CS248872B1 - Tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen a způsob její pfipravy - Google Patents

Abstract

Tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen je určena k aktivní imunoprofylaxi infekční hepatitidy kachen. Obsahuje inaktivovaný virus infekční hepatitidy kachen CAPM V - 296 v lyofllizovaném stavu. Vakcína se k použití připraví rozpuštěním v lipoidním adjuvans. Tkáňová vakcína proti hepatitidě kachen se vyrábí pomnožením kmene viru infekční hepatitidy kachen na primární kultuře epiteliálních buněk ledvin kachňat v růstovém médiu po dobu 70 až 74 hodin při teplotě 35 až 39 °C až do dosažení miniLDg · 105 /0,1 ém3, 11 denní intraalantoidně/, potom se málních titrů kuřecí embryo, virus inaktivuje účinkem glutaraldehydu a Iyofílizuje se.

Description

Vynález se týká tkáňové vakcíny proti infekční hepatitidě kachen a způsobu její přípravy

V podmínkách intenzivních velkochovů jsou nutná účinná preventivní opatření před nákazami. Jednou z nákaz, které způsobují velké ztráty v chovech káčat je infekční zánět jater. Toto onemocnění postihuje především káčata v prvních dnech po vylíhnutí. Virus infekční hepatitidy kachen /IHK/ byl klasifikován jako kachní picorna virus /Taurasso N, Μ., G Goghill β. E., Klutch M. J.s Proportions of the attenuated vaccine strain of duck hepatitis virus. Avian D. S. 13, 1969, s. 321 až 329/.

K největším ztrátám následkem infekce virem IHK dochází v prvních dvou týdnech po nalíhnutí /Schoop, Staub: Ober die Virushepatitis der Enten 3. Mitt. Die Bekampfung.

Mh. Tierheilhde, 10, 1958 s 29 až 35/. Současně s narůstajícím věkem káčat se zvyšuje i rezistence proti této nákaze a úhyny jsou podstatně nižší. Další autoři se s těmito údaji ztotožňují. Mortalita je v průběhu onemocnění roždílná^ podle různých autorů kolísá mezi 3 až 95 % /Schoop, Staub: Virushepatitis of ducks. Mh. Tierheilhde, 9, 1957, s. 317 až 322/,

Uvedené údaje jsou důvodem k specifické formě boje proti této nákaze, kterou se stala cílená imunizace a včasná aplikace hyperimunního séra. Aktivní imunizace může být prováděna u chovných kachen živou nebo inaktivovanou vakcínou, nebo vakcinace může být použita u čerstvě vylíhlých kachňat živou vakcínou.

V šedesátých letech byla v ČSSR vyvinuta živá vakcína proti IHK, připravená z atenuovaného kmene TN 62 /žuffa A., Černík Κ. , Rajtár V., Žuffová J.: Imunoprofylaxia infekčného zápalu pečene kačíc. Veterinářství, 11, 1966, s. 490 až 495/. Vakcína byla určena výhradně ke zdolávání nákazové situace v chovech, kde byl virulentní virus přítomný.

Současně byla v 60. letech zavedena do výroby adsorbátová inaktivovaná vakcína proti IHK. Výrobní kmen Valdíkov 530 je domácího původu a je antigenně shodný s terénními kmeny Izolovanými v ČSSR i s kmenem TN 60 původem z Anglie /Kožušník Z., Dvořáková D.: Izolace a vlastnosti kmenů virového zánětu jater kachen v ČSSR. Acta vet., 39, 1970, s. 143 až 150/. Virus se pomnožuje a pasážuje na 10 až 11 denních kuřecích zárodcích a při intraalantoidní aplikaci působí hynutí kuřecích zárodků za 2 až 5 dní po inokulaci.

V současné době je v ČSSR imunoprofylaxe proti IHK zajištována 2 druhy vakcín.

a/ Vakcína proti infekčnímu zánětu jater kachen b/ Vakcína proti infekčnímu zánětu jater kachen lyofilizovaná ad a/ Vakcína proti IHK je suspenze viru IHK pomnoženého v kuřecích embryích inaktivovaná beta-propiolaktonem, adsorbovaná na gel hydroxidu hlinitého, konzervována formalínem.

ad b/ Vakcína je suspenze viru IHK pomnoženého na kuřecích embryích, inaktivovaná glutaraldehydem a lyofilizována. Lyofilizát se před použitím rozpustí v olejovém solvens.

Těmito dvěma biopreparáty je v současné době prováděna pravidelná imunizace chovných hejn ve velkochovech. Vzniklé protilátky v organismu chovných kachen po vakcinaci jsou transovariálně předávány káčatům, vylíhlým z vajec takto imunizovaných kachen. Káčata jsou chráněna těmito získanými protilátkami v nejvíce ohroženém období svého života.

