JP2008212064A - 植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクター、塊茎形成が制御された植物の製造方法および植物 - Google Patents

Abstract

【課題】 植物への導入により、植物の塊茎形成を制御（促進または抑制）できる新たな塊茎形成制御ベクター、ならびに、それを用いて、塊茎形成が制御された植物を製造する方法を提供する。
【解決手段】 ＬＫＰ２遺伝子を含むベクターを、植物に塊茎形成を促進するための塊茎形成促進ベクターとして使用する。他方、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子を含むベクターを、植物に塊茎形成を抑制するための塊茎形成抑制ベクターとして使用する。前記両ベクターにおいて、各遺伝子は、発現プロモーターの制御下に挿入されていることが好ましい。前者のベクターを導入した植物は、塊茎形成が促進され、後者のベクターを導入した植物は、塊茎形成が抑制される。
【選択図】 図１

Description

本発明は、植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクター、塊茎形成が制御された植物の製造方法、および、塊茎形成が制御された植物に関する。

ジャガイモは、バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）の肥大した塊茎であり、例えば、食物資源として広く栽培されている。このように植物の塊茎を食物等の資源として利用する場合には、様々な要因に影響を受けることなく、植物が、塊茎を効率良く形成することが望まれる。他方、植物の塊茎以外の部位が資源として利用されることもある。このような場合、塊茎形成に植物の栄養源が使用されるのを防ぐため、反対に、塊茎を形成し難いことが望まれる。このため、植物の塊茎形成を目的に応じて制御できれば、効率良く目的とする植物資源を作出することが可能になると考えられる。

自然界において、植物の塊茎形成は、日長に左右されており、例えば、バレイショの場合、短日条件では、塊茎形成が促進され、反対に、長日条件では、塊茎形成が阻害されることが報告されている（非特許文献１）。したがって、日長条件の調節や、栽培地域の選択により、塊茎形成の促進または塊茎形成の抑制を図ることは可能と考えられる。しかしながら、植物の栽培において、実際に、日長条件を制御したり、栽培地域を選択することは、手間がかかり、また、栽培地域も限定されることから、結果的に、効率の低下を招き、実用的ではない。

そこで、塊茎形成が促進された植物または塊茎形成が抑制された植物を生産する方法の確立が望まれている。
Ｒｏｄｏｒｉｑｕｅｚ−Ｆａｌｃｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｅａｓｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｂｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｔａｔｏ：Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．５７，１５１−１８０（２００６） Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＬＫＰ２ ｉｎ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３，２６５９−２６７０（２００１）． Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＳＫ ａｎｄ ｃｌｏｃｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｒｔｎｅｒｓ ｏｆ ＬＫＰ２（ＬＯＶ ｋｅｌｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５５，２０１５−２０２７（２００４）． Ｐｕｔｔｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ＣＯＮＳＴＡＮＳ ｇｅｎｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｉｎｇ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｔｏ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．"Ｃｅｌｌ ８０，８４７−８５７（１９９５）． Ｔａｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＣＯＮＳＴＡＮＳ ａｎｄ ｔｈｅ ＥＡＲ ｍｏｔｉｆ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｃａｕｓｅｓ ｌａｔｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．"Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ（２００７）

そこで、本発明は、植物への導入により、植物の塊茎形成を制御（促進または抑制）できる新たな塊茎形成制御ベクター、塊茎形成が制御された植物の製造方法ならびに塊茎形成が制御された植物の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のベクターは、植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクターであって、ＬＫＰ２遺伝子、または、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入されたことを特徴とする。

本発明の製造方法は、塊茎形成が制御された植物の製造方法であって、植物に、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする。また、本発明の植物は、本発明の製造方法により得られる、塊茎形成が制御された植物である。

本発明者らは、鋭意研究の結果、植物体において人為的にＬＫＰ２遺伝子を発現させることによって、塊茎形成が促進され、また、植物体において人為的にＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子を発現させることによって、塊茎形成を抑制できることを見出し、本発明に到った。

