WO2003035122A1 - Zusammensetzung aus einem aminoruppen tragenden polymer und einem aldehyd mit mindestens drei aldehydgruppen - Google Patents

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WO2003035122A1
WO2003035122A1 PCT/EP2002/011880 EP0211880W WO03035122A1 WO 2003035122 A1 WO2003035122 A1 WO 2003035122A1 EP 0211880 W EP0211880 W EP 0211880W WO 03035122 A1 WO03035122 A1 WO 03035122A1
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polymer
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PCT/EP2002/011880
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Helmut Goldmann
Jürgen WEGMANN
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Aesculap Ag & Co. Kg
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof

Definitions

  • the invention relates to a composition of at least two, in particular two, biocompatible, chemically crosslinkable components, in particular for bonding biological tissue, comprising at least the following components: a) aqueous solution of at least one polymer carrying amino groups b) aqueous solution of at least one aldehyde with at least three aldehyde groups ,
  • sutures and staples are mainly used to join separate tissue pieces.
  • these techniques come up against their limits especially in minimally invasive surgery, which includes laparoscopy, thoracocospia, athroscopy, cardiosurgery and intraluminal endoscopy.
  • tissue adhesives and sealants are easier, faster and safer.
  • synthetic and natural polymer or macromer systems that can be used to glue soft tissues, to seal air and fluid leaks in organs and blood vessels.
  • the fibrin glues commercially available on the market consist, among other things, of human and / or bovine plasma proteins, which are significant in terms of the transmission of infections
  • compositions are particularly suitable which can be applied to the tissue in a liquid state and then harden within a short time by forming covalent bonds.
  • the in situ curing is usually based on the crosslinking of macromer systems and can be carried out by radical polymerization or by chemical reaction with bi- or multifunctional crosslinking reagents.
  • the radical crosslinking can be triggered by light or heat sources and by oxidative radical formation with inorganic persulfates or enzymes.
  • U.S. Patents 6,156,345, Chudzik et al., US 6,083,524, Sawhney et al. and US 6,060,582, Hubbel et al. describe synthetic macromers with free-radically polymerizable end groups, the polymerization of which is initiated by irradiation with UV light in situ on the tissue.
  • viscous solutions of collagen and collagen derivatives can also be crosslinked in this way (US Pat. No. 6,183,498 B1, Devore et al., US Pat. No. 5,874,537 Kelman et al.).
  • polymerization can also be triggered using a heat source.
  • the required temperatures damage healthy cells in the tissue and often kill them.
  • damage to healthy tissue is a problem in most radical polymerizations because they are exothermic, i.e. heat is released to the environment during the polymerization.
  • macromers can also be chemically crosslinked via reactive groups.
  • the macromolecular cross-linking reagents are produced by oxidizing dextran or starch with sodium periodate. This reaction has been described by Bernstein et al. (Natl. Cancer Inst. 1978, 60, 379-384) and is state of the art.
  • the use of collagen in medicine is critical with regard to the risk of infection, especially with regard to BSE and Kreutzfeld-Jakob diseases.
  • immune reactions in the body can be triggered by proteins.
  • Chitin is a widespread linear, nitrogen-containing polysaccharide in nature and forms the main component of the outer skeleton of arthropods (cockchafer wings, lobster and shrimp shells).
  • the deacetylation product chitosan is formed from chitin, which, in contrast to chitin, has free amino groups and is soluble in a weakly acidic, aqueous medium.
  • the 'degradation of pure and treated with glutaraldehyde Chitosan as well as the acute toxicity and the hemostatic effect of chitosan is of Rao et al. (J. Biomed. Mater. Res. 1997, 34, 21-28).
  • chitosan and chitin are promising substances for medical products.
  • proteins are incorporated into chitosan sponges and the composition is used for external wounds.
  • the chitosan sponges release the proteins and accelerate wound healing.
  • Ono et al. describe a biological tissue adhesive made of photocrosslinked chitosan (K. Ono, et al., J. Biomed. Mater. Res. 2000, 49, 289-295). Crosslinking takes place by irradiation with UV light. As already mentioned, this expensive and complex technology has not become established in practice. In addition, the adhesive strength of this adhesive is inadequate, it lies in the area of fibrin glue.
  • the invention has for its object to provide a composition which has the disadvantages of the prior art overcomes, in particular avoids the risk of transmission of infectious diseases.
  • composition having the features of claim 1.
  • Preferred embodiments of the composition according to the invention are characterized in the subclaims.
  • composition according to the invention is free of protein, there is a risk of transmission of
  • Collagen is switched off. This is a great advantage over the protein-containing compositions described in the prior art, in particular with regard to a possible transmission of BSE pathogens to humans. In addition, the risk of protein-related immune reactions is also eliminated in the protein-free composition according to the invention.
  • composition according to the invention Another advantage of the composition according to the invention is that the gelling of the components takes place spontaneously and no additional energy sources are required. This simplifies the application and is gentle on the tissue, since the healthy tissue is not z. B. is affected by excessively high thermal energy.
  • Another advantage of the invention is that the components can be applied in an aqueous medium, thereby ensuring better coverage of the wound area than is the case, for example, with preformed patches (see, for example, US Pat. No. 6,051,648).
  • the aldehyde and polymer carrying amino groups can be crosslinked at body temperature. This can avoid the additional energy sources mentioned above, which in turn
  • the amino-bearing polymer is preferably derived from a biodegradable natural product. It is particularly preferred that the polymer carrying amino groups is a polysaccharide, in particular a modified saccharide, in which the amino groups are released by deacetylation. In a particularly preferred embodiment of the invention
  • the amino group-carrying polymer is an at least partially deacetylated chitin with a degree of deacetylation of 50 to 100%, preferably 60 to 90%, in particular 70 to 80%.
  • Deacetylation converts the acetamide groups in chitin into amino groups. Among other things, this causes again that the breakdown in the body is slower than with (not deacetylated) chitin.
  • the polymer carrying amino groups is chitosan. Chitosan has a blood clotting effect.
  • Deacetylated chitin, especially chitosan is preferably used in water-soluble salt form (chloride, acetate, glutamate).
  • the polymer carrying amino groups is a synthetic polymer, in particular a polymer suitable for kidneys. This has the advantage that a simple excretion of the polymer carrying amino groups is possible in the urine.
  • the synthetic polymer is advantageously a modified amino group-carrying polyvinyl alcohol, preferably with a
  • Molecular weight ⁇ 50,000, in particular ⁇ 50,000, preferably ⁇
  • polyvinyl alcohol examples include the esterification of polyvinyl alcohol with amino acids, the esterification with dicarboxylic acids or anhydrides combined with amide formation with polyvalent amines, in particular diamines, and the formation of cyclic acetals.
  • the degree of modification can be set as desired and is not restricted to the chain ends, as is the case with PEG or polyhydroxyalkanoates.
  • Polysaccharides such as dextran, cellulose, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, agar, chitin and chondroitin sulfate are also available as further multifunctional polymers with free hydroxyl groups.
  • connection of amino acids to polyvinyl alcohol takes place in two steps. First the alcohol is esterified with a BOC protected alanine. A base is added as a catalyst. The reaction must be carried out in anhydrous solvent. After successful binding, the BOC protective group can be split off with trifluoroacetic acid under mild conditions at room temperature.
  • any amino acid can be bound in this way, but amino acids with additional thiol or hydroxy groups, such as cysteine, serine, threonine, tyrosine, are preferred; amino acids with further amino groups such as asparagine, lysine, glutamine, arginine or trytophan are particularly preferred ,
  • the connection of a mixture of the amino acids mentioned is also conceivable.
