WO2002097436A1

WO2002097436A1 - Core-shell type particles having signal-generating substance enclosed therein and process for producing the same

Info

Publication number: WO2002097436A1
Application number: PCT/JP2002/005271
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Yukio Nagasaki; Naoya Shibata; Nobuhiro Hoshino
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.; Nanocarrier Co., Ltd.
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2002-12-05
Also published as: EP1398635A1; ATE423970T1; DE60231301D1; US20040171771A1; EP1398635B1; KR20040010667A; JP4167975B2; JPWO2002097436A1; CN1618019A; EP1398635A4; CN1299116C; US6881484B2

Description

明細書シグナル生成物質封入コア一シェル型粒子及びその製造方法技術分野

本発明は、シグナル生成物質封入コアーシ：！:ル型粒子及びその製造方法に関する。本発明のシグナル生成物質封入コア一シヱル型粒子は、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物 [例えば、ポリエチレングリコール（P E G ) ] をブラシ状に担持する粒子の内部に、検出可能な物質を封入して含んでおり、最外殻に他の物質と結合性を有する活性残基を有しているので、簡易且つ高感度な標識物質として使用することができる。背景技術

微量な物質を視覚化したり、あるいは、定量するために、種々の標識物が開発されてきた。特に高感度を必要とする分野では、ラジオアイソトープが代表的な標識物であり、卜リチウムや放射性ヨウ素等が代表例として用いられ、フィルムによる感光、あるいは、シンチレーシヨンカウンタ一による放射能の測定という形で検出されてきた。

続いて、放射性物質の取り扱い制限に影響されない方法として、酵素標識法が開発された。ペルォキシダ一ゼ、アル力リフォスファタ一ゼ、グルコースォキシダーゼ、又は ^一 D—ガラクトシダーゼ等の抗原又は抗体に対する標識法が開発され、組織切片の染色法による観察や、酵素免疫測定法に適用した定量法が確立された。

一方、組織切片の染色法として、蛍光物質（例えば、フルォレツセイン又は口ーダミン等）を抗体に標識し、反応後、蛍光顕微鏡で観察するという方法が知られている。この方法は、放射性物質を用いることがないため、使用に制限を受けない点や、酵素のように基質を加えて反応するステップの必要がない点等、便利な点が多いが、標識としての絶対的感度が不足するという欠点がある。

この蛍光物質標識法の一つの発展型に時間分解蛍光測定がある。ユーロピウムキレー卜に代表される蛍光消光時間の長い蛍光物質にパルスの励起光をあて、直接の励起光や周辺物質に起因する短い蛍光が消光してしまう一定時間の後に、蛍光を測定し、ユーロピウム特異的蛍光を測定することにより、測定の精度及び感度を上昇させようという方法である。

更に感度を上げるために、このユーロピウムキレートをポリスチレン粒子に閉じこめ、一粒子あたりの蛍光物質量を増やして、感度を上昇させる試みもなされてきた。この方法では確かに粒子あたりの蛍光量は増すが、ポリスチレンは疎水性であるため、粒子表面も疎水性となり、生物学的反応に用いるには、環境に存在する多くの疎水性物質とべたべたくつつくという不利な点を承知の上で使用しなければいけないという欠点をもっていた。

一方、感度の向上よりも、むしろ操作の手軽さを追求する手段として色素をポリスチレン粒子に閉じこめ、ポリスチレン粒子の表面に抗原又は抗体をコ一卜して試薬とし、抗原抗体反応によって固定化されたポリスチレン粒子を視覚的に検出しようとする試みもなされている。

公知技術として知られている、色素や蛍光物質をポリスチレン粒子に閉じこめて標識物質とする方法は、操作の手軽さ、あるいは、或る程度の感度が得られるという意味で優れたものであるが、表面が疎水性ポリスチレンであるという特質から、（1 ) コートしたい抗原又は抗体等の機能性分子を結合した後、非結合表面にタンパク質や種々の生体物質の類似物質をコートしてポリスチレンの疎水性を覆い隠す方法、あるいは、（2 ) 反応時に液体中に界面活性剤を加えてポリスチレン粒子が相互に影響し合うのを防ぐ方法等の工夫をして用いてきたが、それでも非特異的な反応による判定の誤りが生まれることがあった。