ＬＫＰ２遺伝子は、ＬＯＶ ｋｅｌｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ２（以下、「ＬＫＰ２」という）の遺伝子である。ＬＫＰ２は、（１）青色光受容部でありタンパク質−タンパク質間相互作用に関わるＬＯＶドメインと、（２）ユビキチンプロテアソーム系を介したタンパク質分解に関与するＳＣＦ複合体の構成因子Ｆ−ｂｏｘ ｍｏｔｉｆ、および、（３）ユビキチン化の基質タンパク質の認識領域と考えられているｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ、という３つのドメインからなるタンパク質である。そして、ＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２については、以下のことが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。まず、ＬＫＰ２遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現させると、開花遅延が生じ、概日リズム周期が消失することが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。また、ＬＫＰ２遺伝子は、ＳＣＦ複合体の構成因子ＡＳＫと相互作用することから、標的タンパク質の分解を通して概日時計の制御を行う可能性があることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、このようなＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２の機能が、植物の塊茎形成に関係していることは何ら報告されておらず、そのような示唆もされていない。このような技術常識の中、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、植物中で人為的にＬＫＰ２遺伝子を発現させることで、塊茎形成を促進させ、例えば、植物体１個当たりの塊茎形成個数の増加を実現した。

ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子は、ＣＯＮＳＴＡＮＳ（以下、「ＣＯ」という）の遺伝子（以下、「ＣＯ遺伝子」という）である。ＣＯは、転写制御因子であり、例えば、シロイヌナズナにおいて、転写活性化因子として長日の日照条件に特異的に反応して開花を促進することが報告されている（非特許文献４）。また、ＥＡＲモチーフとは、ＥＲＦ−ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｔｉｆであり、転写活性化因子の機能を抑制するという機能を有するポリペプチドであることが報告されている。そして、ＣＯのＣ末端側に１２アミノ酸からなるＥＡＲモチーフを連結させるキメラ遺伝子を、長日植物シロイヌナズナで発現させると、長日条件下であっても、ＥＡＲモチーフによりＣＯＮＳＴＡＮＳの機能が抑制され、花芽形成および開花が遅延することが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、このようなＣＯの機能抑制が、植物の塊茎形成に関係していることは何ら報告されておらず、そのような示唆もされていない。このような技術常識の中、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、植物中で人為的にＣＯ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子を発現させることで、塊茎形成を抑制し、例えば、植物体１個当たりの塊茎形成個数の減少を実現した。

したがって、本発明によれば、ＬＫＰ２遺伝子を含むベクターまたは前記キメラ遺伝子を含むベクターを使用することにより、塊茎形成が促進された植物と塊茎形成が抑制された植物のそれぞれを、目的に応じて作出することができる。これによって得られる本発明の植物は、例えば、使用した本発明のベクターの種類に応じて、塊茎形成が制御されるため、より効率良く目的とする植物資源を作出することができる。このため、本発明は、例えば、農業の分野等において極めて有用な技術といえる。

本発明の塊茎形成制御ベクターは、前述のように、ＬＫＰ２遺伝子、または、ＣＯ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入されたことを特徴とする。以下、本発明において、ＬＫＰ２遺伝子を含む塊茎形成制御ベクターを「塊茎形成促進ベクター」といい、前記キメラ遺伝子を含む塊茎形成制御ベクターを「塊茎形成抑制ベクター」という。なお、本発明において、「機能的に配置」、「機能的に結合」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で配置または結合していることを意味する。また、本発明において、遺伝子の発現とは、例えば、遺伝子の転写および翻訳（タンパク質の合成）を含む。

＜塊茎形成促進ベクター＞
本発明において、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。ＬＫＰ２遺伝子としては、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡがあげられる。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）前記（Ａ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＬＫＰ２と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ

前記（Ａ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２遺伝子のＣＤＳ（ＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする、終止コドンを含む配列）である。前記（Ｂ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｂ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２と同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号１で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。

また、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、配列番号２に示すＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。

なお、シロイヌナズナのＬＫＰ２遺伝子の塩基配列ならびにＬＫＰ２のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＢ０３８７９７にコードされている。本発明においてＬＫＰ２遺伝子は、ＬＫＰ２と同様の機能を有するファミリータンパク質（例えば、ＺＴＬ）をコードする遺伝子であってもよい。