Přes nesporně dobré výsledky získané při použití těchto dvou druhů vakcín proti IHK vyráběných v n. p. Bioveta Ivanovice na Hané mají tyto vakcíny určité nedostatky. Používání kuřecích zárodků k výrobě vakcíny je z provozních důvodů poměrně nevýhodné /značné množství vajec, několikanásobná manipulace s nimi atd./. Pro nemožnost získání SPF vajec jsou pro výrobu používána vejce z velkochovů slepic, což nezaručuje jejich naprostou bezinfekčnost a zůstává rizikem přenos různých infekčních agens embryonálními vakcínami /mykoplasmata, viry, atd./. Vyrobené vakcíny ve formě embryonální suspenze jsou biopreparáty s vysokým obsahem balastních látek, což komplikuje vytvoření solidní imunity proti žádanému virovému agens. Uvedené nedostatky vedou k vývoji nových vakcín proti IHK, kde virus je pomnožován ve vhodném kultivačním substrátu. Zvláště významná jsou zjištění, že virus IHK se množí v tkáňových kulturách /Richard A. Mason, Nicola M. Taurasso, Robert K. Ginn: Growth of Duck hepatitis in Chicken embryos and in Cell Cultures derived from infected Embryos. Avian Deseases, VOL. 6, š. 5, 1972/ nebo práce /Morris Pollard, Theodore J. Starr: Propagation of Duck Hepatitis Virus in Tissue Culture. Reprinted from Avian Diseases, VOL. 23, NO. 3, July - September, 1979/.

Dle dostupných informací není v zahraničí vyráběna vakcína proti IHK na tkáňových kulturách. V zahraničí je imunoprofylaxe proti infekční hepatitidě kachen zabezpečována podobně jako v ČSSR inaktivovanými vakcínami pro imunizaci chovných hejn kachen a tím zajišňění chráněnosti kachňat cestou transovariálně jim předaných protilátek od imunizovaných matek, nebo se používají vakcíny vyráběné z atenuovaných kmenů virů infekční hepatitidy kachen, které se aplikují čerstvě vylíhnutým kachňatům.

Podstatou našeho vynálezu je tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen a způscb její přípravy. Tkáňová vakcína proti IHK je určena k aktivní imunoprofylaxi proti IHK vakcinací chovných kachen. Cestou transovariálního přenosu postvakcinačních protilátek proti IHK od imunizovaných matek jsou chráněna proti této nemoci vnímavá kachňata v nejmladším věkovém období. 1 cm³ vakcíny obsahuje minimálně 1 milión LD_5Q inaktivovaného virusu infekční hepatitidy kachen CAPM V-296 v lyofilizovaném stavu.

Způsob přípravy tkáňové vakcíny proti infekční hepatitidě kachen se vyznačuje tím, že vakcinační virus IHK je získán kultivací a pomnožením v kultuře primárních buněk kachních ledvin, po sklizni je inaktivován glutaraldehydem a lyofilizován. Imunogenni účinnost vakcíny proti IHK, obsahující virus získaný pomnožením na tkáňových kulturách, je stimulována zředovačen ve formě lipoidního adjuvans.

Vakcína představuje suspenzi inaktivovaného viru infekční hepatitidy kachen, růstové médium, lyofilizační médium a olejový zředovač, který slouží zárověň jako adjuvans vakcíny.

Komponenty pro přípravu tkáňové vakcíny proti infekční hepatitidě kachen:

1. Kmen viru infekční hepatitidy kachen - uložený v Československé sbírce mikroorganismů, sbírce zoopatogenních mikroorganismů Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, Brno 21, Medlánky, pod označením CAPM V - 296.

2. Buněčná kultura pro pomnožování viru IHK

3. Růstové a udržovací médium

4. Antibiotika

5. Inaktivní činidlo a způsob provedení inaktivace viru IHK

6. Lyofilizační ochranné médium pufrované, koncentrované

7. Zředovač a adjuvans vakcíny ad 1 - Pro výrobu tkáňové vakcíny proti infekčnímu zánětu jater kachen se používá kmen viru infekční hepatitidy kachen izolovaný z území ČSSR, pod označením Valdíkov 530, uložený ve sbírce mikroorganismů pod označením CAPM V - 296.

ad 2 - Buněčná kultura pro kultivaci výše uvedeného kmene je kultura primárních epiteliálních buněk kachních ledvin.

ad 3 - Složení růstového média:

M- 199 Médium dle Parkera - modifikované bez purinů, pyrimidinů, vit. D2 a cholesterolu /PNY 30-259-79 PN ÚSOL Praha/, Tryptose phosphate Broth - Difco /číslo katalogu 0060-01-6/ Bovinní sérum ultrafiltrované, inaktivované /PN Bl 182/85/ Roztok 7,5% kyselého uhličitanu sodného NaHCO^ p.a. /ČsL 3/. Jednotlivé složky dle pořadí jsou v poměru: 90 : 10 : 5 : 1.