  • ester bonds should be hydrolytically cleavable
  • Free amino groups are also linked to polyvinyl alcohol via cyclic diacid anhydrides in two stages.
  • the anhydride is bound to the alcohol using a catalytic base EDC.
  • EDC catalytic base
  • the reaction takes place with a diamine.
  • the diamine should be used in excess in order to avoid crosslinking of the polyvinyl alcohol during the reaction.
  • Maleic anhydride, adipic anhydride or glutaric anhydride can also be used as diacid anhydrides.
  • Terminal amino groups can be introduced into the polyvinyl alcohol in one step via acetal bonds.
  • the formation of the cyclic acetal is energetically preferred.
  • Combinations of polysaccharides bearing amino groups and polyvinyl alcohols bearing amino groups can also be used.
  • the aldehyde is advantageously a polyaldehyde. This is preferably of biological origin.
  • the aldehyde is an oxidized polysaccharide. It is particularly preferred if both the polymer carrying amino groups and the aldehyde have polysaccharide skeletons.
  • the aldehyde is an oxidized polysaccharide, the polysaccharide being at least one from the group of dextran, chitin, starch, agar, cellulose, alginic acid, glycosaminoglycans, hyaluronic acid, chondroitin sulfate and their derivatives. Dextran aldehyde is preferred.
  • the aldehyde in particular dextran aldehyde, preferably has a molecular weight of approximately 60,000 to 600,000, in particular approximately 200,000. Higher molecular weights, in particular at least 200,000, bring high degrees of crosslinking.
  • the aldehyde is advantageously partially or completely masked.
  • the purpose of the masking, in particular of oxidized polyaldehydes, is to avoid the formation of intermolecular acetals and thus to ensure the stability of the solutions.
  • the controlled release of the aldehydes finally takes place in situ by controlled hydrolysis in a pH range from 2 to 6, preferably 2 to 4.5. It is particularly preferred that the aldehyde be masked with an S, O or N nucleophile.
  • the partially or completely masked aldehyde is advantageously a polysaccharide alkali hydrogen sulfite adduct.
  • the aldehyde is partially or completely masked with ethanol or glycerol.
  • the pH values of the components are advantageously coordinated such that the pH value of a mixture of the components is between 3 and 8, in particular between 5 and 7.5.
  • a high pH value favors crosslinking, but leads to the precipitation of chitosan, for example.
  • the stoichiometric amount of aldehyde groups in component b) is advantageously at least three times the stoichiometric amount of amino groups in component a).
  • the components are advantageously matched to one another in such a way that they combine with one another in a short time, in particular a time of 15 to 200 seconds.
  • the crosslinking time can be controlled, for example, by the concentration of the solutions and the mixing ratio.
  • the degree of crosslinking can also be set, namely via the number of aldehyde groups of the aldehyde.
  • the viscosity of the composition can also be controlled.
  • the viscosities of the components are advantageously matched to one another such that a layer of the composition with a thickness of 0.1 to 1 mm can be applied.
  • the aldehyde component b) is advantageously 5 to 20% by weight, in particular 10 to 15% by weight.
  • the content of component a) in the amino group-carrying polymer is preferably 1 to 25% by weight, in particular 2 to 20% by weight.
  • the volume ratios of the two solutions a): b) are between 5: 1 and 1: 5, preferably between 3: 1 and 1: 3. If they are 1: 1, which is preferred in many cases, the same volumes can be mixed with one another in a simple manner.
  • component a) is an acetic acid solution of chitosan and component b) is an aqueous solution of dextran aldehyde.
  • Dextran for example, is distinguished from glutaraldehyde (see e.g. US 5,385,606) in that it is not toxic.
  • the invention also relates to the provision of the composition according to the invention for use as surgical adhesive, in particular for sealing or closing surfaces or openings.
  • the components are preferably mixed with one another shortly before application. This can be done, for example, with the aid of a twin syringe, in which the two components are pressed into a common squeezing tube, in which a static mixer is located.
  • the static components in the squeezing tube mix the two components and, just before they crosslink, are squeezed out of the syringe onto the application site.
  • the components are mixed only at one application site, for example by applying the two components to an application site in quick succession.
  • the invention also claims a kit consisting of two containers which are essentially separate in terms of content, each container each containing a component of the composition according to the invention.
  • the two containers act as syringe cylinders of a double syringe.
  • a double syringe which is also called a twin syringe
  • the separately stored components are pressed into a common ejection tube.
  • the kit advantageously has a device for mixing the components. It is particularly preferred that the kit has a static mixer, which can be plugged in particular onto a double syringe. This static mixer is particularly located in the squeeze tube of the double syringe.
  • the double syringe at the push-on point of the squeezing tube is closed and evident. figure description
  • FIG. 1 shows a schematic longitudinal section through a preferred embodiment of the kit according to the invention.
  • kits according to the invention shown in the single drawing show a longitudinal section through a double syringe 1.
  • This double syringe consists of two connected syringe cylinders 2a and 2b, which contain the two components separately in the composition according to the invention.
  • the volume ratios of the two syringe cylinders are matched to the mixing ratio of the two components.
  • the two syringe cylinders 2a and 2b have the same volumes of two components of a composition according to the invention. It is also possible to use double syringes in which the volumes are different, for example the cylinders have different diameters.
  • the double syringe 1 comprises two syringe plungers 3a and 3b, which are connected to one another by a connecting plate 4.
  • two piston seals 5a and 5b are applied.
  • These piston sealing rings are essentially airtight with the walls of the two syringe cylinders 2a and 2b.
  • each of the two syringe cylinders 2a and 2b each has an opening 6a or 6b which is directly adjacent to one another. These openings are closed until the first use.
  • a squeezing tube 7 can be plugged onto the two adjacent openings 6a and 6b.
  • a static mixer 8 is located in the squeezing tube 7. At its upper end, the squeezing tube narrows to a squeezing opening 9.
  • the two syringe plungers 3a and 3b with the piston sealing rings 5a and 5b attached to them move in the direction of the openings 6a and 6b.
  • the two components located in the syringe cylinders are pressed out of the openings 6a and 6b into the squeezing tube 7.
  • the static mixer 8 located in the extrusion tube 7 the two components are intimately mixed with one another in the extrusion tube and are finally pressed in the mixed state out of the extrusion opening 9 onto an application point.
  • Solution A aqueous solution of chitosan Solution
  • Solution B aqueous solution of dextran aldehyde
  • the gelation is based on the formation of imines (Schiff bases) between the aldehyde groups in the oxidized dextran and the free amino groups in the chitosan (see reaction scheme, beginning 1).
  • solutions of modified polysaccharides can be used.
  • synthetic Polymers polyvinyl alcohol modified with amines
  • Protasan UP Cl 213 is a chitosan salt with chloride as a counter ion.
  • the 5% (w / v) sodium periodate solution used for the synthesis is freshly prepared before each reaction and combined with a 10% (w / v) dextran solution.
  • Different stoichiometric ratios can be used to produce the dextran aldehydes (see Table 1).
  • the reaction mixture is stirred overnight at room temperature, dialyzed against distilled water for 2 days and finally the purified reaction solution is lyophilized.
  • the reaction product is a white fibrous solid.
  • the average molecular weight in the dextran was varied. Dextran with an average MW of 60,000 to 90,000 Daltons (from Fischer Scientific, Schrö, Germany) and dextran with a higher average MW of 413,263 Daltons (from Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) were used.
