WO2003055903A1 - Gene et peptide regulateurs de transcription - Google Patents

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WO2003055903A1
WO2003055903A1 PCT/JP2002/013443 JP0213443W WO03055903A1 WO 2003055903 A1 WO2003055903 A1 WO 2003055903A1 JP 0213443 W JP0213443 W JP 0213443W WO 03055903 A1 WO03055903 A1 WO 03055903A1
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amino acid
gene
acid sequence
seq
peptide
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PCT/JP2002/013443
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Masaru Takagi
Keiichirou Hiratsu
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Definitions

  • the present invention provides a peptide or protein having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor, a gene encoding the peptide or protein, a chimera protein in which the peptide or protein is linked to a transcription factor, A chimeric gene in which a gene encoding the peptide or protein is linked to a gene encoding a transcription factor;
  • the present invention relates to a recombinant vector having a mela gene, and a transformant containing the recombinant vector.
  • antisense DNA or RNA complementary to a specific site such as a target gene whose transcription is to be suppressed or mRNA transcribed therefrom is used, but the prepared antisense DNA or RNA is not used. It cannot be used to suppress the expression of genes other than the target gene, and it is necessary to prepare new antisense DNA or RNA for other target genes in accordance with the sequence.
  • the ribozyme in order to cleave a target DNA or mRNA by a ribozyme, the ribozyme has a complementary sequence for binding to the target DNA or mRNA, and is capable of cutting at a predetermined position with force. Need to be designed.
  • the ribozyme even if the ribozyme is designed to cleave the target gene, for example, the ribozyme may be ligated to a promoter such as the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus and a transcription termination sequence to introduce the transfer vector. When constructed, and actually introduced into plant cells, extra sequences may be added to the transcribed ribozyme and the ribozyme activity may be lost.
  • the identification of the target gene and the base Sequence determination was essential.
  • there is a method of suppressing gene expression by a gene knockout method but this method was not applicable to, for example, diploid plants.
  • the subject of the present invention is simple and widely applicable without having to design DNA or RNA each time according to the nucleotide sequence of a target gene as in the conventional antisense method or ribozyme method. It is an object of the present invention to provide a means for suppressing transcription of a gene. Another object of the present invention is to further advance research on the above-described transcription repressor protein and to determine the most basic amino acid sequence portion actually required when performing gene transcription repression, An object of the present invention is to provide a peptide and a gene thereof for more easily performing transcription suppression. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on the proteins having the above-mentioned common motif to solve the above-mentioned problems.As a result, the protein that suppresses gene transcription may be a peptide having an extremely simple structure, We have made the surprising discovery that peptides with these simple structures have the function of converting transcription factors into transcription repressors.
  • Arabidopsis SUPERMAN hereinafter sometimes referred to as SUP
  • SUP Arabidopsis SUPERMAN
  • a chimeric gene in which a gene encoding the SUPERMAN protein is linked to a gene encoding a transcription factor produces a protein having a strong transcription repressing ability. Reached.
  • the present invention includes the following inventions.
  • X 1 represents 0 to 10 amino acid residues
  • X 2 represents Asn or G 1 u
  • X 3 represents at least 6 amino acid residues.
  • Y U represents 0 to 10 amino acid residues, 2 represents 11 e or I 1 e, and Y 3 represents at least 6 amino acid residues.
  • Z4 represents G1u, G1n, or Asp.
  • a protein having any one of the following amino acid sequences (a) to (d) and having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor:
  • X 1 represents 0 to 10 amino acid residues
  • X 2 represents Asn or G 1 u
  • X 3 represents at least 6 amino acid residues.
  • a double-stranded DNA comprising a part encoding the peptide or protein according to any one of the above (1) to (5), and having a restriction enzyme site at both ends.
  • a chimeric gene obtained by linking the gene according to any one of the above (6) to (10) with a gene encoding a transcription factor.
  • FIG. 1 is a diagram showing a procedure for constructing a GAL4DB-RD effector plasmid containing various DNA fragments to be tested.
  • FIG. 2 shows the first half of the procedure for constructing the reporter gene p35S-GAL4-LUC.
  • FIG. 3 is a diagram showing the latter half of the procedure for constructing the reporter gene P35S-GAL4-LUC.
  • FIG. 4A is a diagram showing a reporter gene and effector plasmid.
  • 5XGAL4 GAL4 transcription factor DNA binding sequence
  • TATA CaMV35S open motor region containing TATA box
  • LUC Luciferase gene
  • CaMV 35S Force reflower mozaic virus 35S protein gene promoter
  • GAL4DB Enzyme GAL4 transcription factor DNA binding domain coding region
  • Nos Nopaline synthase gene transcription termination region.
  • Figure 4B shows that various peptides bound to PGAL4DB have reporter gene activity.
  • FIG. 5 is a diagram showing a procedure for constructing effector plasmid pGAL4DB-SUP.
  • FIG. 6 is a diagram showing the procedure for constructing effector plasmid pAtERF5.
  • FIG. 7 is a diagram showing the first half of the procedure for constructing reporter plasmid pGAL4-GCC-LUC.
  • Figure 8 shows the second half of the procedure for building the reporter plasmid pGAL4-GCC-LUC.
  • Figure 9A shows the structure of 35S-GAL4-LUC integrated into plasmid as a reporter gene and its integration as an effector gene in a transcriptional repression test.
  • FIG. 9B shows the results of a transcriptional repression test using the SUP gene and a fragment thereof.
  • FIG. 10A shows the outline of the structure of GAL4-GCC-LUC used as a reporter and the structure of an effector gene constructed by incorporating AtERF5, GAL4DB, GAL4DB-SUP, and GAL4DB175 / 204SUP in a transcription suppression test.
  • FIG. 10A shows the outline of the structure of GAL4-GCC-LUC used as a reporter and the structure of an effector gene constructed by incorporating AtERF5, GAL4DB, GAL4DB-SUP, and GAL4DB175 / 204SUP in a transcription suppression test.
  • FIG. 10B is a diagram showing the results of a transcription suppression test using each effector.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of examining the effect of suppressing the transcriptional activation function of EIN3 by the SUP gene and the ERF3 gene on the basis of the stem length of plants and the degree of root elongation in the presence of an ethylene precursor.
  • FIG. 12 is a photograph showing the results of examining the inhibitory effect of the SUP gene and the ERF3 gene on the transcriptional activation function of EIN3 in plants by the degree of plant growth in the presence of ethylene.
  • FIG. 4 presents photographs showing the results of examining the effect of suppressing the expression of BCHN and ERF1 genes by Northern plot hybridization using the presence or absence of detection of mRNA indicating the expression of these ethylene-inducible genes as an index.
  • Figure 14 shows the plasmids used to transform Arabidopsis plants.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of p35S :: CUC1SRD.
  • Fig. 15 shows the results of the wild type (Col-0), the cucl / cuc2 double mutant (cucl / cuc2), and the plant transformed with p35S :: CUC1SRD (35S :: CUC1SRD) from day 5 after germination. It is a photograph of the cotyledon part of the leaf body on day 10.
  • Fig. 16 shows Arabidopsis plant transformants using pEIN3SRDl.
  • FIG. 2 is a photograph showing the morphology of plant stems and roots observed in the presence of ethylene in (35S :: EIN3SRD1) and the same transformant (35S :: EIN3RD1) by EIN3RD1.
  • Figure 1 7 is Arabidopsis thaliana transformants by P EIN3SRD1
  • FIG. 2 is a photograph showing the degree of plant growth observed in the presence of ethylene in (35S :: EIN3RD1) and the same transformant (35S :: EIN3RD1) by EIN3RD1.
  • FIG. 18A is a photograph of each germinated material obtained by growing p35S :: PAP1SRDX-transformed Arabidopsis thaliana plants and a wild strain in an MS medium containing 3% sucrose.
  • FIG. 18B is an electrophoretic photograph showing the result of analyzing the expression of the DFR gene in the above-mentioned plant by RT-PCR.
  • FIG. 19A is a photograph of leaves of an Arabidopsis thaliana plant transformed with p35S :: AtMYB23SRDX and a wild strain.
  • FIG. 19B is an electrophoretic photograph showing the result of analyzing the expression of the trichome-generating gene in the above-mentioned plant by RT-PCR.
  • the present invention will be described in more detail.
  • the present invention provides a peptide having an amino acid sequence represented by the following formula (I) and having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor.
  • the number of amino acid residues for X1 may be 0 to 10; however, from the viewpoint of easy synthesis of the peptide to be used, the shorter the number, the better the number is 10. Or less, more preferably 5 or less.
  • X3 the number of amino acid residues in X3 is important, it was surprisingly found that at least 6 amino acids would exhibit the above function. Furthermore, any kind of amino acid may be used for X 1 and X 3.
  • the common motif (L / F) DLN ( L / F) (X) P (proline) is not necessary among P, and may simply be alanine.
  • the sequence of only LDLNL (Leu-Asp-Leu-Asn-Leu) or LDLN (Leu-Asp-Leu-Asn) does not show the above function
  • X2 has 5 or 6
  • the one designed to have 3 amino acid residues does not show the above-mentioned function, whereas the one designed to have 3 amino acid residues does not show the above-mentioned function.
  • the present invention also provides a peptide having an amino acid sequence represented by the following formula (II) and having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor.
  • Y 1 represents 0 to 10 amino acid residues
  • Y 2 represents Phe or I 1 e
  • Y 3 represents at least 6 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues for Y1 should be 0 to 10, but from the viewpoint of ease of synthesis of the peptide to be used, the shorter the better, the better. 0 or less, more preferably 5 or less.
  • the present invention further provides a peptide having an amino acid sequence represented by the following formula ( ⁇ ) and having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor.
  • Z 1 represents L eu or A sp—L eu or L eu—A sp—L eu
  • Z2 represents G1u or G1n or Asp
  • Z3 represents 0 to 10 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues for Z3 may be 0 to 10; however, in view of the ease of synthesis of the peptide to be used, shorter is better, and 10 is more preferable. Or less, more preferably 5 or less.
  • Z3 include, for example, G, GFF, GFA, GYY, AAA, and the like, but are not limited thereto.
  • the peptide represented by (III) has a DLELRL motif different from the common motif (L / F) DLN (L / F) (X) P of the peptide shown in the prior art, It corresponds to the 1st to 20th amino acid sequence (Asp-Leu-Glu-Leu-Arg-Leu).
  • the total number of peptides is preferably at most 20 amino acids in total in view of the ease of peptide synthesis. For example, the following peptides are exemplified.
  • the peptide having a function of converting the transcription factor of the present invention into a transcription repressor may be a peptide having a minimum sequence of Asp-Leu-Glu-Leu-Arg-Leu.
  • glutamic acid (E) in the minimum sequence may be replaced with glutamine (Q) or aspartic acid (D).
  • glutamine (Q) or aspartic acid (D) For example, Leu—Asp—Leu—Gin—Leu—Arg—Leu—Gly-
  • the peptide of Tyr-Tyr Asp-Leu-Asp-Leu-Arg-Leu has a very excellent transcriptional repressing effect.
  • the sequence Leu-Glu-Leu-Arg-Leu has no transcription repressing function.
  • the present invention provides a protein having any one of the following amino acid sequences (a) to (d) and having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor. It is.
  • ⁇ 1 to several '' in the above ⁇ amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 (or SEQ ID NO: 61) '' is particularly Is not limited, but means, for example, about 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
  • the deletion, substitution, or addition of the amino acid can be performed by modifying a gene encoding the protein by a method known in the art.
  • Mutagenesis can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method analogous thereto.
  • a mutagenesis kit using a site-directed mutagenesis method for example, Mutant- K (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)
  • TAKARA LA in vitro
  • the SUP protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 and the gene encoding the same are known per se.
  • the 195th to 199th sequence (corresponding to the base sequence 585 to 597) of the amino acid sequence is leucine (L) -aspartic acid (D) -leucine (L) monoglutamic acid (E) -leucine (L)
  • a proline residue is not included at the 3 terminal downstream side of this sequence, and an amino acid sequence different from the motif (L / ⁇ ) DLN (L / F) (X) P shown in the above-mentioned prior art is used.
  • the protein used for converting a transcription factor into a transcription repressor in the present invention is not limited to a protein having the full-length amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, but may be a protein having a partial sequence thereof. Or it may be a peptide.
  • a protein having the partial sequence for example, shown in SEQ ID NO: 61
  • a protein having an amino acid sequence (the amino acid sequence at the 175th to the 2nd-4th position of the SUP protein) is exemplified, and a peptide having a partial sequence thereof is the peptide represented by the above (III).
  • a chimeric protein in which any one of the above peptides or proteins is linked to a transcription factor a chimeric gene in which a gene encoding any one of the above peptides or proteins is linked to a gene encoding a transcription factor Is also provided.
  • a transformant transformed with the recombinant vector containing the chimeric gene a chimeric protein corresponding to the chimeric gene is produced.
  • the transcription factor-derived DNA-binding region of the chimeric protein binds to the target gene. In this case, the function of the transcription factor is converted to a transcription repressing function, transcription of the target gene is suppressed, and expression of the target gene Does not happen.
  • the transcription repressing function of the chimeric protein of the present invention acts regardless of the type of gene. Since the transcription suppression function of the chimeric protein of the present invention requires binding to a target gene, the gene encoding the above peptide or protein (hereinafter, sometimes referred to as the gene of the present invention) may be a specific target gene. By fusing with a gene encoding the DNA binding domain of the transcription factor to be bound to form a chimeric gene, transcriptional repression can be performed targeting only a specific gene.
  • the chimeric gene of the present invention expresses a peptide having a function of converting a transcription factor into a transcription repressor or a chimeric protein in which a protein and a transcription factor are linked to each other. It specifically suppresses transcription of the gene to which it binds. Therefore, when performing the transcriptional repression of a specific gene, a transcription factor that controls the transcription of the gene is selected, and the gene of the present invention is linked to the end of the gene encoding the transcription factor or the DNA binding domain.
  • the chimera gene may be constructed, the gene may be ligated to an appropriate vector, and introduced into a biological site where the transcription of the specific gene is to be suppressed, so that the transcription of the specific gene may be suppressed.
  • the chimeric protein produced by the chimeric gene of the present invention is The DNA binding domain of the transcription factor specifically represses the transcription of the gene to which it binds, and this repression appears as a dominant trait. That is, it also suppresses the functions of other transcription factors that are involved in the transcription of this gene in a redundant manner.
  • CUC1 is a transcription factor that controls the formation of shoot apical shoots.Cotyledons of the plant cotyledon form only when both the CUC1 and CUC2 genes have mutations (Cup-sahped cotyledon), and it has been clarified that the formation of division tissues of the apical buds is not performed. On the other hand, it is known that CUC1 and CUC2 are functionally redundant factors, since those containing mutations in only one of CUC1 and CUC2 are normal (Development, 126, 1563). ,
  • the expressed chimeric protein is: It can suppress the transcriptional activity of not only the CUC1 transcription factor but also the functionally duplicated CUC2 transcription factor, and suppress the expression of genes controlled by the CUC1 transcription factor.
  • the cotyledon of the plant becomes the shape of the CuCl / C uc2 dual variable variant of the cup-shaped a trait (cup- shaped cotyledon), also apical meristem is not formed.
  • the peptide DLDLELR of the present invention was used.
  • LGFA construct chimeric gene fused to the gene and CUC 1 gene encoding (peptide called SRD to) (1 4), the result of the Arabidopsis plants transformed with the chimeric gene, the C ucl / CUC 2 Dip-shaped characterizing double-deficient strain
  • the fusion with GFA indicates that the gene has been converted to a transcriptional repressor.Furthermore, it preferentially suppresses not only the activity of the CUC1 transcription factor but also the function of the functionally overlapping CUC2 transcription factor, and reduces the expression of downstream genes. Indicates that it is suppressed.
  • the peptide of the present invention and the gene encoding the same have the ability to convert any transcription factor into a transcription repressor, and are functionally redundant (redundant). It also has the ability to suppress the activity of other transcription factors.
  • plant transcription factors often have a plurality of functionally duplicated transcription factors, as indicated by cue, and the transcription repressor that has been converted in function according to the present invention is a dominant trait ( According to the present invention, it is possible to analyze the function of a transcription factor that has not been clarified by knocking down a single gene, and it is also possible to use a plant having a diploid genome such as wheat. This is an extremely useful means in that it can act effectively on
  • the chimeric gene of the present invention suppresses the transcription of the target gene by generating a chimeric protein corresponding to the gene and binding the chimeric protein to the target gene.
  • a chimeric protein may be separately synthesized and directly introduced into a biological site where the target gene exists.
  • this chimeric protein may be carried out using conventional genetic engineering techniques.
  • the above-described chimeric gene may be incorporated into an appropriate vector, and the resulting microorganism may be cultured. A large amount of chimeric protein can be synthesized.
  • the binding position of the gene of the present invention to a transcription factor is downstream of a region encoding a DNA binding domain in the transcription factor. Insertion of the gene of the present invention into a gene encoding a transcription factor involves complicated operations such as cleavage of the gene encoding the transcription factor, ligation and reconnection of the gene of the present invention. It is convenient to bind the gene of the present invention to the downstream end of the protein coding region of the present invention. This is one of the advantages of the present invention.
  • the gene of the present invention may be a peptide having the amino acid sequence represented by any one of the above formulas (I) to (III) or a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 or 61.
  • the base sequence may be any.
  • the gene of the present invention may be provided with a linking site for linking to a gene encoding a transcription factor, and the amino acid reading frame of the gene of the present invention does not match the reading frame of the gene encoding the transcription factor. If so, design the genes to match. Therefore, it may have an additional base sequence for that purpose.
  • the chimeric protein in order to suppress gene transcription, may be directly introduced into a living body.
  • the transcription of a specific gene is constantly suppressed, It is necessary to suppress the expression of the gene, and it is more effective to ligate the gene encoding the chimeric protein to an appropriate vector and to transform a plant or the like using the recombinant vector.
  • the gene encoding the chimeric protein is constantly expressed in the plant, and the generated chimeric protein continues to suppress gene transcription.
  • EIN3 gene Arabidopsis thaliana ETHLEN-INSESITIVE3 gene
  • SEQ ID NO: 52 The sequence of this EIN3 gene and the protein produced therefrom are shown in SEQ ID NO: 52.
  • the EIN 3 gene product functions as a transcription factor. It is a physiological action induced by the plant hormone ethylene, a morphological change (triple response) of yellow sprouts, elongation inhibition, and an ethylene-responsive gene. It is an ethylene signal transduction factor that mediates expression and the like.
  • a gene fragment encoding the above-described peptide or protein of the present invention is ligated to a region encoding the DNA-binding domain of the EIN3 gene to form a chimeric gene, which is, for example, a plant having a cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • the recombinant vector is used to transform Arabidopsis thaliana.
  • Arabidopsis wild-type strains exhibit morphological changes (triple response) and elongation inhibition of yellow buds in the presence of ethylene or its precursor, 1-aminocyclopropane-1D-potassium ribonate, whereas the above traits In the converted Arabidopsis thaliana, these ethylene-responsive physiological actions are significantly suppressed. Therefore, the gene of the present invention converts the transcription activating function of FIN3 into a repressing function.
  • the transcription factor that is converted into a transcription repressor and its gene are as described above.
  • EIN3 and its genes yeast GAL4, ERF4, CBF1, ERF2, ERE
  • proteins such as Bl, CUC1 and CUC2, and genes thereof.
  • the present invention is not particularly limited thereto, and is widely used for transcription factors of animals, plants, and microorganisms. And its genes are available. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 (i) various synthetic gene fragments linked to the region encoding the DNA-binding domain of the yeast GAL4 transcription factor were transformed into a plant-functioning force reflower mosaic virus 35 Constructing effecta-plasmid at the downstream of S promoter, (ii) Enhancer region of cauliflower mosaic virus 35S promoter, DNA sequence binding to GAL4 protein, and 35S promoter of force reflex mosquito virus A reporter gene consisting of a luciferase gene in which the TATAII region was linked to the promoter region was constructed.
