JP2001324507A - イムノナノスフェアーを含有する免疫測定用組成物 - Google Patents
イムノナノスフェアーを含有する免疫測定用組成物Info
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗原または抗体のイムノアッセイ用組成物の
提供。 【解決手段】 高分子ミセルからなるイムノナノスフェ
アーであって、親水性ホモポリマーまたは親−疎水性ブ
ロックコポリマーからなり、かつ高分子ミセルのコア
が、該ポリマーのω−末端の重合可能なエチレン性不飽
和二重結合と疎水性モノマーとの付加重合によって固化
した構造を有するイムノナノスフェアーを含むイムノア
ッセイ用組成物。
提供。 【解決手段】 高分子ミセルからなるイムノナノスフェ
アーであって、親水性ホモポリマーまたは親−疎水性ブ
ロックコポリマーからなり、かつ高分子ミセルのコア
が、該ポリマーのω−末端の重合可能なエチレン性不飽
和二重結合と疎水性モノマーとの付加重合によって固化
した構造を有するイムノナノスフェアーを含むイムノア
ッセイ用組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生物学的試料中に存
在する被検体を免疫複合体の形成を介して検出するため
のイムノアッセイ用組成物に関する。
在する被検体を免疫複合体の形成を介して検出するため
のイムノアッセイ用組成物に関する。
【０００２】本発明では、高分子ミセルおよび生物学的
な特異的結合が利用される。
な特異的結合が利用される。
【０００３】
【従来の技術】例えば、血清学的診断に際し、間接凝集
反応（または受動凝集反応）を利用して特異的抗体また
は特異的抗原を検出するために、抗体または抗原のキャ
リアーとして例えばベントナイト、ポリスチレンラテッ
クスまたは赤血球もしくは細菌細胞等が使用されてい
る。これらのうちポリスチレンラテックスは均一な大き
さのポリスチレン粒子含有するラテックスを作成しやす
く、粒子自体に抗原性がない等の理由で間接凝集反応に
広く利用されている。このポリスチレンラテックスにお
けるポリスチレン粒子はタンパク質等を強く吸着すると
いう点で抗原または抗体を固定するのに優れている。
反応（または受動凝集反応）を利用して特異的抗体また
は特異的抗原を検出するために、抗体または抗原のキャ
リアーとして例えばベントナイト、ポリスチレンラテッ
クスまたは赤血球もしくは細菌細胞等が使用されてい
る。これらのうちポリスチレンラテックスは均一な大き
さのポリスチレン粒子含有するラテックスを作成しやす
く、粒子自体に抗原性がない等の理由で間接凝集反応に
広く利用されている。このポリスチレンラテックスにお
けるポリスチレン粒子はタンパク質等を強く吸着すると
いう点で抗原または抗体を固定するのに優れている。
【０００４】しかし、ポリスチレン粒子のこのような吸
着性は、一方では、試料中に存在する被検体以外の成分
の非特異的吸着をもたらし、誤った結果を生じる可能性
がある。また、上記のようなラテックス中の粒子の大き
さは主として約０．５μｍであるが、粒径が大きいこと
から測定系のバックグランドが高まる可能性もある。
着性は、一方では、試料中に存在する被検体以外の成分
の非特異的吸着をもたらし、誤った結果を生じる可能性
がある。また、上記のようなラテックス中の粒子の大き
さは主として約０．５μｍであるが、粒径が大きいこと
から測定系のバックグランドが高まる可能性もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
学的試料中の被検体の検出に際し、上述の間接凝集反応
系を初めとする各種測定系に利用でき、しかも、上記ポ
リスチレンラテックス等の使用に伴う短所が存在しない
か、あるいは解消された検出手段を提供することにあ
る。
学的試料中の被検体の検出に際し、上述の間接凝集反応
系を初めとする各種測定系に利用でき、しかも、上記ポ
リスチレンラテックス等の使用に伴う短所が存在しない
か、あるいは解消された検出手段を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、片末端も
しくは両末端に官能基を有する親水性ホモポリマーまた
は親−疎水性ブロックコポリマーの提供と、それらの特
徴付けおよび応用について検討してきた。このようなポ
リマーのうち、親水性ホモポリマーの片末端（以下、α
−末端という）または親水性ブロック末端（以下、α−
