CS201481B1

CS201481B1 - Vakcína proti trichofytóze skotu živá lyofilizované a způsob její výroby

Info

Publication number: CS201481B1
Application number: CS217579A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Sisak; Alois Rybnikar; Eva Sisakova
Original assignee: Miroslav Sisak; Alois Rybnikar; Eva Sisakova
Priority date: 1979-03-31
Filing date: 1979-03-31
Publication date: 1980-11-28

Description

(54) Vakcína proti trichofytóze skotu živá lyofilizované a způsob její výroby

Vynález se týká vakcíny proti trichofytóze skotu Živé lyofilizované a způsobu její z

přípravy z živé virulentní kultury Trichophyton verrucosum Bodin 1902 /kmene Bi-O36-š Strážnice/ a které je určena k profylaxi a terapii trichofytózy skotu.

Trichofytóze skotu je velmi závažné infekční onemocnění -anthropozoonoza, které se rozšířila u nás zejména se zvyšováním koncentrace skotu ve velkokapacitních teletnících a u velkých stád skotu. Onemocněni trichofytózou je přenosné na člověka, přičemž léčeni jedné infikované osoby je značně nákladné. Onemocnění způsobuje Vedle rozsáhlých škod v kožedělném průmyslu /nepoužitelné kůže ke kožedělnému zpracování/ i další ekonomické ztráty hlavně v zemědělství - znemožněním moderního způsobu odchovu a možnost přesunů zvířat v rámci velkých zemědělských závodů.

V literatuře je popsána celá řada terapeutických prostředků proti tomuto onemocněni. Tyto přípravky jsou však většinou nedostatečně účinné, značně finančně nákladné a jejich aplikace je náročná na práci a Čas. Celé řada pokusů o vyvinutí vakcíny proti trichofytóze skotu byla neúspěšná, připravené vakcíny byly nedostatečně efektivní. Teprve v SSSR byla připravena v poslední době účinná vakcína k profylaxi trichofytózy hovězího dobytka. Jde o suspenzi mikrokonidií imunógenního kmene Trichophyton faviforme ve fyziologickém roztoku

201 481

201 481 v koncentraci od 6 do 9 milionů v 1 cm\ Vakcína bylá získána pomnožením sovětského výrobního kmene δ. 130 na sladinkovém agaru, homogenizací narostlé kultury v prostředí fyziologického roztoku a zředěním suspenze buněk na výše uvedenou koncentraci mikrokonidií. Přípravek je aplikován zvířatům v intervalu 10 až 14 dnů v dávkách od .5 do 10 cm^ /Sarkisov: Prophylaxie specifique de la Triehophyton des jeunes bovides. Bull, OIB, 85, 1976 : 481 až 488 a čs. autorské osvědčení č. 160324/.

Podstatou našeho vynálezu je výroba živé lyofilizované vakcíny proti trichofytóze skotu z kmene Triehophyton verrucosum, získaného na území ČSSB. Výroba vakcíny je realizována podle našeho technologického postupu tak, že výrobní kmen se pomnoží na tekutá Sabouraudově půdě, tekuté sladinkové půdě nebo na pevných půdách Sabeuraudově glukozovém agaru a sladinkovém agaru /půdy jsou obohaceny proti běžným předpisům o thiamin a kyselinu glutamovou/, provede se homogenizace narostlé kultury v prostředí pufrovaného fyziologického roztoku, přidá se pufrované lyofilizační méaium s neomycinem a mikroskopicky se stanoví počet mikrokonidií v jednotce vakcíny a na základě koncentrace mikrokonidií se provede rozplnění vakcíny tak, že jejich počet v 1 cm^ vakcíny je 10 až 20 milionů. Hozplněná . vakcína je zamražena na -40 °C a usušena v lyofilizačním zařízení.

