WO2003087163A1 - Procede d'elaboration d'une banque scdb - Google Patents

Procede d'elaboration d'une banque scdb Download PDF

Info

Publication number
WO2003087163A1
WO2003087163A1 PCT/JP2003/004773 JP0304773W WO03087163A1 WO 2003087163 A1 WO2003087163 A1 WO 2003087163A1 JP 0304773 W JP0304773 W JP 0304773W WO 03087163 A1 WO03087163 A1 WO 03087163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
variable region
antibody
antigen
chain variable
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/004773
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuo Kojima
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to AU2003227504A priority Critical patent/AU2003227504A1/en
Priority to AT03717592T priority patent/ATE512989T1/de
Priority to US10/510,971 priority patent/US8030461B2/en
Priority to JP2003584118A priority patent/JP4386741B2/ja
Priority to EP03717592A priority patent/EP1500665B1/en
Publication of WO2003087163A1 publication Critical patent/WO2003087163A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Definitions

  • the present invention relates to a single chain diabody (scDb) library and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a gene constituting the single-chain diapody library, an expression vector containing the gene, and a method for producing them, and further relates to a peptide encoded by the gene.
  • Multispecific antibodies eg, bispecific antibodies (BsAb)
  • BsAb bispecific antibodies
  • Multispecific antibodies can be used, for example, when immobilizing enzymes used in enzyme immunoassays.
  • one arm of the multispecific antibody is designed to bind to a portion of the enzyme that does not inhibit the enzymatic reaction on the enzyme, and the other arm is designed to bind to the carrier to be immobilized.
  • the enzyme is bound to the carrier via an antibody (for example, Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461-1473 (1968)).
  • Bispecific antibodies used in diagnosing cancer are designed so that one arm of the antibody recognizes a tumor-associated antigen and the other is designed to bind to a detectable marker (eg, Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62 (1992); Le Doussal et al. 3 J. Nucl. Med. 34: 1662-1671 (1993); Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650-6655 (1991)).
  • a detectable marker eg, Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62 (1992); Le Doussal et al. 3 J. Nucl. Med. 34: 1662-1671 (1993); Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650-6655 (1991)
  • Multispecific antibodies can also be designed to elicit T cell killing effects (Shalaby et al., J. Exp. Med.
  • multispecific antibodies can be used as fibrinolytics or vaccine adjuvants, for the treatment of infectious diseases (eg, targeting cells infected with HIV, influenza, protozoa), tumors, It can also be used to deliver antitoxins to cells and to activate immune complexes on cell surface receptors (Fanger et al., Supra).
  • infectious diseases eg, targeting cells infected with HIV, influenza, protozoa
  • tumors e.g, tumors, It can also be used to deliver antitoxins to cells and to activate immune complexes on cell surface receptors (Fanger et al., Supra).
  • multispecific antibodies have been used for (1) chemical coupling of antibodies having different specificities with heterobifunctional linkers (Paulus, Behring Inst. Mitt., 78: 118-132 (1985)), (2) ) Fusion of hybridoma cells secreting different monoclonal antibodies (Millstein and 'Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)), and (3) light and heavy chain genes of different monoclonal antibodies (four genes ) Into murine myeloma cells or other eukaryotic cell expression systems followed by isolation of the bispecific monovalent moiety (Zi Erman, Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176). -260 (1986); Van Dijk et al . :
  • Diabody (Db) is a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP 404,097, W093 / 11161, etc.).
  • a diabody is a dimer composed of two polypeptide chains, each of which is a position where the light chain variable region (VL) and the heavy chain variable region (VH) cannot bind to each other in the same chain. It is linked by a short linker, for example, about 5 residues. VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain V region fragment (scFv) due to the short linker between them, and form a dimer.
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • bispecific Db there are three types of assembling of the two types of chains, so that only 50% of the bispecific Db is obtained.
  • VH and VL are linked with a linker of about 15 residues to display the antigen binding site as scFv.
  • the length of the linker is required for the expression of the scFv. Complicated operations such as PCR assembling were necessary to change from a basic group to a linker with a length of about 5 residues enabling Db expression, and it was difficult to perform batch processing.
  • the present invention provides a method for constructing a novel bispecific scDb library.
  • VL and VH for two different antigens (a, b) are assigned in the order of VLa-VHb-VLb-VHa, with 15 remaining between VHb and VLb. It is expressed as a single chain that is linked by more than one group (however, the present invention is not limited to the order of the variable regions such as VLa, VHa, VLb, and VHb).
  • a bispecific scDb library that expresses such a polypeptide chain (VLa-VHb-VLb-VHa) is -Can be created by batch processing from the library. That is, a gene in which nucleotides encoding two antibody variable regions (VLa and VHa) are linked by a linker having a restriction enzyme cleavage site, and a nucleotide encoding two antibody variable regions (VLb and VHb) are long.
  • the present invention relates to a method for constructing such a bispecific scDb library, a gene usable in the method, a gene obtained by the method, an expression vector or an antibody library containing these genes, and the gene Which provides a peptide encoded by
  • an antibody clone concentrated from a phage antibody library by panning or the like is used as a method for expressing VH and VL of scFv selected by binding to an antigen as a bispecific scDb by batch processing.
  • an antibody clone concentrated from a phage antibody library by panning or the like is used as a method for expressing VH and VL of scFv selected by binding to an antigen as a bispecific scDb by batch processing.
  • an antibody clone concentrated from a phage antibody library by panning or the like is used as a method for expressing VH and VL of scFv selected by binding to an antigen as a bispecific scDb by batch processing.
  • an antibody clone concentrated from a phage antibody library by panning or the like is used as a method for expressing VH and VL of scFv selected by binding to an antigen as a bispecific scDb by batch processing.
  • the first and second antibody variable regions and the third and fourth antibody variable regions are connected with a short linker, and the second and third antibody variable regions are connected with a long linker.
  • the light chain variable region for the first antigen, the heavy chain variable region for the second antigen, the light chain variable region for the second antibody, and the heavy chain variable region for the first antigen are arranged in this order (10 ) Described gene,
  • step (c) inserting the gene created in step (b) between the genes created in step (a),
  • step (c) inserting the gene created in step (b) between the genes created in step (a),
  • the method of the present invention is used to screen not only bispecific scDb but also monospecific scDb (for example, scDb that recognizes the same epitope but has variable regions having different sequences). It can also be applied to
  • an antibody phage library is constructed by connecting VL-VH in order from the spleen of an animal immunized with antigen A and the like.
  • the antibody phage library can be constructed according to a known method (for example, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); C lackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al. 5 J. Mol. Biol. 222: 582-597 (1991)).
  • Antigens for immunizing animals include complete immunogenic antigens and incomplete non-immunogenic antigens (including haptens). Substances composed of proteins, polypeptides, polysaccharides, nucleic acids, lipids and the like are mentioned as antigens, and in the present invention, the kind of substances constituting the antigen is not particularly limited.
  • an immunogen used to immunize an animal a substance that can be an antigen in some cases can be bound to another molecule to be a soluble antigen, and a fragment thereof can be used in some cases.
  • a transmembrane molecule such as a receptor
  • cells expressing the transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen. Such cells can be of natural (such as tumor cell lines) or cells that have been constructed to express transmembrane molecules by recombinant techniques.
  • Bispecific Db can be used in the same manner as a conventionally known bispecific antibody.
  • one arm can be designed to recognize a tumor cell antigen, and the other arm can be designed to recognize a molecule that induces cytotoxicity.
  • tumor cell antigens include, for example, CD15, pl85 HER2 , 1D10 (malignant B cells), p97, renal cell carcinoma, 0VCM-3, L-D1 (colorectal cancer), melanosite stimulating hormone analog, EGF receptor, CAMA1, MoV18, CD19, neural cell adhesion molecule (NCAM) ⁇ folate binding protein (FBP) ⁇ AMOC-31 (pan carcinoma assocated antigen), Id-1, CD22, CD7, CD38, CEA You can choose. Examples of molecules that induce cytotoxicity include FcaRI, CD16, and CD3. You.
  • Db can be designed to bind to a toxin such as saponin, ricin A chain, IFN-hi, and vin alkaloid. Such bispecific Db is particularly useful in treating cancer.
  • Bispecific Db is also useful as an agonist antibody.
  • many site force-in receptors form homo- or hetero-dimers, and the distance and angle between the chains forming the dimer change when the ligand binds, resulting in intracellular changes. It is thought that the signal can be transmitted. Therefore, bispecific Db that binds to a receptor that forms such a dimer can mimic receptor dimerization by a ligand, and can be an agonist Db.
  • Db that binds to CD30 and alkaline phosphatase and consequently involves enzymes that aid in the conversion of substances, such as Db that converts mitomycin phosphate to mitomycin alcohol.
  • Db which can be used as a fibrinolytic agent, binds to fibrin, tPA, uPA, etc.
  • Db which can be used as a fibrinolytic agent, binds to fibrin, tPA, uPA, etc.
  • LDL and Fc receptors FcaRI, FcRII or FcaRIII
  • Db that induces immune complexes to cell surface receptors (4) Db that can be used for infectious diseases that recognize antigens on T cells such as CD3 and antigens of pathogenic bacteria such as HCV, influenza and HIV (5) Db capable of binding to a detectable substance such as E0TUBE, DPTA, hapten, etc., and (6) Db (Fanger et al. 5 Crit. Rev.) which can be used as a vaccine adjuvant. Immunol. 12: 101-124 (1992)) and (7) may be used in diagnostics.
  • Detectable substances such as ⁇ egret IgG, horseradish peroxidase (HRP), FITC, ⁇ -galactosidase, and Db with antigens such as hormones, ferritin, somatosustin, substance P, CEA, etc. .
  • the Db of the present invention is not limited to these.
  • the appropriate mammal is then immunized with the antigen.
  • animals such as mice, hamsters, or rhesus monkeys can be used for immunization.
  • lymphocytes can be immunized in vitro.
  • DNA encoding the antibody contained in the spleen or lymphocytes of the immunized animal is purified by a conventional method (for example, antibody weighting).
  • the H chain and L chain variable regions refer to a portion of the H chain and L chain of an immunoglobulin which usually consists of about 110 amino acids from the N-terminus.
  • Immunoglobulins are divided into different classes (IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM), which are further subclassed (isotyped) (eg, IgG-1, IgG2, IgG-3, and IgG-4, And IgA-1, and IgA-2), but the H chain and L chain variable regions of the present invention may belong to any of these classes and subclasses, and are not particularly limited.
  • the antibody variable region of the present invention may be a shorter or modified antibody fragment as long as it has a binding property to a desired antigen.
  • An “Fv” fragment is the smallest antibody fragment and contains a complete antigen-recognition and binding site.
  • This region is a dimer in which the variable regions of one H chain and L chain are strongly linked by non-covalent bonds.
  • the three complementarity determining regions (hypervariable regions; CDRs) present in each variable region interact to form an antigen-binding site on the surface of the dimer. That is, the six CDRs, including the H chain and the L chain, function as antigen-binding sites of the antibody.
  • the antibody variable region constituting Db in the present invention is particularly preferably, but not limited to, an Fv fragment, and is capable of recognizing and binding to an antigen in which an H chain or L chain CDR is conserved. Any area is acceptable.
  • variable regions of the present invention also include modified variable regions such as humanized.
  • variable regions can be modified to improve the biological properties of the antibody, such as binding to an antigen.
  • modification can be performed by site-specific mutation (see Kunkel, Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)), PCR mutation, cassette mutation, and the like.
  • antibody variants with improved biological properties are derived from amino acid sequence homology and similarity of 70% or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more (eg, 95% or more). With the amino acid sequence of the variable region of the H or L chain.
  • the homology and similarity of the sequence are determined by aligning the sequence as necessary so that the sequence homology takes the maximum value, introducing a gap, and then homologous (same as the original antibody residue). Residues) or similar (amino acid residues that fall into the same group based on the properties of common amino acid side chains).
  • natural amino acid residues are (1) hydrophobic: norleucine, methionine, alanine, valine, leucine and isoloicin, (2) neutral hydrophilicity: cysteine, serine, threonine, asparagine and glutamine, (3) acidic: Aspartic acid and glutamic acid, (4) basicity: histidine, lysine, and arginine; (5) residues that affect chain orientation: glycine and proline; and (6) aromaticity: tributofan, tyrosine, and phenylalanine.
  • the amino acids are classified into groups based on the properties of the side chains of each amino acid.
  • the isolated heavy and light chain DNAs are linked using a linker of about 20 residues in length, and Into a phage library to create a phage library ⁇ At this time, the recognition sequence of the restriction enzyme BainHI, Acc III, etc. . Keep arranged Such linker one may be exemplified those having a sequence such as follows: BamHI AccI II
  • GlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 2) Xbal ⁇ Aatl ⁇ Bell ⁇ BstEI I ⁇ Ehel ⁇ Kpnl, Nhel, Pstl ⁇ PvuI I, Sfil, Bgl Hael K K Hhal, HpaI I, Xhol and the like.
  • the phages constituting the phage library include G4 phage, M13 phage, fd phage, fl phage, phage, T4 phage, T7 phage, P1, phage MS2, phage ⁇ , phage ⁇ 174, AgWES, Eb, Charon 4A, Charon30, and the like.
  • an animal or lymphocyte is immunized with an antigen different from antigen A or with the same antigen (for example, when the epitope is different), and DNA encoding the heavy or light chain of the antibody is isolated.
  • An antibody phage library is constructed by linking VH-VL in order using a linker approximately the length of residues. At this time, the 5 'end of VHb, and the VLb of VLb were inserted so that the genes encoding VHb and VLb binding to antigen B could be inserted between the genes encoding VLa and VHa binding to antigen A. Provide a sequence recognized by the restriction enzyme at the 3 'end.
  • a library for antigen A is constructed by arranging a recognition sequence such as restriction enzyme BamHK AccI II, BamHI is arranged at the 5 ′ end of VH, and AccI II is arranged at the 3 and end of VL. Keep it.
  • the phage library or a gene containing a variable region prepared from the phage library for example, a phagemid of each library concentrated by panning or the like (for example, Vaughan et al., Nature Biotechnolog 14) : 309-314
  • a library of discDb can be constructed.
  • the “linker” is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of an antibody variable region linked to both ends, and may or may not have a restriction enzyme cleavage site.
  • the “long linker” refers to a linker having a length displayed as scFv when the H chain variable region and the L chain variable region of an antibody are expressed on a phage library by linking the linker. Means that.
  • the chain length is not particularly limited, but is preferably 30 to; I50 bp, more preferably 36 to 90 bp, and particularly preferably 45 to 60 bp.
  • short linker means a linker that forms a dimer (diabody: Db) when expressed by connecting the variable region of the H chain and the variable region of the L chain of the antibody with the linker.
  • the chain length is not particularly limited, but preferably has a chain length of 6 to 27 bp, more preferably has a chain length of 9 to 21 bp, and particularly preferably has a chain length of 12 to L8 bp. .
  • VLa-VHb-VLb-VHa was cut out by providing an appropriate restriction enzyme recognition site on the opposite side of the linker encoding the genes encoding VLa and VHa, and an appropriate expression vector was obtained.
