JP4220565B2 - 酸化防護効果の高い溶媒を用いる還元型補酵素ｑ１０の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０の合成方法及び晶析方法に関する。還元型補酵素Ｑ_１０は、酸化型補酵素Ｑ_１０に比べて高い経口吸収性を示し、優れた食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、飲料、飼料、動物薬、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な化合物である。

広く生物界に分布するベンゾキノン誘導体である酸化型補酵素Ｑ_１０は、そのビタミン様の機能からビタミンＱとも呼ばれており、弱った細胞活性を健康な状態に戻す栄養源として身体を若返らせる成分である。一方、還元型補酵素Ｑ_１０は、酸化型補酵素Ｑ_１０の２電子還元体であり、酸化型補酵素Ｑ_１０が橙色結晶であるのに対し、還元型補酵素Ｑ_１０は白色結晶である。還元型補酵素Ｑ_１０及び酸化型補酵素Ｑ_１０は、ミトコンドリア、リソゾーム、ゴルジ体、ミクロソーム、ペルオキシソーム、或いは細胞膜等に局在し、電子伝達系の構成成分としてＡＴＰ産生賦活、生体内での抗酸化作用、膜安定化に関与している事が知られている生体の機能維持に必要不可欠な物質である。

還元型補酵素Ｑ_１０は、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により補酵素Ｑ_１０を得た後、クロマトグラフィーにより流出液中の還元型補酵素Ｑ_１０区分を濃縮する方法等により得られることが知られている（特許文献１参照）。この場合、さらに上記還元型補酵素Ｑ_１０中に含まれる酸化型補酵素Ｑ_１０を、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム（次亜硫酸ナトリウム）等の一般的な還元剤を用いて還元した後、クロマトグラフィーによる濃縮を行っても良いこと、また、還元型補酵素Ｑ_１０は、既存の高純度補酵素Ｑ_１０（酸化型）に上記還元剤を作用させる方法によっても得られることが、当該公報中に記載されている。しかしながら、このようにして得られる還元型補酵素Ｑ_１０は、必ずしも純度が高い状態では取得できず、例えば、酸化型補酵素Ｑ_１０をはじめとする不純物を含有する低純度結晶、半固体状や油状物として得られやすい。

なお、補酵素Ｑ_１０をヘキサンに溶解し、これにハイドロサルファイトソーダ（次亜硫酸ナトリウム）水溶液を加えて撹拌し、還元型補酵素Ｑ_１０を合成した例が開示されている（特許文献２参照）が、還元剤として補酵素Ｑ_１０の２倍重量もの次亜硫酸ナトリウムを用いており、経済的な観点からも、その後の精製の煩雑さからも問題を有していた。

還元型補酵素Ｑ_１０は、分子酸素によって酸化型補酵素Ｑ_１０に酸化されやすい。工業的規模での製造においては、完全な酸素の除去は極めて難しく、さらに、個々の操作に要する時間はラボスケールでの製造とは異なりかなり長時間になるため、残存する酸素が大きな悪影響を及ぼす。上記酸化は難除去性の酸化型補酵素Ｑ_１０の副生及び製品への混入といった収率、品質面の問題に直結する。高純度の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を得るためには、上記酸化から好適に防護することが重要である。
特開平１０−１０９９３３号公報 特開昭５７−７０８３４号公報

本発明は、上記に鑑み、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を得るための簡便且つ効率的な合成方法並びに晶析方法を提供することを目的とする。さらに、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を得るための工業的規模での生産に適した優れた製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、還元型補酵素Ｑ_１０は特定の溶媒中で分子酸素による酸化から好適に防護されることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して還元型補酵素Ｑ_１０を合成する方法において、ヘキサンを除く炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いることを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０の製造方法に関する。
また、本発明は、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して還元型補酵素Ｑ_１０を合成する方法において、脱酸素雰囲気下、炭化水素類を溶媒として用いることを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０の製造方法に関する。

さらに、本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０を、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて晶析することを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０の晶析方法に関する。
また、本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０を炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解させて取り扱うことにより、分子酸素による酸化を防護することを特徴とする還元型補酵素Ｑ_１０の安定化方法に関する。
さらに、本発明は、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比が９６／４以上である還元型補酵素Ｑ_１０結晶に関する。

本発明の方法によれば、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して還元型補酵素Ｑ_１０を合成する方法において、還元型補酵素Ｑ_１０が分子酸素によって酸化されるのを好適に防護することができ、酸化型補酵素Ｑ_１０の副生が最小化された状態で、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を合成できる。また、還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する方法において、還元型補酵素Ｑ_１０が分子酸素によって酸化されるのを好適に防護することができ、酸化型補酵素Ｑ_１０の副生が最小化された状態で結晶状態へ移行させ、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０結晶を取得することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、還元型補酵素Ｑ_１０から酸化型補酵素Ｑ_１０への分子酸素による酸化を抑制して、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を合成するため、及び、晶析するため、さらに、還元型補酵素Ｑ_１０を安定に取り扱うために、上記酸化からの防護効果の高い溶媒、即ち、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を用いる。還元型補酵素Ｑ_１０は、驚くべきことに、結晶状態よりも、上記溶媒に溶解した、又は、懸濁した状態において、分子酸素による酸化からより好適に防護される。このような上記溶媒による酸化防護効果は、本発明者らにより初めて見出されたものである。

炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。

脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２のものが用いられる。
具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキセン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができる。
中でも、炭素数５〜８の飽和脂肪族炭化水素がより好ましく、炭素数５のペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン（ペンタン類と称す）；炭素数６のヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン（ヘキサン類と称す）；炭素数７のヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン（ヘプタン類と称す）；炭素数８のオクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン（オクタン類と称す）；及びこれらの混合物が好ましく用いられる。とりわけ、上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い傾向があり、特に好ましく、ヘプタンが最も好ましい。

芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼンである。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。

ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、非環状のものが好ましく用いられる。塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素がより好ましく、塩素化炭化水素がさらに好ましい。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが用いられる。
具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンである。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンである。さらに好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレンである。

脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。酢酸エステル、ギ酸エステルが好ましく、酢酸エステルがより好ましい。エステル基としては、特に制限されないが、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数１〜８のアラルキルエステル等が挙げられ、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルである。

プロピオン酸エステルとしては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチルである。

酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシルである。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルであり、最も好ましくは、酢酸エチルである。

ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸エチルである。

エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。
具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。
好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルである。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルである。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。

ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、クロロプロピオニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリルである。より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。

上記溶媒の中でも、例えば、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の行いやすい沸点（１気圧下、約３０〜１５０℃）、室温での取り扱い時でも室温以下に冷却した時でも固化しにくい融点（約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下）を持ち、粘性が低い（２０℃において約１０ｃｐ以下等）等の、沸点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。工業的な作業上の観点から、常温で揮発し難いものが好ましく、例えば、沸点が約８０℃以上のものが好ましく、約９０℃以上のものがより好ましい。

還元型補酵素Ｑ_１０は高濃度の溶液ほど酸化されにくい傾向にある。上記溶媒に対して還元型補酵素Ｑ_１０は高い溶解性を示し、上記溶媒はこの点でも酸化防護に好適である。還元型補酵素Ｑ_１０の酸化を防護するために好ましい濃度は、溶媒の種類等により一律に規定できないが、上記溶媒に対する還元型補酵素Ｑ_１０の濃度として、通常１ｗ／ｗ％以上、好ましくは２ｗ／ｗ％以上である。上限は、特に制限されないが、実際的な操作性という観点から、４００ｗ／ｗ％以下、好ましくは２００ｗ／ｗ％以下、より好ましくは１００ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは５０ｗ／ｗ％以下である。

さらに、上記溶媒に対する還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度は好適な温度依存性を示す。このため、上記溶媒の使用は、還元型補酵素Ｑ_１０の溶解量を好適に減じて、結晶状態へ移行させる（結晶化させる）上でも好適である。

このように、上記溶媒の使用によって、望ましくない酸素の副反応は、酸化型補酵素Ｑ_１０の還元反応、及び／又は、還元型補酵素Ｑ_１０の晶析の工程において最小化される。加えて、還元型補酵素Ｑ_１０を、上記溶媒に溶解させて取り扱うことにより、分子酸素による酸化を防護し、還元型補酵素Ｑ_１０を安定化させることができるので、抽出・水洗（外部添加した上記溶媒を用いる抽出・水洗）、濃縮（濃縮しながら他溶媒を添加する溶媒置換を含む）、カラムクロマトグラフィー等の取り扱い操作を好適に実施することができる。本発明においては、言うまでもなく、酸化型補酵素Ｑ_１０の還元反応から、還元型補酵素Ｑ_１０の晶析（精製晶析）までの一連の過程（必要に応じて還元型補酵素Ｑ_１０の抽出・水洗等を含む）を、上記溶媒を使用して実施するのが好ましい。

本発明においては、必要に応じて、上記溶媒の他に、他の溶媒を悪影響のない範囲で併用することもできる。例えば、還元反応においては、酸化型補酵素Ｑ_１０や還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度、還元剤の溶解度、反応速度等を改善するために、又、還元型補酵素Ｑ_１０の晶析においては、還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度、晶析濃度、晶析温度、収率、スラリー性状、結晶性状等を改善するために、上記の溶媒に他の溶媒を適量加えて使用することができる。
このような他の溶媒としては、特に制限されず、例えば、水、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、ニトリル類を除く窒素化合物類、硫黄化合物類等を挙げることができる。

アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜５、特に好ましくは炭素数１〜３のものである。さらには、炭素数２〜３の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。

１価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等を挙げることができる。
好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノールである。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコールである。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコールである。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、とりわけ好ましくは、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、最も好ましくは、エタノールである。