Lyofilizací stabilizovaný imunogenní kmen Triehophyton verrucosum se stává součástí tohoto vynálezu a je uložen v Čs. sbírce mikroorganismů - sbírce zoopatogenních mikroorganismů - Brno, třída Obránců míru 10, a to kultura Triehophyton verrucosum, kmen Bi-036-S /CCM-E-650/ používaná k výrobě československé vakcíny proti trichofytóze skotu, která byla izolována z telat postižených trichofytózou v JZD Strážnice okres Hodonín/. Kultivací na sladinkovém agaru se objevuje růst již 2,až 3· den po inokulaci. Povrch kultury je jasně bílý, bez pigmentů, střed kolonií je vyvýšený, okraje široce hvězdicovitě rozlézavé. Porost kultury určený k výrobě vakcíny /stáří 14 až 21 dnů/ pokrývá souvisle kultivační médium, je bílý, povrch je jemný, vláknitý, mírně rozrýhovaný. Při mikroskopickém vyšetřováni zjištujeme mikrokonidie /téměř kulaté, hruškovité nebo kyjovité, 1,5 až 2 x 2 až 5 ^urn \ velké/, makrokonidie /tenkostěnné kyjovité spory s četnými přepážkami, 4 až 6 x 10 až 50 velké/, mycelium a chlamydospory. Optimální pH pro růst a sporulaci je 6,0 až 6,9.

Při pokusném ověřování účinnosti vakcíny proti trichofytóze skotu československého původu bylo dosaženo velmi dobrých výsledků /Komárek Surveillance dermatomykóz domácích zvířat 1976, 102 až 112, Čstav vet. osvěty Pardubice/. Při použiti vakcíny ve velkokapacil nich teletnících dosahoval léčebný efekt 98%, profylaktický 97,5% /Jaroš : Zkušenoeti s tlumením trichofytózy ve Velkokapacitním teletníku Trutnov, Veterinářství 26, 1976» 256/ Telata vakcinovaná profylaktickými dávkami a umístěná do zamořeného prostředí mezi skot postižený trichofytózou, touto chorobou neonemocněla. Při vakcinaci nemocných kusů došlo k jejich uzdravení. Vakcína je neškodná, při její aplikaci nedošlo u zdravých zvířat k on mocnění trichofytózou.

201 401

Použití vakcíny proti trichofytóze skotu přináší značný ekonomický přínos, usnadnění práce veterinární služby a příznivý dopad má i na oblast zdravotnictví. Použití této vakoíny v chovech skotu vedlo již ke snížení zamořenoeti okresů, obcí a ohnisek v ČSR při porovnání epizootologické situace v roce 1977 a v roce 1978, jak je zřejmé z tabulky:

Zamořených okresů	Rozdíl 1977/1978 absolutně -9	v % -14,6
obcí	-156	38,1
ohnisek	-168	-38,7

Podstata technologického postupu vynálezu spočívá v tom, že čs. výrobní kmen Trichophyton cerrucosum pomnožený na vhodném kultivačním médiu se homogenizuje v prostředí pufrovaného fyziologického roztoku po dobu 5 až 10 minut, přidá se pufrované lyofilizační médium s neomycinem v koncentraci 0,2 g/1, mikroskopicky se stanoví počet zárodků, urči se množství koncentrátu k rozplnění tak, aby počet mikrokonidií v 1 cm^ vakcíny byl 15+5 milionů, provede se rozplnění do lékovek a lyofilizace vakcíny. Vakcína je rozplněna do lékovek o obsahu 50 nebo 100 cm^ a ke každé lékovce je přibalen jako zřeáovač pufrovaný fyziologický roztok.

Dávkování vakcíny je následující :

a/ profylaktické dávky : 2 x 2,5 cm^ telatům 1 až 2 měsíčním 2x5 em^ skotu nad 2 měsíce b/ léčebné dávky : dvojnásobné dávky profylaktické podle stáří a kategorie zvířat,

U zvířat silně postižených je možno použít bez obav ještě další revakcinační dávku.

Vakcína se aplikuje hluboko intramuskulárně v krajině bederní, křížové nebo stehenní, vakcinační dávka v levé, revakcinační dávka v pravé polovině těla zvířete. Mezi vakcinací a revakcinací je rozmezí 10 až 14 dnů.

Příklady provedení

Příklad 1 - pomnožení výrobní kultury Trichophyton verrucosum ha Sabouraudově půdě - výroba 20.000 dávek vakcíny.