  • the gene encoding the target Db can be screened using the biological activity as an index. For example, when BamHI and AccIII are used in a fuzzy antibody library against antigens A and B as described above, appropriate expression using another restriction enzyme such as Sfil as shown in FIG. It can be inserted into a vector.
  • Examples of the biological activity used as an index include an activity of specifically binding to an antigen, and depending on the type of antigen, an inhibitory activity, an agonist activity, an engonist activity, and the like are also included.
  • a biscDb library constructed using an antibody library for cytokine receptors is inserted into a vector such as a retrovirus vector, Agonist biDb can be selected for by infecting cell-dependent proliferating cells.
  • Procedures for constructing an expression system for expressing the Db of the present invention and construction of a recombinant vector suitable for a host can be carried out using a conventional technique in the field of genetic engineering (for example, Sambrook et al. 5 Molecular Cloning, Cold Spring Harb or Labolatories (1989), etc.).
  • a conventional technique in the field of genetic engineering for example, Sambrook et al. 5 Molecular Cloning, Cold Spring Harb or Labolatories (1989), etc.
  • the host cell any cells that can express the Db of the present invention, such as prokaryotes such as bacteria and eukaryotic cells such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • mammalian cells are preferable from the viewpoint of glycosylation.
  • the expression vector must include units for controlling the transcription and translation of genetic information, such as a promoter and a unit.
  • a promoter for example, when a microorganism of the genus Escherichia such as Escherichia coli is used as a host cell, pBR and pUC-based plasmids can be used as plasmids, and lac, trp, tac, trc, phage PL, PR, etc. Promos from the United States are available.
  • one-minute and one-minute one derived from trpA, one derived from phage, and one derived from rrnB ribosomal RNA can be used as the one-minute and one-minute.
  • plasmids such as pUBllO and pC194 are known, and in some cases, the gene can be integrated into a chromosome.
  • Promo One Night 'One Min One Night One can be derived from apr, npr, amy, etc.
  • Other prokaryotic cells include genus Pseudomonas (eg, Pseudomonas putida,
  • Brevibacterium eg, Brevibacterium lactofermentum; pAJ43, etc.
  • Corynebacterium eg, Corynebacterium glutamicum, etc .; pCSll, pCBlOl, etc.
  • Plasmid isolated from Lactococcus (Rhodococcus rhodochrous, etc.) (J. Gen. Microbiol. 138: 1003 (1992)
  • Streptococcus pHV1301, pGKl, etc.
  • Streptomyces genus for example, Streptomyces lividans, S.
  • a system using Saccharomyces cerevisiae as a host and using YRp, YEp, YCp, and Yip plasmids is known.
  • promoters such as ADH, GAPDH, PHOs GALs PGK, and ENO can be used.
  • the genus Kleiberomyces eg, Kluyveromyces lactis, etc .; plasmids such as 2m, pKDl, pGKIl, KMS, etc.
  • the genus Shizosa ⁇ caromyces eg, Schiz osaccharomyces pombe, etc .; pAUR224, etc.
  • Genus eg, Zygos accharomyces rouxii, etc .; pSB3 and PH05 promoter derived from S.
  • Genus Candida e.g., Candida laltosa, Candida tropical is, Can dida utilis, Candida albicans, etc.
  • genus Aspereginoles e.g., E.g., Trichoderma rees ei
  • E.g., Trichoderma rees ei can be used in the expression vector system of the present invention.
  • plant cells can be used as hosts.
  • plant cells derived from cotton, corn, potato, tomato, soybean, petunia, and tobacco can be used as hosts.
  • a system using cells derived from Nicotina tabacum is known, which may be cultured in callus.
  • the vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens using an expression vector such as PM0N530.
  • this bacterium is transmitted to tobacco (for example, Nicotina ta bacum), the desired polypeptide can be obtained from tobacco leaves and the like.
  • Silkworm Bactyx mori eight force (Aede aegypti, Aedes albopictus) N Sho jaw Bruno, 'E (Drosophila melanogaster) c for example insect cells can also be used as hosts, such as the case of using silkworms, a DNA encoding Db By inserting the virus into a baculovirus vector and infecting the silkworm with the virus, (Nature 315: 592-594 (1985)).
  • promoters include promoters and enhancers for the cytomegalovirus IE gene, early promoter for SV40, and LTRs for retroviruses such as RSV, HIV and MMLV. And promoters of genes derived from animal cells such as metallothionein-actin, elongation factor 1, HSP, etc.
  • viral vectors as described above Examples of viral vectors include DNA and RNA of retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, simbis virus, Sendai virus, SV40, HIV, etc. Viruses.
  • Animal cell hosts include mouse myeloma cells (e.g., SP2 / 0, NS0, etc.), rat myeloma cells (e.g., YB2 / 0, etc.), mouse'hypridoma cells, Nmalwa cells (KJM -1 cells, etc.), human embryonic kidney cells (293 cells, etc.), human leukemia cells (BALL-1, etc.), CH0 cells, COS cells (C0S-1, C0S-7, etc.), hamster embryonic kidney cells ( BHK, etc.), mouse Sertoli cells (TM4, etc.), African green monkey kidney cells (VER0-76, etc.), HBT637 cells, HeLa cells, egret kidney cells (MDCK, etc.), human liver cells (HepG2, etc.), mouse breast cancer cells (MMT060562 cells), TRI cells, MRC cells, 'FS3 cells and the like.
  • mouse myeloma cells e.g., SP2 / 0, NS0, etc.
  • the method for introducing the expression vector depends on the type of the host and the vector, and any method can be used as long as it can introduce DNA encoding Db into cells.
  • the method of introducing a vector into prokaryotic cells is to use calcium ions USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972)), the protoplast method (Japanese Patent Publication No. 63-24829), the electroporation method (Gene 17: 107 (1982); Molecular & General Genetics 168). : 111 (1979)) and the like; examples of the method of introduction into yeast include the electoporation method (Methods in Enzymology, 194: 182 (1990)) and the spheroplast method (Proc.
  • the transformant obtained as described above can be cultured, for example, by the following method.
  • the medium contains substances necessary for the growth of the carbon source, nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be utilized by the organism, and the efficient culture of the transformant
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it enables the above.
  • the cultivation may be carried out under aerobic or anaerobic conditions, and conditions such as the growth temperature, the pH of the medium, and the growth time can be appropriately determined by those skilled in the art according to the type of the transformant used. is there.
  • the expression vector using an inducible promoter it is possible to add an Indian user to the medium as needed (for example, IPTG for lac promoter, IAA for trp promoter, etc.). ).
  • the culture medium is TNM-FH medium (Pharmin gen) ⁇ Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCel 1400 and ExCel 1405 (JRH Biosciences) ⁇ Grace's Insect Medium (Nature 195) : 788 (1962)) and the like, and if necessary, an antibiotic such as genyumycin may be added.
  • the transformant is an animal cell
  • commonly used RPMI1640 medium The Journal of American Medical Association 199: 519 (1967)
  • Eagle's banded medium Science 122: 501 (1952)
  • DMEM Medium Virology 8: 396 (1959)
  • 199 medium Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950)
  • the culture can be performed under normal conditions, for example, at pH 6 to 8, 30 to 40 °, and 5% CO 2 .
  • an antibiotic such as kanamycin or penicillin may be added to the medium (the Db of the present invention thus obtained is secreted into host cells or extracellularly by using a signal sequence).
  • the Db of the present invention thus obtained is secreted into host cells or extracellularly by using a signal sequence.
  • an antibiotic such as kanamycin or penicillin
  • it can be isolated from the medium, etc. and purified as a substantially pure polypeptide.
  • the separation and purification of polypeptides are commonly used in chromatography, filters, ultrafiltration. , Salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc.
  • Chromatography includes affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, Antibodies: reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc.
  • chromatographies can be carried out using liquid phase chromatography such as HPLC and FPL C. Since Db binds to an antigen, it can be purified using its binding property to the antigen.
  • the present invention can be used in the above-described method for producing the scDb library.
  • a linker encoding two antibody variable regions, wherein one of the variable regions and the other variable region have a restriction enzyme cleavage site.
  • two antibodies available It relates to a gene encoding a variable region and having restriction enzyme cleavage sites added to both ends.
  • the variable regions of the genes used as materials in the production of the scDb library of the present invention are preferably such that the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked by a long linker so as to be expressed as scFv. Things.
  • genes of (I) and (II) or the antibody library containing the genes are treated with restriction enzymes and ligated to encode the four antibody variable regions of the present invention.
  • Genes having restriction enzyme cleavage sites between the second antibody variable region and between the third antibody variable region and the fourth antibody variable region can be obtained.
  • a short linker is used between the first and second antibody variable regions and between the third and fourth antibody variable regions, and a long linker is used between the second and third antibody variable regions.
  • the first is the heavy chain variable region for the first antigen
  • the second is the light chain variable region for the second antigen
  • the third is the heavy chain variable region for the second antigen
  • the fourth is If the light chain variable regions for the first antigen are arranged in this order, a bispecific single chain diabody can be obtained when this is expressed.
  • the present invention includes a vector and a library containing such a gene, and a peptide encoded by the gene.
  • the present invention also provides
  • the present invention also provides a method for preparing an antibody library or an expression vector comprising: According to this method, the method for producing the scDb library of the present invention can be applied to monospecific Db.
  • the following BaMil site (underlined) is provided in the linker at the time of constructing a phage library.
  • GlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyG SerGlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 3)
  • GGTGGTGGT6GATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGAGCGGCGGCTCCGGAGGTGGTGGATCC (SEQ ID NO: 4) Phagemid or a gene amplified from the above phage library using PCR) is treated with BamHI and self-cyclized to reduce the linker length from 20 residues for scFv to 5 residues optimal for diabody.
  • the VL-VH fragment containing the receptor-binding antibody thus produced is inserted into an appropriate expression vector to achieve biological activity. For example, by inserting a Db library constructed using a cytokine receptor antibody library into a retrovirus vector and infecting target cytokine-dependent proliferating cells, The agonist Db can be selected.
  • the scDb of the present invention is useful in clinical fields such as immunodiagnosis, treatment, and diagnosis by immunoassay, as with conventionally known multispecific antibodies.
  • immunoassay for example, to induce cytotoxicity such as killing tumor cells, etc., as a vaccine adjuvant, to properly deliver drugs such as thrombolytic agents to the target in vivo, to be activated by enzymes
  • drugs such as thrombolytic agents
  • to be activated by enzymes In order to reliably convert prodrugs to be converted at target sites, to treat infectious diseases, and to induce immune complexes with cell surface receptors, to target immunotoxins and other target cells such as tumor cells
  • Various therapeutic purposes are conceivable, such as for transportation to a hospital.
  • the pharmaceutical composition containing Db of the present invention used for such a therapeutic purpose may be formulated as necessary by mixing with a suitable pharmaceutically acceptable carrier, medium or the like which is inactive against them. can do.
  • a suitable pharmaceutically acceptable carrier for example, sterile water or physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG , Tween etc.), chelating agent (EDTA etc.), c can be given binding agent also other low molecular weight polypeptides, serum albumin, gelatin and immune Glo purine proteins such as glycine, glutamine, Asuparagin, arginine It may contain amino acids such as ricin, sugars such as polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols such as mannitol and sorbitol.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride, are suitable.
  • the Db of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules of hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid], etc.), and colloid drug delivery systems (ribosome, albumin microsphere, micro Emar Ji may be a nano-particles, and nano-capsules) ( "Remi ngton 's Pharmaceutical Science 16 th edition", Oslo Ed. (1980)).
  • a method of converting a drug into a sustained-release drug is also known and can be applied to the Db of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, chem.Tech. 12: 98-105 (1982); U.S. Patent No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) No. 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983) ); EP 133, 988).
  • Administration to the patient is preferably by injection or infusion, for example, by intra-arterial injection,
  • intra-arterial injection In addition to intravenous injection, subcutaneous injection, etc., intranasal, transbronchial, intramuscular, transdermal or oral routes can be used to carry out the method known to those skilled in the art.
  • the dose varies depending on various factors such as the patient's body weight, age, type of disease, symptoms, administration method and the like, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the administration method includes direct administration using naked plasmid, packaging in ribosome, retrovirus vector, adenovirus vector, vaccinia virus vector, box virus vector, adenovirus-related vector, HVJ vector, etc. (See Adolph “Viral Genome Method”, CRC Press, Florid (1996)) or coated on bead carriers such as colloidal gold particles (W093 / 17706 etc.) for administration can do. However, it may be administered by any method as long as Db is expressed in vivo and exerts its action.
  • injection, infusion, or gas-induced particle bombardment (intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intradermal, adipose tissue, intramammary tissue, inhalation or intramuscular routes)
  • a sufficient amount is administered by an electron gun or the like, or via a mucosal route such as a nasal drug). ex) to blood cells and bone marrow-derived cells, etc., using ribosome transfection, particle bombardment (U.S. Pat. No. 4,945,050), or viral infection, and the cells are administered to animals.
  • the gene encoding Db of the present invention may be administered by re-introduction.
  • the Db of the present invention can also be used for enzyme immunoassay.
  • one antibody variable region of Db is designed to recognize an epitope that does not inhibit enzyme activity on the enzyme, and the other is to recognize a carrier that binds to the carrier.
  • Db which recognizes IgG, ferritin, HRP, hormone and the like can be mentioned.
  • the Db of the present invention can also be used for immunodiagnosis of various diseases in i / 2 vivo and in vitro.
  • one of the antibody variable regions of Db is designed to recognize an antigen specific to tumor cells, and the other is designed to bind to a detectable marker. can do.
  • Radioisotopes as detectable Ma one force one e.g., 3 ⁇ 4, 14 C, 32 P , 35 S, 125 1 , etc.
  • fluorescent dyes Fluoresein, luciferin, etc.
  • chemical Ruminesen scan compound I Seo thio Xia sulfonates , Rhodamine, etc.
  • alkaline phosphatase -galactosidase
  • HRP horseradishin
  • Binding and detection of Db with these substances can be carried out according to known methods (Hunter, etc.). et al., Natur e 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Me th. 40: 219 (1981); Nygen, J. Histochem and Cytochem 30: 407 (1982)).
  • the Db of the present invention having reactivity to a detectable substance as described above can be used for competitive binding analysis, direct and indirect sandwich immunoassay (ELISA etc.), immunoprecipitation assay (Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques ", pp. 147-158, CRC Press Inc. (1987)) and the like.
  • ELISA etc. sandwich immunoassay
  • Zola immunoprecipitation assay
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method for constructing a bispecific scDb library for antigens A and B.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a method for constructing a Db library from a phage antibody library.
  • the present invention provides a method for constructing a novel bispecific scDb library.
  • a bispecific scDb library can be prepared from a scFv phage library by a batch processing without complicated processing.
  • the present invention also provides a method for collectively transferring an antibody clone concentrated from a phage antibody library by panning or the like to an expression vector for animal cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Automatic Tape Cassette Changers (AREA)