このように、ポリスチレン粒子を担体として用い、その粒子をブロッキング剤で安定化させる方法、あるいは、反応時の緩衝液に添加剤を加えて非特異的反応を抑制する方法などの対応では、感度と特異性の点で問題がある。発明の開示

本発明の課題は、標識物質として使用することのできるシグナル生成物質封入粒子であって、例えば、環境物質や生体成分などとの非特異的反応の影響を受けずに、しかも、高感度で、且つ簡便に調製することのできる前記シグナル生成物質封入粒子及びその製造方法を提供することにある。前記課題は、本発明による、

(1) 水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（2) 反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなリ、しかも、前記コア部分と前記シ： Lル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコアーシ： Lル型粒子において、

前記コア部分にシグナル生成物質が封入されていることを特徴とする、シグナル生成物質封入コアーシ:!:ル型粒子によリ解決することができる。

また、本発明は、

( a ) (1 ) 水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（2) 反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシ Iル部分とからなリ、しかも、前記コア部分と前記シヱル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア一シェル型粒子と、（b) シグナル生成物質とを、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることのできる有機溶媒を含有する溶液中に浸瀆することによつて、コア部分に前記シグナル生成物質を封入させることを特徴とする、前記シグナル生成物質封入コア一シェル型粒子の調製方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1 (1 ) で調製したブロックコポリマーの¹ H— NMRスぺクトルである。

図 2は、実施例 1 (2) で得られたアルデヒド末端 PEG被覆粒子の走査電子顕微鏡（SEM) 写真である。

図 3は、実施例 1 (2) で得られた比較用アルデヒド末端 PEG被覆粒子の S EM写真である。

図 4は、ユーロピウムキレー卜封入粒子を用いたィムノアッセィ法による CR P測定の結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。 ( 1 ) 水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分と、（2 ) 反応性官能基を有する水溶性高分子化合物を主成分とし、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシヱル部分とからなるコア一シェル型粒子、すなわち、水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコアーシ工ル型粒子それ自体は、公知である。

本発明において、コア部分を形成するのに用いることのできる水不溶性高分子化合物は、水に溶解しない高分子化合物であって、しかも、コア部分を形成した際に、その内部にシグナル生成物質を封入することができる高分子化合物である限り、特に限定されるものではない。前記水不溶性高分子化合物としては、例えば、疎水性ポリマー [例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ

(メタクリル酸 2—ヒドロキシェチル）、ポリ（N—^ rソプロピルアクリルアミド）ポリイソプレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリラクトン、又はポリラクタムなど] 、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルァミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリアリルァミン、又はポリアクリル酸など）の架橋ゲル、あるいは、水不溶性天然高分子化合物（例えば、ゼラチン又は多糖など）などを挙げることができる。

本発明において、前記のコア部分は、前記の水不溶性高分子化合物 1種類のみから実質的に形成されているか、又は前記の水不溶性高分子化合物 2種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。

前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には 5 n m〜5 0 0 n m程度である。

本発明において、シェル部分を形成するのに用いることのできる水溶性高分子化合物は、直鎖状の高分子化合物であり、その一方の末端（結合末端）でコア部分の表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記コア部分の表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。本明細書において、「コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部」とは、シヱル部が多数の直鎖状水溶性高分子化合物からなり、それら直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端でコア部分の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物と導入物（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。また、これらのブラシ状の水溶性高分子化合物鎖の自由末端には、それぞれ導入物 [例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は D N A ) ] と結合可能な反応性官能基が存在するので、シェル部分の最外殻は、多数の反応性官能基で覆われている。

前記水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（P E G ) 、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルァミンなどを挙げることができ、 P E G又はポリビニルアルコールが好ましい。

本発明において、シェル部を構成する水溶性高分子化合物鎖は、各水溶性高分子化合物鎖が前記の水溶性高分子化合物 1種類のみから実質的に形成されているか、又は各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の水不溶性高分子化合物 2 種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。

前記シェル部分を構成する水溶性高分子化合物鎖は、前記のコア部分の全表面を実質的に完全に覆っているのが好ましい。また、前記シェル部分を構成する各水溶性高分子化合物鎖は、それぞれ、実質的に同じ長さであり、各水溶性高分子化合物鎖の自由末端によつて大略球状又は大略楕球状のシ Xル部分外殻表面が形成されるのが好ましい。