  • effector plasmids and a reporter gene were simultaneously introduced into Arabidopsis thaliana using a particle gun, and the activity of the reporter gene, luciferase gene, was measured to determine the transcriptional repression ability of the synthesized gene fragment. is there.
  • Example 2 the transcriptional repressing ability of a gene encoding a protein having the entire amino acid sequence of SUP and a gene encoding a SUP partial protein having the 175-204 amino acid sequence of SUP were examined by measuring the luciferase activity of a reporter gene. It is a thing.
  • Example 3 In a plant, suppression of the transcriptional function of EIN3 by a gene encoding a SUP partial protein having an amino acid sequence of 175 to 204 of SUP was examined.
  • Example 4 In a plant, suppression of the transcriptional function of EIN3 by a gene encoding an ERF3 partial protein having an amino acid sequence of 191-225 of ERF3 was examined in plants.
  • Example 6 binds genes encoding LDLELRLGFA (SRD1; SUPERMAN repression domain 195-204) and LDLNLAPPMEF (RD1; ERF3 repression domain 215-225) to EIN3 gene which is a transcription factor in plants.
  • LDLELRLGFA SUPERMAN repression domain 195-204
  • LDLNLAPPMEF LDLNLAPPMEF
  • EIN3 gene which is a transcription factor in plants.
  • Arabidopsis thaliana plants were transformed, and the morphology of the plants in the presence of ethylene was observed to examine the effect of the above-mentioned gene fragment on the transcriptional function of the EIN3 gene.
  • Example 7 is PRODUCTION-0F-ANTH0CYANIN- PIGMENT! (PAPl) [Borevitz J.0., Xia Y., Blount J., Dixon RA & Lamb C., Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis.
  • Example 8 describes the AtMYB23 transcription factor [Kirik V., Thomasger A., Radchuk V., Adler K., Hulskamp ⁇ . & Baumlein H., Ectopic expression oi tne
  • AtMYB23 gene induces differentiation of trichome cells. Dev Biol. 235, 366 (2001); a carboxyl terminal of a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Cell 12, 2383 (2000)].
  • a transgenic plant was produced by introducing a chimeric repressor (35S :: AtMYB23SRDX) to which a peptide (SRDX) consisting of 12 amino acids represented by the amino acid sequence of LDLDLELRLGFA was added to an Arabidopsis thaliana plant.
  • SRDX a peptide consisting of 12 amino acids represented by the amino acid sequence of LDLDLELRLGFA was added to an Arabidopsis thaliana plant.
  • Example 9 a transcription suppression experiment was carried out on tobacco leaves and tuyua.
  • Plasmid pBI221 (Clontech, USA) was cut with restriction enzymes Xhol and Sacl, blunt-ended with T4 polymerase, and the GUS gene was removed by agarose gel electrophoresis. A 35S-Nos plasmid fragment DNA containing the CaMV 35S below) and the transcription termination region of the nopaline synthase gene (Nos terminator, hereinafter referred to as Nos-ter) was obtained.
  • the pAS2-1 vector from Clontech was digested with the restriction enzyme Hindlll, and a 748 bp DNA fragment (hereinafter referred to as GAL4DBD) encoding the DNA binding region (1-147 amino acid residues) of the yeast GAL4 protein was purified by agarose gel electrophoresis. After isolation, blunt-ended with T4 DNA polymerase. The DNA fragment containing the GAL4DBD coding region was inserted into the 35S-Nos DNA at the blunt-ended site between the 35S promoter and Nos terminator, and the DNA binding region of the yeast GAL4 protein was linked to the 35S promoter.
  • the p35S-GAL4DBD vector was constructed by selecting ones in which the 0RFs were arranged in the forward direction.
  • a double-stranded DNA encoding a peptide to be prepared designed so that the reading frame matches the amino acid reading frame of GAL4DBD was synthesized.
  • the following shows the base sequences of the synthesized DNA and the amino acid sequences encoded by them.
  • PUC18 plasmid with Nos-ter was digested with restriction enzymes Hindlll and BamHI.
  • the synthesized double-stranded DNA was inserted into the Hindlll-BamHI site of pUC18 to construct a plasmid containing a TATA-box and a Nos-ter.
  • This plasmid was digested with the restriction enzyme Sstl and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • Plasmid vector PGV-CS2 (Toyo Ink) containing the firefly luciferase gene (LUC) is digested with the restriction enzymes Xbal and Ncol, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to agarose gel electrophoresis. A 1.65 kb DNA fragment containing the luciferase gene was isolated and purified. This DNA fragment was inserted into a plasmid containing the above TATA box and Nos terminator to construct a pTATA-LUC reporter gene.
  • DNA fragments were purified by agarose gel electrophoresis. Restriction enzyme for TATA-LUC vector
  • CaMV 35S promoter 1 - a DNA fragment of 800 to 1 46 region including 760bp was isolated by Agarosugeru electrophoresis. This Hindlll fragment was inserted into the reporter gene pGAL4-LUC that had been digested with the restriction enzyme Hindlll in advance, and those with the CaMV 35S promoter DAN oriented in the forward direction were selected, and the p35S-GAL4-LUC reporter gene was selected. (See Figure 3).
  • the reporter gene and effector plasmid were introduced into Arabidopsis thaliana using the particle gun method, and the effector effect was examined by measuring the activity of the reporter gene.
  • the Arabidopsis thaliana leaves that had been allowed to stand for 6 hours were pulverized in liquid nitrogen, suspended in the Passive Lysis Buffer 2001 with the Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Proraega), centrifuged, and centrifuged to remove the supernatant. Was recovered. 20 ⁇ l of this cell extract is mixed with 100 ⁇ l of the measurement buffer attached to the Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega) and attached using a luminometer (TD20 / 20, Turener Design). Luciferase activity was measured. Firefly luciferase and P. luciferase activities were measured by counting the luminescence for 10 seconds in the integration mode according to the instructions of the measurement kit.
  • the activity value of the reference gene was divided by the activity value of one reporter gene, and the relative value, Relative lucifarase activity, was determined as the measured value.
  • three independent transient experiments were performed for each type of effector plasmid, and the average value and standard deviation were calculated. Assuming that the relative value of the activity of the P35S-GAL4-LUC reporter gene without an effector was 100, the effect of the effector was investigated by the change in the activity value of the reporter gene when effector plasmid was simultaneously introduced into cells.
  • the effector plasmid pGAL4DB_RD incorporating the p35S-GAL4-LUC reporter gene and the DNA encoding each peptide sequence is introduced, if the activity value of the revoluter decreases, the peptide will be activated by the reporter gene. This has the effect of suppressing (reblesser function).
  • the activity value of the reporter was measured, and when the relative activity value of the p35S-GAL4-LUC reporter was 100 or less, it was determined that the introduced effector had a repressor function.
  • Figure 4A shows the structure of the reporter gene and effector plasmid.
  • Fig. 4 B Table 1 below shows the measurement results of the activity of the reporter gene.
  • LRL-containing peptides can be used to transfer reporter gene activity to effectors. The reduction was 85% to 98% as compared with the case of no reporter gene alone (control), demonstrating that these peptides function as functional peptides having the ability to suppress transcription.
  • P35S-GAL4DBD which did not contain the peptide sequence and was used as a control experiment, did not reduce the activity of the reporter gene. This indicates that the peptide bound to the GAL4 DNA binding domain functions as a repressor that suppresses transcription.
  • the nucleotide sequence of the SUP gene has already been reported. Oligonucleotides having sequences corresponding to the 5 'and 3 sides of the protein coding region of the Arabidopsis SUP gene were synthesized, respectively, and these were used as primers for the TAC library-containing TAC library K14B15 clone (transferred from Kazusa DNA Research Institute). ) was subjected to PCR, and a DNA fragment containing the protein coding region of the SUP gene was isolated. The entire nucleotide sequence was determined and confirmed to be the protein coding region of the SUP gene already reported. The PCR was performed under the conditions of a denaturation reaction at 94 ° C for 1 minute, an anneal reaction at 47 ° C for 2 minutes, and an extension reaction at 74 ° C for 1 minute.
  • Plasmid P BI221 from Clontech (Clontech, USA) is cut with restriction enzymes Xhol and Sacl, blunt-ended with T4 polymerase, and the GUS gene is removed by agarose gel electrophoresis. CaMV 35S and Nos-ter are removed. A 35S-Nos plasmid fragment DNA was obtained.
  • GAL4DBD 5's upper primer primer 1 designed to match the reading frame (frame) of the SUP gene (SEQ ID NO: 29: Binds to the SUP gene's nucleotide sequence 18): GATGGAGAGATCAAACAGC,
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 32: SUP base sequence 522-539): GAATGATGAAATCATCAG,
  • an effector plasmid PGAL4DB was constructed in the same manner as described above except that the SUP gene and 175 / 204SUP were not used.
  • reporter genes Two types of reporter genes, p35S-GAL4-LUC and pGAL4-GCC-LUC, were constructed by the following method.
  • Plasmid pUC18 was digested with restriction enzymes EcoRI and Sstl.
  • pBI221 plasmid (Clontech) was digested with restriction enzymes EcoRI and Sstl, and a 270 bp DNA fragment containing the Nos-ter (nopaline synthase terminator) region was isolated by agarose gel electrophoresis. The obtained fragment was inserted into the EcoRI-Sstl site of plasmid pUC18 that had been digested with restriction enzymes EcoRI and Sstl. Then, the complementary strand DNA 1: containing the cauliflower mosaic virus 35S promoter TATA box: No. 35) and
  • DNA 2 Number 36 was synthesized. The synthesized DNA was heated at 90 ° C for 2 minutes, then heated at 60 ° C for 1 hour, and then allowed to stand at room temperature (25 ° C) for 2 hours to form a double strand. PUC18 plasmid with Nos was digested with restriction enzymes Hindlll and BamHI. The synthesized double-stranded DNA was inserted into the Hindlll-BamHI site of pUC18 to construct a plasmid containing a TATA-box and Nos_ter.
  • This plasmid was digested with the restriction enzyme Sstl and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • the plasmid vector PGV-CS2 (Toyo Ink) containing the firefly luciferase gene (LUC) is digested with the restriction enzymes Xbal and Ncol, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, a 1.65 kb DNA fragment containing the luciferase gene was isolated and purified. This DNA fragment was inserted into a plasmid containing the above TATA box and Nos terminator to construct a pTATA-LUC reporter gene.
  • plasmid pG5CAT manufactured by Clontech
  • a plasmid pG5CAT having 5 copies of the DNA binding sequence of yeast GAL4 protein was digested with restriction enzymes Smal and Xbal, blunt-ended with T4 DNA polymerase, The DNA fragment containing the DNA binding sequence of GAL4 protein was purified by agarose gel electrophoresis.
  • the TATA-LUC vector was digested with the restriction enzyme Bglll and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • PGAL4-LUC was constructed (see Fig. 2).
  • Atsukuku Fupmer primer 6
  • a complementary strand of 45 bp DNA (described below) containing four GCC box sequences (AGCCGCC) was synthesized, heated at 70 ° C for 15 minutes, left at room temperature for 60 minutes, and annealed to obtain double-stranded DNA.
  • a plasmid pG5CAT (manufactured by Clontech) having 5 copies of the DNA binding sequence of yeast GAL4 protein was digested with the restriction enzymes Smal and Xbal, blunt-ended with T4 DNA polymerase, A DNA fragment containing the DNA binding sequence of GAL4 protein was purified by agarose gel electrophoresis. This DNA fragment was inserted into pGCC-LUC plasmid, which had been blunt-ended, and those having the GAL4 sequence in the forward direction were selected to construct a PGAL4-GCC-LUC reporter gene (see FIG. 8).
  • PGAL4 DB - SUP or pGAL4DB thereof is Dereshiyon - 175 / 204SUP of ⁇ 1.2 ⁇ g, gold comparative plasmid p35S- AtERF5 or pGAL4DBl.2 ⁇ g, and the reference gene plasmid 0. 3 2.mu. g diameters l mm 510 g of granules (BioRad) were coated. Growth period 21 Seven Arabidopsis leaves on the 1st day are arranged in a 9 cm petri dish with filter paper soaked in water, and a Bio-Rad PDS-1000 / He bombardment machine is also used. I shot the DNA. Then, the cells were allowed to stand at 22 ° C for 6 hours in a light place, and then the activity of a reporter gene was measured.
  • the Arabidopsis thaliana leaves that had been allowed to stand for 6 hours were crushed in liquid nitrogen, suspended in the Passive Lysis Buffe OO / i 1 attached to the Dual-Lucif eraseTM Reporter Assay System (Promega), centrifuged, and the supernatant was centrifuged. Was recovered.
  • This cell extract is mixed with the measurement buffer 1001 attached to the 20 ⁇ Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega) and the luciferase activity is measured using a luminometer (TD20 / 20, Turener Design). A measurement was made.
  • Firefly 'Luciferase' and 'Michitake' luciferase activities were measured by counting luminescence for 10 seconds in the integration mode according to the description of the measurement kit.
  • the reference gene activity value was divided by the reporter gene activity value, and the relative value, Relative lucifarase activity, was determined as a measured value.
  • transient assay experiments three times for each type of effector plasmid, and calculated the average value and standard deviation. Assuming that the relative value of the p35S-GAL4-LUC reporter gene activity without an effector is 100 and the relative value of the pGAL4-GCC-LUC reporter gene is 1, the reporter gene is simultaneously introduced into the cells when efetaplasmid is introduced. The effect of the effector was investigated by the variation of the activity value.
  • FIG. 9A is a diagram showing a reporter gene and effector plasmid.
  • 5XGAL4 is a GAL4 transcription factor DNA binding sequence
  • TATA is a region containing a CaMV35S promoter-TATA box
  • LUC is a luciferase gene
  • CaMV35S is a forceful mosaic virus 35S protein gene promoter
  • GAL4DB is a yeast GAL4 transcription factor DNA binding.
  • the domain coding region Nos represents the nopaline synthase gene transcription termination region.
  • Fig. 9B shows that SUP and SUP release are dependent on reporter gene activity (Relative
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect on the activity.
  • the numbers on the left (such as 175/204 ′) indicate the amino acid region of SUP.
  • the middle box indicates the amino acid sequence region corresponding to the number on the left.
  • the graph on the right shows the activity of the reporter gene when the effector plasmid having the region on the left was introduced.
  • PGAL4DB-SUP suppresses the activity of the reporter gene because the reporter activity value decreases when the p35S-GAL4-LUC reporter gene and pGAL4DB-SUP efetaplasmid are introduced. Indicates that there is an effect (repressor function).
  • the PGAL4DB-SUP effector reduced the activity of the reporter gene by 75% compared to the case of the reporter gene without the effector alone (control) (Fig. 9B; 1/204).
  • P35S-GAL4DB which did not contain the SUP coding region, was used as a control experiment and did not reduce the activity of the reporter gene. This indicates that SUP functions as a repressor that suppresses transcription.
  • pGAL4DB-175 / 204SUP an effector plasmid having a DNA fragment in which the protein coding region of the SUP gene has been deleted, shows a further inhibitory effect than when pGAL4DB-SUP is introduced, and reduces the activity of the reporter gene by 95%. It has been shown that there is a repressor function. ( Figure 9B; 175 / 204SUP).
  • Figure 1 0 A is a reporter gene - a diagram (P GAL4 GCC-LUC) and showing various effector plus Mi de.
  • Plasmid p35S-GFP from Clontech (Clontech, USA) is cut with the restriction enzymes Hindlll and BamHI, and the force reflower mosaic virus 35S promoter is digested.
  • a DNA having the following sequence was synthesized, heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then annealed by natural cooling to obtain a double-stranded DNA.
  • This DNA fragment has a BamHI restriction enzyme site at the 5 'end, an omega sequence derived from tobacco mosaic virus for improving translation efficiency, and restriction enzyme sites Smal and Sail.
  • the DNA fragment containing the CaMV 35S promoter region and the synthesized double-stranded DNA were inserted into HindIII and Sstl sites of pBIG-HYG excluding the GUS gene, to obtain a plant transformation vector PBIG2.
  • ATGAATCCCCGGGATATTATTC SEQ ID NO: 44
  • a DNA fragment containing the base sequence 1-1485 region corresponding to the amino acid sequence 1-1162 coding region of EIN3 was amplified by PCR and cut with restriction enzyme Smal Thereafter, the target DNA fragment was isolated by agarose electrophoresis. This fragment was inserted into pBIG2 cut with the restriction enzyme Smal, and the one cloned in the forward direction was isolated to obtain pBIG2-EIN3-1/162.
  • the pEIN3 clone containing the full length of EIN3 cDNA was digested with restriction enzymes Smal and Pstl, and a DNA fragment (487-1695) encoding the region of the amino acid sequence 163-565 of EIN3 was isolated by agarose electrophoresis. This DNA fragment was inserted into the cloning vector pBluescriptll that had been cut with the restriction enzymes Smal and Pstl to prepare the plasmid pEIN3-163 / 565.
  • ATCCCGAACCATATGGATACATCTTGCTGC (SEQ ID NO: 46) was used to amplify a DNA fragment containing the nucleotide sequence (1696-1884) corresponding to the amino acid sequence 566-628 of EIN3 by PCR and cut with the restriction enzyme Pst I After that, it was isolated by agarose electrophoresis.
  • Amino acid sequence of EIN3 566 The above DNA fragment containing the base sequence (1696-1884) corresponding to the 628 coding region was cut with the restriction enzymes Pstl and Sail.
  • Plasmid pEIN3-163 / 628-SupRD is digested with restriction enzymes Smal and Sail, and DNA fragments encoding the amino acid sequence 163-628 of EIN3 and the ⁇ 5-204 of SUP are isolated by agarose gel electrophoresis. did. The isolated fragment was transformed with the PBIG2- EIN3-1-162 was inserted into pBIG2-EIN3- 1/162 digested with the restriction enzyme Smal to obtain a transformation vector pEIN3SUPRD containing 35S-EIN3-SupRD-Nos.
  • Transformation of Arabidopsis thaliana plants by PEIN3SUPRD was performed using the Transfomation of Arabidopsis thaliana byvacuum inn ltration (http: //www.bch.msu.
  • the seeds of the resulting next-generation (T2) transformed plant were cultured in a sterilized growth medium supplemented with 1-aminocyclopropane-D-carboxylic acid (ACC), a precursor of ethylene, with a final concentration of 10 uM calo. MS plates (Table 5 below).
  • ACC 1-aminocyclopropane-D-carboxylic acid
  • the wild strain Col-0 shows a triple response in which the stem length hook is bent and the root elongation is suppressed in the presence of ACC
  • the pEIN3 clone containing the full length of EIN3 cDNA was digested with restriction enzymes Sraal and Pstl, and a DNA fragment (487-1695) encoding the region of the amino acid sequence 163-565 of EIN3 was isolated by agarose gel electrophoresis. This DNA fragment was inserted into a cloning vector pBluescriptll that had been cut with the restriction enzymes Smal and Pstl to prepare a plasmid pEIN3-163 / 565.
  • ATCCCGAACCATATGGATACATCTTGCTGC (SEQ ID NO: 46) a DNA fragment containing the nucleotide sequence (1696-1884) corresponding to the amino acid sequence 566-628 coding region of EIN3 was amplified by PCR and cut with the restriction enzyme PstI. Later, it was isolated by agarose electrophoresis.
  • the DNA fragment of the base sequence (571-675) corresponding to the amino acid sequence 191-225 of ERF3 having the restriction enzyme Sail site at the 3 'end was ligated with the carboxyl terminal of EIN3, the frame and reading frame. Designed to match.
  • the nucleotide sequence of the full length gene of ERF3 and its amino acid sequence are as shown in SEQ ID NO: 53.
