本発明核酸や調製したい核酸の領域の両端の塩基配列を基に適宜ブラィマーを作成し、それを用いて PCR法などによって目的の領域を増幅して調製することが可能である。本発明核酸の好ましい態様である配列番号 1の塩基番号 289〜2328からなる DNAの調製は以下のように行うことができる。

CSGlcA - Tのアミノ酸配列（GenBank accession No. AB037823がコードするァミノ酸配列）をクエリーとして BLAST検索を行ない本発明核酸の部分配列を得ることができる。そして例えばそれによつて得られる EST (GenBank accession No. MN_018590等）を基にゲノムデータベースからゲノム配列の検索を行うことができる。ゲノム配列の検索は例えば GenScan (米国スタンフォード大学）などを用いて行うことができる。この方法によつて配列番号 1記載の全塩基配列を得ることができる。このようにして得られた塩基配列からプライマーを調製して塩基番号 289〜2328からなる DNAを調製することができる。 DNAの調製は例えばポリメラーゼチェインリアクション法（以下「PCR法」と記載する）が好ましくは挙げられる。 PCR法においては、ベクターにあわせた適切な制限酵素領域を予めプライマーに含めておくことが、本発明核酸のベクターへの導入が容易とするため好ましい。この様なプライマーとしては例えば 5'プライマーとしては配列番号 3記載の塩基配列（EcoRI領域を含んでいる）、 3'プライマ一としては配列番号 4記載の塩基配列（BamHI領域を含んでいる）が例示される。

例えば上記 GenScanで GenBank accession No. MN_018590の ESTを基にして検索して得られるゲノムは、データベース上の情報からヒトの脳で発現していることが分かる。そこで PCR法の铸型としては市販のヒト脳 cDNAライブラリー (例えば Marathon- Ready cDNA human brain (クロンテック社製等））などを用いることができる。

上記で例示したプライマーを用いて PCR法を行うと約 2kbの増幅産物として本発明核酸（DNA) が生じる。この増幅産物の単離はァガロースゲル電気泳動法などの分子量による DNAの分離方法とゲルの切り出し、本発明核酸の抽出などを常法に従って行うことができる。

上記で例示したプライマーは EcoRI領域と BamHI領域とを含んでいるため、これらの制限酵素によって処理することで、 EcoRI及び BamHI領域を有するべクタ一^■常法により挿入することができる。例えば上記で例示した基本ベクターである pFLAG-CMV- 1には EcoRI及び BamHI領域が含まれているため、この基本べクタ一を EcoRI及び BamHIで消化し、本発明核酸を結合させることで本発明べクタ一を得ることができる。

本発明ベクターの宿主細胞への導入は常法に従って行うことができる。基本ベクターとして pFLAG-CMV-1を使用した場合には pFLAG_CMV_lの宿主細胞として機能する C0S1細胞や C0S7細胞等のほ乳類由来の細胞にエレクトロポレーシヨン法などの常法を用いて導入して形質転換体を得ることができる。 ( 5 ) 本発明酵素調製法

本発明酵素調製法は、本発明組換体を生育させ、生育物に本発明酵素を蓄積させて該生育物から前記本発明酵素を単離することを特徴とする。

本発明酵素の調製は、形質転換体をそれが生育するのに適した条件下で生育させて、本発明核酸を発現させてその生育物から調製して行なうことができる。ここで宿主細胞の生育とは、宿主細胞を培養することの他、宿主細胞を生体などに投与してその生体内で宿主細胞を生育させることも含む概念である。また、生育物とは、培養された宿主細胞、培養上清の他、宿主細胞を生体内で生育させた場合には、その生体の排泄物、分泌物なども含む概念である。