  • the molecular weight had no effect on the proportion of oxidized glucose units depending on the amount of Nal0 4 used . Determination of the aldehyde content
  • 0.15 g of dextran aldehyde are placed in an Erlenmeyer flask and then mixed with 10 ml of a 0.25 N carbonate-free NaOH solution. The mixture is stirred until the dextran aldehyde used is dissolved. The flask is then immersed in a hot water bath (80 ° C) for one minute and then placed in an ice bath with vigorous stirring. After one minute, 15 ml of 0.25 N sulfuric acid are carefully added with stirring. The mixture is then diluted with 50 ml of water and 1 ml of 0.2% phenolphthalein solution is added. The acidic solution is titrated against the indicator with 0.25 N NaOH solution.
  • dialdehyde content X is calculated as follows from the amount of dextran or dextran aldehyde added and the consumption of acid and base:
  • the optimal stoichiometric ratio Nal ⁇ 4 per glucose unit dextran was determined in further synthetic approaches.
  • the following graphic shows that from a stoichiometric ratio of Nal0 4 per glucose unit dextran of 2: 1, the percentage of oxidized glucose units is over 90%.
  • the gel time depends on the dextran aldehyde used and the mixing ratio of the dextran aldehyde and the chitosan solution.
  • the gelation time increases with increasing degree of oxidation of dextran aldehyde and with increasing ratio of 15% dextran aldehyde solution: 2% chitosan solution. It is between 15 and 200 seconds.
  • the adhesive shear force of the new tissue adhesive is determined with the help of cleaned and lyophilized type I collagen from bovine heart bags (Lyoplant, BBraun Aesculap, Tuttlingen).
  • the lyoplant is cut into strips 40 mm long and 10 mm wide, at the end of which the area to be glued is marked by 1 cm 2 .
  • the adhesive shear force increases, as does the gelation time, with an increasing degree of oxidation and an increasing amount of dextran aldehyde solution.
  • Table 8 Comparison of the adhesive shear forces of the new adhesive as a function of the average molecular weight of the dextran aldehyde. Mixing ratio of the solutions 1: 1
  • Adhesive tests were also carried out with Bioglue ® (Cryolife International Inc. USA) consisting of proteins and glutaraldehyde and with GLUETISS, a gelatin-resorcinol dialdehyde adhesive, which was applied to the lyoplant strips in accordance with the instructions for use. The strips glued with these adhesives were also covered with a film and loaded with 50 g for 10 minutes. A comparison of the adhesive shear forces achieved is shown in Table 9.
  • the surgical adhesive was used to stop bleeding from the rat liver (SPF Wistar rats). For this, a
  • Composition selected from a 4% aqueous Protasan solution and a 15% aqueous dextran aldehyde solution DA 6.
  • the Solutions were used in a mixing ratio of 1: 1.
  • An applicator from Mixpac was used to mix and apply the components.
  • the cross incision model (length of the sections: 2.5 cm) was selected on the liver.
  • the adhesive was applied to the bleeding wound immediately after the incision.
  • a gel formed which adhered firmly to the surface of the liver so that the bleeding stopped immediately after the adhesive was applied.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung aus mindestens zwei, insbesondere zwei, biokompatiblen, untereinander chemisch vernetzbaren Komponenten, insbesondere zum Verkleben von biologischem Gewebe, umfassend mindestens folgende Komponenten: a wässrige Lösung mindestens eines aminogruppentragenden Polymers, b wässrige Lösung mindestens eines Aldehyds mit mindestens drei Aldehydgruppen, wobei die Zusammensetzung frei von Eiweiß ist. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Bereitstellung der Zusammensetzung zur Verwendung als chirurgischer Gewebekleber sowie einen Kit, bestehend aus zwei im wesentlich getrennten Behältnissen, die Komponenten der Zusammensetzung enthalten.

Description

Beschreibung
ZUSAMMENSETZUNG AUS EINEM AMINORUPPEN TRAGENDEN POLYMER UND EINEM ALDEHYD MIT MINDESTENS DREI ALDEHYDGRUPPΞN
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung aus mindestens zwei, insbesondere zwei, biokompatiblen, untereinander chemisch vernetzbaren Komponenten, insbesondere zum Verkleben von biologischem Gewebe, umfassend mindestens folgende Komponenten: a) wässrige Lösung mindestens eines aminogruppentragenden Polymers b) wässrige Lösung mindestens eines Aldehyds mit mindestens drei Aldehydgruppen.
In der Chirurgie werden zum Zusammenfügen von getrennten Gewebeteilen hauptsächlich Nahtmaterialien und Klammern verwendet. Diese Techniken stoßen jedoch vor allem in der minimal invasiven Chirurgie, zu welcher unter anderem die Laparoskopie, die Thorakokospie, die Athroskopie, die Kardiochirurgie sowie die intraluminale Endoskopie zählen, auf ihre Grenzen. In diesen Bereichen ist die Anwendung von Gewebeadhäsiven und Sealants einfacher, schneller und sicherer. Mehrere Patente beschreiben synthetische und natürliche Polymer- oder Makromersysteme, die zum Verkleben von Weichgewebe, zum Abdichten von Luft- und Flüssigkeitsleckagen in Organen und Blutgefäßen angewendet werden können.
Die auf dem Markt kommerziell erhältlichen Fibrinkleber bestehen unter anderem aus humanen oder/und bovinen Plasmaproteinen, die hinsichtlich der Übertragung von Infektionen ein erhebliches
Gesundheitsrisiko darstellen. Zudem ist ihre Haftkraft oft unzureichend. lm Vergleich zu Fibrinklebern weisen Hydrogele deutlich höhere cohäsive wie auch adhäsive Eigenschaften auf. Besonders geeignet sind Zusammensetzungen, die in flüssigem Zustand auf das Gewebe aufgebracht werden können und dann durch Ausbildung kovalenter Bindungen innerhalb kurzer Zeit aushärten. Die in situ Aushärtung beruht in der Regel auf der Vernetzung von Makromersystemen und kann durch radikalische Polymerisation oder durch chemische Reaktion mit bi- oder multifunktionellen Vernetzungsreagenzien erfolgen.
Die radikalische Vernetzung kann durch Licht- oder Wärmequellen sowie über oxidative Radikalbildung mit anorganischen Persulfaten oder Enzymen ausgelöst werden. In den US-Patenten 6,156,345, Chudzik et al., US 6,083,524, Sawhney et al. und US 6,060,582, Hubbel et al., werden synthetische Makromere mit radikalisch polymerisierbaren Endgruppen beschrieben, deren Polymerisation durch Bestrahlung mit UV-Licht in situ auf dem Gewebe initiiert wird. Neben synthetischen Polymeren können auf diese Weise auch viskose Lösungen von Kollagen und Kollagenderivaten vernetzt werden (US 6,183,498 B1 , Devore et al., US 5,874,537 Kelman et al.). Aufgrund der zusätzlich benötigten Lichtquelle ist die Technik sehr aufwendig und teuer. Als Alternative zur UV-Aktivierung kann eine Polymerisation auch mit Hilfe einer Wärmequelle ausgelöst werden. Die erforderlichen Temperaturen beschädigen allerdings gesunde Zellen im Gewebe und töten diese häufig ab. Prinzipiell ist die Beschädigung von gesundem Gewebe bei den meisten radikalischen Polymerisationen ein Problem, da diese exotherm verlaufen, d.h., während der Polymerisation wird Wärme an die Umgebung abgegeben.