本発明の塊茎形成促進ベクターは、植物に導入された際に、ＬＫＰ２遺伝子を発現するものであればよく、ＬＫＰ２遺伝子以外の構造は制限されない。本発明の塊茎形成促進ベクターとしては、例えば、さらに発現プロモーターを有し、前記発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が挿入されていることが好ましい。この場合、塊茎形成促進ベクターは、目的の植物体に導入した際に、例えば、植物体の染色体に組み込まれてもよいし、植物体の染色体には組み込まれず、植物体において独立したエピソームとして存在してもよい。前者の場合、ＬＫＰ２遺伝子は、発現プロモーターの制御下に位置する状態で、植物体のゲノムに組み込まれることが好ましい。また、塊茎形成促進ベクターは、植物体に導入され、組換えによって植物体の染色体に組み込まれることにより、ＬＫＰ２遺伝子が発現プロモーターの制御下に配置するような構造であってもよい。この場合、前記発現プロモーターは、例えば、植物体の染色体が本来備えるプロモーターであってもよいし、予め、染色体に組み込んだ外来の発現ベクターであってもよい。

前記発現プロモーターとしては、制限されないが、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）、マンノピン合成酵素遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター等があげられる。本発明の塊茎形成促進ベクターにおいて、ＬＫＰ２遺伝子の位置は、例えば、発現プロモーターの制御下であればよく、通常、プロモーターの下流側（３’側）に機能的に配置される。

本発明の塊茎形成促進ベクターは、種々のベクターにＬＫＰ２遺伝子が挿入されていればよく、前記ベクターの種類は、制限されず、例えば、後述するようなベクターの導入方法に応じて適宜決定できる。前記ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター等があげられる。

後述するようなアグロバクテリウムを介した形質転換（アグロバクテリウム法）を行う場合は、例えば、バイナリーベクターが好ましく、これにＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、本発明の塊茎形成促進ベクターとして使用できる。前記バイナリーベクターの種類は特に制限されないが、Ｔｉプラスミドベクターや、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）とを有するベクター等があげられる。このようなバイナリーベクターは、前記Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に目的のＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、植物に導入した際に、ＲＢからＬＢの領域を植物の染色体に組み込むことができる。この場合、前述のようにＲＢとＬＢとの間には、さらに発現プロモーターが挿入され、この発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が機能的に配置されていることが好ましい。ＬＫＰ２遺伝子を挿入するバイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＥ２１１３，ｐＢＩＮ１９等が使用できる。また、例えば、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）やパーティクルガン法を行う場合には、従来これらの方法に使用されている各種プラスミドを使用することもできる。

本発明の塊茎形成促進ベクターは、さらに、植物への導入の有無を確認できることから、選択マーカーをコードする配列（選択マーカー配列）を有することが好ましい。選択マーカー配列としては、特に制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー等のマーカーをコードする配列があげられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、特に制限されず、例えば、カナマイシン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等があげられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）等があげられる。これらの選択マーカー配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカー配列を有する市販のベクターから調製することもできる。

＜塊茎形成抑制ベクター＞
本発明において、前記キメラ遺伝子は、転写活性化因子であるＣＯをコードする塩基配列（ＣＯ遺伝子）と、転写抑制活性を有するＥＡＲモチーフ（以下、「Ｒｅｐ」ともいう）をコードするＤＮＡ配列（以下、「Ｒｅｐ配列」ともいう）とが機能的に結合したキメラ遺伝子である。前記キメラ遺伝子は、以下、「ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子」ともいう。前記ＣＯ遺伝子とＲｅｐ配列との位置関係は、制限されず、ＣＯとＲｅｐ（ＥＡＲモチーフ）との融合タンパク質が産生され、ＥＡＲモチーフの機能により、ＣＯの転写活性能が抑制できればよい。具体例としては、前記ＣＯ遺伝子の３’末端側にＲｅｐ配列が機能的に配置されていることが好ましい。この場合、発現したＣＯのＣ末端側にリプレッサーが連結される。

本発明において、ＣＯ遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよく、また、合成した塩基配列であってもよい。

