WO2003006408A1 - Method of producing reduced coenzyme q10 using solvent with high oxidation-protective effect - Google Patents

Description

明細書

酸化防護効果の高い溶媒を用いる還元型補酵素 Q i。の製造方法 技術分野

本発明は、 還元型補酵素 。の合成方法及び晶析方法に関する。 還元型補酵 素 。は、 酸化型補酵素 。に比べて高い経口吸収性を示し、 優れた食品、 栄 養機能食品、 特定保健用食品、 栄養補助剤、 栄養剤、 飲料、 飼料、 動物薬、 化粧 品、 医薬品、 治療薬、 予防薬等として有用な化合物である。 背景技術

広く生物界に分布するべンゾキノン誘導体である酸化型補酵素 Q 0は、 その ビタミン様の機能からビタミン Qとも呼ばれており、 弱った細胞活性を健康な状 態に戻す栄養源として身体を若返らせる成分である。 一方、 還元型補酵素 Q _{1 0} は、 酸化型補酵素 。の 2電子還元体であり、 酸化型補酵素 。が橙色結晶で あるのに対し、 還元型補酵素 Q _{1 0}は白色結晶である。 還元型補酵素 。及び酸 化型補酵素 Q _{1 0}は、 ミ トコンドリア、 リソゾーム、 ゴルジ体、 ミクロノーム、 ペルォキシソーム、 或いは細胞膜等に局在し、 電子伝達系の構成成分として A T P産生賦活、 生体内での抗酸化作用、 膜安定化に関与している事が知られている 生体の機能維持に必要不可欠な物質である。

還元型補酵素 。は、 例えば、 合成、 発酵、 天然物からの抽出等の従来公知 の方法により補酵素 。を得た後、 クロマトグラフィーにより流出液中の還元 型補酵素 Q i。区分を濃縮する方法等により得られることが知られている （特開 平 1 0— 1 0 9 9 3 3号公報） 。 この場合、 さらに上記還元型補酵素 Q _{1 0}中に 含まれる酸化型補酵素 。を、 水素化ホウ素ナトリウム、 亜ジチオン酸ナトリ ゥム （次亜硫酸ナトリウム） 等の一般的な還元剤を用いて還元した後、 クロマト グラフィ一による濃縮を行っても良いこと、 また、 還元型補酵素 Q _{1 0}は、 既存 の高純度補酵素 Q _{1 0} (酸化型） に上記還元剤を作用させる方法によっても得ら れることが、 当該公報中に記載されている。 しかしながら、 このようにして得ら れる還元型補酵素 Q _{1 0}は、 必ずしも純度が高い状態では取得できず、 例えば、 酸化型補酵素 Q _{1 0}をはじめとする不純物を含有する低純度結晶、 半固体状や油 状物として得られやすい。

なお、 特開昭 5 7— 7 0 8 3 4号公報には、 補酵素 。をへキサンに溶解し、 これにハイ ドロサルフアイトソーダ （次亜硫酸ナトリウム） 水溶液を加えて撹拌 し、 還元型補酵素 。を合成した例が開示されているが、 還元剤として補酵素 。の 2倍重量もの次亜硫酸ナトリゥムを用いており、 経済的な観点からも、 その後の精製の煩雑さからも問題を有していた。

還元型補酵素 Q i。は、 分子酸素によつて酸化型補酵素 Q i。に酸化されやすい。 工業的規模での製造においては、 完全な酸素の除去は極めて難しく、 さらに、 個 々の操作に要する時間はラボスケールでの製造とは異なりかなり長時間になるた め、 残存する酸素が大きな悪影響を及ぼす。 上記酸化は難除去性の酸化型補酵素 。の副生及び製品への混入といった収率、 品質面の問題に直結する。 高純度 の還元型補酵素 Q i _Q結晶を得るためには、 上記酸化から好適に防護することが 重要である。 発明の要約

本発明は、 上記に鑑み、 高品質の還元型補酵素 。を得るための簡便且つ効 率的な合成方法並びに晶析方法を提供することを目的とする。 さらに、 高品質の 還元型補酵素 Q _{1 0}結晶を得るための工業的規模での生産に適した優れた製造方 法を提供することを目的とする。

本発明者らは、 鋭意研究した結果、 還元型補酵素 。は特定の溶媒中で分子 酸素による酸化から好適に防護されることを見出し、 本発明を完成するに至った。 即ち、 本発明は、 酸化型補酵素 Q _{1 0}を還元して還元型補酵素 Q _{1 0}を合成する 方法において、 へキサンを除く炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及 び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種を溶媒として用いることを特徴とす る還元型補酵素 。の製造方法に関する。

また、 本発明は、 酸化型補酵素 。を還元して還元型補酵素 。を合成する 方法において、 脱酸素雰囲気下、 炭化水素類を溶媒として用いることを特徴とす る還元型補酵素 Q i。の製造方法に関する。 さらに、 本発明は、 還元型補酵素 Q _{1 0}を、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種を溶媒として用いて 晶析することを特徴とする還元型補酵素 Q i 0の晶析方法に関する。

また、 本発明は、 還元型補酵素 。を炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エー テル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種の溶媒に溶解させて取り 扱うことにより、 分子酸素による酸化を防護することを特徴とする還元型補酵素 。の安定化方法に関する。

さらに、 本発明は、 還元型補酵素 Q _{1 0} /酸化型補酵素 。の重量比が 9 6 4以上である還元型補酵素 Q！。結晶に関する。

本発明の方法によれば、 酸化型補酵素 。を還元して還元型補酵素 Q _{1 Q}を合 成する方法において、 還元型補酵素 Q _{1 0}が分子酸素によって酸化されるのを好 適に防護することができ、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の副生が最小化された状態で、 高 品質の還元型補酵素 。を合成できる。 また、 還元型補酵素 0，。を晶析する方 法において、 還元型補酵素 。が分子酸素によって酸化されるのを好適に防護 することができ、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の副生が最小化された状態で結晶状態へ移 行させ、 高品質の還元型補酵素 。結晶を取得することができる。 発明の詳細な開示

以下、 本発明を詳細に説明する。

本発明においては、 還元型補酵素 。から酸化型補酵素 。への分子酸素に よる酸化を抑制して、 高品質の還元型補酵素 。を合成するため、 及び、 晶析 するため、 さらに、 還元型補酵素 。を安定に取り扱うために、 上記酸化から の防護効果の高い溶媒、 即ち、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及 ぴ、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種を用いる。 還元型補酵素 Q _{1 0}は、 驚くべきことに、 結晶状態よりも、 上記溶媒に溶解した、 又は、 懸濁した状態に おいて、 分子酸素による酸化からより好適に防護される。 このような上記溶媒に よる酸化防護効果は、 本発明者らにより初めて見出されたものである。

炭化水素類としては、 特に制限されないが、 例えば、 脂肪族炭化水素、 芳香族 炭化水素、 ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。 脂肪族炭化水素、 芳香 族炭化水素が好ましく、 脂肪族炭化水素がより好ましい。

脂肪族炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 通常、 炭素数 3〜 2 0、 好ましくは炭素数 5〜1 2のもの が用いられる。

具体例としては、 例えば、 プロパン、 ブタン、 イソブタン、 ペンタン、 2—メ チノレブタン、 シクロペンタン、 2—ペンテン、 へキサン、 2—メチゾレペンタン、 2 , 2—ジメチノレブタン、 2 , 3—ジメチノレブタン、 メチルシクロペンタン、 シ クロへキサン、 1一へキセン、 シクロへキセン、 ヘプタン、 2—メチノレへキサン、 3—メチノレへキサン、 2、 3—ジメチノレペンタン、 2， 4一ジメチノレペンタン、 メチルシクロへキサン、 1一ヘプテン、 オクタン、 2， 2 , 3—トリメチルペン タン、 イソオクタン、 ェチ^^シクロへキサン、 1—オタテン、 ノナン、 2， 2， 5—トリメチルへキサン、 1一ノネン、 デカン、 1—デセン、 p—メンタン、 ゥ ンデカン、 ドデカン等を挙げることができる。

中でも、 炭素数 5〜 8の飽和脂肪族炭化水素がより好ましく、 炭素数 5のペン タン、 2—メチルブタン、 シクロペンタン （ペンタン類と称す） ；炭素数 6のへ キサン、 2—メチノレペンタン、 2 , 2—ジメチ^/ブタン、 2 , 3—ジメチノレブタ ン、 メチルシクロペンタン、 シクロへキサン （へキサン類と称す） ；炭素数 7の ヘプタン、 2—メチルへキサン、 3—メチルへキサン、 2， 3—ジメチルペンタ ン、 2 , 4—ジメチルペンタン、 メチルシクロへキサン （ヘプタン類と称す） ； 炭素数 8のオクタン、 2， 2， 3—トリメチルペンタン、 イソオクタン、 ェチル シクロへキサン （オクタン類と称す） ；及びこれらの混合物が好ましく用いられ る。 とりわけ、 上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い傾向があり、 特 に好ましく、 ヘプタンが最も好ましい。