前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、 5 n m〜5 0 0 n mとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、 5 n m〜5 0 0 n m とすることができる。

前記水溶性高分子化合物鎖の自由末端に存在する反応性官能基は、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入するができる。これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、本発明のシグナル生成物質封入コア一シェル型粒子を標識物質として使用する際の導入物 [例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は DNA) ] と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではなく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、アミノ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はメタンスルホニル基などを挙げることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、又はマレイミド基が好ましい。

水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコアーシェル型粒子を調製する方法としては、これまで報告されている様々な公知方法が適用可能である。前記公知方法としては、例えば、

(1 ) (a) 反応性官能基を有する親水性セグメントと疎水性セグメントとを結合したブロック共重合体（親一疎水型ブロック共重合体）と、（b) 疎水性ポリマーとを混合して粒子を調製するェマルジヨン法；

(2) 反応性官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、疎水性モノマーを重合させる分散重合法；又は

(3) ハイドロゲル粒子表面に水溶性高分子化合物ブラシを導入する方法などを挙げることができる。

前記のェマルジヨン法（1 ) で用いる親一疎水型ブロック共重合体の合成方法、及び前記の分散重合法（2) で用いる反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーの合成方法としては、例えば、既に本発明者及びその共同研究者が開発した方法（例えば、 W096/33233号公報、 W099 571 743号公報、又は特開平 1 1—32291 7号公報）を用いることができる。

前記の親一疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、 WO 96ノ 33233号公報に記載の式（ I A) ：

,ΙΑ

\

CH- (CH₂)_pA- 0- (CH₂CH₂0) ^—（CO- L- 0) 一（CH₂)_g— Z_A (IA)

R 2A

[式中、 R^1A及び R^2Aは、独立して、炭素数 1〜1 0のアルコキシ基、ァリールォキシ基、又はァリール一（炭素数 1〜 3のアルキルォキシ）基であるか、あるいは、 R^1A及び R^2Aは、一緒になつて、炭素数 1〜 6のアルキル基で置換されていてもよい式：

-O-C H (R ) -CH-0-

(ここで R' は水素原子又は炭素数 1 ~ 6のアルキル基である）

で表されるエチレンジォキシであるか、あるいは、 R^1A及び R^2Aは、一緒になつて、ォキシ（ = o) であり、

Lは、式：

-CH (R^3A) -O-CO-CH (R^4A) 一

又は

― (CH₂)

で表される 2価の基であり、ここで、 R^3A及び R^4Aは、独立して、.水素原子、炭素数 1 1 0のアルキル基、ァリール基、又はァリール— （炭素数 1 3のアルキルォキシ）基であり、 rは 2 5の整数であり、 m_Aは 2 1 0, 000の整数であり、 n_Att2 1 0, 000の整数であり、 p _Aは 1 5の整数であり、 q は 0又は 1 20の整数であり、そして、 Z_Aは、 qが 0であるとき、水素原子、アルカリ金属、ァセチル基、ァクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基、 p—トルエンスルホニル基、 2—メルカプトプロピオニル基、 2—アミノプ口ピオニル基、ァリル基、又はビニルベンジル基であり、 qが 1 20の整数であるとき、炭素数 1 6のアルコキシカルポニル基、カルポキシルメルカプト基、又はアミノ基である]

で表されるへトロテレケリックブロックコポリマ一を挙げることができる。前記の式（ I A) で表されるへトロテレケリックブロックコポリマーは、例えば、 W 096/33233号公報に記載の製造方法により調製することができる。

また、前記の親一疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、 W099Z571 743号公報に記載の式（ I B) ：

A'

N- CH₂CH₂0— (0¾0¾0 [CO-CHiRi-Olne— Y (IB)

Β'

(式中、 A' 及び B' は、相互に独立して、有機シリル型のァミノ保護基を表すか、あるいは、それらが結合する窒素原子と一緒になつて、 4 7員のジシラーァザシク口へテ口環式環を形成することのできる有機シリル型のァミノ保護基であり、