  • 5-terminal upper primer primer 12 SEQ ID NO: 47; binding site ERF3 base sequence 569-593
  • Arabidopsis plants were transformed using the transformation vector PEIN3PRD and the comparative control transformation vector pEIN3RDm, and further selected on a hygromycin plate to obtain next-generation seeds.
  • the gene is induced by ethylene in the wild type, but is not induced by ethylene in the ein3 plant which is a non-responsive mutant of ethylene.
  • PDF1.2 gene basic chitinase (BCHN) gene
  • BCHN basic chitinase
  • Fig. 15 shows the characteristics of the germinated body of the obtained transformed plant (35S :: CUC1SRD).
  • the cotyledon in the double mutant of the wild strain Col-0 and cucl uc2 was The morphology is shown in Fig. 15 (left) and Fig. 15 (middle), respectively.
  • the pEIN3 clone containing the full length EIN3 cDNA was digested with the restriction enzymes Smal and Pstl, and a DNA fragment (487-1695) encoding the region of the amino acid sequence 163-565 of EIN3 was isolated by agarose gel electrophoresis. Was created 565 - This DNA fragment was inserted into a cloning vector pBluescriptll which had been cut with restriction enzymes Smal and Pstl plasmid P EIN3-163.
  • both strands of DNA designed to encode the amino acid sequence of RD1 (LDLNLAPPMEF) having a restriction enzyme Sail site at the 3 'end, prepared so that the reading frames of amino acids match.
  • Array both strands of DNA designed to encode the amino acid sequence of RD1 (LDLNLAPPMEF) having a restriction enzyme Sail site at the 3 'end, prepared so that the reading frames of amino acids match.
  • Plasmid pEIN3-163 / 628-SRD1 and pEIN3-163 / 628-RD1 are cleaved with restriction enzymes Smal and Sail, and a DNA fragment obtained by fusing the SRD1 or RD1 encoding region with the amino acid sequence 163-628 region of EIN3 was isolated by agarose electrophoresis.
  • the isolated fragment was inserted into pBIG2-EIN3-1 / 162 obtained by cutting PBIG2-EIN3- 1/162 obtained in the same manner as in Example 3 (2) with the restriction enzyme Smal, and containing CaMV35S-EIN3-SupRD_Nos Transformation vectors pEIN3SRDl and pEIN3RDl were obtained.
  • Transformation of Arabidopsis thaliana plants with pEIN3SRDl or pEIN3RDl was performed in the same manner as in Example 3 (3) to obtain the next-generation seeds.
  • the obtained cDNA of the PAP1 gene and the encoded amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 66 in the sequence listing.
  • DNAs encoding the 12-amino acid peptide LDLDLELRLGFA (SRDX) and designed to have a stop codon TAA at the 3 ′ end and having the following sequences were synthesized, and the two DNAs were annealed in the same manner as in Example 3. Strand DNA was used.
  • the DNA fragment containing only the PAP1 gene protein coding region and the DNA fragment containing the coding region of SRDX obtained above were inserted into PBIG2 cut with the restriction enzyme Smal in the same manner as in Example 3, and The cloned product was isolated to obtain a transformation vector p35S :: PAP1 SRDX.
  • Transformation vector p35S :: Next-generation seeds of Arabidopsis plants transformed with AtMYB23SRDX and a wild-type strain (Col. -0) was sown on an MS agar medium and grown under the same conditions as in Example 3.
  • the plants transformed with p35S :: AtMYB23SRDX showed that the wild type plant, Col-0, had no trichomes present in the epidermis, or had a significantly reduced number of trichomes compared to the wild type. (Fig. 19A).
  • GLABRA1 GL1
  • GLABRA2 GL2
  • TRANSPARENT TESTA GLABRA1 TTG1
  • Example 9 Transcription suppression experiment in tobacco leaves and petunia After seeding tobacco (Nicotiana tabacum BY4) as in Example 2, using CaMV35S :: GAL4 :: LUC as the reporter gene and CaMV35S :: GAL4DBD: RD (the SUP repression domain 175-204 region) as the effector plasmid
  • the leaves were left at 25 ° (16 hours) on a filter paper moistened with water, and the reporter gene was The luciferase activity was measured.As a result, when the 35S-GAL4DB-RD was introduced compared to 35S-GAL4DB used as a control and reporter plasmid introduced (assuming a relative value of 100).
  • the effector plasmid and reporter were similarly added to leaves (l. Ocra) collected from plants three weeks after sowing petunia seeds. Plasmid was introduced using a particle gun, and the luciferase activity was measured.As a result, compared to the case where 35S-GAL4DB used as a control and the reporter plasmid were introduced (neutral value: 100). When 35S-GAL4DB-RD was introduced, an effect of suppressing reporter gene activity by 82% was shown.
  • the chimeric gene having the repression domain has a transcription repressing function not only in Arabidopsis but also in tobacco leaves and petunia.
  • the first strand of cDNA was synthesized from the total RNA using the T-Primed First-Strand Kit manufactured by Amersham. Suspend the dried 1.65 ug or 2.5 ug of total RNA in 33 ul of DEPC-treated water, incubate at 65 ° C for 5 minutes, add the RNA solution to the tube containing the First-Strand Reaction Mix, and add the RNA solution. The reaction was carried out at 60 ° C for 60 minutes. It is considered that total RNA was theoretically converted to first strand cDNA by this reaction.
  • PCR was performed using a primer specific to the gene to be examined.
  • the base sequences of the primers used and the composition of the PCR reaction solution are shown below.
  • the PCR was performed at 95 ° C for 2 minutes for denaturation, followed by 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The cycle was changed from 25 to 35 depending on the gene to be examined.
  • the RT-PCR product obtained by the above series of operations was semi-quantitatively evaluated by the Southern method. 1/100 to 1/1000 of the DNA amplified by the PCR reaction was subjected to agarose gel electrophoresis and transferred to a nylon membrane. The corresponding gene DNA was prepared as a probe, labeled using Amersham ECL direct nucleic acid labeling and detection system 'kit, and subjected to hybridization and detection. Since the detected band indicates the amount of DNA corresponding to the mRNA of the gene to be examined, the expression level of each gene was examined by comparing this with the wild type and the transformed sample. At this time, the expression level of the endogenous gene ⁇ -tubulin (TUB) was simultaneously detected as a control.
  • TAB endogenous gene ⁇ -tubulin
  • the gene of the present invention can also efficiently suppress oncogene expression by, for example, fusing it with DNA that specifically binds to the transcription regulatory region of the oncogene and expressing it in cells.
  • the gene of the present invention can be used, for example, in plants to create a flower having a different color petal, which has never been obtained before, by controlling the expression of a gene encoding a pigment metabolizing enzyme. And the production of foods low in allergens by suppressing the expression of proteins that are allergens. In addition, by suppressing the expression of lignin synthesis genes, it is possible to produce trees with low lignin content, thereby producing high-quality pulp. Therefore, the present invention provides a technical means applicable and useful in a very wide range of fields.

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Description

転写抑制遺伝子及ぴぺプチド 技術分野
本発明は、 転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチド又はタン パク質、 該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、 該ペプチド又はタンパ ク質と転写因子とが連結したキメ明ラタンパク質、 該ぺプチド又はタンパク質をコ 一ドする遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とが連結したキメラ遺伝子、 該キ 田
メラ遺伝子を有する組み換えベクター、 及び該組み換えベクターを含む形質転換 体に関する。 背景技術
これまで生体遺伝子の m R N Aへの転写を抑制又は該遺伝子の発現を抑制する ば、 発癌遺伝子等疾病の原因となる遺伝子の発現の抑制又は植物の改良等への利 用に関して研究が進められている。 アンチセンス法では、 転写を抑制しようとす る標的遺伝子又はこれを転写した m R N A等の特定部位と相補的なアンチセンス D N A又はR N Aが用ぃられるが、 調製されたアンチセンス D N A又は R N Aは 該標的遺伝子以外の遺伝子の発現抑制には使用できず、 他の標的遺伝子に対して はその配列に合わせて新たにアンチセンス D N A又は R N Aを調製する必要があ る。 一方、 リポザィム法では、 標的 D N A又は m R N Aをリボザィムにより切断 するには、 該標的 D N A又は m R N Aと結合するための相補的な配列を有し、 力、 つ所定位置で切断可能なようにリボザィムを設計する必要がある。 また、 標的遺 伝子を切断するように設計されたリボザィムであっても、 例えば、 これを、 カリ フラヮーモザィクウィルスの 3 5 Sプロモーター等のプロモーター及び転写終結 配列に連結して導入ベクターを構築し、 実際に植物細胞中に導入すると、 転写さ れたリボザィムに余分な配列が付加されてリボザィム活性が失われる場合がある。 また、 これらの従来技術においては、 当然のことながら標的遺伝子の特定、 塩基 配列の決定が不可欠となっていた。 このほか、 遺伝子ノックアウト法により遺伝 子の発現を抑える方法もあるが、 この方法によっては例えば複 2倍体植物におい ては適用ができなかった。
一方、 上記従来技術とは全く別のアプローチとして、 本発明者等は、 シロイヌ ナズナ由来の A t E R F 3、 A t ERF 4、 A t ERF 7、 及び A t E R F 8タ ンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が遺伝子の転写を顕著に抑制すると 'の知見を得た。 そこで、 上記タンパク質をそれぞれコードする '遺伝子及びこれか ら切り出した DNAを含むエフェクタープラスミ ドを構築し、 これを植物細胞に 導入することにより、 実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した （特開 2 00 1— 26 9 1 77号、 2001— 26 9 1 78号、 200 1— 2 9 27 7 6 号、 及び 2001 -292777号公報） 。 さらに、 本発明者等は、 Class II ERF (ethylene responsive element binding factor 遺 子群の——つで ¾>るタ バコ E R F 3 (特開平 200 1— 2 6 9 1 76号公報） 、 イネ O s ERF 3タン パク質をコードする遺伝子 （特開平 200 1 - 269 1 79号公報） 、 及び Z n フィンガータンパク （Zinc Finger Protein) の遺伝子群の一つであるシロイヌ ナズナ Z AT 1 0、 同 Z AT 1 1をコードする遺伝子についてもまた、 上記と同 様な試験を行ったところ、 遺伝子の転写を抑制することを見い出している。 そし て、 これらの遺伝子の塩基配列はまちまちではあるが、 これらの遺伝子がコード するタンパク質又はペプチドには、 （L/F) DLN (L/F) (X) Pなる共 通のモチーフ （但し、 Xは、 任意のアミノ酸残基を表す。 ） が存在することを明 らカ にした （The Plant Cell, Vol.13, 1959 - 1968， August, 2001) 。
従って、 本発明の課題は、 従来のアンチセンス法又はリボザィム法のように標 的遺伝子の塩基配列に合わせてその都度 DN A又は RN Aの設計を行う必要がな く、 簡便でかつ広く適用可能な遺伝子の転写抑制手段を提供することにある。 ま た、 本発明のもう一つの課題は、 上記転写抑制タンパク質に関する研究をさらに 進めて、 遺伝子の転写抑制を行う場合において実際に必要となる最も基本的なァ ミノ酸配列部分を確定し、 遺伝子の転写抑制をさらに簡便に行うためのぺプチド 及ぴその遺伝子を提供することにある。 発明の開示
本発明者等は、 上記課題を解決するため、 上記の共通のモチーフを有するタン パク質について鋭意研究の結果、 遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単 純な構造のペプチドであってもよく、 これら単純な構造を有するペプチドが、 転 写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するという驚くべき発見をした。 本発 明者等はまた、 シロイヌナズナ SUPERMAN (以下、 SUPという場合がある。 ） タン パク質は、 上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、 転写因子を 転写抑制因子に変換する機能を有すること、 また該 SUPERMANタンパク質をコー ドする遺伝子を、 転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、 強 力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することを見い出し、 本発明を完成す るに至った。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
(1) 下記式 （ I ) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチド。
X I— L e u-A s p-L e u-X 2-L e u-X3 - - - ( I)
(式中、 X 1は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を表し、 X 2は A s n又は G 1 uを表 し、 X 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
(2) 下記式 （II) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチド。
Y 1— Ph e -A s p-L e u-A s Π-Υ 2-Υ3 · · · (II)
(式中、 Y:U¾0〜1 0個のアミノ酸残基を表し、 丫2は 11 e又は I 1 eを表 し、 Y 3は少なく とも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
(3) 下記式 （III) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制 因子に変換する機能を有するぺプチド。
Z 1— A s p— L e u— Z 2-L e u-Ar g-L e u— Z 3 - · * (III) (式中、 Z 1は L e u又は A s p— L e u又は L e u— A s p— L e uを表し、 Z 2は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表し、 Z 3は 0から 1 0個のァミノ酸残基 を表す。 ）
(4) A s p-L e u-Z 4-L e u— A r g— L e uで表されるアミノ酸配列 を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチド。
(式中、 Z 4は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表す。 ）
(5) 以下の（a)から（d)のいずれかのアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転 写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質
( a ) 配列番号 31に示すァミノ酸配列
(b) 配列番号 3 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列
( c ) 配列番号 6 1に示すァミノ酸配列
(d) 配列番号 6 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列
(6) 下記式 （I) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
X I— L e u— A s p— L e u— X 2— L e u— X 3 · · · ( I )
(式中、 X 1は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を表し、 X 2は A s n又は G 1 uを表 し、 X 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
(7) 下記式 （II) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
Y l -Ph e -A s p-L e u-A s n-Y 2-Y 3 - · · (II)
(式中、 1は0〜1 0個のアミノ酸残基を表し、 2は卩11 e又は I 1 eを表 し、 Y 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
(8) 下記式 （III) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制 因子に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
Z 1— A s p— L e u— Z 2— L e u—Ar g— L e u— Ζ 3 · · (III) (式中、 Z 1は L β u乂は A s p― L 6 u.又は L e u― A s Ό― L e uを し、 Z 2は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表し、 Z 3は 0から 1 0個のァミノ酸残基 を表す。 ）
(9) A s p-L e u-Z 4-L e u-Ar g-L e uで表されるアミノ酸配列 を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドをコード する遺伝子。 (式中、 Z 4は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表す。 ）
(1 0) 以下の（a)から（d)のいずれかのアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を 転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
( a ) 配列番号 31に示すァミノ酸配列
(b) 配列番号 3 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列 .