Description

明細書 s c D bライブラリ一の作成方法 技術分野
本発明は、 単鎖ダイァボディ（single chain diabody; scDb)ライプラリー及び その作成方法に関する。 また、 本発明は該単鎖ダイアポディライブラリ一を構成 する遺伝子、 及び、 該遺伝子を含む発現ベクター、 並びに、 それらの作成方法に 関し、 さらに、 該遺伝子によりコードされるペプチドに関する。 背景技術
異なる抗原に結合することができる多特異性抗体 (例えば、 二特異性抗体 (BsA b) )は免疫診断、 治療及び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用であ る。 多特異性抗体は、 例えば、 酵素免疫分析で用いられる酵素を固定化する際に 利用することができる。 即ち、 多特異性抗体の一方の腕を酵素上の酵素反応を阻 害しない部分のェピト一プと結合するように、 そしてもう一方の腕は固定化する 担体上に対して結合するように設計し、 担体上に酵素を抗体を介して結合する（例 えば、 Hammer ling et al.， J. Exp. Med. 128: 1461-1473 ( 1968) )。 また、 多特異 性抗体を癌等の様々な疾病の免疫診断において利用する方法も報告されている（So ngsivilai et al .， CI in. Exp. Immunol. 79 : 315 ( 1990) )。 癌の診断において使用 される二特異性抗体は、 例えば、 抗体の一方の腕が腫瘍関連抗原を認識するよう に設計され、 他方は検出可能なマーカーに結合するように設計される（例えば、 Le Doussal et al. , Int. J. Cancer Suppl . 7: 58-62 ( 1992) ; Le Doussal et al. 3 J. Nucl.Med. 34: 1662-1671 (1993) ; Stickney et al .， Cancer Res. 51 : 6650-665 5 ( 1991 ) )。
さらに、 病原体または腫瘍細胞に対する患者の細胞性免疫応答の誘発において 多特異性抗体を利用する方法も知られている（Segal et al., Chem. Immunol. 47: 179 (1989); Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2(4) De Vita et al. eds. , J.B.Lippomcott, Philadelphia (1992) p.1; Hseih-Ma et al. , Cancer Re s. 52: 6832-6839 (1992); Weiner et al., Cancer Res. 53: 94-100 (1993))。 また、 多特異性抗体は T細胞の細胞を殺す作用を誘起するように設計することも できる（Shalaby et al.， J. Exp. Med. 175(1): 217 (1992); de Li i et al. "Bis pecif ic Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity", Romet-Lemonne, Fa nger and Segal Eds. , Lienhart (1991 )p.249; Clark et al. "Bispecific Antib odies and Targeted Cellular Cytotoxicity", Romet-Lemonne, F anger and Sega 1 Eds. Lienhart (1991)p.243; Kroesen et al. , Cancer Immunol. Immnother. 3 7: 400-407 (!993); Kroesen et al., Br. J. Cancer 70: 652-661 (1994); Weiner et al., J. Immunol. 152: 2385 (1994))。 その他、 多特異性抗体は、 繊維素溶解 剤またはワクチンのアジュバントとしても利用し得るし、 感染性の疾患 (例えば、 HIV、 インフルエンザ、 原生虫等に感染した細胞を標的として）の治療用、 腫瘍細 胞へ抗毒素の運搬、 及び、 細胞表面受容体へ免疫複合体を作用させるためにも利 用することができる（Fanger et al.、 上述）。
従来、 多特異性抗体は、 （1)異なる特異性を有する抗体の異種二機能性リンカ一 による化学的カップリング (Paulus、 Behring Inst. Mitt.， 78:118-132 (1985))、 (2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイプリ ド一マ細胞の融合 （Millstein and'Cuello, Nature 305: 537-539 (1983))、 及び（3)異なるモノクローナル抗体 の軽鎖及び重鎖遺伝子 (4種類の遺伝子)のマウス骨髄腫細胞または他の真核細胞 発現系へのトランスフヱクシヨンとそれに続く二特異性の一価部分の単離（Zi腿 er emann、 Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260 (1986); Van Dijk et al. :
Int.J.Cancer 43: 944-949 (1989))等の方法により製造されてきた。
ダイァボディ（Db)は、 遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片 である（P.Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)、 EP 404，097号、 W093/11161号等）。 ダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖から構成 されるダイマ一であり、 ポリペプチド鎖は各々、 同じ鎖中で軽鎖可変領域 (VL )及 び重鎖可変領域 (VH)が、 互いに結合できない位に短い、 例えば、 5残基程度のリ ンカーにより結合されている。 同一ポリべプチド鎖上にコードされる VLと VHと は、 その間のリンカ一が短いため単鎖 V領域フラグメント（ scFv )を形成すること が出来ず二量体を形成するため、 ダイァボディは 2つの抗原結合部位を有するこ ととなる。 このとき 2つの異なる抗原（a、 1))に対する ¥1と¥11を 1^-¥1¾と¥1^- VHaの組合わせで 5残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させるとニ特 異性 Dbとして分泌される。 二特異性 Dbは多特異性抗体の一種である。 発明の開示
二特異性 Dbにおいては、 2種類の鎖の汲み合わせは 3通りあるため、 得られる 二特異性 Dbは全体の 50%に留まる。 一方、 ファージ抗体ライブラリーを用いて 抗原との反応性により特定の遺伝子を選択するためには、 抗原結合部位を scFvと して提示させるために VHと VLを 15残基程度のリンカーで結合して発現させる必 要がある。 このように抗原との結合性により選択されたファージ抗体ライブラリ —由来の scFvの VHと VLを二特異性 scDbとして発現させるためには、 リンカー の長さを scFvの発現に必要とされる 15残基程度のものから、 Dbの発現を可能に する 5残基程度の長さのリンカーに換えるための PCRアセンブル等の煩雑な操作 が必要となり、 一括処理することは困難であった。
本発明により、 新規な二特異性 scDbライブラリーの構築法が提供される。 本発 明においては、 二特異性 Dbを確実に生産できるよう、 2つの異なる抗原 (a、 b )に 対する VLと VHを VLa- VHb-VLb- VHaの順に、 VHbと VLbの間は 15残基以上のリン 力一で結んだ単鎖として発現させる （但し、 本発明は VLa、 VHa、 VLb、 VHb等 の可変領域の順序で限定されるものではない） 。 本発明では、 このようなポリべ プチド鎖 (VLa- VHb- VLb- VHa)を発現する二特異性 scDbライブラリ一を scFvのファ —ジライブラリ一から一括処理により作成することができる。 即ち、 2つの抗体 可変領域 (VLaと VHa)をコードするヌクレオチドが制限酵素切断部位を有するリン カーで結ばれた遺伝子、 及び、 2つの抗体可変領域 (VLbと VHb)をコードするヌク レオチドが長いリンカ一により結ばれ、 可変領域をコードするヌクレオチドのリ ンカーと結合されていない側に制限酵素切断部位を有する遺伝子を用い、 これら を制限酵素で処理した後、 VLaと VHaの間に VLb ¾び VHbが挟まれるように結合 させる。 本発明は、 このような二特異性 scDbライブラリーの構築法に加え、 該方 法に用い得る遺伝子、 該方法により得られる遺伝子、 これらの遺伝子を含む発現 ベクタ一または抗体ライプラリー、 及び、 該遺伝子によりコードされるペプチド を提供する。
また、 本発明では、 抗原との結合で選択された scFvの VHと VLを二特異性 scD bとして一括処理で発現させる方法として、 ファ一ジ抗体ライブラリ一からパン ニング等によって濃縮した抗体クロ一ンを一,括して動物細胞用の発現べクタ一に 移す方法を提案する。 より詳細には、 本発明は、
( 1) 2つの抗体可変領域をコードし、 一方の抗体可変領域と他方の抗体可変領 域が制限酵素切断部位を有するリンカーで結ばれている遺伝子、
(2) リンカ一に制限酵素切断部位が 2つ以上存在することを特徴とする （ 1) 記載の遺伝子、
(3) 2つの抗体可変領域の一方が重鎖可変領域であり、 他方が軽鎖可変領域で ある （ 1) または （2) 記載の遺伝子、
(4) 2つの抗体可変領域が長いリンカーで結ばれていることを特徴とする
( 1) 〜（ 3 )いずれか記載の遺伝子、
(5) 2つの抗体可変領域をコードし、 その両端に制限酵素切断部位を付加した 子、
(6) 2つの抗体可変領域の一方が重鎖可変領域であり、 他方が軽鎖可変領域で ある（ 5 )記載の遺伝子、 (7) 2つの抗体可変領域をコードする遺伝子が長いリンカーで結ばれているこ とを特徴とする （5) または（6)記載の遺伝子、
(8) 4つの抗体可変領域をコードし、 1番目の抗体可変領域と 2番目の抗体可 変領域の間、 及び 3番目の抗体可変領域と 4番目の抗体可変領域の間に制 限酵素切断部位が存在することを特徴とする遺伝子、
(9) 1番目と 2番目の抗体可変領域の間及び 3番目と 4番目の抗体可変領域の 間が短いリンカーで結ばれ、 2番目と 3番目の抗体可変領域の間が長いリ ンカーで結ばれていることを特徴とする （8) 記載の遺伝子、
(10) 4つの抗体可変領域が第一の抗原に対する重鎖可変領域、 第一の抗原に 対する軽鎖可変領域、 第二の抗原に対する重鎖可変領域、 第二の抗原に 対する軽鎖可変領域である （8) または （9) 記載の遺伝子、
(1 1) 第一の抗原に対する軽鎖可変領域、 第二の抗原に対する重鎖可変領域、 第二の抗体に対する軽鎖可変領域、 第一の抗原に対する重鎖可変領域の 順に並んでいる （10) 記載の遺伝子、
(12) 以下の工程を含む二特異性単鎖ダイァボディ一をコ一ドする遺伝子の作 成方法
(a) (1) 〜 （4) 記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、
(b) (5) 〜 （7) 記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(c) (b)の工程で作成した遺伝子を、 （a)の工程で作成した遺伝子の間に挿入す る工程、
を含む方法、
( 13) ( 1) 〜 （ 1 1) いずれかの記載の遺伝子によりコードされるペプチド、
(14) (1) 〜 （1 1) のいずれか記載の遺伝子を含む抗体ライブラリ一、
(15) 以下の工程を含む抗体ライブラリ一又は発現べク夕一の作成方法、
(a)第一の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を、 制限酵素部位を含む 長いリンカーにより結合した抗体ファージライブラリーを作成する工程、 (b)第二の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域が長いリンカ一で結ばれ、 それそれの可変領域のリンカーが付加していない側に制限酵素部位が存在 している抗体ファージライブラリーを作成する工程、
( c ) ( a )及び ( b )で作成したファージライプラリー又は該ファージライブラリー から調製された可変領域を含む遺伝子を制限酵素で処理する工程、
(d)上記処理により得られたフラグメントをライゲ一シヨンすることにより、 第一の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間に、 第二の抗原に対 する重鎖可変領域と軽鎖可変領域が挿入されたフラグメントを作成するェ 程、
(16) 以下の工程を含む抗体ライブラリ一又は発現べクタ一の作成方法
(a) (1)〜（4) 記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、
(b) (5)〜（7) 記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(c) (b)の工程で作成した遺伝子を、 （a)の工程で作成した遺伝子の間に挿入す る工程、
(17) 以下の工程を含む抗体ラィブラリ一又は発現べクタ一の作成方法、
(a)抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を、 制限酵素切断部位が 2っ以 上存在する長いリンカ一により結合した抗体ファージライブラリーを作成 する工程、
(b)上記ファージライブラリ一又は該ファージライブラリーから調製された可 変領域を含む遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
( c )上記処理により得られたフラグメントをセルフライゲ一シヨンすることに より、 可変領域間のリンカ一を短いリンカ一にする工程、 並びに
(18) ( 1)〜（11) いずれか記載の遺伝子を含む発現ベクター
に関する。
本発明の方法は、 二特異性 scDbのみならず一特異性 scDb (例えば、 同じェビ ト一プを認識するが配列の異なる可変領域を有する scDbなど） のスクリーニング にも応用できる。
