WO2003011329A2 - Impfstoff für veterinäre und humanmedizinische prophylaxe und therapie von dermatophytosen - Google Patents

Impfstoff für veterinäre und humanmedizinische prophylaxe und therapie von dermatophytosen Download PDF

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WO2003011329A2
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Josef Chumela
Vladimir Vrzal
Libor Bittner
Evzen Weigl
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Bioveta Ag
Riemser Arzneimittel Ag
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    • A61K2039/515—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a new vaccine containing vaccination strains of dermatophytes, its use for
  • the vaccines according to the invention can be used in both veterinary and human medicine
  • a number of vaccines are currently used in veterinary medicine both prophylactically and therapeutically against dermatophytoses. These are both live vaccines and inactivated vaccines. They are described in CS 160324, PL 156844, SU 1734762, GB 2025222, SU 955570, SU 955571, SU 548947, SU 835446, RU 2013444, RU 2013445, EP 393371, DE 9218921 U1, PL 100958, US 4,229,434, US 5,277,904, among others. US 5,284,652, CS 201481, CS 246791, CS 261460, CZ 279278 and CZ 279982.
  • the present invention first relates to a new vaccine containing vaccination strains of dermatophytes, its use for
  • the vaccines according to the invention are used both in human and in veterinary medicine.
  • the warm-blooded animals to be treated according to the invention in veterinary medicine include, in particular, domestic and farm animals.
  • dermatophytosis means a disease of the skin and its appendages caused by dermatophytes.
  • the invention relates to a vaccine containing at least one dermatophyton vaccination strain.
  • Dermatophytes include fungi of the genera Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Arthroderma and Nannizzia.
  • Particularly preferred vaccination strains belong to the genus Trichophyton, in particular the strains Trichophyton verrucosum CCM F-765 (a1), Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2), Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 (a3) and Trichophyton rubrum CCM 8291 (a).
  • Trichophyton verrucosum CCM F-765 (a1) and Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2) strains were originally filed by applicants to the Czech Collection of Microorganism (CCM), Masaryk University, Tvrdeho 14, 602 00 Brno on November 5, 1984 respectively on February 23, 1993 under the deposit numbers CCM F-765 and CCM 8166, these deposits were converted on December 14, 1992 and July 22, 2002 into deposits under the Budapest Treaty.
  • Cultures of the above-mentioned strains Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 (a3) and Trichophyton rubrum CCM 8291 (a4) were deposited there on July 23, 2001 under the Budapest Treaty under the deposit numbers CCM 8290 and CCM 8291, respectively.
  • a further preferred embodiment is a vaccine which contains a combination of at least two of the vaccination strains of the genus Trichophyton listed above; a combination of three of the four vaccination strains listed above is very particularly preferred.
  • a ratio of the individual vaccination strains a1: a2: a3: a4 of 0 or 2-10: 0 or 1-5: 0 or 5-30: 0 or 2-10, or of 0 or 1-10: 0 or 1-2: 0 or 3-30: 0 or 1-3, or of 0 or 1-10: 0 or 1 ⁇ : 0 or 3-30: 0 or 1-10 in the end product is particularly preferred.
  • Embodiments with the ratio a1: a2: a3 of 2: 1: 5 or 10: 1: 30 or the sole use of a1 are very particularly preferred for veterinary use.
  • Embodiments with the ratio a1: a2: a3: a4 of 4: 2: 10: 3 or 10: 1: 30: 2 and the ratios a1: a3: a4 of 1: 3 are very particularly preferred for human use. 1 and a2: a4 of 1: 2 or the sole use of a4 (Trichophyton rubrum CCM 8291).
  • the total number of vegetative forms of the vaccination strains in the end product is at least 1 million per 1 ml.
  • a total number of at least 5 million per 1 ml is particularly preferred, very particularly preferably at least 10 million per 1 ml.
  • the pH range of the end product is pH 3.0 to 10.0.
  • Suitable buffer systems that are generally known to the person skilled in the art, such as Acetate or carbonate buffer systems or pharmaceutically acceptable organic or inorganic acids such as citric acid, acetic acid or hydrochloric acid are used.
  • the preferred pH range is pH 6.0 to 8.0. To do this. Phosphate buffer systems of different compositions are used which are generally known to the person skilled in the art.
  • the total formaldehyde content is 0.02% or less for human medical purposes and 0.05% or less for veterinary purposes. This amount remaining after inactivation is physiologically safe and legally permitted. It also has a disinfectant and prophylactic and therapeutic effect. If necessary, the formaldehyde can be supplemented or substituted by other substances. In addition to the particularly suitable formaldehyde, chemical measures or physical applications can be used, such as beta-propionolactone, binary ethyleneimine and acetic acid.
  • a total content of less than 0.02% or 0.05% formaldehyde is very particularly preferred.
  • the vaccines according to the invention can be administered parenterally, e.g. can be administered intramuscularly or subcutaneously or also epicutaneously.
  • Epicutaneous application ie, is particularly preferred for human medical use. the application and distribution on the skin.
  • epicutaneous application in the toe area the main source of skin mycoses of other parts of the body in humans, is preferred.
  • epicutaneous application can minimize the risk of potentially life-threatening anaphylactic or anaphylactoid reactions.
  • the epicutaneous route of administration also has other advantages, since no injection is necessary, as is the case with the otherwise usual parenteral administration of vaccines. Due to the absence of pain or the lower fear of expectation, patient compliance is better, this also applies to veterinary medicine, of course, since no dangerous fear / pain reaction of the animals is to be expected for the treating person.
  • Another aspect of the invention is the provision of a production method for the vaccine against dermatophytoses according to the invention as described below:
  • the vaccination strains are individually grown on saccharide- and organically bound nitrogen-containing agar soils of suitable composition as nutrient media, if necessary after an intermediate adjustment of the pH, at temperatures in the range from 25 to 29 ° C. under sterile conditions for a period of 10 to 30 Days increased until the optimal formation of vegetative forms.