( c ) 配列番号 6 1に示すァミノ酸配列
(d) 配列番号 6 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列
(1 1) 上記 （1) から （5) のいずれかのペプチド又はタンパク質をコードす る部分を含み、 その両端部に制限酵素部位を有する二本鎖 DNA。
(1 2) 上記 （1) から （5) のいずれかのペプチド又はタンパク質と転写因子 とを連結したキメラタンパク質。
(1 3) 上記 （6) から （1 0) のいずれかの遺伝子と転写因子をコードする遺 伝子とを連結したキメラ遺伝子。
(14) 上記 （13) のキメラ遺伝子を有する組み換えベクター。
(1 5) 上記 （14) の組み換えベクターを含む形質転換体。
(1 6) 上記 （14) の組み換えベクターを含む植物。 図面の簡単な説明
図 1は、 試験対象の各種 DN A断片を含む GAL4DB— RDエフェクタープラスミ ドを構築する手順を示す図である。
図 2は、 レポーター遺伝子 p35S - GAL4 - LUCを構築する手順の前半部を示す図で める。
図 3は、 上記レポーター遺伝子 P35S-GAL4-LUCを構築する手順の後半部を示す 図である。
図 4 Aは、 リポーター遺伝子とエフェクタープラスミ ドを示す図である。
なお、 図 1から 4 A中、 5XGAL4: GAL4転写因子 DNA結合配列、 TATA: CaMV35Sプ 口モーター TATAボックスを含む領域、 LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、 CaMV 35S: 力リフラワーモザィクウィルス 35Sタンパク質遺伝子プロモーター、 GAL4DB :酵 母 GAL4転写因子 DNA結合ドメインコード領域、 Nos：ノパリン合成酵素遺伝子転 写終止領域を表す。
図 4 Bは、 PGAL4DBに結合した各種ぺプチドがリポーター遺伝子の活性
(Relative Activity)に及ぼす影響を示す図である。 図中、 右側のグラフは、 各 種 D N A断片を有するエフェクタープラスミ ドを導入したときのリポーター遺伝 子の活性を示す （エフェクターを入れないときのリポーター遺伝子の活性を 100 とした） 。
図 5は、 エフェクタープラスミ ド pGAL4DB-SUPの構築手順を示す図である。 図 6は、 エフェクタープラスミ ド pAtERF5の構築手順を示す図である。
図 7は、 レポータープラスミ ド pGAL4- GCC-LUCの構築手順の前半部を示す図で ある。
図 8は、 レポータープラスミ ド pGAL4- GCC- LUCの構築手順の後半部を示す図で める。
図 9 Aは、 転写抑制試験において、 レポーター遺伝子としてプラスミ ドに組み 込まれた 35S- GAL4-LUCの構造及ぴエフェクター遺伝子として組み込まれた
SUP (D)'の構造の概略を示す図である。
図 9 Bは SUP 遺伝子及びその断片による 転写抑制試験の結果を示す図である。 図 1 0 Aは、 転写抑制試験において、 レポーターとして使用した GAL4- GCC- LUCの構造、 及び AtERF5、 GAL4DB、 GAL4DB- SUP、 GAL4DB175/204SUPを組み込ん で構築されたエフヱクタ一遺伝子の構造の概略を示す図である。
図 1 0 Bは各エフェクターによる転写抑制試験の'結果を示す図である。
図 1 1は、 SUP遺伝子及び ERF3遺伝子による EIN3の転写活性化機能の抑制効 果を、 エチレン前駆体存在下における植物体の茎長及ぴ根の伸長程度により調べ た結果を示す写真である。
図 1 2は、 SUP遺伝子及び ERF3遺伝子による植物体における EIN3の転写活性 化機能の抑制効果をエチレン存在下における植物体成長の程度により調べた結果 を示す写真である。
図 1 3は、 SUP遺伝子及び ERF3遺伝子による、 エチレン存在下での PDF1. 2、 BCHN及び ERF1遺伝子の発現抑制効果を、 これらェチレン誘導性遺伝子の発現を 示す mRN Aの検出の有無を指標にノーザンプロットハイプリダイゼーションに より調べた結果を示す写真である。
図 14は、 シロイヌナズナ植物体を形質転換するためのプラスミ ド
p35S: :CUC1SRDの構造を示す模式図である。
図 1 5は、 野生型 （Col- 0) 、 cucl/cuc2二重変異体 （cucl/cuc2) 及び p35S: :CUC1SRDで形質転換された植物体 （35S：： CUC1SRD) について各発芽後 5日 から 1 0日目の葉体の子葉部を撮影した写真である。
図 1 6は、 pEIN3SRDlによるシロイヌナズナ植物形質転換体
(35S: :EIN3SRD1) 、 及び EIN3RD1による同形質転換体 （35S：： EIN3RD1) におい てエチレン存在下で観察された植物体の茎及び根の形態を示す写真である。 図 1 7は、 PEIN3SRD1によるシロイヌナズナ植物形質転換体
(35S:： EIN3SRD1) 、 及び EIN3RD1による同形質転換体 （35S： :EIN3RD1) におい てエチレン存在下で観察された植物体成長の程度を示す写真である。
図 1 8 Aは、 p35S:： PAP1SRDX形質転換シロイヌナズナ植物及び野生株を 3 % ショ糖含有 MS培地で生育させた各発芽体の写真である。
図 1 8 Bは、 上記植物体における DFR遺伝子の発現を RT - PCR法により解析し た結果を示す電気泳動写真である。 ，
図 1 9 Aは、 p35S: :AtMYB23SRDX形質転換シロイヌナズナ植物及び野生株の葉 を撮影した写真である。
図 1 9 Bは、 上記植物体におけるトリコーム発生遺伝子の発現を RT- PCR法に より解析した結果を示す電気泳動写真である。 以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
本発明においては、 下記式 （I ) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因 子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドが提供される。
X I— L e u— A s p— L e u— X 2— L e u— X 3 · · · ( I )
(式中、 X 1は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を表し、 X 2は A s n又は G 1 uを表 し、 X 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ） 上記式 （ I ) 中、 X 1についてアミノ酸残基の数は 0〜1 0個であればよいが、 使用するペプチドの合成のし易さからみれば、 短い方がよく、 好ましくは 1 0個 以下、 より好ましくは 5個以下である。
また、 X 3のアミノ酸残基の数は重要であるが、 驚くべきことに最低 6個あれ ば上記機能を示すことが見いだされた。 さらに、 これら X 1及ぴ X 3においては アミノ酸の種類はどのようなものであってもよく、 例えば、 X 3については、 上 記従来技術に示したペプチドの共通モチーフ （L/F) DLN (L/F) (X) Pのうち P (プロリン） は必要なく、 単にァラニンを並べたものであってもよい。 これに対して、 LDLNL (Leu— Asp— Leu— Asn— Leu)、 又は LDLN (Leu— Asp - Leu-Asn)のみの配列では上記機能を示さず、 また、 X 2については 5個又は 6個 のアミノ酸残基を有するよう設計したものは、 極めて顕著な上記機能を示すのに 対して 3個のアミノ酸残基を有するように設計したものは上記機能を示さない。 本発明においてはまた、 下記式 （Π) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転 写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドが提供される。
Y l -Ph e-A s p-L e u— A s n-Y2-Y 3 - · · (II)
(式中、 Y 1は 0〜 10個のアミノ酸残基を表し、 Y 2は P h e又は I 1 eを表 し、 Y 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
上記式 （II) 中、 Y 1についてアミノ酸残基の数は 0〜 1 0個であればょレ、が、 使用するペプチドの合成のし易さからみれば、 短い方がよく、 好ましくは 1 0個 以下、 より好ましくは 5個以下である。
また、 Y 3のアミノ酸残基の数も、 最低 6個あれば上記機能を示すことが見い だされた。 さらに、 これら Y 1及び Y 3においてはアミノ酸の種類はどのような ものであってもよい。
本発明においてはさらに、 下記式 （ΠΙ) で表されるアミノ酸配列を有し、 か つ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドが提供される。
Z l -A s p-L e u-Z 2-L e u-A r g-L e u~Z 3 - · (III) (式中、 Z 1は L e u又は A s p— L e u又は L e u— A s p— L e uを表し、 Z 2は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表し、 Z 3は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を 表す。 ) 上記式 （III) 中、 Z 3についてアミノ酸残基の数は 0〜1 0個であればよい が、 使用するペプチドの合成のし易さからみれば、 短い方がよく、 好ましくは 1 0個以下、 より好ましくは 5個以下である。 Z 3の具体例としては、 例えば G、 GF F、 GFA、 GYY、 AAA等が挙げられるが、 これらに限定はされない。 上記 （III)で表されるペプチドは、 従来技術に示したペプチドの共通モチーフ (L/F) DLN (L/F) (X) Pとは異なる D L E L R Lなるモチーフを有 し、 これは SUPタンパク質の 1 96〜 20 1番目のアミノ酸配列 （Asp- Leu— Glu — Leu— Arg— Leu)に相当する。 全ぺプチド数はぺプチド合成のし易さからみれば、 多くても合計で 20アミノ酸以下のものが望ましい。 例えば下記の各ぺプチドが 例示される。
Leu— Asp— Leu— Glu— Leu— Arg— Leu^
Leu— Asp— Leu— Glu— Leu— Arg— Leu— Gly
Leu— Asp— Leu— Glu— Leu— Arg— Leu— Ala— Ala— Ala Leu— Asp— Leu— Glu— Leu— Arg— Leu— Gly— Phe— Ala Asp— Leu— Asp— Leu— Glu— Leu— Arg— Leu— Gly— Phe— Ala
Leu― Asp— Leu— Asp— Leu— blu― Leu— Arg― Leu— Lrly— Phe— Ala
さらに、 本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドと しては、 Asp - Leu— Glu— Leu— Arg— Leuなる最小配列を有するぺプチドであって もよい。
上記のぺプチドにおいて、 最小配列部分のグルタミン酸 （E) はグルタミン (Q) 又はァスパラギン酸 （D) に置き換えたものでもよく、 例えば 、 Leu— Asp― Leu— Gin— Leu— Arg— Leu— Gly-Tyr-Tyr Asp— Leu— Asp— Leu— Arg— Leu なるペプチドの転写抑制効果も極めて優れている。 これに対して、 Leu— Glu— Leu— Arg— Leuなる配列では転写抑制機能がない。
以上のことから、 上記式（I)から （III)で表されるペプチドにおいて、 転写因 子を転写抑制因子に変換する機能を発揮するために必要な最小限のぺプチドのァ ミノ酸残基の数は、 わずか 5から 6個にすぎない。
さらに、 本発明においては、 以下の（a)から（d)のいずれかのアミノ酸配列を 有し、 かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質が提供さ れる。
( a ) 配列番号 3 1に示すァミノ酸配列
(b) 配列番号 3 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列
( c ) 配列番号 6 1に示すァミノ酸配列
(d) 配列番号 6 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列
上記の 「配列番号 3 1 (又は配列番号 6 1) に示すアミノ酸配列において 1若 しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列」 における 「1から数個」 の範囲は特には限定されないが、 例えば、 1から 20個、 好まし くは 1から 1 0個、 より好ましくは 1から 7個、 さらに好ましくは 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。
上記アミノ酸の欠失、 置換若しくは付加は、 上記タンパク質をコードする遺伝 子を、 当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができ る。 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手 法又はこれに準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的突然変異誘発 法を利用した変異導入用キット （例えば Mutant-K (TAKARA社製） や Mutant - G(TAKARA社製） ）などを用いて、 あるいは、 TAKARA社の LA PCR in vitro
Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
配列番号 31に示されるアミノ酸配列を有する SUPタンパク質及びそれをコー ドする遺伝子はそれ自体公知である。 該アミノ酸配列の 1 95〜1 99番目の配 列 （塩基配列の 583〜 597に相当） は、 ロイシン （L) —ァスパラギン酸 (D) —ロイシン （L) 一グルタミン酸 （E) —ロイシン （L) であり、 また、 この配列の 3末端下流側にはプロリン残基を含まず、 上記従来技術に示した （L /¥) DLN (L/F) (X) Pなるモチーフとは異なるアミノ酸配列を有する。 また、 本発明において転写因子を転写抑制因子に変換するために使用されるタ ンパク質は、 配列番号 3 1に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するタンパク 質に限られず、 その部分配列を有するタンパク質又はべプチドであってもよレ、。 その部分配列を有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号 6 1に示される アミノ酸配列 （SUPタンパク質の 1 7 5〜 2◦ 4番目のアミノ酸配列） を有する タンパク質が挙げられ、 その部分配列を有するペプチドとしては、 上記 （III)で 表されるぺプチドが挙げられる。
本発明によればまた、 上記のいずれかのぺプチド又はタンパク質をコードする 遺伝子が提供される。
本発明においては、 上記のいずれかのぺプチド又はタンパク質と転写因子とが 連結したキメラタンパク質；上記のいずれかのぺプチド又はタンパク質をコード する遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とが連結したキメラ遺伝子も提供され る。 このキメラ遺伝子を含む組み換えベクターを用いて形質転換した形質転換体 においては、 該キメラ遺伝子に対応するキメラタンパク質が生成される。 このキ メラタンパク質における転写因子由来の D N A結合領域は標的遺伝子と結合する が、 この場合、 転写因子の機能は、 転写抑制機能に変換され、 該標的遺伝子の転 写が抑制され、 標的遺伝子の発現は起こらない。
本発明のキメラタンパク質による転写抑制機能は遺伝子の種類を問わず作用す る。 本発明のキメラタンパク質の転写抑制機能は標的遺伝子との結合が必要であ るから、 上記のペプチド又はタンパク質コードする遺伝子 （以下、 本発明の遺伝 子という場合がある） は、 特定の標的遺伝子に結合する転写因子の D N A結合ド メインをコードする遺伝子と融合させてキメラ遺伝子とし、 特定の遺伝子のみを 標的にした転写抑制を行うことができる。
すなわち、 本発明のキメラ遺伝子は、 転写因子を転写抑制因子に変換する機能 を有するぺプチド又はタンパク質と転写因子とが連結したキメラタンパク質を発 現し、 該キメラタンパク質における転写因子由来の D N A結合ドメインが結合す る遺伝子の転写を特異的に抑制する。 したがって、 ある特定の遺伝子の転写抑制 を行う場合、 該遺伝子の転写を支配している転写因子を選び、 該転写因子をコー ドする遺伝子の末端又は D N A結合ドメインに本発明の遺伝子を連結させてキメ ラ遺伝子を構築し、 該遺伝子を適当なベクターに連結して、 上記特定の遺伝子の 転写を抑制したい生体部位に導入して、 上記特定の遺伝子の転写を抑制すればよ い。
さらに、 本発明の上記キメラ遺伝子により生ずるキメラタンパク質は、 その転 写因子の D N A結合ドメインが結合する遺伝子の転写を特異的に抑制し、 この抑 制は優性形質として現れる。 すなわち、 この遺伝子の転写に重複して関与する他 の転写因子の機能をも抑制する。
この点については、 CUP-SHAPEDC0TYLED0N1 (CUC1)転写因子を用いた （Plant
Cell, 9, 841, 1997)場合を例にしてさらに詳細に説明する。
CUC1は、 同じ NAC ドメインを持つ CUC2 と共に、 芽生えの頂芽の形成を制御す る転写因子であり、 CUC1 と CUC2遺伝子の両方に変異を持つ場合にのみ、 その植 物体の子葉がカップ状の形態（cup-sahped cotyledon)を示し、 かつ頂芽の分裂組 織の形成が行われないことが明らかになつている。 一方、 CUC1又は CUC2の一方 だけに変異が入っているものは正常であることから、 CUC1 と CUC2は、 機能的に 重複した（redundant)因子であることが知られている （Development, 126, 1563，
1999； Development, 128， 1127, 2000) 。 これら重複した機能を持つ CUC1 と
CUC2転写因子の遺伝子のうち、 一方の遺伝子、 例えば CUC1遺伝子に、 本発明の ぺプチドをコ一ドする遺伝子を結合させたキメラ遺伝子を植物体で発現させた場 合、 発現したキメラタンパク質は、 CUC1転写因子ばかりでなく、 機能的に重複 した CUC2転写因子の転写活性をも抑制し、 CUC1転写因子が制御する遺伝子の発 現を抑制することができる。 この場合、 その植物体の子葉は cucl/Cuc2の二重変 異体の形質であるカップ状 （cup- shaped cotyledon) の形状になり、 また、 頂芽 分裂組織は形成されない。 後記実施例 5では、 本発明のペプチド D L D L E L R
L G F A (該ペプチドを SRDと称する） をコードする遺伝子と C U C 1遺伝子と を融合させたキメラ遺伝子を構築し （図 1 4 ) 、 キメラ遺伝子でシロイヌナズナ 植物を形質転換した結果、 Cucl/CUC2の二重欠損株である特徴を示す力ップ状
(cup-shaped cotyledon) の形質 （図 1 5 ：右） を示すこと、 及び CUC1転写因 子によつて制御されている頂芽分裂細胞の形成を制御する STM遺伝子の欠損株と 同様に、 項芽分裂組織の形成がみられないことが確認された。 このことは、 転写 活性化機能を有する CUC1転写因子が、 本発明の上記べプチド D L D L E L R L
G F Aとの融合により、 転写抑制因子に機能変換したことを示し、 さらに CUC1 転写因子ばかりでなく、 機能的に重複する CUC2転写因子の活性をも優先的に抑 制し、 下流の遺伝子の発現を抑制していることを示す。 以上のことから理解されるように、 本発明のぺプチド及びそれをコードする遺 伝子は、 任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有し、 さらに機能的 に重複 （リダンダント） する他の転写因子の活性も抑制する能力を有する。
—方、 植物の転写因子は、 多くの場合、 cueで示されたように、 機能的に重複 した複数の転写因子を持つ場合が多く、 本発明により機能変換した転写抑制因子 は、 優性形質 （ドミナント） で作用することから、 本発明によれば、 これまで一 遺伝子のノックァゥトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能とな り、 また、 コムギなどの複二倍体ゲノムを持つ植物にも有効に作用できる等の点 で、 極めて有用な手段である。
上記したように、 本発明のキメラ遺伝子は、 該遺伝子に対応するキメラタンパ ク質を生成させ、 このキメラタンパク質が標的遺伝子と結合することにより、 該 標的遺伝子の転写を抑制するものであるから、 このキメラタンパク質を別途合成 し、 これを直接標的遺伝子が存在する生体部位に導入してもよい。
このキメラタンパク質の合成には、 通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよ く、 例えば、 上記キメラ遺伝子を適当なベクターに組み込み、 これを用いて形質 転換させた微生物を培養することにより、 上記キメラタンパク質を多量に合成す ることができる。
本発明の遺伝子の転写因子に対する結合位置は、 該転写因子中の D N A結合ド メインをコードする領域の下流側である。 本発明の遺伝子を転写因子をコードす る遺伝子に挿入しょうとする場合、 転写因子をコードする遺伝子の切断、 本発明 の遺伝子の連結、 再結合等の面倒な操作を伴うので、 単に該転写因子のタンパク 質コード領域の下流側末端に、 本発明の遺伝子を結合するのが簡便である。 この 点は本発明の利点の一つでもある。
なお、 本発明の遺伝子は、 上記式 （ I ) から （III) で表されるアミノ酸配列 を有するペプチド、 あるいは配列番号 3 1又は 6 1に示されるアミノ酸配列を有 するタンパク質をコードするものであれば塩基配列はどのようなものであっても よい。 また、 本発明の遺伝子は、 転写因子をコードする遺伝子と連結するための 連結部位を設けてもよく、 また本発明の遺伝子のアミノ酸読み枠と転写因子をコ 一ドする遺伝子読み枠が一致しない場合には、 一致するように遺伝子を設計する。 したがってそのための付加的な塩基配列を有していてもよい。
本発明において遺伝子の転写を抑制するには、 上記キメラタンパク質を、 直接 生体に導入してもよいが、 例えば植物の品種改良等を行う場合、 恒常的に特定遺 伝子の転写を抑制し、 該遺伝子の発現を抑制する必要があり、 上記キメラタンパ ク質をコードする遺伝子を適当なベクターに連結させ、 この組換えベクターを用 いて植物等を形質転換するのがより効果的である。 これにより、 キメラタンパク 質をコードする遺伝子は植物体内で恒常的に発現し、 生成されたキメラタンパク 質は、 遺伝子の転写を抑制し続ける。
さらに、 この転写抑制について、 転写因子としてシロイヌナズナ ETHLEN- INSESITIVE3 遺伝子 （以下、 E I N 3遺伝子という。 ） を用いた場合を例にとり、 具体的に説明する。 なお、 この E I N 3遺伝子及びその産生タンパクの配列を配 列番号 5 2に示す。
E I N 3遺伝子産物である E I N 3タンパク質因子は、 転写因子として機能し、 植物ホルモンであるエチレンによって誘導される生理作用である黄化芽生えの形 態変化 （トリプルレスポンス） 、 伸長阻害、 エチレン応答性遺伝子の発現などを 媒体するエチレンシグナル伝達因子である。
この E I N 3遺伝子の D N A結合ドメインをコードする領域に、 本発明の上記 ぺプチド又はタンパク質をコードする遺伝子断片を連結してキメラ遺伝子とし、 これを、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス 3 5 Sプロモーターを有する植 物形質転換用ベクターに連結し、 この組み換えべクターを用いてシロイヌナズナ を形質転換する。 シロイヌナズナ野生株が、 エチレン又はその前駆体である 1一 アミノシクロプロパン一 D—力ルボン酸の存在下、 黄化芽生えの形態変化 （トリ プルレスポンス） 、 伸長阻害を示すのに対して、 上記形質転換されたシロイヌナ ズナは、 これらのエチレン応答性の生理作用が著しく抑制される。 従って、 本発 明の遺伝子は、 F I N 3の転写活性化機能を抑制機能に変換する。
本発明において、 転写抑制因子に変換される転写因子及ぴその遺伝子は、 上記
E I N 3とその遺伝子、 酵母 G A L 4、 E R F 4 , C B F 1、 E R F 2、 E R E
B l， C U C 1 C U C 2等のタンパク質又はその遺伝子等が挙げられるが、 本 発明は特にこれらに限定されるものではなく、 広く動植物、 微生物の転写因子及 びその遺伝子が利用可能である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を示すが、 本発明は特にこれら実施例に限定されるもの ではない。
実施例 1においては、 （ i ) 酵母の G A L 4転写因子の D N A結合ドメインを コードしている領域を結合させた種々の合成遺伝子断片を、 植物細胞で機能する 力リフラワーモザィクウィルス 3 5 Sプロモーターの下流につないでェフエクタ 一プラスミ ドを構築するとともに、 （i i) カリフラワーモザイクウィルス 3 5 S プロモーターのェンハンサー領域と G A L 4タンパク質結合 D N A配列と力リフ ラヮーモザィクウィルスの 3 5 Sプロモーターの T A T A镔域をプロモーター領 域に結合したルシフェラーゼ遺伝子からなるリポーター遺伝子を構築した。 これ らのエフェクタープラスミ ドとリポーター遺伝子とを同時にシロイヌナズナ葉に パーティクルガンを用いて導入し、 リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝 子の活性を測定することによって合成した遺伝子断片の転写抑制能を調べたもの である。
実施例 2は、 SUPの全アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、 SUPの 175-204ァミノ酸配列を有する SUP部分タンパク質をコードする遺伝子の 転写抑制能をリポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の測定により調べたも のである。
実施例 3は、 SUPの 175 - 204アミノ酸配列を有する SUP部分タンパク質をコー ドする遺伝子による EIN3 の転写機能の抑制を植物体において調べたものである。 実施例 4は、 ERF3の 191-225のアミノ酸配列を有する ERF3部分タンパク質を コードする遺伝子による EIN3の転写機能の抑制を植物体において調べたもので ある。
実施例 5は実際の植物における転写因子である C U C 1遺伝子に DLDLELRLGFA
(SRD； SUPERMAN リプレッションドメイン 194-204)をコードする遺伝子断片を結 合させ、 これを力リフラワーモザィクウイノレス 3 5 Sプロモーターの下流につな いで形質転換プラスミ ドを構築し、 該プラスミ ドによりシロイヌナズナ植物体を 形質転換させ、 その発芽後の子葉の形態を観察することにより、 CUC 1遺伝子 及び該遺伝子と機能的に重複する CUC 2遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写 機能抑制効果を調べたものである。
実施例 6は LDLELRLGFA (SRD1； SUPERMAN リプレッションドメイン 195-204) 、 及ぴ LDLNLAPPMEF (RD1 ;ERF3 リプレッションドメイン 215- 225) をコードする遺 伝子を植物における転写因子である E I N 3遺伝子に結合し、 同様にしてシロイ ヌナズナ植物体を形質転換させ、 ェチレン存在下における植物の形態を観察する ことにより、 E I N 3遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写機能抑制効果を調べ たものである。