Jako pomnožovací půda se použije Sabouraudův roztok složení : 10 litrů destilované vody, 400 g maltózy, 100 g peptonu. PH se upraví na 6,6 až 6,9. Půda se autoklávuje po dobu 30 minut při tlaku 0,05 MPa. Potom se provede rozplnění půdy do Roux lahví obsahu 2 1 po 150 až 200 cm^ na láhev a další autoklávování při stejných poměrech. Po vychladnutí půdy se provede její inokulace kulturou Trichophyton verrucosum. Inekulum bylo připraveno ze 14 až 35 denní kultury Trichophyton verrucosum /výrobní kmen Bi-036-5/ pomnožené na pevné půdě. Porost kultury v celkovém množství asi 3 až 6 χ 10¹⁰ mikrokonidií byl homogenizován v 1000 cm^ puírovaného fyziologického roztoku v mixéru po dobu 5 až 10 minut. Do takto připraveného inokula bylo přidáno 0,2 g neomycinu. Inokulace byla prováděna injekční stři~ 8 kačkou tak, že na 1 kultivační láhev bylo použito 10 enr inokula /asi 3 až 6 x 10 mikro201481 konidií této houby/. Po 14 až 21 dnech růstu v temnu při teplotě 28 až 30 °C byla narostlá kultura z 5 až 6 lahví přemístěna do mixéru, přidáno 0,5 litru pufrovaného fyziologického roztoku a byla provedena homogenizace kultury po dobu 5 až 10 minut. Homogenní kultura byla filtrována přes gázu do zásobní láhve objemu 20 litrů, kam bylo přidáno pufrované lyofiliζβδηί médium ve stejném množství jako u pufrovaného fyziologického roztoku.

Složeni pufrovaného fyziologického roztoku :

destilované voda 1000 cnp chlorid sodný p.a. 3 8 chlorid draselný p.a. 0,2 g sekundární fosforečnan sodný p,a. /12 HgO/ 2,38 g kyselý fosforečnan draselný p.a. 0,2 g

Složení pufrovaného lyofilizačního média :

redestilovaná voda 1000 cm želatina pro bakt. 50 g sacharóza 75 g sekundární fosforečnan sodný p.a. /12 H^O/ 3,82 g kyselý fosforečnan draselný p.a. 0,36 g

Do takto připraveného homogenizátu se přidává neomycin v koncentraci 0,2 g/1.

Veškeré práce při výrobě vakcíny je nutno provádět za podmínek sterilního prostředí, materiál a potřeby použité k přípravě vakcíny musí být autoklávovány a před použitím opalovány nad plynovým kahanem. Ze zásobní láhve s homogenizátem vakcíny se odebere vzorek v množství asi 5 pro provedeni kontrolních zkoušek. Ve vzorku vakcíny je mikroskopicky stanoven počet mikrokonidií pomocí počítací komůrky dle Btlrkera. Na základě dosaženého výsledku je vypočten poměr rozplnění vakcíny tak, aby její koncentrace konečná' byla 15 + 5 milionů mikrokonidií na 1 cm^ vakcíny.

Vakcína je rozplněna do lékovek obsahu 50 nebo 100 cm}. Následuje zamražení na -40 °C nejméně po dobu 4 až 5 hodin a sušení v lyofilizačním zařízení po dobu 24 až 48 hodin s přihřivánim do 25 °C, Lyofilizaoe je ukončena tehdy, když teplota produktu dosáhne teploty sušícího kotle a nejméně 4 hodiny se nemění. Po ukončení sušení se vakuum v zařízení ruší dusíkem. Lékovky s usušenou vakcínou se uzavírají gumovými zátkami ve vakuu.

Před upotřebením se lyofilizovaná vakcína ředí zřeďovačem. U lyofilizované vakcíny /

jsou prováděny následující kontrolní zkoušky : zkouška čistoty a bakteriální sterility je prováděna výsevem vakcíny na krevní agar, masopeptonový agar, masopeptonový bujón, glukozový agar a Sabouraudův agar. Zjišlování bakteriální sterility při 37 °C trvalo po dobu 72 hodin a 7 dnů a při teplotě 20°0 9 dnů. Sledování nepřítomnosti cizích plísní na Sabouraudově agaru probíhalo po dobu 12 dní.při teplotě 28 až 30°C, Stanovení koncentrace vodíkových iontů se provádí na pH metru. Přípustné pH zředěné vakcíny je 6,0 až 7,5. Zkouška účinnosti se provádí stanovením počtu živých zárodků. Zjištuje se plotnovou metodou na Sabouraudově agaru. Vakcína musí obsahovat nejméně 10 až 20 milionů zárodků, živých zárod201 481 ků Trichophyton verrucosum v 1 cm³, Zkouška na vakuum se prováůí pomooí vysokofrekvenčního elektrického zkoušeče vakua. Zkouška neškodnosti se provádí na 2 králících váhy kolem 3 kg. Králíkům se aplikuje hluboko intramuskulárně 2,5 cm³ vakcíny do svaloviny zadní-končetiny. Šarže s nevyhovujícími parametry nejsou vhodné k imunizaci a je nutno je inaktivovat autoklávovánim.