本発明の scDbライブラリーの作成方法においては、 例えば、 まず図 1に示すよ うに、 抗原 Aを免疫した動物の脾臓等から VL- VHの順につないだ抗体ファージラ イブラリーを構築する。 抗体ファージライブラリ一は、 公知の方法に従って構築 することができる（例えば、 McCafferty et al .， Nature 348: 552-554 (1990) ; C lackson et al . , Nature 352: 624-628 ( 1991 ) ; Marks et al .5 J.Mol .Biol . 22 2 : 582-597 ( 1991)等参照）。
動物を免疫化する抗原としては、 免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を有 さない不完全抗原（ハプテンを含む）が挙げられる。 蛋白質、 ポリペプチド、 多糖 類、 核酸、 脂質等からなる物質が抗原として挙げられ、 本発明において、 特に抗 原を構成する物質の種類は限定されない。 動物を免疫するのに用いる免疫原とし ては、 場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性抗原とすることも 可能であり、 また、 場合によりそれらの断片を用いてもよい。 受容体のような膜 貫通分子を抗原として用いる場合、 これらの断片 (例えば、 受容体の細胞外領域） を用いるのが好ましい。 また、 膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原 とすることもできる。 このような細胞は天然 (腫瘍セルライン等）由来、 または、 組換え技術により膜貫通分子を発現するように構成された細胞であり得る。
二特異性 Dbは、 従来知られている二特異性抗体と同様に使用することができる ものである。 そこで癌の治療を目的として、 例えば、 一方の腕を腫瘍細胞抗原を 認識するようにし、 他方が細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計する ことができる。 この場合、 腫瘍細胞抗原としては例えば CD15、 pl85HER2、 1D10 (悪 性 B細胞)、 p97、 腎細胞癌、 0VCM- 3、 L-D1 (大腸癌)、 メラノサイ ト刺激ホルモン アナログ、 EGF受容体、 CAMA1, MoV18、 CD19、 神経細胞接着分子 (neural cell ad hesion molecule; NCAM)ヽ 葉酸結合蛋白質（FBP)ヽ AMOC-31 (pan carcinoma assoc iated antigen), Id- 1、 CD22、 CD7、 CD38、 CEAを選択することができる。 また、 細胞傷害性を誘起する分子としては、 Fcァ RI、 CD16、 CD3等を挙げることができ る。 また、 上述の細胞障害性を誘起する分子に代えて、 例えば、 サポニン、 リシ ンの A鎖、 IFN-ひ、 ビン力アルカロイ ド等の毒素と結合するように Dbを設計する こともできる。 このような二特異性 Dbは癌の治療において特に有用である。
又、 二特異性 Dbはァゴニスト抗体としても有用である。 例えば、 多くのサイ ト 力イン受容体ではホモ又はへテロ二量体を形成しており、 リガンドが結合するこ とによって二量体を形成する鎖間の距離 ·角度が変化して細胞内にシグナルを伝 えうるようになると考えられている。 従って、 このような二量体を形成する受容 体に結合する二特異性 Dbは、 リガンドによる受容体の二量体化を模倣でき、 ァゴ ニスト Dbとなり得る。
その他の二特異性 Db としては、 （1 )CD30及びアルカリホスファタ一ゼに結合し、 その結果、 リン酸マイ トマイシンをマイ トマイシンアルコールに変換する Db等、 物質の変換を助ける酵素を伴うもの、 （2)繊維素溶解剤として用い得る、 フイブリ ン、 tPA、 uPA等に結合する Db、 （3)LDL及び Fc受容体 (Fcァ RI、 Fc RI Iまたは F cァ RI I I )等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導する Db、 （4)CD3等の T細 胞上の抗原と、 HCV、 インフルエンザ、 HIV等の病原菌の抗原を認識する感染性の 疾患に用い得る Db、 （5 )腫瘍の検出に用い得る腫瘍抗原と、 E0TUBE、 DPTA、 ハプ テン等の検出可能な物質に結合性を有する Db、 （6)ワクチンアジュバントとして 用い得る Db(Fanger et al. 5 Crit. Rev. Immunol . 12: 101-124 ( 1992)参照）、 並 びに（7)診断において使用し得るゥサギ IgG、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)、 FITC、 ^ -ガラクトシダ一ゼ等の検出可能な物質と、 ホルモン、 フェリチン、 ソマ トス夕チン、 サブスタンス P、 CEA等を抗原とする Dbが挙げられる。 しかしなが ら、 本発明の Dbはこれらに限定されるものではない。
次に抗原を用いて適当な哺乳動物を免疫する。 例えば、 マウス、 ハムスター、 またはァカゲザル等の動物を免疫化に使用することができる。 また、 in vitroに おいてリンパ球を免疫化することもできる。 その後、 免疫化された動物の脾臓ま たはリンパ球中に含まれる抗体をコードする DNAを、 慣用の方法 (例えば、 抗体重 鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるヌクレオチドフ' ローブ等を用いる方法）により単離する。
本発明における、 H鎖及び L鎖可変領域とは、 免疫グロブリンの H鎖及び L鎖 のうち、 N末端から通常約 110残基のアミノ酸からなる部分を指す。 免疫グロブ リンは、 異なるクラス（IgA、 IgD、 IgE、 IgG及び IgM)に分類され、 さらにこれら は幾つかのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、 IgG- 1、 IgG2, IgG- 3、 及び IgG-4、 並びに IgA- 1、 及び IgA- 2等）に分類されるが、 本発明の H鎖及び L鎖可変領域は、 これらいずれのクラス及びサブクラスに属するものであってもよく、 特に限定さ れない。
さらに、 本発明の抗体可変領域は所望の抗原との結合性を有している限り、 よ り短いまたは改変された抗体断片であってもよい。 「Fv」 断片は最小の抗体断片 であり、 完全な抗原認識部位と結合部位とを含むものである。 この領域は 1つの H鎖及び L鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。 各 可変領域中に存在する 3つの相補性決定領域 (超可変部; CDR)が相互作用し、 ダイ マ一の表面上に抗原結合部位を形成している。 即ち、 H鎖と L鎖をあわせて 6つ の CDRが抗体の抗原結合部位として機能している。 しかしながら、 1つの可変領 域であっても全結合部位を含む場合よりは低い親和性ではあるものの、 抗原を認 識し、 結合する能力を有していることが知られている。 従って、 本発明における Dbを構成する抗体可変領域は、 Fv断片が特に好ましいが、 これに限定されるもの ではなく、 H鎖または L鎖の CDRが保存され抗原を認識し、 結合する能力を有す る領域であればよい。
また、 遺伝子工学的に非ヒト哺乳動物 (マウス、 ラット、 ハムスター等）由来の モノク口一ナル抗体の CDR以外の部分をヒト免疫グ口ブリン由来の可変領域の枠 組構造配列に置き換え 「ヒト化抗体」 とする技術が公知である（例えば、 Jones et al.5 Nature 321 : 522-525 (1986) ; Reichmann et al.， Nature 332: 323-329 (1988) ; Presta Curr. Op. Struct. Biol . 2: 593-596 (1992)参照）。 ヒト化抗体は、 レシピエント抗体に導入させた CDRまたは枠組構造配列のどちらにも含まれない アミノ酸残基を含んでいてもよい。 通常、 このようなアミノ酸残基の導入は、 抗 体の抗原認識 ·結合能力をより正確に至適化するために行われる。 本発明の可変 領域はヒト化等の改変された可変領域も包含する。
その他の可変領域を、 抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するため に改変することもできる。 このような改変は、 部位特異的変異 (Kunkel, Proc . Nat 1. Acad. Sci . USA 82 : 488 ( 1985 )参照)、 PCR変異、 カセット変異等の方法により 行うことができる。 一般に、 生物学的特性の改善された抗体変異体は 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上 (例えば 95%以上）のァミ ノ酸配列相同性 ·類似性を元となった抗体 H鎖または L鎖の可変領域のアミノ酸 配列と有する。 本明細書において、 配列の相同性，類似性は、 配列相同性が最大 の値を取るように必要に応じ配列を整列化、 及びギャップ導入した後、 元となつ た抗体残基と相同（同じ残基）または類似 (一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき 同じグループに分類されるアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義され る。
通常、 天然のアミノ酸残基は（1 )疎水性：ノルロイシン、 メチォニン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン及びィソロイシン、 （2)中性親水性：システィン、 セリン、 スレ ォニン、 ァスパラギン及びグルタミン、 （3)酸性：ァスパラギン酸及びグルタミン 酸、 （4)塩基性： ヒスチジン、 リシン及びアルギニン、 （5 )鎖の配向に影響する残 基：グリシン及びプロリン、 並びに（6 )芳香族性： トリブトファン、 チロシン及び フエ二ルァラニンのグループに各々のァミノ酸の側鎖の性質に基づき分類される ( 続いて、 単離した重鎖及び軽鎖の DNAを間に 20残基程度の長さのリンカ一を用 い結合し、 適当なファージベクターに組込み、 ファ一ジライブラリ一を作成する < このとき、 リンカ一の中に、 例えば制限酵素 BainHI、 Acc I I I等の認識配列を配し ておく。 このようなリンカ一としては、 例えば以下のような配列を有するものを 例示することができる ： BamHI AccI II
GGTGGTGGTGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGTGGTGGTTCT (配列番号: 1 ) CCACCACCACCTAGGCCACCACCACCAAGACCGCCGCCGCCGAGGCCTCCACCACCAAGA
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer (配列番号: 2 ) その他、 本発明において使用し得る制限酵素認識配列としては、 例えば BamHI、 AccI I I Alulヽ EcoRK Hind iヽ Hindi I K Hinfl、 Notlヽ Saclヽ Sall、 Sau3AI、 Sm alヽ Taqlヽ Xbalヽ Aatlヽ Bellヽ BstEI Iヽ Ehelヽ Kpnl、 Nhel、 Pstlヽ PvuI I、 Sfil、 Bgl l Hael l K Hhal、 HpaI I、 Xhol等が挙げられる。
また、 ファ一ジライブラリ一を構成するファージとしては、 G4ファ一ジ、 M13 ファージ、 fdファージ、 flファージ、 えファージ、 T4ファージ、 T7ファージ、 P 1ファージ、 MS2ファージ、 ΦΚファージ、 ΦΧ174ファージ、 AgWES、 え B、 Charo n 4A、 Charon30等を例示することができる。
同様にして抗原 Aとは異なる抗原、 または同じ抗原 (例えば、 ェピトープが異な る場合など）により動物またはリンパ球を免疫化し、 抗体の重鎖または軽鎖をコ一 ドする DNAを単離し、 20残基程度の長さのリンカーを用い VH- VLの順につないだ 抗体ファ一ジライブラリ一を構築する。 このとき、 抗原 Aに結合する VLaと VHa とをコードする遺伝子の間に、 抗原 Bに結合する VHb及び VLbをコードする遺伝 子を挿入することができるように VHbの 5'末端、 及び VLbの 3'末端に制限酵素に より認識される配列を設ける。 即ち、 抗原 Aについてのライブラリ一を制限酵素 BamHK AccI I I等の認識配列を配して作成した場合には、 VHの 5'末端には BamHI を、 VLの 3，末端には AccI I Iを配しておく。
次に、 上記ファージライブラリー又は該ファージライブラリーから調製された 可変領域を含む遺伝子 （例えば、 パンニング等で濃縮したそれそれのライブラリ 一のファ一ジミ ド（例えば、 Vaughan et al . , Nature Biotechnolog 14: 309-314
( 1996 )参照）あるいは上記ファージライブラリーから PCRを用いて増幅した遺伝 子など） を、 リンカ一並びに VL及び VHをコードする遺伝子の末端に配置した制 限酵素、 例えば上記 BamHI と AccI IIの認識部位を含むリンカーを用いた場合には、 BamHIと AccIIIで処理する。 得られた抗原 Bに対する抗体の VH-VL断片をコード する遺伝子を抗原 Aに対する抗体ファージミ ドの BajnHIと AccII Iの間に挿入する ( これによつて抗 A抗体と抗 B抗体の様々な組み合わせの discDbのライブラリ一が 構築できる。
本発明において、 「リンカ一」 は、 その両端に連結された抗体可変領域の発現 を阻害するものでなければ特に限定されず、 制限酵素切断部位を有していても、 有していなくてもよい。 ここで、 「長いリンカ一」 とは、 抗体の H鎖可変領域と L 鎖可変領域を該リンカーを結んでファージライプラリー上に発現させた場合に、 scFvとして提示される長さのリンカ一のことを意味する。 その鎖長は特に制限さ れないが、 好ましくは 30〜； I50bpの鎖長を有し、 さらに好ましくは 36〜90bpの鎖 長を有し、 特に好ましくは 45〜60bpの鎖長を有する。 また、 「短いリンカ一」 と は、 抗体の H鎖可変領域と L鎖可変領域を該リンカーで結んで発現させた場合に、 二量体 (diabody:Db)を形成するリンカ一のことを意味し、 その鎖長は特に制限さ れないが、 好ましくは 6〜27bpの鎖長を有し、 さらに好ましくは 9〜21bpの鎖長 を有し、 特に好ましくは 12〜； L8bpの鎖長を有する。