実施例 7は、 PRODUCTION- 0F-ANTH0CYANIN- PIGMENT! (PAPl) [Borevitz J.0. , Xia Y.， Blount J. , Dixon R. A. & Lamb C. , Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Cell 12， 2383 (2000)]のカルボキシル末端に LDLDLELRLGFAのアミノ酸配列で示される 1 2アミノ酸からなるぺプチド（SRDX) を付与したキメラリプレッサー（35S:： PAP1S RDX)をシロイヌナズナ植物体に導入して、.形質転換体植物を作製し、 該植物にお けるアントシァニン合成系遺伝子の転写抑制効果を調べたものである。
実施例 8は、 AtMYB23転写因子 [Kirik V.， Schnittger A.， Radchuk V. , Adler K. , Hulskamp Μ. & Baumlein H.， Ectopic expression oi tne
Arabidopsis AtMYB23 gene induces differentiation of trichome cells. Dev Biol. 235, 366 (2001)； a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Cell 12, 2383 (2000) ]のカルボキシル末端に
LDLDLELRLGFAのァミノ酸配列で示される 1 2アミノ酸からなるぺプチド（SRDX) を付与したキメラリプレッサー（35S:： AtMYB23SRDX)をシロイヌナズナ植物体に導 入することによって形質転換体植物を作製し、 トリコームの発生を制御する遺伝 子の転写抑制効果を調べたものである。
実施例 9は、 タバコ葉およぴぺチュユアにおいて転写抑制実験を行ったもので ある。
(実施例 1) リプレッションドメインとして機能するペプチドの同定 ( 1 ) エフェクタープラスミ ド pGAL4DB- RDの構築 （図 1 )
クロ一ンテック社製（Clontech社， USA)のプラスミ ド pBI221を制限酵素 Xhol と Saclで切断し、 T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、 ァガロースゲル電気 泳動で GUS遺伝子を除き、 カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーター （以 下 CaMV 35Sという） とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域 （Nosターミネ 一ター、 以下 Nos- terという）を含む 35S- Nosプラスミ ド断片 DNAを得た。
クローンテック社製の pAS2 - 1ベクターを制限酵素 Hindlllで消化し、 酵母 GAL4 タンパク質の DNA 結合領域 （ 1-147 アミノ酸残基） をコードする 748 bp の DNA 断片 （以下 GAL4DBDという） をァガロースゲル電気泳動によって単離し た後、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をした。 この GAL4DBDコ一ド領域 を含む DNA断片を、 先ほどの 35S- Nosの DNAの 35Sプロモーターと Nosターミネ 一ター間の平滑末端にした部位に挿入し、 35Sプロモーターに対して酵母 GAL4 タンパク質の DNA結合領域の 0RF が順方向に並んでいるものを選抜して p35S - GAL4DBD ベクターを構築した。
GAL4DBDのアミノ酸読み枠 （フレーム） と読み枠が一致するように設計した調 查するぺプチドをコ一ドする両鎖 DNAを合成した。 以下に合成した DNAの塩基配 列と、 それらがコードしているアミノ酸配列を示す。
ERF3RD (214/225)
Amino acid sequence : DLDLNLAPPMEF (配列番号 1 )
5' -CGATCTTGATCTTAACCTTGCTCCACCTATGGAATTTTGAG-3' (配列番号 2 )
5' -TCGACTCAAAATTCCATAGGTGGAGCAAGGTTAAGATCAAGATCG-3' (配列番号 3 )
3 RD1
Amino acid sequence : LDLNLAPPMEF (配列番号 4 )
5' -CCTTGATCTTAACCTTGCTCCACCTATGGAATTTTGAG-3' (配列番号 5 )
5' -TCGACTCAAAATTCCATAGGTGGAGCAAGGTTAAGATCAAGG-3' (配列番号 6 )
3 RD2 Amino acid sequence : LDLNLAAAAAA (配列番号 7 )
5' - CCTTGATCTTAACCTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGAG - 3' (配列番号 8 )
5' - TCGACTCAAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGGTTAAGATCAAGG - 3' (配列番号 9 )
Min-LDLN
Amino acid sequence : LDLN (配歹 lj番号 1 0 )
5' - CCTGGATCTAAATTAAG - 3' (配列番号 1 1 )
5' - TCGACTTAATTTAGATCCAGG- 3' (配列番号 1 2 )
Min-LDLNL
Amino acid sequence : LDLNL (配歹 [j番号 1 3 )
5' -CCTGGATCTAAATCTGTAAG-3' (配列番号 1 4 )
5' -TCGACTTACAGATTTAGATCCAGG-3' (配列番号 1 5 )
SRD1
Amino acid sequence : LDLELRLGFA (配列番号 1 6 )
5' - CCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG- 3， （酉己歹 (J番号 1 7 )
5' -TCGACTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGG-3' (配列番号 1 8 )
SRD2
Amino acid sequence : LDLELGFA (配歹 II番号 1 9 )
5' -CCTGGATCTAGAACTCGGTTTCGCTTAAG-3' (配列番号 2 0 )
5' - TCGACTTAAGCGAAACCGAGTTCTAGATCCAGG-3' (配列番号 2 1 )
LELDL
Amino aci d sequence : LELDLAAAAAA (酉己歹 U番号 2 2 )
5' - ACTGGAACTAGATCTAGCTGCAGCTGCAGCTGCTTAAG- 3， （配列番号 2 3 )
5' - TCGACTTAAGCAGCTGCAGCTGCAGCTAGATCTAGTTCCAGT - 3' (配列番号 2 4 ) Amino acid sequence: LELRLAAAAAA (配列番号 8 0)
5, - ACTAGAACTCCGTTTGGCTGCCGCAGCGGCTGCATAATGAG- 3' (配列番号 8 1 )
5， - TCGACTCATTATGCAGCCGCTGCGGCAGCCAAACGGAGTTCTAGT - 3' (配列番号 8 2)
Amino acid sequence: DLELRL (配歹番号 8 3)
5' -AGATCTAGAACTCCGTTTGTAATGAG-3 ' (配列番号 8 4 )
5' -TCGACTCATTACAAACGGAGTTCTAGATCT-3' (配列番号 8 5 )
Amino acid sequence: LDLQLRLGYY (配列番号 8 6)
5， -ACTGGATCTACAACTCCGTTTGGGTTATTACTAATGAG-3' (配列番号 8 7)
5' -TCGACTCATTAGTAATAACCCAAACGGAGTTGTAGATCCAG-3' (配歹番号 8 8 )
Amino acid sequence: LDLELRL (酉己列番号 8 9)
5' -ACTGGATCTAGAACTCCGTTTGTAATGAG-3' (配列番号 9 0 )
5' -TCGACTCATTACAAACGGAGTTCTAGATCCAG T-3 ' (配列番号 9 1 )
Amino acid sequence: LDLELAAAAAA (配歹 Ij番号 9 2 )
5' -ACTGGATCTAGAACTCGCTGCCGCAGCGGCTGCATAATGAG-3' (配列番号 9 3 )
5' -TCGACTCATTATGCAGCCGCTGCGGCAGCGAGTTCTAGATCCAGT-3' (配列番号 9 4)
Amino acid sequence: LDLELRLAAA (配歹 Ij番号 9 5)
5' -ACTGGATCTAGAACTCCGTTTGGCTGCCGCATAATGAG-3' (配列番号 9 6 )
5' -TCGACTCATTATGCGGCAGCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGT-3' (配列番号 9 7 )
Amino acid sequence: LELDLAAAAAA (配列番号 9 8)
5， -CCTTGAGCTTGATCTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGAG-3' (配歹 IJ番号 9 9 )
5' -TCGACTCAAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGATCAAGCTCAAGG-3' (配列番号 1 0 0)
Amino acid sequence: LDLELRLG (配列番号 1 0 1 ) 5' -CCTGGATCTAGAACTCCGTGGTTAAG-3 ' (配列番号 1 0 2 )
5' -TCGACTTAACCACGGAGTTCTAGATCCAGG -3 ' (配列番号 1 0 3 )
Amino acid sequence: LELRL (配歹 IJ番号 1 0 4)
5' -TCTA GAA CTC CGT TTG TAA TGAG-3 ' (配列番号 1 0 5 )
5' - TCGACTCA TTA CAA ACG GAG TTC TAG A - 3， （配列番号 1 0 6 )
Amino acid sequence: FDLNFAPLDCV (配列番号 1 0 7)
5， -ATTCGATCTTAATTTTGCA.CCGTTGGATTGTGTTTAAG-3' (配列番号 1 0 8 )
5' -TCGACTCATTAAACACAATCCAACGGTGCAAAATTAAGATCGAAT-3' (配列番号 1 0 9)
Amino acid sequence: FDLNIFPPIPEF (配列番号 1 1 0)
5' -GTTTGACCTCAACATCCCTCCGATCCCTGAATTCTAAG- 3， （酉己歹 U番号 1 1 1 )
5' -TCGACTTAGAATTCAGGGATCGGAGGGATGTTGAGGTCAAAC-3' (酉己歹 lj番号 1 1 2)
Amino acid sequence: FQFDLNFPPLDCV (配列番号 1 1 3)
5' - CTTTCAATTCGATCTTAATTTTCCACCGTTGGATTGTGTTTAAG-3' (配列番号 1 1 4) 5' - TCGACTTAAACACAATCCAACGGTGGAAAATTAAGATCGAATTGAAAG-3' (酉己歹 (J番号 1 1 5)
Amino acid sequence: DLDLRL (配列番 1 1 6 )
5， -ACTGGATCTAGATCTCCGTTTGTAATGAG-3' (酉 11番号 1 1 7 )
5' -TCGACTCATTACAAACGGAGATCTAGATCCAGT-3' (配列番号 1 1 8) これらのぺプチドをコードする DNA断片を、 制限酵素 Smal と Sailで予め消化 しておいた P35S-GAL4DBDプラスミ ドに組み込み、 エフェクタープラスミ ド PGAL4DB-RDを構築した。
(2) レポーター遺伝子の構築
(2 - 1) pGAL4-LUCリポーター遺伝子の構築 （図 2) プラスミ ド pUC18 を制限酵素 EcoRI と Sstl で消化した。 pBI221 プラスミ ド (クローンテック社） を 制限酵素 EcoRI と Sstlで消化し、 Nos- ter (nopaline synthase terminator) 領域を含む 270bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動 によって単離した。 得られた断片を制限酵素 EcoRI と Sstl で消化しておいたプ ラスミ ド pUC18 の EcoRI- Sstl部位に揷入した。 カリフラワーモザイクウィルス
35Sプロモーター TATAボックスを含む相補鎖の DNA 1 ：
LGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCL
(配列番号 2 5 ) 及ぴ DNA 2 ：
iATCCAGCGTGTCCTl
(配列番号 2 6 )
を合成した。
合成した DNAを 90°C 2分加熱した後、 6 0 °Cで 1時間加熱し、 その後室温 ( 2 5 °C) で 2時間静置してアニーリングさせ 2本鎖を形成させた。 Nos - terを 持つ pUC18プラスミ ドを制限酵素 Hindlll と BamHI で消化した。 合成した 2本 鎖 DNAを pUC18の Hindlll- BamHI部位に揷入し、 TATA- boxと Nos - terを含むプ ラスミ ドを構築した。
このプラスミ ドを制限酵素 Sstlで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化 処理を行った。
ホタル .ルシフェラーゼ遺伝子（LUC)をもつプラスミ ドベクター PGV - CS2 (東 洋インキ社製） を 制限酵素 Xbal と Ncolで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平 滑末端化処理を行った後、 ァガロースゲル電気泳動によって、 ルシフェラーゼ遺 伝子を含む 1. 65 kb の DNA 断片を単離精製した。 この DNA断片を上記の TATA ボックスと Nosターミネータ一を含むプラスミ ドに揷入し、 pTATA - LUC リポータ 一遺伝子を構築した。
酵母の GAL4 タンパク質の D N A結合配列を 5コピー持つプラスミ ド pG5CAT
(Clontech社製） を 制限酵素 Smal と Xbalで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平 滑末端化処理を行った後、 5コピーの GAL4 タンパク質の D N A結合配列含む
DNA 断片をァガロースゲル電気泳動で精製した。 TATA- LUC ベクターを制限酵素
Bglllで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。 この部位に 平滑末端化した 5コピーの GAL4 タンパク質の D N A結合配列含む DNA 断片を 挿入し、 得られたプラスミ ドのうち GAL4 タンパク質の D N A結合配列が順方向 に向いているものを選抜し、 リポーター遺伝子 pGAL4-LUC を構築した （図 2参 照） 。
( 2 - 2 ) p35S-GAL4-LUCの構築 （図 3 )
プラスミ ド pBI121を鎵型として、 5末アッパープライマー：
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (配列番号 2 7 ) と
3末ローワープライマー ：
AAGGGTAAGCTTAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATC (配列番号 2 8 ) を用いて PCR を行い- CaMV 35Sプロモータ—— 800〜一 46領域を含む DNA断片を得た。 制限酵素
Hindlllで消化した後、 CaMV 35Sプロモータ1—— 800〜一 46領域含む 760bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動によって単離した。 この Hindlll断片を、 あ らかじめ制限酵素 Hindlllで消化しておいたリポーター遺伝子 pGAL4- LUCに挿入 し、 CaMV 35Sプロモーター DANが順方向に向いているものを選抜し、 p35S- GAL4 - LUC リポーター遺伝子を構築した （図 3参照） 。
( 3 ) レファレンス遺伝子の構築
ゥミシィタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセットべクタ 一 pRL-null を制限酵素 Nhel と Xbal 制限酵素で切断し、 T4 DNA ポリメラーゼ で平滑末端化処理を行った後、 ァガロースゲル電気泳動で ゥミシイタケ 'ルシ フェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精製した。 この DNA 断片をエフ ェクタープラスミ ドの構築の際に用いた GUS遺伝子を除いた pBI221ベクターの GUS遺伝子があった領域に挿入した。 得られたプラスミ ドのうち、 ゥミシイタ ケ .ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜した （pPTRL の構
( 4 ) レボータ一遺伝子の活性測定法
シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミ ドをパーティ クルガン法を用いて導入し、 エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測 定することによって調べた。
( 5 ) パーティクルガンによる遺伝子導入 上記で作成した p35S- GAL4 - LUC リポーター遺伝子とエフェクタープラスミ ド PGAL4DB-RDの DNAを各 1. 2mgと、 リファレンス遺伝子プラスミ ド 0· 32mgを直径 l mmの金粒（BioRad社製） 510ragにコーティングした。 生育期間 2 1 日目のシロ ィヌナズナ葉 7枚を、 水で湿らせた濾紙をおいた 9 c mシャーレにならべ、 Bio- Rad社製 PDS- 1000/Heボンパートメント機を用いて DNAを打ち込んだ。 2 2 °Cで 6時間明所で静置した後、 レポーター遺伝子の活性を測定した。
( 6 ) ルシフェラーゼ活性測定
6時間静置したシロイヌナズナ葉を、 液体窒素中で粉碎し、 Dual - Luciferase TM Reporter Assay System (Proraega 社製) iこ添付 れてレヽる Passive Lysis Buffer 200 1 に懸濁した後、 遠心して上清を回収した。 この細胞抽出液 20 μ 1を Dual— LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega 社製） ίこ添付されてレヽ る測定バッファー 100 μ 1に混合し、 ルミノメーター （TD20/20, Turener Design 社製） を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。 ホタル 'ルシフェラーゼ及び ゥミシィタケ .ルシフヱラーゼ活性の測定を測定キットの説明書に従って 10 秒 間の発光を積分モードでカウントした。 リファレンス遺伝子の活性値をリポータ 一遺伝子の活十生値で割り、 その相対値である Relative lucifarase activityを 測定値として求めた。 実験は、 エフェクタープラスミ ドの種類ごと 3回個別にト ランジェントアツセィ実験を行い、 平均値と標準偏差を求めた。 エフェクターを 入れない場合の P35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の活性の相対値を 1 0 0として、 エフェクタープラスミ ドを同時に細胞に導入したときにリポーター遺伝子の活性 値の変動によってエフェクターの効果を調査した。 すなわち、 p35S - GAL4-LUC レ ポーター遺伝子と各ぺプチド配列をコードする DNAを組み込んだエフェクタープ ラスミ ド pGAL4DB_RDを導入したとき、 リボータ一の活性値が減少すれば、 その ペプチドは、 レポーター遺伝子の活性を抑制する効果 （リブレッサー機能） があ ることを示している。 以下、 リポーターの活性値を測定して、 p35S- GAL4 - LUCリ ポーターの相対活性値が 1 0 0以下になる場合に、 導入したエフェクターにはリ プレツサー機能が存在すると判断した。
( 7 ) リプレッサードメインの同定
図 4 Aに、 リポーター遺伝子とエフェクタープラスミ ドの構造を示す。 図 4 B 及び下記表 1にリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
(表 1 ) プチド名 プチド配列 相対値 (％)
ERF3RD (214/225) DLDLNLAPPMEF 15.0
3RD1 LDLNLAPPMEF 14.6
3RD2 LDLNLAAAAAA 17.5
SRD1 LDLELRLGFA 2.0
SRD2 LDLELGFA 221
LELDL LELDLAAAAAA 196
Min-LDLN LDLN 153
Min-LDLNL LDLNL 150
LELRLAAAAAA 130.6
DLELRL 8.9
LDLQLRLGYY 3.8
LDLELRL 4.5
LDLELAAAAAA 72.5
LDLELRLAAA 6.9
I FT ΑΑΑΑΛΛ * U
LDLELRLG 8.9
LELRL 101.5
FDLNFAPLDCV 17.5
FDLNIFPPIPEF 16.0
FQFDLNFPPLDCV 10.9
DLDLRL 9.2
コン卜口ール GAL4DB のみ 100
上記結果に示されるように、 LDL (N/E) L又は FD LN (F/ I ) を含み-
C -末端側に少なく とも 6個のアミノ酸を持つペプチド、 あるいは D L (E/Q/
D) LRLを含むペプチドは、 リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入し ないリポーター遺伝子のみの場合 （コントロール） に比べ 85%〜98%減少させた ことから、 これらのぺプチドは転写抑制能を持つ機能ぺプチドとして機能するこ とが証明された。
対照実験として行ったぺプチド配列を含まない p35S- GAL4DBDは、 リポーター 遺伝子の活性を低下させなかった。 このことは、 GAL4DNA結合ドメインに結合し た上記べプチドが、 転写を抑制するリブレッサーとして機能していることを示し ている。
(実施例 2 ) SUP遺伝子含有エフェクタープラスミ ドによる転写抑制
( 1 ) SUP遺伝子の単離
SUP遺伝子の塩基配列は、 すでに報告されている。 シロイヌナズナ SUP遺伝子 のタンパク質コード領域の 5'側と 3，側に相当する配列をもつオリゴヌクレオチ ドをそれぞれ合成し、 これらをプライマーとして、 SUP遺伝子を含む TACライブ ラリー K14B15クローン （かずさ DNA研究所より譲渡） を铸型として、 PCRを行い、 SUP遺伝子のタンパク質コード領域を含む DNA断片を単離した。 全塩基配列を決 定し、 すでに報告されている SUP遺伝子のタンパク質コード領域であることを確 認した。 なお上記 PCR反応の条件は、 変性反応 94°C 1分、 ァニール反応 47°C 2 分、 伸長反応 74°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル行った。
( 2 ) エフェクタープラスミ ドの構築
( 2— 1 ) SUP遺伝子の全タンパク質コード領域を含むエフェクタープラスミ ド PGAL4DB-SUPの構築（図 5 )
クローンテック社製（Clontech社， USA)のプラスミ ド PBI221を制限酵素 Xhol と Saclで切断し、 T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、 ァガロースゲル電気 泳動で GUS遺伝子を除き、 CaMV 35Sと Nos - terを含む 35S- Nosプラスミ ド断片 DNAを得た。
クロ一ンテック社製の PAS2- 1ベクターを制限酵素 Hindlllで消化し、 酵母に おける転写活性化因子である GAL4DBDをァガロースゲル電気泳動によって単離 した後、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をした。 この GAL4DBDコード領 域を含む DNA断片を、 先ほどの 35S- Nosの DNAの 3 プロモーターと Nosターミ ネーター間の平滑末端にした部位に挿入し、 35Sプロモーターに対して酵母 GAL4 タンパク質の DNA 結合領域の 0RF が順方向に並んでいるものを選抜して p35S- GAL4DBD ベクターを構築した。
GAL4DBDの読み枠 （フレーム） がー致するように設計した SUP遺伝子の 5末ァ ッパープライマー primer 1 (配列番号 2 9 ： SUP遺伝子'塩基配列卜 18に結 合） ： GATGGAGAGATCAAACAGCと、
制限酵素 Sail部位を持つ 3末ローワープライマー primer 2 (配列番号 3 0 ：
SUP遺伝子塩基配列 602-641に結合） ：
GATAAAGTTATTACCGTCGACTTAAGCGAAAC
を用いて SUP遺伝子の全タンパク質コード領域 （配列番号 3 1 ：アミノ酸配列 1-204 ) を PCR法によって増幅し、 DNA断片を得た。 PCR反応の条件は、 変性反 応 94°C 1分、 ァニール反応 °C47°C 2分、 伸長反応 74°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル行った。 以下全ての PCR反応は同じ条件で行った。 得られた DNA断 片を制限酵素 Sailで消化した後、 ァガロース電気泳動によって目的とする DNA 断片を単離した。 この SUPをコードする DNA断片を、 制限酵素 Smalと Sailで予 め消化しておいた p35S- GAL4DBDプラスミ ドに組み込み、 エフェクタープラスミ ド pGAL4DB- SUPを構築した。
( 2 - 2 ) SUPのアミノ酸配列 175- 204を含むエフェクタープラスミ ド pGAL4DB- 175/204SUPの構築
GAL4DBDをコードするフレームと読み枠が一致するように設計した 5末ァッパ 一プライマー primer 3 (配列番号 3 2 ：結合部位 SUP塩基配列 522-539) ： GAATGATGAAATCATCAGと、
制限酵素 Sail部位を持つ 3末ローワープライマー primer 2 (配列番号 3 0 ： 結合部位 SUP塩基配列 602-641) ：
GATAAAGTTATTACCGTCGACTTAAGCGAAAC
を用いて SUPのァミノ酸配列 175-204 コード領域に該当する塩基配列 523-612の 領域を含む DNA断片を PCR法によって得た。 この DNA断片を制限酵素 Sailで消 化し、 ァガロース電気泳動によって目的とする DNA断片を単離し、 塩基配列を決 定した。 この SUPのァミノ酸配列 175-204をコードする DNA断片（DNA領域 523 - 612)を、 制限酵素 Smal と Sailで予め消化しておいた 35S-GAL4DBDプラスミ ドに 組み込み、 エフェクタープラスミ ド PGAL4DB- 175/204SUPを構築した。
( 2 - 3 ) 比較対照エフェクタープラスミ ドの構築 （図 6 )
シロイヌナズナ AtERF5cDNAを含むクローン pAtERF5を鏡型として、
5末アツノヽーフラづマー primer 4 ：
CATGGCGACTCCTAACGAAGTATCTGCAC (配列番号 3 3 ) と
3末ローワープライマ一 primer 5：
ATCGTTCAAAAACTCAAGGCTAACTAATCAACAACGGTC (配列番号 3 4 )
を用いて AtERF5全タンパク質コード領域を PCR法によって増幅した。 この DNA 断片を、 上記に示した平滑末端にした 35S-Nosプラスミ ド断片に組み込み、 エフ ェクタープラスミ ド p35S- AtERF5を構築した。
また、 これとは別に， SUP遺伝子及ぴ 175/204SUPを用いない他は上記手段と 同様にしてエフェクタープラスミ ド PGAL4DBを構築した。
( 3 ) レポーター遺伝子の構築
リポーター遺伝子として、 以下の手法により、 p35S- GAL4-LUC及び pGAL4 - GCC - LUCの 2種を構築した。
( 3 - 1 ) p35S-GAL4-LUCの構築 （図 2及ぴ図 3 )
a . pGAL4- LUCの構築 （図 2 ) .