Složení udržovacího média:

M - 199 Médium dle Parkera - modifikované bez purinů, pyrimidinů, vit. D₂ a cholesterolu /PNY 30-259-79 PN ÚSOL Praha/ Tryptose phosphate Broth - Difco /číslo katalogu 0060-01-6/ Bovinní sérum ultrafiltrované, inaktívovaru' /PN Bl 182/85/ Roztok 7,5* kyselého uhličitanu sodného NaHCO^ p.a. /ČsL 3/. Jednotlivé složky dle pořadí jsou V poměru: 90 : 10 : 1 : 1.

ad 4 - Pro růstová a udržovací média jsou použita antibiotika v následujících koncentracích: Zásobní roztok penicilinu: Penicilín G 10 mil. m.j.

Voda tridestilovaná sterilní ad 300 cm Zásobní roztok streptomycinu: Streptomycin sulfát 10 g

Voda tridestilovaná sterilní ad 300 cm³ Zásobní roztok fungioidinu: Pungioidin 20 g

Etylenglykol p.a. ad 2.000 cm ad 5 - Virus infekční hepatitidy kachen se inaktivuje následujícím způsobem:

k inaktivaci se používá glutaraldehyd v konečné koncentraci 0,15 až 0,20%, po dobu 1 hodiny při 34 až 38 °C. Inaktivace probíhá ve vodní lázni. Po inaktivaci se upraví pH na hodnotu 6,4 až 7,8.

ad 6 - Složení lyofilizačního ochranného média pufrovaného, koncentrovaného: Želatina 250 g Sacharóza 375 g

Hydrofosforečnan sodný /Na₂HP0^ x 12H₂O/ 12 g

Dihydrofosforečnan draselný /ΚΗ,,ΡΟ^/ 1,125 g

Voda redestilovaná ad 1.000 cm³ ad 7 - Složení solvens a adjuvans:

Olej vaselinový medicinální Al 24.000 g Lanolín 8.000 g /Tween 80/ monoolejanester sorbitanu polyetylenglykoléteru 1,600 g Voda redestilovaná 66.400 g

Příklad provedení:

Trypsinací ledvin mladých kachňat získáme primární epiteliální ledvinové buňky.

Suspenze těchto buněk je resuspendována v růstovém médiu na denzitu 300 000 až 400 000 buněk o >33 v 1 cm a rozplní se do Roux lahví a 1 200 cm po 120 cm buněčné suspenze· Kompletně narostlé monolayery primárních kultur ve stáří 4 až 5 dnů jsou infikovány virem IHK. Na

6 3 monolayer navrntvíme 15 cm viru IHK o titru minimálně LD_5Q = 10/0,1 cm 11 denní kuřecí embryo, intraalar.toidně/. Necháme adsorbovat po dobu 2 až 3 hodin při teplotě 35 až 39 °C.

Po této době siejeme přebytek viru a doplníme 120 cm udržovacího média.

Sklizeň viru se provádí za 72 hodin po infekci buněčné kultury. Pro výrobu vakcíny se 5 3 používají sběry viru o minimálním titru LD_5Q - 10 /0,1 cm 11 denní kuřecí embryo, intraulantoídně/. Vhodný sklizený virus se inaktivuje glutaraldehydem v konečné koncentraci 0,15 až 0,20% po dobu 1 hodiny při 35 až 39 °C. Inaktivovaný virus IHK se smísí v poměru 9 dílů viru s 1 dílem lyofilizačního ochranného média pufrovaného, koncentrovaného. Inaktivovaný virus IHK s lyofilizačním médiem se rozplní do lékovek a zamrazí. Pak se provede lyofilizace vakcíny nejšetrnějším způsobem /v průběhu lyofilizace nesmí teplota produktu překročit 25 °c/.

Požadovaná zbytková vlhkost musí být nižší než 3 %. Lyofilizovaná vakclna je uzavřena gu.7«.í>u zátkou ve vakuované iěkcvce. K vakcíné za připraví lipoidní adjuvant, které je současně zředovac.vakcíny. Uvedené Komponenty solvens se emulgují a rozplní do lékovek. Lékovky se neuron;. ·’· uzavřou a jejích obsah se sterilizuje autoklávovánim. Vakclna se k aplikaci připraví tak, že ivoiilnát se rozpustí ' iípoi.c.ín ad j’j· t.ns..