Yは、水素原子、アルカリ金属、又は適当な反応によリアルカリ金属に代えて導入可能な有機基であり、

Rは水素原子又は炭素数 1〜 6のアルキル基であり、

n_Bは 1〜20， 000の整数であり、そして、

m_Bは 0〜20， 000の整数である）

で表されるポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ I B) で表されるポリオキシエチレン誘導体は、例えば、 W099Z571 743号公報に記載の製造方法によリ調製することができる。

更に、前記の親一疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開平 1 1—32291 7 号公報に記載の式（ I C) ：

, ^Rl

R^2C一一 S— [ (CH₂)pc-S]_mC一（CH₂CH₂0)_nC— Z_c (IC)

R^3C

(式中、 R^{1 C}、 R^2C, 及び R^3Gは、相互に独立して、直鎖若しくは分岐のアルキル基又はァラルキル基を表し、

Z_cは、水素原子、ァクリロイル基、メタクリロイル基、ビニルベンジル基、ァリル基、パラトルエンスルホニル基、モノ一若しくはジー低級アルキル置換アミノ基、力ルポキシル基若しくはそのエステル基を有するアルキル基、アルデヒド基若しくはそのァセタール基を有するアルキル基、及びアル力リ金属からなる群より選ばれ、

m_cは 0又は 1であり、

n_cは 0〜20, 000の整数であり、そして、

p_cは正数 2又は 3であるが、

但し、 m_cと n_cは同時に 0とならない）

で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ I C) で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体は、例えば、特開平 1 1一 3 2 2 9 1 7号公報に記載の製造方法によリ調製することができる。

コア一シェル型粒子の前記ェマルジヨン法（1 ) 【こよれば、前記の式（ I A ) 、式（ I B ) 、又は式（ I C ) で表される各化合物（すなわち、親一疎水型ブロック共重合体）と、疎水性ポリマーとを混合することにより、コア一シ： πル型粒子 (すなわち、シグナル生成物質を封入する前の粒子）を調製することができる。また、コアーシ：!:ル型粒子の前記分散重合法（2 ) によれば、前記の式（ I A) 、式（ I B ) 、又は式（ I C) で表される各化合物（すなわち、水溶性高分子マクロモノマー）を分散剤として、疎水性モノマーを重合させることにより、コア一シェル型粒子（すなわち、シグナル生成物質を封入する前の粒子）を調製することができる。

本発明において使用することのできるシグナル生成物質は、コア—シヱル型粒子のコア部分に封入した状態でも、そのシグナルをコア一シェル型粒子の外側から分析（検出及び測定を含む）することのできる物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、発光物質、又は色素を挙げることができる。前記蛍光物質としては、例えば、ランタノイドキレ一卜（例えば、ランタンキレート、セリウムキレート、プラセオジムキレート、ネオジムキレート、プロメチウムキレート、サマリウムキレート、ユウ口ピウムキレート、ガドリニウムキレー卜、テルビウムキレート、ジスプロシウムキレート、ホルミウムキレート、エルビウムキレート、ツリウムキレート、イッテルビウムキレート、又はルテチゥムキレート、好ましくはユウ口ピウ厶キレート又はテルビウムキレート）、フルォロセインイソシァネー卜、ジクロロトリアジニルフルォロセイン、又はテトラメチルローダミンイソシァネートを挙げることができる。

また、前記色素としては、例えば、メチルイエ口一、ソルベントブルー 3 5、オイルオレンジ S S、又はオイルレツド E G Nを挙げることができる。

シグナル生成物質封入コア一シヱル型粒子の直径も、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状の粒子の場合、 1 0 n m〜 1 mm程度であることができる。

本発明のシグナル生成物質封入コアーシ：!:ル型粒子は、例えば、本発明の製造方法により調製することができる。本発明による製造方法では、例えば、先に説明した種々の公知方法により調製したコア一シェル型粒子（すなわち、シグナル生成物質を封入する前の粒子）に、シグナル生成物質を封入するのに、まず、コアーシ: Lル型粒子のコア部分を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルェン等）が一定比率で含まれる溶液中に、前記コアーシ：!:ル型粒子及びシグナル生成物質（例えば、疎水的な性質を有する色素又は蛍光物質など）を浸潰させる。前記浸潰により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴ってシグナル生成物質がコア部分に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的なシグナル生成物質はコア部分から外に出ることができず、コア部分に封入される。所望により、コァ部分に取り込まれなかったシグナル生成物質を除去することにより、本発明のシグナル生成物質封入コア一シェル型粒子を得ることができる。