末端ともいう）にタンパク質等を共有結合せしめうる官
能基を有し、そしてもう一つの片末端（以下、ω−末端
という）または疎水性ブロック末端（以下、ω−末端と
もいう）に重合可能なエチレン性不飽和二重結合を有す
るポリマーを、コモノマーとしても作用する疎水性モノ
マーに溶解した後、水性液中で乳化重合させることによ
り得られるコアーシェル型の安定化された高分子ミセル
含有物が、上記の間接凝集反応を利用するイムノアッセ
イにおいて、ポリスチレンラテックスに都合よく代替で
きることが見出された。
しくは両末端に官能基を有する親水性ホモポリマーまた
は親−疎水性ブロックコポリマーの提供と、それらの特
徴付けおよび応用について検討してきた。このようなポ
リマーのうち、親水性ホモポリマーの片末端（以下、α
−末端という）または親水性ブロック末端（以下、α−
末端ともいう）にタンパク質等を共有結合せしめうる官
能基を有し、そしてもう一つの片末端（以下、ω−末端
という）または疎水性ブロック末端（以下、ω−末端と
もいう）に重合可能なエチレン性不飽和二重結合を有す
るポリマーを、コモノマーとしても作用する疎水性モノ
マーに溶解した後、水性液中で乳化重合させることによ
り得られるコアーシェル型の安定化された高分子ミセル
含有物が、上記の間接凝集反応を利用するイムノアッセ
イにおいて、ポリスチレンラテックスに都合よく代替で
きることが見出された。
【０００７】したがって、本発明は、生物学的試料中に
存在する抗原または抗体を検出することのできるイムノ
ナノスフェアーを含んでなるイムノアッセイ用組成物で
あって、イムノナノスフェアーがコア−シェル型高分子
ミセルであり、該高分子ミセルが親水性ホモポリマーま
たは親−疎水性ブロックコポリマーに由来し、かつ、該
ポリマーが片末端（α−末端）または親水性ブロック末
端（α−末端）に共有結合した抗体または抗原を有し、
そしてもう一方の片末端（ω−末端）または疎水性ブロ
ック末端（ω−末端）に重合可能なエチレン性不飽和二
重結合を有しており、該エチレン性不飽和二重結合がス
チレン、低級アルキルメタクリレート、低級アルキルア
クリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、
ブタジエンおよびイソプレンからなる群より選ばれるコ
モノマーとの付加重合を介して前記高分子ミセル内で固
化されたコアを形成していることを特徴とす前記組成物
を提供する。
存在する抗原または抗体を検出することのできるイムノ
ナノスフェアーを含んでなるイムノアッセイ用組成物で
あって、イムノナノスフェアーがコア−シェル型高分子
ミセルであり、該高分子ミセルが親水性ホモポリマーま
たは親−疎水性ブロックコポリマーに由来し、かつ、該
ポリマーが片末端（α−末端）または親水性ブロック末
端（α−末端）に共有結合した抗体または抗原を有し、
そしてもう一方の片末端（ω−末端）または疎水性ブロ
ック末端（ω−末端）に重合可能なエチレン性不飽和二
重結合を有しており、該エチレン性不飽和二重結合がス
チレン、低級アルキルメタクリレート、低級アルキルア
クリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、
ブタジエンおよびイソプレンからなる群より選ばれるコ
モノマーとの付加重合を介して前記高分子ミセル内で固
化されたコアを形成していることを特徴とす前記組成物
を提供する。
【０００８】
【本発明の好適な態様の説明】本発明にいう生物学的試
料とは、抗原または抗体のいずれか一方を含有しうる流
体であれば、天然由来のものまたは人工的なもののいず
れも包含される。天然由来のものとしては、血液、尿、
汗、唾液、あるいはこれらの希釈的もしくは濃縮物等を
挙げることができ、人工的なものとしては、動生物もし
くは微生物細胞の培養物、これらの細胞の破砕物、ペプ
チドもしくは核酸の合成混合物等を挙げることができ
る。このような生物学的試料は、必要により、適当な緩
衝剤を使用して緩衝化した水性溶液であることができ
る。
料とは、抗原または抗体のいずれか一方を含有しうる流
体であれば、天然由来のものまたは人工的なもののいず
れも包含される。天然由来のものとしては、血液、尿、
汗、唾液、あるいはこれらの希釈的もしくは濃縮物等を
挙げることができ、人工的なものとしては、動生物もし
くは微生物細胞の培養物、これらの細胞の破砕物、ペプ
チドもしくは核酸の合成混合物等を挙げることができ