本発明において、ＣＯ遺伝子としては、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のＤＮＡがあげられる。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｄ）前記（Ｃ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＣＯと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ

前記（Ｃ）のＤＮＡは、ＣＯ遺伝子のＣＤＳ（ＣＯのアミノ酸配列をコードする、終止コドンを含む配列）である。前記（Ｄ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｄ）のＤＮＡは、ＣＯと同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ｃ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号３で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子は、例えば、配列番号３における終止コドン（ＴＧＡ）をＧＣＡ等に置換してもよい。

また、ＣＯ遺伝子は、例えば、配列番号４に示すＣＯのアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。なお、シロイヌナズナのＣＯ遺伝子ならびにＣＯの配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ１２１５８９にコードされている。本発明においてＣＯ遺伝子は、例えば、シロイヌナズナのＣＯ遺伝子には制限されず、他の植物種由来のＣＯ遺伝子でもよい。

本発明において、Ｒｅｐ配列は、例えば、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のＤＮＡがあげられる。
（Ｅ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｆ）前記（Ｅ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＥＡＲモチーフと同様の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

前記（Ｅ）のＤＮＡは、ＥＡＲモチーフのアミノ酸配列をコードする配列である。前記（Ｆ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｆ）のＤＮＡは、ＥＡＲモチーフと同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ｅ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号５で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。

また、Ｒｅｐ配列は、例えば、配列番号６に示すＥＡＲモチーフのアミノ酸配列（ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。

ＣＯ遺伝子とＲｅｐ配列とからなるキメラ遺伝子の一例を配列番号７に示す。この配列において、９−１１８０番目の領域が終止コドンをＧＣＡに置換したＣＯ遺伝子であり、１１３７−１１７２番目の領域がＲｅｐ配列である。その他の部分（例えば、３’末端）は、ベクターへの連結が容易になることから、制限酵素部位（配列番号７においてはＮｏｔＩサイト）等を有している。なお、この配列は一例であって、本発明を制限するものではない。

本発明の塊茎形成促進ベクターは、植物に導入された際に、前記キメラ遺伝子を発現するものであればよく、前記キメラ遺伝子以外の構造は制限されない。本発明の塊茎形成抑制ベクターとしては、例えば、さらに発現プロモーターを有し、前記発現プロモーターの制御下に前記キメラ遺伝子が挿入されていることが好ましい。この場合、塊茎形成抑制ベクターは、目的の植物体に導入した際に、例えば、植物体の染色体に組み込まれてもよいし、植物体の染色体には組み込まれず、植物体において独立したエピソームとして存在してもよい。前者の場合、前記キメラ遺伝子は、発現プロモーターの制御下に位置する状態で、植物体のゲノムに組み込まれることが好ましい。また、塊茎形成抑制ベクターは、植物体に導入され、組換えによって植物体の染色体に組み込まれることにより、前記キメラ遺伝子が発現プロモーターの制御下に配置するような構造であってもよい。この場合、前記発現プロモーターは、例えば、植物体の染色体が本来備えるプロモーターであってもよいし、予め、染色体に組み込んだ外来の発現ベクターであってもよい。前記発現プロモーターとしては、前述のようなものがあげられる。前記キメラ遺伝子の位置は、例えば、発現プロモーターの制御下であればよく、通常、プロモーターの下流側（３’側）に機能的に配置される。

本発明の塊茎形成抑制ベクターは、種々のベクターに前記キメラ遺伝子が挿入されていればよく、前記ベクターの種類は、制限されず、前述のようなものがあげられる。また、前述と同様に、アグロバクテリウム法を行う場合は、例えば、バイナリーベクターが好ましく、これに前記キメラ遺伝子を挿入すれば、本発明の塊茎形成抑制ベクターとして使用できる。前記バイナリーベクターは、前述と同様のものが使用でき、前記キメラ遺伝子の挿入も、前記ＬＫＰ２遺伝子と同様である。

