JPS60110286A - 遺伝子工学的に作成された無毒性Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、その用途及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本ｇｚは、コレラｆｉｇ　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅ
ｒａりにおける遺伝子犬ｍｋともなう制限フラグメント
の分離法と、それくとってできる菌株に関する。

この申請書は１９８３年３月４日に提出したアメリカ合
衆国時計申請−＠：０６／４７２．２７６のＷｃ　編で
ある。この申請書中の研究は、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　において
行わｎたものでおる。

発明の背景 コレラ菌（Ｖ、　ａｈｏｌｅｒａｅ　）は、小腸の粘膜
表面にまでは広がることのない非侵入性の腸病原である
。

それ故、粘膜面において免疫を伝達する局所ＳＩｇＡは
防御機構としての関連性をもつ。病原性Ｖ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ　０１は、コレラエンテロトキシン、
コレラゲン、必るいはコレラ毒素として知られているタ
ンパクエンテロトキシンを生成する。それは、小腸に多
盆の分必物を促す働きをし、コレラ感染の臨床的結果で
あるところの漿液性下痢を誘発させることになる。コレ
ラ性の下痢は激烈を極め、早急な治療を施さなければ身
体内の水分及び電Ｓ質を失わせ、脱水症、アンド−シス
、ショック、そして死に至らしめるものである。

現在発達を遂げているコレラワクチンを言、大きく２つ
の範躊に分類さ牡゛る。抗毒性免役を刺激することを目
的とするものと、抗ノ（クチリア性免疫を引き起こすこ
とを目的とするものとである。動物実績により、抗禅素
性、抗）くクチリア性免疫の両者か、いずｎか一力の防
御の役割ｔみることカーできる。両者の免疫が調和して
働く場合ｋま、相助作用ノ効果かめる（Ｈｏ１ｍｇｒｅ
ｎ＋　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ−シ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｅ。

１３６　抱瀘、、　８１０５−８１１２２　（４９？　
７　）　：　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｗ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　１３．
７３５（１９７６月。しめ為しながら、人における防ｎ
ａ免疫は、その工うな相助作用効果がみられない工うで
ある。すなわち、抗褐累性兄反か抗）（クチリア性免疫
の（・ずれ力為の効果しかないのである（　Ｅｕｂａｎ
ｋｓｓ　Ｅ、　ｋＬ、　ａｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　１５．５３３　（１９７７）　：　Ｆｕ
ｊｉｔａ、　Ｋ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ
。

Ｄｉｓ、　１２５．６４７　（１９７２）　：　Ｈｏｌ
ｍｇｒｅｎｅ　Ｊ、’＋　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ’−＋柑Ｄ：　Ｌａｎｇｅ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　
Ａｅｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｅａ
ｎｄ　５ｅｃｔ。

Ｐｉｅｒｃｅ＋　Ｎ、　Ｆ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉ
ｎｆａｃｔ、　１）ｉｓ、　１３５．８８８（１９７７
、）　：Ｒｅ５ｎｌｃｋ會１．　Ｇ、　ｅｔ　ａｌす５
ｕｐｒａ　ｅ　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ａ、　−Ｍ
　ｅｔ　ａｌ。

！〕。

死菌ワクチン １、約ｉｏｏ年間、Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　の死菌は
非経口性ワクチンとして用いりｎてきた。このワクチン
はいまだに市販されている。最近、非経口性ワクチンの
使用について、Ｊｏｏ＋　Ｉの「コレラワクチン」で再
検討された　Ｉｎ　Ｃｈｏｌｅｒａ、　（Ｂａｒｕａ　
Ｄ、　ａｎｄ　ＢｕｒｒｏｗｓＷ、、　ｅｄｓ、）、　
５ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐ
ｐ、ａａａ−３５５（１９７４）ａｎｄ　ｉｎ　Ｆ＠ｅ
ｌｅｙ、　Ｊ、　Ｄ、　ｅｔ　ｍｌ＋Ｉｎ　Ｃｈｏｌｅ
ｒａ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＤｉａｒｒｈｅａｓ、　
４３　ｒｄ　Ｎｏｂｅｌ　Ｓｙｍｐ、＋　Ｓｔｏｃ）ｃ
ｈｏｌｍ　１９７８．　（０゜Ｏｕｃｈｅｒｌｏｎｇ＋
　Ｊ、　ｆ（ｏ１ｍｇｒｅｎ＋　ａｄｓ、　）　Ｋａｒ
ｇａｒ＋　Ｂａａｅｌ、　ｐｐ、　２０４−２１０（１
９８（１）、そのようなワクチンは血清中のビブリオ菌
に対する抗体の力価を高める。又、パキスタン人にその
ワクチンを投与すると、Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ体性Ｏ
抗原に対する腸内ＳＩｇＡ　抗体が増力ｎするが、スウ
ェーデン人の場合には、これが認められない（Ｓｖｅｎ
ｎｅｒｈｏｌｍｓ　Ａ、　−ｒＡ、　＠ｔ　ａｌ、　Ｉ
ｎｆｅｅｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３０．４２７（１９８０）
：　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍｓ　Ａ、　−Ｍ、　ｅｔ　
ａｌ、　５ｃａｎ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　６．１３４
５（１９７７）ｌパキスタン人がこの工うな反応奮起こ
丁理由として、彼等は既に完投的にあらかじめ抗原性接
触が与えられていて、例えばスウェーデン人の様に非風
土病地域に居住している人々には、それがないからだと
推測さｔ″Ｌる。非経口性ワクチンは、同種のＶ−ｃｈ
ｏｌｅｒａｓ血清型に対する防御効果は有意であると示
咲されているが、通常その効果の持続期間は１年以下で
ある（　Ｊｏｏ＋　ｒ、、　５ｕｐｒａ　：Ｆｅｅｌｅ
ｙ＋　Ｊ、　Ｃ，、５ｕｐｒａ　：　Ｓｖｅｎｎｅｒｂ
ｏｌｍ、Ａ、　−Ｍ、　ａｔ　ａｌ、　ａｕｐｒ＆。

（１９８０）　：　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ａ、　
−Ｍ、　ａｔ　ａｌ、　、１ｆｆｐｒａｌ　（１９７７
）；Ｍｏ１Ｉｌｅｙ、　Ｗ、　ｆ（、ｅｔ　ａｌ、　Ｂ
ｕｌｌ、　Ｗｅｄ、　Ｈｌｔｈ、　Ｏｒｇ、　４９．長
ｊ０９７３）：　Ｐｈ１ｌｉｐｐｉｎｅａ　Ｃｈｏｌｅ
ｒａ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ、　Ｂｕｌｌ、　Ｗｌｄ、　
Ｈｌｔｈ、　Ｏｒｇ。

４９、３８１（１９７３，）〕、非経口性稲葉型ワクチ
ンは、稲葉型株と同様に小川型株コレラに有効で短期の
防御効果を持つが、小川型ワクチンは小川型株にのみ有
効であることを示す数例の報告がある。

補助薬（抗原補強剤ンの使用にエリ、非経口性ワクチン
は１年半の期間まで約７０％の有効性を維持することが
可能となった〔例、５ａｒｏｓｏｅ　Ｊ、　Ｓ。

ｅｔ　ｍｌ、　Ｂｕｌｌ、　Ｗｌｄ、　Ｈｌｔｈ、　Ｏ
ｒ　、　５６．６１９（１９７ｇ　）　診照〕０しかし
抗原補強したワクチンの接種部位に露呈する無菌性１濃
腫等の副作用も度々みらｎるので、そのような補強さｎ
たワクチンのルーチン使用は不可能であるのが現状であ
る。

２、ＮＯ性ワクチン 経口投与さｔた死菌ワクチンは、局所小腸の抗ビブリオ
抗体の出現を促す（Ｆｒｅｔｅｒ＋　Ｒ，Ｊ、　Ｉｎｆ
ｅｃｔ。

胆、す、１．３７（１９７２）　＊　Ｆｒａｔａｒ、　
Ｒ，ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

９１、７２４　（１９６３）　：　Ｇａｎｇｕｌｙ、　
Ｒ，ａｔ　ａｌ、　Ｂｕｌｌ、　Ｗｌｄ、　Ｈｌｔｈ。

喰、す、　ａｚａ（ｔ９７ｓ））、その他の研究者達は
現在ノワクチンの有効性を示しているが、ワクチン投与
を受けた多くの人々は、病原のビブリオが入シ込むと下
痢を起こすのである（　Ｃａｇｂｖ　Ｒ，Ａ、　ａｔ　
ａｌ、　Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉａ、　１３０．３２５（１９７４
）：ｌ。

トキソイド コレラを防御する為の抗毒素性抗体を促す免役剤には以
丁のものがある、 υ　ホルムアルデヒド処理のコレラトキソイド２）グル
メルアルデヒド処理のコレラドキンイド ３）　１ｎｊｌ製Ｂサブユニツト ４）７’ｏ：＋レラゲノイド（ホルムアルデヒド処理を
したもの、又はそうでないもの） １、　ホルムアルデヒド処理のコレラトキソイドｉｎ　
ｖｉｔｒｏ　’″ｒ：稽製コレラ毒累をホルムアルデヒ
ド処理することは、毒性を除去することであシ、その結
、果として、生物学的に毒素の活性を殆んど持たないが
動物の非経口性免疫に沿った抗毒素性抗体を刺激するト
キソイドとなる。しかし同型の最初のトキソイドを猿や
人に非経口ワクチンとして投与すると、このトキソイド
は一部毒性を持つようになシ、接種部位に副作用を示し
た（　Ｎｏｒｔｈｒｕｐ＊Ｒ，Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ
、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｇ、　１２５．４７１　（１
９７２）〕。アルミニウム補強でホルマリン処理のコレ
ラトキソイドは、授乳期の母ｉｔ−含むパンクラディシ
ュのボランティアに非経口投与されたが、このワクチン
の試用では、前述のエラなことは起こらなかった（Ｍａ
ｒｇｏｎｗＭ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　Ｉ
＃　９３１（１９８０）］　。ククリソの存在下で調整
さ扛たホルマリン処理のコレラトキソイドも又非経口で
投与さｎ７’ｃが、このワクチンの有効性の証明はでき
なかった（　Ｏｈｔｏｍｏ、　Ｎ−Ｉｎ　Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２　ｔｈ　Ｊｏｌｎｔ　
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｃｈｏｌｅｒａ。

Ｕ−８，−Ｊａｐａｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ、　５ａ
ｐｐｏｒ。

（Ｆｕｋｕｍｉ　Ｈ，＊　Ｚｉｎｎａｋａ　ｙ、＃　ａ
ｄｓ、〕ｐｐ、　２８６−２９６（１９７す；ＮｏｒＬ
ｋｉ　＊　Ｈ，Ｉｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔ
ｈｅ　１２　ｔｈ　Ｊｏｉｎｔ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
　ｏｎＣｈｏｌｅｒａｓ　Ｕ、　Ｓ、−Ｊａｐａｎ　Ｃ
ｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｓｎｅ
ｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ。