る。このような生物学的試料は、必要により、適当な緩
衝剤を使用して緩衝化した水性溶液であることができ
る。
【０００９】本明細書において、低級アルキル基と称す
る場合は、炭素原子数１〜６個の分枝していてもよいア
ルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロ
ピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチ
ル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルを
挙げることができる。本発明においては、低級アルキル
基がメチルである場合が好ましい。
る場合は、炭素原子数１〜６個の分枝していてもよいア
ルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロ
ピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチ
ル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルを
挙げることができる。本発明においては、低級アルキル
基がメチルである場合が好ましい。
【００１０】本発明で用いるポリマーにおいて、親水性
ホモポリマーまたは親−疎水性ブロックコポリマーの親
水性セグメントは、ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルピロリドンまたはポリビニルアルコールのセグメント
を含んでなるが、ポリエチレングリコールセグメントを
含むものが好ましい。親−疎水性ブロックコポリマーに
おける疎水性セグメントは、ポリプロピレングリコー
ル、ポリテトラエチレンオキシド、ポリグリコリド、ポ
リラクチド、ポリラクトン類、ポリラクタム類、ポリ
（α−アミノ酸）類、ポリシロキサン、ポリ（低級アル
キルメタクリレート）、ポリ（低級アルキルアクリレー
ト）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリブタジエン、
ポリイソプレン等から構成することができる。
ホモポリマーまたは親−疎水性ブロックコポリマーの親
水性セグメントは、ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルピロリドンまたはポリビニルアルコールのセグメント
を含んでなるが、ポリエチレングリコールセグメントを
含むものが好ましい。親−疎水性ブロックコポリマーに
おける疎水性セグメントは、ポリプロピレングリコー
ル、ポリテトラエチレンオキシド、ポリグリコリド、ポ
リラクチド、ポリラクトン類、ポリラクタム類、ポリ
（α−アミノ酸）類、ポリシロキサン、ポリ（低級アル
キルメタクリレート）、ポリ（低級アルキルアクリレー
ト）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリブタジエン、
ポリイソプレン等から構成することができる。
【００１１】イムノナノスフェアーを形成するための親
水性ホモポリマーまたは親−疎水性ブロックコポリマー
であって、いまだ、α−末端に抗体または抗原が共有結
合する前のポリマーとして好ましいものは、例えば、次
の一般式（Ｉ）で表されるホモポリマーまたはブロック
コポリマーを挙げることができる。
水性ホモポリマーまたは親−疎水性ブロックコポリマー
であって、いまだ、α−末端に抗体または抗原が共有結
合する前のポリマーとして好ましいものは、例えば、次
の一般式（Ｉ）で表されるホモポリマーまたはブロック
コポリマーを挙げることができる。
【００１２】一般式（Ｉ）：
【００１３】
【化８】
【００１４】上式中、Ａは官能基を表し、Ｂは、
【００１５】
【化９】
【００１６】のユニットを表し、ここでＲ1は水素原子
又は低級アルキル基であり、Ｒ2は水素原子、メチル
基、１−メチルエチル基、１−メチルプロピル、２−メ
チルプロピル、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基
またはベンジルオキシカルボニルメチル基であり、Ｌ1
は式
又は低級アルキル基であり、Ｒ2は水素原子、メチル
基、１−メチルエチル基、１−メチルプロピル、２−メ
チルプロピル、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基
またはベンジルオキシカルボニルメチル基であり、Ｌ1