本発明の塊茎形成抑制ベクターは、選択マーカー配列を有することが好ましく、前記選択マーカー配列としては、前述と同様のものがあげられる。

＜塊茎形成が制御された植物の製造方法＞
本発明の製造方法は、塊茎形成が抑制された植物の製造方法であって、植物に、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする。本発明の製造方法によれば、本発明の塊茎形成促進ベクターを導入することにより、塊茎形成が促進され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加した植物を得ることができる。他方、本発明の塊茎形成抑制ベクターを導入すれば、塊茎形成が抑制され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が減少した植物を得ることができる。

本発明の製造方法においては、本発明の塊茎形成制御ベクターを目的の植物に導入すればよく、例えば、ベクターの導入方法や条件等は制限されない。

本発明の製造方法において、対象となる植物は、制限されない。具体例としては、ナス科の植物があげられ、前記ナス科の植物としては、例えば、バレイショがあげられる。

本発明の塊茎形成制御ベクターの導入方法は、制限されず、植物の種類やベクターの種類等に応じて適宜決定でき、例えば、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）、パーティクルガン法等があげられる。これらの導入方法は、従来公知の方法に従って行うことができる。

アグロバクテリウム法を採用する場合、例えば、以下のようにして本発明の植物を生産できる。本発明の塊茎形成制御ベクターを、Ｖｉｒ領域を有するプラスミドを持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。そして、目的の植物体に前記アグロバクテリウムを感染させ、培地で培養を行う。この際、前述のように塊茎形成制御ベクターが選択マーカー配列を有していれば、例えば、薬剤等を含有する培地で培養することによって、本発明の塊茎形成制御ベクターが導入された形質転換体を容易に選択できる。このようにして得られた形質転換体は、ＬＫＰ２遺伝子を導入した場合には、ＬＫＰ２遺伝子の発現によって、塊茎形成が促進され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加し、前記キメラ遺伝子を導入した場合には、前記キメラ遺伝子の発現によって、塊茎形成が抑制され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が減少する。

アグロバクテリウム法によりバレイショに本発明の塊茎形成制御ベクターを導入する際には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、バレイショのマイクロチューバー（小指の先ぐらいの大きさの塊茎）を準備する。これを、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入したアグロバクテリウムとともに培養し、前記アグロバクテリウムを感染させる。そして、さらに培養することによりカルスを形成させ、例えば、薬剤等を含有する培地で培養し、前記カルスから再分化したシュートを選択すればよい。また、塊茎以外にも、例えば、葉の切片を用いる葉片培養においてアグロバクテリウムを感染させてもよい。

このようにして得られる本発明の植物（形質転換体）は、導入された各遺伝子の発現によって、塊茎形成が促進または抑制される。なお、本発明において植物とは、例えば、植物体全体でも、葉、種子等の植物体の一部でもよく、また、プロトプラスト、カルス等の植物細胞であってもよい。

［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。

バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）に、ＬＫＰ２遺伝子を有する塊茎形成促進ベクター（ｐＢＥ２１１３/ＬＫＰ２）を導入し、塊茎形成の状態を確認した。

＜塊茎形成促進ベクターｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２の構築＞
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、以下同様）のｃＤＮＡから、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲによって、ＬＫＰ２コード領域（ＣＤＳ）を増幅させた。なお、下記プライマーセット１は、フォワードプライマー（配列番号８）が５’側にＢａｍＨＩサイトを、リバースプライマー（配列番号９）が５’側にＢａｍＨＩサイトを備える。この増幅物の概略を図１に示す。同図における数値は、増幅物における塩基の番号を示す。
（プライマーセット１）
フォワードプライマー ５’−GGATCCGTATGCAAAATCAAATGGAGTGGG−３’
リバースプライマー ５’−GGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGTAGAA−３’