  • the strains are then homogenized in an aqueous 0.1% formaldehyde solution and the suspensions formed are inactivated at a temperature of 18-26 ° C. for at least 24 to 36 hours. The homogenization takes place in such a way that the majority of the spores are separated from the mycelium without destroying their surface structure.
  • the individual strains are mixed with one another, if necessary, and supplemented with a phosphate or, if appropriate, buffered physiological saline solution in such a way that the total number of vegetative forms of all vaccination strains is at least 1 million per 1 ml, preferably at least 5 million per 1 ml of vaccine, the pH is between pH 3 and pH 10, preferably between 6.0 - 8.0 and the formaldehyde content remaining after inactivation is 0.02% or less in a human medical application and in a veterinary application Is 0.05% and less.
  • the mixture of the strains a1: a2: a3: a4 corresponds to the ratio of 0 or 2-10: 0 or 1-5: 0 or 5-30: 0 or 2-10 in the end product, the abovementioned Mixing ratios and individual strains are particularly preferred.
  • the antigenic composition of the vaccine according to the invention is so wide that immune reactions against homologous genera and cross-reactions against other dermatophyte genera such as e.g. Microsporum canis or Trichophyton equinum have been detected.
  • Example 1 Preparation of a veterinary vaccine and application
  • a culture medium containing 1.2% agar, -5.0% saccharides and 0.3% organically bound nitrogen was used to grow / multiply the vaccination strains of the genus Trichophyton.
  • the nutrient medium was sterilized in a steam autoclave for 20 to 30 minutes at a pressure of 80 to 100 kPa. After the pH was adjusted to 6.0 to 7.0, the bottom of the glass flask was covered with the nutrient medium and the sterilization was repeated under the above conditions. After the agar had solidified and the sterility had been checked, the culture flasks were individually inoculated with suspensions of the vaccination strains. Either lyophilisates or freshly prepared inocula from the vaccination strains (CCM F-765, CCM 8166 and CCM 8290) were used for the inoculation. Each inoculum contained at least 0.5 million viable CFUs per 1 ml.
  • the inocula of the vaccination strains were distributed on the surface of the nutrient medium.
  • the cultivation took place at a temperature of 25 to 29 ° C for 10 to 30 days in order to achieve an optimal formation of vegetative forms.
  • the grown cultures were removed at the stage of a high productivity of the fungal antigen from the surface of the nutrient medium and homogenized in an aqueous 0.1% 'strength by weight formaldehyde solution.
  • the homogenization with the homogenizer takes place in such a way that the majority of the spores are separated from the mycelium without destroying their surface structure.
  • the resulting homogeneous suspension was individually aliquoted into storage vessels and stored at a temperature of 18 to 26 ° C for 24 hours to inactivate the vaccination strains.
  • the number of vegetative forms for the individual vaccination strains was then determined in a Bürker counting chamber. It totaled 41 million in 1 ml vaccine.
  • the individual vaccination strains were mixed so that a ratio of Trichophyton verrucosum CCM F-765 in the finished vaccine preparation: Trichophyton verrucosum CCM 8166: Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 of 2: 1: 5 was present.
  • the formaldehyde content was 0.05%.
  • the pH of the preparation was adjusted to pH 6.0 by adding phosphate-buffered physiological saline.
  • the vaccine thus produced was checked for sterility and number of vegetative forms and used to vaccinate cattle infected with trichophytosis. After two intramuscular inoculations in a dose of 5 ml each, the disease in cattle from two breeds cured within 14 days after the revaccination.
  • a culture medium with an agar content of 1.3%, a saccharide content of 10.0% and a content of organically bound nitrogen of 0.5% was used to grow the vaccination strain.
  • the sterilization was carried out in a steam autoclave twice for 30 minutes at an overpressure of 120 kPa.
  • the pH of the nutrient medium was 6.6. This was inoculated with a suspension of the Trichophyton verrucosum GCM F-765 strain, and the cultivation temperature was kept at 25-26 ° C.
  • the culture was homogenized in a 0.1% formaldehyde solution after 15 days of cultivation. After 36 hours of inactivation at a temperature of 22 ° C, phosphate-buffered saline was added.
  • the formaldehyde content in the finished vaccine solution was 0.04%, the pH 7.3 and the number of vegetative forms of the vaccination strain 22 million in 1 ml.
  • Example 3 Preparation of a veterinary vaccine and application
  • Example 2 The procedure was similar to that in Example 1, the strains T. verrucosum CCM F-765, T. verrucosum CCM 8166 and T. mentagrophytes CCM 8290 were in a ratio of 10: 1: 30.
  • the formaldehyde content was 0.04%
  • the pH was adjusted to 8.0
  • the total number of vegetative forms of all vaccination strains was 80.0 million in 1 ml of vaccine.
  • the vaccine solution was tested for tolerance on calves 1 month of age. 10 ml of vaccine solution were inoculated into five calves intramuscularly in the gluteal muscles. At a time interval of 24 hours before vaccination, at the time of vaccination, 4 hours after vaccination and on the following 4 days, the calves' temperature was measured rectally. The vaccine was tolerated, the body temperatures remained in the range of the physiological values in all animals. No unwanted local or other after-effects were found in the vaccinated calves.
  • Example 4 Preparation of a human medical vaccine and application
  • the vaccination strains were propagated in a nutrient medium containing 1.5% agar, 15.0% saccharides and 1.0% organically bound nitrogen.
  • the sterilization of the nutrient medium was carried out twice for 25 minutes in a steam autoclave at an excess pressure of 80 to 100 kPa. Inoculation, cultivation of the vaccination strains, homogenization, inactivation and determination of the number of vegetative forms were carried out in the same manner as described under 1 above.
  • the vaccine strains Trichophyton verrucosum CCM F-765: Trichophyton rubrum CCM 8291: Trichophyton CCM mentagrophytes CCM 8290 were mixed in a ratio of 1: 1: 3.
  • a suitable amount of phosphate-buffered physiological saline was added to the suspension obtained, resulting in a residual formaldehyde content of 0.02% and a total number of vegetative forms contained in the end product of 10 million.