例えば COS- 7細胞を宿主細胞として選択した場合には、 in vitroで形質転換体を培養し、その培養物（培養後の形質転換体及び培養上清）から本発明物質を精製することが可能である。本発明酵素の単離 ·精製の方法は、識別べプチドによって適宜、適当な方法を常套的に選択することが可能である。特に上記 pFLAG-CMV-1ベタターを用いた場合には本発明酵素は FLAGぺプチドとの融合タンパク質として得られるので、本発明物質は例えば抗 FLAG抗体（例えば Mlなど）を用いて、ァフイエティー精製などの方法で本発明酵素を単離 ·精製することが可能である。抗 FLAG抗体が結合した樹脂などを使用すると、宿主細胞の培養物（培養上清や宿主細胞の抽出物など）からタンパク質を容易に単離 ·精製することが可能であり、またその樹脂をそのまま緩衝液などに懸濁して酵素懸濁液として使用することも可能である。

( 6 ) 本発明合成法

(a)本発明合成法 1

本発明合成法 1は、本発明酵素を作用させて下記式（1)で示される構造を有する GalNAc受容体及ぴ GalNAc供与体に対して作用させて、 GalNAc受容体に GalNAc残基を GalNAc供与体から転移することを特徴とする、下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。

(GlcUA— GalNAc) _n—(GlcUA)_m (1)

GalNAc- (GlcUA— GalNAc) _n— (GlcUA) _m (2) 式（1)及び (2)中、「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

本発明合成法 1において、 GalNAc受容体とは、 GalNAc残基が転移される対象となる上記式（1)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、更にその非還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した化合物でめって¹ 良レ、。

上記式（1)の GalNAc受容体に対して本発明酵素を作用させて GalNAc供与体から GalNAc残基を転移すると、上記式 (2)で示す構造を有する化合物が得られる。コンドロイチン骨格は、 GlcUA残基と GalNAc残基とが ]3 1, 3グリコシド結合で結合した二糖が 3 1, 4グリコシド結合で結合した構造からなり、本発明合成方法 1においてもそのような糖鎖に GalNAc残基を結合できることが好ましい。すなわち上記式（1)の構造を有する GalNAc受容体は下記式（ )の構造を有することがより好ましい。

(4GlcUA ]3 l -3GalNAc j3 l) _n-4 (GlcUA) _m ( ) 式（ )中の「GlcUA」、「GalNAc」及び「一」は上記式（1)と同様である。 ]3 は β結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。

式（ )に本発明酵素で GalNAc残基を転移させ、下記式 (2' )の構造を含む産物が得られることが好ましい。 GalNAc残基を β 1, 4グリコシド結合で GlcUA残基に結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。

GalNAc β 1— (4GlcUA ]3 1— 3GalNAc β l) _n_4 (GlcUA) _m (2， ) 式 (2' )中の「GlcUA」、「GalNAc」及び「―」は上記式（2)と同様である。 β は ]3結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。

本発明合成方法 1において GalNAc供与体から GalNAc受容体に対して GalNAc残基が転移される。本発明合成方法 1に使用する本発明酵素は、前記 GalNAc受容体に対し前記 GalNAc供与体から GalNAc残基を β 1, 4グリコシド結合で転移するものであることが好ましい。コンドロイチン骨格への GalNAc残基の結合は ]3 1， 4グリコシド結合でなされているからである。

本発明合成方法における GalNAc供与体から GalNAc受容体への GalNAc残基の転移反応は、本発明酵素の至適反応 pH、至適反応温度の範囲内で行われることが好ましい。例えば pHは 5. 0〜9. 0が好ましく、 5. 5〜8. 0がより好ましく、 6. 0〜 7. 5であることが最も好ましい。このような条件を保っために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましい。緩衝液としては酢酸緩衝液、 MES緩衝液、ヒドロキシメチルァミノエタン-塩酸緩衝液（以下単に「Tris - HC1緩衝液」とも記載する）、及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましい _PH範囲

(_PH6. 0〜7. 5) 全体において安定した pHを保つ作用が強いことから MESが最も好ましい。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが 10〜200mmol/l、好ましい範囲としては 20〜100mmol/lが例示される。

また、この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、更に好ましくはマンガンイオン、コバルトイオン等、特にマンガンイオンが含まれていることが好ましい。このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても良い。塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物が例示される。