このＰＣＲ増幅物とバイナリーベクターｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入した。このようにして得られた組換え発現ベクターを、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２、または、３５Ｓ：ＬＫＰ２という。ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔの構成の一部の概略を図１に示す。同図に示すように、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを備える発現ベクターである。同図において、「Ｅ１２」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター上流領域Ｅ１２配列（−４１９〜−９０ｂｐの２回繰り返し配列）であり、「Ｐ３５Ｓ」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターであり、「Ω」は、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）の５’非翻訳領域エンハンサーΩ領域であり、「ＮＯＳ−Ｔ」は、ノパリン合成酵素遺伝子ｎｏｓ３’非翻訳領域終止シグナル（転写ターミネーター及びｍＲＮＡポリアデニル化シグナル）であり、「ＲＢ」は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの右側境界配列（Ｒｉｇｈｔ Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）であり、「ＬＢ」は、前記Ｔ−ＤＮＡの左側境界配列（Ｌｅｆｔ Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）である。ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２は、前述のようにＬＫＰ２遺伝子の増幅物をｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入しているため、ＬＫＰ２遺伝子の増幅物が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとに挟まれた構造となる。

この発現ベクターは、ＲＢとＬＢとの間にプロモーターＰ３５ＳとＬＫＰ２遺伝子とが挿入され、前記ＬＫＰ２遺伝子は前記プロモーターの制御下に配置されている。したがって、従来公知の方法に従って、これらの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させれば、ＲＢからその下流に位置するＬＢまでの領域が、組換えにより植物体のゲノム中に組み込まれる。そして、組み込まれた発現プロモーターＰ３５Ｓの制御下にあるＬＫＰ２遺伝子が過剰に発現することとなる。

＜形質転換体の作製＞
作製したｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２を、アグロバクテリウム法によりバレイショに導入した。特に示さない限り、アグロバクテリウム法は、インプランタインフィルトレーション法（Ishige, T, Ohshima, M, Ohashi, Y "Transformation of Japanese potato cultivars with the β-glucoronidase gene fused with the promoter of the pathogenesis-related 1a protein gene of tobacco." Plant Science 73, 167-174 (1991).）ならびに「日本生化学会編基礎生化学実験法第３巻タンパク質ＩＩ機能・動態解析法」（東京化学同人、２００１年、ｐｐ．１１６−１２５）に従って行った。形質転換体の作製工程の概略を図２に示す。

バレイショの小さな塊茎（マイクロチューバー）に、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２を導入したアグロバクテリウムを感染させた。３〜４週間再分化培地で培養し、そして、再分化したカルスを、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）とＣｅｆｏｔａｘｉｍｅ（３００ｍｇ／Ｌ）とを含む再分化培地で育成し、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２のＲＢからＬＢの領域）が導入された形質転換体を仮選択した。

さらに、前記仮選択を行った形質転換体について、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションを行い、ＬＫＰ２遺伝子が発現している株を選択した。まず、前記形質転換体から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡを、１．８５％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルに供し、電気泳動を行った。電気泳動したＲＮＡをナイロンメンブランにブロッティングし、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）で標識化したＲＮＡプローブと反応させてハイブリッドを形成させた。そして、試薬（商品名ＣＤＰ ｓｔａｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて化学蛍光シグナルを発生させ、これを検出装置（商品名ｌｉｇｈｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ；ＡＴＴＯ社製）で検出した。この結果を、図３に示す。同図は、薬剤選択した形質転換体のＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。同図において、上欄が、ＬＫＰ２ｍＲＮＡの結果であり、下欄は、泳動したＲＮＡ量を確認するためのコントロールの結果である。そして、同図の結果から、３５、３６、４０、４２、４４、４５、４７、４８の計８株の形質転換体を、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２のＲＢからＬＢの領域）が導入された植物体として選択した。

各形質転換体（８株）のシュートを切り取り、２％ショ糖含有改変ＭＳ寒天培地（日本生化学編基礎生化学実験法第３巻タンパク質）に植え、長日条件（１６時間明期／８時間暗記）で培養した。成長したバレイショを、１５％ショ糖を含むＭＳ寒天培地に移植し、暗所下で２ヶ月培養した。各形質転換体について、１株から得られた塊茎の形成個数を確認した。また、コントロールとして、ＬＫＰ２遺伝子を挿入していないバイナリーベクターｐＢＥ２１１３を用いて、同様にしてバレイショの形質転換を行い、得られた形質転換体についても同様に塊茎の形成個数の確認を行った。これらの結果を、図４に示す。同図は、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２（３５Ｓ：ＬＫＰ２）を導入した形質転換体と、コントロールベクターｐＢＥ２１１３を導入した形質転換体における塊茎の形成個数の平均を示すグラフである（ｎ＝８）。同図において、バーは、標準誤差を示し、＊は、ｔ検定によるＰ値が０．０５以下であることを示す。