２価アルコールとしては、例えば、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることができる。好ましくは、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオールであり、最も好ましくは、１，２−エタンジオールである。
３価アルコールとしては、例えばグリセリン等を好適に用いることができる。

脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくは、アセトンである。
窒素化合物類としては、例えば、ニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等を挙げることができる。
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。

上記の他の溶媒は、融点、沸点、蒸気圧特性、相転移等の既知の物性や前記反応溶媒量、さらに酸化型補酵素Ｑ_１０、還元型補酵素Ｑ_１０や還元剤に対する溶解度に与える効果等をもとに、各々の溶媒の特性に従って好ましい割合で、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒と共に用いるのがよい。

上記の他の溶媒は、悪影響のない範囲で特に制限無く使用できるが、酸化防護効果や後述する晶析収率等の観点から、前述の酸化防護効果の高い溶媒（炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種）の比率（容量比）が大きいほど好ましく、実質的に酸化防護効果の高い溶媒を主成分とする溶媒を用いるのがより好ましい。

系が均一の溶媒相である場合は、反応溶媒、晶析溶媒、又は、濃縮、抽出、カラムクロマトグラフィー等で取り扱う際に使用する場合の主成分が、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒であるのが好ましい。又、系が異なる溶媒相を形成するような場合は、還元型補酵素Ｑ_１０をより良く溶解する溶媒相（例えば、水と相溶性の低い有機溶媒と水との混合溶媒系であるような場合、還元型補酵素Ｑ_１０は、水相には難溶であり、水と相溶性の低い有機溶媒相に可溶である）の主成分が、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の溶媒であるのが好ましい態様である。

この観点から、他の溶媒の使用量は、均一系の場合は、全溶媒量に対する容量比として、また、不均一系の場合は、還元型補酵素Ｑ_１０をより良く溶解する溶媒相の容量に対する容量比として、通常約０．３未満、好ましくは約０．２未満、より好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０５未満である。言うまでもなく、下限は０である。
上記の他の溶媒のなかでも、酸化型補酵素Ｑ_１０の還元反応においては、反応速度や収率向上の点から、アルコール類及び／又は水を併用するのが特に好ましい。還元型補酵素Ｑ_１０の晶析においては、流動性等のスラリー性状改善の点から、水を好ましく用いることができる。

次に、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して還元型補酵素Ｑ_１０を製造する方法について説明する。
本発明に用いる酸化型補酵素Ｑ_１０は、前述のように合成、発酵、天然物からの抽出等により調製したものであってもよく、既存の高純度補酵素Ｑ_１０であってもよい。また、酸化型補酵素Ｑ_１０のみを含有するものであってもよく、酸化型補酵素Ｑ_１０と還元型補酵素Ｑ_１０の混合物であってもよい。

本発明において、酸化型補酵素Ｑ_１０の還元は、上記の酸化防護効果の高い溶媒、即ち、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類のうちの少なくとも１種を溶媒として用い、水素化金属化合物、鉄（金属又は塩としての鉄）、亜鉛（金属としての亜鉛）、次亜硫酸類、アスコルビン酸類等を還元剤として用いて実施される。

水素化金属化合物としては、特に制限されないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム等を挙げることができる。上記水素化金属化合物の使用量は、水素化金属化合物の種類により異なり、一律に規定できないが、通常、理論水素当量の１〜３倍量で好適に実施できる。

鉄又は亜鉛を用いる還元は、通常、酸を使用して実施される。酸としては、特に制限されないが、例えば、酢酸等の脂肪酸、メタンスルホン酸等のスルホン酸、塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができる。好ましくは無機酸であり、より好ましくは硫酸である。
鉄の使用量は、特に制限されないが、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、例えば、約１／５重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限されないが、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。なお、鉄は、金属鉄のみならず、硫酸鉄（ＩＩ）等の塩の形態でも使用できる。
亜鉛の使用量は、特に制限されないが、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、例えば、約１／１０重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限されないが、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。

次亜硫酸類としては特に制限されず、通常、次亜硫酸の塩である。次亜硫酸の塩としては特に制限されず、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が好ましく、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩がより好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。上記次亜硫酸類の使用量は、特に制限されないが、通常、酸化型補酵素Ｑ_１０の仕込み重量に対して、約１／５重量以上、好ましくは約２／５重量以上、より好ましくは約３／５重量以上である。多くても特に支障はないが、経済的な観点から、通常、約２倍重量以下、好ましくは同重量以下で用いられる。よって、約２／５重量〜約同重量の範囲でより好適に実施できる。