  • the pH was adjusted to between 6.0 and 8.0 depending on the composition of the buffer solution.
  • the vaccine was checked for sterility and tested for harmlessness in humans on volunteers. For this purpose, the vaccine was applied three times a week in an amount of 10 ml by rubbing it into the intertropical skin on the lower extremities. No harmful side effects on humans have been identified.
  • the vaccine was applied epicutaneously twice to cattle experimentally infected with trichophytosis. Compared to non-vaccinated animals, the healing success occurred about a week earlier, which demonstrates the therapeutic effectiveness of the vaccine according to the invention thus produced.
  • Example 5 Production of a vaccine for human medical use
  • the Trichophyton rubrum CCM 8291 vaccination strain was cultivated for 18 days at a temperature of 26-28 ° C. in a nutrient medium with a composition according to Example 2.
  • the inactivation of the homogenized culture in a 0.1% formaldehyde solution at a temperature of 26 ° C took 24 hours.
  • the pH was 6.8, the formaldehyde content was 0.015% and the number of vegetative forms of the vaccination strain was 11 million in 1 ml.
  • a challenge test was carried out on the calf with the vaccine solution.
  • the calves vaccinated twice epicutaneously were before an experimental trichophytic infection sufficiently protected, in contrast to the control animals not treated with vaccine.
  • Example 6 Production of a vaccine for human medical use
  • the vaccine solutions were prepared from different amounts of the two strains of dermatophytes Trichophyton verrucosum CCM F-765 and Trichophyton mentagrophytes CCM 8290.
  • a culture medium containing 1.5% agar with 8.0% saccharides and 0.8% peptone was used to grow them.
  • the sterilization was carried out twice in a steam sterilizer for 30 minutes at an overpressure of 120 kPa.
  • the nutrient media were inoculated individually with the suspensions of the vaccination strains mentioned with a content of 1.0 million to 1 ml of inoculum. After 10 days of incubation at 25-27 ° C., the cultures were homogenized in a 0.1% formaldehyde solution at 10,000 revolutions per minute for a period of 2 to 3 minutes.
  • the suspensions were then kept in the dark at 72 ° C. for 72 hours to inactivate the vaccination strains.
  • the inactivation was demonstrated by means of an incubation test on the nutrient media.
  • the inactivated suspension was diluted with a phosphate-buffered physiological saline so that the formaldehyde content assumed the value 0.018%, the pH 7.17 and the number of vegetative forms of the vaccination strains 15.8 million in 1 ml.
  • Example 7 Production of a vaccine for human medical use
  • the vaccination strains T. verrucosum CCM 8166 and T. rubrum CCM 8291 were grown on a culture medium with a composition of 1.2% agar, 10.0% saccharides and 0.5% peptone. These substances were sterilized in an autoclave in water under the same conditions as in Example 6. The cultivation at 28-29 ° C. was completed after 30 days, the cultures removed were homogenized in a 0.1% formaldehyde solution and inactivated at 24 ° C. for 24 hours. The ratio of the strains represented T. verrucosum CCM 8166 and T. rubrum CCM 8291 in the vaccine was 1: 2. The pH was adjusted between 6.0 and 8.0 by adding phosphate-buffered physiological saline solutions with different sodium hydrogen phosphate content. The number of vegetative forms was 5 million in 1 ml vaccine solution.
  • the vaccine solution was epicutaneously applied to an area of 10 x 10 cm shaved and scarified skin of three calves in a volume of 5 ml per animal for three consecutive days. Neither local nor other post-vaccination reactions were observed in the animals.
  • Example 8 Preparation of a human medical vaccine and application
  • the nutrient medium was prepared according to example 2.
  • the inoculation, cultivation and homogenization of the cultivated cultures was carried out analogously to Example 1.
  • the total number of vegetative forms of the vaccination strains was 75 million in 1 ml, the formaldehyde content was 0.015%.
  • the pH was adjusted between 6.0 and 8.0 by adding phosphate-buffered physiological saline solutions with different sodium hydrogen phosphate content
  • the vaccine solution was tested on two volunteers with a volume of 2 ml epicutaneously in the area between the toes on 3 consecutive days.
  • the vaccine was harmless and did not produce any undesirable clinical changes, either local or overall.
  • Example 9 Preparation of a human medical vaccine and application
  • the vaccine solution was applied therapeutically to affected areas in the area between the toes, as well as to the big toe of the left foot with clinical changes that suggest a mycosis; but failed to isolate the pathogen.
  • the present invention thus provides a highly effective and also easy-to-administer vaccine for immunoprophylaxis and treatment of dermatophytoses in veterinary and human medicine.
  • the vaccine according to the invention can be used in veterinary medicine both parenterally, in particular intramuscularly and subcutaneously, and epicutaneously.
  • the vaccine according to the invention is in the Human medicine particularly preferably epicutaneously applicable by suitable application, such as by spraying with sterile spray ampoules onto human skin.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff enthaltend Vakzinationsstämme von Dermatophyten, seine Verwendung zur Immunoprophylaxe und Behandlung von Dermatophytosen, sowie geeignete Methoden zu seiner Herstellung.