芳香族炭化水素としては、 特に制限されないが、 通常、 炭素数 6〜2 0、 好ま しくは炭素数 6〜1 2、 より好ましくは炭素数 7〜1 0のものが用いられる。 具 体例としては、 例えば、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キ シレン、 p—キシレン、 ェチノレベンゼン、 タメン、 メシチレン、 テトラリン、 ブ チノレベンゼン、 p—シメン、 シクロへキシノレベンゼン、 ジェチノレベンゼン、 ペン チルベンゼン、 ジペンチルベンゼン、 ドデシルベンゼン、 スチレン等を挙げるこ とができる。 好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 p—キシレン、 ェチノレベンゼン、 タメン、 メシチレン、 テトラリン、 ブチルベン ゼン、 p—シメン、 シクロへキシノレベンゼン、 ジェチノレベンゼン、 ペンチノレベン ゼンである。 より好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレ ン、 p—キシレン、 クメン、 テトラリンであり、 最も好ましくは、 クメンである。 ハロゲン化炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問 わず、 特に制限されないが、 非環状のものが好ましく用いられる。 塩素化炭化水 素、 フッ素化炭化水素がより好ましく、 塩素化炭化水素がさらに好ましい。 また、 炭素数 1〜6、 好ましくは炭素数 1〜4、 より好ましくは炭素数 1〜 2のものが 用いられる。

具体例としては、 例えば、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1， 1ージクロ口工タン、 1 , 2—ジクロロェタン、 1， 1 , 1一トリクロロェタン、 1 , 1 , 2—トリクロロェタン、 1， 1， 1， 2—テトラクロロェタン、 1， 1 , 2， 2—テトラクロロェタン、 ペンタクロロェタン、 へキサクロ口エタン、 1 , 1—ジクロ口エチレン、 1 , 2—ジクロロエチレン、 トリクロロエチレン、 テト ラクロ口エチレン、 1， 2—ジクロ口プロパン、 1 , 2 , 3— トリクロ口プロノヽ。 ン、 クロ口ベンゼン、 1， 1， 1 , 2—テトラフルォロェタン等を挙げることが できる。 好ましくは、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 , 1—ジ クロロェタン、 1， 2—ジクロロェタン、 1， 1 , 1—トリクロロェタン、 1 , 1 , 2 _トリクロロェタン、 1 , 1—ジクロロエチレン、 1， 2—ジクロロェチ レン、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 1 , 1， 1 , 2—テトラフ/レオ口 ェタンである。 より好ましくは、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 1， 2—ジク ロロエチレン、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 1 , 1， 1 , 2—テトラ フルォロェタンである。 さらに好ましくは、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 1 , 2—ジクロ口エチレン、 トリクロロエチレンである。

脂肪酸エステル類としては、 特に制限されないが、 例えば、 プロピオン酸エス テル、 酢酸エステル、 ギ酸エステル等を挙げることができる。 酢酸エステル、 ギ 酸エステルが好ましく、 酢酸エステルがより好ましい。 エステル基としては、 特 に制限されないが、 炭素数 1〜8のアルキルエステル、 炭素数 1〜8のァラルキ ルエステル等が挙げられ、 好ましくは炭素数 1〜 6のアルキルエステル、 より好 ましくは炭素数 1〜4のアルキルエステルである。

プロピオン酸エステルとしては、 例えば、 プロピオン酸メチル、 プロピオン酸 ェチル、 プロピオン酸ブチル、 プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができ る。 好ましくはプロピオン酸ェチルである。

酢酸エステルとしては、 例えば、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢 酸イソプロピル、 酢酸ブチル、 酢酸イソプチル、 酢酸 s e c—ブチル、 酢酸ペン チル、 酢酸イソペンチル、 酢酸 s e c一へキシル、 酢酸シクロへキシル、 酢酸べ ンジル等を挙げることができる。 好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プ 口ピル、 酢酸イソプロピル、 酢酸ブチル、 酢酸イソプチル、 酢酸 s e c—ブチル、 酢酸ペンチル、 醉酸イソペンチル、 酢酸 s e c一へキシル、 酢酸シクロへキシノレ である。 より好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢酸イソプ 口ピル、 酢酸ブチル、 酢酸ィソブチルであり、 最も好ましくは、 酢酸ェチルであ る。

ギ酸エステルとしては、 例えば、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロピル、 ギ 酸イソプロピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸ィソプチル、 ギ酸 s e c—ブチル、 ギ酸ペン チル等を挙げることができる。 好ましくは、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロ ピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸イソプチル、 ギ酸ペンチルであり、 最も好ましくは、 ギ 酸ェチルである。

エーテル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問.わず、 特 に制限されないが、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 3〜2 0、 好ましくは炭素数 4〜1 2、 より好ましくは炭素数 4〜 8のものが用いられる。 具体例としては、 例えば、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t一ブチルエーテ ノレ、 ジプロピノレエーテノレ、 ジイソプロピノレエ一テル、 ジブチノレエーテノレ、 ジへキ シルエーテル、 ェチルビ二ノレエーテル、 ブチノレビニノレエーテノレ、 ァニソール、 フ エネトール、 プチノレフエニノレエーテノレ、 メ トキシトノレェン、 ジォキサン、 フラン、 2—メチノレフラン、 テ トラヒ ドロフラン、 テトラヒ ドロピラン、 エチレングリコ ーノレジメチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレジェチノレエーテノレ、 エチレングリコ 一ノレジブチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 エチレングリ コーノレモノエチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノブチノレエーテノレ等を挙げる ことができる。

好ましくは、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t—プチルエーテル、 ジプロピ ノレエーテル、 ジイソプロピノレエーテノレ、 ジブチノレエーテノレ、 ジへキシルエーテル、 ァニソ一ノレ、 フエネト一ノレ、 ブチルフエニノレエーテノレ、 メ トキシトノレェン、 ジォ キサン、 2—メチルフラン、 テトラヒ ドロフラン、 テトラヒ ドロピラン、 ェチレ ングリコールジメチノレエーテル、 エチレングリコーノレジェチルエーテノレ、 ェチレ ングリ コールジブチルエーテル、 エチレングリ コーノレモノメチルエーテノレ、 ェチ レングリコールモノェチルエーテルである。 より好ましくは、 ジェチルエーテル、 メチノレ t e r t一プチノレエーテノレ、 ァニソ一ノレ、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフラ ン、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノェチノレエ 一テルである。 さらに好ましくは、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t—プチル エーテル、 ァニソール等であり、 最も好ましくは、 メチノレ t e r t一ブチルエー テノレである。

二トリル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特 に制限されないが、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 2〜2 0、 好ましくは炭素数 2〜1 2、 より好ましくは炭素数 2〜 8のものが用いられる。 具体例としては、 例えば、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 マロノ二トリ ノレ、 プチロニトリノレ、 イソブチロニトリノレ、 スクシノニトリノレ、 ノ レロニトリノレ、 グルタロニトリノレ、 へキサン二トリル、 ヘプチノレシアニド、 ォクチルシアニド、 ゥンデカン二トリル、 ドデカン二トリル、 トリデカン二トリル、 ペンタデカン二 トリノレ、 ステアロニトリノレ、 クロロアセトニトリル、 ブロモアセトニトリノレ、 ク ロロプロピオ二トリル、 ブロモプロピオ二トリル、 メ トキシァセトニトリル、 シ ァノ酢酸メチノレ、 シァノ齚酸ェチル、 トノレニトリノレ、 ベンゾニトリル、 クロ口べ ンゾニトリル、 ブロモベンゾニトリル、 シァノ安息香酸、 ニ ト ロべンゾニト リノレ、 ァニソ二トリノレ、 フタロニトリノレ、 ブロモトノレ二トリノレ、 メチノレシァノベンゾェ ート、 メ トキシベンゾニトリル、 ァセチルベンゾニトリル、 ナフトニトリル、 ビ フエニルカルボ二トリル、 フエニルプロピオ二トリル、 フエ二ルブチロニトリノレ、 メチノレフエニノレアセトニトリル、 ジフエ二ルァセトニトリル、 ナフチノレアセトニ トリノレ、 ニトロフエニノレアセトニトリル、 クロ口べンジノレシアニド、 シクロプロ パンカルボ二トリル、 シクロへキサンカルボ二トリル、 シクロヘプタンカノレボェ トリノレ、 フエニルシクロへキサンカルボ二トリル、 トリノレシクロへキサンカルボ 二トリル等を挙げることができる。

好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 ブチロニトリル、 イソプチ ロニ ト リノレ、 スクシノュト リノレ、 バレロ二 ト リノレ、 クロ口プロピオ二 ト リノレ、 シ ァノ酢酸メチル、 シァノ酢酸ェチル、 トル二トリル、 ベンゾ-トリルである。 よ り好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ-トリル、 プチロニトリル、 イソブチ ロニトリルであり、 最も好ましくは、 ァセ トニトリルである。