Příklad 2 - pomnožení výrobní kultury Trichophyton verrucosum na tekuté sladinkové půdě obohacené thiaminem.

Ke kultivaci kultury Trichophyton verrucosum je možno použít tekuté sladinkové půdy následujícího složení: 10 litrů destilované vody, 1 kg pevné sládinky získané sušením tekuté pivovarské sládinky v atomizéru, 50 g peptonu, 0,2 g thiaminu.

Tato půda je autoklávována při tlaku 0,05 MPa po dobu 30 minut v autoklévu, pH je upraveno na 6,0 až 6,6 a je provedeno rozplnění půdy do Roux lahví objemu 2 litry po 150 až 200 cm³ na láhev. Po uzavření kultivačních lahví vatovými zátkami je provedeno autoklávování při stejných poměrech. Inokulace půdy se provede pomocí injekční stříkačky, na jed* Q nu kultivační láhev připadá asi 3 až 6 x 10 zárodků Trichophyton verrucosum. Kultivace probíhá v temné komoře při teplotě 28 až 30 °C. Po 14 až 21 dnech růstu je kultura přenesena do mixéru, kde je po dobu 5 až 10 minut homogenizována v prostředí pufrovaného fyziologického roztoku. Na 500 cm³ pufrovaného fyziologického roztoku připadá porost z 5 až 6 kultivačních lahví. Po ukončení homogenizace kultury je mixér propláchnut pufrovaným lyofilizačním médiem s neomycinem v koncentraci 0,2 g/1. Množství lyofilizačního média bylo stejné jako množství fyziologického roztoku. Počítáni zárodků v homogenizátu je prováděno mikroskopicky. Rozplnění vakcíny je prováděno na základě výpočtu tak, aby v 1 cm³ vakcíny bylo 15+5 milionů mikrokonidií Trichophyton verrucosum.

Zamražení a,lyofilizace rozplněného přípravku, jakož i kontrolní zkoušky byly prováděny stejně, jak je uvedeno v příkladě 1. Celkově bylo získáno 20000 dávek vakcíny proti trichofytóze skotu lyof.

Přiklad 3 - pomnožení výrobní kultury Trichophyton verrucosum na ředěném sladinkovém agaru obohaceném o thiamin a kyselinu glutamovou.

Jako živné médium byl použit sladinkový agar ředěný a obohacený o thiamin a kyselinu glutamovou v tomto složení : 10 litrů tekuté pivovarské sládinky, 5 litrů destilované vody., 225 g agaru, 75 g peptonu, 0,3 g thiaminu a 0,3 g kyseliny glutamové.

Médium bylo autoklévováno 30 minut při tlaku 0,05 MPa, pH upraveno na 6,0 až 6,6 a půda byla rozpínána asi po 400 cm³ do Roux lahví objemu 2 litry. Láhve byly uzavřeny vatovými zátkami a autoklávovány znovu při stejných poměrech. Po ztuhnutí média byly láhve