さらに、 VLa及び VHaをコードする遺伝子のリンカ一とは逆側の部分にも適当 な制限酵素認識部位を設けておくことにより VLa- VHb-VLb-VHaをコードする断片 を切出し、 適当な発現ベクターへ揷入し、 発現させ、 その生物活性を指標に目的 とする Dbをコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。 例えば、 上述 のように抗原 A及び抗原 Bに対するファ一ジ抗体ラィブラリーにおいて BamHI及 び AccIIIを用いている場合には、 図 1において示すように Sfil等の別の制限酵 素を用いて適当な発現ベクターに挿入することが出来る。 指標とする生物活性と しては、 例えば、 抗原と特異的に結合する活性が挙げられ、 抗原の種類によって は阻害活性、 ァゴニスト活性、 アン夕ゴニスト活性等も挙げられる。 例えば、 サ イ トカイン受容体に対する抗体ライブラリ一を用いて構築した biscDbライブラリ 一については、 レトロウイルスベクター等のベクタ一に挿入し、 目的サイ トカイ ン依存性増殖細胞に感染させることによってァゴニスト biDbを選択することがで ぎる。
本発明の Dbを発現させるための発現系を構築するための手順および宿主に適合 した組換えベクターの構築は遺伝子工学の分野において慣用の技術を用いて行う ことができる (例えば、 Sambrook et al .5 Molecular Cloning, Cold Spring Harb or Labolatories (1989)等参照）。 宿主細胞としては、 細菌等の原核生物、 並びに、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞及び植物細胞等の真核細胞等、 本発明の Dbを発現でき る細胞であればいずれも用いることができる。 特に、 グリコシル化の点から考え ると哺乳動物細胞が好ましい。
発現べクタ一は、 遺伝情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、 夕一ミネ 一夕一等のユニットを含む必要がある。 例えば、 大腸菌等のェシヱリシァ属の微 生物を宿主細胞とする場合、 プラスミ ドぺク夕一として pBR、 pUC系プラスミ ドを 利用することができ lac、 trp、 tac、 trc、 えファージ PL、 PR等に由来するプロ モ一夕一が利用可能である。 また、 夕一ミネ一夕一としては trpA由来、 ファージ 由来、 rrnBリボソ一マル RNA由来のものを用いることができる。 枯草菌等のバチ ルス属の微生物を宿主とする場合については、 pUBllO系、 pC194系等のプラスミ ドが知られており、 場合により遺伝子を染色体にィンテグレートすることもでき る。 プロモ一夕一 '夕一ミネ一夕一として apr、 npr、 amy等由来のものが利用で きる。 その他、 原核細胞としてはシユードモナス属（例えば、 Pseudomonas putida,
? 6 &(^&等； 1240等のべク夕ー)、 ブレビパクテリゥム属（例えば、 Brevibac terium lactofermentum； pAJ43等）、 コリネバクテリゥム属（例えば、 Corynebact erium glutamicum等； pCSll、 pCBlOl等）、 ストレプトコヅカス属（pHV1301、 pGKl 等）、 ラクトバチルス属（pAM ? l等）、 ロドコッカス属（Rhodococcus rhodochrous 等より単離されたプラスミ ド（J. Gen. Microbiol . 138: 1003 ( 1992) )等)、 ストレ プトマイセス属（例えば、 Streptomyces lividans, S.virginiae等； pIJ486、 pKC 1064、 pUWL-KS等）、 ェンテロパク夕ー属、 エルウイ二ァ属、 クレビシエラ属、 プ 口テウス属、 サルモネラ属（Salmonella typhi皿 rium等)、 セラチア属 ( Serratia marcescans)、 シゲレラ属に属する微生物が挙げられる。
真核微生物の発現系としては、 Saccharomyces cerevisiae を宿主とし、 YRp 系、 YEp系、 YCp系、 Yip系のプラスミ ドを用いた系が知られている。 また、 ADH、 GAP DH、 PHOs GALs PGK、 ENO等のプロモータ一 .夕一ミネ一夕一が利用可能である。 その他、 クライべロマイセス属（例えば、 Kluyveromyces lactis等； 2〃m系、 pKDl 系、 pGKIl系、 KMS系等のプラスミ ド）、 シゾサヅカロマイセス属（例えば、 Schiz osaccharomyces pombe等； pAUR224等）、 チゴサヅカロマイセス属（例えば、 Zygos accharomyces rouxii等； pSB3、 及び、 S. cerevisiae 由来 PH05 プロモーター等）、 ハンゼヌラ属（例えば、 Hansenula polymorpha等）、 ピキア属（例えば、 Pichia pa storis等)、 カンディダ属 (例えば、 Candida laltosa, Candida tropical is, Can dida utilis, Candida albicans等)、 ァスぺレギノレス属 (ί列え《ま、 Aspergillus o ryzae, Aspergillus niger等)、 及び卜リコデフレマ属 (ί列え ίま、 Trichoderma rees ei等）等を本発明の発現べクタ一系において用いることができる。
その他、 植物細胞を宿主として用いることもできる。 例えば、 綿、 トウモロコ シ、 ジャガイモ、 トマト、 ダイズ、 ペチュニア、 及びタバコ等由来の植物細胞を 宿主とすることができる。 特に良く知られた系として Nicotina tabacum由来の細 胞を用いたものが知られており、 これをカルス培養すればよい。 植物を形質転換 する際には、 例えば、 PM0N530等の発現べクタ一を用い、 該ベクターを Agrobacte rium tumefaciens等の細菌に導入する。 この細菌をタバコ（例えば、 Nicotina ta bacum)に感染させると、 所望のポリぺプチドをタバコの葉等から得ることができ る。
カイコ (Bombyx mori八 力 (Aede aegypti, Aedes albopictus)N ショウジョウノ、' ェ（Drosophila melanogaster)等の昆虫細胞を宿主として用いることも可能である c 例えば、 カイコを用いる場合、 Dbをコードする DNAをバキュロウィルスべクタ一 等に挿入し、 該ウィルスをカイコに感染させることによりカイコの体液から目的 のポリペプチドを得ることができる（Nature 315: 592-594 (1985))。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 例えば、 pME18S(Med. inununol. 20: 27- 32 (1990))、 pEF-BOS(Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990))、 pCDM8(Nature 32 9: 840-842 (1987)、 pRSVneo, pSV2-neo、 pcDNAI/Amp(Invitrogen)s pcMAIヽ A MoERC3Sc pCDM8( ature 329: 840 (1987))、 pAGE107(Cytotechnology 3: 133 (1 990))、 pREP4(Invitrogen)、 pAGE103(J.Biochem. 101: 1307 (1987))、 pAMoA、 pA S3 - 3、 pCAGGS(Gene 108: 193-200 (1991))、 pBK-CMVヽ pcDNA3.1( Invirtogen), pZ eoSV(Stratagene)等が発現べクタ一として挙げられる。 プロモーターとしては、 サイ トメガロウィルスの IE遺伝子のプロモー夕一及びェンハンサー、 SV40の初 期プロモ一夕一、 RSV、 HIV及び MMLV等のレトロウイルスの LTR、 メタロチォネィ ン ? -ァクチン、 伸長因子 1、 HSP等の動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等を 挙げることができる。 その他、 上述のようにウィルスベクタ一を用いることもで きる。 ウィルスベクタ一としては、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随 伴ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウィルス、 シン ビスウィルス、 センダイウィルス、 SV40、 HIV等の DNA及び RNAウィルスが挙げ られる。
動物細胞宿主としては、 マウス · ミエローマ細胞 (例えば、 SP2/0, NS0等)、 ラ ヅト · ミエ口一マ細胞 (例えば、 YB2/0等)、 マウス 'ハイプリ ドーマ細胞、 Nmalw a細胞 (KJM-1細胞等も含む)、 ヒト胎児腎臓細胞 (293細胞等)、 ヒト白血病細胞 (B ALL- 1等)、 CH0細胞、 COS細胞 (C0S-1、 C0S-7等）、 ハムスター胎児腎臓細胞 (BHK 等）、 マウスセルトリ細胞 (TM4等）、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞 (VER0- 76等）、 H BT637細胞、 HeLa細胞、 ゥサギ腎臓細胞 (MDCK等)、 ヒト肝臓細胞 (HepG2等)、 マ ウス乳癌細胞 (MMT060562細胞)、 TRI細胞、 MRC細胞、' FS3細胞等がある。
発現ベクターの導入方法としては、 宿主及びべクタ一の種類に依存するが、 細 胞に Dbをコ一ドする DNAを導入できる方法であれば、 いずれも用いることができ る。 原核細胞へベクターを導入する方法としては、 カルシウムイオンを用いる方 法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69: 2110 (1972))、 プロトプラスト法（特閧昭 63-24 829号公報)、 エレクトポーレーシヨン法 (Gene 17: 107 (1982); Molecular&Gene ral Genetics 168: 111 (1979))等があり ；酵母への導入方法としては、 エレクト ポレーシヨン法（Methods in Enzymology, 194: 182 (1990))、 スフエロプラスト 法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 4889 (1984))、 酢酸リチウム法 (J.Bacteriol. 1 53: 163 (1983))等があり ；植物細胞については Agrobacterium法（Gene 23: 315 (1983); W089/05859等）や、 超音波処理による方法 (W091/00358)等が知られる ； 動物細胞へベクタ一を導入する方法としてはエレクトポレーシヨン（ Cytotechnolo gy 3:133 (1990)), リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075号公報)、 リボフヱクシ ヨン法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413 (1987); Virology 52: 456 (節））、 リン酸-カルシウム共沈法、 DEAE-デキストラン法、 微小ガラス管を用いた DNAの 直接注入法等が挙げられる。
上述のようにして取得された形質転換体は、 例えば、 以下の方法で培養するこ とができる。
形質転換体が原核生物や真核微生物である場合は、 培地は該生物が資化し得る 炭素源、 窒素源、 無機塩類等の生育に必要な物質を含有し、 形質転換体の効率的 な培養を可能にするものであれば天然培地、 合成培地のいずれでもよい。 培養は 好気的条件、 嫌気的条件のいずれで行ってもよく、 生育温度、 培地の pH、 生育時 間等の条件は、 用いる形質転換体の種類に応じ適宜当業者により決定され得るも のである。 また、 誘導性のプロモ一夕一を用いた発現べクタ一については、 必要 に応じてィンデユーザーを培地に添加すればよい（例えば、 lacプロモーターであ れば IPTG、 trpプロモータ一であれば IAA等）。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 培地としては TNM- FH培地 (Pharmin gen)ヽ Sf-900 II SFM培地 (Life Technologies), ExCel 1400及び ExCel 1405 (JRH Biosciences)ヽ Grace's Insect Medium( Nature 195: 788 (1962))等を用いること ができ、 必要に応じゲン夕マイシン等の抗生物質を添加してもよい。 形質転換体が動物細胞である場合には、 一般に使用されている RPMI1640培地 (T he Journal of American Medical Association 199: 519 (1967) )、 Eagleの匪 培地（Science 122 : 501 (1952) )、 DMEM培地 (Virology 8: 396 (1959) )、 199培地 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950) )、 ま たは、 これらの培地に BSA等を添加した培地を使用することができる。 培養は通 常の条件、 例えば、 pH6〜8、 30〜40° 5%C02存在下で行うことができる。 この 際、 必要に応じカナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい ( このようにして得られた本発明の Dbは、 宿主細胞内、 または、 シグナル配列を 用いて細胞外に分泌させた場合には培地等から単離し、 実質的に純粋なポリぺプ チドとして精製することもできる。 ポリペプチドの分離、 精製は、 一般的に使用 される、 クロマトグラフィー、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈澱、 溶媒抽 出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動、 透析、 再結晶等の方法を適宜選択し、 必要に応じて組合せることにより行うこと ができる。 クロマトグラフィーとしては、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相ク 口マトグラフィ一、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Pro tein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual , Daniel R.Marshak et al. eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1996 )； Antibo dies : A Laboratoy Course Manual , Harlow and David Lane eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1988) )。 これらのクロマトグラフィ一は、 HPLCや FPL C等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 また、 本発明の Dbは 抗原に対して結合することから、 抗原への結合性を利用して精製することも可能 である。