上記溶媒の中でも、 例えば、 溶解度を高めるための適度な加温ができ、 且つ、 湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の行いやすい沸点 （ 1気 圧下、 約 3 0〜 1 5 0 °C) 、 室温での取り扱い時でも室温以下に冷却した時でも 固化しにくい融点 （約 2 0 °C以下、 好ましくは約 1 0 °C以下、 より好ましくは約 0 °C以下） を持ち、 粘性が低い （2 0 °Cにおいて約 1 0 c p以下等） 等の、 沸点、 粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。 工業的な作業上の観点から、 常 温で揮発し難いものが好ましく、 例えば、 沸点が約 8 0 °C以上のものが好ましく、 約 9 0 °C以上のものがより好ましい。

還元型補酵素 Q！。は高濃度の溶液ほど酸化されにくい傾向にある。 上記溶媒 に対して還元型補酵素 。は高い溶解性を示し、 上記溶媒はこの点でも酸化防 護に好適である。 還元型補酵素 Q i。の酸化を防護するために好ましい濃度は、 溶媒の種類等により一律に規定できないが、 上記溶媒に対する還元型補酵素 。の濃度として、 通常 l wZw %以上、 好ましくは 2 w/w %以上である。 上限 は、 特に制限されないが、 実際的な操作性という観点から、 4 0 0 _{W /} w %以下、 好ましくは 2 0 0 w/w %以下、 より好ましくは 1 0 O wZw %以下、 さらに好 ましくは 5 0 w/w %以下である。

さらに、 上記溶媒に対する還元型補酵素 Q _{1 0}の溶解度は好適な温度依存性を 示す。 このため、 上記溶媒の使用は、 還元型捕酵素 。の溶解量を好適に減じ て、 結晶状態へ移行させる （結晶化させる） 上でも好適である。

このように、 上記溶媒の使用によって、 望ましくない酸素の副反応は、 酸化型 補酵素 。の還元反応、 及び Z又は、 還元型補酵素 。の晶析の工程において 最小化される。 加えて、 還元型補酵素 c^。を、 上記溶媒に溶解させて取り扱う ことにより、 分子酸素による酸化を防護し、 還元型補酵素 。を安定化させる ことができるので、 抽出 *水洗 （外部添加した上記溶媒を用いる抽出 '水洗） 、 濃縮 （濃縮しながら他溶媒を添加する溶媒置換を含む） 、 カラムクロマトグラフ ィ一等の取り扱い操作を好適に実施することができる。 本発明においては、 言う までもなく、 酸化型補酵素 。の還元反応から、 還元型補酵素 。の晶析 （精 製晶析） までの一連の過程 （必要に応じて還元型補酵素 。の抽出 ·水洗等を 含む） を、 上記溶媒を使用して実施するのが好ましい。

本発明においては、 必要に応じて、 上記溶媒の他に、 他の溶媒を悪影響のない 範囲で併用することもできる。 例えば、 還元反応においては、 酸化型補酵素

。や還元型補酵素 。の溶解度、 還元剤の溶解度、 反応速度等を改善するために、 又、 還元型補酵素 。の晶析においては、 還元型補酵素 Q i。の溶解度、 晶析濃 度、 晶析温度、 収率、 スラリー性状、 結晶性状等を改善するために、 上記の溶媒 に他の溶媒を適量加えて使用することができる。

このような他の溶媒としては、 特に制限されず、 例えば、 水、 アルコール類、 脂肪酸類、 ケトン類、 二トリノレ類を除く窒素化合物類、 硫黄化合物類等を挙げる ことができる。

アルコール類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 1〜2 0、 好ましくは炭素数 1〜1 2、 より好ましくは炭素数 1〜6、 さらに好ましくは炭 素数 1〜5、 特に好ましくは炭素数 1〜3のものである。 さらには、 炭素数 2〜 3の 1価アルコール、 炭素数 2〜5の 2価アルコール、 炭素数 3の 3価アルコー ルが好ましい。

1価アルコールとしては、 例えば、 メタノール、 エタノール、 1 _プロパノー ノレ、 2—プロパノーノレ、 1—ブタノーノレ、 2—ブタノ一ル、 イソブチノレアノレコー ル、 t e r t _ブチルアルコーノレ、 1—ペンタノール、 2—ペンタノール、 3— ペンタノール、 2—メチル一 1ーブタノール、 イソペンチルアルコール、 t e r t一ペンチルアルコール、 3—メチル _ 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコー ノレ、 1—へキサノーノレ、 2—メチノレー 1—ペンタノ一ノレ、 4—メチノレ一 2—ペン タノール、 2—ェチノレ一 1ーブタノール、 1—ヘプタノール、 2—ヘプタノール、 3—ヘプタノール、 1ーォクタノール、 2—ォクタノーノレ、 2—ェチルー 1一へ キサノール、 1—ノナノール、 1—デカノール、 1 _ゥンデ力ノール、 1—ドデ カノーノレ、 ァリノレアノレコーノレ、 プロノ レギノレアノレコール、 ベンジルァノレコ一ノレ、 シクロへキサノーノレ、 1—メチルシクロへキサノー/レ、 2—メチルシクロへキサ ノーノレ、 3—メチルシクロへキサノール、 4ーメチルシクロへキサノール等を挙 げることができる。

好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノール、 2—ブタノール、 イソブチルァノレコーノレ、 t e r t—ブチノレア ノレコーノレ、 1—ペンタノ一ノレ、 2—ペンタノ一ノレ、 3—ペンタノ一ノレ、 2—メチ ノレ一 1—ブタノーノレ、 イソペンチノレアノレコーノレ、 t e r t—ペンチノレアノレコーノレ、 3—メチルー 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコール、 1—へキサノール、 2 ーメチノレー 1—ペンタノ一ノレ、 4ーメチノレ一 2 _ペンタノ一ノレ、 2—ェチノレー 1 —ブタノール、 シクロへキサノールである。 より好ましくは、 メタノール、 エタ ノーノレ、 1—プロパノーノレ、 2—プロパノーノレ、 1—ブタノーノレ、 2—ブタノー ル、 イソブチルアルコール、 t e r t—ブチルアルコール、 1 _ペンタノール、 2—ペンタノ一ノレ、 3—ペンタノール、 2—メチノレー 1—ブタノ一ノレ、 イソペン チノレアルコール、 t e r t—ペンチルァノレコール、 3—メチノレー 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコールである。 さらに好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1—プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノ一ノレ、 2—ブタノール、 イソ ブチルアルコール、 2 _メチル一 1—ブタノーノレ、 イソペンチルアルコールであ る。 特に好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロノ ノールであり、 とりわけ好ましくは、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロ パノールであり、 最も好ましくは、 エタノールである。

2価アルコールとしては、 例えば、 1 , 2—エタンジオール、 1 , 2—プロノ、 ンジォ一ノレ、 1 , 3 _プロパンジオール、 1 , 2—ブタンジオール、 1 , 3—ブ タンジオール、 1， 4—ブタンジオール、 2， 3 _ブタンジオール、 1 , 5—ぺ ンタンジオール等を挙げることができる。 好ましくは、 1， 2—エタンジオール、 1， 2—プロパンジオール、 1 , 3—プロパンジオールであり、 最も好ましくは、 1， 2—エタンジオールである。

3価アルコールとしては、 例えばダリセリン等を好適に用いることができる。 脂肪酸類としては、 例えば、 ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸等を挙げることができ る。 好ましくは、 ギ酸、 酢酸であり、 最も好ましくは酢酸である。

ケトン類としては、 特に制限されず、 炭素数 3 ~ 6のものが好適に用いられる。 具体例としては、 例えば、 アセトン、 メチルェチルケトン、 メチルプチルケトン、 メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。 好ましくは、 アセトン、 メチ ルェチルケトンであり、 最も好ましくは、 アセトンである。

窒素化合物類としては、 例えば、 ニトロメタン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ホノレムアミ ド、 N—メチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルァセトアミ ド、 N—メチルピロリ ドン等を挙げることができる。 硫黄化合物類としては、 例えば、 ジメチルスルホキシド、 スルホラン等を挙げ ることができる。

上記の他の溶媒は、 融点、 沸点、 蒸気圧特性、 相転移等の既知の物性や前記反 応溶媒量、 さらに酸化型補酵素 Q _{1 0}、 還元型補酵素 Q _{1 0}や還元剤に対する溶解 度に与える効果等をもとに、 各々の溶媒の特性に従って好ましい割合で、 炭化水 素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくと も 1種の溶媒と共に用いるのがよい。