Description

Neuer Impfstoff für Veterinäre und humanmedizinische Prophylaxe und
Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Impfstoff enthaltend Vakzinationsstämme von Dermatophyten, seine Verwendung zur
Immunoprophylaxe und Behandlung von Dermatophytosen, sowie die Methode zu seiner Herstellung. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin angewendet werden
Gegenwärtig werden in der Veterinärmedizin eine Reihe von Impfstoffen sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch gegen Dermatophytosen verwendet. Hierbei handelt es sich sowohl um Lebendimpfstoffe als auch um inaktivierte Impfstoffe. Sie werden u.a. in CS 160324, PL 156844, SU 1734762, GB 2025222, SU 955570, SU 955571 , SU 548947, SU 835446, RU 2013444, RU 2013445, EP 393371 , DE 9218921 U1 , PL 100958, US 4,229,434, US 5,277,904, US 5,284,652, CS 201481 , CS 246791 , CS 261460, CZ 279278 und CZ 279982 beschrieben. Allen in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Vakzinen ist ihre parenterale Applikation gemeinsam, größtenteils erfolgt die Applikation intramuskulär, seltener auch subkutan. Da die parenterale Applikation potentiell die Gefahr der Entstehung von anaphylaktischen und anaphylaktoiden Reaktionen beim geimpften Organismus mit sich bringt (Gudding R. und Naess B., Amer. J. Vet. Res. 47, 1986, 2415-2417, „Vaccination of cattle against ringworm caused by Trichophyton verrucosum"), ist natürlich eine humanmedizinische Anwendung der bisher hergestellten Impfstoffe ausgeschlossen, daher wird v.a. ein auch in der Humanmedizin anwendbarer Impfstoff dringend benötigt. Detailierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst einen neuen Impfstoff enthaltend Vakzinationsstämme von Dermatophyten, seine Verwendung zur
Immunoprophylaxe und Behandlung von Dermatophytosen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe finden sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin ihren Einsatz. Zu den erfindungsgemäß zu behandelnden Warmblütlem in der Veterinärmedizin gehören insbesondere Haus- und Nutztiere.
Erfindungsgemäß wird unter Dermatophytose eine durch Dermatophyten hervorgerufene Erkrankung der Haut und ihrer Anhangsgebilde verstanden. Die Erfindung betrifft einen Impfstoff enthaltend mindestens einen Dermatophyton- Vakzinationsstamm.
Zu den Dermatophyten werden hierbei unter anderem Pilze der Gattungen Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Arthroderma und Nannizzia gezählt. Besonders bevorzugte Vakzinationsstämme gehören der Gattung Trichophyton an, insbesondere sind die Stämme Trichophyton verrucosum CCM F-765 (a1), Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2), Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 (a3) und Trichophyton rubrum CCM 8291 (a4) bevorzugt. Kulturen der obengenannten Stämme Trichophyton verrucosum CCM F-765 (a1) und Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2) wurden von den Anmeldern bei der Czech Collection of Microorganism (CCM), Masaryk Universität, Tvrdeho 14, 602 00 Brno ursprünglich am 5. November 1984 bzw. am 23. Februar 1993 unter den Hinterlegungsnummern CCM F-765 bzw. CCM 8166 hinterlegt, diese Hinterlegungen wurden am 14. Dezember 1992 bzw. 22. Juli 2002 in Hinterlegungen nach dem Budapester Vertrag umgewandelt. Kulturen der obengenannten Stämme Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 (a3) und Trichophyton rubrum CCM 8291 (a4), wurden dort am 23. Juli 2001 nach dem Budapester Vertrag unter den Hinterlegungsnummern CCM 8290 bzw. CCM 8291 hinterlegt. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein Impfstoff, der eine Kombination aus mindestens zwei der oben aufgeführten Vakzinationsstämme der Gattung Trichophyton enthält, ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination aus drei der vier oben aufgeführten Vakzinationsstämme.
Hierbei ist ein Verhältnis der einzelnen Vakzinationsstämme a1 : a2 : a3 : a4 von 0 oder 2-10 : 0 oder 1-5 : 0 oder 5-30 : 0 oder 2-10, bzw. von 0 oder 1-10 : 0 oder 1-2 : 0 oder 3-30 : 0 oder 1-3, bzw. von 0 oder 1-10: 0 oder 1^ : 0 oder 3-30 : 0 oder 1-10 im Endprodukt besonders bevorzugt.
Ganz besonders bevorzugt für die Veterinäranwendung sind hierbei Ausführungsformen mit dem Verhältnis a1 : a2 : a3 von 2 : 1 : 5 bzw. von 10 : 1 : 30 bzw. die alleinige Anwendung von a1 (Trichophyton verrucosum CCM F-765).
Ganz besonders bevorzugt für die Humananwendung sind hierbei Ausführungsformen mit dem Verhältnis a1 : a2 : a3 : a4 von 4 : 2 : 10 : 3 bzw. 10 : 1 : 30 : 2, sowie den Verhältnissen a1 : a3 : a4 von 1 : 3 : 1 und a2 : a4 von 1 : 2 bzw. die alleinige Anwendung von a4 (Trichophyton rubrum CCM 8291).
Ferner ist es bevorzugt wenn die Gesamtzahl der vegetativen Formen der Vakzinationsstämme im Endprodukt mindestens 1 Mio. pro 1ml ist. Besonders bevorzugt ist eine Gesamtzahl von mindestens 5 Mio pro 1 ml, ganz besonders bevorzugt mindestens 10 Mio. pro 1ml.
Der pH-Bereich des Endproduktes liegt bei pH 3,0 bis 10,0. Hierzu werden geeignete Puffersysteme, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, wie z.B. Acetat- bzw. Carbonatpuffersysteme oder pharmazeutisch verträgliche organische oder anorganische Säuren wie Zitronensäure, Essigsäure oder Chlorwasserstoffsäure verwendet.
Der bevorzugte pH-Bereich liegt bei pH 6,0 bis 8,0. Hierzu werden. Phophatpuffersysteme unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Für humanmedizinische Zwecke liegt der Gesamtgehalt von Formaldehyd bei 0,02 % oder weniger und für veterinärmedizinische Zwecke bei 0,05% oder weniger. Diese nach der Inaktivierung verbleibende Menge ist physiologisch unbedenklich und gesetzlich erlaubt. Sie hat zudem eine desinfizierende und eine die prophylaktische und therapeutische Wirkung unterstützende Funktion. Das Formaldehyd kann, falls erforderlich, durch andere Stoffe ergänzt oder substituiert werden. Neben dem besonders geeigneten Formaldehyd können chemische Maßnahmen oder physikalische Anwendungen eingesetzt werden, wie z.B. beta- Propionolacton, binäres Ethylenimin und Essigsäure.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Gesamtgehalt von weniger als 0,02% bzw. 0,05% Formaldehyd.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können parenteral wie z.B. intramuskulär oder subkutan oder auch epikutan appliziert werden. Besonders bevorzugt für die humanmedizinische Anwendung ist hierbei die epikutane Applikation, dh. das Aufbringen und Verteilen auf der Haut.