さらに、 本発明は上述の scDbラィブラリ一の作成方法において用いることがで きる、 （1 )2つの抗体可変領域をコードし、 一方の可変領域と他方の可変領域が制 限酵素切断部位を有するリンカーで結ばれている遺伝子、 及び（11 )2つの抗体可 変領域をコードし、 その両端に制限酵素切断部位を付加した遺伝子に関する。 こ れらの本発明の scDbライブラリ一の作成における材料となる遺伝子の可変領域は 好ましくは、 scFvとして発現されるように重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが長い リンカ一で結合されているものである。 一 '二— '- ( I )または（Π )を含
- む発現べクタ一をバクテリオファージコート蛋白質融合（Smith, Science 228: 13 15 ( 1985) ; Scott and Smith, Science 249: 386 ( 1990) ; Cwirla et al .， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 8: 309 (1990) ; Devlin et al.， Science 249 : 404 ( 1990) ; Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 : 597 ( 1992) ;米国特許第 5, 223,4 09号)等の方法によりファージ粒子表面上にディスプレイさせ、 ディスプレイさ れたぺプチドの表現型により選択することにより、 それをコ一ドする遺伝子も同 時に得られるという点で有利である。
( I )及び（I I )の遺伝子、 または、 該遺伝子を含む抗体ライブラリーを制限酵素処 理し、 連結することで本発明の 4つの抗体可変領域をコードし、 1番目の抗体可 変領域と 2番目の抗体可変領域の間、 及び 3番目の抗体可変領域と 4番目の抗体 可変領域の間に制限酵素切断部位が存在する遺伝子を得ることができる。 このよ うな遺伝子において、 1番目と 2番目の抗体可変領域の間及び 3番目と 4番目の 抗体可変領域の間を短いリンカーで、 2番目と 3番目の抗体可変領域の間を長い リンカ一で結合し、 且つ、 1番目が第一の抗原に対する重鎖可変領域、 2番目が第 二の抗原に対する軽鎖可変領域、 3番目が第二の抗原に対する重鎖可変領域、 そ して 4番目が第一の抗原に対する軽鎖可変領域の順で並んでいると、 これを発現 させた場合に二特異性単鎖ダイァボディを得ることができる。
本発明は、 このような遺伝子を含むベクター及びライブラリ一、 並びに、 該遺 伝子によりコードされるぺプチドを含むものである。
本発明はまた、
(a)抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を、 制限酵素切断部位が 2つ以上存 在する長いリンカーにより結合した抗体ファージライブラリ一を作成する工程、 (b)上記ファージライブラリー又は該ファージライブラリーから調製された可変領 域を含む遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(c )上記処理により得られたフラグメントをセルフライゲ一シヨンすることにより、 可変領域間のリンカーを短いリンカーにする工程
を含む抗体ライブラリー又は発現べクタ一の作成方法を提供する。 この方法によ り、 本発明の scDbラィブラリ一の作成方法を一特異性 Dbへ応用することができ る。 例えば、 ファージライブラリ一構築時にリンカー内に例えば、 下記のような BaMilサイ ト（下線部）を二箇所設けておく。
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyG SerGlyGlyGlyGlySer (配列番号: 3 ) GGTGGTGGT6GATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGTGGTGGATCC (配列番号： 4 ) 次に、 上記ファージライブラリー又は該ファージライブラリーから調製された 可変領域を含む遺伝子 （例えば、 パンニング等で濃縮したそれそれのライブラリ —のファージミ ドあるいは上記ファージライブラリーから PCRを用いて増幅した 遺伝子など） を、 BamHIで処理し、 自己閉環させることでリンカ一の長さを scFv 用の 20残基からダイァボディに最適の 5残基
( "GGTGGTGGTGGATCC (配列番号： 5 ) "
によりコードされる'' GlyGlyGlyGlySer (配列番号： 6 ) " )にすることが出来る。 こうして出来た受容体結合抗体を含む VL-VH断片を適当な発現べク夕一に挿入す ることによって生物活性を指標に Dbをスクリーニングすることが出来る。 例えば、 サイ トカイン受容体に対する抗体ライブラリ一を用いて構築した Dbライブラリー をレトロウイルスベクターに挿入し、 目的サイ トカイン依存性増殖細胞に感染さ せることによってァゴニスト Dbを選択することができる。
本発明の scDbは、 従来知られている多特異性抗体と同様に、 免疫診断、 治療及 び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用である。 例えば、 腫瘍細胞 を殺す等の細胞障害性を誘起するため、 ワクチンアジュバントとして、 血栓溶解 剤等の薬剤を適切に生体内において標的に対して運搬するため、 酵素により活性 化されるプロドラッグを標的部位において確実に変換するため、 感染性の疾患の 治療用に、 細胞表面受容体に対して免疫複合体を誘導するため、 免疫毒素等を腫 瘍細胞等の標的細胞に運搬するため等、 様々な治療目的が考えられる。
このような治療目的で使用される本発明の Dbを含む医薬組成物は、 必要に応じ、 それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、 媒体等と混和して製剤 · 化することができる。 例えば、 滅菌水や生理食塩水、 安定剤、 賦形剤、 酸化防止 剤（ァスコルビン酸等)、 緩衝剤（リン酸、 クェン酸、 他の有機酸等)、 防腐剤、 界 面活性剤 (PEG、 Tween等)、 キレート剤 (EDTA等)、 結合剤等を挙げることができる c また、 その他の低分子量のポリペプチド、 血清アルブミン、 ゼラチンや免疫グロ プリン等の蛋白質、 グリシン、 グルタミン、 ァスパラギン、 アルギニン及ぴリシ ン等のアミノ酸、 多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、 マンニトールやソルビトー ル等の糖アルコールを含んでいてもよい。 注射用の水溶液とする場合には、 例え ば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、 例えば、 D-ソルビトー ル、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリウムが挙げられ、 適当な溶角军補 助剤、 例えばアルコール（エタノール等）、 ポリアルコール（プロピレングリコ一ル、 PEG等)、 非イオン性界面活性剤（ポリソルベート 80、 HC0- 50)等と併用してもよい c また、 必要に応じ本発明の Dbをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセル口一 ス、 ゼラチン、 ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、 コロイ ドドラッグデリバリ一システム（リボソーム、 アルブミンミクロスフエア、 マイクロエマルジヨン、 ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる ("Remi ngton' s Pharmaceutical Science 16th edition" , Oslo Ed. ( 1980)等参照）。 さら に、 薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、 本発明の Dbに適用し得る（Lan ger et al.， J. Biomed.Mater.Res. 15 : 167-277 ( 1981 ) ; Langer, chem. Tech. 1 2 : 98-105 (1982) ;米国特許第 3, 773, 919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481号; Sidman et al. , Biopolymers 22 : 547-556 ( 1983) ;EP第 133， 988号）。
患者への投与は、 好ましくは注射や点滴により行われ、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射等のほか、 鼻腔内、 経気管支、 筋内、 経皮または経口等の 経路により当業者に公知の方法により行い得る。 投与量は、 患者の体重、 年齢、 疾病の種類、 症状、 投与方法等の種々の要因により変化するが、 当業者であれば 適当な投与量を適宜選択することができる。
また、 本発明の Dbをコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺伝 子治療を行うことも考えられる。 投与方法としては、 nakedプラスミドによる直 接投与の他、 リボソーム等にパッケージングするか、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 ボックスウィルスべク 夕一、 アデノウイルス関連ベクター、 HVJベクタ一等の各種ウィルスベクタ一と して形成するか (Adolph『ウィルスゲノム法』 ， CRC Press, Florid ( 1996 )参照）、 または、 コロイ ド金粒子等のビーズ担体に被覆 (W093/17706等）して投与すること ができる。 しかしながら、 生体内において Dbが発現され、 その作用を発揮できる 限りいかなる方法により投与してもよい。 好ましくは、 適当な非経口経路 (静脈内、 腹腔内、 皮下、 皮内、 脂肪組織内、 乳腺組織内、 吸入または筋肉内の経路を介す る注射、 注入、 またはガス誘導性粒子衝撃法 (電子銃等による）、 添鼻薬等粘膜経 路を介する方法等）により十分な量が投与される。 ex においてリボソームト ランスフヱクシヨン、 粒子衝撃法 (米国特許第 4, 945，050号）、 またはウィルス感 染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、 該細胞を動物に再導入す ることにより本発明の Dbをコードする遺伝子を投与してもよい。
本発明の Dbは酵素免疫分析に用いることもできる。 このためには、 Dbの一方 の抗体可変領域は酵素上の酵素活性を阻害しないェピトープを、 そして他方は担 体に結合するような担体を認識するように設計する。 例えば、 IgG、 フェリチン、 HRP及びホルモン等を認識する Dbを挙げることができる。
また、 本発明の Dbは i/2 vivo及 Χ in w'troにおける種々の疾病の免疫診断に 用いることも可能である。 例えば、 Dbの一方の抗体可変領域を腫瘍細胞に特異的 な抗原等を認識するようにし、 他方は検出可能なマーカ一に結合するように設計 することができる。 検出可能なマ一力一としては放射性同位体 (例えば、 ¾、 14C、 32P、 35S、 1251等）、 蛍光色素（フルォレセイン、 ルシフェリン等)、 化学ルミネセン ス化合物（ィソチオシァネート、 ローダミン等）、 アルカリホスファタ一ゼ、 -ガ ラクトシダーゼ、 HRP等の汎用の酵素等を挙げることができ、 Dbのこれらの物質 との結合及び検出は公知の方法に従って行うことができる（Hunter et al .， Natur e 144: 945 ( 1962) ; David et al. , Biochemistry 13 : 1014 (1974) ; Pain et a 1· , J. Immunol . Me th. 40 : 219 (1981 ) ; Nygen, J.Histochem and Cytochem 30 : 4 07 (1982)参照）。
このように検出可能な物質に対して反応性を有する本発明の Dbは、 拮抗的結合 分析、 直接的及び間接的なサンドイッチ免疫分析 (ELISA等)、 免疫沈降分析 (Zola, "Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques", pp.147-158, CRC Press I nc. (1987) )等を含む、 種々の分析において用いることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗原 A、 Bに対する二特異性 scDbライブラリ一の構築方法を概略的に 示す図である。
図 2は、 ファ一ジ抗体ラィブラリ一からの Dbライブラリ一の構築方法を概略的 に示す図である。 産業上の利用の可能性
本発明により、 新規な二特異性 scDbライブラリーの構築法が提供される。 本発 明の方法により、 二特異性 scDbラィブラリ一を scFvのファージライブラリ一か ら煩雑な処理なしに一括処理により作成することができる。 また、 本発明は、 フ ァ一ジ抗体ラィブラリ一からパニング等によって濃縮した抗体ク口一ンを一括し て動物細胞用の発現ベクターに移す方法を提供するものである。