上記の他の溶媒は、 悪影響のない範囲で特に制限無く使用できるが、 酸化防護 効果や後述する晶析収率等の観点から、 前述の酸化防護効果の高い溶媒 （炭化水 素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくと も 1種） の比率 （容量比） が大きいほど好ましく、 実質的に酸化防護効果の高い 溶媒を主成分とする溶媒を用いるのがより好ましい。

系が均一の溶媒相である場合は、 反応溶媒、 晶析溶媒、 又は、 濃縮、 抽出、 力 ラムクロマトグラフィ一等で取り扱う際に使用する場合の主成分が、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種 の溶媒であるのが好ましい。 又、 系が異なる溶媒相を形成するような場合は、 還 元型補酵素 Q _{1 C)}をより良く溶解する溶媒相 （例えば、 水と相溶性の低い有機溶 媒と水との混合溶媒系であるような場合、 還元型補酵素 。は、 水相には難溶 であり、 水と相溶性の低い有機溶媒相に可溶である） の主成分が、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種 の溶媒であるのが好ましい態様である。

この観点から、 他の溶媒の使用量は、 均一系の場合は、 全溶媒量に対する容量 比として、 また、 不均一系の場合は、 還元型補酵素 Q _{1 0}をより良く溶解する溶 媒相の容量に対する容量比として、 通常約 0 . 3未満、 好ましくは約 0 . 2未満、 より好ましくは約 0 . 1未満、 さらに好ましくは約 0 . 0 5未満である。 言うま でもなく、 下限は 0である。

上記の他の溶媒のなかでも、 酸化型補酵素 。の還元反応においては、 反応 速度や収率向上の点から、 アルコール類及び/又は水を併用するのが特に好まし い。 還元型補酵素 。の晶析においては、 流動性等のスラリー性状改善の点か ら、 水を好ましく用いることができる。

次に、 酸化型補酵素 Q i。を還元して還元型補酵素 Q i。を製造する方法につい て説明する。

本発明に用いる酸化型補酵素 。は、 前述のように合成、 発酵、 天然物から の抽出等により調製したものであってもよく、 既存の高純度補酵素 。であつ てもよい。 また、 酸化型補酵素 。のみを含有するものであってもよく、 酸化 型補酵素 Q i。と還元型補酵素 Q！。の混合物であってもよい。

本発明において、 酸化型補酵素 。の還元は、 上記の酸化防護効果の高い溶 媒、 即ち、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類のう ちの少なくとも 1種を溶媒として用い、 水素化金属化合物、 鉄 （金属又は塩とし ての鉄） 、 亜鉛 （金属としての亜鉛） 、 次亜硫酸類、 ァスコルビン酸類等を還元 剤として用いて実施される。

水素化金属化合物としては、 特に制限されないが、 例えば、 水素化ホウ素ナト リウム、 水素化リチウムアルミニウム等を挙げることができる。 上記水素化金属 化合物の使用量は、 水素化金属化合物の種類により異なり、 一律に規定できない 1 通常、 理論水素当量の 1〜 3倍量で好適に実施できる。

鉄又は亜鉛を用いる還元は、 通常、 酸を使用して実施される。 酸としては、 特 に制限されないが、 例えば、 醉酸等の脂肪酸、 メタンスルホン酸等のスルホン酸、 塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができる。 好ましくは無機酸であり、 より 好ましくは硫酸である。

鉄の使用量は、 特に制限されないが、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の仕込み重量に対し て、 例えば、 約 1 / 5重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されないが、 経済性の観点等から、 約 2倍重量以下である。 なお、 鉄は、 金属鉄のみならず、 硫酸鉄 （II) 等の塩の形態でも使用できる。

亜鉛の使用量は、 特に制限されないが、 酸化型補酵素 。の仕込み重量に対 して、 例えば、 約 1 / 1 0重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されな いが、 経済性の観点等から、 約 2倍重量以下である。

次亜硫酸類としては特に制限されず、 通常、 次亜硫酸の塩である。 次亜硫酸の 塩としては特に制限されず、 アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥ ム塩等が好ましく、 リチウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩等のアルカリ金属塩 がより好ましく、 ナトリウム塩が最も好ましい。 上記次亜硫酸類の使用量は、 特 に制限されないが、 通常、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の仕込み重量に対して、 約 1 Z 5 重量以上、 好ましくは約 2 Z 5重量以上、 より好ましくは約 3 / 5重量以上であ る。 多くても特に支障はないが、 経済的な観点から、 通常、 約 2倍重量以下、 好 ましくは同重量以下で用いられる。 よって、 約 2 5重量〜約同重量の範囲でよ り好適に実施できる。

ァスコルビン酸類としては、 特に制限されず、 例えば、 ァスコルビン酸のみな らず、 rhamno—ァスコルビン酸、 arabo—ァスコルビン酸、 gluco—ァスコルビン 酸、 fuco—ァスコルビン酸、 glucohepto—ァスコルビン酸、 xylo—ァスコルビン 酸、 galacto—ァスコルビン酸、 gulo—ァスコルビン酸、 alio—ァスコルビン酸、 er ythro—ァスコルビン酸、 6—デスォキシァスコルビン酸等のァスコルビン酸に 類するものが挙げられ、 また、 それらのエステル体や塩であってもかまわない。 さらに、 これらは、 L体、 D体、 或いは、 ラセミ体であっても良い。 より具体的 には、 例えば、 Lーァスコルビン酸、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァ スコルビン酸ステアレート、 D— arabo—ァスコルビン酸等を挙げることができ る。 還元型補酵素 。の製造において、 上記ァスコルビン酸類をいずれも好適 に使用できるが、 生成した還元型補酵素 Q i。との分離のしゃすさ等を考慮する と、 上記のァスコルビン酸類のうち、 特に水溶性のものが好適に用いられ、 最も 好ましくは、 入手容易性、 価格等の観点から、 L—ァスコルビン酸、 D— arabo ーァスコルビン酸等のフリ一体である。

上記のァスコルビン酸類の使用量は、 特に制限されず、 酸化型補酵素 。を 還元型補酵素 Q i。に変換しうる有効量であればよく、 酸化型補酵素 Q 。に対し て、 通常 1倍モル量以上、 好ましくは 1 . 2倍モル量以上である。 上限は特に制 限されないが、 経済性を考慮して、 通常 1 0倍モル量以下、 好ましくは 5倍モル 量以下、 より好ましくは 3倍モル量以下である。

上記還元剤のうち、 還元能力、 収率、 品質といった観点から、 亜鉛、 次亜硫酸 類、 ァスコルビン酸類が好ましく、 特に次亜硫酸類 （具体的には、 次亜硫酸塩） 、 ァスコルビン酸類が好ましい。

還元反応においては、 上記のようにアルコール類及び 又は水を好適に併用す ることができる。 水は、 特に還元剤として鉄、 亜鉛、 次亜硫酸類を用いる場合に 好適である。 還元剤として水素化金属化合物ゃァスコルビン酸類を用いる場合に は、 アルコール類を併用することができる。 水、 アルコール類の併用は、 これら 水、 アルコール類の特性が発揮され、 反応速度の向上や反応収率の向上等に寄与 する。

以下に好ましい還元方法についてより詳細に述べる。

上記次亜硫酸類を用いる還元は、 水を併用して、 上記の炭化水素類、 脂肪酸ェ ステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種の有機溶 媒と水との混合溶媒系で実施するのが好ましい。 その際、 反応時の P Hは、 収率 等の観点から、 通常 p H 7以下、 好ましくは p H 3〜7、 より好ましくは p H 3 〜 6で実施される。 上記 p Hは、 酸 （例えば、 塩酸や硫酸等の無機酸） や塩基 （ 例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物） を用いて調整することがで さる。

上記次亜硫酸類を用いる還元において、 水の使用量は、 特に制限されず、 還元 剤である次亜硫酸類を適度に溶解する量であれば良く、 例えば、 上記次亜硫酸類 の水に対する重量が、 通常 3 0 wZw %以下、 好ましくは 2 0 w/w %以下にな るように調整するのが良い。 又、 生産性等の観点から、 通常 l _{W /} w %以上、 好 ましくは 5 w / w %以上、 より好ましくは 1 0 w / w %以上であるのが良い。 上記ァスコルビン酸類を用いる還元は、 上記の炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類のうち、 特に水と相溶性の高い溶媒、 なかでも、 水と相溶性の高いエーテル類及び二トリル類から選ばれる少なくとも 1種、 具体 的には、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 ァセトニトリル等を用いて実施する のが特に好ましい。 他の溶媒としてアルコール類を使用することもできる。 又、 還元型補酵素 。の製造における反応促進の観点から （例えば、 反応温度の低 下、 反応時間の短縮等） 、 塩基性物質や亜硫酸水素塩等の反応促進効果を有する 添加剤を共存させて、 還元を実施することができる。