Insbesondere ist die epikutane Applikation im Zwischenzehenbereich, der Hauptquelle von Hautmykosen sonstiger Körperteile beim Menschen bevorzugt. Wie bereits oben erwähnt lässt sich durch die epikutane Appikation die Gefahr von eventuell lebensbedrohlichen anaphylaktischen oder anaphylaktoiden Reaktionen minimieren.
Der epikutane Applikationsweg bringt zudem noch weitere Vorteile mit sich, da keine Injektion, wie bei der sonst üblichen parenteralen Applikation von Impfstoffen, notwendig ist. So ist auf Grund des Ausbleibens von Schmerzen bzw. der geringeren Erwartungsangst die Patienten-Compliance besser, dies gilt natürlich auch für die Veterinärmedizin da keine für die behandelnde Person gefährliche Angst/Schmerzreaktion der Tiere zu erwarten ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung einer Herstellungsmethode für den erfindungsgemäßen Impfstoff gegen Dermatophytosen wie nachfolgend beschrieben: Die Vakzinationsstämme werden einzeln auf saccharid- und organisch gebundenen Stickstoff enthaltenden Agarböden geeigneter Zusammensetzung als Nährmedien, ggf. nach einer zwischenzeitlichen Einstellung des pH-Wertes, bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 29°C unter sterilen Bedingungen für eine Zeitdauer von 10 bis zu 30 Tagen bis zur optimalen Bildung der vegetativen Formen vermehrt. Anschließend werden die Stämme in einer wässrigen 0,1%igen Formaldehydlösung homogenisiert und die entstandenen Suspensionen bei- einer Temperatur von 18 - 26°C mindestens 24 bis 36 Stunden inaktiviert. Die Homogenisierung erfolgt in der Weise, dass der überwiegend Teil der Sporen vom Myzel abgetrennt wird, ohne dabei Ihre Oberflächenstruktur zu zerstören.
Nach Bestimmung der Anzahl der Vegetativformen werden die einzelnen Stämme gegebenenfalls untereinander gemischt und mit einer phosphat-, ggf. auch anderweitig gepufferten physiologischen Kochsalzlösung in der Weise ergänzt, dass die Gesamtzahl der Vegetativformen aller Vakzinationsstämme mindestens 1 Mio. pro 1 ml, bevorzugt mindestens 5 Mio pro 1ml Impfstoff beträgt, der pH-Wert zwischen pH 3 und pH 10, bevorzugt zwischen 6,0 - 8,0 liegt und der nach der Inaktivierung verbleibende Gehalt von Formaldehyd bei einer humanmedizinischen Anwendung 0,02% und geringer und bei einer veterinärmedizinischen Anwendung 0,05% und geringer ist.
Hierbei ist bevorzugt, daß die Mischung der Stämme a1 : a2 : a3 : a4 dem Verhältnis von 0 oder 2-10 : 0 oder 1-5 : 0 oder 5-30 : 0 oder 2-10 im Endprodukt entspricht, wobei die oben genannten Mischungsverhältnisse und Einzelstämme besonders bevorzugt sind.
Die antigene Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Impfstoffes ist so breit, dass auch Immunreaktionen gegen homologe Gattungen und Kreuzreaktionen gegen andere Dermatophytgattungen wie z.B. Microsporum canis oder Trichophyton equinum nachgewiesen wurden.
Nachfolgend werden besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Dies dient jedoch nur zur Illustration nicht aber zur Einschränkung der Erfindung. Herstellungs- und Anwendungsbeispiele
Beispiel 1 : Herstellung einer veterinärmedizinischen Vakzine und Anwendung
Zur Anzucht/Vermehrung der Vakzinationsstämme der Gattung Trichophyton wurde ein Nährmedium verwendet, das 1 ,2% Agar,-5,0% Saccharide und 0,3% organisch gebundenen Stickstoff enthielt.
Das Nährmedium wurde im Dampfautoklav 20 bis 30 Minuten bei einem Überdruck von 80 bis 100 kPa sterilisiert. Nach der Einstellung des pH-Werts auf 6,0 bis 7,0 wurde der Boden des Glaskolbens mit dem Nährmedium bedeckt und die Sterilisation unter den obengenannten Bedingungen wiederholt. Die Anzuchtkolben mit dem Nährmedium wurden nach Erstarrung des Agars und erfolgter Sterilitätsprüfung einzeln mit Suspensionen der Vakzinationsstämme inokuliert. Für die Inokulation wurden entweder Lyophylisate oder frisch vorbereitete Inokula der Vakzinationsstämme (CCM F- 765, CCM 8166 und CCM 8290) verwendet. Jedes Inokulum enthielt mindestens 0,5 Mio. lebensfähige CFU pro 1ml. Die Inokula der Vakzinationsstämme wurden auf der Oberfläche des Nährmediums verteilt. Die Kultivierung erfolgte bei einer Temperatur von 25 bis 29 °C für 10 bis 30 Tage um eine optimale Bildung von vegetativen Formen zu erreichen. Die gewachsenen Kulturen wurden im Stadium einer hohen Produktivität des Pilzantigens von der Oberfläche des Nährmediums abgenommen und in einer wässrigen 0,1%'ιgen Formaldehydlösung homogenisiert. Die Homogenisierung mit dem Homogenisator erfolgt derart, dass der überwiegende Teil der Sporen vom Myzel abgetrennt wird, ohne dabei ihre Oberflächenstruktur zu zerstören. Die so entstandene homogene Suspension wurde einzeln in Voratsgefäße aliquotiert und bei einer Temperatur von 18 bis 26 °C für 24 Stunden zur Inaktivierung der Vakzinationsstämme gelagert. Danach wurde in einer Zählkammer nach Bürker die Anzahl der Vegetativfomen für die einzelnen Vakzinationsstämme ermittelt. Sie betrug insgesamt 41 Mio. in 1 ml Vakzin. Die einzelnen Vakzinierungsstämme wurden so gemischt, dass im fertigen Impfstoffpräparat ein Verhältnis von Trichophyton verrucosum CCM F-765 : Trichophyton verrucosum CCM 8166: Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 von 2:1:5 vorlag.