アスコルビン酸類としては、特に制限されず、例えば、アスコルビン酸のみならず、ｒｈａｍｎｏ−アスコルビン酸、ａｒａｂｏ−アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏ−アスコルビン酸、ｆｕｃｏ−アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏ−アスコルビン酸、ｘｙｌｏ−アスコルビン酸、ｇａｌａｃｔｏ−アスコルビン酸、ｇｕｌｏ−アスコルビン酸、ａｌｌｏ−アスコルビン酸、ｅｒｙｔｈｒｏ−アスコルビン酸、６−デスオキシアスコルビン酸等のアスコルビン酸に類するものが挙げられ、また、それらのエステル体や塩であってもかまわない。さらに、これらは、Ｌ体、Ｄ体、或いは、ラセミ体であっても良い。より具体的には、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、Ｄ−ａｒａｂｏ−アスコルビン酸等を挙げることができる。還元型補酵素Ｑ_１０の製造において、上記アスコルビン酸類をいずれも好適に使用できるが、生成した還元型補酵素Ｑ_１０との分離のしやすさ等を考慮すると、上記のアスコルビン酸類のうち、特に水溶性のものが好適に用いられ、最も好ましくは、入手容易性、価格等の観点から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−ａｒａｂｏ−アスコルビン酸等のフリー体である。
上記のアスコルビン酸類の使用量は、特に制限されず、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元型補酵素Ｑ_１０に変換しうる有効量であればよく、酸化型補酵素Ｑ_１０に対して、通常１倍モル量以上、好ましくは１．２倍モル量以上である。上限は特に制限されないが、経済性を考慮して、通常１０倍モル量以下、好ましくは５倍モル量以下、より好ましくは３倍モル量以下である。

上記還元剤のうち、還元能力、収率、品質といった観点から、亜鉛、次亜硫酸類、アスコルビン酸類が好ましく、特に次亜硫酸類（具体的には、次亜硫酸塩）、アスコルビン酸類が好ましい。

還元反応においては、上記のようにアルコール類及び／又は水を好適に併用することができる。水は、特に還元剤として鉄、亜鉛、次亜硫酸類を用いる場合に好適である。還元剤として水素化金属化合物やアスコルビン酸類を用いる場合には、アルコール類を併用することができる。水、アルコール類の併用は、これら水、アルコール類の特性が発揮され、反応速度の向上や反応収率の向上等に寄与する。

以下に好ましい還元方法についてより詳細に述べる。
上記次亜硫酸類を用いる還元は、水を併用して、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒と水との混合溶媒系で実施するのが好ましい。その際、反応時のｐＨは、収率等の観点から、通常ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ３〜７、より好ましくはｐＨ３〜６で実施される。上記ｐＨは、酸（例えば、塩酸や硫酸等の無機酸）や塩基（例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物）を用いて調整することができる。

上記次亜硫酸類を用いる還元において、水の使用量は、特に制限されず、還元剤である次亜硫酸類を適度に溶解する量であれば良く、例えば、上記次亜硫酸類の水に対する重量が、通常３０ｗ／ｗ％以下、好ましくは２０ｗ／ｗ％以下になるように調整するのが良い。又、生産性等の観点から、通常１ｗ／ｗ％以上、好ましくは５ｗ／ｗ％以上、より好ましくは１０ｗ／ｗ％以上であるのが良い。

上記アスコルビン酸類を用いる還元は、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類のうち、特に水と相溶性の高い溶媒、なかでも、水と相溶性の高いエーテル類及びニトリル類から選ばれる少なくとも１種、具体的には、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル等を用いて実施するのが特に好ましい。他の溶媒としてアルコール類を使用することもできる。又、還元型補酵素Ｑ_１０の製造における反応促進の観点から（例えば、反応温度の低下、反応時間の短縮等）、塩基性物質や亜硫酸水素塩等の反応促進効果を有する添加剤を共存させて、還元を実施することができる。

上記塩基性物質としては、特に制限されず、例えば、無機化合物、有機化合物を問わず使用しうる。上記無機化合物としては、特に制限されないが、例えば、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩やアンモニア等を挙げることができる。その代表的なものとして、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、炭酸マグネシウム等のアルカリ土類金属炭酸塩等を挙げることができる。上記有機化合物としては、特に制限されないが、例えば、トリエチルアミン等のアミン等を挙げることができる。上記の塩基性物質のうち、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）の炭酸塩、炭酸水素塩、アンモニア等の無機化合物；トリエチルアミン等のアミン等の有機化合物といった弱い塩基性物質（弱塩基又は弱アルカリ）を好ましく使用できる。より好ましくは上記の弱塩基性の無機化合物である。
また、上記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等のアルカリ金属亜硫酸水素塩等を好適なものとして挙げることができる。

上記添加剤の量は、期待する程度の反応促進効果を発揮しうる量（有効量）であればよく、特に制限されないが、経済性も考慮して、アスコルビン酸類に対して、通常２０倍モル量以下、好ましくは１０倍モル量以下、より好ましくは５倍モル量以下、さらに好ましくは２倍モル量以下である。下限は、特に制限されないが、通常０．０１倍モル量以上、好ましくは０．０５倍モル量以上、より好ましくは０．１倍モル量以上、さらに好ましくは０．２倍モル量以上である。

