CZ20012732A3

CZ20012732A3 - Vakcína proti dermatofytózám a způsob její výroby

Info

Publication number: CZ20012732A3
Application number: CZ20012732A
Authority: CZ
Inventors: Ev®En Doc. Mudr. Weigl; Alois Rndr. Rybnikář; Josef Mvdr. Chumela; Vladimír Mvdr. Csc. Vrzal; Libor Ing. Csc. Bittner
Original assignee: Bioveta, A.S.
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2002-08-14
Also published as: CZ290509B6; PL365029A1; CA2453831A1; WO2003011329A3; JP2004536146A; EP1411976A2; US20040151726A1; RU2253467C1; WO2003011329A2; RU2003137591A; CN1545417A

Description

Vakcína proti dermatofytózám a způsob její výroby

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti antimykotických vakcin a řeší složení humánní a veterinární vakcíny proti dermatofytózám a způsob její výroby.

Dosavadní stav techniky

V současné době je ve veterinární medicíně používána celá řada vakcin proti dermatofytózám. Jde o vakcíny živé i inaktivované, například podle CS 160324, PL 156844, SU 1734762, GB 2025222, SU 955570, SU 955571, SU 548947, SU 835446, RU 2013444, RU 2013445, EP 393371, DE 9218921 U1, PL 100958, US 4,229,434, US 5,277,904, US 5,284,652, CS 201481, CS 246791, CS 261460, CZ 279278, CZ 279982. Společnou vlastností těchto přípravků je parenterální způsob jejich aplikace zvířatům. Většinou jsou zaváděny intramuskulárně, vzácněji subkutánně. Injekční aplikace vakcin představuje potenciální možnost vzniku anafylaktických a anafylaktoidních reakcí u očkovaného organizmu s nebezpečím ohrožení života, což je citováno např. v publikaci „Vaccination of cattle against ringworm caused by Trichophyton verrucosum“ autorů Gudding, R.- Naess, B. (Amer, J. Vet. Res., 47, 1986: 2415-2417). Tato skutečnost prakticky vylučuje použitelnost dosud vyráběných vakcin v humánní medicíně, což je jejich velká nevýhoda.

-2Podstata vynálezu

Uvedený nedostatek je v podstatě vyřešen vakcínou proti dermatofytózám na bázi kombinace vakcinačních kmenů dermatofytů rodu Trichophyton v roztoku formaldehydu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje alespoň tři ze čtyř kmenů ai) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a₂) Trichophyton verrucosum CCM 8166

83) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 a₄) Trichophyton rubrum CCM 8291, jejichž vzájemný poměr ve výsledném produktu je dán vztahem ai : a₂: a₃: a₄ = 2 až 10 : 1 až 5 : 5 až 30 : 2 až 10, přičemž celkový počet vegetativních forem všech vakcinačních kmenů je minimálně 10 milionů na 1 ml vakcíny.

Další podstatou řešení je, že pH hotového produktu je v rozmezí 6,0 až 8,0 a že celkový obsah formaldehydu pro humánní účely je menší než 0,02 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny a celkový obsah formaldehydu pro veterinární účely je menší než 0,05 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny.

Také je podstatou vynálezu způsob výroby vakcíny proti dermatofytózám na bázi kombinace vakcinačních kmenů dermatofytů rodu Trichophyton v roztoku formaldehydu, obsahující alespoň tři ze čtyř kmenů ai) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a₂) Trichophyton verrucosum CCM 8166

83) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 a₄) Trichophyton rubrum CCM 8291, podle něhož se vakcinační kmeny jednotlivě pomnoží na agarové živné půdě při teplotě 25 až 29 °C po dobu 10 až 30 dnů a poté se homogenizují v prostředí 0,1 % roztoku formaldehydu, načež je vzniklá suspenze inaktivována při teplotě 18 - 26 °C minimálně 24 hodin a podle následně zjištěného počtu vegetativních forem u jednot

-3livých kmenů se smíchá a doplní pufrovaným fyziologickým roztokem tak, aby jednak zastoupení jednotlivých kmenů v hotovém produktu odpovídalo poměrům ai : a₂: a3: a₄ = 2 až 10 : 1 až 5 : 5 až 30 : 2 až 10, a jednak celkový počet vegetativních forem všech vakcinačních kmenů byl minimálně 10 milionů na 1 ml vakcíny, pH hotového produktu bylo v rozmezí 6,0 až 8,0 a celkový obsah formaldehydu byl pro humánní účely menší než 0,02 hmotnostních % a pro veterinární účely menší než 0,05 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny.