作用時の温度条件は 20〜45°Cが例示され、好ましくは 24〜40°C、最も好ましくは 36〜37°Cが例示される。

本発明酵素は、上述の式 (2)及び式 (2' )記載の糖鎖の合成に使用することができ、式 (2)又は式（2' )の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在する GalNAc残基を転移するための使用は本発明使用となる。

(b)本発明合成法 2

本発明合成法 2は、本発明酵素を下記式 (3)で示される構造を有する Gl cUA受容体及ぴ GlcUA供与体に対して作用させて、 GlcUA受容体に GlcUA残基を GlcUA供与体から転移することを特徴とする、下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。 (GalNAc-GlcUA) _n- (GalNAc) _m (3)

GlcUA- (GalNAc-GlcUA) _n- (GalNAc) _ra (4) 式（3)及ぴ（4)中、「GalNAc」は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 raは 1又は 0を示し「―」はグリコシド結合を示す。

本発明合成法 2において、 GlcUA受容体とは、 GlcUA残基が転移される対象となる上記式（3)の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、さらにその非還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する化合物であっても良い。

上記式 (3)の GlcUA受容体に対して本発明酵素を作用させて GlcUA供与体から GlcUA残基を転移すると、上記式 (4)で示す構造を有する化合物が得られる。コンドロイチン骨格は、 GlcUA残基と GalNAc残基とが 1， 3グリコシド結合で結合した二糖が ]3 1, 4グリコシド結合で結合した構造からなり、本発明合成方法 1と同様に本発明合成方法 2においてもそのような糖鎖に GlcUA残基を結合できることが好ましい。すなわち上記式 (3)の構造を有する GlcUA受容体は下記式 (3' )の構造を有することがより好ましい。

(3GalNA )3 l -4GlcUA ]3 l) _n-3 (GalNAc) _ra (3' ) 式（3' )中の「GlcUA」、「GalNAc」及び「一」は上記式（3)と同様である。 β は ]3結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。

式 (3' )に本発明酵素で GlcUA残基を転移させ、下記式 (4' )の構造を含む産物が得られることが好ましい。 GlcUA残基を β 1， 3グリコシド結合で GalNAc残基に結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。

GlcUA ]3 1 - (3GalNAc j3 l -4GlcUA /3 l) _n-3 (GalNAc)_m (4' ) 式（3' )、（4' )中の「GlcUA」、「GalNAc」及び「一」は上記式（1)、（2)と同様である。 /3は] 3結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置） 'を示す。

本発明合成方法 2において GlcUA供与体から GlcUA受容体に対して GlcUA残基が転移される。本発明合成方法 2に使用する本発明酵素は、前記 GlcUA受容体に対し前記 GlcUA供与体から GlcUA残基を ]3 1， 3ダリコシド結合で転移すものであることが好ましい。コンドロイチン骨格への GlcUA残基の結合は β 1， 3結合でなされているからである。

本発明合成方法における GlcUA供与体から GlcUA受容体への GlcUA残基の転移反応は、本発明酵素の至適反応 pH、至適反応温度で行われることが好ましい。例えば pHは 4. 0〜8. 0が好ましく、 4. 5〜7. 0がより好ましく、 5. 7〜6. 7であることがより好ましく、特に 6. 0〜6. 5であることが好ましい。このような条件を保つために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましレ、。緩衝液としては酢酸緩衝液、 MES、 Tris- HC1緩衝液及びリン酸ナトリゥム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましい pH範囲（_PH6. 0〜6. 5) 全体において安定した pHを保つ作用が強いことから MESが好ましレ、。 ρΗ6· 0〜6. 5が緩衝領域の中心域なので、 pHをより安定に保つことができるからである。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが 10〜200腿 ol/l、好ましい範囲としては 20〜100mmol/lが例示される。

また、この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、更に好ましくはマンガンイオン、コバルトイオン等、特にマンガンイオンが含まれていることが好ましい。このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても良レ、。塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物が例示される。

作用時の温度条件は 20〜45°Cが例示され、好ましくは 24〜40° ( 、最も好ましくは 36〜37°Cが例示される。

本発明酵素は、上述の式 (4)及び式（4' )記載の糖鎖の合成に使用することができ、式 (4)又は式 (4' )の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在する GlcUA残基を転移するための使用は本発明使用となる。実施例 1