Als Alternative zur radikalischen Polymerisation können Makromere auch über reaktive Gruppen chemisch vernetzt werden. Vor allem
Carbonyl- wie auch bestimmte Carboxylreaktionen besitzen bezüglich der Kinetik die gewünschten Eigenschaften, um eine schnelle Gelierung der Komponenten zu gewährleisten. In US-Patent 6,051 ,648, Rhee et al., werden synthetische Polymere mit N-Hydroxysuccinimid aktivierten Carboxylgruppen beschrieben, die unter Abspaltung des N- Hydroxysuccinimids mit nukleophilen multifunktionellen Polymeren vernetzen. Durch die fehlende Stabilität der aktivierten Carboxylgruppen in wässriger Lösung müssen hierbei vorgeformte Patchs angewendet werden, was gerade in der minimal invasiven Chirurgie erhebliche Nachteile mit sich bringt.
Freie Lysineinheiten in Polypeptiden und Proteinen bilden durch die Reaktion mit Di- oder Polyaldehyden Schiffsche Basen aus. Kowanko beschreibt in US-Patent 5,385,606 eine adhäsive Zusammensetzung bestehend aus humanen oder tierischen Proteinen und einem Di- oder Polyaldehyd, wobei die Vernetzung bevorzugt mit Glutaraldehyd durchgeführt wird. Die Verwendung von Glutaraldehyd ist jedoch kritisch. Vries et al. (Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richmond, USA p. 51 , 1992) konnten nachweisen, daß mit Glutaraldehyd vernetzte Gelatine toxische Wirkung auf Zellen hatte, was bei reiner Gelatine nicht der Fall ist.
In US-Patent 6,156,488 hingegen beschreibt Tardy et al. einen biokompatiblen Gewebekleber bestehend aus einer wässrigen Kollagenlösung und einer wässrigen Polyaldehydlösung und vermeidet somit die Verwendung von kleinen toxischen Molekülen zur Vernetzung. Ein Gewebekleber aus oxidiertem Dextran oder Stärke und modifizierter Gelatine wird auch von Mo et al. in J. Biomater, Sei. Polymer Edn. 2000, 11 , 341 -351 beschrieben. Dextran ist in vielen Medizinprodukten enthalten und wird zum Beispiel in Wunddressings in oxidierter Form als vernetzende Komponente verwendet (Schacht et al, US-Patent 6,132,759). Die makromolekularen Vernetzungsreagenzien werden dabei durch Oxidation von Dextran oder Stärke mit Natriumperiodat hergestellt. Diese Reaktion wurde unter anderem von Bernstein et al. (Natl. Cancer Inst. 1978, 60, 379-384) beschrieben und ist Stand der Technik. Die Verwendung von Kollagen in der Medizin ist dagegen bezüglich der Infektionsgefahr kritisch, besonders im Hinblick auf BSE und Kreutzfeld-Jakob Erkrankungen. Zudem können durch Eiweißstoffe Immunreaktionen im Körper ausgelöst werden.
Chitin ist in der Natur ein weitverbreitetes lineares, stickstoffhaltiges Polysaccharid und bildet den Hauptbestandteil des Außenskelettes von Gliederfüßern (Maikäferflügel, Hummer- und Garnelenschalen). In konzentrierter Natronlauge entsteht aus Chitin das Deacetylierungsprodukt Chitosan, welches im Gegensatz zum Chitin freie Aminogruppen besitzt und in schwach saurem, wässrigem Medium löslich ist. Das' Degradationsverhalten von reinem und mit Glutaraldehyd behandelten Chitosan sowie die akute Toxität und die hämostatische Wirkung von Chitosan wird von Rao et al. beschrieben (J. Biomed. Mater. Res. 1997, 34, 21 -28). Aufgrund der antimikrobiellen und hämostatischen Wirkung in Kombination mit ihrer hohen Biokompatibilität sind Chitosan und Chitin vielversprechende Substanzen für medizinische Produkte. In US-Patent 6,124,273 werden Proteine in Chitosanschwämme eingearbeitet und die Zusammensetzung bei äußerlichen Wunden eingesetzt. Die Chitosanschwämme setzen dabei die Proteine frei und beschleunigen die Wundheilung. Ono et al. beschreiben einen biologischen Gewebekleber aus photovernetztem Chitosan (K. Ono, et al., J. Biomed. Mater. Res. 2000, 49, 289-295). Die Vernetzung erfolgt durch Bestrahlung mit UV-Licht. Diese teure und aufwendige Technik hat sich in der Praxis, wie bereits erwähnt, nicht durchgesetzt. Zudem ist die Haftkraft dieses Adhäsives unzureichend, sie liegt im Bereich der Fibrinkleber.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Zusammensetzung zu schaffen, welche die genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet, insbesondere die Gefahr der Übertragung von Infektionskrankheiten vermeidet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Zusammensetzung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Aus- bzw. Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
Durch die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Zusammensetzung frei von Eiweiß ist, ist die Gefahr einer Übertragung von
Infektionskrankheiten, die bei einer Verwendung von Eiweiß (z.B.
Kollagen) gegeben ist, ausgeschaltet. Dies ist insbesondere im Hinblick auf eine mögliche Übertragung von BSE-Erregern auf den Menschen ein großer Vorteil gegenüber den, im Stand der Technik beschriebenen eiweißhaltigen Zusammensetzungen. Zudem ist auch die Gefahr von eiweißbedingten Immunreaktionen bei der erfindungsgemäßen, eiweißfreien Zusammensetzung gebannt.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung besteht darin, daß die Gelierung der Komponenten spontan erfolgt und keine zusätzlichen Energiequellen erforderlich sind. Dadurch ist die Applikation vereinfacht und verläuft gewebeschonend, da das gesunde Gewebe nicht z. B. durch übermäßig hohe Wärmeenergie beeinträchtigt wird.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist es, daß die Komponenten in wässrigem Medium appliziert werden können und dadurch eine bessere Bedeckung der Wundfläche gewährleistet ist als dies beispielsweise bei vorgeformten Patches der Fall ist (vgl. z.B. US 6,051 ,648).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind der Aldehyd und das aminogruppentragende Polymer bei Körpertemperatur miteinander vernetzbar. Dadurch können die oben genannten zusätzlichen Energiequellen vermieden werden, was wiederum
Gewebeschädigungen vermeidet.
Vorzugsweise ist das aminogruppentragende Polymer von einem biologisch abbaubaren Naturstoff abgeleitet. Besonders bevorzugt ist es, daß das aminogruppentragende Polymer ein Polysaccharid, insbesondere ein modifiziertes Saccharid, bei dem die Aminogruppen durch Deacetylierung freigesetzt sind, ist. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Zusammensetzung ist das amiogruppentragende Polymer ein mindestens [ teilweise deacetyliertes Chitin mit einem Deacetylierungsgrad von 50 bis 100 %, vorzugsweise 60 bis 90 %, insbesondere 70 bis 80 %. Durch die Deacetylierung werden die Acetamidgruppen im Chitin in Aminogruppen umgewandelt. Dies bewirkt u.a. wiederum, daß der Abbau im Körper langsamer verläuft als bei (nicht deacetyliertem) Chitin. Besonders bevorzugt ist es, wenn das aminogruppentragende Polymer Chitosan ist. Chitosan hat eine blutgerinnende Wirkung. Deacetyliertes Chitin, insbesondere Chitosan, wird vorzugsweise in wasserlöslicher Salzform eingesetzt (Chlorid, Acetat, Glutamat).
Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist das Aminogruppen tragende Polymer ein synthetisches Polymer, insbesondere ein nierengängiges Polymer. Dies hat den Vorteil, daß eine einfache Ausscheidung des aminogruppentragenden Polymers über den Urin möglich ist.
Vorteilhafterweise ist das synthetische Polymer ein modifizierter aminogruppentragender Polyvinylalkohol, vorzugsweise mit einem
Molekulargewicht < 50.000, insbesondere < 50.000, vorzugsweise <
20.000, insbesondere < 20.000. Beispiele für die Modifizierung von Polyvinylalkohol sind die Veresterung von Polyvinylalkohol mit Aminosäuren, die Veresterung mit Dicarbonsäuren bzw. -anhydriden verbunden mit einer Amidbildung mit mehrwertigen Aminen, insbesondere Diaminen, und die Bildung zyklischer Acetale.
Der Modifizierungsgrad kann beliebig eingestellt werden und ist nicht auf die Kettenenden beschränkt wie zum Beispiel bei PEG oder Polyhydroxyalkanoaten. Als weitere multifunktionelle Polymere mit freien Hydroxygruppen stehen auch Polysaccharide wie Dextran, Cellulose, Chitosan, Hyaluronsäure, Alginsäure, Stärke, Agar, Chitin und Chondroitinsulfat zur Verfügung.
Beispiele für Modifikationen von Polyvinylalkohol (PVA)
a) Retrosynthese von Alanin modifiziertem PVA
Figure imgf000008_0001
Die Anbindung von Aminosäuren an Polyvinylalkohol erfolgt in zwei Schritten. Zuerst wird der Alkohol mit einem BOC geschützten Alanin verestert. Als Katalysator wird eine Base hinzugefügt. Die Reaktion muss in wasserfreiem Lösungsmittel durchgeführt werden. Nach erfolgreicher Anbindung kann die BOC Schutzgruppe unter milden Bedingungen bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure abgespalten werden. Prinzipiell kann jede beliebige Aminosäure auf diese Weise angebunden werden, bevorzugt sind jedoch Aminosäuren mit zusätzlichen Thiol- oder Hydroxygruppen, wie z.B. Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin, besonders bevorzugt sind Aminosäuren mit weiteren Aminogruppen wie z.B. Asparagin, Lysin, Glutamin, Arginin oder Trytophan. Ebenso ist die Anbindung einer Mischung aus den erwähnten Aminosäuren denkbar.
5 Vorteil:
- keine Amidbindungen, Esterbindungen sollten hydrolytisch spaltbar sein
- Abbauprodukt ist eine Aminosäure (toxikologisch unbedenklich). 0 b) Retrosynthese mit Bernsteinsäureanhydrid und Diamin
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
Die Anbindung von freien Aminogruppen an Polyvinylalkohol über zyklische Disäureanhydride erfolgt ebenfalls in zwei Stufen. Im ersten Schritt wird das Anhydrid mit Hilfe einer katalytisch wirkenden Base EDC an den Alkohol gebunden. Anschließend erfolgt die Umsetzung mit einem Diamin. Das Diamin sollte im Uberschuss eingesetzt werden, um eine Vernetzung des Polyvinylalkohols während der Reaktion zu vermeiden. Als Disäureanhydride können u.a. auch Maleinsäureanhydrid, Adipinsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid verwendet werden.
Vorteil:
Ausgangssubstanzen sind sehr günstig
Anbindung an PVA durch Esterbindung kann leicht abgebaut werden
Diamine könnten toxikologisch problematisch sein (möglicher
Ersatz durch Triethylenglycoldiamin) (NH2-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-
NH2))
c) Einführung von terminalen Aminogruppen über zyklische Acetale
Figure imgf000010_0001
Über Acetalbindungen lassen sich in einem Schritt terminale Aminogruppen in den Polyvinylalkohol einbringen. Die Bildung des zyklischen Acetals ist dabei energetisch bevorzugt. Die Kettenlänge des Spacers kann variiert werden, bevorzugt ist n < 4, besonders bevorzugt ist n = 1.
Vorteile:
- Einführung der Aminogruppe in einem einzigen Syntheseschritt - Keine Schutzgruppenchemie, eine Vernetzung während der
Reaktion ist nicht zu erwarten.
Es können auch Kombinationen von aminogruppentragenden Polysacchariden und aminogruppentragenden Polyvinylalkoholen zur Anwendung kommen.
Mit Vorteil ist der Aldehyd ein Polyaldehyd. Dieser ist vorzugsweise biologischen Ursprungs. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung ist der Aldehyd ein oxidiertes Polysaccharid. Es ist besonders bevorzugt wenn sowohl das Aminogruppen tragende Polymer als auch der Aldehyd Polysaccharidgerüste aufweisen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung ist der Aldehyd ein oxidiertes Polysaccharid, wobei das Polysaccharid mindestens eines aus der Gruppe von Dextran, Chitin, Stärke, Agar, Cellulose, Alginsäure, Glycosaminoglykane, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und deren Derivate ist. Dextranaldehyd ist bevorzugt. Der Aldehyd, insbesondere der Dextranaldehyd, besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von ca. 60.000 bis 600.000, insbesondere ca. 200.000. Höhere Molekulargewichte, insbesondere von mindestens 200.000, bringen hohe Vernetzungsgrade. Vorteilhafterweise ist der Aldehyd teilweise oder vollständig maskiert. Zweck der Maskierung, insbesondere von oxidierten Polyaldehyden, ist es, die Bildung von intermolekularen Acetalen zu vermeiden und somit die Stabilität der Lösungen zu gewährleisten. Die kontrollierte Freisetzung der Aldehyde erfolgt schließlich in situ durch kontrollierte Hydrolyse in einem pH-Bereich von 2 bis 6, bevorzugt 2 bis 4,5. Es ist besonders bevorzugt, daß der Aldehyd mit einem S-, O- oder N- Nukleophil maskiert ist. Mit Vorteil ist der teilweise oder vollständig maskierte Aldehyd ein Polysaccharidalkalihydrogensulfitaddukt. Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist der Aldehyd teilweise oder vollständig mit Ethanol oder Glycerol maskiert.
Mit Vorteil sind die pH-Werte der Komponenten so abgestimmt, daß der pH-Wert einer Mischung der Komponenten zwischen 3 und 8, insbesondere zwischen 5 und 7,5 liegt. Ein hoher pH-Wert begünstigt zwar eine Vernetzung, führt aber zum Ausfallen von beispielsweise Chitosan.
Es ist insbesondere der Aldehyd, der für die Klebekraft verantwortlich ist und die Bindung an das Gewebe ermöglicht, jedoch ist allein durch den Aldehyd keine Bedeckung des Gewebes möglich. So ist vorteilhafterweise die stöchiometrische Menge an Aldehydgruppen in Komponente b) mindestens die dreifache der stöchiomethschen Menge an Aminogruppen in Komponente a).
Vorteilhafterweise sind die Komponenten so aufeinander abgestimmt, daß sie nach Vereinigung in kurzer Zeit, insbesondere einer Zeit von 15 bis 200 Sekunden, miteinander vernetzen. Die Vernetzungszeit kann zum Beispiel durch die Konzentration der Lösungen und über das Mischungsverhältnis gesteuert werden. Der Vernetzungsgrad kann ebenfalls eingestellt werden, nämlich über die Zahl der Aldehydgruppen des Aldehyds.