上記塩基性物質としては、 特に制限されず、 例えば、 無機化合物、 有機化合物 を問わず使用しうる。 上記無機化合物としては、 特に制限されないが、 例えば、 金属 （好ましくは、 アルカリ金属、 アルカリ土類金属等） の水酸化物、 炭酸塩、 炭酸水素塩やアンモニア等を挙げることができる。 その代表的なものとして、 例 えば、 水酸化ナトリゥム等のアルカリ金属水酸化物、 炭酸ナトリゥム等のアル力 リ金属炭酸塩、 炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、 炭酸マグネシ ゥム等のアルカリ土類金属炭酸塩等を挙げることができる。 上記有機化合物とし ては、 特に制限されないが、 例えば、 トリェチルァミン等のアミン等を挙げるこ とができる。 上記の塩基性物質のうち、 金属 （好ましくは、 アルカリ金属、 アル カリ土類金属等） の炭酸塩、 炭酸水素塩、 アンモニア等の無機化合物； トリェチ ルァミン等のァミン等の有機化合物といった弱い塩基性物質 （弱塩基又は弱アル カリ） を好ましく使用できる。 より好ましくは上記の弱塩基性の無機化合物であ る。

また、 上記亜硫酸水素塩としては、 例えば、 亜硫酸水素ナトリウム等のアル力 リ金属亜硫酸水素塩等を好適なものとして挙げることができる。

上記添加剤の量は、 期待する程度の反応促進効果を発揮しうる量 （有効量） で あればよく、 特に制限されないが、 経済性も考慮して、 ァスコルビン酸類に対し て、 通常 2 0倍モル量以下、 好ましくは 1 0倍モル量以下、 より好ましくは 5倍 モル量以下、 さらに好ましくは 2倍モル量以下である。 下限は、 特に制限されな いが、 通常 0. 01倍モル量以上、 好ましくは 0. 05倍モル量以上、 より好ま しくは 0. 1倍モル量以上、 さらに好ましくは 0. 2倍モル量以上である。

本発明の還元反応は、 強制流動下に実施するのが好ましい。 単位容積当たりの 撹拌所要動力として、 通常約 0. 01 kWZm³以上、 好ましくは約 0. l kW Zm³以上、 より好ましくは約 0. 3 kWZm³以上の流動が好ましい。 上記の 強制流動は、 通常、 撹拌翼の回転により与えられるが、 上記流動が得られれば必 ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、 例えば、 液の循環による方法等を利用しても 良い。

還元温度は、 還元剤の種類や量によって異なり、 一律に規定できない。 例えば、 次亜硫酸類を用いる還元においては、 通常 100°C以下、 好ましくは 80°C以下、 より好ましくは 60°C以下で実施される。 下限は、 系の固化温度である。 よって、 還元は、 通常 0〜 100 °C程度、 好ましくは 0〜 80 °C程度、 より好ましくは 0 〜 60°C程度で好適に実施できる。 また、 ァスコルビン酸類を用いる還元におい ては、 通常 30 °C以上、 好ましくは 40°C以上、 より好ましくは 50°C以上で実 施される。 上限は系の沸点である。 よって、 還元は、 通常 30〜 150°C程度、 好ましくは 40〜 120 °C程度、 より好ましくは 50〜 100 °C程度で好適に実 施できる。

反応濃度は、 特に制限はないが、 溶媒の重量に対する酸化型補酵素 。の重 量として、 通常約 l wZw%以上、 好ましくは 3 w/w%以上、 より好ましくは 10w/w%以上、 さらに好ましくは 15 w/wo/o以上である。 上限は、 特に制 限されないが、 通常約 60w/w%以下、 好ましくは 5 Ow/w%以下、 より好 ましくは 40 wZw%以下、 さらに好ましくは 30 w/wo/o以下である。 よって、 反応濃度は、 約 1〜 60 w/w%, 好ましくは約 3〜 50 wZw%、 より好まし くは約 10~40 wZw%で好適に実施できる。

還元反応は、 還元剤の種類や量によって異なり、 一律に規定できないが、 通常、 48時間以内、 好ましくは 24時間以内、 より好ましくは 10時間以内、 さらに 好ましくは 5時間以内に完了させることができる。

なお、 還元反応は、 脱酸素雰囲気下で実施するのが極めて好ましく、 驚くべき ことには、 特に次亜硫酸類を用いた還元反応では、 還元反応収率向上や還元剤量 の削減に大きく寄与することも見い出した。 脱酸素雰囲気は、 不活性ガスによる 置換、 減圧、 沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。 少なくとも、 不活性ガスによる置換、 即ち、 不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。 上記 不活性ガスとしては、 例えば、 窒素ガス、 ヘリウムガス、 アルゴンガス、 水素ガ ス、 炭酸ガス等を挙げることができ、 好ましくは窒素ガスである。

このようにして得られた還元反応液から、 生成した還元型補酵素 Q _{1 0}を含有 する有機相を採取し、 必要に応じて （好ましくは） 、 さらに有機相を水や食塩水 等を用いて繰り返し水洗して、 夾雑物を完全に除去した後、 晶析に用いることが できる。 特に、 還元剤として、 次亜硫酸ナトリウム等の上記の次亜硫酸類を用い た場合には、 次亜硫酸類由来の夾雑物を完全に除去したり、 水相の p Hを安定さ せるために、 繰り返し水洗することが望ましい。

又、 酸化型補酵素 。を、 上記の水と相溶性の高い溶媒、 特に、 水と相溶性 の高いエーテル類及び二トリル類 （例えば、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 ァセトニトリル等） から選ばれる少なくとも 1種を用いて、 ァスコルビン酸類で 還元を行った場合は、 還元反応液から直接還元型補酵素 Q _{1 0}を晶析する （直接 単離法 （ワンポット法） ） のが極めて簡便且つ効率的な方法である。

上記還元反応後の処理は、 脱酸素雰囲気下にて実施するのが好ましく、 これに より酸化防護効果をさらに高めることができる。

次に、 還元型補酵素 。の晶析について説明する。

晶析に用いる還元型補酵素 。は、 例えば、 合成、 発酵、 天然物からの抽出 等の従来公知の方法により得ることができる。 好ましくは、 還元型補酵素 Q _{1 0} 中に含まれる酸化型補酵素 Q _{1 0}を還元、 或いは、 酸化型補酵素 Q _{1 0}を還元する ことにより得られたものであり、 より好ましくは、 前記の本発明の還元反応を用 いて得られたものである。

本発明の晶析法は、 酸化型捕酵素 。を比較的多く含有するものについても 適用できるが、 上記の還元方法等により調製された高純度の還元型補酵素 Q J 0 に対して特に有効である。 本発明においては、 従来公知の方法により得られた、 あるいは、 上記の還元方法等により製造された、 還元型補酵素 。を含有する 反応液や抽出液に含有される不純物の除去も兼ねて精製晶析するのが特に効果的 である。 より具体的には、 上記還元方法で得られた還元反応液、 又は、 該反応液 から還元型補酵素 。含む有機相を採取し、 必要に応じて有機相を洗浄して得 られた溶液から還元型補酵素 Q _{1 0}を晶析することができる。 このとき、 不純物 を母液に除去することが好ましい。 これにより、 共存する不純物、 特に、 通常除 去するのが必ずしも容易ではない構造の類似した類縁化合物 （具体的には、 還元 型補酵素 Q ₉、 還元型補酵素 Q ₈、 還元型補酵素 Q ₇等） を除去することができる。 言うまでもなく、 一度精製晶析して得られた還元型補酵素 Q！ ₀結晶を再精製す るための、 再結晶法としても利用可能である。

還元型補酵素 。の晶析は、 上記の炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテ ル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種を溶媒として用いて行われ る。 なかでも炭化水素類が好ましく、 脂肪族炭化水素、 芳香族炭化水素がより好 ましく、 脂肪族炭化水素がさらに好ましく、 前述のペンタン類、 へキサン類、 へ ブタン類、 オクタン類が特に好ましい。 また、 晶析収率、 晶析時に過度の冷却を 必要としない等の観点からは、 脂肪族炭化水素類のなかでも、 非環状脂肪族炭化 水素が特に好ましい。

晶析方法としては、 特に制限されず、 一般に用いられる晶析法、 即ち、 冷却晶 析、 濃縮晶析、 溶媒置換晶析等のうちの少なくとも一つを用いて実施することが できる。 特に、 冷却晶析、 又は、 冷却晶析に他の晶析法を組み合わせて実施する のが好ましい。

晶析時の冷却温度は一つの重要な因子であり、 例えば収率等の観点から、 通常 2 0 °C以下、 好ましくは 1 0 °C以下、 より好ましくは 5 °C以下である。 下限は、 系の固化温度である。 よって、 冷却温度を、 通常一 3 0 °C~ + 1 0 °C程度、 好ま しくは一 2 0 °C〜+ 1 0 °C程度、 より好ましくは一 1 0 °C〜+ 5 °C程度とするこ とにより、 晶析を好適に実施できる。