本発明による製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレー卜などにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。

また、コア部分を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、シグナル生成物質が水不溶性高分子化合物に取リ込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、 4 0〜6 0 ( V o I / v o I ) %であることができる。

本発明においては、本発明のシグナル生成物質封入コア一シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基に、更に、前記反応性官能基と反応可能な導入物（例えば、生理活性物質）を結合させることができる。

前記導入物は、シグナル生成物質封入コアーシヱル型粒子の表面に存在する反応性官能基と反応可能である限り、特に限定されるものではないが、生理活性物質、例えば、タンパク質（例えば、抗体又は酵素）若しくは核酸（例えば、 D N A又は R N A ) 、又は細胞などを挙げることができる。

導入物と、シグナル生成物質封入コア一シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基とを結合させる方法は、公知の結合方法の中から、前記導入物及び反応性官能基の種類に応じて適宜選択することができる。

例えば、反応性官能基がアルデヒド基である場合には、生理活性物質 [例えば, タンパク質（例えば、抗原、抗体、又はレセプター等）、ペプチド、低分子ホルモン、又は DNA等] のァミノ基とシッフベースを形成させることにより、結合することができる。

また、反応性官能基がカルボキシル基である場合には、生理活性物質のァミノ基との間を、縮合剤（例えば、カルポジイミドなど）を用いて結合することができる。あるいは、予めカルボキシ基をスクシンイミド又はマレイミド等で活性化しておいて、その状態のまま、生理活性物質と混合することにより結合させることもできる。実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例

(1 ) ァセタール一 P EG— P LA—メタクリロイルの合成

アルゴン下、室温の反応容器に、溶媒としてテトラヒドロフラン（TH F) 4 OmLを装入した後、 3, 3' —ジエトキシー 1一プロパノール 0. 32mL

(2mmo I ) を加え、更に、 0. 3263mo l ZLカリゥ厶ナフタレンの T HF溶液 6. 2mL (2mmo I ) を加え、 1 5分間攪拌し、メタル化を行なつた。更に、冷却したシリンジにてエチレンォキシド 1 2mL (240 mm o I ) を加えた後、室温で 2日間攪拌し、開環重合を行なった。次に、 1 mo I ZLの D L—ラクチド TH F溶液 84mL (84mmo L) を加え、室温で 3時間重合した。その後、無水メタクリル酸 4. 5mL (28mmo I ) を加え、室温にて 2日間攪拌してから、停止反応を行なった。

得られたブロックコポリマー溶液を、一 1 5°Cに冷却した 2—プロパノールに再沈殿させた後、遠心分離（6000 r pm, 40分間，一1 0°C) を行ない、溶媒を除去した。この操作を 2回繰り返してブロックコポリマーの精製を行なつた後、ベンゼンに溶解し、凍結乾燥を行なった。図 1に、ブロックコポリマーの¹ H— NMRスペクトルを示す。ポリエチレングリコール（P EG) の分子量は、 G PC測定の結果より算出した。ポリ乳酸

(P LA) の分子量は、 ¹H— NMRの結果より、 G PC測定で得られた PEG 分子量を用いて算出した。 P EGの分子量は約 5000であり、 P L Aの分子量は約 500であった。

(2) アルデヒド末端 PEG被覆粒子の調製

アルゴン下、室温の反応容器に、アルゴン置換した超純水 1 6 OmLを加えた後、ァゾビスイソプチロニトリル（A I BN) 3 Omg及びブロックコポリマ一 [実施例 1 (1 ) で調製したもの] 3. 4 gのスチレン溶液 2m Lをアルゴン置換し、攪拌下（400 r pm) で滴下した。

室温にて 30分間攪拌した後、 60°Cにて 1 8時間、更に 80°Cにて 6時間攪拌（400 r pm) することにより、重合を行なった。重合反応終了後、濾紙 [F i l t e r p a p e r 2 (直径 = 1 85 mm; ； Ad v a n t e c†土] による濾過を行なうことにより樹脂塊やゴミ等を分別し、表層部にァセタール基を有する z — Γイクノレ、 a c e t a l f u n c t i o n a l i z e d p a r t i c i e) を得た。このパーティクルを水中に分散させた後、 1 mo I ZL— HC I を用いて、前記パーティクル分散液を p H 2. 0に調整した後、 2時間攪拌した。その後、 1 mo I ZL— N a OHを用いて p H 5. 0として、保護基であるァセタール基を脱保護し、表層部にアルデヒド基を導入した。