プラスミ ド pUC18 を制限酵素 EcoRI と Sstl で消化した。 一方、 pBI221 プラ スミ ド （クローンテック社） を 制限酵素 EcoRI と Sstlで消化し、 Nos - ter (nopaline synthase terminator) 領域を含む 270bpの DNA断片をァガロースゲ ル電気泳動によって単離した。 得られた断片を制限酵素 EcoRI と Sstl で消化し ておいたプラスミ ド pUC18 の EcoRI- Sstl部位に挿入した。 次いで、 カリフラヮ 一モザィクウィルス 35Sプロモーター TATAボックスを含む相補鎖の DNA 1 ： 番号 3 5 ) と
DNA 2 ： 番号 3 6 ) を合成した。 合成した DNAを 90°C 2分加熱した後、 60°Cで 1時間加熱し、 その 後室温 （25°C) で 2時間静置してアニーリングさせ 2本鎖を形成させた。 Nosを 持つ PUC18プラスミ ドを制限酵素 Hindlll と BamHI で消化した。 合成した 2本 鎖 DNAを pUC18の Hindlll- BamHI部位に挿入し、 TATA- boxと Nos_terを含むプ ラスミ ドを構築した。
このプラスミ ドを制限酵素 Sstlで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化 処理した。
一方、 ホタル 'ルシフェラーゼ遺伝子（LUC)をもつプラスミ ドベクター PGV - CS2 (東洋インキ社製） を 制限酵素 Xbal と Ncolで消化し、 T4 DNA ポリメラー ゼで平滑末端化処理を行った後、 ァガロースゲル電気泳動によって、 ルシフェラ ーゼ遺伝子を含む 1. 65 kb の DNA 断片を単離精製した。 この DNA断片を上記の TATAボックスと Nosターミネーターを含むプラスミ ドに揷入し pTATA - LUC リポ 一ター遺伝子を構築した。
さらに、 酵母の GAL4 タンパク質の D N A結合配列を 5コピー持つプラスミ ド pG5CAT (Clontech社製） を 制限酵素 Smal と Xbalで消化し、 T4 DNA ポリメラ ーゼで平滑末端化処理を行った後、 5コピーの GAL4 タンパク質の D N A結合配 列含む DNA 断片をァガロースゲル電気泳動で精製した。 TATA- LUC ベクターを制 限酵素 Bglllで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。 この 部位に平滑末端化した 5コピーの GAL4 タンパク質の D N A結合配列含む DNA 断片を挿入し、 得られたプラスミ ドのうち GAL4 タンパク質の D N A結合配列が 順方向に 向いているものを選抜し、 リポーター遺伝子 PGAL4-LUC を構築した (図 2参照） 。
b . p35S- GAL4- LUCの構築 (図 3 )
プラスミ ド pBI121を錶型として、
5末アツノくープフ マー primer 6 ：
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACと （配列番号 3 7 )
3末ローワープライマー primer 7 ：
AAGGGTAAGCTTAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATC (配列番号 3 8 )
を用いて PCRを行い、 CaMV 35Sプロモータ一- 800^ 46領域を含む DNA断片を得 た。 制限酵素 Hindlllで消化した後、 CaMV 35Sプロモータ一- 800〜- 46領域含む 760bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動によって単離した。 この Hindlll断 片を、 あらかじめ制限酵素 Hindlllで消化しておいたリポーター遺伝子 pGAL4- LUCに揷入し、 CaMV 35Sプロモーター DNAが順方向に向いているものを選抜し、 P35S-GAL4-LUCリポーター遺伝子を構築した （図 3参照） 。
( 3 - 2 ) pGAL4- GCC- LUCの構築 （図 7及び図 8 )
4個の GCC box配列 （AGCCGCC) を含む 45bpDNAの相補鎖 （下記） を合成し、 70°Cで 15分間加熱した後、 室温で 60分放置し、 ァニールさせ、 2本鎖 DNAとし た。
5 ' -GATCAGCCGCCGATCAGCCGCCGATCAGCCGCCGATCAGCCGCC- 3 ' (配列番号 3 9 ) 3 ' -TCGGCCGGCTAGTCGGCGGCTAGTCGGCGGCTAGTCGGCGGGATC- 5， （配列番号 4 0 ) この 4 5 b pの DNA断片を、 制限酵素 Bglllで予め消化しておいた上記の TATA - LUC ベクターと 1 ： 1のモル数になるように混合し、 T4 リガーゼを用いてライ ゲーションを行い、 GCC boxを含む DNA断片が順方向に入っているものを選択し、 プラスミ ド pGCC- LUCを構築した。 このプラスミ ドを制限酵素 Bgl IIで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を行った （図 7参照） 。
一方、 酵母の GAL4 タンパク質の DNA結合配列を 5コピー持つプラスミ ド pG5CAT (Clontech社製） を 制限酵素 Smal と Xbalで消化し、 T4 DNA ポリメラ ーゼで平滑末端化処理を行った後、 5コピーの GAL4タンパク質の DN A結合配 列含む DNA 断片をァガロースゲル電気泳動で精製した。 この DNA断片を、 平滑 末端処理をした、 pGCC- LUCプラスミ ドに挿入し、 GAL4配列が順方向に入ってい るものを選択し、 PGAL4-GCC-LUCリポーター遺伝子を構築した （図 8参照） 。
( 4 ) パーティクルガンによる遺伝子導入
PGAL4-LUCレポーター遺伝子 L 6 X g、 エフェクタープラスミ ド として
PGAL4DB - SUP、 又はそのデレーシヨンである pGAL4DB - 175/204SUP の ϋΝΑ1.2μ g、 比較対照プラスミ ド p35S- AtERF5又は pGAL4DBl.2μ g , 及び リファレンス遺伝 子プラスミ ド 0.32μ gを直径 l mmの金粒（BioRad社製） 510 gにコーティング した。 生育期間 2 1 日目のシロイヌナズナ葉 7枚を、 水でしめらせた濾紙をおい た 9 c mシャーレにならべ、 Bio - Rad社製 PDS- 1000/Heボンバートメント機をも ちいて DNAを打ち込んだ。 次いで、 2 2 °Cで 6時間明所で静置した後、 レポータ 一遺伝子の活性を測定した。
( 5 ) ルシフニラーゼ活性測定
6時間静置したシロイヌナズナ葉を、 液体窒素中で粉砕し、 Dual- Lucif eraseTM Reporter Assay System (Promega 社 ) に添付されてレヽる Passive Lysis Buffe OO/i 1に懸濁した後、 遠心して上清を回収した。 この細 胞抽出液 20 μ ΐ ¾r Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega 社製） に添付されている測定バッファー 100 1に混合し、 ルミノメーター (TD20/20, Turener Design社製） を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。 ホタル 'ル シフェラーゼ及びゥミシィタケ 'ルシフヱラーゼ活性の測定を測定キットの説明 書に従って 10 秒間の発光を積分モードでカウントした。 リファレンス遺伝子の 活性値をリポーター遺伝子の活性値で割り、 その相対値である Relative lucifarase activityを測定値として求めた。 実験は、 エフヱクタ一プラスミ ド の種類ごと 3回個別にトランジェントアツセィ実験を行い、 平均値と標準偏差を 求めた。 エフェクターを入れない場合の p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の活性 の相対値を 1 0 0、 pGAL4 - GCC- LUCリポーター遺伝子の相対値を 1として、 エフ エタタープラスミ ドを同時に細胞に導入したときにリポーター遺伝子の活性値の 変動によってエフェクターの効果を調査した。
図 9 Aは、 リポーター遺伝子とエフェクタープラスミ ドを示す図である。 図 9 Aにおいて、 5XGAL4は GAL4転写因子 DNA結合配列、 TATAは CaMV35Sプロモータ 一 TATAボックスを含む領域、 LUCはルシフエラーゼ遺伝子、 CaMV35Sは力リフラ ヮーモザイクウィルス 35Sタンパク質遺伝子プロモーター、 GAL4DBは酵母 GAL4 転写因子 DNA結合ドメインコード領域、 Nosはノパリン合成酵素遺伝子転写終止 領域をそれぞれ表す。
図 9 Bは SUP及び SUPのディリーションがリポーター遺伝子の活性（Relative
Activity)に及ぼす影響 を示す図である。 図 9 Bにおいて、 左の数字 （175/204' 等） は、 SUPのアミノ酸領域を示す。 真ん中のボックスは左の数字に該当するァ ミノ酸配列領域を示す。 右のグラフは、 左の領域をもつエフェクタープラスミ ド を導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す。 図 9 Bの結果によれば、 p35S - GAL4- LUCレポーター遺伝子と pGAL4DB- SUPエフ エタタープラスミ ドを導入したときのリポーターの活性値が減少することから、 PGAL4DB- SUPは、 レポーター遺伝子の活性を抑制する効果 （リプレッサー機能） があることを示している。 PGAL4DB- SUPエフェクターは、 リポーター遺伝子の活 性をエフェクターを導入しないリポーター遺伝子のみの場合 （コントロール） に 比べ 7 5 %減少させた （図 9 B ； 1/204) 。 対照実験として行った SUPのコード 領域を含まない p35S- GAL4DBは、 リポーター遺伝子の活性を低下さなかった。 こ のことは、 SUPが転写を抑制するリブレッサーとして機能していることを示して いる。
また、 SUP遺伝子のタンパク質コード領域をディリーションした DNA断片をも つエフェクタープラスミ ドである pGAL4DB - 175/204SUPは、 pGAL4DB- SUPを導入 した場合よりもさらなる抑制効果を示し、 レポーター遺伝子の活性を 95%抑える リプレッサー機能があることが示された。 （図 9 B ； 175/204SUP ) 。
この結果から、 SUPのリプレッサー機能を持つ領域 （リプレッションドメイ ン） は、 SUPのアミノ酸配列、 175 - 204領域に存在することが明らかとなった。 このアミノ酸配列を配列番号 6 1に示した。
図 1 0 Aは、 リポーター遺伝子 （PGAL4 - GCC-LUC ) と各種エフェクタープラス ミ ドを示す図である。
また、 図 1 0 Bによれば、 pGAL4-GCC-LUCリポーター遺伝子と、 転写活性化能 を持つことが示されている P35S-AtTERF5エフェクタープラスミ ドをシロイヌナ ズナ葉にパーティクルガンで導入すると、 リポーター遺伝子の活性は、 エフェク タープラスミ ドを導入しない場合 （1 とする） に比べ、 1 5倍以上上昇した。 リ ポーター遺伝子と p35S - AtERF5さらに pGAL4DB - SUPを同時に導入した場合、 リポ 一ター遺伝子の活性は、 2 . 5倍程度にしか上昇しなかった。 よって、 このこと は、 SUPタンパク質は、 AtERF5の転写活性化能を 84% (1- 2. 5/15)抑制する効果を 持つことを示している。 さらに、 SUPのデイリーシヨン領域を持つ pGAL4DB- 175/204SUPを GAL4- GCC - LUC リポーター遺伝子と pATERF5ェフエクタ一と同時に 導入した場合、 リポーター遺伝子の活性を 9 0 %抑制する効果を示した。 p35S-
AtERF5によるリポーター遺伝子の活性の上昇は、 PGAL4DBを導入した場合には、 影響されないことから、 リポーター遺伝子の転写抑制効果は、 SUPタンパク質の 効果であることを示している。
(実施例 3 ) SUP リプレッションドメイン 175 - 204 をコードする遺伝子による. 植物体における EIN3の転写活性化機能の抑制
( 1 ) 形質転換用ベクター pBIG2の構築
クローンテック社製 （Clontech社， USA) のプラスミ ド p35S— GFPを制限酵素 Hindlllと BamHIで切断し、 力リフラワーモザィクウィルス 35Sプロモーター
(CaMV 35S) を含む D N A断片をァガロースゲル電気泳動で分離し回収した。 米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクター pBIG— HYG
(Becker, D. 1990 Nucleic Acid Research, 18 : 203) を制限酵素 Hindlll と Sst Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動によって GUS遺伝子を除いた DNA断片 を得た。
以下の配列を有する DNAを合成し、 70°Cで 10分加温した後、 自然冷却により ァニールさせて 2本鎖 DNAとした。 この DNA断片には、 5 '末端に BamHI制限酵 素部位、 翻訳効率を高めるタバコモザイクウィルス由来の omega配列、 及び制限 酵素部位 Smal、 Sailを有する。
5' -（
CGAGCTC-3' (配列番号 4 1 )
5' _(
G-3 ' (配列番号 4 2 )
CaMV 35Sプロモーター領域をふくむ DNA断片と合成した 2本鎖 DNAを GUS遺 伝子を除いた pBIG—HYGの HindIII、 Sstl部位に揷入し、 植物形質転換用べクタ 一 PBIG2を得た。
( 2 ) 形質転換べクタ一 pEIN3SUPRDの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、 EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを鍚 型として、
5末アツノ一プライマー primer 8 ：
AATGATGTTTAATGAGATGGG (配列番号 4 3 ) と 3末ローワープライマー primer 9 ：
ATGAATCCCCGGGATATTATTC (配列番号 4 4 )を用いて、 EIN3のァミノ酸配列 1一 162コード領域に該当する塩基配列 1一 485の領域を含む DNA断片を PCR法によ つて増幅し、 制限酵素 Smalで切断した後、 ァガロース電気泳動によって目的と する DNA断片を単離した。 この断片を制限酵素 Smalで切断した pBIG2に挿入し、 順方向にクローニングされているものを単離し、 pBIG2- EIN3 - 1/162を得た。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを制限酵素 Smalと Pstlで切断し、 ァ ガロース電気泳動によって EIN3のアミノ酸配列 163— 565の領域をコードする DNA断片 (487-1695) を単離した。 この DNA断片を、 制限酵素 Smalと Pstlで切 断しておいたクローニングベクター pBluescriptllに挿入しプラスミ ド pEIN3- 163/565を作成した。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを铸型として、
5末アツノく一プライマー primer 1 0 ：
CGACACTGCAGATCACAAC (配列番号 4 5 ) と
3末端の終止コドン TAAを CCCに変換した、 3末ローワープライマー primer l
ATCCCGAACCATATGGATACATCTTGCTGC (配列番号 4 6 ) を用いて EIN3のァミノ酸 配列 566— 628コード領域に該当する塩基配列 （1696-1884) の領域を含む DNA断 片を PCR法によって増幅し、 制限酵素 Pst Iで切断した後、 ァガロース電気泳動 によって単離した。
先に述べた実施例 2 ( 2 ) ( 2 - 2 ) と同様にアミノ酸の読み枠が一致するよ うに作成しておいた、 3 '末端に制限酵素 Sail部位を有する SUPのアミノ酸配列
175- 204コード領域に該当する塩基配列 (523-612) の領域を含む DNA断片と、
EIN3のァミノ酸配列 566— 628コード領域に該当する塩基配列 （1696 - 1884) の 領域を含む DNA断片を、 制限酵素 Pstl、 Sailで切断しておいた上記 pEIN3 -
163/565に挿入し、 PEIN3-163/628-SupRDを作成した。
プラスミ ド pEIN3- 163/628- SupRDを、 制限酵素 Smalと Sailで切断し、 EIN3 のァミノ酸配列 163— 628領域と SUPの Π5 - 204の領域をコードする DNA断片を、 ァガロース電気泳動によって単離した。 単離した断片を、 上記で述べた PBIG2- EIN3 - 1/162を制限酵素 Smalで切断した pBIG2-EIN3- 1/162に挿入し、 35S- EIN3 - SupRD-Nosを含む形質転換ベクター pEIN3SUPRDを得た。
( 3 ) pEIN3SUPRDで形質転換した植物体の作成
PEIN3SUPRDによるシロイヌナズナ植物の形質転換は、 Transfomation of Arabidopsis thal iana byvacuum inn ltration (http ： // www. bch. msu.