Auch die Viskosität der Zusammensetzung ist steuerbar. Vorteilhafterweise sind die Viskositäten der Komponenten so aufeinander abgestimmt, daß eine Schicht der Zusammensetzung mit einer Dicke von 0,1 bis 1 mm applizierbar ist.
Die genannten Einstellungsmöglichkeiten (z.B. Vernetzungsgeschwindigkeit, Viskosiät, Reaktivität) sind bei Zusammensetzungen mit Gelatine oder Kollagen, die je nach ihrem Ursprung verändert sind und keine definierten Reaktionen erlauben, nicht gegeben.'
Vorteilhafterweise beträgt der Gehalt von Komponente b) an Aldehyd 5 bis 20 Gew.%, insbesondere 10 bis 15 Gew.%. Vorzugsweise beträgt der Gehalt von Komponente a) an aminogruppentragendem Polymer 1 bis 25 Gew.%, insbesondere 2 bis 20 Gew.%. Die Volumenverhältnisse der beiden Lösungen a) : b) liegen zwischen 5:1 und 1 :5, vorzugsweise zwischen 3:1 und 1 :3. Liegen sie, was in vielen Fällen bevorzugt ist, bei 1 :1 , dann können in einfacher Weise gleiche Volumina miteinander gemischt werden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist die Komponente a) eine essigsaure Lösung von Chitosan und Komponente b) eine wässrige Lösung von Dextranaldehyd. Dextran zeichnet sich beispielsweise gegenüber Glutaraldehyd (vgl. z.B. US 5,385,606) dadurch aus, dass es nicht toxisch ist.
Die Erfindung betrifft außerdem die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Verwendung als chirurgischer Kleber, insbesondere zum Versiegelen oder Verschließen von Oberflächen bzw. Öffnungen.
Bevorzugt werden die Komponenten kurz vor einer Applikation miteinander vermischt. Dies kann beispielsweise mit Hilfe einer Zwillingsspritze von statten gehen, bei der die beiden Komponenten in ein gemeinsames Auspressrohr, in dem sich ein statischer Mischer befindet, hineingedrückt werden. Durch den statischen Mischer im Auspressrohr werden die beiden Komponenten miteinander vermischt und werden, kurz bevor sie miteinander vernetzen, aus der Spritze auf die Applikationsstelle ausgepresst.
Es ist weiterhin auch möglich, daß die Komponenten erst auf einer Applikationsstelle vermischt werden, indem die beiden Komponenten beispielsweise kurz nacheinander auf eine Applikationsstelle aufgetragen werden.
Die Erfindung beansprucht auch einen Kit, bestehend aus zwei, bezogen auf den Inhalt, im wesentlichen getrennten Behältnissen, wobei jedes Behältnis jeweils eine Komponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform fungieren die beiden Behältnisse als Spritzenzylinder einer Doppelspritze. Bei einer solchen Doppelspritze, die auch Zwillingsspritze genannt wird, werden die getrennt gelagerten Komponenten in ein gemeinsames Auspressrohr gedrückt. Vorteilhafterweise weist der Kit eine Einrichtung zum Vermischen der Komponenten auf. Besonders bevorzugt ist es, daß der Kit einen statischen Mischer aufweist, der insbesondere auf eine Doppelspritze aufsteckbar ist. Dieser statische Mischer befindet sich insbesondere im Auspressrohr der Doppelspritze. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Doppelspritze an der Aufsteckstelle des Auspressrohres verschließ- und offenbar. Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt einen schematischen Längsschnitt durch eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits.
Die in der einzigen Zeichnung dargestellte bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Kits zeigt einen Längsschnitt durch eine Doppelspritze 1. Diese Doppelspritze besteht aus zwei zusammenhängenden Spritzenzylindern 2a und 2b, welche die beiden Komponenten bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung getrennt beinhalten. Die Volumenverhältnisse der beiden Spritzenzylinder sind auf das Mischungsverhältnis der beiden Komponenten abgestimmt. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel weisen die beiden Spritzenzylinder 2a und 2b gleiche Volumina an zwei Komponenten einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf. Es ist auch möglich Doppelspritzen zu verwenden, bei denen die Volumina verschieden sind, beispielsweise die Zylinder verschieden große Durchmesser haben.
Ferner umfasst die Doppelspritze 1 zwei Spritzenstempel 3a und 3b, die durch eine Verbindungsplatte 4 miteinander verbunden sind. Am oberen Ende der beiden Spritzenstempel 3a und 3b sind jeweils zwei Koibendichtringe 5a und 5b aufgebracht. Diese Kolbendichtringe schließen im wesentlichen luftdicht mit den Wandungen der beiden Spritzenzylinder 2a und 2b ab. An ihrem oberen Ende weist jeder der beiden Spritzenzylinder 2a und 2b jeweils eine, direkt aneinander angrenzende Öffnung 6a bzw. 6b auf. Diese Öffnungen sind bis zum ersten Gebrauch verschlossen. Auf die beiden angrenzenden Öffnungen 6a und 6b ist nach deren Öffnen ein Auspressrohr 7 aufsteckbar. Im Auspressrohr 7 befindet sich ein statischer Mischer 8. An seinem oberen Ende verschmälert sich das Auspressrohr zu einer Auspressöffnung 9.
Beispielsweise durch Druck auf die Verbindungsplatte 4 und Gegendruck auf die Platte 10 bewegen sich die beiden Spritzenstempel 3a und 3b mit den daran befestigten Kolbendichtringen 5a und 5b in Richtung der Öffnungen 6a und 6b. Dadurch werden die beiden in den Spritzenzylindern befindlichen Komponenten aus den Öffnungen 6a und 6b in das Auspressrohr 7 gedrückt. Insbesondere durch den im Auspreßrohr 7 befindlichen statischen Mischer 8 werden die beiden Komponenten im Auspressrohr innig miteinander vermischt und werden schließlich in vermischtem Zustand aus der Auspressöffnung 9 auf eine Applikationsstelle gedrückt.
Beispiel einer erfindunqsqemäßen Zusammensetzung:
1 . Zusammensetzung
Lösung A: wässrige Lösung von Chitosan Lösung B: wässrige Lösung von Dextranaldehyd
Durch Mischen der beiden Lösungen bildet sich ein Gel aus, welches adhäsive Eigenschaften besitzt. Die Gelierung beruht auf der Ausbildung von Iminen (Schiffschen Basen) zwischen den Aldehydgruppen im oxidierten Dextran und den freien Aminogruppen im Chitosan (s. Reaktionsschema Angang 1 ).
Alternativ zur Chitosanlösung können auch Lösungen von modifizierten Polysacchariden (mit Aminen modifiziertes Dextran) oder synthetischen Polymeren (mit Aminen modifizierter Polyvinylalkohol) verwendet werden.
1.1. Chitosanlösung
2g Chitosan werden in 100 ml 2%ige Essigsäurelösung (v/v) gegeben und fünf Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Als Alternative hierzu wird eine 4 %ige wässrige (w/v) Protasan® UP Cl 213 (Fa. FMC Biopolymers, Drammen, Norwegen) Lösung (VE-Wasser) verwendet. Bei Protasan® UP Cl 213 handelt es sich um ein Chitosansalz mit Chlorid als Gegenion.
1.2 Synthese von Dextranaldehyd
Die zur Synthese verwendete 5%ige (w/v) Natriumperiodatlösung wird vor jeder Umsetzung frisch hergestellt und mit einer 10%igen (w/v) Dextranlösung vereinigt. Zur Herstellung der Dextranaldehyde können unterschiedliche stöchiometrische Verhältnisse verwendet (s. Tabelle 1 ) werden. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, 2 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert und schließlich die aufgereinigte Reaktionslösung lyophilisiert. Das Reaktionsprodukt ist ein weißer faserartiger Feststoff.