は式
【００１７】
【化１０】
【００１８】（ここで、ｑは１〜６の整数である）の連
結基を表し、Ｌ2は原子価結合または−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ
−の連結基の連結基を表し、Ｌ3はカルボニル基、メチ
レン基、
結基を表し、Ｌ2は原子価結合または−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ
−の連結基の連結基を表し、Ｌ3はカルボニル基、メチ
レン基、
【００１９】
【化１１】
【００２０】の基を表し、Ｒは水素原子またはメチル基
を表し、ｍは、１０〜２０，０００の整数であり、そし
てｎは、０〜１０，０００の整数である。
を表し、ｍは、１０〜２０，０００の整数であり、そし
てｎは、０〜１０，０００の整数である。
【００２１】このようなホモポリマーまたはブロックコ
ポリマーの、代表的なものは、一部を本発明者と共通す
る発明者等によって提案された、例えば、ＷＯ９６／３
３２３３、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０
３や、それらに記載されている
ポリマーの、代表的なものは、一部を本発明者と共通す
る発明者等によって提案された、例えば、ＷＯ９６／３
３２３３、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０
３や、それらに記載されている
【００２２】
【化１２】
【００２３】を得た後、必要により−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨを
−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2に変換し、次いで必要により、プロ
ピレンオキシド、テトラヒドロフラン、対応するラクチ
ド、対応するラクトン等を用いる開環重合、あるいは、
α−アミノ酸誘導体のＮ−カルボン酸無水物を用いる二
酸化炭素脱離重縮合法（所謂、ＮＣＡ法）により得るこ
とができる。例えば、後者では、
−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2に変換し、次いで必要により、プロ
ピレンオキシド、テトラヒドロフラン、対応するラクチ
ド、対応するラクトン等を用いる開環重合、あるいは、
α−アミノ酸誘導体のＮ−カルボン酸無水物を用いる二
酸化炭素脱離重縮合法（所謂、ＮＣＡ法）により得るこ
とができる。例えば、後者では、
【００２４】
【化１３】
【００２５】単位を伸長させた後、−Ｌ3−ＣＲ＝ＣＨ2
に対応する基、例えば、−ＣＯＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＯＣ
(ＣＨ3)＝ＣＨ2、
に対応する基、例えば、−ＣＯＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＯＣ
(ＣＨ3)＝ＣＨ2、
【００２６】
【化１４】
【００２７】−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2、
【００２８】
【化１５】
【００２９】等を導入し、ω−末端を形成し、目的のホ
モポリマーまたはブロックコポリマーを得ることができ
る。 上記、例えば、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９６
／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０３に記載されるのと
同様に本発明で用いるホモポリマーまたはブロックコポ
リマーのＡの官能基として多種多様な基、例えば、アル
デヒド基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ2）、メルカ
プト基（−ＳＨ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）を担持させることができる。
モポリマーまたはブロックコポリマーを得ることができ
る。 上記、例えば、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９６
／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０３に記載されるのと
同様に本発明で用いるホモポリマーまたはブロックコポ