Nová vakcína umožňuje použití jak ve veterinární medicíně aplikací buď epikutánně a nebo parenterálně, a to intramuskulárně i subkutánně, tak v humánní medicíně epikutánně vetřením do pokožky. Přitom nejvhodnějším místem při použití u lidí je krajina meziprstí na dolních končetinách, která je hlavním zdrojem kožních mykóz ostatních částí těla. Vakcína má přitom profylaktický i terapeutický účinek. Antigenní složení použitých kmenů dermatofytů je dostatečně široké, když se prokázala schopnost vyvolání imunity proti homologním druhům ale i zkřížené imunitní reakce proti jiným druhům dermatofytů, například proti Microsporum canis nebo Trichophyton equinum.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - příprava vakcíny pro veterinární použití:

K pomnožení vakcinačních kmenů byla použita 1,2 % agarová živná půda, obsahující 5 hmotnostních % sacharidů a 0,3 hmotnostních % organických dusíkatých látek. Živná půda byla sterilována v parním autoklávu 20 až 30 minut při přetlaku 80 až 100 kPa. Po úpravě pH na 6,0 až 7,0 byla půda rozplněna do skleněných baněk a znovu autoklávována při stejných sterilizačních poměrech. Kultivační baňky se živnou půdou byly po ztuhnutí a prověření sterility inokulovány jednotlivě suspenzemi vakcinačních kmenů. K inokulaci byly použity lyofilizáty nebo

-4čerstvě připravená inokula vakcinačních kmenů. Každé inokulum obsahovalo minimálně 5 x 10⁵ životaschopných CFU v 1 ml. Inokula vakcinačních kmenů byla rozmístěna po povrchu živného média. Kultivace proběhla při teplotě 25 až 29 °C po dobu 10 až 30 dnů s cílem dosažení optimální tvorby vegetativních forem. Narostlé kultury byly sejmuty ve stadiu vysoké produktivity houbového antigenu z povrchu živného média a homogenizovány v prostředí 0,1 % vodného roztoku formaldehydu. Homogenizace proběhla v homogenizátoru tak, aby došlo k oddělení převážné části spor od mycelia a přitom nedošlo k porušení jejich povrchové struktury. Vzniklé homogenní suspenze byly jednotlivě přelity do zásobních lahví a uchovávány při teplotě 18 - 26 °C po dobu 24 hodin za účelem inaktivace vakcinačních kmenů. Potom byl mikroskopicky zjištěn v počítací komůrce dle Bůrkera počet vegetativních forem u jednotlivých vakcinačních kmenů a provedeno jejich smíchání tak, že zastoupení v hotové vakcíně bylo v poměrech

Trichophyton verrucosum CCM F-765 : Trichophyton verrucosum CCM 8166 : Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 = 2:1:5.

Celkový obsah formaldehydu byl 0,05 hmotnostních %. Doředění bylo provedeno pufrovaným fyziologickým roztokem o pH=7,6 tak, že hodnota celkového pH byla 6,0.

Vzniklý produkt byl testován z hlediska sterility a počtu vegetativních forem a použit k vakcinaci skotu postiženého trichofytózou. Po dvourázové intramuskulámí vakcinaci došlo k vyléčení zvířat ve dvou chovech po 14 dnech od revakcinace. Tento výsledek není běžný při použití dosud vyráběných imunobiologických přípravků, kde doba vyléčení obvykle představuje 1 až 3 měsíce.