Claims

請求の範囲
I . 2つの抗体可変領域をコードし、 一方の抗体可変領域と他方の抗体可変領域 が制限酵素切断部位を有するリンカーで結ばれている遺伝子。
2 . リンカーに制限酵素切断部位が 2つ以上存在することを特徴とする請求項 1 記載の遺伝子。
3 . 2つの抗体可変領域の一方が重鎖可変領域であり、 他方が軽鎖可変領域であ る請求項 1または 2記載の遺伝子。
4 . 2つの抗体可変領域が長いリンカ一で結ばれていることを特徴とする請求項
1〜 3のいずれか記載の遺伝子。
5 . 2つの抗体可変領域をコードし、 その両端に制限酵素切断部位を付加した遺 伝子。
6 . 2つの抗体可変領域の一方が重鎖可変領域であり、 他方が軽鎖可変領域であ る請求項 5記載の遺伝子。
7 . 2つの抗体可変領域をコードする遺伝子が長いリンカ一で結ばれていること を特徴とする請求項 5または 6記載の遺伝子。
8 . 4つの抗体可変領域をコードし、 1番目の抗体可変領域と 2番目の抗体可変 領域の間、 及び 3番目の抗体可変領域と 4番目の抗体可変領域の間に制限酵 素切断部位が存在することを特徴とする遺伝子。
9 . 1番目と 2番目の抗体可変領域の間及び 3番目と 4番目の抗体可変領域の間 が短いリンカーで結ばれ、 2番目と 3番目の抗体可変領域の間が長いリンカ
—で結ばれていることを特徴とする請求項 8記載の遺伝子。
1 0 . 4つの抗体可変領域が第一の抗原に対する重鎖可変領域、 第一の抗原に対 する軽鎖可変領域、 第二の抗原に対する重鎖可変領域、 第二の抗原に対す る軽鎖可変領域である請求項 8〜 9記載の遺伝子。
I I . 第一の抗原に対する軽鎖可変領域、 第二の抗原に対する重鎖可変領域、 第 二の抗体に対する軽鎖可変領域、 第一の抗原に対する重鎖可変領域の順に 並んでいる請求項 1 0記載の遺伝子。
1 2 . 以下の工程を含む二特異性単鎖ダイァボディをコードする遺伝子の作成方 法
(a)請求項 1〜4記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、
(b)請求項 5〜 7記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(c) (b)の工程で作成した遺伝子を、 （a)の工程で作成した遺伝子の間に挿入す る工程、
を含む方法。
1 3 . 請求項 1〜1 1いずれかの記載の遺伝子によりコードされるペプチド。
1 4 . 請求項 1〜 1 1のいずれか記載の遺伝子を含む抗体ライブラリ一。
1 5 . 以下の工程を含む抗体ライブラリ一又は発現ベクターの作成方法。
(a)第一の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を、 制限酵素部位を含む 長いリンカ一により結合した抗体ファージライブラリーを作成する工程、
(b)第二の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域が長いリンカーで結ばれ、 それそれの可変領域のリンカーが付加していない側に制限酵素部位が存在 している抗体ファージライブラリ一を作成する工程、
(c ) (a)及び (b)で作成したファージライブラリ一又は該ファージライブラリー から調製された可変領域を含む遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(d)上記処理により得られたフラグメントをライゲーシヨンすることにより、 第一の抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間に、 第二の抗原に対 する重鎖可変領域と軽鎖可変領域が挿入されたフラグメントを作成するェ 程。
1 6 . 以下の工程を含む抗体ライブラリー又は発現ベクターの作成方法
(a)請求項 1〜 4記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、
(b)請求項 5〜 7記載のいずれかの遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び (c) (b)の工程で作成した遺伝子を、 （a)の工程で作成した遺伝子の間に挿入す る工程。
. 以下の工程を含む抗体ライブラリー又は発現べクタ一の作成方法、
(a)抗原に対する軽鎖可変領域と重鎖可変領域を、 制限酵素切断部位が 2っ以 上存在する長いリンカ一により結合した抗体ファ一ジライブラリーを作成 する工程、
(b)上記ファージライブラリー又は該ファージライブラリーから調製された可 変領域を含む遺伝子を制限酵素で処理する工程、 及び
(c )上記処理により得られたフラグメントをセルフライゲ一シヨンすることに より、 可変領域間のリンカーを短いリンカーにする工程。
. 請求項 1〜1 1いずれか記載の遺伝子を含む発現べクタ一。
PCT/JP2003/004773 2002-04-15 2003-04-15 Procede d'elaboration d'une banque scdb WO2003087163A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003227504A AU2003227504A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 METHOD OF CONSTRUCTING scDb LIBRARY
AT03717592T ATE512989T1 (de) 2002-04-15 2003-04-15 Verfahren zur herstellung von scdb-bibliotheken
US10/510,971 US8030461B2 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Methods for constructing scDb libraries
JP2003584118A JP4386741B2 (ja) 2002-04-15 2003-04-15 ｓｃＤｂライブラリーの作成方法
EP03717592A EP1500665B1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 METHODS FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-112369 2002-04-15
JP2002112369 2002-04-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003087163A1 true WO2003087163A1 (fr) 2003-10-23

Family

ID=29243316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/004773 WO2003087163A1 (fr) 2002-04-15 2003-04-15 Procede d'elaboration d'une banque scdb