その後、脱塩のため、このパーティクル分散液 1 0 OmLを蒸留水 2 Lに対して一日透析 [分画分子量（MWCO) = 1 2000〜 1 4000、蒸留水を 4回交換] を行なった後、濾紙 [F i l t e r p a p e r 2 (直径 = 1 85m m) ； A d v a n t e c社] による濾過を行ない、表層部にアルデヒド基を有する/ 一丁イクリレ a l d e h y d e f u n c t i o n a l i z e d p a r t i c I e) 、すなわち、末端アルデヒドブロックポリマースチレン粒子（粒径 = 65 nm) を得た。得られた粒子（ P E G分子量 =約 5000， 1_ 分子量= 約 500) の走査電子顕微鏡（SEM) 写真を、図 2に示す。

また、実施例 1 (1 ) において、エチレンォキシドの開環重合を行なった後、 DL—ラクチド TH F溶液を加えることなく、無水メタクリル酸を加えたこと以外は、実施例 1 (1 ) 及び実施例 1 (2) の操作を繰り返すことにより、 P LA ユニットの長さを変化させた比較用粒子（P EG分子量 =約 5000， P L A分子量 =0) を調製した。得られた比較用粒子の S EM写真を、図 3に示す。

(3) ユーロピウムキレート封入粒子の調製

塩化ユーロピウム 6水和物の水溶液（22mgZmL、蒸留水） 1 mLに、チエノィルトリフルォロアセトン（TTA) のアセトン溶液（S mgZmL) 1 mLを加え、更にトリオクチルホスフィンオキサイド（TOPO) のアセトン溶液（43. 5mg/mL) 2 m Lを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。

—方、実施例 1 (2) で調製した末端アルデヒドブロックポリマースチレン粒子（粒径 =65 nm) の懸濁液（1 8mgZmL、蒸留水） 5mLに、アセトン 5mLを加え、撹拌した。この混合液に、先に調製したユーロピウムキレート溶液 0. 1 2m Lを加え、更に 1 0秒間撹拌した。撹拌終了後、遮光下で室温にて 30分間静置した後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除去した。その後、粒子に取リ込まれず、ァセトンを除去したために沈殿したユー口ピウムキレートを、 0. 2ミクロンのフィルターを通すことで除くことにより、本発明のユーロピウムキレート封入粒子を得た。

実施例 2

( 1 ) ユーロピウム封入粒子標識抗 C R P抗体の調製

実施例 1で調製したユーロピウム封入粒子 0. 5mLに、 0. 2mo Iノ Lリン酸緩衝液（p H8. 0) 0. 5mLを加えて撹拌した後、抗 C反応性タンパク質（CRP) ゥサギ抗体 F (a b' ) ₂分画（20mgZmL、生理食塩水） 0. 1 mLを加えて混和し、室温で一時間静置反応を実施した。なお、前記抗 CRP ゥサギ抗体 F (a b' ) ₂分画は、常法に従って、抗 CRPゥサギ抗体（Da k o社）から調製した。この反応液に、 N a BCNH₃1 2m gを加え、室温で 1 5時間混和反応を実施した。

反応液を、 0. 1 5M塩化ナトリウム含有 5 OmM卜リス塩酸緩衝液（p H 7. 8) で平衡化したセファクリル S— 300カラム（1 cmX 45 cm ; フアルマシァ）にアプライし、 1 OmLZ時間の流速で 1 mLZチューブに分画した。最初に溶出された粒子のピークを紫外部の吸光度でモニターし、プールしてュ一口ピウム封入粒子標識抗 C R P抗体とした。 (2) ユーロピウム封入粒子標識抗 CRP抗体を用いたィムノアッセィ法による CRPの測定