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Tabelle 1 : Stöchiometrische Mengenverhältnisse der durchgeführten Synthesen
Von den auf die oben beschriebene Weise hergestellten Dextranaldehyden werden 15%ige Lösungen (w/v) hergestellt, indem 4,5g Dextranaldehyd in 30 ml destilliertes Wasser gegeben und über Nacht im Wasserbad bei 37°C geschüttelt werden. Für die Gelierung ist es vorteilhaft den pH-Wert der Dextranaldehydiösung durch Zugabe eines Phosphatpuffers zu erhöhen. Anteil an oxidierten Glucoseeinheiten im Dextran in Abhängigkeit vom molaren Verhältnis Nal04 pro Glucoseeinheiten
Figure imgf000019_0001
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 molares Verhältnis Nal04 bezogen auf Glucoseeinheiten
1.3 Molekulargewicht Dextran
Das mittlere Molekulargewicht im Dextran wurde variiert. Es wurde Dextran mit einem mittleren MW von 60.000 bis 90.000 Dalton (Fa. Fischer Scientific, Schwerte, Deutschland) und Dextran mit einem höheren mittleren MW von 413.263 Dalton (Fa. Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) eingesetzt.
Das Molekulargewicht hatte keine Auswirkung auf den Anteil von oxidierten Glucoseeinheiten in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge an Nal04. Bestimmung des Aldehvdαehalts
Die Bestimmung des prozentualen Anteils an oxidierten Glucoseeinheiten erfolgte titrimetrisch analog der Literatur [B.T. Hofreiter, B.H. Alexander, I.A. Wolff, Anal. Chem. 1955, 27, 1930ff.]
0,15 g Dextranaldehyd werden in einem Erlenmeyerkolben vorgelegt und anschließend mit 10 ml einer 0,25 N carbonatfreien NaOH Lösung versetzt. Die Mischung wird gerührt bis der eingesetzte Dextranaldehyd gelöst ist. Danach wird der Kolben für eine Minute in ein heißes Wasserbad (80°C) getaucht und anschließend unter starkem Rühren ins Eisbad gestellt. Nach einer Minute werden unter Rühren vorsichtig 15 ml 0,25 N Schwefelsäure hinzugegeben. Die Mischung wird anschließend mit 50 ml Wasser verdünnt und mit 1 ml 0,2 %iger Phenolphthaleinlösung versetzt. Die saure Lösung wird mit 0,25 N NaOH Lösung gegen den Indikator titriert.
Aus der zugegebenen Menge an Dextran bzw. Dextranaldehyd sowie dem Verbrauch an Säure und Base berechnet sich der Dialdehydgehalt X wie folgt:
Figure imgf000020_0001
X: Dialdehydgehalt neqsäure: Äquivalentzstoffmenge der Säure nΘqBase: Äquivalentstoffmenge der Base WDA: Trockengewicht Dextranaldehyd Woextran: Trockengewicht Dextran nNaOH: Normalität des NaOH Titers ΠH2SO4: Normalität der verwendeten H2S04-Lösung
In weiteren Syntheseansätzen wurde das optimale stöchiometrische Verhältnis Nalθ4 pro Glucoseeinheit Dextran ermittelt. Nachfolgende Grafik zeigt, dass ab einem stöchiometrischen Verhältnis Nal04 pro Glucoseeinheit Dextran von 2:1 der prozentuale Anteil an oxidierten Glucoseeinheiten über 90 % liegt.
2. Gelierungszeit der beiden Lösungen
Die Gelierungszeit hängt vom verwendeten Dextranaldehyd sowie vom Mischungsverhältnis der Dextranaldehyd- und der Chitosanlösung ab. Die Gelierungszeit nimmt mit zunehmendem Oxidationsgrad des Dextranaldehyds und mit zunehmendem Verhältnis 15%ige Dextranaldehydiösung: 2%ige Chitosanlösung zu. Sie liegt zwischen 15 und 200 Sekunden.
Figure imgf000022_0001
Tabelle 2: Gelierungszeiten in Abhängigkeit vom verwendeten Dextranaldehyd und vom Mischungsverhältnis der Lösungen
3. Bestimmung der Haftscherkraft
Die Haftscherkraft des neuen Gewebeklebers wird mit Hilfe von gereinigtem und lyophilisiertem Kollagen Typ I aus Rinderherzbeuteln (Lyoplant, BBraun Aesculap, Tuttlingen) bestimmt. Hierzu wird das Lyoplant zu Streifen mit 40 mm Länge und 10 mm Breite zugeschnitten, an deren Ende die zu verklebende Fläche von 1 cm2 markiert wird. Die Klebung der Lyoplantstreifen verläuft wie folgt: Die entsprechenden Mengenverhältnisse (s. Tabelle) Chitosan- und Dextranaldehydiösung werden in einem Reagenzglas vereinigt und 2 Sekunden geschüttelt, um eine gute Durchmischung der Lösungen zu erhalten. Anschließend werden jeweils 20 μl zentriert auf die zu verklebende Fläche aufgetragen. Die Klebefläche wird mit einer Folie vor dem Austrocknen geschützt und 10 Minuten mit 50g belastet. Danach werden die Streifen mit einer Zuggeschwindigkeit von 100 mm/min auseinandergezogen. Die Versuche wurden mit zwei unterschiedlichen Chargen Dextranaldehyd durchgeführt und der Mittelwert aus n = 13 Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 3 bis 5 aufgelistet.
Figure imgf000023_0001
Tabelle 3: Vergleich der Haftscherkraft von DA 3 Charge 1 und 2 in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis 2%ige
Chitosanlösung: 15%ige DA(3)Lösung
Volumenverhältnis 2%ige Haftscherkraft DA 4 Haftscherkraft DA 4 Chitosanlösung / 15%ige Charge 1 (kPa) Charge 2 (kPa) DA(4) Lösung
3:1 128 ± 56 163 + 56,8
1 :1 124 ± 36,4 175 ± 22,2
1 :3 167 ± 54,1 192 ± 71 ,8
Tabelle 4: Vergleich der Haftscherkraft von DA 4 Charge 1 und 2 in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis 2%ige
Chitosanlösung zu 15%ige DA(4)Lösung
Figure imgf000024_0001
Tabelle 5: Vergleich der Haftscherkraft von DA 5 Charge 1 und 2 in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis 2%ige Chitosanlösung zu 15%ige DA(5)Lösung
Die Haftscherkraft nimmt ebenso wie die Gelierungszeit mit zunehmendem Oxidationsgrad und zunehmender Menge an Dextranaldehydiösung zu.