Der Gehalt von Formaldehyd betrug 0,05%.
Durch Zugabe von phosphat-gepufferter physiologischen Kochsalzlösung wurde der pH-Wert des Präparats auf pH 6,0 eingestellt.
Der so hergestellte Impfstoff wurde auf Sterilität und Anzahl der vegetativen Formen überprüft und zur Impfung von mit Trichophytose befallenen Rindern verwendet. Nach einer zweimaligen intramuskulären Impfung in einer Dosis von jeweils 5 ml war die Erkrankung bei Rindern aus zwei Züchtungen innerhalb von 14 Tagen nach der Revakzination ausgeheilt.
Dieser Erfolg ist in Hinblick auf die mit den bisher verwendeten immunbiologischen Präparaten erzielten Ergebnissen, hier dauert die Therapie i.R. 1 bis 3 Monate, sehr überraschend.
Beispiel 2: Herstellung einer veterinärmedizinischen Vakzine und Anwendung
Zur Anzucht des Vakzinationsstammes wurde ein Nährmedium mit einem Agaran- teil von 1,3 %, einem Saccharidgehalt von 10,0 % und einem Gehalt an organisch gebundenem Stickstoff von 0,5 % verwendet. Die Sterilisierung wurde in einem Dampfautoklav zweimal je 30 Minuten bei einem Überdruck von 120 kPa vorgenommen. Der pH-Wert des Nährmediums betrug 6,6. Dieses wurde mit einer Suspension des Stammes Trichophyton verrucosum GCM F-765 beimpft, die Kultivierungstemperatur bei 25-26 °C gehalten. Die Homogenisierung der angezüchteten Kultur in einer 0,1%igen Formaldehyd-Lösung wurde nach 15 Kultivierungstagen vorgenommen. Nach einer 36 Stunden dauernden Inaktivierung bei einer Temperatur von 22 °C wurde eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung zugegeben. Der Formaldehydgehalt in der fertigen Vakzinlösung betrug 0,04%, der pH-Wert 7,3 und die Anzahl der vegetativen Formen des Vakzinationsstammes 22 Mio. in 1 ml.
Die Vakzinlösung wurde zum Testen am Rind verwendet und zeigte eine gute protektive Wirkung. Beispiel 3: Herstellung einer veterinärmedizinischen Vakzine und Anwendung
Bei der Herstellung wurde ähnlich wie in Beispiel 1 vorgegangen, die Stämme T. verrucosum CCM F-765, T. verrucosum CCM 8166 und T. mentagrophytes CCM 8290 lagen einem Verhältnis 10 : 1 : 30 vor. Der Formaldehyd-Gehalt betrug 0,04 %, der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt, die Gesamtanzahl der vegetativen Formen aller Vakzinationsstämme betrug 80,0 Mio. in 1 ml Vakzin.
Die Vakzinlösung wurde auf Verträglichkeit an Kälbern in einem Alter von 1 Monat getestet. 10 ml Vakzinlösung wurden jeweils fünf Kälbern intramuskulär in die Glutealmuskulatur eingeimpft. In einem Zeitabstand von 24 Stunden vor der Vakzinierung, zur Zeit der Vakzinierung, 4 Stunden nach der Vakzinierung und an den folgenden 4 Tagen wurde bei den Kälbern die Temperatur rektal gemessen. Die Vakzine war verträglich, die Körpertemperaturen blieben bei allen Tieren im Bereich der physiologischen Werte. Bei den geimpften Kälbern konnten keinerlei unerwünschte lokalen oder anderweitigen Nachwirkungsreaktionen festgestellt werden,.
Beispiel 4: Herstellung einer humanmedizinischen Vakzine und Anwendung
Die Vakzinationsstämme wurden in einem Nährmedium vermehrt, das 1,5% Agar, 15,0% Saccharide und 1 ,0% organisch gebundenen Stickstoff enthält. Die Sterilisierung des Nährmediums wurde zweimal für je 25 Minuten im Dampfautoklaven bei einem Überdruck von 80 bis 100 kPa durchgeführt. Inokulation, Kultivierung der Vakzinationsstämme, Homogenisierung, Inaktivierung und Bestimmung der Anzahl der Vegetativformen wurde auf dieselbe Art und Weise wie oben unter 1 beschrieben durchgeführt. Das Mischen der Vakzinationsstämme Trichophyton verrucosum CCM F-765 : Trichophyton rubrum CCM 8291 : Trichophyton CCM mentagrophytes CCM 8290 erfolgte im Verhältnis 1 :1 :3. Die erhaltene Suspension wurde mit einer geeigneten Menge an phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung versetzt, sodass ein Gehalt an verbleibendem Formaldehyd von 0,02% und eine Gesamtanzahl der im Endprodukt enthaltenen Vegetativformen von 10 Mio. resultierte. Dabei wurde der pH-Wert in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Pufferlösung auf Werte zwischen 6,0 und 8,0 eingestellt.
Der Impfstoff wurde nach der Ermittlung der Anzahl der Vegetativformen, des Formaldehydgehaltes und des jeweiligen pH-Wertes auf Sterilität überprüft und auf Unschädlichkeit beim Menschen an freiwilligen Probanden getestet. Hierzu wurde der Impfstoff dreimal in einer Woche in einer Menge von 10 ml durch Einreiben in die Zwischenzehenhaut an den unteren Extremitäten appliziert. Es konnten keine schädlichen Nebenwirkungen auf den Menschen festgestellt werden..