本発明酵素の調製

( 1 ) cDNAのクローニングと発現ベクターの構築

コンドロイチン硫酸グルクロン酸転移酵素（CSGlcA- T) のアミノ酸配列 (GenBank accession No. AB037823がコードするアミノ酸配列）をクエリーとして、 BLAST検索を行った。その結果、 EST (GenBank accession No. NM_018590) が見つかった。しかし、この配列は不完全であったため、ゲノムデータベースから、 _GenScan (米国スタンフォード大学）により 0RFを調べた。その結果、配列番号 1記載の塩基配列（コードされるァミノ酸配列は配列番号 2 ) を発見した。配列番号 1記載の塩基配列からなる遺伝子は、少なくともヒト脳で発現していることを Marathon- Ready cDNA (クロンテック社製）を铸型とした RT- PCR法によって確認した。この遺伝子の膜貫通領域を含む領域（配列番号 2のアミノ酸番号 1 〜 9 6からなる領域）を除く可溶性領域をクローニングするため、配列番号 3及び配列番号 4の 2種のプライマーを用いて常法に従つて PCRを行った。使用した铸型 cDNAは Marathon-Ready cDNA human brain (クロンテック社製）を使用した。増幅された約 2 kbのバンドを常法に従って EcoRIと BamHIで消化し、ほ乳類細胞用の発現べクタ一 pFLAG-CMV - 1 (シグマ社製）の EcoRIと BamHI部位に常法に従って挿入して K11- FLAG- CMV1を得た。得られたベタターの塩基配列を確認したところ、配列番号 1記載の塩基配列の塩基番号 287〜2328の塩基配列からなる DNA断片が挿入されていることを確認した。

( 2 ) 本発明酵素の調製

K11-FLAG-CMV1 15 gを TransFast (プロメガ社製）を用い、プロトコールに従つて 100mm培養皿に 70%コンフルェントになるように培養した C0S7細胞に遺伝子を導入した。 3日間培養した上清を回収し、 0. 22 μ ηιのフィルターで濾過後、その上清 10mlに Ant i- FLAG M2- Agarose Affinity Gel (シグマ社製） 100 μ 1を加え、 4 °Cでー晚、転倒混和した。反応後、ゲルを 50匪 ol Tris-HCl, pH7. 4/20%グリセロールで 3回洗浄後、 27Gの注射針をつけたシリンジを用い余分な洗浄液を除いた。このゲルを 50raraol/l Tris-HCl, pH7. 4/20%グリセロール /10瞧 ol/l フエ二ルメチルスノレホニルフノレオライド / 1 μ g/ml leupeptin/ 1 μ g/ml pepstatinに 50% (v/v)となるように懸濁し、これを遠心分離した後に上清を取り除いて酵素吸着ゲル懸濁液とした。実施例 2

本発明酵素を用いたコンドロイチン骨格の伸長

(1)コンドロイチン/コンドロイチン硫酸奇数糖の調製

コンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）をゥシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を 10 分間 100°Cで保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液を Superdex 30カラム

(60 X 1. 6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相： 0. 2mol/l NH₄HC0₃、流速： 2ml/分）にかけ溶出液を 225nmの吸光度でモニターしながら、 2ml毎に分画し、 10糖相当画分をプールした。各画分を PD10カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従って力ルバゾール硫酸法によりゥロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を 1讓 ol/lとなるように蒸留水に溶解し、偶数オリゴ糖サンプルとした

(コンドロイチン由来の 10糖を「CH10」、コンドロイチン硫酸由来の 10糖を rcsioj と記載する）。

10nmol/lの MnCl₂、 171 μ mol の ATPナトリゥム塩を含む 50mmol/l MES緩衝液 (pH6. 5) に酵素吸着ゲル懸濁液 10 μ 1、被検物質（コンドロイチン（CHEL) 、コンドロイチン硫酸（CSEL) 、 CH10又は CS10) を lnmol、 [³H]UDP- GalNAcを 0. 036nmol添加して全量を 30 μ 1とした。酵素反応は 37°Cで 1時間行い、その後反応液を 100°Cで 1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。