本発明の還元反応は、強制流動下に実施するのが好ましい。単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ^３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ^３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ^３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法等を利用しても良い。

還元温度は、還元剤の種類や量によって異なり、一律に規定できない。例えば、次亜硫酸類を用いる還元においては、通常１００℃以下、好ましくは８０℃以下、より好ましくは６０℃以下で実施される。下限は、系の固化温度である。よって、還元は、通常０〜１００℃程度、好ましくは０〜８０℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度で好適に実施できる。また、アスコルビン酸類を用いる還元においては、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上で実施される。上限は系の沸点である。よって、還元は、通常３０〜１５０℃程度、好ましくは４０〜１２０℃程度、より好ましくは５０〜１００℃程度で好適に実施できる。

反応濃度は、特に制限はないが、溶媒の重量に対する酸化型補酵素Ｑ_１０の重量として、通常約１ｗ／ｗ％以上、好ましくは３ｗ／ｗ％以上、より好ましくは１０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは１５ｗ／ｗ％以上である。上限は、特に制限されないが、通常約６０ｗ／ｗ％以下、好ましくは５０ｗ／ｗ％以下、より好ましくは４０ｗ／ｗ％以下、さらに好ましくは３０ｗ／ｗ％以下である。よって、反応濃度は、約１〜６０ｗ／ｗ％、好ましくは約３〜５０ｗ／ｗ％、より好ましくは約１０〜４０ｗ／ｗ％で好適に実施できる。

還元反応は、還元剤の種類や量によって異なり、一律に規定できないが、通常、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１０時間以内、さらに好ましくは５時間以内に完了させることができる。

なお、還元反応は、脱酸素雰囲気下で実施するのが極めて好ましく、驚くべきことには、特に次亜硫酸類を用いた還元反応では、還元反応収率向上や還元剤量の削減に大きく寄与することも見い出した。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。

このようにして得られた還元反応液から、生成した還元型補酵素Ｑ_１０を含有する有機相を採取し、必要に応じて（好ましくは）、さらに有機相を水や食塩水等を用いて繰り返し水洗して、夾雑物を完全に除去した後、晶析に用いることができる。特に、還元剤として、次亜硫酸ナトリウム等の上記の次亜硫酸類を用いた場合には、次亜硫酸類由来の夾雑物を完全に除去したり、水相のｐＨを安定させるために、繰り返し水洗することが望ましい。

又、酸化型補酵素Ｑ_１０を、上記の水と相溶性の高い溶媒、特に、水と相溶性の高いエーテル類及びニトリル類（例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル等）から選ばれる少なくとも１種を用いて、アスコルビン酸類で還元を行った場合は、還元反応液から直接還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する（直接単離法（ワンポット法））のが極めて簡便且つ効率的な方法である。

上記還元反応後の処理は、脱酸素雰囲気下にて実施するのが好ましく、これにより酸化防護効果をさらに高めることができる。

次に、還元型補酵素Ｑ_１０の晶析について説明する。
晶析に用いる還元型補酵素Ｑ_１０は、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により得ることができる。好ましくは、還元型補酵素Ｑ_１０中に含まれる酸化型補酵素Ｑ_１０を還元、或いは、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元することにより得られたものであり、より好ましくは、前記の本発明の還元反応を用いて得られたものである。

本発明の晶析法は、酸化型補酵素Ｑ_１０を比較的多く含有するものについても適用できるが、上記の還元方法等により調製された高純度の還元型補酵素Ｑ_１０に対して特に有効である。本発明においては、従来公知の方法により得られた、あるいは、上記の還元方法等により製造された、還元型補酵素Ｑ_１０を含有する反応液や抽出液に含有される不純物の除去も兼ねて精製晶析するのが特に効果的である。より具体的には、上記還元方法で得られた還元反応液、又は、該反応液から還元型補酵素Ｑ_１０含む有機相を採取し、必要に応じて有機相を洗浄して得られた溶液から還元型補酵素Ｑ_１０を晶析することができる。このとき、不純物を母液に除去することが好ましい。これにより、共存する不純物、特に、通常除去するのが必ずしも容易ではない構造の類似した類縁化合物（具体的には、還元型補酵素Ｑ_９、還元型補酵素Ｑ_８、還元型補酵素Ｑ_７等）を除去することができる。言うまでもなく、一度精製晶析して得られた還元型補酵素Ｑ_１０結晶を再精製するための、再結晶法としても利用可能である。

還元型補酵素Ｑ_１０の晶析は、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて行われる。なかでも炭化水素類が好ましく、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素がより好ましく、脂肪族炭化水素がさらに好ましく、前述のペンタン類、ヘキサン類、ヘプタン類、オクタン類が特に好ましい。また、晶析収率、晶析時に過度の冷却を必要としない等の観点からは、脂肪族炭化水素類のなかでも、非環状脂肪族炭化水素が特に好ましい。