Zudem wurde der Impfstoff zweimal an experimentell mit Trichophytose infizierten Rindern epikutan appliziert. Im Vergleich zu nicht geimpften Tieren trat der Heilungserfolg ca. eine Woche früher ein, was die therapeutische Wirksamkeit des so hergestellten erfindungsgemäßen Impfstoffes belegt.
Beispiel 5: Herstellung einer Vakzine zur humanmedizinischen Anwendung
Der Vakzinationsstamm Trichophyton rubrum CCM 8291 wurde 18 Tage bei einer Temperatur von 26-28 °C in einem Nährmedium mit einer Zusammensetzung gemäß Beispiel 2 kultiviert. Die Inaktivierung der homogenisierten Kultur in einer 0,1%igen Formaldehydlösung bei einer Temperatur von 26 °C dauerte 24 Stunden. Nach dem Vermischen der inaktivierten Suspension mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung betrug der pH-Wert 6,8, der Formaldehydgehalt 0,015 % und die Anzahl der vegetativen Formen des Vakzinationsstammes 11 Mio. in 1 ml.
Mit der Vakzinlösung wurde ein Challengetest am Kalb durchgeführt. Die zweimal epikutan geimpften Kälber waren vor einer experimentellen Trichophytieinfektion genügend geschützt, im Gegensatz zu den nicht vakzin-behandelten Kontrolltieren.
Beispiel 6: Herstellung einer Vakzine zur humanmedizinische Anwendung
Die Vakzinlösungen wurden aus verschiedenen Mengen der beiden Dermatophy- ten-Stämmen Trichophyton verrucosum CCM F-765 und Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 hergestellt. Zu deren Anzucht wurde ein 1 ,5 % Agar enthaltendes Nährmedium mit 8,0 % Sacchariden und 0,8 % Pepton verwendet. Die Sterilisierung erfolgte zweimal je 30 Minuten in einem Dampfsterilisator bei einem Überdruck von 120 kPa. Die Nährmedien wurden einzeln mit den Suspensionen der genannten Vakzinationsstämme mit einem Gehalt von 1 ,0 Mio. auf 1 ml Inokulum beimpft. Nach 10 Inkubationstagen bei 25 - 27 °C wurden die Kulturen in einer 0,1%igen Formaldehydlösung bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für die Dauer von 2 bis 3 Minuten homogenisiert. Dann wurden die Suspensionen 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 18 °C zwecks Inaktivierung der Vakzinationsstämme im Dunkeln gehalten. Die Inaktivierung wurde mittels eines Inkubationstestes auf den Nährmedien nachgewiesen. Die inaktivierte Suspension wurde mit einer phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung so verdünnt, dass der Gehalt an Formaldehyd den Wert 0,018 %, der pH-Wert 7,17 und die Anzahl der vegetativen Formen der Vakzinationsstämme 15,8 Mio in 1 ml annahm.
Die Vakzine wurde auf Unschädlichkeit am Kaninchen getestet. Nach der intramuskulären Injektion von 3 ml Vakzinlösung in die Beckenmuskulatur konnten bei keinem der zehn Kaninchen unerwünschte lokale Reaktionen oder Veränderungen des Allgemeinbefindens festgestellt werden. Beispiel 7: Herstellung einer Vakzine zur humanmedizinischen Anwendung
Die Vakzinationsstämme T. verrucosum CCM 8166 und T. rubrum CCM 8291 wurden auf einem Kultivierungsmedium mit einer Zusammensetzung 1 ,2 % Agar, 10,0 % Saccharide und 0,5 % Pepton angezüchtet. Diese Substanzen wurden in einem Autoklav in Wasser unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 sterilisiert. Die Kultivierung bei 28 - 29 °C wurde nach 30 Tagen abgeschlossen, die entnommenen Kulturen in einer 0,1 %igen Formaldehydlösung homogenisiert und 24 Stunden bei 24 °C inaktiviert. Das Verhältnis der vertretenen Stämme T. verrucosum CCM 8166 und T. rubrum CCM 8291 im Vakzin war 1 : 2. Durch Hinzufügen phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösungen mit unterschiedlichem Natriumhydrogenphosphat-Anteil wurde der pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 eingestellt. Die Anzahl der vegetativen Formen betrug 5 Mio. in 1 ml Vakzinlösung.
Die Vakzinlösung wurde auf eine Fläche von 10 x 10 cm geschorener und skarifizierter Haut von drei Kälbern in einem Volumen von 5 ml pro Tier während drei aufeinander folgender Tage epikutan appliziert. Bei den Tieren konnten weder lokale noch andere Postvakzinationsreaktionen beobachtet werden.
Beispiel 8: Herstellung einer humanmedizinischen Vakzine und Anwendung
Das Nährmedium wurde entsprechend Beispiel 2 vorbereitet. Die Beimpfung, Kultivierung und Homogenisierung der angezüchteten Kulturen erfolgte analog zu Beispiel 1. Für die Herstellung der Vakzine wurden 4 Vakzinationsstämme in folgendem gegenseitigen Verhältnis verwendet: T. verrucosum CCM F-765 : T. verrucosum CCM 8166 : T. mentagrophytes CCM 8290 : T. rubrum CCM 8291 = 4 : 2 : 10 : 3.
Die Gesamtanzahl der vegetativen Formen der Vakzinationsstämme betrug 75 Mio. in 1 ml, der Formaldehydgehalt betrug 0,015 %. . Durch Hinzufügen phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösungen mit unterschiedlichem Natriumhydrogenphosphat-Anteil wurde der pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 eingestellt
Die Vakzinlösung wurde an zwei freiwilligen Probanden mit einem Volumen von 2 ml epikutan im Bereich zwischen den Zehen an 3 aufeinander folgenden Tagen getestet. Die Vakzine war unschädlich und erzeugte keine unerwünschten klinischen Veränderungen, weder lokale noch das Gesamtbefinden betreffend.