このようにＬＫＰ２遺伝子を過剰発現させた形質転換体は、形成される塊茎の個数がコントロール（１００％）よりも約２倍程度多い結果となった。この結果から、ＬＫＰ２遺伝子の発現により、塊茎の形成を促進できることがわかる。

バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）に、ＣＯ-Ｒｅｐ遺伝子（前記キメラ遺伝子）を有する塊茎形成抑制ベクター（ｐＢＥ２１１３/ＣＯ-Ｒｅｐ）を導入し、塊茎形成の状態を確認した。なお、特に示さない限りは、前記実施例１と同様にして操作を行った。

＜塊茎形成抑制ベクターｐＢＥ２１１３/ＣＯ-Ｒｅｐの構築＞
特に示さない限りは、文献（Takase, T et al., "Overexpression of the chimericgene of the floral regulator CONSTANS and the EAR motif repressor causes late flowering in Arabidopsis." Plant Cell Rep. Epub ahead of print (2007)）に従った。まず、５’末端にＢａｍＨＩサイト、３’末端にＢｇｌIIサイトを備えるＥＡＲモチーフの二本鎖ＤＮＡを合成した。この二本鎖の順鎖の配列を下記配列番号１０に示す。この二本鎖をＢａｍＨＩとＢｇｌIIで処理し、ｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入した。この組換えベクターを、ｐＢＥ２１１３／Ｒｅｐという。
５’−GGATCCCTTGATCTTGATCTTGAACTTAGACTTGGATTTGCTTAGATCT−３’（配列番号１０）

つぎに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、以下同様）のｃＤＮＡから、下記プライマーセット２を用いたＰＣＲによって、ＣＯコード領域（ＣＤＳ）を増幅させた。なお、下記プライマーセット２において、フォワードプライマー（配列番号１１）およびリバースプライマー（配列番号１２）は、共に、５’側にＢａｍＨＩサイトを備え、リバースプライマーは、終止コドンＴＧＡをＧＣＡに置き換える配列とした。この増幅物の概略を図１に示す。同図における数値は、増幅物の長さを示す。
（プライマーセット２）
フォワードプライマー ５’−AGGATCCGTATGTTGAAACAAGAGAGTAAC−３’
リバースプライマー ５’−TGGATCCTGCGAATGAAGGAACAATCCCA−３’

この増幅物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし、ＢａｍＨＩで処理した後、この断片を前述のｐＢＥ２１１３／ＲｅｐのＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。このようにして得られた組換え発現ベクターを、ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐ、または、３５Ｓ：ＣＯ−Ｒｅｐという。ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐは、前述のように、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の増幅物をｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入しているため、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の増幅物が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとに挟まれた構造となる。

この発現ベクターは、ＲＢとＬＢとの間にプロモーターＰ３５ＳとＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子とが挿入され、前遺伝子は前記プロモーターの制御下に配置されている。したがって、従来公知の方法に従って、これらの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させれば、ＲＢからその下流に位置するＬＢまでの領域が、組換えにより植物体のゲノム中に組み込まれる。そして、組み込まれた発現プロモーターＰ３５Ｓの制御下にあるＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子（キメラ遺伝子）が過剰に発現することとなる。

＜形質転換体の作製＞
作製したｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐを、前記実施例１と同様にしてアグロバクテリウム法によりバレイショに導入した。そして、同様にして、薬剤による仮選択を行い、続いて、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションにより、ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子が発現している株を選択した。ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションの結果を、図５に示す。同図は、薬剤選択した形質転換体のＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。同図において、上欄が、ＣＯ−ＲｅｐｍＲＮＡの結果であり、下欄は、泳動したＲＮＡ量を確認するためのコントロールの結果である。そして、同図の結果から、計２２株（７，８，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２６，２８，３１，３５，３７，５４，５６，５７，５８，５９，６３，７１，７３，７４）の形質転換体を、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−ＲｅｐのＲＢからＬＢの領域）が導入された植物体として選択した。