edu/pamgreen/protocol . htm) に従った。 ただし、 感染させるのにバキユウムは 用いないで、 浸すだけにした。 プラスミ ド pEIN3RDを、 土壌細菌
[ (Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58ClRifr) pMP90 (Gmr) (koncz and Schell 1986) 〕 株にエレク トロポレーシヨン法で導入した。 導入 した菌を 1 リットルの YEP培地 （下記表 2 ) で 0D600が 1になるまで培養した。 (表 2 )
一 YEP medium (1 l iter;
10g Bactopeptone
lOg yeast extraxt
5 NaCl
次いで、 培養液から菌体を、 回収し、 1 リットルの感染用培地 （Infi ltrat ion medium) (下記表 3 ) に懸濁した。
(表 3 )
Infiltration medium (l l iter)
2. 29g MS salt
50g Sucrose
0. 5g MES to pH 5. 7 with 画
0. 044 μ M benzylaminopurine
0. 2ml Si l et L - 77
この溶液に、 14日間生育したシロイヌナズナを 1分間浸し、 感染させた後、 再ぴ生育させ結種させた。 回収した種子を 50%ブリーチ、 0. 02% Triton X— 100溶液で 7分間滅菌した後、 滅菌水で 3回リンスし、 滅菌したハイグロマイシ ン選択培地 （下記表 4 ) に蒔種した。
(表 4 ) ハイグロマイシン選択培地 ·
4. 3 g/1 MS salt
1% Sucrose
0. 5g/l MES to pH 5. 7 with KOH
0. 8% Phytagar
30 g/ml Hygromicine
500 ml Vamcromicine
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体を選抜し、 土壌に植え 換え、 次世代の種子を得た。
( 4 ) 形質転換植物のエチレン感受性の有無
得られた次世代 （T2) の形質転換植物の種子を、 エチレンの前駆体である 1- aminocyclopropane-D-carboxyl ic aci d (ACC) 力 S最終濃度 10uM添カロされ、 滅菌 された生育培地を含む MSプレート （下記表 5 ) に蒔種した。
(表 5 )
MSプレート選択培地
4. 3 g/1 MS salt
1% sucrose
0. 5g/l MES to pH 5. 7 with KOH
0. 8% Phytagar ACC (final 10 M)
上記種子を、 4°Cで 3日間低温処理した後、 喑所 22°Cで 3日間生育させ、 定法 に従って、 エチレン応答を示す生理現象である黄化芽生えでのトリプルレスポン ス （3重応答） を観察した。 結果を図 1 1及び図 1 2に示す。
図 1 1及び図 1 2によれば、 野生株である Col- 0は、 ACCの存在下で、 茎長 フックが屈曲し、 根の伸長が抑制されるトリプルレスポンスを示すが、
PEIN3SUPRDで形質転換した植物体 （図 1 1 ； 35S : : EIN3SUPRD) では、 EIN3の変 異体である ein3植物体 （図 1 1 ； ein3- 1) と同様に、 茎長の屈曲及び根の伸長 阻害がみられず、 エチレン非応答性の形質を示した。 また、 常光下で生育させた 野生型植物体は、 エチレンガス （lOOppm lml/min ) 常時存在下で、 エチレン応 答性の生理現象である矮性の植物体になるが、 pEIN3SUPRDで形質転換した植物 体 （図 1 2 ； 35S :： EIN3SUPRD) では、 EIN3の変異体である ein3植物体 （図 1 2 ； ein3- l) よりもやや大きな植物体となった。
さらに、 野生型ではエチレンで発現が誘導され、 エチレン非応答性の変異体で ある ein3植物体ではエチレンで発現が誘導されない遺伝子である PDF1. 2遺伝子、 塩基性キチナーゼ （BCHN) 遺伝子及び Ethylen Responsive Factorl (ERF1) 遺 伝子の発現について、 野生型と pEIN3SUPRDで形質転換した植物体から RNAを精 製し、 ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨン法を用いて調べた。
その結果、 図 1 3に示すように、 エチレン処理 （ΙΟΟρρΜエチレンガス、 12時 間） した野生型（図 1 3 ： Col— 0) では、 PDF1. 2、 ERF1及び BCHN遺伝子の発現 の誘導がみられた。 一方、 pEIN3SUPRDで形質転換した植物体（図 1 3 ：
35S : : EIN3SUPRD) は、 エチレン処理を行っても、 ein3変異体植物同様 PDF1. 2、 ERF1及ぴ BCHN遺伝子の発現の誘導がみられず、 エチレン非応答性の形質を示し た （図中、 EF (elongation factor)は内十生コントローノレを示す） 。
以上の結果から、 SUPの 175— 204のァミノ酸配列を持つぺプチド及びそれを コードする遺伝子は、 任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有して いることが明らかとなった。
(実施例 4 ) E R F 3 リプレッションドメイン 191-225をコードする遗伝子によ る、 植物体における EIN3の転写活性化機能の抑制
( 1 ) 形質転換用ベクター pBIG2の構築
形質転換用ベクター PBIG2の構築は実施例 3 ( 1 ) と同様にして行った。
( 2 ) 形質転換べクタ一 pEIN3RDの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、 EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを鍀 型として、
5末アツノく一プライマー primer 8 ：
AATGATGTTTAATGAGATGGG (配列番号 4 3 ) と
3末ローワープライマー primer 9 ：
ATGAATCCCCGGGATATTATTC (配列番号 4 4 )を用いて、 EIN3のアミノ酸配列 1一
162 コード領域に該当する塩基配列 1一 485の領域を含む DNA断片を PCR法によ つて増幅し、 制限酵素 Smalで切断した後、 ァガロース電気泳動によって目的と する DNA断片を単離した。 この断片を制限酵素 Smalで切断した pBIG2に挿入し, J噴方向にクローニングされているものを単離し、 pBIG2- EIN3 - 1/162を得た。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを制限酵素 Sraal と Pstlで切断し、 ァ ガロース電気泳動によって EIN3のアミノ酸配列 163— 565の領域をコードする DNA断片 （487-1695) を単離した。 この DNA断片を、 制限酵素 Smalと Pstlで切 断しておいたクローニングベクター pBluescriptllに挿入しプラスミ ド pEIN3- 163 /565を作成した。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを鎵型として、
5末アツノく一プライマー primer 1 0 ；
CGACACTGCAGATCACAAC (配列番号 4 5 ) と
3末端の終止コドン TAAを CCCに変換した、 3末ローワープライマー primer l
ATCCCGAACCATATGGATACATCTTGCTGC (配列番号 4 6 ) を用いて EIN3のアミノ酸 配列 566— 628コード領域に該当する塩基配列 （1696-1884) の領域を含む DNA断 片を PCR法によって増幅し、 制限酵素 Pst Iで切断した後、 ァガロース電気泳動 によって単離した。
3'末端に制限酵素 Sail部位を有する ERF3のアミノ酸配列 191—225をコード する領域に相当する塩基配列 （571-675) の領域の DNA断片を、 EIN3のカルポキ シル基末端とフレームと読み枠が一致するように設計した。 なお、 ERF3の全長 遺伝子の塩基配列及びそのアミノ酸配列は配列番号 5 3に示すとおりである。 5末アッパープライマー primer 1 2 (配列番号 4 7 ；結合部位 ERF3塩基配列 569- 593) ：
AGTGGGTCCTACTGTGTCGGACTCと
制限酵素 Sail部位を持つ 3末ローワープライマー primer l 3 (配列番号 4 8 ；結合部位 ERF3塩基配列 661 -678) ：
CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAAATTCCATAGGTG
を用いて ERF3のアミノ酸配列 191-225コード領域に該当する塩基配列 （571 -
675) の領域を含む蘭 A断片を PCR法によって得た。 この DNA断片を制限酵素 Sailで消化し、 ァガロース電気泳動によって目的とする DNA断片を単離した。 この ERF3のリプレツションドメインをコードする DNA断片と、 EIN3のァミノ 酸配列 566— 628をコードする塩基配列 （1696-1884) の DNA断片を、 制限酵素 Pst I -Sal Iで切断しておいた上記 pEIN3— 163/565に挿入し、 pEIN3— 163/628 一 RDを作成した。
プラスミ ド pEIN3— 163/628— RDを、 制限酵素 Sma lと Sai lで切断し、 EIN3 のアミノ酸配列 163— 628領域と ERF3の 191一 225の領域をコードする DNA断片 を、 ァガロース電気泳動によって単離した。 単離した断片を、 上記で述べた PBIG2-EIN3- 1/162 を制限酵素 smal で切断した pBIG2— EIN3— 1/162 に挿入し, 35S— EIN3— RD— Nosを含む形質転換ベクター pEIN3RDを完成させた。
( 3 ) 比較対照形質転換ベクターの構築
上記と同じ方法で、 下記配列の ERF3の 191一 225のリプレッションドメインの 215と 217番目のァスパラギン酸を共にァラニンに置換した変異ドメインを持つ RDmをコードする DNA断片を揷入し pEIN3RDmを完成させた。
VGPTVSDSSSAVEENQYDGKRDIALALNLAPPMEF (配列番号 4 9 )
ァラニン置換した変異ドメインをコードする DN Aは、 以下の 両ス トランド を合成した。
TTGATCTTGATCTTAACCTTGCTCCACCTATGGAATTTTGAG-3' (配列番号 5 0 )
GGTTCTCTTCCACTGCAGAGGACGAGTCCGACACAGTAGGACCCACT-3 (配列番号 5 1 )
( 4 ) pEIN3RDで形質転換した植物体の作成
実施例 3 ( 3 ) と同様にして、 形質転換ベクター PEIN3PRD及ぴ比較対照形質 転換ベクター pEIN3RDmを用いてシロイヌナズナ植物の形質転換を行い、 さらに ハイグロマイシンプレートで選抜し、 次世代の種子を得た。
( 5 ) 形質転換植物のエチレン感受性の有無
得られた次世代 （T2) 形質転換植物の種子を、 実施例 3 ( 4 ) と同様にして生 育させ、 エチレン応答を示す生理現象である、 黄化芽生えでのトリプルレスボン ス （3重応答） を観察した。 同一条件下で野生株 Col- 0及ぴ EIN3の変異体であ る ein3植物体のエチレン応答性も観察した。 結果を図 1 1、 図 1 2に示す。
図 1 1によれば、 野生株である Col - 0は、 ACCの存在下で、 茎長フックが屈曲 し、 根の伸長が抑制される トリプルレスポンスを示す。 また、 ERF3の 191— 225 のリプレッションドメインの 215と 217番目のァスパラギン酸を共にァラニンに 置換した変異ドメインを持つ RDmを有する pEIN3-RDmで形質転換された植物体
(図 1 1 ； 35S : : EIN3RDm) も、 上記野生株 Co!l-Oと同様のエチレン応答性を示す。 これに対して、 pEIN3RD で形質転換された植物体 （図 1 1 ； 35S： : EIN3RD) では、 EIN3の変異体である ein3植物体（図 1 1 ； ein3- 1)と同様に、 茎長の屈曲及び根 の伸長阻害がみられず、 ェチレン非応答性の形質を示した。
また、 図 1 2によれば、 常光下で生育させた野生型植物体は、 エチレン
(lOOppm, 1 2時間） 常時存在下で、 エチレン応答性の生理現象である矮性の植 物体 （図 1 2 ； Col-1) になるが、 pEIN3RDで形質転換した植物体 （図 1 2 ； 35S : : EIN3RD) では、 EIN3の変異体である ein植物体 （図 1 2 ； ein3 - 1) とほと んど変わらない大きさを示した。
さらに、 野生型ではエチレンで発現が誘導されるが、 エチレン非応答性の変異 体である ein3植物体ではエチレンで発現が誘導されない遺伝子である PDF1. 2遺 伝子、 塩基性キチナーゼ （BCHN) 遺伝子及び Ethylen Responsive Fa c tori (ERF - 1)遺伝子の発現について、 野生型と PEIN3RDで形質転換した植物体から RNAを精 製し、 ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨン法を用いて調べた。
その結果、 図 1 3に示すように、 エチレン処理 （ΙΟΟρρΜエチレンガス、 12時 間） した野生型では、 PDF1. 2、 ERF- 1 及び BCHN 遺伝子の発現の誘導がみられる。 一方、 pEIN3RDで形質転換した植物体では、 エチレン処理を行っても、 ein3変異 体植物同様 PDF1. 2, ERF1及び BCHN遺伝子の発現の誘導がみられず、 エチレン非 応答性の形質を示した。
以上の結果から、 ERF3の 191一 225のァミノ酸配列を持つぺプチド及びそれを コードする遺伝子は、 任意の転写活性化因子を転写抑制因子に変換できる能力を 持つことが明らかとなった。
(実施例 5 ) ぺプチド DLDLELRLGFA (SRD； SUP リプレッションドメイン 194-204 に対応）をコードする遺伝子による、 植物体における CUC1の転写活性化機能の抑 制
(1) 形質転換用ベクター PBIG2の構築
形質転換用ベクター PBIG2の構築は、 実施例 3 (1) と同様にして行った。
(2) 形質転換ベクター pCUClSRDの構築
ァミノ酸ぺプチド DLDLELRLGFA (SRDという） と、 転写因子 CUC- SHAPED
C0TYKED0N1 (CUCl) のタンパク質コード領域 （配列番号 54 )のカルボキシル末 端とが結合した状態のァミノ酸配列（VSVWPFTLDLDLELRLGFA)になるように、 かつ CUC1遺伝子のコード領域から終止コドンを削除した配列と SRDのコード領域と の読み枠が一致するように、 相補鎖 (3'コンプリメント DNA) である以下の配列 を合成した。 列番号 55 )
—方、 CUC1遺伝子のタンパク質コード領域の 5'領域に相当する以下の DNA配列 を合成した。
5' -GGGATGGATGTTGATGTGTTTAACGG-3' (配列番号 56 )
これらの 2個の一本鎖 DNAをプライマーとして、 奈良先端大学田坂教授より譲 渡された CUCl cDNAの全長を含むクローンを鎳型にもちいて PCRを行い、 CUC1 コード領域と SRDが融合した CUC1SRD遺伝子を作成した。 PCRの反応条件は、 上 記と同じである。
得られた DNA試料からァガロース電気泳動によって目的とする DNA断片を単離 し、 制限酵素 Smalで切断した pBIG2に挿入し、 順方向にクローニングされてい るものを単離し、 p35S::CUClSRDを得た。
( 3 ) p35S: :CUC1SRDで形質転換した植物体の作成
実施例 3 (3) と同様にして、 p35S::CUClSRDによるシロイヌナズナ植物の形 質転換を行った。
(4) 形質転換植物の発芽体の形質
得られた形質転換植物 （35S::CUC1SRD) の発芽体の形質を図 1 5 (右） に示す。 また、 '比較として、 野生株 Col- 0及ぴ cuclん uc2の二重変異体における子葉の 形態を図 1 5 (左） 及び図 1 5 (中） にそれぞれ示す。
野生株 Col- 0の子葉は、 2枚に別れており、 基部、 葉体部のいずれにおいても 融合は見られなかった。 一方、 cuclん uc2の二重変異体では、 2枚の子葉が、 そ の両片部のほとんどの領域で融合しており、 カップ状の形質（cup- shaped cotyledon)を不した。
p35S：： CUC1SRDで形質転換したシロイヌナズナ植物体ではハイグロマイシン存 在下で生育する全ての発芽体において、 子葉の基部から葉状部にかけて、 一部な いし大部分が融合した形状を示した。 この形質は、 cuc lん uc2の二重欠損株で 見られる形状と非常に似ている。 また、 子葉の一部が融合した形質は、 cuc l /stm - 1の二重欠損株で見られる形状とほぼ同様であった（Plant Cell, 9， 841, 1997； Development, 126, 1563， 1999； Development, 128, 1127, 2000)。 さら に、 これらの形質転換植物においては、 ほとんどのもので、 頂芽分裂組織の形成 が見られなかった。
以上の結果から、 DLDLELRLGFA (SUPリプレツションドメイン 194-204に対応） のアミノ酸配列を持つぺプチド及びそれをコードする遺伝子は、 任意の転写因子 を転写抑制因子に変換できる能力を有していることが明らかとなった。
(実施例 6 ) ぺプチド LDLELRLGFA (SRD1； SUP リプレッションドメイン 195- 204に対応） 、 及ぴぺプチド LDLNLAPPMEF (RD ERF3 リプレッションドメイン 215-225に対応）をコードする遺伝子による、 植物体における EIN3の転写活性化 機能の抑制
( 1 ) 形質転換用ベクター PBIG2の構築
形質転換用ベクター pBIG2の構築は実施例 3 ( 1 ) と同様にして行った。
( 2 ) 形質転換ベクター PEIN3SUPRDの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、 EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを錶 型として、
5末アツノ、0—プライマー primer 8 ；
AATGATGTTTAATGAGATGGG (配列番号 4 3 ) と
3末ローワープライマー primer 9 ； ATGAATCCCCGGGATATTATTC (配列番号 4 4 )を用いて、 EIN3のァミノ酸配列 1- 162コード領域に該当する塩基配列 1— 485の領域を含む DNA断片を PCR法によ つて増幅し、 制限酵素 Smalで切断した後、 ァガロース電気泳動によって目的と する DNA断片を単離した。 この断片を制限酵素 Smalで切断した PBIG2に揷入し. 順方向にクローニングされているものを単離し、 PBIGII-EIN3- 1/162を得た。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを制限酵素 Smalと Pstlで切断し、 ァガ ロース電気泳動によって EIN3のアミノ酸配列 163 - 565の領域をコードする DNA 断片 （487-1695) を単離した。 この DNA断片を、 制限酵素 Smalと Pstlで切断し ておいたクローニングベクター pBluescriptllに挿入しプラスミ ド PEIN3-163 - 565を作成した。
EIN3cDNAの全長を含む pEIN3クローンを铸型として、
5末アツノく一プライマー primer 1 0 ：
CGACACTGCAGATCACAAC (配列番号 4 5 ) と
3末端の終止コドン TAAを CCCに変換した、 3末ローワープライマー primer 1
ATCCCGAACCATATGGATACATCTTGCTGC (配列番号 4 6 )
を用いて EIN3のァミノ酸配列 566-628 コード領域に該当する塩基配列 （1696 - 1884) の領域を含む DNA断片を PCR法によって増幅し、 制限酵素 Pst lで切断し た後、 ァガロース電気泳動によって単離した。
前記実施例 2 ( 2 ) ( 2 - 2 ) と同様にアミノ酸の読み枠が一致するように作 成しておいた、 3 '末端に制限酵素 Sail部位を有する S R D 1 (LDLELRLGFA)のァ ミノ酸配列をコードするように設計した DNAの両鎖である配列：
5' -CCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAA-3' (配列番号 5 7 )
5' -TCGACTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGG-3' (配列番号 5 8 )
又は、 アミノ酸の読み枠が一致するように作成しておいた、 3 '末端に制限酵素 Sail部位を有する R D 1 (LDLNLAPPMEF) のァミノ酸配列をコードするように設 計した DNAの両鎖である配列：
5' -CCTTGATCTTAACCTTGCTCCACCTATGGAATTTTGA-3' (配列番号 5 9 )
5' -TCGACTCAAAATTCCATAGGTGGAGCAAGGTTAAGATCAAGG-3' (配列番号 6 0 ) を、 実施例 2で示した方法でァニーリングした DNAと、 EIN3のァミノ酸配列コ 一ド領域に該当する塩基配列 1696-1884の領域を含む DNA断片を、 制限酵素 Pstl、 Sailで切断しておいた上記 pEIN3- 163/565に挿入し、 pEIN3_163/628 - SRD1及ぴ pEIN3 - 163/628- RD1を作成した。
プラスミ ド pEIN3 - 163/628- SRD1及び pEIN3 - 163/628- RD1を、 制限酵素 Smalと Sailで切断し、 SRD1又は RD1をコードする領域と EIN3のアミノ酸配列 163 - 628 領域を融合させた DNA断片を、 ァガロース電気泳動によって単離した。 単離した 断片を、 実施例 3 ( 2 ) と同様にして得た PBIG2-EIN3- 1/162を制限酵素 Smalで 切断した pBIG2- EIN3-1/162に挿入し、 CaMV35S - EIN3- SupRD_Nosを含む形質転換 ベクタ一 pEIN3SRDl及ぴ pEIN3RDlを得た。
( 3 ) pEIN3SRDl又は pEIN Dlで形質転換した植物体の作成
実施例 3 ( 3 ) と同様にして pEIN3SRDl又は pEIN3RDlによるシロイヌナズナ 植物の形質転換を行い、 次世代の種子を得た。
( 4 ) 形質転換植物のエチレン感受性の有無
実施例 3 ( 4 ) と同様にして種黄化芽生えでのトリプルレスポンス （三重応 答） を観察した。 結果を図 1 6及ぴ図 1 7に示す。