U každé vyrobené šarže vakcíny se provádí výstupní kontrola: Zkoušky sterility, neškodnosti, účinnosti, stanovení pH, vlhkosti, vzhledu a vakua ve vakcíně.

Možnosti využití vynálezu:

Tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen byla pokusně vyrobena a ověřena v rámci laboratorního a klinického ověřování u chovných a vylíhlých kachňat. Bylo použito následující imunizační schéma, dávky a sledování u kachňat.

Vakcinační dávka pro kachny jsou 2 cm³ rozpuštěné vakcíny aplikované intramuskulárně. Vakcína je určena k aktivní imunizaci dospělých kachen před snáškou. Vakcinace se provádí 6 týdnů před snáškou, revakcinace je těsně před započetím snášky a další revakcinace je v průběhu snášky, tj. 2 až 3 měsíce po zahájení snášky. Transovariálním přenosem vzniká u kachňat vysoká chráněnost trvající do 28 dne po jejich vylíhnutí od vakcinovaných kachen. Při aplikaci ve výše uvedené dávce a postupu byla zjištována dobrá imunizační schopnost vakcíny, detekované u vakcinovaných kachen a jejich kachňat neutralizačním testem v kuřecích zárodcích. /Tab. č. 1./.

Během ověřování nebyly u vakcinovaných zvířat pozorovány postvakcinační reakce po vakci naci či následných revakcinacích místního nebo celkového charakteru.

Tabulka 1

Zjištěné průměrné hodnoty PD_ v sérech vakcinovaných kachen a jejich potomstva /log 10/.

Dospělé kachny:

1. Jeden měsíc po vakcinaci, před revakcinací /před zahájením snáškového období —50 ⁼ 5,5/.

2. Uprostřed snáškového období PD_5Q = 4,0

3. Konec snáškového období PD_&0 = 3,3

Kachňata: /Transovariální přenos protilátek od vakcinovaných matek/:

1. den -	PD50 =	4,13
7. den -	-50 =	4,34
14. den -	PD50 =	3,29
28. den -	-50 =	2,85
32. den -	-50 =	2,0

Uvedené výsledky potvrzují dobrý imunizační efekt vakcíny proti infekční hepatitidě kachen u dospělých kachen a vysokou chráněnost jejich potomstva. Ještě 32. den po vylíhnutí od vakcinovaných matek kachen chrání sérum kachňat proti 100 id_5Q viru IHK.

Claims (6)

1. Tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen určená k imunoprofylaxi infekční hepatitidy kachen cestou transovariálního přenosu postvakcinačních protilátek kachňatům od imunizovaných matek, vyznačující se tím, že 1 cm vakcíny obsahuje minimálně 1 milion LD^₀ inaktivovaného viru infekční hepatitidy kachen CAPM V - 296 v lyofilizovaném stavu.

2. Tkáňová vakcína proti infekční hepatitidě kachen podle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje zřeSovač ve formě lipcídního adjuvans.

3. Způsob výroby tkáňové vakcíny proti infekční hepatitidě kachen podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že se virus infekční hepatitidy kachen pomnožuje na primárních kultu248872 rách epiteliálních buněk kachních ledvin v růstovém médiu po dobu 70 až 74 hodin při teplotě 35 až 39 °C, až do dosažení minimálního titru LDg₀ ~ 10^, potom se sklizený virus inaktivuje glutaraldehydem.

4. Způsob výroby podle bodu 3, vyznačující se tím, že při výrobě se používá k infekci primární kultury epiteloidních buněk ledvin virus infekční hepatitidy kachen v dávce 15 až 20 cm³ viru o minimálním titru LD_5Q“ 10⁶ na 1 Roux láhev á 1 200 cm³ a nechá se adsorbovat 2 až 3 hodiny při teplotě 35 až 39 °C.

5; Způsob výroby podle bodu 3, vyznačující se tím, že k inaktivacl sklizeného viru infekční hepatitidy kachen.se používá glutaraldehyd v konečné koncentrci 0,15 až 0,20% po dobu 1 hodiny při 34 až 38 °C ve vodní lázni s následnou úpravou pH na hodnotu 6,4 až 7,8.

6. Způsob výroby podle bodu 3, vyznačující se tím, že inaktivovaný virus infekční hepatitidy kachen se mísí s lyofilizačním médiem obsahující v konečné směsi 3,75% želatiny a 2,5% sacharózy, rozplňuje se do lékovek, zamražuje a lyofilizuje.