RU2270857C2 - Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина - Google Patents
Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2270857C2 RU2270857C2 RU2004110630/13A RU2004110630A RU2270857C2 RU 2270857 C2 RU2270857 C2 RU 2270857C2 RU 2004110630/13 A RU2004110630/13 A RU 2004110630/13A RU 2004110630 A RU2004110630 A RU 2004110630A RU 2270857 C2 RU2270857 C2 RU 2270857C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coli
- escherichia coli
- anatoxin
- bacteriosis
- preparing
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при приготовлении колибактериозного анатоксина. Питательная среда для выращивания кишечной палочки содержит в литре дистиллированной воды: лимонную кислоту, хлористый натрий, сернокислый магний, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислое железо, аспарагин, глюкозу, глицерин в заданном соотношении компонентов. Способ получения колибактериозного анатоксина предусматривает выращивание кишечной палочки на питательной среде вышеприведенного состава. В полученную биомассу добавляют 0,6%-ный формалин для детоксикации токсинов кишечной палочки и отделяют ее фильтрацией. После чего проводят сорбцию инактивированного колибактериозного анатоксина на геле гидрата окиси алюминия. Изобретение позволяет проводить выращивание кишечной палочки в стандартных бутылях, увеличить рост и выход биомассы кишечной палочки. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается разработки жидкой синтетической среды для выращивания кишечной палочки и способов получения анатоксина кишечной палочки.
Известно использование бульона Хоттингера для выращивания кишечной палочки при получении вакцины против колибактериоза (Малахов Ю.А. Вакцина против колибактериоза поросят. А.С. №1149466 от 29.07.83 г.).
Недостатком является применение дорогой питательной среды, нестандартность ее состава, технологические трудности культивирования кишечной палочки, связанные с аэрацией.
За прототип взята синтетическая питательная среда для выращивания синегнойной палочки, также относящейся к кишечной инфекции (Среда для выращивания синегнойной палочки. Патент №22033943. Авторы: Евглевская Е.П., Лоторев А.Н., Евглевский А.А., Галкин В.В., Лапиков С.Н.).
Ее состав содержит следующие компоненты в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9-5,0; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 4,9-5,0; аспарагин - 0,9-1,0; глицерин - 30-31,0 мл; глюкоза - 0,9-1,0; сернокислое железо - 0,04-0,05.
Пересеянная с мясопептонного бульона (МПБ) на данную питательную среду культура кишечной палочки позволяла обеспечить хороший рост и накопление биомассы в пределах 13-14 млрд. микробных тел в 1 мл, что свидетельствовало о ее потенциальной перспективности использования для получения вакцинных и антигенных препаратов.
Тем не менее, недостатком данной питательной среды являлось то, что ее состав был оптимизирован для выращивания синегнойной палочки, а в этой связи он в меньшей степени отвечал ростовым потребностям кишечной палочки.
Для устранения данного недостатка были проведены поисковые опыты по оптимизации известного состава питательной среды, в наибольшей степени отвечающей ростовым потребностям кишечной палочки, позволяющей обеспечить накопление биомассы в пределах 15-16 млрд. микробных тел на 1 мл. При этом важным условием являлось упрощение технологии культивирования кишечной палочки, в частности исключение процесса аэрации.
Результаты исследований показали, что уменьшение содержания в питательной среде калия фосфорнокислого двухзамещенного, магния сульфата, до 2 г/литр и глицерина до 10 мл/литр не отразилось на накоплении биомассы кишечной палочки.
Увеличение содержания глюкозы до 3 г/л в питательной среде оказало позитивное влияние на ускорение процесса роста и максимального накопления биомассы кишечной палочки до 14-15 млрд. микробных тел/мл. Последовательные пересевы кишечной палочки на модифицированной синтетической среде не вызвали ослабления или усиления роста микроорганизмов. Однако выяснилось, что последовательные 5-6 пересевов кишечной палочки на синтетической среде могли привести у отдельных культур к утере гемолитических свойств. Последнее необходимо учитывать при изготовлении вакцинных и антигенных препаратов из кишечной палочки.
Таким образом, использование нового варианта жидкой синтетической среды позволяет не менее 5 раз использовать последовательный пересев на ней культуры кишечной палочки, прежде чем она потеряет гемолитические свойства. В то же время добавление к синтетической среде 5% МПБ позволяло в наибольшей степени сохранять антигенные свойства исходной культуры без утери ее гемолитических свойств после 5 последовательных пересевов. Стабильное накопление биомассы до 15-16 млрд. микробных тел в 1 мл без необходимости стерильной подачи воздуха значительно облегчает технологический процесс производства антигенных и вакцинных препаратов. При этом для выращивания кишечной палочки не требуются дефицитные и дорогие продукты животного происхождения.