各形質転換体（２２株）からシュートを切り取り、前記実施例１と同様に、培養を行い、各形質転換体について１株から得られた塊茎の形成個数を確認した。これらの結果を、図６に示す。同図は、ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐ（３５Ｓ：Ｃｏ−Ｒｅｐ）を導入した形質転換体（ｎ＝２２）と、コントロールベクターｐＢＥ２１１３を導入した形質転換体（ｎ＝７０）における塊茎の形成個数の平均を示すグラフである。同図において、バーは、標準誤差を示し、＊は、ｔ検定によるＰ値が０．０５以下であることを示す。

このようにＣｏ−Ｒｅｐ遺伝子を過剰発現させた形質転換体は、形成される塊茎の個数がコントロール（１００％）よりも約２５％程度少ない結果となった。この結果から、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の発現により、塊茎の形成を抑制できることがわかる。

本発明によれば、例えば、目的に応じて、ＬＫＰ２遺伝子を含む塊茎形成促進ベクターまたは前記キメラ遺伝子（ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子）を含む塊茎形成抑制ベクターを植物に導入することにより、塊茎形成が促進または抑制された植物を作出できる。このようにして得られる植物は、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加し、または、植物体１個当たりの塊茎個数を減少することができる。したがって、本発明は、目的に応じて、植物の塊茎形成を制御でき、効率良く目的の植物資源を作出できることから、例えば、農業の分野において、極めて有用な技術といえる。

図１は、本発明の一実施例における塊茎形成制御ベクターの構築の一例を示す概略図である。 図２は、本発明の他の実施例において、形質転換体の作製の一例を示す概略図である。 図３は、本発明のさらにその他の実施例における、ＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。 図４は、本発明のさらにその他の実施例において、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２を導入した形質転換体の塊茎数を示すグラフである。 図５は、本発明のさらにその他の実施例における、ＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。 図６は、本発明のさらにその他の実施例において、ｐＢＥ２１１３／Ｃｏ−Ｒｅｐを導入した形質転換体の塊茎数を示すグラフである。

Claims (14)

1. 植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクターであって、
   ＬＫＰ２遺伝子、または、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入されたことを特徴とする、塊茎形成制御ベクター。
2. 前記ＬＫＰ２遺伝子を含み、植物の塊茎形成を促進する塊茎形成促進ベクターである、請求項１記載の塊茎形成制御ベクター。
3. 前記キメラ遺伝子を含み、植物の塊茎形成を抑制する塊茎形成抑制ベクターである、請求項１記載の塊茎形成制御ベクター。
4. 前記ＬＫＰ２遺伝子または前記キメラ遺伝子が、発現プロモーターの制御下に挿入されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の塊茎形成制御ベクター。
5. 前記塊茎形成制御ベクターが、プラスミドベクターである、請求項１または４記載の塊茎形成制御ベクター。
6. 前記塊茎形成制御ベクターが、Ｔｉプラスミドベクターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の塊茎形成制御ベクター。
7. 前記塊茎形成制御ベクターが、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）との間に、前記ＬＫＰ２遺伝子または前記キメラ遺伝子が挿入されたベクターである、請求項１から６のいずれか一項に記載の塊茎形成制御ベクター。
8. 前記塊茎形成制御ベクターが、アグロバクテリウム法に使用するベクターである、請求項１から７のいずれか一項に記載の塊茎形成制御ベクター。
9. 塊茎形成が制御された植物の製造方法であって、
   植物に、請求項１から８のいずれか一項に記載の塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする製造方法。
10. 前記塊茎形成制御ベクターが、前記ＬＫＰ２遺伝子を含むベクターであり、塊茎形成が促進された植物の製造方法である、請求項９記載の製造方法。
11. 前記塊茎形成制御ベクターが、前記キメラ遺伝子を含むベクターであり、塊茎形成が抑制された植物の製造方法である、請求項９記載の製造方法。
12. 前記植物が、ナス科の植物である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
13. 前記ナス科の植物が、バレイショである、請求項１２記載の製造方法。
14. 請求項９から１３のいずれか一項に記載の製造方法により得られる植物。

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