晶析方法としては、特に制限されず、一般に用いられる晶析法、即ち、冷却晶析、濃縮晶析、溶媒置換晶析等のうちの少なくとも一つを用いて実施することができる。特に、冷却晶析、又は、冷却晶析に他の晶析法を組み合わせて実施するのが好ましい。

晶析時の冷却温度は一つの重要な因子であり、例えば収率等の観点から、通常２０℃以下、好ましくは１０℃以下、より好ましくは５℃以下である。下限は、系の固化温度である。よって、冷却温度を、通常−３０℃〜＋１０℃程度、好ましくは−２０℃〜＋１０℃程度、より好ましくは−１０℃〜＋５℃程度とすることにより、晶析を好適に実施できる。

得られる還元型補酵素Ｑ_１０中への各種不純物の混入を最小化する、又は良好な性状のスラリーを得る目的で、晶析時の単位時間当たりの結晶の晶出量を制御することができる。好ましい単位時間当たりの晶出量は、例えば、単位時間当たり全晶出量の約５０％量が晶出する速度以下（即ち、最大で５０％量／時間）であり、好ましくは、単位時間当たり全晶出量の約２５％量が晶出する速度以下（即ち、最大で２５％量／時間）である。尚、冷却晶析における冷却速度は、通常、約４０℃／時間以下であり、好ましくは約２０℃／時間以下である。

晶析濃度も一つの重要な因子であり、晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還元型補酵素Ｑ_１０の重量として、約１５ｗ／ｗ％以下、好ましくは約１３ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約１０ｗ／ｗ％以下である。用いる溶媒種によっても好適な晶析濃度は異なり、良好に晶析するためには、例えば、脂肪族炭化水素又は脂肪族炭化水素を主成分とする場合は、晶析濃度は約１３ｗ／ｗ％以下、好ましくは約１０ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約８ｗ／ｗ％以下であり、最も好適な非環状脂肪族炭化水素又は非環状脂肪族炭化水素を主成分とする場合は、晶析濃度は約１０ｗ／ｗ％以下、好ましくは約８ｗ／ｗ％以下、より好ましくは約７ｗ／ｗ％以下である。上記濃度を維持することによって、工業的規模での操作性に耐えうる好適な晶析が可能となる。濃度の下限は、特に制限されないが、生産性の観点から、通常、約１ｗ／ｗ％以上であり、好ましくは約２ｗ／ｗ％以上である。

晶析は、強制流動下に実施するのが好ましい。過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うため、また、高品質化の観点から、単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ^３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ^３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ^３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法等を利用しても良い。

晶析に際しては、過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うために、種晶を添加するのが好ましい。

本発明の晶析においては、必要に応じて、上記酸化防護効果の高い溶媒の他に、上述した補助的な他の溶媒を悪影響のない範囲で併用することもできる。還元型補酵素Ｑ_１０の溶解度、晶析濃度、晶析温度、収率、スラリー性状、結晶性状等を改善するために、上記の溶媒に補助的な溶媒を適量加えて使用してもよいが、混合溶媒とすることにより、溶解度が劇的に上昇して、むしろ晶析収率が低下する等の傾向が認められる場合もある。従って、酸化防護効果や晶析収率等の観点から、実質的に上記溶媒を主成分とする溶媒を用いるのが好ましい。よって、他溶媒との混合溶媒として用いる場合においては、他の溶媒の比率（容量比）は、必ずしも限定はされないが、通常約０．３未満、好ましくは約０．２未満、より好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０５未満である。言うまでもなく、下限は０である。容量比は、前述の如く、均一系においては全溶媒の容量に対する他の溶媒の容量比率であり、不均一系においては還元型補酵素Ｑ_１０をより良く溶解する溶媒相の容量に対する他の溶媒の容量比率である。

しかし、補助的な他の溶媒として水を併用することにより、水の特性が発揮され、スラリー性状の改善等に寄与しうる。還元型補酵素Ｑ_１０の晶析における水の使用量は、晶出した還元型補酵素Ｑ_１０のスラリー濃度やスラリー性状に影響する。水使用量が多いほど、スラリー濃度が低下し、一般に流動性も向上する一方、全体としてのスラリー濃度が下がって生産性の低下につながるので、これらの点を勘案して、好適な範囲に調整・維持するために適宜変量すればよく、特に制限されない。
上記の補助的な他の溶媒は、晶析に際して、予め添加しても良く、晶析途中で添加して良く、また、晶出量が安定した後に添加しても良い。

このようにして得られる還元型補酵素Ｑ_１０の結晶は、例えば、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過等による固液分離、さらに、必要に応じてケーキ洗浄を行い、湿体として取得することができる。また、さらに内部を不活性ガスに置換した減圧乾燥器（真空乾燥器）に湿体を仕込み、減圧下、乾燥し、乾体として取得することができるし、乾体として取得するのが好ましい。