Разработанная среда содержит компоненты в следующем соотношении на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 1,9-2,0; хлористый натрий 0,9-1,0; сернокислый магний 1,9-2,0; аспарагин 0,9-1,0; глицерин 10,0-11,0 мл; глюкоза 2,9-3,0; сернокислое железо 0,04-0,05.
Среду готовят путем растворения предварительно смешанных компонентов в дистиллированной воде с последующей нейтрализацией 10% едким натрием до рН 7,2-7,3 перед автоклавированием.
Использование вышеуказанной синтетической питательной среды позволяет проводить выращивание кишечной палочки в стандартных 2-х литровых биобутылях с объемом среды 49-50% до конечной концентрации 15-16 млрд. микробных тел в 1 мл.
Контрольное пятикратное выращивание кишечной палочки на известной синтетической среде для выращивания синегнойной палочки во всех случаях обеспечивало на 2-3 млрд. меньшую концентрацию микроорганизмов. Предлагаемая среда может быть использована для получения колибактериозного анатоксина.
В качестве ближайшего аналога изобретения, касающегося получения колибактериозного анатоксина использовали известный способ получения анатоксина синегнойной палочки (RU 2002101629 А1, 20.08.2003), включающий выращивание микробов на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы, детоксикацию формалином, отделение полученной биомассы фильтрацией, сорбцию на геле гидрата окиси алюминия.
Отличается заявленный способ от известного тем, что выращивают кишечную палочку на жидкой питательной среде, содержащей: лимонную кислоту 4,9-5,0 г; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 1,9-2,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 1,9-2,0; сернокислое железо - 0,04-0,05; аспарагин 0,9-1,0, глюкозу 2,9-3,0; глицерин 10,0-11,0, дистиллированную воду 1,0 литр; детоксикацию проводят 0,6% формалином при температуре 49-50°С в течение 8-9 дней, исключая при этом процесс автоклавирования. Такие условия позволяют убить биомассу кишечной палочки, способствуют увеличению выхода токсина в культуральную жидкость, тем самым повышают ее биологическую активность и иммуногенные свойства конечного вакцинного препарата. После проведения детоксикации фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости, а последнюю используют в качестве анатоксина кишечной палочки.
Пример осуществления способа. Для получения колибактериозного анатоксина использовали свежевыделенные культуры кишечной палочки двух серотипов О141 и О149, выращенные на МПБ. Пересев маточных культур кишечной палочки провели в 2-х литровые биобутыли с объемом 50% синтетической среды: лимонная кислота - 5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 2,0; хлористый натрий - 1,0; сернокислый магний - 2,0; аспарагин - 1,0; глицерин - 10,0; глюкоза - 3,0; сернокислое железо - 0,05.
Плотность посева маточной культуры составила 90-100 млн. микробных тел на 1 мл среды. Выращивание кишечной палочки провели при 37-38°С в течение 24 часов. По окончании выращивания максимальная концентрация микробных тел в 1 мл составила 15-16 млрд. При этом разницы в интенсивности роста и накопления биомассы обеих культур не наблюдалось.
В дальнейшем в биобутыли добавили формалин с таким расчетом, чтобы его концентрация была на уровне 0,6%. Обезвреживание микроорганизмов провели при температуре 50°С в течение 7 дней. Фильтрацией отделили биомассу от культуральной жидкости. В культуральную жидкость добавили гель гидрата окиси алюминия из расчета 3 мг/мл, тщательно перемешали. Затем рН довели 10% едким натрием до 7,0. Препарат расфасовали в стерильные флаконы. Полученный анатоксин кишечной палочки провели на стерильность, безвредность, протективную активность.
При контрольных высевах анатоксина на мясопептонный агар (МПА), МПБ и МПБ под вазелиновое масло рост микрофлоры отсутствовал, что свидетельствовало о стерильности препарата.
При внутрибрюшинном введении анатоксина в дозе 0,5 мл белым мышам массой 20-22 г, состояния угнетения или их гибели в течение 10 дней не отмечали.
Испытание протективных свойств анатоксина кишечной палочки провели на белых мышах. Порядок применения анатоксина предусматривал двукратную с интервалом в 7 дней, в дозе 0,3+0,3 мл, подкожную иммунизацию белых мышей со средней массой 20-22 г. Для иммунизации применили в первых группах моноанатоксин, а в 3-й - ассоциированный анатоксин. Заражение опытных мышей провели спустя 7 дней после последнего введения анатоксина. Для заражения использовали моно- и гетерологичные культуры кишечной палочки в дозе 2 LD50. Результаты испытания анатоксина кишечной палочки отражены в таблице 1.