５ａｐｐｏｒｏ　（Ｆｕｋｕｍｉ　Ｈ，ｅ　Ｚｉｎｎａ
ｋａ　ｙ、＊　ｅｄｓ、　）　ｐｐ　３０２−３１０（
１９７６）〕。

２、　グルタルアルデヒド処理のコレラトキソイド生体
内の抗原を基本的に汚染することのないグルタルアルデ
ヒド処理のコレラドキンイドの大規模な調整力法が開発
された［　Ｒａｐｐａｐｏｒｔ、　Ｅ、　Ｓ、　ａｔ　
ａｌ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　１４．６８７（１９７
６）〕。この抗原は抗毒素性免疫のみの防御の役割を純
粋な方法で評価するために使用されることが望ましく、
非経口ワクチンとして大規模な試用が１９７４年にパン
クラディシュで行われた（　Ｃｕｒｌｉｎｇ　Ｇ、　ａ
ｔ　ａｌ、　Ｉｎ　Ｐｒｏｅａｅｄｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ
　１１　ｔｈ　Ｊｏｉｎｔ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏ
ｎ　Ｃｈｏｌｅｒａ＋　Ｕ、　Ｓ、　−ＪａｐａｎＣｏ
ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ
　Ｐｒｏｇｒａｍ＋ＰＰ−、３１４−３２９，ＮｅｗＱ
ｒｌｅａｎｇｓ　（１９７５）　］。このトキ／（）’
！！、／（ン／　ラデイシュにおける被投与者において
は循環抗毒素の力価を高めた。ＥＩ　Ｔｏｒ　Ｉｎａｂ
ａ　ｌ　ＥＩ　Ｔｏｒ　’Ｏｇａｗａの２種のコレラは
当地域に猛威をふるったが、ワクチンの有効性全評価す
ることができた。防御効果（ま唯一つの年令層にのみあ
られｎ、稲葉型力を派行している時期に限られた。非経
口ワクチンとしてのみ投与されたグルタルアルデヒド処
理のコレラドキンイドは防御効果は殆んどなく、非経口
性死菌ワクチンの被投与者に比較してかなり劣って〜・
た。

経口ワクチンとしてのグルタルアルデヒド処理さ：ｒｔ
ｆｃコレラトキソイドの使用は、腸の抗毒素を刺撤する
ことから工９効果的ではなＩｖ）力島と（１う仮定に基
づき、現在も研究が進めゆれて〜・る（Ｌｅｖｉｎｅ。

Ｍ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｒａｎｇ　Ｒｏ　、　Ｓ
ｏｃ、　Ｔｒｏ　、　Ｍａｄ、　Ｈｙｇ、　７３．３（
１９７９Ｊ）。

ボランティアの２グループを対象に腸ｖｔヲ通して小腸
の内腔に直接トキソイドを１ダ月間隔で各々２．０ダを
３回、８．Ｏダｔ３回投与し免役性を与えた。ワクチン
を受けたものと、免役性を与えら扛ないコントロールグ
ループは実験として行われたコレラ研究に８加した。コ
ントロールグループと比較するとワクチン受容者のいす
ｎもが、発病率や下痢−を巌癒する顕著な結果を示さな
かった。経ログルメルアルデヒド処理のコレラドキンイ
ドの有効性の欠如は、ＧＭＩガングリオシドと結合する
Ｂサブユニットの能力がグルタルアルデヒドでトキソイ
ド化する結果として感じることに起因するように思われ
る。

３、　精製サブユニット コレラエンテロトキシンは、Ａ、Ｂとよばｎる２つのサ
ブユニットから構成される。Ａサブユニットは分藝物を
促す酵素的変化を与えるが、毒性のＢ？プユニットは腸
の上皮細胞上の毒素（Ｇｉｖ１１ガングリオシド）受容
器と粘びつく完投抗原性の部分である（　Ｈｏ１ｍｇｒ
ｅｎ伊ｓＬ　Ｎａｔｕｒｅ　２９２．４１３（１９８１
、））。

パンクラディシュの人々に経口或は非経口的に投与した
′！＃製Ｂｔプユニットは、腸液中でＳＩｇ　Ａ抗毒素
の出現を促し、コレラ風土病池域における完投学的起爆
剤となるものでろる（　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　ａ
−Ｍ。

ａｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　！、　３０５（１９８２
〕〕。

抗毒素性免疫を促すためのＢサブユニット経口性ワクチ
ンの最大の利点は、完全に安全であること（トキソイド
と共に存在している４汗でも再び毒素になることはない
）や、腸細胞上の毒素受容器に粘着する能力を持つこと
等である。しかし動物実験では、抗毒素を促す点におい
ては本来備っているオロトキシンより効力の劣ることが
示されｆＣ（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｎ、　ｐ、ｌ　５ｕｐｒ
ａｅ　（１９８２月。

’４１＃８サブユニットが、例えばｄ口元ビブリオ−と
共に経口複合ワクチンとして使用されれば、抗毒素性及
び抗バクテリア性の抗体形成を促丁ことが考えりれる◇ ４、　プロコレラゲノイド プロコレラゲメイドは分子量が約１．０００，０００の
超分子のトキソイドでメジ、コレラエンテロトキシンを
最低５分間６５℃で熱処理して得られる［　Ｆｉｎｌｏ
ｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｒ，Ａ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉ
ｙｎｍｕｎｏｌ、　１０７．１０４３（１９７す］０又
、これは生物学的毒性の１６性が、コレラエンテロトキ
シンの毒素の５％以下しかもたぬ免役抗原である。熱処
理時間が例えば２５分という長時間の場合には、生物学
的毒性も少７エいものが得らｎる（　Ｇｅｒｍａｎｉｅ
ｒ＋　Ｒ，ａｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ
ｌ　１３．１６９２（１９７６）コシ、又そｎを引き続
きホルムアルデヒドで処理すると残っている毒性は殆ん
ど消滅する。

でき上ったホルムアルテヒド処理グロコレラゲノイドは
、ウサギの免疫性を誘発する血清抗趨累を促進する場オ
には、本来持っていた４素と少くとも同弄の力をもって
いる。スイスのボランティアにおいては、ホルムアルデ
ヒド処理プロコレラグノイドの非経口的７エ１０　、３
０　、１０　Ｌｌ　ｍｃｇの各投与量での免役性にＬシ
もたらされる血清抗毒素の反応がみも扛だ（Ｇｅｒｍａ
ｎｉｅｒ＋　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

独、す、５．５’１２（１９７ｊ））。父、顕著な逆作
用は観桜し得なかった。

経口抗原としてのプロコレラグツイドは、ホルムアルデ
ヒド処理全しない形で投与した場合には、より免疫抗原
性を増す。犬においては、未処理プロコレラグツイドは
社ロワクチンと同様の耐性をもち、ＮａＨＣＯ３と共に
５００　ｍｃｇまでの経口投与量では下痢は起こさなく
、また、４２日間５回の５０　’Ｏｍｃｇの投与量は、
病原としてのＶ、　Ｃｈｏｌｅｒａｅ　（ｉ：経口で与
えた場合、有意な防禦を示した。５０お工び２００　ｍ
ｃｇのＮａＨＣＯ，ｆ含む投与が６人と４人の２つの成
人ボランティアグループになさ扛た力瓢各グループとも
逆作用を引きおこすことはなかった。

プロコレラグツイドは、抗バクテリア注完投を促す死ビ
ブリオ菌又は適切な抗原と共に使用す扛ば、プロコレラ
グツイドが引き出す抗毒素の兄役注が工９高めらｎると
考えることができよう。

混什ワクチン 生きていない経口コレラワクテンの大きな利点は女全性
にある。抗バクテリア性及び抗梅素性免疫を共に促すた
めの、抗原の混合からなるワクチンｔ′！、以下の理由
に３いて最もふされしいものとｄえよう。抗毒ｇ注免疫
のみを促丁トキソイドワクチンは、人においてコレラに
対して有効的ではないように思わするが、動物において
は有効な防御全発揮する。更に、抗毒素性兎侵を促さぬ
経口或は非経口死菌ワクチンは、短期間ではあるが人に
おいて有意な訪帥効果を発揮する。加えて抗毒素性、抗
バクテリア性免疫を共に促す本来の毒素又はコレラ４素
にリポポリサッカライドを加えた様な抗原の組合せは、
相助の防御作用効果をもたらす。

多くの混合ワクチンを使用して２つの研究が長期間にわ
たり行われてきた。１つは、グルタルアルデヒド処理の
コレラトキソイド（４週間。１週間に２ダ）及び死菌化
したＥＩ　Ｔｏｒ　Ｉｎａｂａ型ビブリオ菌（４週間。

２週ＩＨ１あたタ１６１０個ビブリオ蕗）を投与された
９人のボランティアが、投与１ケ月後に病原としてＥＩ
　Ｔｏｒ　Ｉｎａｂａビブリオ菌２　ｉ　ｏａ個投与さ
れた。父、コントロールとして６人の免疫を持たないも
のにも同様に行った。ｆ荊は９人中２人に、又６人中４
人（ワクチン有効性６７％うにみらＩＬｌその症状は投
与群中の２人は軽い症状でアラた。更にこの観察結果で
注目すべきことは、９人の投与群中にお′いては２人の
み、６人のコントロール群では全員において便中からＶ
、　ｃｈｏｌｅｒａｓが直接培養さｎたのである。この
ことは、兜没学的機構がビブリオ菌の増殖を妨げたこと
を意味している。

と＜　最近Ｂサブユニットと死丙ワクチンの混合を、ワ
クチン有効性テストに参加した成人ボランティアに３回
投与を行った。この混合ワクチンは、０．１４．２８日
に与えろ扛た。３回投与をしたワクチンは、各々０．５
　ｍ９のＢサブユニットと２×１０１１　個の死菌化Ｖ
、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　（内訳は５　Ｘ　１０１’ｃｌ
ａｓｓｉｃａｌ　Ｉｎａｂ＋　５　Ｘ　１０”°　ｃｌ
ａｓｓｉｃａｌ　Ｏｇａｗａと、Ｉ　Ｘ　１０”ＩＥＩ
　Ｔｏｒ　Ｉｎａｂａである）を含んでいた。

この混合ワクチンで免疫を与えら扛た１１人のボランテ
ィアのグループは、最終投与の１ダ月後に、７人のボラ
ンティアによるコントロールグループと共に、病原とし
てのＥＩ　Ｔｏｒ　Ｉｎａｂａ型Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａ
ｅが１０６個与えられた。下痢は７人中全員、１１１人
中４のみが起仁しくＰ＝０．０１）、その４人の下痢の
症状は明らかに軽度でめった。

以上から紅ロトキソイドと死菌ワクチンの混合の研兄結
釆は、有効率を示してはいるがそのワクチンの防御効率
は良くも悪くもな（（５５−６５％）、防御効果をひき
おこすためには多量の投与が必要である。