得られる還元型補酵素 Q _{1 0}中への各種不純物の混入を最小化する、 又は良好 な性状のスラリ一を得る目的で、 晶析時の単位時間当たりの結晶の晶出量を制御 することができる。 好ましい単位時間当たりの晶出量は、 例えば、 単位時間当た り全晶出量の約 5 0 %量が晶出する速度以下 （即ち、 最大で 5 0 %量 時間） で あり、 好ましくは、 単位時間当たり全晶出量の約 2 5 %量が晶出する速度以下 （ 即ち、 最大で 2 5%量/時間） である。 尚、 冷却晶析における冷却速度は、 通常、 約 40°C/時間以下であり、 好ましくは約 2 0°CZ時間以下である。

晶析濃度も一つの重要な因子であり、 晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還 元型補酵素 。の重量として、 約 1 5 wZw%以下、 好ましくは約 1 3 w/w %以下、 より好ましくは約 1 OwZwyo以下である。 用いる溶媒種によっても好 適な晶析濃度は異なり、 良好に晶析するためには、 例えば、 脂肪族炭化水素又は 脂肪族炭化水素を主成分とする場合は、 晶析濃度は約 1 3 wZw%以下、 好まし くは約 1 0w/w%以下、 より好ましくは約 8 wZw%以下であり、 最も好適な 非環状脂肪族炭化水素又は非環状脂肪族炭化水素を主成分とする場合は、 晶析濃 度は約 1 0 w/w%以下、 好ましくは約 8 w/w%以下、 より好ましくは約 7w /w%以下である。 上記濃度を維持することによって、 工業的規模での操作性に 耐えうる好適な晶析が可能となる。 濃度の下限は、 特に制限されないが、 生産性 の観点から、 通常、 約 l w/w%以上であり、 好ましくは約 2 w/w%以上であ る。

晶析は、 強制流動下に実施するのが好ましい。 過飽和の形成を抑制し、 スムー スに核化 '結晶成長を行うため、 また、 高品質化の観点から、 単位容積当たりの 撹拌所要動力として、 通常約 0. 0 1 kWZm³以上、 好ましくは約 0. 1 kW /m³以上、 より好ましくは約 0. 3 kW/m³以上の流動が好ましい。 上記の 強制流動は、 通常、 撹拌翼の回転により与えられるが、 上記流動が得られれば必 ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、 例えば、 液の循環による方法等を利用しても 良い。

晶析に際しては、 過飽和の形成を抑制し、 スムースに核化 ·結晶成長を行うた めに、 種晶を添加するのが好ましい。

本発明の晶析においては、 必要に応じて、 上記酸化防護効果の高い溶媒の他に、 上述した補助的な他の溶媒を悪影響のない範囲で併用することもできる。 還元型 補酵素 。の溶解度、 晶析濃度、 晶析温度、 収率、 スラリー性状、 結晶性状等 を改善するために、 上記の溶媒に補助的な溶媒を適量加えて使用してもよいが、 混合溶媒とすることにより、 溶解度が劇的に上昇して、 むしろ晶析収率が低下す る等の傾向が認められる場合もある。 従って、 酸化防護効果ゃ晶析収率等の観点 から、 実質的に上記溶媒を主成分とする溶媒を用いるのが好ましい。 よって、 他 溶媒との混合溶媒として用いる場合においては、 他の溶媒の比率 （容量比） は、 必ずしも限定はされないが、 通常約 0 . 3未満、 好ましくは約 0 . 2未満、 より 好ましくは約 0 . 1未満、 さらに好ましくは約 0 . 0 5未満である。 言うまでも なく、 下限は 0である。 容量比は、 前述の如く、 均一系においては全溶媒の容量 に対する他の溶媒の容量比率であり、 不均一系においては還元型補酵素 Q _{1 0}を より良く溶解する溶媒相の容量に対する他の溶媒の容量比率である。

し力 し、 補助的な他の溶媒として水を併用することにより、 水の特性が発揮さ れ、 スラリー性状の改善等に寄与しうる。 還元型補酵素 Q _{1 0}の晶析における水 の使用量は、 晶出した還元型補酵素 。のスラリー濃度やスラリー性状に影響 する。 水使用量が多いほど、 スラリー濃度が低下し、 一般に流動性も向上する一 方、 全体としてのスラリー濃度が下がって生産性の低下につながるので、 これら の点を勘案して、 好適な範囲に調整 '維持するために適宜変量すればよく、 特に 制限されない。

上記の補助的な他の溶媒は、 晶析に際して、 予め添加しても良く、 晶析途中で 添加して良く、 また、 晶出量が安定した後に添加しても良い。

このようにして得られる還元型補酵素 Q _{1 0}の結晶は、 例えば、 遠心分離、 加 圧濾過、 減圧濾過等による固液分離、 さらに、 必要に応じてケーキ洗浄を行い、 湿体として取得することができる。 また、 さらに内部を不活性ガスに置換した減 圧乾燥器 （真空乾燥器） に湿体を仕込み、 減圧下、 乾燥し、 乾体として取得する ことができるし、 乾体として取得するのが好ましい。

なお、 晶析は脱酸素雰囲気下にて実施することにより、 さらに、 酸化防護効果 を高めることができる。 脱酸素雰囲気は、 不活性ガスによる置換、 減圧、 沸騰や これらを組み合わせることにより達成できる。 少なくとも、 不活性ガスによる置 換、 即ち、 不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。 上記不活性ガスとしては、 例えば、 窒素ガス、 ヘリ ウムガス、 アルゴンガス、 水素ガス、 炭酸ガス等を挙げ ることができ、 好ましくは窒素ガスである。

本発明により、 高品質の還元型補酵素 。を簡便且つ効率的に合成、 晶析す ることができる。 また、 本発明により得られる還元型補酵素 Q _{1 Q}結晶は、 極め て高品質であり、 還元型補酵素 Q_lf)Z酸化型補酵素 。の重量比は、 96/4 以上、 好ましくは 98Z2以上、 より好ましくは 99/1以上が期待できる。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら実施 例のみに限定されるものではない。 また、 実施例中の還元型補酵素 Q₁₀の純度、 還元型補酵素 Q！。と酸化型補酵素 Q i。との重量比は、 下記 H P L C分析により 求めたが、 得られた還元型補酵素 Q₁₀の純度は本発明における純度の限界値を 規定するものではなく、 また、 同様に、 還元型補酵素 。と酸化型補酵素 Q₁₀ との重量比も、 その上限値を規定するものではない。

(HP LC分析条件）

カラム ； SYMMETRY C 18 (W a t e r s製） ， 25 Omm (長さ） ， 4. 6 mm (内径） 、 移動相； C₂H₅OH： CH₃OH=4 ： 3 (v ： v) 、 検 出波長； 2 1 0 nm、 流速； 1 m 1 /m i n、 還元型補酵素 Q i。の保持時間； 9. lm i n、 酸化型補酵素 。の保持時間； 1 3. 3m i n。

(実施例 1 )

100 gの酸化型補酵素 Q_{1 ()} (酸化型補酵素 Q ₉を 0. 40%含有、 純度 99. 4 %) を 25 °Cで 1000 gのへプタンに溶解させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤として次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 100 gに 100 Om 1の水を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 25 °C、 pH4〜6で還元反応を行った。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 脱気 した飽和食塩水 1000 gでヘプタン相を 6回水洗して還元型補酵素 Q₁₀を 1 00 g (還元型補酵素 Q₉を 0. 40%含有） を含むヘプタン相を得た。 このへ ブタン相を撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW m³) しながら 2°Cまで冷却し、 白 色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 得ら れたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を冷ヘプタン、 冷エタノール、 冷水、 冷エタ ノール、 冷ヘプタンで順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2°C) して、 さら に、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 l〜30mmHg) することにより、 白 色の乾燥結晶 93 g (還元型補酵素 Q ₉を 0. 29%含有、 除去率 28%) を得 た （有姿収率 93モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 。ノ酸化型補酵素 。の重量比は 99. 6/0. 4、 還元型補酵素 。の純度は 99. 2%であ つた。

(実施例 2、 比較例 1)

実施例 1で得られた 1 gの還元型補酵素 。を、 25 °C下で表 1に示す各種 溶媒 20 gに溶解した。 大気中、 25 °Cで 24時間の撹拌後、 液中の還元型補酵 素 。/酸化型補酵素 。の重量比を測定した結果と、 比較のため上記と同条 件下 （1 gの還元型補酵素 。を大気中 25°Cで 24時間） で結晶を保存した 結果を表 1に示す。