Příklad 2 - příprava vakcíny pro humánní použití:

Vakcinační kmeny byly pomnoženy na pevné živné půdě o složení 1,5 hmotnostních % agaru, 15 hmotnostních % sacharidů a 1 hmotnostního % organických dusíkatých látek. Sterilizace živné půdy byla provedena dvakrát po 25 minutách v parním sterilizátoru při přetlaku 80 až 100 kPa. Inokulace a kultivace vakcinačních kmenů proběhly stejně jako v příkladu 1, podle jehož popisu byl rovněž shodný

-5způsob homogenizace, inaktivace a mikroskopie počtu vegetativních forem vakcinačních kmenů. Smíchání vakcinačních kmenů Trichophyton verrucosum CCM F-765, Trichophyton rubrum CCM 8291 a Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 bylo provedeno v poměru 1:1: 3 podle výše uvedeného pořadí. Pufrovaný fyziologický roztok byl k výsledné suspenzi přidán v takovém množství, že celkový obsah formaldehydu byl 0,02 hmotnostních % a celkový počet vegetativních forem všech vakcinačních kmenů v 1 ml vzniklého produktu byl 10 milionů.

Vakcína byla testována z hlediska sterility, počtu vegetativních forem a pH. Výsledky vyhovovaly běžné normě a vakcína byla testována ve zkoušce neškodnosti na lidech - dobrovolnících, když přípravek byl aplikován v množství po 10 ml vetřením do pokožky meziprstí dolních končetin, a to třikrát po jednom týdnu. Po vyhodnocení výsledků bylo možno konstatovat, že vakcína ve zkoušce neškodnosti vyhověla.

Vakcína byla dále aplikována dvakrát epikutánně skotu experimentálně infikovanému trichofytózou. K vyléčení vakcinovaných zvířat došlo asi o 1 týden dříve než u zvířat nevakcinovaných, což prokazuje dobrý terapeutický účinek vakcíny.

Průmyslová využitelnost

Vakcínu proti dermatofytózám podle vynálezu je možno použít k účinné imunoprofylaxi a k účinnému léčení ve veterinární i humánní medicíně, když je ji možno aplikovat jak parenterálně, například intramuskulárně nebo subkutánně, tak epikutánně vtíráním do pokožky, čímž se výrazně snižuje riziko ohrožení zdraví nebo i života ošetřených zvířat či lidí.

Claims

1. Vakcína proti dermatofytózám na bázi kombinace vakcinačních kmenů dermatofytů rodu Trichophyton v roztoku formaldehydu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři ze čtyř kmenů ai) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a₂) Trichophyton verrucosum CCM 8166 a₃) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290

84) Trichophyton rubrum CCM 8291, jejichž vzájemný poměr ve výsledném produktu je dán vztahem a-ι : a₂: a₃ : θ4 = 2 až 10 : 1 až 5 : 5 až 30 : 2 až 10, přičemž celkový počet vegetativních forem všech vakcinačních kmenů je minimálně 10 milionů na 1 ml vakcíny

2. Vakcína proti dermatofytózám podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH hotového produktu je v rozmezí 6,0 až 8,0.

3. Vakcína proti dermatofytózám podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že celkový obsah formaldehydu pro humánní účely je menší než 0,02 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny.

4. Vakcína proti dermatofytózám podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že celkový obsah formaldehydu pro veterinární účely je menší než 0,05 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny.

kmenů ai) Trichophyton verrucosum CCM F-765 a₂) Trichophyton verrucosum CCM 8166 a₃) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 a₄) Trichophyton rubrum CCM 8291

-7se jednotlivě pomnoží na agarové živné půdě při teplotě 25 až 29 °C po dobu 10 až 30 dnů a poté se homogenizují v prostředí 0,1 % roztoku formaldehydu, načež je vzniklá suspenze inaktivována při teplotě 1842 26 °C minimálně 24 hodin a podle následně zjištěného počtu vegetativních forem u jednotlivých kmenů se smíchá a doplní pufrovaným fyziologickým roztokem tak, aby jednak zastoupení jednotlivých kmenů v hotovém produktu odpovídalo poměrům ai : a₂: a3 : a₄ = 2 až 10 : 1 až 5 : 5 až 30 : 2 až 10, a jednak celkový počet vegetativních forem všech vakcinačních kmenů byl minimálně 10 milionů na 1 ml vakcíny, pH hotového produktu bylo v rozmezí 6,0 až 8,0 a celkový obsah formaldehydu byl pro humánní účely menší než 0,02 hmotnostních % a pro veterinární účely menší než 0,05 hmotnostních % vztažených na celkovou hmotnost vakcíny.