Таблица 1 Протективная эффективность анатоксина кишечной палочки при испытании на белых мышах (п=9). |
|||||||||
№ п/п | Вид препарата | Защитный эффект при заражении 3 LD50 культурой E.coli в % | |||||||
O141 | O142 | O8 | |||||||
Выжило | Пало | Выжило | Пало | Выжило | Пало | ||||
1. | Анатоксин E.coli серогруппы O141 в дозе 0,3 мл + 0,3 мл | 77,7 | 22,2 | 55,5 | 44,4 | 55,5 | 44,4 | ||
2. | Анатоксин E.coli серогруппы O142 | 66,6 | 33,3 | 77,7 | 22,2 | 66,6 | 33,3 | ||
3. | Анатоксин E.coli серогрупп O141, O142 в соотношении 1:1 | 77,7 | 22,2 | 77,7 | 22,2 | 77,7 | 22,2 | ||
4. | Контроль | 0 | 9 | 0 | 9 | 0 | 9 |
Результаты испытания показали, что опытные серии анатоксинов имеют необходимое количество протективного антигена, обеспечивающего требуемый к вакцинным препаратам уровень иммунитета при заражении культурами кишечных палочек независимо от их серогрупповой принадлежности.
Claims (2)
1. Среда для выращивания кишечной палочки, содержащая лимонную кислоту, хлористый натрий, сернокислый магний, фосфорнокислый калий двузамещенный, сернокислое железо, аспарагин, глюкозу, глицерин, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит вышеприведенные компоненты при следующем содержании, г/л дистиллированной воды:
2. Способ получения колибактериозного анатоксина кишечной палочки, включающий выращивание кишечной палочки на жидкой питательной среде, детоксикацию формалином, отделение полученной биомассы фильтрацией, сорбцию на геле гидрата окиси алюминия, отличающийся тем, что выращивание кишечной палочки ведут на жидкой питательной среде по п.1 формулы изобретения, а детоксикацию проводят 0,6%-ным формалином при температуре 49-50°С в течение 7-9 дней.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004110630/13A RU2270857C2 (ru) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004110630/13A RU2270857C2 (ru) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004110630A RU2004110630A (ru) | 2005-09-27 |
RU2270857C2 true RU2270857C2 (ru) | 2006-02-27 |
Family
ID=35849887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004110630/13A RU2270857C2 (ru) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2270857C2 (ru) |
-
2004
- 2004-04-07 RU RU2004110630/13A patent/RU2270857C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2004110630A (ru) | 2005-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2308288C1 (ru) | Вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных | |
US4472378A (en) | Live vaccine for the prevention of salmonellosis in water fowl, a process for making and applying the same | |
RU2270857C2 (ru) | Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина | |
CN110075289A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗及其应用 | |
RU2432174C1 (ru) | Способ получения эшерихиозного анатоксина | |
RU2388489C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
RU2325183C1 (ru) | Способ получения вакцины против эшерихиоза животных | |
RU2650628C1 (ru) | Способ получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят | |
RU2098127C1 (ru) | Ассоциированная вакцина "нековак" против некробактериоза крупного рогатого скота | |
US4002736A (en) | Porcine bacterin | |
US4287179A (en) | Immersion vaccine for enteric redmouth | |
US3843451A (en) | Microorganism production | |
RU2288002C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий | |
RU1066074C (ru) | Вакцина против псевдомоноза пушных зверей, преимущественно норок, способ ее получения и способ профилактики псевдомоноза пушных зверей, преимущественно норок | |
CN110124022A (zh) | 一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗及其应用 | |
RU2270867C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА Pseudomonas aeruginosa | |
RU2109519C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против некробактериоза животных | |
RU2340357C2 (ru) | Вакцина против эшерихиоза животных | |
RU2813771C1 (ru) | Способ профилактики эшерихиоза у телят | |
RU2763991C1 (ru) | Вакцина против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированная, способ её получения | |
RU2268933C1 (ru) | ШТАММ Haemophilus parasuis СК-1 - ВОЗБУДИТЕЛЬ ГЕМОФИЛЕЗНОГО ПОЛИСЕРОЗИТА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | |
RU2406532C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота | |
RU1566532C (ru) | Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных | |
RU2288004C1 (ru) | Вакцина против колибактериоза нутрий | |
RU2269570C2 (ru) | Штамм haemophilus parasuis ил-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060408 |