弱毒化Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅワク−チンｃｌａｓｓｉ
ｃａｌ及びＥＩ　Ｔｏｒ型コレラの臨床的感染は、化ア
メリカのボランティアで少くとも３年間防御効果の高い
免疫性を促した（　Ｃａ５ｈ、　Ｒ，Ａ、　ａｔ　ａｌ
−＊」↓（１９７４〕：　Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｍ、　Ｍ、
　ａｔ　ａｌ、＋　ｆｌｕｐｒｌｋ　（１９７９）　：
Ｌｅｖｉｎｅ＋　Ｍ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、＋　”　ｖ
ｏｌｕｎｔｅｅｒｓ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｄｅｖ＠
ｌｏｐｍｅｎｔｏｆ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｇａｉｎｓ
ｔ　ｃｈｏｌｅｒａ　ａｎｄ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇ
ｅｎｉｃ　＆ｃｈｅｒｉｃｈｉａＪ、　Ｈｏｌｍｇｒｅ
ｎ、　Ｍ、　Ｍｅｒａｏｎ＋　ａｎｄ　Ｒ，Ｍｏ１ｌｂ
ｙ、　ｅｄｓ＋）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ａｍｓｔｅｒｄａｍ＋　ｐｐ、　４４３−４５９　（１
９８１）　：　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｍ、　Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｇ、　１４
３．８１８（１９８１））。ボランティアでの観察ｔも
とに、コレラの免疫学的制御に対して最も期待でさるも
のは、経口ワクチンとして使用される弱樟化された非毒
素産生性のＶ、　ｃｈｏｌａｒａｅ株を用いることであ
るかも知れない。

１、野生株 インド及びブラジルの環境源から分離さｎた非毒素産生
性のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ　０１株は、免疫性の期待
に反した結果をもつ人々に対して有効なワクチンと評価
さ扛ている。このような株はヒトの腸内に潜伏すること
ができないか、或はできても極く僅かであろう。ｖｉｂ
ｒｏｃｉｄａｌ抗体の反応は僅かであり、防御効果をも
つことができなかったＣ　Ｃａ５ｈｓ　Ｒ−Ａ−ｅｔａ
ｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　１０．７６２（
１９７４）　：　Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｍ、　Ｍ、　ｅｔａ
ｌ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｇ、　１４５．２９
６　（１９８２）〕ｏこれらの株の多くは、放射活性Ｄ
ＮＡ調査での雑′ｐＪ合成、ｃシ毒素遺伝子が欠損して
いるようである［　Ｋａｐｅｒ、　Ｊ。

Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　
３２．６６１（１９８１〕〕。

２、　突然変異による弱毒化法 Ｃ１ａｓｓｉｃａｌ　Ｉｎａｂａ　５６９　Ｂは、ニト
ロソグアニド（ＮＴＧ）で突然変異を起し、低褐素産生
性の変異株が分離する（　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、　
Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ。

１２９、１１７（１９７４）　：　Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｒ
，Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

ハ二畦、む、　５５１（１９７５））。この突然変異株
Ｍ１３をボランティア２に投与した。この株は潜入しに
くいので下痢は起らなかった。多量投与により免役がで
き、そのために防御効果が得らｎることを多くの研究が
示唆している（Ｗｏｏｄｖａｒｄ、　Ｅ、　ａｔ　ａｌ
、　Ｄｅｖｅｌｏｐ。

Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄ、　３３．１０８（１０８（１
９７６））ｏＥＩＴｏｒＯ３０８３もまた突然変異によ
ってできたものである（　Ｍｏｎｍ５’ｒ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　
７６、２０５２（１９７９月。

一つの又利子もの株の選択及び分析を行い、Ａサブユニ
ット又はホロトキシンを生成することは不可能だが、免
疫抗原性ｔもつＢサブユニツ）１−生成する１つの分離
株ｔｎ″シだした。この分離株Ｔ＋ｅｘａｓ　５ｔａｒ
　−８Ｒは、上述のようにＢサブユニットを通常量又は
増量に生成するが、ホロトキシン活性又はＡサブユニッ
ト活性の検査では陰性を示す。

Ｔｅｘａｓ　５ｔａｒ−８Ｒは広範囲にわ７ｃ　Ｄ　、
ボランティアで定量されている（　Ｌｅｖｉｎｅ＋　ｉ
Ａ、　Ｍ、　ａｔ　ａｌ、　Ａｃｕｔｅ　Ｅｎｔ＠ｒｉ
ｃｓｓｕｐｒａ　（１９８１）参照〕。５人かｒ−）１
４人のボランティアから成るグループに１０６かり５　
Ｘ　１０”個のＴｅｘｔｓ　５ｔａｒ−８ｎ生体ｔ１回
投与した。その他の８人のボランティアには１週間につ
きｌＯ＠個を２週間投与し、更に別の１８人のボランテ
ィアには１週間につき２Ｘ１０”６個を２週間投与した
。下剤を起したのは６８人中１６人であった（２４％ン
。

そのうちの１人におけるトータルの便ｔはｉ、　ｏ　ｔ
を超えていた（１４６ｔｄ）。典型的なワクチン誘引性
下痢は便総量が４００−以下の２〜３回の少量の下痢便
である。ワクチン生体はワクチン受容者の約半分に便の
培養からあうわｎた。１０８以上のワクチン生体を投与
さｎた入の全腸液の培養したところ、４６人の被投与者
中３５人が剛性であった（７６％）。何百ものＴｅｘａ
ｓ　５ｔａｒ　のクローンは便培養や全腸液培養で回復
したが、コレラノ・ロトキシン用の高感度Ｙ−１副腎細
胞検査を行ったが、闇性はいなかった。

血清抗毒素は、有意な上昇はワクチン被投与者の２９％
にのみみらｎたが、血清ｖｉｂｒｉｏｃｉｄａｌ抗体の
有意な上昇が９３％であり、その力価は、病原としての
Ｖ、ｃｈｏｌａｒａｅ　Ｋニジ起因する感染症の場合で
の力価とはｌヨ同じである。ボランティアによる実験的
研究で、Ｔｅｘａ＠５ｔａｒ−８ＲはＥＩ　Ｔｏｒ　Ｏ
ｇａｗａ型とＥＩＴｏｒ　Ｉｎａｂａ型ビブリオ菌に対
して有意な防御効果ｔ与えることが判明した。Ｔｅｘａ
ｓ　５ｔａｒ　−Ｓ　Ｒ弱毒化経ロワクチンの１回又は
２回の投与はＥＩ　Ｔｏｒ型コレラに対して良い防御効
果を示す。

弱毒化法は、コレラに対する感染症誘導免疫をまねるの
で、その使用には個々の利点があるのは明らかである。

しかしＴｅｘａｓ　５ｔａｒ　−Ｓ　Ｒ株には疑う余地
ない障害がある。はじめにニトロソグアニジン等を使用
する突然変異法が、必ずしも全部が確認できないような
複数の変異種ｔつくり出すのである。その他に、Ｔｅ：
ｃａｓ　５ｔａｒ−８Ｒの弱毒化？担うと思わ扛る正確
な遺伝子的欠損が未だ判明していない。更に、Ｔｅｘａ
ｓ　５ｔａｒ　−Ｓ　Ｒは、ニトロングアニジンにより
突然変異を起こした他の病原のように、毒性を再び取り
戻す可能性がある。

今回の発明の申請者は、ボランティアにおいて完投性と
疾病をもたらすことで知られるＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ
の毒性法の遺伝子が欠如した変異株を、ｌ＠新な方法で
陶体することに成功した。遺伝子欠如は制限エンドヌク
レアーゼの７ラグメントである。今回の発明のワクチン
株は、免役に必要な他の要素に影響することなく、組換
型ＤＮＡテクニックを用いて無毒化したものである。こ
の弱毒化は毒素遺伝子のようなコレラ毒性を担う遺伝子
を特に欠如でせる為に、バクテリアの遺伝子の特別な部
位を、制限エンドヌクレアーゼを使用して開裂させ生成
させたものである。毒素遺伝子にもつプラスミドは、毒
素遺伝子を欠如させるために制限エンドヌクレアーゼで
分解さ扛た。しかしＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅの染色体側
面にあるＤＮＡの広がっている長さ？保持するために、
再び組み立てら扛てしまう。そ扛らのプラスミドを持つ
接合遺伝子のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅへの移植によって
、そのプラスミドのコピーを染色体外に有する毒性のＶ
、　ｃｈｏｌｅｒａｅが産生する。ひき続き選択性プラ
スミドマーカーの適切な選択後、他のプラスミドを生成
する細胞と、毒素部位を欠いているＶ、　ｃｈｏｌｅｒ
ａｅとの結合が起こる。そのような非毒素産生性の遺伝
子欠如変異株は小腸内に壱人し、しかもバクテリア細胞
に対して局所的防御性の免疫を促すことができるもので
ある。短期間の潜伏後、そのワクチンは、毒性で毒素産
生性のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ株による感染症に防御効
果を有するようになる。

Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　瘍累に対する遺伝子を複製し
た（Ｐｅａｒｓｏｎ＋Ｇ、　Ｄ、　Ｎ、　ａｔ　ａｌ、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　ＡｃａｃＬ　Ｓｃｉ、　７９
．２９７６　（１９８２）　：Ｋａｐｅｒ＋　Ｊ、　Ｂ
＋ｅｔ　ａｌ、　Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　Ａｂｓｔｒ＋Ａｎｎｕ。

Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒ　ｉａ
＋　３６　（１９８２）　＊　Ｋａｐｅｒ、　Ｊ、　Ｂ
。

Ｄｕｂｌｉｎ、　ＩｒｅｌａｎｃＬ　ＡｂｓｔｒａｃＬ
　Ｎｏ、　２．５　（１９８２）　〕。毎素形成遺伝子
を欠如したＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅの変異株は、染色体
に沿ったランダムな部位にまと互る変異ｄ−葵性のビブ
リオファージによってのみ分離することができるのであ
る（　Ｍｅｋａｌａｎｏａ＋　Ｊ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　７９．１５１（１９８２））。Ｖ、　ｃｈｏ
ｌｅｒａｅ内での組換え報告はあるが、ワクチン投与全
目的とする素形遺伝子欠如の制限フラグメン［−分離す
ることには適用できない（Ｐａｒｋｅｒ、　Ｃ，ａｔ　
ａｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１１２＋　７０７１１３２
　（１９８１）　：　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｓｏｎ、　Ｊ、
　Ａ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａａｔ。

燻り、　３７４（１９８１）］。

発明の概説 Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅの培養株は無毒性で、かつ宿主
である動物の腸内に潜伏することのできるＤＮＡ欠損の
Ｉｌｌ　限エンドヌクレアーゼフラグメントを有するＶ
、　ｃｈｏｌｅｒａｅ株である。遺伝子欠如の変異株を
分離する１つは、Ａｃｃ工制限エンドヌクレアーゼによ
って定義されるよう毒素遺伝子中の欠如を包囲する。

Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅの遺伝子欠如変異株を分離する
方法は以下に順序だてて説明する。

（ａ）　１つ又はそれ以上の欠如をもつ制限エンドヌク
レアーゼフラグメントを有するＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ
側鎖と、そのフラグメントｉ有する連鎖を結びつけた外
部由来の選択性マーカーとしての遺伝子を含む最初のプ
ラスミド全組み立てる。上述の連鎖群は、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏで再組換え促進することができる十分な長さをもった
ものが必要である。

（ｂ）　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅの毒性法と上述のプラ
スミドをもつ微生物とを結合させる。