R

ヘプタン 99. 1/0. 9

へキサン 98, 7/1. 3

トルエン 98. 8/1. 2

実施例 2 クロ口ホルム 98. 9/1. 1

酢酸ェチル 98. 9/1. 1

メチノレ t e r t—ブチノレエ一テ レ 98. 6/1. 4

テトラヒ ドロフラン 98. 5/1. 5

メチルイソブチルケトン 69. 2/30 8 ジメチルホルムアミ ド 31. 0/69 0 比較例 1

N—メチルーピ口リ ドン 67. 3/32 7 fct曰 95. 9/4. 1

R：還元型捕酵素 Q！ 0ノ酸化型補酵素 Q 0の重量比

(実施例 3、 比較例 2)

実施例 1で得られた 1 gの還元型補酵素 。を、 35 °C下で表 2に示す各種 溶媒 100 gに溶解した。 大気中、 35 °Cで 24時間の撹拌後、 液中の還元型補 酵素 Q !。ノ酸化型補酵素 Q i。の重量比を測定した結果を表 2に示す。

表 2

R：還元型補酵素 Q！。/酸化型捕酵素 Q i Qの重量比

(実施例 4 )

1 0 gの酸化型補酵素 。を 2 5 °Cで表 3に記載の各種溶媒 1 0 0 gに溶解 させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. S kWZm³) しながら、 還元剤として市販の 次亜硫酸ナトリウム （純度 7 5%以上） 1 0 gに 1 0 Om 1 の水を加えて溶解さ せた水溶液を、 徐々に添加し、 2 5°C、 p H4〜6で還元反応を行った。 2時間 後、 反応液から水相を除去し、 さらに脱気した飽和食塩水 1 0 0 gで有機相を 6 回水洗した。 なお、 すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。 有機相中の還元型 補酵素 Q i。ノ酸化型補酵素 Q i。の重量比を測定した結果を表 3に示す。

表 3 溶媒 R

ヘプタン 9 9. 5/0. 5

へキサン 9 9. 3/0. 7

酢酸ェチル 9 9. 4/0. 6

メチノレ t e r tーブチノレエーテノレ 9 9. 2/0. 8

トルエン 9 9. 4/0. 6

クロロホノレム 9 9. 3/0. 7

R：還元型補酵素 Q , ₀ /酸化型補酵素 Q ,。の重量比

(実施例 5 ) 10 gの酸化型補酵素 。を 25°Cで 100 gのヘプタンに溶解させ、 亜鉛 粉末 1. 5 g及び 2. 9N硫酸 110 gを添カ卩し、 25 °Cで 6時間の撹拌 （撹拌 所要動力 0. 3 kW/m³) 後、 100 gの濃塩酸を添加した。 ヘプタン相の還 元型補酵素 Q！ ₀ノ酸化型補酵素 Q i 0の重量比を測定したところ 99. 6/0. 4であった。 なお、 すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。

(実施例 6 )

酸化型補酵素 。を溶解する溶媒としてへキサンを用いる以外、 実施例 1と 同様に、 還元および晶析を行った。 その結果、 白色の乾燥結晶 93 gを得た （有 姿収率 93モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 。ノ酸化型補酵素 Q₁₀の 重量比は 99. 4/0. 6、 還元型補酵素 。の純度は 99. 0%であった。

(実施例 7 )

100 gの酸化型補酵素 Q！。 （純度 99. 4%) を 25 °Cで 1000 gのへ キサンに溶解させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤 として次亜硫酸ナトリウム （純度 75 %以上） 100 gに 1000 m 1の水を加 えて溶解した水溶液を、 徐々に添加し、 25°C、 pH4〜6で還元反応を行った。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 さらに脱気した飽和食塩水 1000 gでへ キサン相を 6回水洗した。 このへキサン相にメタノール 50 gを添カ卩し、 撹拌 （ 撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら 2°Cまで冷却して、 白色のスラリーを 得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 得られたスラリーを 減圧ろ過し、 湿結晶を冷へキサン、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノール、 冷へキ サンで順に洗浄し （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2°C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （2 0〜40°C、 1〜3 OmmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 92 gを得た (有姿収率 92モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q_1QZ酸化型補酵素

。の重量比は 99. 4/0. 6、 還元型補酵素 。の純度は 99. 0%であった。

(実施例 8)

100 gの酸化型補酵素 Q_{1 D} (純度 99. 4%) を 25°Cで 1000 gの酢 酸ェチルに溶解させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. S kWZm³) しながら、 還元 剤として次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 100 gに 100 Om 1の水を 加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加して、 25°C、 pH4〜6で還元反応を 行った。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 さらに脱気した飽和食塩水 100 0 gで酢酸ェチル相を 6回水洗した。 この酢酸ェチル相にエタノール 300 gお よび水 50 gを添加し、 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら 2°Cま で冷却し、 実施例 1と比較して流動性の改善された白色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を冷エタノール、 冷水、 冷エタノールで順に洗浄し （洗浄に用いた冷溶媒 の温度は 2°C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 l〜30mmHg) するこ とにより、 白色の乾燥結晶 89 gを得た （有姿収率 89モル％) 。 得られた結晶 の還元型補酵素 。 酸化型補酵素 。の重量比は 99. 5/0. 5、 還元型 補酵素 。の純度は 99. 2%であった。 (実施例 9 )

還元型補酵素 Q_1Q 100 g (還元型補酵素 Q^Z酸化型補酵素 。の重量比 =95/5、 補酵素 Q₁₀の純度は 99. 4%) を 25°Cで 1000 gのへプタ ンに溶解させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤とし て次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 10 gに 100 Om 1の水を加えて溶 解させた水溶液を、 徐々に添加し、 25°C、 pH4〜6で還元反応を行った。 2 時間後、 反応液から水相を除去し、 さらに脱気した飽和食塩水 1000 gでヘプ タン相を 6回水洗した。 このヘプタン相を撹拌しながら （撹拌所要動力 0. 3 k W/m³) 2°Cまで冷却し、 白色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は 窒素雰囲気下で実施した。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を冷ヘプタン、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノール、 冷ヘプタンで順に洗浄し （洗浄に用いた冷 溶媒の温度は 2 °C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 l〜30mmHg) す ることにより、 白色の乾燥結晶 93 gを得た （有姿収率 93モル％) 。 得られた 結晶の還元型補酵素 Q^Z酸化型補酵素 。の重量比は 99. 6/0. 4、 還 元型補酵素 。の純度は 99. 2%であった。 (実施例 10)

使用した酸化型補酵素 。の純度が 98. 4% (酸化型補酵素 Q₉を 1. 0%、 酸化型補酵素 Q₈を 0. 30%、 及び、 酸化型補酵素 Q₇を 0. 04%含有） で あること以外は、 実施例 1とまったく同条件下にて還元及び晶析を行った。 その 結果、 白色の乾燥結晶 93 g (還元型補酵素 Q₉を 0. 72%含有：除去率 28 %、 還元型補酵素 Q₈を 0. 1 1° /。含有：除去率 63%、 還元型補酵素 Q₇は検 出されず） を得た （有姿収率 93モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q₁₀ Z酸化型補酵素 Qi。の重量比は 99. 6/0. 4、 還元型補酵素 。の純度は 99. 0 %であった。

(実施例 1 1 )

実施例 1と同様の方法で得られた還元型補酵素 。の結晶 （還元型補酵素 Q₉ を 0. 29%含有、 純度 99. 1%、 還元型補酵素 Q^Z酸化型補酵素 。の 重量比は 99. 4/0. 6) 10 gを 45。Cで 140 gのァセトニトリルに溶解 させ、 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら 2°Cまで冷却して白色の スラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 得られた スラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を冷ァセトニトリル、 冷水、 冷ァセトニトリルで 順に洗浄し （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜4 0°C 1~3 OmmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 9. 5 g (還元型補 酵素 Q₉を 0. 25%含有、 除去率 14%) を得た （有姿収率 95モル％) 。 得 られた結晶の還元型補酵素 。/酸化型補酵素 。の重量比は 99. 4/0. 6、 還元型補酵素 。の純度は 99. 1%であった。 (実施例 12 )

実施例 1と同様の方法で得られた還元型補酵素 。の結晶 （還元型補酵素 Q₉ を 0. 29%含有、 純度 98. 8%、 還元型補酵素 Q_1QZ酸化型補酵素 。の 重量比は 99. 1/0. 9) 10 gを 25°Cで 100 gのヘプタンに溶解させ、 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら 2°Cまで冷却して白色のスラリ 一を得た。 なお、 以上すベての操作は空気中で実施した。 得られたスラリーを減 圧ろ過し、 湿結晶を冷ヘプタン、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノール、 冷へプタ ンで順に洗浄し （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20 〜40°C、 l〜30mmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 （還元型補酵素 0₉を0. 20%含有、 除去率 31%) 9. 3 gを得た （有姿収率 93モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q_1C)Z酸化型補酵素 Q_1Qの重量比は 99. 0/1. 0、 還元型補酵素 。の純度は 98. 8%であった。

(比較例 3 )