201 481 přemístěny do komory s teplotou 28 až 30 °C, kde byly ponechány po dobu 5 až 9 dnů pro zjištění sterility média. Inokulace byla provedena injekční stříkačkou, na 1 kultivační láhev připadlo asi 3 až 6 x 10 mikrokonidií Trichophyton verrucosum. Po inokulaci byly láhve umístěny do temné komory s teplotou 28 až 30°C kultivačním médiem dolů. Po 1 až 2 dnech * po uchycení kultury k živnému médiu byly láhve obráceny kultivačním médiem vzhůru. Kultura byla každodenně makroskopicky prohlížena na nepřítomnost cizí flory. Po 14 až 21 dnech růstu byla narostlá kultura oddělena pomocí kovové kličky od kultivačního média a pomocí kovových motyček přemístěna do mixéru. Na 500 cm^ pufrovaného fyziologického roztoku byl použit porost ze 4 kultivačních lahví, doba homogenizace tohoto množství byla 5 až 10 minut. Homogenizát byl filtrován přes gázu do skleněné zásobní láhve objemu 20 litrů a proplachován pufrovaným lyofilizačním médiem s neomycinem v koncentraci 0,2 g/1. Celkové množství pufrovaného lyofilizačního; média bylo stejné jako celkové množství pufrovaného fyziologického roztoku. V získaném homogenizátu byl mikroskopicky v počítací komůrce dle Btirkera stanoven počet mikrokonidií. Na základě zjištěné hodnoty byl proveden výpočet poměru rozplnění vakcíny do lékovek obsahu 50 nebo 100 cm^ tak, aby hotový výrobek obsahoval; 15+5 milionů mikrokonidií v 1 cm\

Provedení zamražení a lyofilizace výrobku a kontrolních zkoušek je stejné, jak je uvedeno v příkladě 1.

Výše popsaným způsobem se získá asi 16 000 dávek vakcíny proti trichofytóze skotu.

Veškeré práce při přípravě ihokula, při inokulaci, výrobě vakcíny, při jejím rozplňování a lyofilizaoi, jakož i při uzavírání lékovek, je nutno provádět sterilně. Sterilizace laboratoří je prováděna UV zářením a desinfekčními prostředky, roztoky a pomůcky potřebné k přípravě výrobku je nutno autoklávovat dvakrát po dobu 30 minut při tlaku 0,05 MPa. Eozplňování koncentrátu do lékovek před lyofilizaoi‘se děje v proudu laminérního sterilního vzduchu. Pracovníci jsou povinni při práci s kulturou Trichophyton verrucosum používat ochranné oděvy, gumové rukavice, obličejovou roušku a pokrývku hlavy. Použité kultivační půdy a ostatní pomůcky kontaminované kulturou Trichophyton verrucosum je nutno autoklávovat po dobu 1 hodiny při tlaku 0,2 MPa. Podobně se inaktivují nevyhovující šarže vakcíny, popřípadě prázdné lékovky po provedené vakcinaci v terénu.

Přípravek má exspirační dobu 1 rok. Skladování přípravku je přípustné pouze při teplotě 4 °C a v temnu.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Vakcína proti trichofytóze skotu živá lyofilizovaná určená k profylaxi a terapii trichofytózy skotu, vyznačujíoí se tím, že obsahuje lyofilizovaný pomnožený kmen Trichophyton verrucosum Bodin /BÍ-036-Š/ CCM E-650 v množství 10 až 20 x 10^ mikrokonidií v 1 cm^ vakcíny a zřeóovač.

201 481
2. Vakcína podle bodu 1, vyznačující se tím, že zřeáovač je pufrovaný fyziologický roztok obsahující 8 g chloridu sodného, 0i2 g chloridu draselného, 2,38 g sekundárního fosforečnanu sodného, 0,2 g kyselého fosforečnanu draselného a 1 litr destilované vody.

z
3. Způsob výroby vakcíny podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kmen Trichophyton verrucošum Bodin CCM E-650 kultivuje v živném prostředí po dobu 14 až 21 dni, získaný porost se homogenizuje po dobu 5 až 10 minut v prostředí pufrovaného fyziologického roztoku, přidá se pufrované lyofilizační médium, mikroskopicky se určí koncentrace mikrokonidií a provede se rozplnění tak, aby 1 cm^J vakcíny obsahoval 10 až 20 x 10 mikrokonidií.
4. Způsob výroby vakcíny podle bodu 3, vyznačující se tím, že množství pufrovaného lyofilizačního média je stejné jako množství pufrovaného fyziologického roztoku.
5. Způsob výroby vakcíny podle bodů 3 a 4, vyznačující se tím, že se rozplněná vakcína zaí o mražuje při -40 C nejméně po dobu 4 až 5 hodin, suší se v lyofilizačním zařízení po dobu 25 až 48 hodin při teplotě do 25 °C.
6. Způsob výroby vakcíny podle bodů 3 a 4, vyznačující se tím, že do připraveného homogenizátu se přidává před rozplněním neomycin v koncentraci 0,2 g/1 homogenizátu.