（ｃ）　上述の選択性マーカーを表すＶ−ｃｈｏｌｅｒ
ａｓ　ｆ選ぶ。

［ｄ）　（ｃ）の段階で選択さｔたものと、２番目の選
択性マーカーをもつ２４目のプラスミドを有する微生物
とを結合させる。ここで言う第２のプラスミドとは、最
初のプラスミドとは別個のものである。

（、）　最初の選択性マーカーと２番目の選択性マーカ
ーを表現しているＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅを選ぶ。この
発明におけるＶ、　ｃｈｏｌａｒａｅ遺伝子欠損変異株
は、コレラに対するワクチンとして投与するのに有用で
おる。

今回の発明で、ＣＶＤｌ０Ｉと呼ば扛るＶ、ｃｈｏｌｅ
ｒａｅ株は、人において、同種の血清型をもつ株による
感染症に対して大体１００％近くの有効性を与える。

今回の発明の原理は、Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅワクチン
株を、免役性に関して必要な他の要素に影響することな
く無毒性化する為の組換ＤＮＡの技術を駆使して変形し
、分離することである。この弱毒化１、コレラ毒素又は
それについての部分の遺伝コート°ヲ指定すＺ遺伝子を
欠損させる為に、適切なＶ、ａｈＯ１＠…連鎖を運ぶプ
ラスミドを制限エンドヌクレアーゼで分解することによ
り成し遂げたものである。毒性のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａ
ｅとｉｎ　ｖｉｖｏで再結合するものを選んだ後に、分
解されたプラスミド°ヲ移す接合性遺伝子は、毒素遺伝
子又はそれに類するものがな〜・株にする。今回の発明
は、毒性のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅのそれ以外の欠損部
位をもつ変異株の分離又はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞
中に再誘発をおこす欠損鎖の一部又は全部をもつ株の分
離に対しても応用できると考えられる。

そのワクチンとして最初のものは、毒素産生性のＶ、　
ｃｈｏｌｅｒａｅ株Ｎ１６９６１であった。そｎｅｔボ
ランティアにおいて、典型的な下痢の症状と感染症に対
して、強い防御効果をもつ免役性を呈した（　Ｌｅｖｉ
ｎｅ＋　Ｍ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｃｕｔｅ　ｅ
ｎｔｓｒｉｃ、　ｇｕｐｒ＆＋　１９８１　）　ＯＶ、
　ｃｈｏｌｅｒａ＠ｆ　、熱に不安定なエンテロトキシ
ン遺伝子プローブであるＥ、　ｅｏｌｉでｌｌ：ｉｎｄ
　１分解したのｔ確認してから、コレラ毒性を産生じて
（−ると思われるバクテリア中の染色体の部位をプラス
ミドのクローン化媒体であるｐＢＲ３２５中で増殖した
（　Ｋａｐｅｒ、　ａｔ　ａｌ、　Ａｍｅｒ、　５ｏｅ
−＊　ａｕｐｒａ、　Ｋａｐａｒ　ａｔ　ａｌ、　Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ。

ヨユ）　ＯＶ、　ｏｈｏｌｅｒａｅの染色体フラグメン
トは、毒素産生に必要なすべての遺伝子を含んでいるよ
うである。次にこの染色体゛部位を分析し、毒素遺伝子
を含む正確な位置づけを図で示した（　Ｋａｐｅｒ、　
Ｊ、　Ｂ。

＠ｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　１．１１６２（１９８１
ン〕。その様な遺伝子を含むＤＮＡフラグメントや、結
紮によシ挿入さｔた、列えばアンピシリンに耐性等のよ
うな選択性のあるマーカーを有するＤ　Ｎ　Ａフオグメ
ントを切断するために、制限酵素が使用される。このア
ンピシリン耐性遺伝子や、外側にあるビブリオＤＮＡは
、Ｅ、　ｃｏｌｉからＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅに移され
るｐＲＫ２９０の誘導中で増殖する。その結果のプラス
ミドであるｐＪＢＫ５５は、接合によｊ）　ｆ２．ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　−１２からＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅＮ　１６
９６１に移さｎる。

その結果の株Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ　Ｎ　１６９６１
　（ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５５　）（Ａｐｒ）は、その染色
体中には未だ影響を受けていない毒素遺伝子の部位をも
ち、染色体外においては毒素遺伝子が欠損している部位
に、替わりにアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミ
ドがある（図１参照）。１０＠のうち、１から１０’の
うちの１の低頻度で、染色体の毒素遺伝子と、染色体外
（プラスミド〕のアンピシリン耐性遺伝子が交換したり
父差したシする。又、ｉｎ　ｖｉｖｏでは染色体の毒素
遺伝子が、耐性遺伝子を含むＤＮＡ部位と換わるので組
み換えが起きるのである（図２）。稀に起こる反応は、
挿入さｎる不和合１性のプラスミドに対して起こるもの
で、それが起こる細胞１つ＼ づつに対して検査を行った。又、その細胞は、変異を起
こしたものと起こさないものを混合させて試し友もので
ある（　Ｒｕｖ）ｃｕｎ＊　Ｇ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、
　Ｎａｔｕｒｅ　２８９゜８５（１９８１ル。プラスミ
ドはＡからＷまでのグループに分類さ扛、各グループを
構成するものは互いに共存することができない。例えば
Ｐグループの不ａ合性のプラスミドは、Ｐグループの他
のプラスミド（ＩｎｃＰ）のａ胞中に安定して存在する
こトカできない。スルホンアミド類に抵抗力のあるＲ７
０２のようなＩｎｃ　Ｐプラス・ミドはＰＲＫ２９０゜
ｐＪＢＫ４５．又はｐＪＢＫ５５のような他のＩｎｃ　
Ｐプラスミドの細胞中に存在することができな（１ので
ある。七ｎ故に８７０２は、菌株中の、例えばｐＪＢＫ
５５のような染色体外のプラスミド中ではなく、染色体
のアンピシリン耐性部位に乗シ換えを起して安定をはか
るのである。スルボンアミド耐性のＩｎｃ　Ｐ　Ｒ７０
２ｋ含むＥ、　ｃｏｌｉ株とアンピシリン耐性のｐＪＢ
Ｋｓｓｌ含むＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ株を結合させｆｃ
凱　アンピシリン及びスルホンアミドの両者に耐性のあ
るｖｏｃｈｌｅｒａｅを選択しｆｃシして、スルホンア
ミド耐性がｐＲ７０２によって染色体外で成９立ち、ア
ンピシリン耐性は、毒素遺伝子と置換した後、染色体内
に成立することになる（図３）。Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａ
ｅ　Ｊ　Ｂ　１（５６と呼ば扛る上述のような株は、毒
素形成テストを行った結果、非毒素産生性のものである
ことが判明した。

ワクチン株の最終変形物ＪＢＫ７０は、治療力のある有
用な抗生＄１であるアンピシリンに対する耐性を水銀耐
性に変えて生成したものである。

この置換は、ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５５のアンピシリン耐性
遺伝子を直接的に水銀耐性の遺伝子とさじがえて行った
もので、その結果、アンピシリン耐性ヲ不活化し、水銀
耐性を与えることになる。それにょってできたグラスミ
ドｐＪＥＫ６６もまたＲ７０２と不和会性であシ、Ｖ、
　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５６に変化するもの
でろる。水銀耐性が染色体に組み込ま扛た変異種は、Ｉ
ｎｃ　Ｐプラスミド８７０２に一使用して分離し、アン
ピシリンに感度があり、水銀耐性。

スルホンアミド耐性のＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅである。

自然発生的な誘導物はｐＲ７０２’ｉ取り除くことに使
用さｎる。最終の変異株でろるＪＢＫ７０は、非毒素産
生性の水銀のみに耐性をもつ。

ワクチン株Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　７０
は、Ｉｎａｂａ　血清型の一種である。その他のほとん
どのＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｓはＯｇａｗａ血清型である
。１つの血清型のワクチンは、他の血清型に対して防御
するらしい（ロ）。以前に疾病と防御効果を示した生ワ
クチン株はこれと異なり、Ｏｇａｗａ血清型株Ｅ７９４
６から調整されたも番 のである（　Ｌｅｖｉｎｅ＋　Ｍ、　ｆｉｉ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ａｃｕｔｅ　ｅｎｔｅｒｉｃ＋　５ｕｐｒａ（
１９８１）　］　ｏＶ、ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｉｎａｂａ
　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５６の抹中に起こる突然変異は、Ｖ、　
ｃｈｏｌｅｒａｅ　（Ｄ性因子であるＰの仲介による遺
伝子組み換え？通して、ＪＢＫ５６中の毒素遺伝子の替
りのアンピシリン耐性を含む染色体部位’１Ｅ７９４６
に直接移植することにニジ、Ｒ７９４６株にも起こるの
である（　Ｐａｒｋｅｒ、　Ｃ。

ｅｔ　ｈｌｌｍ　５ｕｐｒａ　）　。Ｉｎｃ　Ｐグラス
ミドと異なるＰ因子は、ＪＢＫ５６に移植され、リフア
ンピン耐性変異株Ｆ、７．９４６と結合する。アンピシ
リンとりファンヒンノ両者に耐性のある変異株ヲ作るこ
トニよシ、宿木遺伝子を光合に欠いたＯｇａｔｒａ血清
型をも’：）’７クチン株を生成したことになる。

着し抗バ′クチリア性完投が防御作用に対して不十分で
ｈｎば、コレラ毒素のＡでなくＢＴブユニット遺伝子を
加えることによって、抗毒性の要素を増してやわば工い
。これは、Ｂサブユニット遺伝子を病原媒介物ｐＭｓ９
に移植することで達成できる。その結果でき上ったプラ
スミドは、ハイレベルのＢｔプユニソｌｔ−生成する。

又、それはＡサプユニットヲ生成することができない弱
毒化さｎｆｃワクチン株Ｊ　Ｂ　Ｋ　７０　（ｐＪＢＫ
５１　）ｆｒ作成するために、無毒性ワクチン株Ｖ、　
ｃｈｏｌｅｒａｓ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　７０に差し込まれる。

今回の発明のワクチン株は、特にＩｎａｂａ　血清型を
有するＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｎ　１６９６１から得
たものである。

他の株又は他の生物型や血清型のものは、禅素遺伝子父
はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ染色体に沿った他の部位を欠
いたワクチン株を生成するために、Ｎ１６９６１の代用
として用いることが可能であると考えられる。

その様なワクチン株を分離する目的は、この申請書中で
述べているようにコレラに対する予防ワクチンとして、
毒性株の変異誘発が大きな可能性を秘めているからであ
る。

例えば申請者は２つの復製毒素遺伝子中のほとんどのＡ
サブユニットの欠如を特敵とする他のＶ、　ｃｈｏｌｅ
ｒａｅワクチン株Ｃ１／Ｄ１０１全生成した。母株３９
５　カ１００％の有効性を示すことからこのｃｖ’ｕｉ
ｏｉも１００％の有効性をもつものと考えられる。