E L I S A用 96穴プレー卜の各ゥヱルに、生理食塩水で 4 g/mLに希釈した抗 CRPゥサギ抗体 F (a b' ) ₂分画 50jW Lを分注し、 4°Cで一夜静置コートした。 1 1 5mo I ZLリン酸緩衝用液（P BS ； p H 7. 4) で各ゥエルを 3回洗浄した後、 1 %牛血清アルブミン（BSA) 含有 PBSO. 25m Lを各ゥエルに分注して 37 °Cで一時間ブロックした。

1/1 5mo I /L-PBS (p H 7. 4) で各ゥエルを 3回洗浄した後、 0. 1 %トウイーン（Tw e e n) 20及び 0. 1 5 M塩化ナトリウム含有 50 mM トリス塩酸緩衝液（p H7. 5) で希釈した CRP標準品 5 OjUしを各ゥエルに分注し、 37 °Cで一時間静置反応を実施した。

1/1 5mo I /L-PBS (p H 7. 4) で各ゥエルを 3回洗浄した後、実施例 2 (1 ) で調製したユーロピウム封入粒子標識 CRP抗体の希釈液 [0. 1 %卜ウィーン 20、 0. 2%BSA、及び 0. 1 5M塩化ナトリウム含有 50 mMトリス塩酸緩衝液（p H7. 5) で 1 000倍に希釈したもの] 50 Lを各ゥヱルに分注して、 37 °Cで一時間静置反応を実施した。

1/1 5mo I /L-P BS (p H 7. 4) で各ゥエルを 5回洗浄した後、プレートの時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ヮラック社) で 1秒間測定した _c 結果を表 1と図 4に示す。

表 1

C R P抗原濃度時間分解蛍光量

( n sZmし）

0 1 61 1

0. 1 4 1 7 1 3

1. 4 2566

1 4 1 9259

140 — 1 52695 産業上の利用可能性

本発明のシグナル生成物質封入粒子は、生理活性物質の標識物質として使用することが可能であり、生理活性物質の活性を利用して結合反応を行わせた後、シグナル生成物質から発生されるシグナルから感度良く、特異的に測定対象物質を検出することが可能である。従って、このシグナル生成物質封入粒子は、安全且つ簡便な優れた標識物質として、広い分野に応用することができる。

今日、農薬や環境ホルモン等の低分子量物質、種々の生体が異常を起こしたときに体液に放出される抗原又は抗体、あるいは、生体内に侵入したウィルス由来の抗原、それに対抗する抗体、 D N A、又は R N A等、高感度に測定することが有意義な物質は非常に多い。そのために、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、又は色素等を、測定対象物質に対し結合活性を有する物質に標識し、種々の操作法によって測定する方法が開発されてきた。しかし、本発明のシグナル生成物質封入粒子は、公知の標識物質に比べ、感度、操作の手軽さ、及び非特異的反応の少なさ等の面で優れた標識物質である。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . ( 1 ) 水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（2 ) 反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなリ、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコアーシエル型粒子において、

前記コア部分にシグナル生成物質が封入されていることを特徴とする、シグナル生成物質封入コアーシヱル型粒子。

2 . 水溶性高分子化合物がポリエチレングリコールである、請求項 1に記載のシグナル生成物質封入コアーシヱル型粒子。

3 . 水不溶性高分子化合物がポリスチレンである、請求項 1又は 2に記載のシグナル生成物質封入コアーシヱル型粒子。

4 . 反応性官能基が、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、又はスクシンイミド基である、請求項 1〜 3のいずれか一項に記載のシグナル生成物質封入コアーシ;!:ル型粒子。

5 . シグナル生成物質が色素である、請求項 1 ~ 4のいずれか一項に記載のシグナル生成物質封入コア—シ; Eル型粒子。

6 . シグナル生成物質が蛍光物質である、請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のシグナル生成物質封入コア—シェル型粒子。

7 . シグナル生成物質がランタノイドキレートである、請求項 1〜4のいずれか —項に記載のシグナル生成物質封入コア—シ 1ル型粒子。

8 . ( a ) ( 1 ) 水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（2 ) 反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシヱル部分とからなリ、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア一シェル型粒子と、（b ) シグナル生成物質とを、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることのできる有機溶媒を含有する溶液中に浸漬することによって、コア部分に前記シグナル生成物質を封入させることを特徴とする、請求項 1に記載のシグナル生成物質封入コアーシ:!:ル型粒子の調製方法。