なお、晶析は脱酸素雰囲気下にて実施することにより、さらに、酸化防護効果を高めることができる。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。

本発明により、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を簡便且つ効率的に合成、晶析することができる。また、本発明により得られる還元型補酵素Ｑ_１０結晶は、極めて高品質であり、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は、９６／４以上、好ましくは９８／２以上、より好ましくは９９／１以上が期待できる。

本発明は、上述の構成よりなるので、工業的規模での生産に適した方法で、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を簡便且つ効率的に得ることができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。また、実施例中の還元型補酵素Ｑ_１０の純度、還元型補酵素Ｑ_１０と酸化型補酵素Ｑ_１０との重量比は、下記ＨＰＬＣ分析により求めたが、得られた還元型補酵素Ｑ_１０の純度は本発明における純度の限界値を規定するものではなく、また、同様に、還元型補酵素Ｑ_１０と酸化型補酵素Ｑ_１０との重量比も、その上限値を規定するものではない。

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム；ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製），２５０ｍｍ（長さ），４．６ｍｍ（内径）、移動相；Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ：ＣＨ_３ＯＨ＝４：３（ｖ：ｖ）、検出波長；２１０ｎｍ、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、還元型補酵素Ｑ_１０の保持時間；９．１ｍｉｎ、酸化型補酵素Ｑ_１０の保持時間；１３．３ｍｉｎ。

（実施例１）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（酸化型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有、純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘプタンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗して還元型補酵素Ｑ_１０を１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．４０％含有）を含むヘプタン相を得た。このヘプタン相を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘプタン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘプタンで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９３ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２９％含有、除去率２８％）を得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。

（実施例２、比較例１）
実施例１で得られた１ｇの還元型補酵素Ｑ_１０を、２５℃下で表１に示す各種溶媒２０ｇに溶解した。大気中、２５℃で２４時間の撹拌後、液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定した結果と、比較のため上記と同条件下（１ｇの還元型補酵素Ｑ_１０を大気中２５℃で２４時間）で結晶を保存した結果を表１に示す。

（実施例３、比較例２）
実施例１で得られた１ｇの還元型補酵素Ｑ_１０を、３５℃下で表２に示す各種溶媒１００ｇに溶解した。大気中、３５℃で２４時間の撹拌後、液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定した結果を表２に示す。

（実施例４）
１０ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０を２５℃で表３に記載の各種溶媒１００ｇに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として市販の次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１０ｇに１００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、さらに脱気した飽和食塩水１００ｇで有機相を６回水洗した。なお、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。有機相中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定した結果を表３に示す。

（実施例５）
１０ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０を２５℃で１００ｇのヘプタンに溶解させ、亜鉛粉末１．５ｇ及び２．９Ｎ硫酸１１０ｇを添加し、２５℃で６時間の撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）後、１００ｇの濃塩酸を添加した。ヘプタン相の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比を測定したところ９９．６／０．４であった。なお、すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。

（実施例６）
酸化型補酵素Ｑ_１０を溶解する溶媒としてヘキサンを用いる以外、実施例１と同様に、還元および晶析を行った。その結果、白色の乾燥結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．４／０．６、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。

（実施例７）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘキサンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解した水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、さらに脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘキサン相を６回水洗した。このヘキサン相にメタノール５０ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却して、白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘキサン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘキサンで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９２ｇを得た（有姿収率９２モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．４／０．６、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。

（実施例８）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇの酢酸エチルに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加して、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、さらに脱気した飽和食塩水１０００ｇで酢酸エチル相を６回水洗した。この酢酸エチル相にエタノール３００ｇおよび水５０ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却し、実施例１と比較して流動性の改善された白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶８９ｇを得た（有姿収率８９モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。

（実施例９）
還元型補酵素Ｑ_１０１００ｇ（還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比＝９５／５、補酵素Ｑ_１０の純度は９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘプタンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）１０ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、さらに脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗した。このヘプタン相を撹拌しながら（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘプタン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘプタンで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．２％であった。

（実施例１０）
使用した酸化型補酵素Ｑ_１０の純度が９８．４％（酸化型補酵素Ｑ_９を１．０％、酸化型補酵素Ｑ_８を０．３０％、及び、酸化型補酵素Ｑ_７を０．０４％含有）であること以外は、実施例１とまったく同条件下にて還元及び晶析を行った。その結果、白色の乾燥結晶９３ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．７２％含有：除去率２８％、還元型補酵素Ｑ_８を０．１１％含有：除去率６３％、還元型補酵素Ｑ_７は検出されず）を得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．６／０．４、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。

（実施例１１）
実施例１と同様の方法で得られた還元型補酵素Ｑ_１０の結晶（還元型補酵素Ｑ_９を０．２９％含有、純度９９．１％、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．４／０．６）１０ｇを４５℃で１４０ｇのアセトニトリルに溶解させ、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却して白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷アセトニトリル、冷水、冷アセトニトリルで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９．５ｇ（還元型補酵素Ｑ_９を０．２５％含有、除去率１４％）を得た（有姿収率９５モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．４／０．６、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．１％であった。

