KR20070077587A

KR20070077587A - 동물혈청을 첨가하지 않은 돈단독균 배지 및 그 배지에서 배양한 돈단독균으로 제조되는 생균 및 사균백신

Info

Publication number: KR20070077587A
Application number: KR1020060007212A
Authority: KR
Inventors: 김종만; 강현미; 장금찬; 정석찬
Original assignee: 대한민국(관리부서 농림부 국립수의과학검역원)
Priority date: 2006-01-24
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2007-07-27
Also published as: KR100769356B1

Abstract

본 발명자는 돈단독균의 발육능을 향상시키기 위하여 개발한 배지에서의 돈단독균 발육성과 이 배지에서 배양한 돈단독균으로 만든 불활화백신의 마우스에서의 면역원성을 시험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

돈단독 생균수는 기존의 BHI 배지에 5-10% 소혈청을 첨가하여 배양하는 것보다 약 10배 이상의 균수 향상을 보였다.

37℃에서 18-20시간 배양후 배양배지의 pH가 7.0으로 매우 안정적인 pH를 나타내었다.

상기의 개발 배지에서 배양한 돈단독균으로 제조한 돈단독불활화 백신의 마우스에서의 항체형성능은 양호하였다.

돈단독 배양배지, 동물혈청 무첨가

Description

동물혈청을 첨가하지 않은 돈단독균 배지 및 그 배지에서 배양한 돈단독균으로 제조되는 생균 미 사균백신{Erysipelothrix rhusiopathiae culture medium without animal serum and swine erysipelas live and killed vaccine prepared with the bacteria cultured on that medium}

본 발명은 동물혈청을 사용하지 않고도 균수를 획기적으로 증가시킬 수 있는 돈단독균 배지에 관한 것이다.

지금까지 생산되고 있는 돈단독균 백신은 비에치아이 브로스(Brain heart infusion broth, 이하 "BHI"이라 함)에 송아지혈청 등을 첨가하여 만든 배지에서 배양하여 제조하고 있으나 배양된 균수가 적어 생산성이 낮으며 다량(생산배지 양의 5-10%)의 가격이 비싼 우태아혈청을 사용함으로써 생산단가가 매우 높은 문제가 있다. 또한 배지에 다양한 이종단백(소태아혈청)이 함유됨으로써 이것으로 만든 백신을 접종시 이종단백질에 의한 부작용 발생이 상존하고 있다. 또한 배양 후의 배지의 PH가 급격히 낮아져 생균의 활력에 영향을 미침으로서 생균의 보존성에 악영향으로 작용하고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 돈단독균 배지에 동물의 혈청을 사용하지 않고도 돈단독균수를 획기적으로 높일 수 있으면서 배지의 PH를 안정적으로 유지할 수 있는 돈단독균 배지를 개발함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명에서 개발한 기술은 돈단독균 백신의 생산성 향상과 생산비 감축 및 백신의 안전성 및 안정성을 향상시키는데 크게 기여할 것으로 기대되므로 산업화 가능성이 매우 높다.

첫째, 본 발명은 Proteose peptone NO.3 5g, Yeast extrct 5g, NaHPO₄12g, KH₂PO₄2.1g, BHI 37g, D.W 1,000ml 로 조성된 기본배지를 PH 7.4-7.5로 조정한 후, 15Lb, 20분 Autoclave한 후, 여과멸균한 Arginine solution 0.05%, Glucose solution 0.04%, Gelatin solution 0.04%, Tween 80 0.1%를 첨가하여 제조되는 돈단독균 배지 및 그 배지에서 배양되는 돈단독균 생균 및 그 배지를 이용하여 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다.

둘째, 본 발명은 상기 배지조성물중에서 BHI를 첨가하지 않고 제조되는 돈단독균 배지 및 그 배지에서 배양되는 돈단독균 생균 및 그 배지를 이용하여 제조 되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다.

본 발명의 개량배지에서는 동물혈청 대신에 돈단독균 발육을 극대화할 수 있도록 필수성분을 여과멸균하여 첨가(Arginine, Glocose, Gelatin, Tween 80)함으로 써 배양한 돈단독균수가 기존의 배지보다 크게 증가하여 생산성을 높일 수 있으며, 고가의 동물혈청을 사용하지 않음으로써 생산비를 절감할 수 있을뿐더러 이종단백질로 인한 백신의 부작용 발생가능성도 감소할 수 있으며, 또한 본 발명의 개량배지에서는 돈단독균의 안전성을 확보하기 위해 균 발육 후에도 PH가 중성으로 유지될 수 있도록 적정량의 NaPHO₄, KH₂PO₄를 적용하여 기본배지를 조성함으로써 돈단독균 생균백신의 안정성에도 긍정적으로 작용할 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예1 . 본 발명의 돈단독균 배지의 제조

배지 조성

Proteose peptone N0.3 5g

Yeast extract 5g

Na₂HPO₄ 12g

KH₂PO₄ 2.1g

BHI 37g

D.W 1,000ml

pH 7.4 - 7.5 조정후 15Lb, 20분 Autoclave한 후 여과멸균한 아래의 성분을 첨가한다.