各々の反応液を孔径 0. 22 μ πιのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、流速 0. 5ml/分）で分離し、溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、シンチレーシヨンカウンターで放射能を測定した（第 1図）。その結果、強い GalNAc転移活性が CHEL (18画分）、 CH10 (23画分）及び CS10 (23画分）を GalNAc受容体基質とした場合に観察され、 CSELに対しては弱い GalNAc転移活性が観察された（16画分）。 CH10及び CS10から得られた反応生成物の 22〜23画分は 11糖が溶出する分子量を示す画分だった。 CH10から得られた 11糖を「CH11」、 CS10から得られた 11糖を rcsiij と記載する。

CS11の 21〜25画分を回収してプールし、 PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を 30騰 ol/lの酢酸ナトリゥムを含む 0. lmol/1の TrisHCl緩衝液（pH7. 4) 100 1に溶解し（CS11A) 、他方をコンドロイチナーゼ ACIIで消化した（lOOmUのコンド口イチナーゼ ACII (生化学工業株式会社製）を 100 μ 1の CS11画分に溶解し、 37°Cで 10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた： CS11B) 。

CS11Aと CS11Bとを孔径 0. 22 mのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、 Superdex p印 tideカラム（30 X 10讓：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、流速 0. 5ml/ 分）で分離し、溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、シンチレーシヨンカウンタ一で放射能を測定したところ、 CS11Bにおいて三糖画分に放射能ピークがシフトした（第 2図）。この結果から、本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の 10 糖の非還元末端の GlcUAに対して GalNAcを ]3 1， 4結合で転移し、 11糖を調製することができることが推測された。

(2)コンドロイチン/コンドロイチン硫酸偶数糖の調製

コンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）をゥシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を 10 分間 100°Cで保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液を 10， 000 X gで 10分間遠心処理し、上清を回収して更にゥシ肝臓由来 ]3ダルクロエダーゼ（シグマ社製）で消化した。酵素反応は反応液を 10分間 100°Cで保って停止させた。この反応液を Superdex 30カラム（60 X I. 6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NH₄HC0₃、流速： 2ml/分）にかけ溶出液を 225nmの吸光度でモニターしながら、 2ml毎に分画し、 11糖相当画分をプールした。各画分を PD10カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従って力ルバゾール硫酸法によりゥロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を lmmol/1となるように蒸留水に溶解し、奇数オリゴ糖サンプルとした（コンドロイチン由来の 11糖：「CH11」、コンドロィチン硫酸由来の 11糖：「CS11」 ) 。

またコンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式社製）をゥシ肝臓由来 /3ダルクロニダーゼ（シグマ社製）で消化してサンプルとした（各々「CH0L」及び「CS0L」と記載する）。

10nmol/lの MnCl₂、 50隱 ol/l 酢酸緩衝液（_PH5. 6) に酵素吸着ゲル懸濁液 10 μ 1、被検物質（CH0L 、 CS0L、 CH11又は CS11 ) を lnmol 、 [¹⁴C] UDP- GlcUAを 0. 432nmol添加して全量を 30 1とした。酵素反応は 37°Cで 1時間行い、その後反応液を 100°Cで 1分間保って酵素を失活させて反を停止させた。

各々の反応液を孔径 0. 22 μ πιのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、流速 0. 5ml/分）で分離し、溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、シンチレーシヨンカウンターで放射能を測定した（第 3図）。その結果、強い GlcUA転移活性が CH0L (18画分）、 CH11 (23画分）及び CS10 (22画分）を GlcUA受容体基質とした場合に観察され、 CS0Lに対しては GlcUA転移活性が観察されなかった。 CH11及び CS11から得られた反応生成物の 22〜23画分は 12糖が溶出する分子量を示す画分だった。 CH11から得られた 12糖を「CH12」、 CS11から得られた 12糖を「CS12」と記載する。