リマーのＡの官能基として多種多様な基、例えば、アル
デヒド基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ2）、メルカ
プト基（−ＳＨ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）を担持させることができる。
【００３０】一般式（Ｉ）のホモポリマーまたはブロッ
クコポリマーのうち、特にＡ−Ｌ1−が
クコポリマーのうち、特にＡ−Ｌ1−が
【００３１】
【化１６】
【００３２】（ここで、ｒは２〜５の整数である。）を
表し、Ｌ2が原子価結合であり、Ｂが
表し、Ｌ2が原子価結合であり、Ｂが
【００３３】
【化１７】
【００３４】を表し、そして−Ｌ3−ＣＲ＝ＣＨ2が−Ｃ
Ｏ−Ｃ(ＣＨ3)＝ＣＨ2または−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ2で表
されるものが、本発明で都合よく用いることができる。
Ｏ−Ｃ(ＣＨ3)＝ＣＨ2または−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ2で表
されるものが、本発明で都合よく用いることができる。
【００３５】本発明では、このようなホモポリマーまた
はブロックコポリマーを水混和性溶媒（例、テトラヒド
ロフラン、ジメチルホルムアミド）または水非混和性溶
媒（例、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン）に溶
解し、水性液と混合処理するそれ自体公知の方法により
高分子ミセルを形成し、その後、上記官能基を介して抗
体または抗原を結合するか、あるいは高分子ミセルを形
成する前に、予め、抗体または抗原をα−末端に共有結
合しておき、そして高分子ミセルを形成してもよい。特
に前者の方法が好ましいが、その場合には、官能基はブ
ロックされた状態（例えば、官能基がアルデヒド基の場
合には、アセタールもしくはケタールの状態）で高分子
ミセルを形成し、抗体または抗原を結合させる直前に、
官能基を生じさせるのがよい。
はブロックコポリマーを水混和性溶媒（例、テトラヒド
ロフラン、ジメチルホルムアミド）または水非混和性溶
媒（例、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン）に溶
解し、水性液と混合処理するそれ自体公知の方法により
高分子ミセルを形成し、その後、上記官能基を介して抗
体または抗原を結合するか、あるいは高分子ミセルを形
成する前に、予め、抗体または抗原をα−末端に共有結
合しておき、そして高分子ミセルを形成してもよい。特
に前者の方法が好ましいが、その場合には、官能基はブ
ロックされた状態（例えば、官能基がアルデヒド基の場
合には、アセタールもしくはケタールの状態）で高分子
ミセルを形成し、抗体または抗原を結合させる直前に、
官能基を生じさせるのがよい。
【００３６】上記の高分子ミセルを形成する際に、コモ
ノマーとして、例えば、スチレン、低級アルキルメタク
リレート、低級アルキルアクリレート、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル、ブタジエンまたはイソプレン
を共存させ、次いで重合させる。なお、これらのモノマ
ーは、コモノマーとすると同時に、唯一の有機溶媒とし
て使用してもよく、こうして得られるホモポリマーまた
はブロックコポリマーとコモノマーとの溶液を水性液
（必要により、緩衝化した、例えば、リン酸緩衝化生理
食塩水）に分散させ、次いで重合させ、高分子ミセルの
疎水性コアを固化して得ることのできる高分子ミセル
が、本発明では、特に好ましく使用できる。上記重合反
応は、上記系で付加重合を生じるそれ自体公知の重合触
媒または開始剤を用いて行う。
ノマーとして、例えば、スチレン、低級アルキルメタク
リレート、低級アルキルアクリレート、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル、ブタジエンまたはイソプレン
を共存させ、次いで重合させる。なお、これらのモノマ
ーは、コモノマーとすると同時に、唯一の有機溶媒とし
て使用してもよく、こうして得られるホモポリマーまた
はブロックコポリマーとコモノマーとの溶液を水性液
（必要により、緩衝化した、例えば、リン酸緩衝化生理
食塩水）に分散させ、次いで重合させ、高分子ミセルの