（実施例１２）
実施例１と同様の方法で得られた還元型補酵素Ｑ_１０の結晶（還元型補酵素Ｑ_９を０．２９％含有、純度９８．８％、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．１／０．９）１０ｇを２５℃で１００ｇのヘプタンに溶解させ、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却して白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は空気中で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘプタン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘプタンで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶（還元型補酵素Ｑ_９を０．２０％含有、除去率３１％）９．３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．０／１．０、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９８．８％であった。

（比較例３）
実施例１で得られた還元型補酵素Ｑ_１０の結晶１０ｇを２５℃で７０ｇのＮ−メチルピロリドンに溶解させた。さらに水１０ｇを添加し、撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却して淡黄色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は空気中で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄し（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、淡黄色の乾燥結晶９．６ｇを得た（有姿収率９６モル％）。得られた結晶は淡黄色で、還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は８８．６／１１．４、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は８８．３％であった。

（実施例１３）
１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０を２５℃で１０００ｇのヘキサンに溶解させた。撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％以上）４０ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘキサン相を６回水洗した。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。このヘキサン溶液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．２／０．８であった。

（実施例１４）
１０００ｇのアセトニトリル中に、１００ｇの酸化型補酵素Ｑ_１０（純度９９．４％）、６０ｇのＬ−アスコルビン酸及び３０ｇの炭酸水素ナトリウムを加え、５５℃にて撹拌し、還元反応を行った。４０時間後、反応液にヘプタン１０００ｇ、脱気した水１０００ｇを加えて２５℃に冷却した。水層を除去した後、さらに脱気した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗した。この、ヘプタン相を撹拌（撹拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ^３）しながら２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷ヘプタン、冷エタノール、冷水、冷エタノール、冷ヘプタンで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９５ｇを得た（有姿収率９５モル％）。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ_１０の純度は９９．０％であった。

（比較例４）
すべての操作を空気中で行うこと以外、すべて実施例１３と同様にして還元反応を行った。得られたヘキサン溶液中の還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比は４５．３／５４．７であった。

本発明は、上述の構成よりなるので、工業的規模での生産に適した方法で、高品質の還元型補酵素Ｑ_１０を簡便且つ効率的に得ることができる。

Claims (15)

1. 脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を晶析溶媒として用いる還元型補酵素Ｑ_１０の晶析方法であって、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類、以外の他の溶媒の使用量が、均一系の場合は、全溶媒量に対する容量比として、不均一系の場合は、還元型補酵素Ｑ_１０をより良く溶解する溶媒相の容量に対する容量比として、０．３未満であることを特徴とする晶析方法。
2. 脂肪族炭化水素を溶媒に用いる請求項１記載の晶析方法。
3. 脂肪族炭化水素が、非環状脂肪族炭化水素である請求項２記載の晶析方法。
4. 脂肪族炭化水素が、ペンタン類、ヘキサン類、ヘプタン類及びオクタン類から選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の晶析方法。
5. 不純物を母液に除去する請求項１〜４のいずれかに記載の晶析方法。
6. 除去される不純物が、還元型補酵素Ｑ_９、還元型補酵素Ｑ_８、及び、還元型補酵素Ｑ_７から選ばれる少なくとも１種である請求項５記載の晶析方法。
7. 還元型補酵素Ｑ_１０の晶析は、冷却晶析、又は、冷却晶析に他の晶析法を組み合わせて行う請求項１〜６のいずれかに記載の晶析方法。
8. 晶析時の冷却温度は、２０℃以下である請求項７記載の晶析方法。
9. 晶析濃度が、晶析終了時の晶析溶媒の重量に対する還元型補酵素Ｑ_１０の重量として、１５ｗ／ｗ％以下である請求項１〜８のいずれかに記載の晶析方法。
10. 晶析は、単位容積当たりの撹拌所要動力として０．０１ｋＷ／ｍ^３以上の強制流動下に実施する請求項１〜９のいずれかに記載の晶析方法。
11. 晶析に際して種晶を添加する請求項１〜１０のいずれかに記載の晶析方法。
12. 脱酸素雰囲気下で実施する請求項１〜１１のいずれかに記載の晶析方法。
13. 還元型補酵素Ｑ_１０／酸化型補酵素Ｑ_１０の重量比が９６／４以上である還元型補酵素Ｑ_１０結晶。
14. 晶析に用いる還元型補酵素Ｑ_１０は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して得られたものである、請求項１記載の晶析方法。
15. 脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、脂肪酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類から選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて、酸化型補酵素Ｑ_１０を還元して得られた還元反応液、又は、該反応液から還元型補酵素Ｑ_１０含む有機相を採取し、必要に応じて有機相を洗浄して得られた溶液から還元型補酵素Ｑ_１０を晶析する請求項１記載の晶析方法。