ＣＶＤｌ０Ｉの生成にオイて、ＣＶｉ）１０１が技術？
必要とする耐性遺伝子ではなかったという事実を除けば
、ＪＢＫの作成等全記載している５ｕｐｒａ　Ｋ記さｎ
ている原理に従って行った。１ｎｖｉｖｏでの２番目及
び最後の組み換え型を淘汰する最終手順は、例えばテト
ラサイタリン等の抗生物質に対する感受性を調べる技術
が必要であるが、母株はテトラ丈イクリン耐性遺伝子Ｃ
Ｔ中のＡ遺伝子の部位に挿入するのである。そのような
抗生物質に対する感受性は、任意マーカーのもう一つの
例であると考えろ扛る。

ワクチン株の生成は様々な方法で行うことが可能である
。方法を以下に示す。Ｖｉｂｒｉｏ　ｅｈｏｌｅｒａｅ
　ｆ保存培養から脳／心臓浸水寒天（Ｂｉ−ＩＩＡ）に
継代培養し、３７℃で一晩繁殖させる。群及び型特異的
抗血清を用いて同一性をテストし、２０から３０のコロ
ニーはＢｆ（Ｉスープに浮遊させる。ブレインキュベー
ションされｇＢ　ＨＩ　Ａ７’レー）　ｉ　Ｂ）ｉＩ懸
濁液と共に接種する。５〜６時間のインキュベーション
後、各プレートはＰＨ７，２±０．１の緩衝化無菌生４
！食塩水Ｓｍｔを用いて採取する。採取さｔた有機物ｉ
、７５（ｌで１０分間低温にて遠心分離し、元の量の４
倍となるよう２回懸濁と水洗を繰り返す。その懸濁液を
分晃光度計で測り、ワクチン投与に必要な微生物の数（
約１０＠、これはボランティアの研究結果によるもので
ある〕に希釈する。最終的な接種物は投与前にダラム株
でテストさ扛、同−源の抗血清の凝果を検査する。

今回の発明のＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、経
口で投与され得るものである。２ｇのＮａＨＣＯｓは５
方ンスの精製水で帛屏させ、この溶液４オンス全ボラン
テイアに服用させる。１分後に、残りの１オンスのＮａ
ＨＣＯｓ液にビブリオ菌全混入したものを服用させる。

ボランティアは、接種の前後９０分はＮＰＯである。

安全性については、そのワクチン株は、疾病をひき起こ
す毒素産生能（例えば元のコレラ毒素を生成するような
）を再び有することは無いと推測される。４素をテスト
する２つの検査法は、Ｙ−１副腎細胞検ｉ　（５ａｃｋ
＋　Ｄ、　Ａ、　ａｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ
ｍｕｎ、　ＩＬ３３４（１９７５）　〕と酵素連結イム
ノソルベント検査（ＥＬＩＳＡ　）　（５ａｃｋ、　Ｄ
、　Ａ、　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ
、　ＩＬ　３５（１９８０）　）である。そのワクチン
株（ＪＢＫ７０）は、それら２検査を繰返し行った結果
、いかなる場合においても陰性であった。しかしそれ以
上に重要なものは、毒素遺伝子の存在をみる遺伝子検量
である。コレラ毒素遺伝子のＤＮＡを放射活性物でラベ
ルし、その株中の他のコレラ毒素遺伝子の同一性を確か
める。この方法は５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、　Ｊ
。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏ、　９８．５０３（１９７５）による
ものである。この方法で検量したところ、この発明で述
べているワクチン株は、コレラ毒素全作り出す疑われる
様な遺伝子物質をゼしていなかった。Ｂａ５ｅｌｓｋｉ
、　Ｖ、　ｅｔａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、
　１５．７０４（１９７７）によると、乳児マウス全モ
デルとしたワクチンテストが試行さｎてい□る。１０回
繰シ返して行った一連の病原菌培養後、疾病の証拠とな
る水分の蓄積がみもれなかった□し、又、期待通、９Ｊ
ＢＫ７０は乳児マウスの腸内に潜伏していた。

次に示す例の中の技術・反応・分離力法は各分野におい
ては広く知られているものである。総ての酵素は市販δ
れてお９、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂａ　
−Ｂｅｖａｒｌｙ＋　ｆｖｌａｓｇａｃｈｕｓｅｔｔｓ
　：　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖａ　Ｂｅｓｅａｒｃｈ
−Ｗｍｌｔｈａｍ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　：　Ｍｉ１１！１１　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−−ＥｌｋｈａｒＬ　Ｉｎｄｉ
ａｎａ　：Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｃ
ａｌｓ　Ｉｎｃ、　−−Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｍ、　
Ｉｎｄｉａｎａ　：　ａｎｄＢｅＬｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−−Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ＋等から得たものである。酵
素による分解を制約するバッファーや反応条件は、各酵
素のメーカーから与えられた忠告に従った。制限酵素の
部分分解では、客酵素のバッチの予備実験から得られた
酵素の濃度を用いて行われる。その他の酵素反応、ゲル
電気泳動法での分離、Ｅ、　ｃｏｌｔＯ形寅変化などの
標準的方法論はＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　Ｖｏｌｕｍｅ　６８．　Ｒａｙ　Ｗｕ＋ｅｄｉ
ｔｏｒ＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７９
）でみつけることができるかも知れない。もう一つの標
準的参考文献はＭａｎｉａｔｅｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）である。バ
クテリアはＭｉｌｌｅｒ、印匹戊匣Ｗｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｇｓｎｅｔｉｃｇ＊　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２）
に記されている方法で繁殖させた。

Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅはＬｅｎｎｅｔｔ、　
Ｅ＋Ａ、　ｅｔ　ａｌ＋＋　ｅｄｇ、　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３
　ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＊　Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　（１９８０）に記されている方法ている
方法により結合させた。

この発明の株はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｋあるｔｈｅ　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎにあずけら扛ている。その株はＶ、　ｃｈｏ
ｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ５　Ｌ　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａ
ｓ　Ｊ　ＢＫ　７　（Ｌ　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ　Ｎ
１６９６１、Ｖ、ｃｈｏｌａｒａｅ　ＪＢＫ７０　（ｐ
ＪＢＫ５１　〕、Ｖ、ｃｈｏｌｅｒａｅＯｇａｗａ　３
９５とＣＩ／ＤＩＯＩであり、そｎらの登録番号は各々
３９，３１７．３９，３１８．３９，３１５　。

３９．３１６．３９，５４１．３９，５４０である。

例　１ プラスミドＪＢＫ１６は、毒素遺伝子をもつ染色体の４
　ｋｂ　Ｐａｔ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｍ　フラグメントを含
んでいる。毒素遺伝子はｉｃｅ　１部位に、ｌ：　Ｄ　
１１１１１面を攻撃されるが、内面にはｉｃｅ　ｒ部位
を含んでいる。ＪＢＫ１６はＡｃｅ　Ｉで分解さ扛、＃
累遺伝子を含むＡｃｅ■フラグメントは、そのプラスミ
ドから分離されたものである。重なって又は粘着してと
どまっているＡｃｅ　Ｉの末端はＥ、　ｃｏｌｉポリメ
ラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで満たさｔでいるこ
とにエフ、反応性が鈍くなっている（というのは、ｉｃ
ｅ　１分解後の一鎖のＤＮＡは、瞬接している末端部位
で二鎖にさｎるのであるり。アンピシリン耐性の遺伝子
はプラスミドｐＲＥＧ１５３や、上述したような充満し
ている粘着末端から精製される（ｐＲＥＧ１５３はｐＲ
ＥＧｌ　５１　（Ｗｅｉｓｓ、　Ａ、　ｅｔａｌ、　Ｊ
、　Ｂａｃｔ、　１５２．５４９−５５２〕の誘導物で
あシ、アンピシリン耐性の代わりにトリメトプリム耐性
やλｅ０８鎖の添加にエフ変形したものである）。Ａｐ
耐性遺伝子が、毒素遺伝子が欠損している場所に入シ込
むために、このフラグメントはビブリオＤＮＡに結は扛
る。その結果できたプラスミドはｐＪＢＫ２１（図４）
と称されるもので、禅素欠洛部位にＡｐ耐性遺伝子を含
んでいるものである。

例　２ ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　２１中の遺伝子欠損の染色体に挿入が
成功したか否か確認するため、ｐＪＢＫ２１からのＰａ
ｔ　−Ｂｇｌ　Ｍの各末端におよそ７，０００ｂｐのＤ
ＮＡを接続し直間−源の組換えが起こる確率は、側面の
同一連鎖の長さが増すにつｔて高くなる）。

こｒｔを行９と、約１８ｋｂの７ラグメントがＮ１６９
６１の染色体から複製された。この複製物は、ｐＪＢＫ
４４と呼ばれ、各側のおよそ４ｋｂのＤ　ｆ’Ｊ　Ａに
より、側面に４ｋｂ　Ｐｓｔ　−８ｇｌ毒素遺伝子フラ
グメントを有するようになる（図５参照）。プラスミド
ｐＪＢＫ２１はＰｓｔ　Ｉで部分的に分解さｎ、Ｐａｔ
部位の１つが切断される（もう１つのＰｓｔ部位はアン
ピシリン耐性遺伝子に含″１１′Ｌる）。更にＢｇｌｎ
で分解され毒素部位が欠損していてＡｐ耐性を含む４ｋ
ｂＰａｔ　−Ｂｇｌ　Ｉｆフラクメントが分離してくる
。約１８ｋｂピフ“リオフラグメントを含むプラスミド
ｐ　ＪＢＫ４４＆’ｊＢｇｌ　ｌで部分的に分解さＡ、
４Ｂｇｌｌｔｆｌ１位の１つが切断される。この部分的
分解は、Ｐａｔでの完全分解によシ引き継が扛るもので
、その結果生じたフラグメント乞硝製して分析する。

成るフラグメントは４ｋｂ　Ｐａｔ　−Ｂｇｌ　ｇ累フ
ラグメント以外のｐＪＢＫ４４の連鎖全すべて含んでい
ることが判明した（図５参照）。側面ＤＮＡ’ｉあられ
丁このフラグメントは、アンピシリン耐性を含むｐ　Ｊ
　Ｂ　Ｋ　２１からのＰｓｔ　−Ｂｇｌフラグメントと
混合し、結合させる。そ扛によってできたプラスミドｐ
ＪＢＫ５４は、欠損した毒素遺伝子の代わりにアンピシ
リン耐性遺伝子をもつ約１７ｋｂのビブリオ染色体を宮
んでいる。

この変形された染色体部位はＶ、　ｃｈｏｌａｒａｅ中
の７’ラスミド中で複製される。このプラスミドｐ　Ｂ
Ｋ２９０（ＤｉｔＬａ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　７７．７３４
７（１９８す〕はＰグループと共存不可能のプラスミド
に属し、ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５４が複製されるＥｃｏ　Ｒ
１部位を所有する（図６）。その結果できるプラスミド
ｐＪＢＫ５５は、粘會性プラスミドｐＲＫ２０１３ｉ１
更用してＶ、　ｃｈｏｌｅｒａ＠Ｎ　１６９６１に結合
させられ、Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｎ１６９６１（ｐ
ＪＢＫ５５バＡＰｒ）’に生成−ｆる。