疎水性コアを固化して得ることのできる高分子ミセル
が、本発明では、特に好ましく使用できる。上記重合反
応は、上記系で付加重合を生じるそれ自体公知の重合触
媒または開始剤を用いて行う。
【００３７】上記の高分子ミセルは、ω−末端に重合可
能なエチレン性不飽和二重結合を有するホモポリマーま
たはブロックコポリマー（またはマクロマー）とコモノ
マー（例、スチレン）の使用割合を選ぶことによって、
高分子ミセルの粒径を調節することができる。
能なエチレン性不飽和二重結合を有するホモポリマーま
たはブロックコポリマー（またはマクロマー）とコモノ
マー（例、スチレン）の使用割合を選ぶことによって、
高分子ミセルの粒径を調節することができる。
【００３８】こうして得られる高分子ミセル（好ましく
は粒径：１０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜３
００ｎｍ）を、例えば、上述の間接凝集反応を利用する
イムノアッセイに用いると、既存のポリスチレンラテッ
クスを用いる場合に比べて、有意にバックグランドを低
下させることができる。
は粒径：１０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜３
００ｎｍ）を、例えば、上述の間接凝集反応を利用する
イムノアッセイに用いると、既存のポリスチレンラテッ
クスを用いる場合に比べて、有意にバックグランドを低
下させることができる。
【００３９】本発明の組成物では、一般的に、生物学的
試料中に存在する被検体との特異的反応を介して形成さ
れる凝集物を光学濃度変化の測定値を、被検体の存在量
の指標とできる。
試料中に存在する被検体との特異的反応を介して形成さ
れる凝集物を光学濃度変化の測定値を、被検体の存在量
の指標とできる。
【００４０】
【実施例】以下、具体例によって、本発明をさらに詳述
するが、本発明をこれらに限定することを意図するもの
でない。
するが、本発明をこれらに限定することを意図するもの
でない。
【００４１】製造例１：反応性ブロックコポリマーの合
成 （α−アセタールポリエチレングリコール／ω−メタア
クリロイルポリラクティックアシドの合成）
成 （α−アセタールポリエチレングリコール／ω−メタア
クリロイルポリラクティックアシドの合成）
【００４２】
【化１８】
【００４３】０．１５７ｍｌ（１ｍｍｏｌ）の３，３−
ジエトキシプロパノールと２．６３ｍｌ（１ｍｍｏｌ）
のカリウムナフタレンを２０ｍｌのテトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）中に溶解した。約２０分間撹拌して、カリウ
ム、３，３−ジエトキシプロパノレート（ＰＤＰ）を合
成した。これに６ｍｌ（１２０ｍｍｏｌ）のエチレンオ
キシドを添加し、２日間室温で撹拌した。こうして分子
量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を合成
した。引き続き、３４．６９（３５ｍｍｏｌ）のラクチ
ドのＴＨＦ溶液を添加して、室温で３ｈ撹拌した。ラク
チドを重合させ、その後、２．２３ｍｌ（１５ｍｍｏ
ｌ）の無水のメタクリル酸を加えて室温で２日間撹拌し
た。得られたブロックコポリマーを冷イソプロピルアル
コール中に添加して沈殿させ、精製し、さらに凍結乾燥
した。このときのポリラクチド（ＰＬＡ）の分子量は約
５０００であった。 こうしてα−アセタールポリエチ
レングリコール／ω−メタアクリロイルポリラクテック
アシドを得た。
ジエトキシプロパノールと２．６３ｍｌ（１ｍｍｏｌ）
のカリウムナフタレンを２０ｍｌのテトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）中に溶解した。約２０分間撹拌して、カリウ
ム、３，３−ジエトキシプロパノレート（ＰＤＰ）を合
成した。これに６ｍｌ（１２０ｍｍｏｌ）のエチレンオ
キシドを添加し、２日間室温で撹拌した。こうして分子
量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を合成
した。引き続き、３４．６９（３５ｍｍｏｌ）のラクチ
ドのＴＨＦ溶液を添加して、室温で３ｈ撹拌した。ラク
チドを重合させ、その後、２．２３ｍｌ（１５ｍｍｏ
ｌ）の無水のメタクリル酸を加えて室温で２日間撹拌し
た。得られたブロックコポリマーを冷イソプロピルアル
コール中に添加して沈殿させ、精製し、さらに凍結乾燥