Arginine solution 0.05%

Glucose solution 0.04%

Gelatin solution 0.04%

Tween 80 0.1%

실험예1 . 배지별 배양한 돈단독균의 생균수 및 배지 PH

배양성 시험에 사용한 균주는 돈단독불활화백신주로 사용하고 있는 강독주인 T2주를 사용하였다. 공시배지로는 기존에 사용하든 BHI배지에 5%우태아혈청을 첨가한 배지, 개발배지에서 BHI 성분을 첨가하지 않은 배지 그리고 개발배지 3종을 비교시험에 사용하였으며 각 배지별로 돈단독균을 배지량의 0.1%되게 접종하고 37℃에서 18-20시간 배양하였다. 이것을 즉시 BHI agar에 10% 비동화한 송아지혈청을 첨가한 배지를 이용하여 표준평판배양법으로 생균수를 시험하였으며 pH는 PH메터(Mettler, MP220)를 이용하여 측정하였다. 생균수를 시험한 BHI agar plate를 37℃에서 48시간 배양한 후 형성된 집락수로 생균수를 조사한 결과 BHI배지에 5% 우태아혈청을 첨가한 배지, 개발배지에서 BHI 성분을 첨가하지 않은 배지 그리고 개발배지에서 배양한 돈단독 생균수가 각 52 X 10⁷ CFU/ml, 98 X 10⁷ CFU/ml, 517 X 10⁷ CFU/ml으로 개발배지에서 배양한 돈단독 생균수가 기존의 BHI배지에서 배양한 것보다 약 10배이상 많았다. 또한 배양 18시간후의 배지의 pH도 BHI배지에서 배양한 것의 5.46보다 개량배지에서 배양한 것이 7.0으로 매우 안정적이었다(표 1).

표1. 배지별 배양한 돈단독균의 생균수 및 배지 pH

배 지	배지 pH	돈단독 생균수( X 10⁷CFU/ml)	평 균
1*	5.46	56, 55, 46	52 X 10⁷
2**	7.21	88, 89, 117	98 X 10⁷
3***	7.0	528, 492, 532	517 X 10⁷

1: BHI + 5% fetal bovine serum

2: 개발배지에 BHI 성분 미첨가(Arginine 배지)

3: 개발배지

실험예2 . 배지별배양한 돈단독균 불활화백신의 마우스에서의 항체형성능

각 배지별 돈단독균 배양물에 0.2%가 되도록 포르마린을 첨가하고 실온에서 4-5일간 보관하면서 불활화시켰다. 백신은 균의 불활화 여부를 확인한 후에 20mg/ml의 겔(Aluminum hydroxide gel)을 배양물의 15%가 되도록 첨가하여 잘 혼합한 후 5℃ 냉장실에서 5-10일간 정치한 후 상청액의 약 50%를 제거하여 백신을 조제하였다. 제조한 불활화 백신을 체중 20-25g의 ICR 마우스에 피하로 0.2ml를 2회 접종하고 각 접종 2주후의 혈중항체가를 발육응집반응(Growth agglutination test, GAT)법으로 조사하였다. 1차접종 2주후 항체가는 BHI 등 2종의 배지에서 배양한 백신의 항체가각 <4이하로 개발배지의 8배에 비하여 낮았으며 2차접종 2주후의 항체가도 개발배지의 항체가 256배에 비하여 각 8배, 16배로 기존의 배지에서 배양한 항원으로 만든 백신의 면역원성이 균수에 비례하여 낮았다(표 2).

표2. 개발 배지에서 배양한 돈단독 불활화백신의 마우스에서의 항체형성능

배 지 별	균 함량	항 체 가(GAT)^*
배 지 별	균 함량	1차접종 2주후	2차접종 2주후
1. BHI + 5% 혈청	52 X 10⁷CFU/ml	<4	8
2. Arginine 배지	98 X 10⁷CFU/ml	<4	16
3. 개발배지	517 X 10⁷CFU/ml	8	256

* GAT : Growth agglutination test

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 개량배지에서는 동물혈청 대신에 돈단독균 발육을 극대화할 수 있도록 필수성분을 여과멸균하여 첨가(Arginine, Glocose, Gelatin, Tween 80)하고 여기에 BHI를 첨가함으로써 배양한 돈단독균수가 기존의 배지보다 10배이상 증가하여 생산성을 높일 수 있으며, 고가의 동물혈청을 사용하지 않음으로써 생산비를 절감할 수 있을뿐더러 이종단백질로 인한 백신의 부작용 발생가능성도 감소할 수 있으며, 또한 본 발명의 개량배지에서는 돈단독균의 안전성을 확보하기 위해 균 발육 후에도 PH가 중성으로 유지될 수 있도록 적정량의 NaPHO₄, KH₂PO₄를 적용하여 기본배지를 조성함으로써 돈단독균 생균백신의 안정성에도 긍정적으로 작용할 수 있는 것이다.

Claims

Proteose peptone NO.3 5g, Yeast extrct 5g, NaHPO₄12g, KH₂PO₄2.1g, BHI 37g, D.W 1,000로 조성된 기본배지를 PH 7.4-7.5로 조정한 후, 15Lb, 20분 Autoclave한 후, 여과멸균한 Arginine solution 0.05%, Glucose solution 0.04%, Gelatin solution 0.04%, Tween 80 0.1%를 첨가하여 제조되는 돈단독균 배지.
청구항 1의 배지에서 배양되는 돈단독균으로 제조되는 돈단독균 생균백신.
청구항 1의 배지에서 배양되는 돈단독균을 불활화하여 제조되는 돈단독균 불활화백신.
청구항 1의 배지 조성물중에서 BHI를 첨가하지 않고 제조되는 돈단독균 배지.
청구항 4의 배지에서 배양되는 돈단독균으로 제조되는 생균백신.
청구항 4의 배지에서 배양되는 돈단독균 생균을 불활화하여 제조되는 돈단독균 불활화백신.