Beispiel 9: Herstellung einer humanmedizinischen Vakzine und Anwendung
Die Herstellung der Vakzinlösung erfolgte in der gleichen Weise wie in Beispiel 8, mit dem Unterschied, dass das gegenseitige Verhältnis der Stämme ai : a2 : a3 : a4. = 10 : 1 : 30 : 2 und der pH-Wert der Lösung 6,9 war. Die Vakzinlösung wurde therapeutisch auf befallene Stellen im Bereich zwischen den Zehen appliziert, sowie am großen Zeh des linken Fußes mit klinischen Veränderungen, die eine Mykose vermuten lassen; wobei es nicht gelang, den Erreger zu isolieren. Durch Einreiben der Vakzinlösung in die infizierte Haut einmal täglich mit einem Volumen von 2 ml an drei aufeinander folgenden Tagen konnte eine Heilung der Hautveränderungen nach 7 Tagen nach der dritten Applikation festgestellt werden.
Wie aus den obengemachten Ausführungen und Anwendungsbeispielen unzweifelhaft hervorgeht stellt die vorliegende Erfindung somit einen hochwirksamen und zudem einfach zu applizierenden Impfstoff zur Immunoprophylaxe und Behandlung von Dermatophytosen in der Veterinär- und Humanmedizin bereit. Der erfindungsgemäße Impfstoff ist in der Veterinärmedizin sowohl parenteral, insbesondere intramuskulär und subkutan, als auch epikutan anwendbar. Ferner ist der erfindungsgemäße Impfstoff in der Humanmedizin besonders bevorzugt epikutan durch geeignetes Aufbringen, wie z.B. durch Aufsprühen mit sterilen Sprühampullen auf die menschliche Haut anwendbar.
Somit wird erstmals ein Impfstoff für die epikutane Applikation gegen Dermatophytosen für die Verwendung in der Humanmedizin bereitgestellt. Durch die epikutane Applikation wird das Risiko einer eventuell lebensbedrohenden anaphylaktischen oder anaphylaktoiden Reaktion ausgeschlossen.

Claims

Patentansprüche
1. Impfstoff, enthaltend mindestens einen der nachstehenden Vakzinationsstämme a1 ) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a2) Trichophyton verrucosum CCM 8166 a3) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 und a4) Trichophyton rubrum CCM 8291.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis der einzelnen Vakzinationsstämme a1 : a2 : a3 : a4 im Endprodukt 0 oder 2-10:0 oder 1-5: 0 oder 5-30:0 oder 2-10 ist.
3. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis der einzelnen Vakzinationsstämme a1 : a2 : a3 : a4 im Endprodukt 0 oder 1-10:0 oder 1-2 : 0 oder 3-30:0 oder 1-3 ist.
4. Impfstoff nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verhältnis der Vakzinationsstämme a1 : a2 : a3 im Endprodukt 2:1 :5 oder 10:1 : 30 ist.
5. Impfstoff nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verhältnis der Vakzinationsstämme a1 : a3 : a4 im Endprodukt- 1 : 3 : 1 ist.
6. Impfstoff nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verhältnis der Vakzinationsstämme a2 : a4 im Endprodukt 1 : 2 ist.
7. Impfstoff nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verhältnis der Vakzinationsstämme a1 : a2 : a3 : a4 im Endprodukt 4:2: 10:3 oder 10: 1 : 30 : 2 ist.
8. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die gesamte Anzahl der vegetativen Formen aller Vakzinationsstämme mindestens 1 Mio. auf 1 ml Impfstoff ist.
9. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die gesamte Anzahl der vegetativen Formen aller Vakzinationsstämme mindestens 5 Mio. auf 1 ml Impfstoff ist.
10. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die gesamte Anzahl der vegetativen Formen aller Vakzinationsstämme mindestens 10 Mio. auf 1ml Impfstoff ist.
11. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass der pH-Wert des Fertigproduktes im Bereich von pH 3,0 bis pH 10,0 liegt.
12. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass der pH-Wert des Fertigproduktes im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0 liegt.
13. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche enthaltend weniger als 0,05 % Formaldehyd.
14. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche enthaltend weniger als 0,02 % Formaldehyd.
15. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche zur epikutanen Anwendung.
16. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche zur humanmedizinischen Anwendung.
17. Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche zur veterinärmedizinischen Anwendung.
18. Verwendung von mindestens einem der Vakzinationsstämme
a1) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a2) Trichophyton verrucosum CCM 8166 a3) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 und a4) Trichophyton rubrum CCM 8291 zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunoprophylaxe oder Behandlung von Dermatophytosen beim Menschen oder Tier.
19. Verwendung nach Anspruch 18 von mindestens zwei der Vakzinationsstämme.
20. Verwendung nach Anspruch 18 von mindestens drei der Vakzinationsstämme.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Verhältnis der Vakzinationsstämme wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 ist.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , wobei der Impfstoff epikutan angewendet wird.
3. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Dermatophytose umfassend:
a) das einzelne Anzüchten der zu kombinierenden Vakzinationsstämme auf saccharid- und organisch gebundenen Stickstoff enthaltenden Agarböden geeigneter Zusammensetzung als Nährmedien, ggf. nach einer zwischenzeitlichen Einstellung des pH-Wertes bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 29 °C unter sterilen Bedingungen für eine Zeitdauer von 10 bis 30 Tagen bis zur optimalen Bildung der vegetativen Formen, b) anschließender Homogenisation in einer wässrigen 0,1%igen Formaldehydlösung, wobei der überwiegende Teil der Sporen vom Myzel abgetrennt wird, ohne dabei Ihre Oberflächenstruktur zu zerstören, c) sowie Inaktivierung der Stämme in der entstandenen Suspension bei einer Temperatur von 18 - 26°C für mindestens 24 bis 36 Stunden, d) Einstellung des Verhältnisses zwischen den Vakzinationsstämmen, e) Einstellung der Anzahl der Vakzinationsstämme auf mind. 1 Mio. in 1 ml Fertigpräparat, f) Einstellung des pH-Wertes im Bereich von 3,0 bis 10,0 und g) Einstellung des Restgehaltes an Formaldehyd, ggf. mit einer nachfolgenden Substitution des Formaldehydes.
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