例　３ ｉｎ　ｖｉｖｏでの組み換え 例で述べてきたように、接合性遺伝子の移植後、変異し
た毒素遺伝子はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅａＮ　１６９６
９１において染色体外に存在するようになる（図１参照
）。１Ｏ−６から１Ｏ−８という低頻度で、その染色体
内で同一の連鎖が対合し、交替する（図７参照）。この
↓うな稀なる現象は、染色体上の毒素遺伝子から毒素部
位を欠除したプラスミドにする。

このような曵象を選んでいくと、そのプラスミドの有す
る不和合性を促進することになる［　Ｒｕｖｋｉｎ・’
Ｊ−Ｂ−ｍ　ａｕｐｒａ　］。プラスミドは同一細胞で
安定して共存でき得る能力を基準としてＡからＷまでの
グループに分類できる。もし同一細胞内の２つのプラス
ミドの共存が安定していない場合は、これらは不和陰性
であり、同一グループに属していると考えられる。それ
らは細胞中の同一の複製機構ｔオＵ用することからその
ような不和合性が起こると仮定できる。各々のプラスミ
ドのもつ種々の抗生物質に耐性盆示す％畝を利用して選
別することも可能である。プラスミドｐＪＢＫ５５は、
ｐＲＫ２９０由米であるため不和合（Ｉｎｃ）グループ
Ｐに属する。プラスミドｉｔ　７０２もまたＩｎｃ　Ｐ
グループに属し、カナマイシン、テトラティクリン、ス
ルホンアミド、ストレプトマイシンに耐性である。

但しアンピシリンには耐性をもたない。ｐＲ７０２（Ｓ
ｎ）ｔＮ１６９６１（ｐＪＢＫ５５）（Ａｐ”）に結合
したシ、アンピシリンとスルホンアミドを共に含む培地
で淘汰することによって、ｐＲ７０２とｐＪＢＫ５５と
は不和合性であるので、アンピシリン耐性が染色体に含
まれスルホンアミド耐性がグラスミドＲ７０２に残るよ
うな細胞を作シ出した（図２参照）。でき上った株ＪＢ
Ｋ５６（図３）はアンピシリン耐性全もち、Ｙ−１副腎
則胞とＧｍＩＥＬＩＳＡＫよるテストでは毒性はないも
のであった。更に、染色体ＤＮＡが複製コレラ′１８素
（ＣＴ）遺伝子を含むＤＮＡと交雑するＷ合でも、ＪＢ
Ｋ５６は毒性がなかったことがら＃ａ累遺伝子が完全に
欠損していると考えらｎる。

Ｒ７０２上にある抗生物質耐性は、自然発生的に生じる
プラスミドをもたない誘導物を淘汰することに、Ｃり除
去された（このことが起きうる頻度は１／２０００であ
ったり。

例　４　− 例１の選択性マーカーの除去 アンピシリン耐性を除去するために、Ａｐ遺伝子のＰｓ
Ｌｄ位で仮装される１（１００から、水銀Ｃρに対して
耐性のめるｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５５の誘導物が作られ、ア
ンピシリン耐性が不活化さｎた。この誘導物’ｔｐＲ７
０２や上述のＨｇＩＬｗ　Ａｐ８＊　Ｖ、　ｃｈｏｌｅ
ｒａｅの淘汰よりできるＪＢＫ５６と結合した。最終菌
株Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　７０は、すべ
ての抗生物質テストにＭ＆度があり、水銀に対しては耐
性があり、かつ毒性のないものである。その染色体のＤ
　Ｎ　ＡはＣＴ遺伝子を含むＤ　ｒＪ　Ａとは交雑しな
かった。染色体を形成する１）ＮＡＯ不足から、ＪＢＫ
７０は、毒素遺伝子欠如、水銀耐性の挿入、アンピシリ
ン耐性遺伝子の不活性化ということを除けば、母株と変
わっていないようにみえる。毒素遺伝子は単に変異を起
したのではなく、完全に欠如されたのであるから、その
ような株は毒素産生能を再び持つことはない。

例　５ 抗毒素性免疫を与える接合性遺伝子の移植もし、バクテ
リア性完投と抗揮累性免役の相互作用が望ましいもので
あるならば、コレラ毒素のみのＢサブユニットを生成す
るためにＪＢＫ７０の誘導−＊１作ることができる。こ
の目的を達成するために、Ｂサブユニットだけを生成し
、Ａサブユニットのための遺伝子を持たない毒素誘尋物
を作シあげた（図８）。Ｂ産生遺伝子を言むｐＪＢＫ１
６からのｆ（ｐａ　ｌフラグメントは、遺伝子の片側に
ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩｆｆ１位ｔもつ媒介物であるＭ
ＢｍｐＩを複製するファージ中に組みこみ複製させた（
図８）。側面にＢａｍ）ＩＩを有するようになったこの
フラグメントは、次に非電に強力なｔｒｐ促進物を含む
ｐ　ｉＡ　Ｓ　９に組みこＩＡＮ複装された。強力な促
進物による転写のコントロールのもとで作成さ扛たＢ遺
伝子の存在は、Ｂ抗原生成を確かめ扛ば工い。複＃物を
テストすると、Ｂ抗原をもたぬものが約５０％であった
。このことは、仮装の挿入に対して２つの可能性を示し
ている。１つはＢサブユニットを生成する誘導物ｐＪＢ
Ｋ５１が、Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　７０
に精検し、母株Ｎ１６９６１よシ多くのＢ抗原を生成す
るかのようにみえることである。もう１つはλＰＬ促進
物を含む異った促進物を用いてＢのみの異性法が作られ
、そｎらがｉｎ　ｖｉｖｏで明らかに異なるものになる
のである。

例　６ 乳児マウス（２，０〜３，５り）を母親から離し、３〜
８時１０ｊ断食させた。それらの４匹に、第１８目に２
２ｇの動物用給餌針で胃に接種を施した。

この接種物はｏ、ｏ５／ｎｌ〜０．１ｍ／！ｉ中に１０
’　ＣＦ　Ｕ（コロニー形成ユニット）／マウ、’、（
７）ＪＢＫ７０でろった。また、この接種物はＢａ５ｅ
ｌｓｋｉ、　Ｖ、　ｅｔａｌ、。

ｇｕｐｒａ　で述べであるように、８１（Ｉスープ中で
調整された。この接種物は約０．０１％のエバンスブル
ー染色を含んでいる。こ牡は、接種が適切に行きわたっ
ているか腹腔を通して確認するためのものである。エバ
ンスブルー染色の添加はＪＢＫ７０の抑制を避けるため
、２日月以廃は実施しなかった。

引き続き行った接種はマウス→マクス（ＭＸ↓シバ又ハ
マウス→プレート→マウス（Ｍ　Ｘ　Ｐ　Ｘ　Ｍ　）　
テ実施したが、１日月の接種で使用したＢａ５ｅｌｓｋ
ｉ　のプロトコールとは異った接種物調整力法を採用し
た。

、■ＸＭの接種物のＡ整のために、無直状態で胃から肛
門に刀・けて腹部を解剖しｆｃｏ内ノ臓の重置を計測し
、ガラス・ホモジエナイザー管に移し、約０、５　ｍｌ
のＢｆ（Ｉスープ乞加えた。その混合物は、組織から液
状になるまでテフロン乳鉢で短時間に均質化した。こう
してできあがった懸濁液は、各乳児マウスに約１０”　
ＣＦ　Ｕ接種するのに使用された。それｉＭＥＡ（肉汁
添加球入）プレート上に置き純度をチェックした。エバ
ンスブルー染色は刀口兄なかった。

ｉＡ　Ｘ　Ｐ　Ｘ　Ｍ接種９勿調整には、細刀諒をＭ　
Ｅ　ＡプレートからＢＨＩスープに移すのに白金耳を用
いた。

仄に１祠〇Ｂｆ（Ｉに約１０１１ＣＦ［Ｊ／ゴを加え、
ｄ懸濁′ｇｔ作成した。混合物を均質化させる為に攪拌
し、０．０５〜０．１　ｒｎｔ（約１０”ＣＦ　Ｕ　）
　’ｉ各乳児マウスに接Ｆｊｆした。エバンスブルー染
色は添加しなかつ７Ｃ０ これらすべての接種のためにマウス達を室温７３〜７６
゛Ｆに保う、ビーカー内に入れておく。

ビーカーは周囲の記度よりやヤ高めの７８°Ｆくらいに
保つために、ゆるくカバーさｒｔているグラスチックの
箱に入れられた。

結果が表Ｉで示さｎているように、次の動物に接種した
１甘、ＭＥＡプレート上のチェックによるとその腸にＱ
丁子分なテスト細胞が仕った。そ扛故にＶｊｂｒｉｏ　
ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｉ３Ｋ　７０は乳児マウスの内
臓に屑状したのである。更に、ＦＡの割片に２いて十分
な増加がないので水分蓄積前の増加はみもれなかった（
　Ｆ　Ａ率が０．０６５以上である場合は水分蓄積量が
顕著である）。毒素産生性の回復はなかった。

例　７ 弱毒化ワクチンとして選ばれるもう一つのクラシカル株
はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ　Ｏｇａｗａ　３９５　（以
下３９５で示す）であり、それはＮ１６９６１のように
ボランティアで広く研究さｎておシ、十分な完投ヲ与え
る（　Ｌｅｖｉｎｅｗ　Ｍ、　Ｍ、　”　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ　ｔｏ　ｃｈｏｌｅｒａ　ａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅ
ｄｉｎ　ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｇ＊　”　ｉｎ　Ｃｈｏｌ
ｅｒａ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｄｉａｒｒｈｅａａ
　：　４３　ｒｄＮｏｂｅｌ　Ｓｙｍｐｏａｉｎｍ＋　
Ｓｔｏｅｋｈｏｌｍ　１９７８．　（０，０ｕｅｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ　＆　Ｊ。

Ｈｏｌｎ１ｇｒｅｎ＋　ｅｄａ、　）　Ｂａ５ｅｌ　：
　Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ、　ｐｐ、　１９５−２０３（１
９８０）：Ｌｅｖｉｎｅｗ　Ｍ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ−
Ａｃｕｔｅ　Ｅｎｔｅｒｉｃ＋　！（１９８１）　）。

３９５の弱毒化に使用される方法はＮ１６９６１で用い
られた方法と大差のないものである（例１−５で述べて
いるように９゜ 最初の手順は３９５の２つの毒素遺伝子を複製し、染色
体上に並べることであった。５ｏｕｔｈｅｒｎプロット
分析により、長さが各々１６と１２ｋｂの２つのＨｉｎ
ｄ　ｌノラグメントヲ見つけた。２つとも複製コレラ毒
素遺伝子をもつものでめる。こｒＬらのフラグメントは
アガロースゲル免役電気泳動にニジ精製さＡ、ｐＢＲ３
２５で分解されたアルカリ性７オスフアターゼ処理−Ｈ
ｌｎｄ　Ｉになる（図９）。