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8030461B2 (ja)
EP (1) EP1500665B1 (ja)
JP (1) JP4386741B2 (ja)
AT (1) ATE512989T1 (ja)
AU (1) AU2003227504A1 (ja)
WO (1) WO2003087163A1 (ja)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8030461B2 (en) 2002-04-15 2011-10-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for constructing scDb libraries
US8062635B2 (en) 2003-10-10 2011-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody substituting for functional proteins
US8337841B2 (en) 2003-01-21 2012-12-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of screening for antibody light chains
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9334331B2 (en) 2010-11-17 2016-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US10759870B2 (en) 2017-09-29 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multispecific antigen-binding molecules having blood coagulation factor VIII (FVIII) cofactor function-substituting activity and pharmaceutical formulations containing such a molecule as an active ingredient
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US11150254B2 (en) 2014-09-26 2021-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring reactivity of FVIII
US11214623B2 (en) 2014-09-26 2022-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody capable of neutralizing substance having activity alternative to function of coagulation factor VIII (FVIII)
US11352438B2 (en) 2016-09-06 2022-06-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor IX and/or activated coagulation factor IX and coagulation factor X and/or activated coagulation factor X
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1561759B9 (en) * 2002-10-11 2009-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death-inducing agent
AU2003271186A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
AU2004297109A1 (en) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death inducing agent
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
EP1757686A4 (en) * 2004-04-09 2008-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd INDUCER OF CELL DEATH
CA2957144C (en) * 2005-04-08 2020-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
JP5224580B2 (ja) * 2005-06-10 2013-07-03 中外製薬株式会社 ｓｃ（Ｆｖ）２部位特異的変異体
CL2007002057A1 (es) * 2006-07-13 2008-01-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Diacuerpo anti-antigeno leucocitario humano (hla), usos del diacuerpo para preparar un medicamento util como inductor de muerte celular, supresor del crecimeinto celular o como agente antitumoral.
AU2008328779B2 (en) 2007-11-27 2014-06-05 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against HER2 and polypeptides comprising the same for the treatment of cancers and/or tumors
EP2361936B1 (en) * 2010-02-25 2016-04-20 Affimed GmbH Antigen-binding molecule and uses thereof
RU2613368C2 (ru) * 2011-07-22 2017-03-16 Аффимед Гмбх Поливалентная антиген-связывающая fv-молекула
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
TWI777174B (zh) 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2016001810A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
KR102612313B1 (ko) 2014-07-21 2023-12-12 노파르티스 아게 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
ES2781175T3 (es) 2014-07-31 2020-08-31 Novartis Ag Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico
US10851149B2 (en) 2014-08-14 2020-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using GFR α-4 chimeric antigen receptor
JP7084138B2 (ja) 2014-08-19 2022-06-14 ノバルティス アーゲー 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ）
CN114621969A (zh) 2014-09-17 2022-06-14 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
MA40035A (fr) 2014-10-14 2016-04-21 Dana Farber Cancer Inst Inc Molécules d'anticorps de pd-l1 et leurs utilisations
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
CN114958764A (zh) 2015-04-08 2022-08-30 诺华股份有限公司 Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体（car）表达细胞的联合疗法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CA3007421A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
WO2017106656A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
MA55746A (fr) 2016-01-21 2022-03-02 Novartis Ag Molécules multispécifiques ciblant cll-1
CA3016287A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
PL3443096T3 (pl) 2016-04-15 2023-06-19 Novartis Ag Kompozycje i sposoby do selektywnej ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych
US20210177896A1 (en) 2016-06-02 2021-06-17 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
EP3484455A2 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Novartis AG Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN118021943A (zh) 2016-07-28 2024-05-14 诺华股份有限公司 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
KR20190036551A (ko) 2016-08-01 2019-04-04 노파르티스 아게 Pro-m2 대식세포 분자의 억제제를 병용하는, 키메라 항원 수용체를 이용한 암의 치료
AR110676A1 (es) 2016-10-07 2019-04-24 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
AU2018290237A1 (en) 2017-06-22 2020-01-16 Novartis Ag Antibody molecules to CD73 and uses thereof
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
CN111278858A (zh) 2017-07-11 2020-06-12 指南针制药有限责任公司 结合人cd137的激动剂抗体及其用途
US20200172617A1 (en) 2017-07-20 2020-06-04 Novartis Ag Dosage regimens of anti-lag-3 antibodies and uses thereof
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
KR20200089286A (ko) 2017-11-16 2020-07-24 노파르티스 아게 조합 요법
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
TW202003580A (zh) 2018-05-21 2020-01-16 美商坎伯斯治療有限責任公司 用於增強nk細胞對標靶細胞之殺死之組合物及方法
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
EP3806962A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Novartis AG Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
US20210238268A1 (en) 2018-06-19 2021-08-05 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
CN113166269A (zh) 2018-11-13 2021-07-23 指南针制药有限责任公司 对抗检查点分子的多特异性结合构建体及其用途
AU2019402189B2 (en) 2018-12-20 2023-04-13 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
MX2021007391A (es) 2018-12-20 2021-09-23 Novartis Ag Regimenes de baja dosis extendida para inhibidores de mdm2.
KR20210129671A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 3-(1-옥소-5-(피페리딘-4-일)이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
EP3924055B1 (en) 2019-02-15 2024-04-03 Novartis AG Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
EP3927371A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Novartis AG Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
SG11202110732XA (en) 2019-03-29 2021-10-28 Atarga Llc Anti fgf23 antibody
BR112022007179A2 (pt) 2019-10-21 2022-08-23 Novartis Ag Inibidores de tim-3 e usos dos mesmos
TW202128166A (zh) 2019-10-21 2021-08-01 瑞士商諾華公司 組合療法
JP2023503163A (ja) 2019-11-26 2023-01-26 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体及びその使用
EP4077389A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novartis AG Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
CN114980902A (zh) 2020-01-17 2022-08-30 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓增生异常综合征或慢性粒单核细胞白血病的包含tim-3抑制剂和低甲基化药物的组合
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
KR20220147109A (ko) 2020-02-27 2022-11-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
TW202216761A (zh) 2020-07-16 2022-05-01 瑞士商諾華公司 抗β細胞素抗體、其片段及多特異性結合分子
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
US20240002509A1 (en) 2020-11-06 2024-01-04 Novartis Ag ANTIBODY Fc VARIANTS
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4284510A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Novartis AG Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US20230383010A1 (en) 2022-02-07 2023-11-30 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1993017706A1 (en) 1992-03-11 1993-09-16 Agracetus, Inc. Genetic vaccine for immunodeficiency viruses

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU5509296A (en) 1995-05-03 1996-11-21 Colin Henry Self Bispecific antibodies in which the binding capability is rev ersibly inhibited by a photocleavable moiety
ES2246069T3 (es) 1997-05-02 2006-02-01 Genentech, Inc. Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EP1238080A2 (en) 1999-12-14 2002-09-11 The Burnham Institute Bcl-g polypeptides, encoding nucleic acids and methods of use
DE60132075T2 (de) 2000-03-22 2009-03-12 Curagen Corp., New Haven Wnt-1 verwandte polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren
AU2002319402B2 (en) * 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
AU2003227504A1 (en) 2002-04-15 2003-10-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD OF CONSTRUCTING scDb LIBRARY
WO2004065611A1 (ja) * 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
WO2004111233A1 (ja) * 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1993017706A1 (en) 1992-03-11 1993-09-16 Agracetus, Inc. Genetic vaccine for immunodeficiency viruses

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADOLPH: "Virus Genome Methods", 1996, CRC PRESS
ANDRIS-WIDHOPF J. ET AL.: "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 242, 2000, pages 159 - 181, XP004210719 *
CWIRLA ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 8, 1990, pages 309
DANIEL R. MARSHAK ET AL.: "Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual", 1996, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
DAVID ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 13, 1974, pages 1014
DENARDO D.G. ET AL.: "Anti-HLA-DR/anti-DOTA diabody construction in modular gene design platform: bispecific antibodies for pretargeted radioimmunotherapy", CANCER BIOTHERAPY & RADIOPHARMACEUTICALS, vol. 16, no. 6, 2001, pages 525 - 535, XP008022084 *
DEVLIN ET AL., SCIENCE, vol. 249, 1990, pages 404
HAMMERLING ET AL., J. EXP. MED., vol. 128, 1968, pages 1461 - 1473
HARLOW AND DAVID LANE: "Antibodies: A Laboratory Course Manual", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
HOLLIGER P. ET AL.: "Diabodies, small bivalent and bispecific antibody fragments", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448, XP002008022 *
HUNTER ET AL., NATURE, vol. 144, 1962, pages 945
LANGER ET AL., J. BIOMED. MATER. RES., vol. 15, 1981, pages 167 - 277
LANGER, CHEM. TECH., vol. 12, 1982, pages 98 - 105
LE DOUSSAL ET AL., INT. J. CANCER SUPPL., vol. 7, 1992, pages 58 - 62
LE DOUSSAL ET AL., J. NUCL. MED., vol. 34, 1993, pages 1662 - 1671
MCGUINNESS B.T. ET AL.: "Phage diabody repertoires for selection of large number of bispecific antibody fragments", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 14, no. 9, 1996, pages 1149 - 1154, XP002100039 *
MCGUINNESS ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 14, 1996, pages 1149 - 1154
NATURE, vol. 195, 1962, pages 788
NYGEN, J. HISTOCHEM. CYTOCHEM., vol. 30, 1982, pages 407
OSLO: "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", 1980
PAIN ET AL., J. IMMUNOL. METH., vol. 40, 1981, pages 219
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SCOTT; SMITH, SCIENCE, vol. 249, 1990, pages 386
SEGAL ET AL.: "Biologic Therapy of Cancer", vol. 2
SEGAL; SNIDER, CHEM. IMMUNOL., vol. 47, 1989, pages 179 - 213
SIDMAN ET AL., BIOPOLYMERS, vol. 22, 1983, pages 547 - 556
SMITH, SCIENCE, vol. 228, 1985, pages 1315
SONGSIVILAI ET AL., CLIN. EXP. IMMUNOL., vol. 79, 1990, pages 315 - 321
STICKNEY ET AL., CANCER RES., vol. 51, 1991, pages 6650 - 6655
TANG Y. ET AL.: "Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 26, 1996, pages 15682 - 15686, XP002962142 *
THE JOURNAL OF AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
TURNER D.J. ET AL.: "Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimization of peptide sequence using pohage display technology", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 205, 1997, pages 43 - 54, XP004082109 *
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396
VOLKEL ET AL., PROT. ENGINEERING, vol. 14, no. 10, 2001, pages 815 - 823
WELLS; LOWMAN, CURR. OPIN. STRUCT. BIOL., vol. 2, 1992, pages 597
ZOLA: "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", 1987, CRC PRESS INC., pages: 147 - 158

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8030461B2 (en) 2002-04-15 2011-10-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for constructing scDb libraries
US8337841B2 (en) 2003-01-21 2012-12-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of screening for antibody light chains
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
US8062635B2 (en) 2003-10-10 2011-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody substituting for functional proteins
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US11168344B2 (en) 2005-03-31 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US10934344B2 (en) 2006-03-31 2021-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11248053B2 (en) 2007-09-26 2022-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9334331B2 (en) 2010-11-17 2016-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies
US10450381B2 (en) 2010-11-17 2019-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treatment that include the administration of bispecific antibodies
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US11001643B2 (en) 2014-09-26 2021-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US11150254B2 (en) 2014-09-26 2021-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring reactivity of FVIII
US11214623B2 (en) 2014-09-26 2022-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody capable of neutralizing substance having activity alternative to function of coagulation factor VIII (FVIII)
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
US11352438B2 (en) 2016-09-06 2022-06-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor IX and/or activated coagulation factor IX and coagulation factor X and/or activated coagulation factor X
US10759870B2 (en) 2017-09-29 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multispecific antigen-binding molecules having blood coagulation factor VIII (FVIII) cofactor function-substituting activity and pharmaceutical formulations containing such a molecule as an active ingredient

Also Published As

Publication number Publication date
EP1500665B1 (en) 2011-06-15
AU2003227504A1 (en) 2003-10-27
US8030461B2 (en) 2011-10-04
US20070087381A1 (en) 2007-04-19
EP1500665A4 (en) 2006-05-24
EP1500665A1 (en) 2005-01-26
JPWO2003087163A1 (ja) 2005-08-18
ATE512989T1 (de) 2011-07-15
JP4386741B2 (ja) 2009-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2003087163A1 (fr) Procede d&#39;elaboration d&#39;une banque scdb
US10501737B2 (en) Method for producing antigen-binding molecule using modified helper phage
CA2544562C (en) Bispecific antibodies
JP4794301B2 (ja) 抗体の製造方法
US20120184716A1 (en) Methods for the Generation of Multispecific and Multivalent Antibodies
CA2978381A1 (en) Chimeric antigen receptor (car) comprising a cd19-binding domain
JP2018537415A (ja) 多価Ｆｖ抗体
BR112021005472A2 (pt) molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável do anticorpo alterada
US20050207977A1 (en) Multimeric protein engineering
CA2177988A1 (en) Expression vector for preparing an anti-body-variable-region library
EP1032660A1 (en) Method of identifying binding site domains that retain the capacity of binding to an epitop
WO2007108152A1 (ja) 高機能性二重特異性抗体
KR20190139909A (ko) 항-pd-l1/항-pd-1 천연 항체 구조-유사 헤테로다이머 이중특이성 항체 및 그의 제조
JPH05500310A (ja) 融合蛋白質の製造方法
CN113195530A (zh) 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
Leong et al. Preparing recombinant single chain antibodies
CN114340668A (zh) 结合于cd38和cd3的异源二聚抗体
US20220354962A1 (en) Rapid production of bispecific antibodies from off-the-shelf iggs with high yield and purity
US20090104660A1 (en) Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment
CN104558181A (zh) 靶向b淋巴瘤细胞的人源单链抗体
CN113993886A (zh) 可活化多特异性抗原结合蛋白复合物
WO2024027120A1 (en) Multi-specific polypeptide complexes
Weichel et al. TandAbs: potent and well-manufacturable bi-specific antibodies
Bakshi Engineering single domain antibodies into antivirals and vaccine delivery vehicles to combat infectious diseases
Remy et al. Design and selection of anti-PD-L1 single-domain antibody and tumor necrosis factor superfamily ligands for an optimal vectorization in an oncolytic virus

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003584118

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003717592

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003717592

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007087381

Country of ref document: US

Ref document number: 10510971

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10510971

Country of ref document: US