した。このときのポリラクチド（ＰＬＡ）の分子量は約
５０００であった。 こうしてα−アセタールポリエチ
レングリコール／ω−メタアクリロイルポリラクテック
アシドを得た。
【００４４】製造例２：高分子ミセルの調製 （１）平均粒子径７０ｎｍ α−アセタールポリエチレングリコール／ω−メタアク
リロイルポリラクテックアシド ブロックコポリマー
０．２ｇと２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（Ａ
ＩＢＮ）７．２ｍｇをスチレン０．５ｍｌ中に溶解し
た。この液を１５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に撹拌しつつ添加し、分散し、Ｏ／Ｗエマルショ
ンを作成した。撹拌は室温で２０分間継続した。その
後、減圧下で脱気を十分行い、エマルションの温度を６
０℃に上昇させ、２４時間撹拌を継続した。これによっ
てスチレンおよびアクリル基が重合してコアが固化し
た、ナノスフェアーが得られた。この粒子を遠心分離に
よって集め（２００００ｒｐｍ）、水で数回洗浄し、未
反応のポリマーを除去した。この粒子径を測定すると平
均７０ｎｍであった。 （２）平均粒子径１１０ｎｍ α−アセタールポリエチレングリコール／ω−メタアク
リロイルポリラクテックアシド ブロックコポリマー
０．２ｇとＡＩＢＮ １４．４ｍｇをスチレン１．０ｍ
ｌ中に溶解した。この液を１５ｍｌのＰＢＳ中に撹拌し
つつ添加し、分散し、Ｏ／Ｗエマルションを作成した。
撹拌は室温で２０分間継続した。その後、減圧下で脱気
を十分行い、エマルションの温度を６０℃に上昇させ、
２４時間撹拌を継続した。これによってスチレンおよび
アクリル基が重合して内核が固化し、ナノスフェアーが
得られた。この粒子を遠心分離によって集め（２０００
０ｒｐｍ）、水で数回洗浄し、未反応のポリマーを除去
した。この粒子径を測定すると平均１１０ｎｍであっ
た。
リロイルポリラクテックアシド ブロックコポリマー
０．２ｇと２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（Ａ
ＩＢＮ）７．２ｍｇをスチレン０．５ｍｌ中に溶解し
た。この液を１５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に撹拌しつつ添加し、分散し、Ｏ／Ｗエマルショ
ンを作成した。撹拌は室温で２０分間継続した。その
後、減圧下で脱気を十分行い、エマルションの温度を６
０℃に上昇させ、２４時間撹拌を継続した。これによっ
てスチレンおよびアクリル基が重合してコアが固化し
た、ナノスフェアーが得られた。この粒子を遠心分離に
よって集め（２００００ｒｐｍ）、水で数回洗浄し、未
反応のポリマーを除去した。この粒子径を測定すると平
均７０ｎｍであった。 （２）平均粒子径１１０ｎｍ α−アセタールポリエチレングリコール／ω−メタアク
リロイルポリラクテックアシド ブロックコポリマー
０．２ｇとＡＩＢＮ １４．４ｍｇをスチレン１．０ｍ
ｌ中に溶解した。この液を１５ｍｌのＰＢＳ中に撹拌し
つつ添加し、分散し、Ｏ／Ｗエマルションを作成した。
撹拌は室温で２０分間継続した。その後、減圧下で脱気
を十分行い、エマルションの温度を６０℃に上昇させ、
２４時間撹拌を継続した。これによってスチレンおよび
アクリル基が重合して内核が固化し、ナノスフェアーが
得られた。この粒子を遠心分離によって集め（２０００
０ｒｐｍ）、水で数回洗浄し、未反応のポリマーを除去
した。この粒子径を測定すると平均１１０ｎｍであっ
た。
【００４５】製造例３：ナノスフェアーの表面への抗体
の結合 １１０ｎｍのナノスフェアー懸濁液のｐＨを２．０に調
整した。その後、この溶液を室温で５時間撹拌し、ｐＨ
を７．０に最長製した。これによってアセタールは外
れ、表面にアルデヒドが結合したイムノナノスフェアー
を得た。１１０ｎｍのイムノナノスフェアー懸濁液１５
２μＬ（５ｍｇ）と２ｍｌのＰＢＳ溶液中と牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）の抗体０．４ｍｌ（２．５ｍｇ／ｍ
ｌ）を混合し、３７℃で２時間撹拌した。さらに、１０
ｍｇのＮａＣＮＢＨ3を添加し、室温で１２時間保持し
た。その後、１０ｍｇのＮａＣＮＢＨ3を再度添加し、
１２時間保持した。これによって抗体はナノスフェアー
の表面に結合した。これを冷所で保存した。
の結合 １１０ｎｍのナノスフェアー懸濁液のｐＨを２．０に調