その結果できる苺素遺伝子を含む組み換えしたグラスミ
ドはｐｃＶＤ１４．ｐｃＶＤ１５と呼ば扛る。

プラスミドｐｃＶＤ１４とｐｃＶＤ１５は、制限エンド
ヌクレアーゼによって染色体上に並べらする。約５５０
ｂｐのＸｂａ　Ｉ　Ｃ１ａ　Ｉフラグメントが発見され
たが、これは最初の１０個のアミノ酸残基のためのコー
ドンをもたないＡＩサブユニットの塩基鎖を含んでいる
。このＸｂａ　Ｉ　−Ｃ１ａ　ＩのフラグメントはｐＣ
Ｂｊ）１５のための、図１Ｏで示すような連続的技法で
、ｐｃＶＤ１４とｐＣＶＤ１５から除去される。最初に
Ｃ１ａでの部分分解することは、５つのＣ１ａ　ｌ　＠
位の１つが切られている線状の分子をもつ個体′ｔ−産
生する。仄に、線状の分子の末端は１）ＮＡポリメラー
ゼでｂｌｕｎｔ　−’ｅｎｄｅｄにされる。Ｘｂａ　ｌ
　Ｏ連結部位は、Ｘｂａ　Ｉ部位がＣ１ａ　１部位の１
つで置換さ扛るような分子を産生するｂｌｕｎｔ−ｅｎ
ｄｅｄなＣ１ａ　１部位と結合する。Ｘｂａ　１酵索は
その連結部位全除去するために加えうｎる。

またＸｂａ　Ｉフラグメント上のテトラサイクリン耐性
遺伝子を加え結合させる。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２
への転移とテトラサイクリン上の選択の後、多くの転移
物を含むプラスミドをテストする。多くの欠損変異株は
１つ乃至それ以上のＸｂａ　Ｉ　Ｃ１ａ　Ｉフラグメン
ト中にみら扛る。Ａ、遺伝子を有する欠損変異株を選ぶ
。ｐＣＶＤ２５とよばれるこの欠損変異株は精製さＱ、
Ｘｂａで分解さ扛、テトラ丈イタリン耐性遺伝子全除去
するために再結曾さｎる。

こうして出き上った複製物ＰＣＶＤ３０は、Ｙ−１副腎
検丘で測定すると、ホロトキシンに対して陰性である（
　５ａｃｋ、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔａｌ、　５ｕｐｒａ　
（１９７５）　）。しかしＥＬＩＳＡで測定？行うと、
Ｂサブユニットの生成物に対しては１榔性である（　５
ａｃｋ、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ。

５ｕｐｒａ　（１９８０）　）。Ａ　ｒ　ｋ標識したも
のを使用するＤＮＡ水素化法によｎば、ＡＩに対する遺
伝子を欠いていることが判明する。毒性を欠いた変異株
？含むｐｃＶＤ３０のＨｉｎｄ　ＩフラグメントはＴｃ
に感受性があり、Ｃｍに耐性があるｐ　ＲＫ　２９０の
誘導物でおるｐＪＢＫ８５に移される。その結果生じた
プラスミドが、ｐＪＢＫ１０８と呼称さ扛るものなので
ある。

ｐ　Ｊ　Ｂ　ｉ（１０８のうちで毒性を欠いた変異株中
の、選択性マーカーを欠いているものには、以前ＥＩＴ
ｏｒ　Ｎｌ　６９６１’に弱毒化するのに用いた方法の
変法が必要である。３９５からＡ１遺伝子を除去させる
には、ｐｃＶＤ１５からのＨｉｎｄ　Ｉフラグメント全
ｐ　ＪＢＫ８５に組み込めてｐ　Ｊ　ＢＫ８８勿生成す
る（図１１）。Ｘｂａ　Ｉフラグメント上のテトラサイ
クリン耐性遺伝子はｐＪＢＫＢ８のＡ１遺伝子内のＸｂ
ａ部位に組み込まれ、ｐＪＢＫ１０７に生成する。この
テトラサイクリン耐性は、以前Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ
　ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５６のためにしたように３９５の染
色体に組換えらｎる。ｐＪＢＫ１０７（Ｔｃｒ。

Ｃｍｒ）は３９５に集めら扛、２番目のＩｎｃ　Ｐプラ
スミドであるｐ　Ｒ７５１（Ｔｐｒ　）が誘発さｎる。

Ｔｃ　＋ＴＰｒ＊　Ｃｍ’コロニーヲ抽出すると、Ｖ、
　ｃｈｏｌｅｒａｅ　ＪＢＫ１１３になる。Ｊ　Ｂ　Ｋ
　１１３は染色体の毒素遺伝子内にテトラサイクリン耐
性遺伝子を含む。欠損変異株を含むｐＪＢＫ１０８は、
Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ１１３に集めｌ；
）ｎる。染色体に集めろ扛た欠損変異株の同−源組み換
えは、ＡＩ遺遺伝鉄鎖失わしめる。そのことによシ、テ
トラサイクリン耐性が失われるように見えるのである。

又、その様な組み換えの起きうる頻度は大変少ないので
、テトラサイクリン耐性細胞全テトラサイクリン感受性
細胞に変える方法が用いられる。その方法とは、テトラ
サイクリンは静菌性の抗生物質であるが、−力アンビシ
リンやＤ−サイプロセリンは殺菌性の抗生物質であると
いう事実を利用するものでちる。

それ故にｐ　Ｊ　Ｂ　ｉ（１０８ｉ含むＶ、　ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ　Ｊ　ＢＫ　１１３の培養菌は２μ（ｊ／ｍｌ
のテトラサイクリン、５０μり／−のアンピシリンおよ
び５０μ９／ｒｎｅのＤ−サイクロセリンを含むＬ−培
養液中には、３７℃、３時間で成長する。３時間の終り
には、はとんどのテトラサイクリン耐性細胞は死んでお
り、テトラサイクリン感受性細胞はＬ−寒天上に移して
みることができるし、テトラサイクリンによって偵製さ
れたものもＬ−寒天上でみることができる。テトラサイ
クリン感受性のコロニーは、１）８人の交雑によシ生ま
ｎるＡ、遺伝子の存在に必要不可欠である。ＡＩサブユ
ニットを複＃！する遺伝子が欠如したテトラサイクリン
感受性株はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅＣｖＤｌｏｌと呼称
さｆＬ、ＥＬＩＳＡでＢＴプユニットヲ生成するのをテ
ストするためのものである［：　５ａｃｋ、　５ｕｐｒ
ａ　）ｏ　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　ＣＶ　Ｄ　１０１
は毒素産生性の母株Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　３９５と
全く同量のＢサブユニット？抗原として生成することが
判明した。

例　８ 褐累遺伝子のＤＮＡ鎖 Ｖ、　ｅｈｏｌｅｒａｅ　Ｉｎａｂａ　６２７４６の毒
素遺伝子の完全なりＮＡ鎖は決定されているし、その一
部はＬｏｃｋｍａｎｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　２５８．１３７−２２　（１９８３）で報
告さレテイる。ｐｃＶＤ１４とｐｃｖｏｉｓｏ染色体上
に並んでいる制限エンドヌクレアーゼは、株６２７４６
にみら扛る連鎖が３９５の毒素遺伝子にも存在している
ことを示している。５５ＱｂｐのＸｂａ　Ｉ　−Ｃ１ａ
　Ｉフラグメントを除去した後Ｘｂａ鎖を加えるとでき
ると予想さｎる接合は、図１２に示してめる。コレラ毒
素のＸｂａ　１　Ｏｆｔ１１位はＡ、構成遺伝子の１０
と１１のアミノ鍍残基である（ＡＩの最初の鎖の１８の
アミノ戚は測定していない〕。

その鎖のＣ１ｍ　１部位は、ＡＩの最後の残基に、又Ａ
２の最初の残基に位置している。

この発見は開催に具現化したものについて述べられてい
るが、よシ一層の修正が可能であると思われるし、この
申請薔は発明の原理の他に、様々なバリエーション、使
用法及び適応力法についても述べられているものである
。また、現在は未知のものについての指針となるべき事
項も含まれているものである。