Analog zur Bestimmung der Haftscherkraft der
Dextranaldehyd/Chitosanmischung wurden Untersuchungen mit Dextranaldehyd und einem Polyvinylalkohol-vinylaminpfropf-polymerisat (PVALNH2) durchgeführt. Das Pfropfpolymerisat wurde als 20%ige, wässrige Lösung vom Hersteller geliefert und in unverdünntem Zustand zur Klebung von Lyoplantstreifen eingesetzt. Die Präparation der Lyoplantstreifen und die Auftragung der Lösungen wurden identisch zu den Dextranaldehyd/Chitosanklebungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in den nachfolgenden Tabellen aufgelistet:
Figure imgf000025_0001
Tabelle 6: Vergleich der Haftscherkraft von DA 4 Charge 3 in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis 20%ige PVALNH - Lösung zu 15%ige DA(4) Lösung
Figure imgf000025_0002
Tabelle 7: Vergleich der Haftscherkraft von DA 5 Charge 5 in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis 20%ige PVAL-NH - Lösung zu 15%ige DA(5)Lösung
Zusätzliche Haftscherkraftuntersuchungen wurden mit höhermolekularem Dextranaldehyd und 4 % iger Protasanlösung durchgeführt. Die Lösungen wurden mit Hilfe eines Applikators der Firma Mixpac auf die Lyoplantstreifen aufgetragen. Der Applikator besteht aus einem Zweikammersystem mit aufgesetzter Mischerspitze. Das Lyoplant wurde zu Streifen mit einer Länge von 40 mm und einer Breite von 10 mm zugeschnitten, an deren Ende eine zu verklebende Fläche von 1 cm2 markiert wurde. Die Lösungen wurden über den Mischer appliziert, die Klebefläche mit einer Folie abgedeckt, um diese vor dem Austrocknen zu schützen und 10 Minuten mit 50 g belastet. Danach wurden die Streifen mit einer Zuggeschwindigkeit von 100 mm/min. auseinandergezogen. Das mittlere MW des verwendeten Dextran beeinflusst die Haftscherkraft, wie in Tabelle 8 gezeigt wird:
Figure imgf000026_0001
Tabelle 8: Vergleich der Haftscherkräfte des neuen Klebers in Abhängigkeit vom mittleren Molekulargewicht des Dextranaldehyds. Mischungsverhältnis der Lösungen 1 :1
Ebenso wurden Klebeversuche mit Bioglue® (Cryolife International Inc. USA) bestehend aus Proteinen und Glutaraldehyd sowie mit GLUETISS einem Gelatine-Resorcinol Dialdehydkleber, die gemäss der Gebrauchsanleitung auf die Lyoplantstreifen aufgetragen wurden, durchgeführt. Die mit diesen Klebern verklebten Streifen wurden ebenfalls mit einer Folie bedeckt und 10 Minuten mit 50 g belastet. Ein Vergleich der erzielten Haftscherkräfte ist in Tabelle 9 gezeigt.
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Tabelle 9: Vergleich der Haftscherkraft einer erfindungsgemässen Zusammensetzung mit BioGIue® und GLUETISS®
4. Stillung von Leberblutungen
Der chirurgische Kleber wurde zur Stillung von Blutungen an der Rattenleber (SPF Wistar Ratten) eingesetzt. Hierzu wurde eine
Zusammensetzung aus einer 4 %igen wässrigen Protasanlösung und einer 15 %igen wässrigen Dextranaldeydlösung DA 6 gewählt. Die Lösungen wurden in einem Mischungsverhältnis von 1 :1 eingesetzt. Zum Mischen und Auftragen der Komponenten wurde ein Applikator der Firma Mixpac verwendet.
Nach der Betäubung der Ratten wurde an der Leber das Modell der Kreuzinzision (Länge derr Schnitte: 2,5 cm) gewählt. Der Kleber wurde direkt nach der Inzision auf die blutende Wunde aufgetragen. Es bildete sich ein Gel aus, welches fest an der Leberoberfläche haftete, so dass die Blutung unmittelbar nach der Auftragung des Klebers zum Stillstand kam.

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung aus mindestens zwei, insbesondere zwei, biokompatiblen, untereinander chemisch vernetzbaren Komponenten, insbesondere zum Verkleben von biologischem Gewebe, umfassend mindestens folgende Komponenten: a) wässrige Lösung mindestens eines aminogruppentragenden Polymers : b) wässrige Lösung mindestens eines Aldehyds mit mindestens drei Aldehydgruppen, wobei die Zusammensetzung frei von Eiweiß ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der
Aldehyd und das aminogruppentragende Polymer bei Körpertemperatur miteinander vernetzbar sind.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aminogruppentragende Polymer von einem biologisch abbaubaren Naturstoff abgeleitet ist.
4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das aminogruppentragende Polymer ein Polysaccharid, insbesondere ein modifiziertes Polysaccharid, bei dem die Aminogruppen durch Deacetylierung freigesetzt sind, ist.
5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das aminogruppentragende Polymer Chitosan ist.
6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das aminogruppentragende Polymer ein mindestens teilweise deacetyliertes Chitin mit einem Deacetylierungsgrad von 50 bis 100 %, vorzugsweise 60 bis 90 %, insbesondere 70 bis 80 %, ist.
7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aminogruppentragende Polymer ein synthetisches Polymer, insbesondere ein nierengängiges Polymer, ist.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Polymer ein modifizierter aminogruppentragender Polyvinylalkohol ist, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht < 50.000 insbesondere < 20.000.
9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd ein Polyaldehyd ist.
10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd ein oxidiertes Polysaccharid ist.
11.Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid mindestens eines aus der Gruppe von Dextran,
Chitin, Stärke, Agar, Cellulose, Alginsäure, Glykosaminoglykane, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und deren Derivaten ist.
12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd, insbesondere Dextranaldehyd, ein Molekulargewicht von ca. 60.000 bis 600.000, insbesondere ca. 200.000, besitzt.
13. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd teilweise oder vollständig maskiert ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd mit einem S-, O- oder N-Nucleophil maskiert ist.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch
» * - gekennzeichnet, dass der teilweise oder vollständig maskierte Aldehyd ein Polysaccharidalkalihydrogensulfitaddukt ist.
16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd teilweise oder vollständig mit Ethanol oder Glycerol maskiert ist.
17. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Komponente b) an Aldehyd 5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 10 bis 15 Gew.-% beträgt.
18. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt von Komponente a) an aminogruppentragendem Polymer 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere 2 bis 20 Gew.-% beträgt.
19. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ph-Werte der Komponenten so abgestimmt sind, dass der ph-Wert einer Mischung der Komponenten zwischen 3 und 8, insbesondere zwischen 5 und 7,5, liegt.
20. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die stöchiometrische Menge an Aldehydgruppen in Komponente b) mindestens die dreifache der stöchiometrischen Menge an Aminogruppen im aminogruppentragenden Polymer ist.
21. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten so aufeinander abgestimmt sind, dass sie nach Vereinigung in kurzer Zeit, insbesondere einer Zeit von 15 bis 200 sek, miteinander vernetzen.
22. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Viskositäten der Komponenten so aufeinander abgestimmt sind, dass eine Schicht der Zusammensetzung mit einer Dicke von 0,1 bis 1 mm applizierbar ist.
23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass Komponente a) eine essigsaure Lösung von Chitosan ist und Komponente b) eine wässrige Lösung von Dextranaldehyd ist.
24. Bereitstellung der Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung als chirurgischer Gewebekleber, insbesondere zum Versiegeln oder Verschließen von Oberflächen bzw. Öffnungen.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten kurz vor einer Applikation miteinander vermischt werden.
26. Verwendung nach Anspruch 24 , dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten auf einer Applikationsstelle vermischt werden.
27. Kit, bestehend aus zwei im wesentlichen getrennten Behältnissen, wobei die Behältnisse jeweils eine Komponente der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 enthalten.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Behältnisse als Spritzenzylinder einer Doppelspritze fungieren.
29. Kit nach einem der Ansprüche 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Einrichtung zum Vermischen der Komponenten aufweist.
30. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass er einen statischen Mischer aufweist, der insbesondere auf eine Doppelspritze aufsteckbar ist..
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