CS12の 21〜25画分を回収してプールし、 PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を 30匪 ol/lの酢酸ナトリゥムを含む 0. lmol/1の TrisHCl緩衝液（pH7. 4) 100 μ ΐに溶解し（CS12A) 、他方をコンドロイチナーゼ ACIIで消化した（lOOmUのコンド口イチナーゼ ACII (生化学工業株式会社製）を 100 / lの CS11画分に溶解し、 37°Cで 10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた： CS12B) 。

CS12Aと CS12Bとを孔径 0. 22 μ ηιのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、 Superdex peptideカラム（30 X 1. 0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィ一条件；移動相： 0. 2mol/l NaCl、流速 0. 5ml/ 分）で分離し、溶出液を 0. 5mlの画分毎に分取して、シンチレーシヨンカウンタ一で放射能を測定したところ、 CS12Bにおいて二糖画分に放射能ピークがシフ卜した（第 4図）。この結果から、本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の 11 糖に対して GlcUAを β 1, 3結合で転移し、 12糖を調製することができることが明かとなつた。実施例 3

実施例 2の本発明酵素の GlcUA及び GalNAc転移作用を、緩衝液の pHを変化させて至適 pHを調べた。酢酸緩衝液、 MES緩衝液、イミダゾール緩衝液、 Tris- HC1緩衝液を、何れの緩衝液も最終濃度 50ramol/lで使用した。

その結果、 GlcUA転移活性の至適 pHは 6. 0〜6. 5 (第 5図）、 GalNAc転移活性の至適 pHは 6· 2 (第 6図）であることが判明した。実施例 4

実施例 2の本発明酵素の GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性の測定条件において、反応系に 10mmol/lのエチレンジァミン四酢酸（EDTA) を添加して GlcUA 転移活性及び GalNAc転移活性を調べたところ、酵素活性が完全に失われた（第 7図）。従って、本発明酵素はその活性に二価陽イオンを必要とすることが明かとなつた。

また、反応系に MnCl₂に代えて CoCl₂を 10議 ol/lで添加すると、高い酵素活性が得られることが明かとなった（第 7図）。

更に、マンガンイオンの濃度による本発明酵素の活性への影響を調べるために、実施例 2の反応条件でマンガンィオンの最終濃度を 0〜50mmol/lの範囲内で変化させて同様に GlcUA転移活性及び GalNAc転移活性を測定したところ、何れの活性も、 10瞧 ol/lの至適マンガンィオン濃度の要求性を有することが明かとなった（第 8図）。実施例 5

本発明遺伝子のヒト組織発現パターンの解析

ヒト各種組織における本発明遺伝子の発現量を解析するために、リアルタイム PCR法（RT- PCR) を用いた。各種 Marathon-Ready cDNA (クロンテック社製）を铸型にし、 2種のプライマー（配列番号 5及び配列番号 6 ) と 3'末端にマイナーグルーヴバインダー（アプライドバイオシステムズ社製）が結合したプローブ（配列番号 7 ) を用いて増幅、定量を行った。標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) を含むプラスミド _PCR2. 1 (インビトロゲン社製）で希釈系列を作り、検量線を作成して使用した。また、 RT - PCRは ABI PRISM 7700 (アプライドバイオシステムス社製）を使用した（第 9図）。第 9図における発現量は、、 1 ：気管、 2 ：脳、 3 ：肝臓、 4 ：骨格筋、 5 ：子宮、 6 ：腎臓、 7 ：心臓、 8 ：胎児脳、 9 ：唾液腺、 1◦ ：小脳、 1 1 ：脊髄、 1 2 ：胎児肝臓、 1 3 ：胎盤、 1 4 ：精巣、 1 5 ：前立腺、 1 6 ：乳腺、 1 7 ：膝臓、 1 8 ：副腎、 1 9 ：甲状腺、 2 0 ：胃、 2 1 :小腸、 2 2 ：大腸における発現量を表す。

その結果、本発明遺伝子は胎盤、精巣、滕臓、甲状腺、胃、小腸、特に膝臓で強く発現していることが明かとなった。

本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとつて明らかである。

本出願は、 2002年 5月 31日おょぴ 2003年 5月 6日出願の日本特許出願（特願特願 2002 - 160854および特願 2003-128343) に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。産業上の利用可能性