【図面の簡単な説明】

１する接脅注遺伝子の移植り１解　加 図３．　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ、Ｂ　Ｋ　５６　
ノＩＩ　解加図４．ＪＢＫ２１生成の図解 図５．　ＪＢＫ５４生成の図解 図６．　Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５６生
成の図解図７．交差によるｉｎ　ｖｉｖｏでの再結合と
毒素遺伝子の除去の１ａ解　加 図８．ｐＪＢＫ５１生成の図解 図９．ｐｃＶＤ１４とｐｃＶＤ１５１７）生成ノ図解 図１０．、ｐＪＢＫ１０８生成の図解 図１１．　ｐ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　１０７生成の図解図１２．
　Ｏｇａｗａ　３９５におけるＡサブユニットの欠［Ｘ
ｂａ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ　５５０ｂｐフラクメント１）
ＮＡ鎖（上図）。このフラグメントの図中での制限エン
ドヌクレアーゼ部位の略字Ｖま以下の通りである。 Ａ　＝　ＡｃＣｌ　制限エンドヌクレアーゼ部位Ｂ＝Ｂ
ｇｌｌ　＃ Ｃ”＝Ｃ１ａｌ　＃ Ｅ　＝　ＷｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位Ｈ＝　
Ｈｉｎｄ　ｌ　ＩＩ Ｐ＝Ｐａｔｌ　ｇ Ｓ＝Ｓａｌｌ　ｔｔ Ｘ　＝　Ｘｂａ　ｌ　ｔｔ 図中及び本文中のその他の略字の意味 Ａｐ　＝アンピシリン耐性遺伝子 Ａｐｒ＝〃〃　の表現型 ＡｐｌＢ＝〃　感受性遺伝子の表現型 Ｃｈｒｏｍ　−染色体 Ｃｍ　＝クロラムフェニコール耐性遺伝子ＣＴ＝コレラ
毒素 ＣＩＴＡ＝　＃　のＡサブユニットをもつ遺伝子 ＣＴＢ＝　ＩＩ　Ｂ　＃ ｋｂ　＝キロベース（ｉｏｏｏ単位塩基）Ｐ＝ニブラス
ミ ドｕ　＝スルホンアミド ５ｕｒ＝〃　耐性遺伝子の表現型 Ｔｃ　＝テトラサイクリン Ｔｃ３＝テトラサイクリン耐性遺伝子の表現型Ｔｐ＝）
リメトプリン 代理人　弁理士　小　林　十四雄 図面の浄凹（内容に変更なし） Ｍ１３ｍｐ７８４３ Ｘｂａ　Ｉ　Ｃｌｏ　Ｉ ＡＳＰ　ＳＥＲＡＲＧ　ＰＲＯＳＥＲｃＥＲＭＥＴ　５
ＥＲＡＩ　Ａ２ ｂａＩ ＡＳＰ　ＳＥＲＡＲＧ　ＡＬＡ　ＭＥＴ手続補正書 昭和５９年１２月２６日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示　昭和５９年特許願第４０５８６号２、
発明の名称　コレラ菌における遺伝子欠損をともなう制
限フラグメントの分離法と、それによ事件との関係　特
許出願人 住所　アメリカ合衆国　メリーランド州　２１２０１、
バルチモア、ウェスト　ロンバード　ストＩＪ−ト　５
２２名称　ユニバーシティ　オブ　メリーランド代表者
　ティー・　アルバート　ファーマー国籍　アメリカ合
衆国 ４、代理人 ６、補正の対象　（１）願書中、特許出願人の欄（２）
委任状及び訳文 −−１うり？６１ ７、・補正の内容 （１）特許出願人の住所１代表者氏名を記載した訂正願
書を提出する。 （２）委任状及び訳文を提串する。 （３）明細書第６１．６２頁の図面の簡単な説明図１、
図２１図３１図７、図１２を次の通り訂正する。 図１は、Ｖ、ｃｈｏｌ＠ｒａｅ　Ｎ１６９６１（ｐ　Ｊ
ＢＫ５５）（Ａｐｒ）の図解。 図２は、交差の過程と、Ｖ、　ｅｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　
Ｂ　Ｋ　５６を生成する接合性遺伝子の移植の図解。 図３は％Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｓ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５６の
図解。 図７は、交差によるｉｎ　ｖｉｖｏでの再結合と毒素遺
Ｊ＠＋ｏ′＊ｔｖ＠ｆｉｌ・ 図１２は、Ｏｇａｗａ　３９５におけるＡサブユニット
の欠損Ｘｂａｉ−Ｃ１ａ１５５０ｂｐ　７ラグメントの
欠如後におけるＣＶＤｌ０Ｉ内の下１ｆｌ 結合及びＸｂａの挿入（千條）とを示す図解である。 （４）　内容に変更のない浄書した明細書を提出する。 （５）内容に変更のない浄書した図面を提出する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、無毒性化及び宿主動物の腸内潜伏能力の保持のため
   、ＤＮＡの欠損制限エンドヌクレアーゼブラグメントを
   持つＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａａ株を含むＶｉｂｒ
   ｉ。 ｃｈｏｌｅｒａｅ　の培養。 ２、特Ｍ、請求の範囲第１項によるＶｉｂｒｉｏ　ｃｈ
   ｏｌｅｒａｓの分離培養において、上述の株は、ｉｎ　
   ｖｉｖｏで毒性Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓと最初
   のプラスミド間における組換えに１夛作成したものであ
   多、欠損ＤＮＡの側鎖のＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ
   ｅ　ｆｔ　貧む最初のプラスミドの欠損ＤＮＡＩ（１位
   に側鎖に結びつけた外部由来の選択性マーカーで代用す
   るものである。ここでＭう側鎖とは、ｉｎ　ｖｌｖｏで
   組換えが起こるような十分な長さｔ煉りものである。最
   初の選択性マーカーの組換えが行われると、そのマーカ
   ーを持つ第２番目のプラスミドと２番目のマーカーとに
   よるｉｎ　ｖｉｖｏでの組み換えが行われる。上述の第
   ２番目のプラスミドは、第１番目のものとは異なる。　
   〜３、　特許請求の範囲第２項（よるＶｉｂｒＬｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｅ　−の培養菌において、上述の欠損ＤＮ
   Ａとは、Ｖｉｂｒｉ。 ｃｈｏｌｅｒａｓ　毒素又はそれに相当するものの遺伝
   コード全指定するＤＮＡｔ欠いたものである。 ４、特許請求の範囲第２項によるＶｉｂｒｉｏ　ｅｈｏ
   ｌｅｒａｅの培養菌において、上述の欠損ＤＮＡの側鎖
   はｌ鎖につき約７．０００の有機塩基をもつ。 ５、特許請求の範囲第２項によるＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏ
   ｌｅｒｍｓの培養菌における、上述の第１番目選択性マ
   ー々−及び第２番目選択性マーカーとは、耐性遺伝子の
   ことである。 ６、特許請求の範囲第２項から第５項のいずｎかによる
   Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａａの培養菌において、上
   述の毒性Ｙｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓとはＩｎａｂ
   ａ　血清型のＮ１６９６１である。 ７、　特許請求の範囲第２項から第５項のいずれかによ
   るＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓの培養菌において、
   最初のプラスミドとはＰＪＢＫ５５でるる。 ８．　％許請求の範囲第２項から第５項のいずれかによ
   るＶｉｂｒｉｏ　ｅｈｏｌａｒａｅの培養菌において、
   第２番目のプラスミドとは↑Ｒ７０２である。 ９、　特許請求の範囲第２項から第５項のいずれかによ
   るＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの培養菌において、
   ｉｎ　ｖｉｖ。 での組換型はＪＢＫ５６である。 １０、％許請求の範囲第２項から第５項のいずれかによ
   るＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓの培養菌において、
   Ｖｉｂｒｉ。 ｃｈｏｌｅｒａ６　の最終法を産生するためにｉｎ　ｖ
   ｉｖｏの組換型の第１番目の選択性マーカーは、第３番
   目の選択性マーカーを挿入することによって不活性化さ
   れる。 １１、％許請求の範囲第１０項によるｖｉｌ）ｒｉＯｃ
   ｈｏｌｅｒａｓの培養菌において、最終法とはＪＢＫ７
   ０である。 １２、特許請求の範囲第１０項によるｖｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｓの培養菌において、最終法は、コレラ４
   累のＢ？プユニットを呈するプラスミドをもつ。 １３、特許請求の範囲第１２項によるＶｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｅの培養菌において、最終法はＪＢＫ７０
   　（ｐＪｆｌＫ５１）でめる。 １４、特許請求の範囲第１項と第３項によるｖｉｂｒｉ
   ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの堵髪面に２いて、制限エンドヌ
   クレアーゼブラグメントは、毒素遺伝子の７ラグメント
   な１ノ以上含んでいる。 １５、特、ｆ［請求の範囲第１項から第５項のいすｎか
   によるＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの培養菌におい
   て、上述の培養菌はコレラに対するワクチン投与に役立
   つものでるる。 １６、特許請求の軛ｔｆｆ１ｇ１１項によるＶｉｂｒｉ
   ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓの培養菌にお２．いて、ＪＢＫ７
   ０はコレラに対するワクチン投与に役立つものである。 １７、以下の手順を含ひＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ
   ｅの遺伝子欠損変異株の分離方法 （、）　入換制御長エンドヌクレアーゼフラグメントの
   側鎖をもつＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　’＜含む
   最初のプラスミドと、上述の欠損フラグメントの部位ヲ
   埋め曾わせるために、上述の側鎖と結オしている外部由
   来の第１番目の選択性マーカーとしての遺伝子を作成す
   る。上述の側鎖は１ｎｖ１マＯ′で組換えできるよう十
   分に長いものである。 （ｂ）　Ｖｉｂｒｉｏ　ｅｈｏｌｅｒａｅの毒性法と、
   最初のプラスミドを持つ最初の微生物とを結合きせる。 （Ｃ）最初の選択性マーカーを取シ込んだＶｉｂｒｉ。 ｅｈｏｌｅｒａｅ　ｆ抽出する。 （ｄ）　［ｃｌの段階で淘汰されたものと、２番目の選
   択性マーカーを持つ２番目のプラスミドをもつ２番目の
   微生物とｔ結合する。２爵目のプラスミドは、最初のプ
   ラスミドとは異なる。 （ｅｌ　ｉｎ　ｖｉｖｏに２いて組換えｔ起こし、最初
   の選択性マーカーと２信目の選択性マーカーを呈するＶ
   ｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　ｋ淘汰する。 １８、特許請求の範囲第１７項による方法において、史
   に欠の手順を含んでいる。 １ｆｌｉ１７項（、）の段階でのｉｎ　ｖｉｖｏにおけ
   る組み俣え型に、３番目の選択性マーカーがある３番目
   のプラスミドをもつ３番目の微生物を結合させる。 （ｇ）３番目の選択性マーカーを呈するｖｉｂｒｉａｅ
   ｈｏｌｅｒａｅ　ｆ　ｌ−汰する。 ｔｈｌ　、ｇｌの段階で淘汰さｎたもののプラスミドを
   治す。 １９、特許請求の範囲第１８項にＬる方法において、最
   初と２番目の選択性マーカーは、抗生物置耐性の遺伝子
   でろり、３番目の選択性マーカーは重金属に対して耐性
   のものである。 ２、特許請求の範囲第１８項による方法において、第１
   ．第２．第３番目の微生物は共にＥ、　ｃｏｌｔ株であ
   る。 ２１、特許請求の軛ｖＪＡ第１８項による方法において
   、第１８項手順（ｇ）で淘汰された物質は、ＪＢＫ７０
   である。 ２２、特、３ｆ請求の範囲第１７項及び第１８項のいず
   ｎかによる方法において、第１７項手ノ威ｔｅｌで淘汰
   さルた物質はＶ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｊ　Ｂ　Ｋ　５
   ６でめる。 ２３、特許請求の範囲ｉ１２項によるＶｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｅのＪ＠養菌に２いて、最終法はコレラに
   対するワクチン投与に役立つものである。 ２４、特許請求の範囲第１３項にょるＶｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｓの培養菌において、最終法は、コレラに
   対するワクチンに有用である。 ２５１％許請求の範囲第１．２．３．５項の（、・ずｔ
   かによるＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの１３１ｉｎ
   において、毒性のＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓは、
   ＜）ｇａｗａ　３９５である。 ２、特許請求の範囲第２．３．５項のいず牡かによるＶ
   ｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの培養菌に２いて、最初
   のプラスミドはｐＪＢＫ１０７である。 ２７、特許請求のｙｉＬ　ＩＡ第２．３．５項のいずれ
   かによるＶｉｂｒｉｏ　ｅｈｏｌｅｒａｅの培養菌にお
   いて、２番目のプラスミドはｐ　Ｒ７５１である。 ２、特許請求の範囲第２．３．５項のいず扛かによるＶ
   ｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの培養面において、ｉｎ
   　ｖｉｖｏＯ組換え型はＪＢＫ−１１３である。　 ２９、特許請求の範囲第１０項によ）るＶｉｂｒｉｏ　
   ｅｈｏｌｅｒａｅの培養菌において、最終法はＣ’ｉ’
   Ｄ’１０１である。 ３０、％許請求の範囲Ｍ２Ｏ項によるＶｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｅの培養菌において、ＣＶＤｌ０Ｉは、コ
   レラに対するワクチン投与として有用である。 ３１、無毒性にすることや、２番目のｖｉｂｒｉｏ　ａ
   ｈｏｌｅｒａｅ株による感染症を防禦する有効性を１０
   ０％発揮するための欠損を持った制限エンドヌクレアー
   ゼフラグメントをもつ最初のＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅ
   ｒａｅ　ａを含むＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの培
   養凶。 ３２、特許請求の範囲第１７項による方法において、更
   に以下の手順を加えると、 （ｆ）第１７項手順１ｅ）でのｉｎ　ｖｉｖｏの組み換
   え型に、３４目のプラスミド全もつ３番目の微生物？結
   合させる。３番目のプラスミドは、最初の選択性マーカ
   ーを持っていない。 （ｇｌ　最初の選択性マーカーを欠（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃ
   ｈｏｌｅｒａｅを淘汰する。 ３３、特許請求の範囲第３２項の方法において、３番目
   のプラスミドは最初の選択性マーカーを欠いておシ、最
   初の選択性マーカーはｉｎ　ｖｉｖｏの組換え後、抗生
   ！ｍ負に対して耐性を示す遺伝子を欠如してしまう。 ３４、特許請求の範囲第３３項の方法において、第３２
   項のｆｇ）段階で淘汰されたものはＣＶｉ）１０１であ
   る。