図 1 6及び図 1 7によれば、 野生株である Col- 0は、 ACCの存在下で、 茎長フ ックが屈曲し、 根の伸長が抑制されるトリプルレスポンスを示すが、 pEIN3SRDl 又は PEIN3RD1で形質転換した植物体 （図 1 6 ； 35S： EIN3SRD1, 35S： EIN3RD1) では、 EIN3の変異体である ein3植物体 （図 1 6 ； ein3- 1) と同様に、 茎長の屈 曲及び根の伸長阻害がみられず、 エチレン非応答性の形質を示した。 また、 常光 下で生育させた野生型植物体は、 エチレンガス （lOOppm) 常時存在下で、 ェチレ ン応答性の生理現象である矮性の植物体になるが、 PEIN3SRD1又は pE 3RD1で 形質転換した植物体 （図 1 7 ； SRD1, RD1) では、 EIN3の変異体であるェチレ ン非感受性突然変異体 ein3植物体 （図 1 7 ； ein3) をエチレン存在下で生育さ せた植物と同様な大きさを示した。
以上の結果から、 LDLELRLGFA及ぴ LDLNLAPPMEFのアミノ酸配列を持つぺプチ ド及びそれをコードする遺伝子は、 任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる 能力を有していることが明らかとなった。 (実施例 7 ) ペプチド： LDLDLELRLGFA (SRDX； SUP リプレッションドメイン 193-204に対応） をコードする遺伝子による、 植物体における PRODUCTION- OF - ANTH0CYANIN-PIGMENT1 (PAP1) 転写因子の機能変換
( 1 ) 形質転換用ベクター P35S:： PAP1SRDXの構築
( 1一 1 ) PAPlcDNAの単離
シロイヌナズナ cDNAライブラリーより、 以下のプライマーを用いて終止コド ンを除く PAP1のコード領域のみを含む DNA断片を PCRを用いて増幅し、 ァガロ ース電気泳動により分離し回収した。 なお、 PCR の条件は実施例 3と同様である c 5' プライマー ：
5' -AAAATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGG-3' (配列番号 6 2)
3' プライマー ：
5' -ATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCGAAAAGACTC-3' (配列番号 6 3 )
得られた PAP1遺伝子の cDNAおよびコードするアミノ酸配列を配列表の配列番 号 6 6に示す。
( 1 - 2) ぺプチド LDLDLELRLGFA (SRDX) をコードする遺伝子の合成
一方、 1 2アミノ酸ペプチド LDLDLELRLGFA (SRDX) をコードし、 3 '末端に 終止コドン TAAを持つように設計した、 以下の配列を有する DNAをそれぞれ合成 し、 実施例 3と同様にァニールして 2本鎖 DNAとした。
5' - CTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG- 3， （配列番号 6 4 )
5' - CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAG- 3， （配歹 IJ場号 6 5 )
( 1 - 3) 形質転換ベクターの作成
上記で得た PAP1遺伝子タンパク質コード領域のみを含む DNA断片と SRDXのコ 一ド領域を含む DNA断片を、 実施例 3と同様にして、 制限酵素 Smalで切断した PBIG2に揷入し、 順方向にクローニングされているものを単離し、 形質転換べク ター p35S:： PAP 1 SRDXを得た。
( 2) 形質転換ベクター p35S:： PAP1SRDXにより形質転換した植物体の作成 形質転換ベクター P35S: :PAP1SRDXにより形質転換して得たシロイヌナズナ植 物の次世代種子と、 比較のための野生株 （Col - 0) の種子とを、 3 %のショ糖を 含む MS寒天培地及びショ糖を含まない MS寒天培地上に蒔種し、 実施例 3と同様 の条件下で生育させた。 その結果、 野生型の発芽体では、 ス トレスを与える条件 である 3 %のショ糖を含む MS寒天培地において、 アントシァニンの特徴を示す 赤紫色の色素を蓄積した。 これに対して、 p35S : : PAP1SRDXで形質転換したシロ ィヌナズナ植物の発芽体では、 この色素の蓄積が見られなかった （図 1 8 A ) 。 また、 アントシァニンの合成系であるフエニルプロパノィ ド合成に関わる遺伝 子である dihydroflavonol reductase (DFR)遺伝子の発現を後記参考例の RT- RCT 法を用いて調べた結果、 野生型では、 この遺伝子の発現が、 ス トレス処理と同時 に上昇するのに対し、 p35S : : PAP1SRDXで形質転換したシロイヌナズナ植物体で は、 このような発現上昇は認められなかった （図 1 8 B ) 。 これらのことは、 SRDXペプチドを付与された PAP1転写因子が、 リブレッサーに変換され、 植物体 内で DFR遺伝子の発現を抑制することにより、 アントシァニン合成を抑制してい ることを示している。 また、 このことは、 このリプレッサーを用いた遺伝子発現 抑制システムが、 二次代謝物の合成抑制にも利用できることを示している。
(実施例 8 ) ぺプチド： LDLDLELRLGFA (SRDX) をコードする遺伝子による、 植 物体における AtMYB23転写因子の機能変換
( 1 ) 形質転換ベクター p35S :： AtMYB23SRDXの構築
( 1一 1 ) AtMYB23 cDNAの単離
シロイヌナズナ cDNAライブラリーより、 以下のプライマーを用いて終止コド ンを除く AtMYB23のコード領域のみを含む DNA断片を PCRを用いて増幅し、 ァガ ロース電気泳動により分離し回収した。 なお、 PCRの条件は実施例 3と同様であ る。
5 ' プライマー ：
5 , - AAAATGAGAATGACAAGAGATGGAAAAGAACATG-3 ' (配列番号 6 7 )
3 ' プライマー ：
5 ' - AAGGCAATACCCATTAGTAAAATCCATCATAGTG - 3， （配列番号 6 8 )
得られた AtMYB23遺伝子の cDNAおよびコードするァミノ酸配列を配列表の配 列番号 6 9に示す。 (1 - 2) ペプチド LDLDLELRLGFA (SRDX) をコードする遺伝子の合成 一方、 1 2ァミノ酸ぺプチド LDLDLELRLGFA (SRDX) をコードし、 3 '末端に 終止コ ドン TAAを持つように設計した、 以下の配列を有する DNAをそれぞれ合成 し、 実施例 3と同様にァニールして 2本鎖 DN Aとした。
5， - CTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG- 3' (配列番号 6 4 )
5' - CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAG- 3' (配列場号 6 5 )
(1 - 3) 形質転換ベクターの作成
上記で得た AtMYB23遺伝子のタンパク質コ一ド領域のみを含む DNA断片と SRDXのコード領域を含む DAN断片を、 実施例 3と同様にして、 制限酵素 Smalで 切断した PBIG2に揷入し、 順方向にクローニングされているものを単離し、 形質 転換ベクター p35S:： AtMYB23SRDXを得た。
(2) 形質転換ベクター p35S::AtMYB23SRDXにより形質転換した植物体の作成 开質転換べクタ一 p35S：： AtMYB23SRDXにより形質転換されたシロイヌナズ植物 のの次世代種子と、 比較のための野生株 （Col- 0) の種子とを、 MS寒天培地上に 蒔種し、 実施例 3と同様の条件下で生育させた。 その結果、 p35S: :AtMYB23SRDX で形質転換した植物体は、 野生型植物である Col- 0では表皮に存在する トリコー ムが無いか、 若しくは著しくその数が野生型に比べて著しく減少している植物体 となった （図 1 9 A) 。
また、 トリコームの発生に関わる遺伝子である GLABRA1 (GL1), GLABRA2 (GL2), TRANSPARENT TESTA GLABRA 1 (TTG1)の発現を後記参考例の RT- PCRを用い て調べた。 野生型ではこれら 3種の遺伝子は同様に発現しているのに対し、 p35S: :AtMYB23SRDXで形質転換したトリコームを持たない植物体においては、 GL2の発現が著しく抑制されていることが明らかになった （図 1 9 B) 。 これら のことは、 SRDXペプチドを付与された AtMYB23転写因子が、 リプレッサーに変 換され、 植物体内で、 GL2遺伝子の転写を抑制することにより、 トリコームの発 生を抑制していることを示している。
(実施例 9 ) タバコ葉およびペチュニアにおける転写抑制実験 リポーター遺伝子として CaMV35S - GAL4 : :LUC、 エフェクタープラスミ ドとして CaMV35S : : GAL4DBD: RD ( S U Pリプレッションドメイン 175-204領域） を用い、 実施例 2と同様にしてタバコ（Nicotiana tabacum BY4)種子蒔種後 2週間目の植 物体から採取した葉 (1. 5cm) にパーティクルガン法を用いて導入した後、 水で 湿らせた濾紙上で 2 5 ° ( 、 1 6時間静置後、 リポーター遺伝子であるルシフェラ ーゼの活性を測定した。 その結果、 コントロールとして用いた 35S-GAL4DBとリ ポータープラスミ ドを導入したもの （相対値 1 0 0とする） に比べ、 35S- GAL4DB-RDを導入した場合、 リポーター遺伝子の活性を 8 4 %抑制する効果を示 した。 また、 同様にして、 ペチュニア種子蒔種後 3週間目の植物体から採取した 葉 （l. Ocra) に上記のエフェクタープラスミ ドとリポータープラスミ ドをパーテ ィクルガンを用いて導入し、 ルシフヱラーゼの活性を測定した。 その結果、 コン トロールとして用いた 35S- GAL4DBとリポータープラスミ ドを導入したもの （ネ目 対値 1 0 0とする） に比べ、 35S- GAL4DB-RDを導入した場合、 リポーター遺伝子 の活性を 8 2 %の抑制する効果を示した。
これらの結果より、 リプレッションドメインを持つキメラ遺伝子は、 シロイ ヌナズナばかりでなく、 タバコ葉およびペチュニアにおいても転写抑制機能を持 つことがわかった。
(参考例） RT- PCR方法による遺伝子発現の解析法
上記実施例 7、 8における RT - PCR方法による遺伝子発現の解析法を以下に示 す。
既に述べた方法でシロイヌナズナ植物葉から、 全 RNAを抽出精製した。 このう ち 1. 65ugまたは 2. 5ugの全 RNAを分取し、 混在する DNAを除くため下記の条件 で DNase処理を行った。
全 RNA 1. 65ugまたは 2. 5ug
10x DNase Buffer 5ul
DNase I lul (5 u)
Rnase Inhibitor 0. 5ul (10 u)
DEPC処理水 全量 50ulに調整 37°Cで 30分間反応したのち、 フエノール ' クロ口ホルム溶液を加えて各酵素 を失活させエタノール沈殿にて DNAを除いた乾燥全 RNAを調製した。
次に全 RNAよりアマシャム社製 T- Primed First-Strand Kitを用いて cDNA の first strandの合成を行った。 乾燥させた 1. 65ugまたは 2. 5ugの全 RNAを 33ul の DEPC処理水に縣濁させ、 65°Cで 5分間インキュベーションした後、 First - Strand Reaction Mixの入ったチューブに RNA溶液を加え、 37°Cで 60分間反応 させた。 この反応により理論的に全 RNAが first strand cDNAに転換されたと考 えられる。
合成した first strand cDNAを铸型として、 調べたい遺伝子に特異的なプライ マーを用いて PCRを行った。 使用したプライマーの塩基配列及び P C R反応溶液 の組成を以下に示す。
(PCRに用いたプライマーの塩基配列）
j8 -チュープリン （TUB)
5' プライマー ： 5，- CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC (配列番号 7 0 )
3 ' プライマー ： 5' - CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC (配列番号 7 1 )
DFR
5 ' プライマー ： 5' - AAAAAGATGACAGGATGGGT (配列番号 7 2 )
3 ' プライマー ： 5' - CCCCTGTTTCTGTCTTGTTA (配列番号 7 3 )
TTG1
5' プライマー ： 5，- GGGATGGATAATTCAGCTCCAGATTC (配列番号 7 4 )
3' プライマー ： 5' - AACTCTAAGGAGCTGCATTTTG (配列番号 7 5 )
GL1
5 ' プライマ、 5， - GGGATGAGAATAAGGAGAAGAGATGAAAAAGAG (配列番号 7 6 ) 3， プライマ、 5' - AAGGCAGTACTCAATATCACTAGAAGCAAAATT (配列番号 7 7 ) GL2
5， プライマー ： 5' - ATGGCCGTCGACATGTCTTCCAAACAACCCACC (配列番号 7 8 ) 3 ' プライマー ： 5' - GCAGGGAGTTCTCGTGCCGTTCTTGAATAG (配列番号 7 9 )
( P C R反応溶液の組成）
铸型 cDNA lul (換算すると全 RNAとして 50ngまたは 75ng)
10 X PCR Buffer 5ul
2. 5mMdNTP mix 4ul
5' プライマー 0. 5ul (100pmol/ul)
3' プライマー 0. 5ul (100pmol/ul)
rTaq ポリメラーゼ 0. 25ul (l. 25u)
DEPC処理水 38. 75ul
PCRの条件は、 95°Cで 2分間反応させ変性させた後、 95°C30秒、 58°C30秒、 72°C1分を一サイクルとし、 調べる遺伝子により 25から 35サイクルに変化させ 行った。
次に、 上記の一連の操作により得られた RT- PCR産物をサザン法により半定量 学的に評価した。 PCR反応で増幅した DNAの 1/100〜1/1000量をァガロースゲル 電気泳動し、 ナイロンメンブレンにトランスファーした。 相当する遺伝子 DNAを プローブとして調製し、 アマシャム製 ECL direct nucleic acid labeling and detection system'キットを用いて標識し、 ハイブリダィゼーシヨン及び検出を 行った。 検出されたパンドは調べたい遺伝子の mRNAに相当する DNA量を意味す ることから、 これをワイルドタイプと形質転換サンプルと比較することにより、 個々の遺伝子の発現量の考察を行った。 この際、 比較対照として内在性遺伝子 β -チューブリン (TUB) の発現量を同時に検出した。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性 本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドは、 極めて 短いサイズであるため、 その合成は極めて簡単であり、 しかも、 効果的に遺伝子 の転写を抑制できる。
本発明の遺伝子は、 特定の標的遺伝子に結合する転写因子の D N A結合ドメイ ンをコ一ドする遺伝子と融合させることにより、 特定の遺伝子のみを標的にした 転写抑制を行うことができる。 また、 この抑制は優性形質として現れ、 この転写 因子の転写に重複して関与する他の転写因子の機能をも抑制する。 したがって、 一遺伝子のノックアウト法では明らかにされなかつた転写機能解析に非常に有効 であり、 また、 小麦等のように複 2倍体ゲノムを持つ植物にも適用できる。
本発明の遺伝子はまた、 例えばガン遺伝子の転写調節領域に特異的に結合する D N Aと融合させて、 細胞内で発現させることにより、 ガン遺伝子の発現を効率 的に抑制することが可能となる。
さらに、 本発明の遺伝子は、 例えば、 植物においては、 色素代謝系の酵素をコ ードする遺伝子の発現を制御することによってこれまでには得られなかつた色違 いの花弁を有する花を創作することを可能にし、 また、 アレルゲンとなるタンパ ク質の発現を抑制することによってァレルゲンの少ない食物の生産を可能にする。 また、 さらに、 リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、 リグニン 含量の少ない木を作り、 これにより高品質のパルプを生産するも可能である。 従 つて、 本発明は極めて広範な分野において適用可能でかつ有用な技術手段を提供 する。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記式 （ I) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子 に変換する機能を有するぺプチド。
X l -L e u-A s -L e u-X 2-L e u-X 3 - · · ( I )
(式中、 X 1は 0〜 10個のアミノ酸残基を表し、 X 2は A s n又は G 1 uを表 し、 X 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
2. 下記式 （II) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチド。
Y 1— P h e— A s p— L e u— A s n— Y 2— Y 3 · · · (II)
(式中、 Y 1は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を表し、 Y2は P h e又は I 1 eを表 し、 Y 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
3. 下記式 （III) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制 因子に変換する機能を有するぺプチド。
Z 1— A s p-L e u-Z 2— L e u-Ar g-L e u— Z 3 · · · (III) (式中、 Z 1は L e u又は A s p— L e u又は L e u— A s p— L e uを表し、 Z 2は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表し、 Z 3は 0から 1 0個のァミノ酸残基 を表す。 ）
4 - A s p— L e u— Z 4— L e u— A r g— L e uで表されるアミノ酸配列 を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチド。
(式中、 Z 4は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表す。 ）
5. 以下の（a)から（d)のいずれかのアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写 抑制因子に変換する機能を有するタンパク質
( a ) 配列番号 3 1に示すァミノ酸配列
( b ) 配列番号 31に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列
( c ) 配列番号 6 1に示すァミノ酸配列
( d ) 配列番号 61に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列
6. 下記式 （I ) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子 に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
X l -L e u-A s p-L e — X 2— L e u— X 3 - - - ( I )
(式中、 X 1は 0〜1 0個のアミノ酸残基を表し、 X 2は A s n又は G 1 uを表 し、 X 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
7. 下記式 （Π) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
Y l -Ph e -A s p-L e u-A s n-Y 2-Y3 - · · (II)
(式中、 Y 1は 0〜 1 0個のアミノ酸残基を表し、 Y 2は P h e又は I 1 eを表 し、 Y 3は少なくとも 6個のアミノ酸残基を表す。 ）
8. 下記式 （III) で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転写抑制因 子に変換する機能を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子。
Z 1— A s p— L e u-Z 2— L e u— Ar g— L e u— Z 3 - · (III) (式中、 Z 1は L e u又は A s p - L e u又は L e u— A s p— L e uを表し、 Z 2は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表し、 Z 3は 0から 1 0個のァミノ酸残基 を表す。 ）
9. A s p— L e u— Z 4— L e u— Ar g— L e uで表されるァミノ酸配列 を有し、 かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するぺプチドをコード する遺伝子。
(式中、 Z 4は G 1 u又は G 1 n又は A s pを表す。 ）
1 0. 以下の（a)から（d)のいずれかのアミノ酸配列を有し、 かつ転写因子を転 写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。 ―
( a ) 配列番号 3 1に示すアミノ酸配列
(b) 配列番号 3 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列
( c ) 配列番号 6 1に示すァミノ酸配列
(d) 配列番号 6 1に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列
1 1. 請求項 1から 5のいずれかに記載のペプチド又はタンパク質をコードする 部分を含み、 その両端部に制限酵素部位を有する二本鎖 DNA。
1 2 . 請求項 1から 5のいずれかに記載のペプチド又はタンパク質と転写因子と を連結したキメラタンパク質。
1 3 . 請求項 6から 1 0のいずれかに記載の遺伝子と転写因子をコードする遺伝 子とを連結したキメラ遺伝子。
1 4 . 請求項 1 3に記載のキメラ遺伝子を有する組み換えベクター。
1 5 . 請求項 1 4に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
1 6 . 請求項 1 4に記載の組み換えベクターを含む植物。
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