本発明により、コンドロイチンの基本骨格を合成するための酵素であって、グルクロン酸転移酵素活性を有しており、且つ N-ァセチルガラクトサミン転移酵素活性も有しているヒト由来の新規コンドロイチン合成酵素が提供される。配列表フリーテキスト

配列番号 3—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 4—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 5—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 6—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 7—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2記載のァミノ酸配列又は配列番号 2記載のァミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列からなるポリぺプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリペプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。

2 . N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を N-ァセチル- D-ガラクトサミン受容体に対して転移する酵素活性又は D-ダルク口ン酸残基を!) -ダルク口ン酸受容体に対して転移する酵素活性を有すると共に、配列番号 2記載のアミノ酸番号 97〜755からなるアミノ酸配列のうち 1〜131個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び又は転移を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含むことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。

3 . 非還元末端に D-グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該 D- グルクロン酸残基に対して N-ァセチル -D-ガラクトサミン供与体から N -ァセチル- D-ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、非還元末端に N-ァセチル -D-ガラクトサミン残基を有するコンドロイチンの当該 N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基に対して D-ダルク口ン酸供与体から D-ダルク口ン酸残基を転移する酵素活性を有することを特徴とする請求の範囲 2記載のコンドロイチン合成酵素。

4 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素をコ一ドする核酸。

5 . 請求の範囲 4記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。

6 . 発現ベクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とする請求の範囲 5記載の発現ベクター。

7 . 請求の範囲 5又は 6記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。

8 . 請求の範囲 7記載の形質転換体を生育させ、生育物にコンドロイチン合成酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を単離することを特徴とするコンドロイチン合成酵素の製造方法。

9 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル- D-ガラクトサミン受容体及び N -ァセチル -D-ガラクトサミン供与体に対して作用させて、 N -ァセチル -D-ガラクトサミン受容体に N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。

(GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA) _m (1)

GalNAc- (GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA)_ffi (2) 式（1)及び（2)中、「GalNAcJ は N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

1 0 . 請求の範囲 1〜3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体及び D-グルクロン酸供与体に対して作用させて、 D-ダルク口ン酸受容体に D-ダルク口ン酸残基を転移することを特徴とする、下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖の合成方法。

(GalNAc— GlcUA) _n— (GalNAc) _m (3)

GlcUA— (GalNAc -GlcUA) _n- (GalNAc) _m (4) 式 (3)及び (4)中、「GalNAc」は N-ァセチル _D -ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

1 1 . 下記式（1)で示される構造を有する N-ァセチル- D-ガラクトサミン受容体の非還元末端に存在する D-グルクロン酸残基に対して、 N-ァセチル -D- ガラクトサミン残基を転移して下記式 (2)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、請求の範囲 1〜 3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の使用。

(GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA) _m (1)

GalNAc- (GlcUA-GalNAc) _n- (GlcUA) _ra (2) 式（1)及ぴ（2)中、「GalNAc」は N_ァセチル- D-ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

1 2 . 下記式（3)で示される構造を有する D-グルクロン酸受容体の非還元末端に存在する N-ァセチル- D-ガラクトサミン残基に対して、 D-グルクロン酸残基を転移して下記式 (4)で示される構造を有する糖鎖を合成するための、請求の範囲 1〜 3いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の使用。

(GalNAc-GlcUA) _n- (GalNAc)_m (3)

GlcUA- (GalNAc-GlcUA) _n- (GalNAc) _m (4) 式（3)及び（4)中、「GalNAc」は N-ァセチル _D -ガラクトサミン残基を示し、「GlcUA」は D-グルクロン酸残基を示し、 nは 1以上の整数を示し、 mは 1又は 0を示し「一」はグリコシド結合を示す。

1 3 . 請求の範囲 1〜 3 、ずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性調節剤。

1 4 . 請求の範囲 1 3記載の活性調節剤を有効成分として含む請求の範囲 1〜 3のいずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。