実施例 1で得られた還元型補酵素 Q i。の結晶 10 gを 25°Cで 70 gの N— メチルピロリ ドンに溶解させた。 さらに水 10 gを添加し、 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら 2°Cまで冷却して淡黄色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は空気中で実施した。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶 を冷エタノール、 冷水、 冷エタノールで順に洗浄し （洗浄に用いた冷溶媒の温度 は 2°C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 l〜30mmHg) することによ り、 淡黄色の乾燥結晶 9. 6 gを得た （有姿収率 96モル。/。） 。 得られた結晶は 淡黄色で、 還元型補酵素 Q₁₍₃Z酸化型補酵素 Q_1Qの重量比は 88. 6/1 1. 4、 還元型補酵素 。の純度は 88. 3%であった。 (実施例 1 3 )

100 gの酸化型補酵素 Qi。を 25でで 1000 gのへキサンに溶解させた。 撹拌 （撹拌所要動力 0. 3kWZm³) しながら、 還元剤として次亜硫酸ナトリ ゥム （純度 75%以上） 40 gに 100 Om 1の水を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 25°C、 pH4〜6で還元反応を行った。 2時間後、 反応液から 水相を除去し、 脱気した飽和食塩水 1000 gでへキサン相を 6回水洗した。 な お、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 このへキサン溶液中の還元型 補酵素 。ノ酸化型補酵素 。の重量比は 99. 2/0. 8であった。

(実施例 14) 1000 gのァセトニトリル中に、 100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4%) 、 60 gの Lーァスコルビン酸及び 30 gの炭酸水素ナトリウムを加え、 55°Cにて撹拌し、 還元反応を行った。 40時間後、 反応液にヘプタン 1000 g、 脱気した水 1000 gを加えて 25°Cに冷却した。 水層を除去した後、 さら に脱気した飽和食塩水 1000 gでヘプタン相を 6回水洗した。 この、 ヘプタン 相を撹拌 （撹拌所要動力 0. S kW/m³) しながら 2°Cまで冷却し、 白色のス ラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 得られたス ラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を冷ヘプタン、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノール、 冷ヘプタンで順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) して、 さらに、 湿結 晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 1-3 OmmHg) することにより、 白色の乾燥 結晶 95 gを得た （有姿収率 95モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q₁₀ Z酸化型補酵素 Q_1Qの重量比は 99. 5/0. 5、 還元型補酵素 。の純度は 99. 0%であった。 (比較例 4 )

すべての操作を空気中で行うこと以外、 すべて実施例 13と同様にして還元反 応を行った。 得られたへキサン溶液中の還元型補酵素 Q₁₀ /酸化型補酵素 Q₁₀ の重量比は 45. 3/54. 7であった。 産業上の利用可能性

本発明は、 上述の構成よりなるので、 工業的規模での生産に適した方法で、 高 品質の還元型補酵素 Q！。を簡便且つ効率的に得ることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 酸化型補酵素 Q i。を還元して還元型補酵素 Q i。を合成する方法において、 へキサンを除く炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類 から選ばれる少なくとも 1種を溶媒として用いることを特徴とする還元型補酵素 。の製造方法。

2 . 溶媒として、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ば れる少なく とも 1種を用いる請求の範囲第 1項記載の製造方法。

3 . 還元を脱酸素雰囲気下に行う請求の範囲第 1項又は 2項記載の製造方法。

4 . 酸化型補酵素 Q！。を還元して還元型補酵素 Q i。を合成する方法において、 脱酸素雰囲気下、 炭化水素類を溶媒として用いることを特徴とする還元型補酵素 。の製造方法。

5 . 溶媒としてヘプタン類を用いる請求の範囲第 4項記載の製造方法。

6 . 還元剤として、 水素化金属化合物、 鉄、 又は、 亜鉛を用いる請求の範囲第 1項〜 5項のいずれかに記載の製造方法。

7 . 還元剤として次亜硫酸類を用い、 水共存下に還元を行う請求の範囲第 1項 〜 5項のいずれかに記載の製造方法。

8 . p H 3〜 7で行われる請求の範囲第 7項記載の製造方法。

9 . 次亜硫酸類の使用量が、 酸化型補酵素 。と同重量以下である請求の範 囲第 7項又は 8項記載の製造方法。

10. 還元剤としてァスコルビン酸類を用いて実施する請求の範囲第 1項〜 5 項のいずれかに記載の製造方法。

1 1. 溶媒として水と相溶性の高いエーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれ る少なくとも 1種を用いることを特徴とする請求の範囲第 10項記載の製造方法。

1 2. ァスコルビン酸類の使用量が、 酸化型補酵素 。に対して、 1倍モル 以上である請求の範囲第 10項又は 1 1項記載の製造方法。

1 3. 塩基性物質又は亜硫酸水素塩の共存下に還元を行う請求の範囲第 10項 〜1 2項のいずれかに記載の製造方法。

14. 還元反応後、 生成した還元型補酵素 Q_{1 Q}を含有する有機相を採取し、 該有機相を水洗する請求の範囲第 1項〜 1 3項のいずれかに記載の製造方法。

1 5. 還元型補酵素 。を、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種を溶媒として用いて晶析すること を特徴とする還元型補酵素 Q i ₀の晶析方法。

1 6. 脂肪族炭化水素を溶媒に用いる請求の範囲第 1 5項記載の晶析方法。

1 7. 脂肪族炭化水素が、 非環状脂肪族炭化水素である請求の範囲第 1 6項記 載の晶析方法。

18. 脂肪族炭化水素が、 ペンタン類、 へキサン類、 ヘプタン類及びオクタン 類から選ばれる少なく とも 1種である請求の範囲第 1 6項記載の晶析方法。

1 9. 不純物を母液に除去する請求の範囲第 1 5項〜 18項のいずれかに記載 の晶析方法。

20. 除去される不純物が、 還元型補酵素 Q₉、 還元型補酵素 Q₈、 及び、 還 元型補酵素 Q₇から選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 19項記載の晶 析方法。

2 1. 還元型補酵素 。の晶析は、 冷却晶析、 又は、 冷却晶析に他の晶析法 を組み合わせて行う請求の範囲第 1 5項〜 20項のいずれかに記載の晶析方法。

22. 晶析時の冷却温度は、 20°C以下である請求の範囲第 21項記載の晶析 方法。

23. 晶析濃度が、 晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還元型補酵素 Q₁₀ の重量として、 1 5 w/w%以下である請求の範囲第 1 5項〜 22項のいずれか に記載の晶析方法。

24. 晶析は、 単位容積当たりの撹拌所要動力として 0. 0 1 kWZm³以上 の強制流動下に実施する請求の範囲第 1 5項〜 23項のいずれかに記載の晶析方 法。

25. 晶析に際して種晶を添加する請求の範囲第 1 5項〜 24項のいずれかに 記載の晶析方法。

26. 脱酸素雰囲気下で実施する請求の範囲第 1 5項〜 25項のいずれかに記 載の晶析方法。

27. 晶析に用いる還元型補酵素 。は請求の範囲第 1項〜 14項のいずれ かに記載の方法により得られたものである、 請求の範囲第 1 5項記載の晶析方法。

28. 請求の範囲第 1項〜 14項のいずれかに記載の方法で得られた還元反応 液、 又は、 該反応液から還元型補酵素 。含む有機相を採取し、 必要に応じて 有機相を洗浄して得られた溶液から還元型補酵素 Q _{1 0}を晶析する請求の範囲第 1 5項記載の晶析方法。

2 9 . 還元型補酵素 。を炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及 び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種の溶媒に溶解させて取り扱うことに より、 分子酸素による酸化を防護することを特徴とする還元型補酵素 Q i 0の安 定化方法。

3 0 . 還元型補酵素 Q j。を取り扱う操作が、 抽出 *水洗、 濃縮、 カラムクロ マトグラフィ一から選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 2 9項記載の安 定化方法。

3 1 . 抽出 ·水洗は、 外部添加した、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテ ル類、 及び、 二トリル類から選ばれる少なくとも 1種の溶媒を用いて行う請求の 範囲第 2 9項又は 3 0項記載の安定化方法。

3 2 . 炭化水素類がペンタン類、 へキサン類、 ヘプタン類及びオクタン類から 選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 2 9項〜 3 1項のいずれかに記載の 安定化方法。

3 3 . 脂肪酸エステル類がギ酸エステル、 酢酸エステル、 プロピオン酸エステ ルである請求の範囲第 2 9項〜 3 1項のいずれかに記載の安定化方法。

3 4 . エーテル類が炭素数 4〜 8のエーテルである請求の範囲第 2 9項〜 3 1 項のいずれかに記載の安定化方法。

3 5 . ニトリル類が炭素数 2〜 8の二トリルである請求の範囲第 2 9項〜 3 1 項のいずれかに記載の安定化方法。

36. 還元型補酵素 Q^Z酸化型補酵素 Q_{1 Q}の重量比が 96/4以上である 還元型補酵素 。結晶。