整した。その後、この溶液を室温で５時間撹拌し、ｐＨ
を７．０に最長製した。これによってアセタールは外
れ、表面にアルデヒドが結合したイムノナノスフェアー
を得た。１１０ｎｍのイムノナノスフェアー懸濁液１５
２μＬ（５ｍｇ）と２ｍｌのＰＢＳ溶液中と牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）の抗体０．４ｍｌ（２．５ｍｇ／ｍ
ｌ）を混合し、３７℃で２時間撹拌した。さらに、１０
ｍｇのＮａＣＮＢＨ3を添加し、室温で１２時間保持し
た。その後、１０ｍｇのＮａＣＮＢＨ3を再度添加し、
１２時間保持した。これによって抗体はナノスフェアー
の表面に結合した。これを冷所で保存した。
【００４６】実施例：イムノナノスフェアーとＢＳＡと
の結合 種々の濃度のＢＳＡ溶液を作製した（０．１２５、０．
２５、０．５、１．０ｍｇ／ｍｌ）。この溶液の２〜４
μＬ（ｐＨ７．８）に４７．６μｇ／ｍｌのイムノナノ
スフェアーの１ｍｌを添加し、抗原−抗体反応を調べ
た。検出は３４０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１
に示す。対照としてＢＳＡに対する抗体溶液とＢＳＡ溶
液との吸光度を示す。図１から明らかのように溶液同志
の反応に比べて強い検出を示した。従来の方法ではＢＳ
Ａとして１０ｎＭ以上でないと検出できず、これと比較
して１０倍以上の感度をもつことが確認された。
の結合 種々の濃度のＢＳＡ溶液を作製した（０．１２５、０．
２５、０．５、１．０ｍｇ／ｍｌ）。この溶液の２〜４
μＬ（ｐＨ７．８）に４７．６μｇ／ｍｌのイムノナノ
スフェアーの１ｍｌを添加し、抗原−抗体反応を調べ
た。検出は３４０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１
に示す。対照としてＢＳＡに対する抗体溶液とＢＳＡ溶
液との吸光度を示す。図１から明らかのように溶液同志
の反応に比べて強い検出を示した。従来の方法ではＢＳ
Ａとして１０ｎＭ以上でないと検出できず、これと比較
して１０倍以上の感度をもつことが確認された。
【００４７】なお、１１０ｎｍのナノスフェアーに代
え、７０ｎｍのナノスフェアーを使用した場合、検出感
度は１１０ｎｍの約１／１０であった。
え、７０ｎｍのナノスフェアーを使用した場合、検出感
度は１１０ｎｍの約１／１０であった。
【図１】図１は実施例で得られた本発明の組成物を用い
た場合の試料中の抗原（ＢＳＡ）の濃度に対応する３４
０ｎｍの吸光度を表すグラフである。四角（■）が本発
明の測定結果であり、丸（●）が対照である。
た場合の試料中の抗原（ＢＳＡ）の濃度に対応する３４
０ｎｍの吸光度を表すグラフである。四角（■）が本発
明の測定結果であり、丸（●）が対照である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片岡 一則 東京都中野区上鷺宮５−17−22
Claims (7)
- 【請求項１】 生物学的試料中に存在する抗原または抗
体を検出することのできるイムノナノスフェアーを含ん
でなるイムノアッセイ用組成物であって、 イムノナノスフェアーがコア−シェル型高分子ミセルで
あり、該高分子ミセルが親水性ホモポリマーまたは親−
疎水性ブロックコポリマーに由来し、かつ、該ポリマー
が片末端（α−末端）または親水性ブロック末端（α−
末端）に共有結合した抗体または抗原を有し、そしても
う一方の片末端（ω−末端）または疎水性ブロック末端
（ω−末端）に重合可能なエチレン性不飽和二重結合を
有しており、 該エチレン性不飽和二重結合が、スチレン、低級アルキ
ルメタクリレート、低級アルキルアクリレート、アクリ
ロニトリル、メタクリロニトリル、ブタジエンおよびイ
ソプレンからなる群より選ばれるコモノマーとの付加重
合を介して前記高分子ミセル内で固化されたコアを形成
していることを特徴とする前記組成物。 - 【請求項２】 α−末端に抗体または抗原が共有結合す
る前の親−疎水性ブロックコポリマーが、一般式
（Ｉ）： 【化１】 上式中、Ａは官能基を表し、Ｂは、 【化２】 のユニットを表し、ここでＲ1は水素原子又は低級アル
キル基であり、Ｒ2は水素原子、メチル基、１−メチル
エチル基、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、
２−ベンジルオキシカルボニルエチル基またはベンジル
オキシカルボニルメチル基であり、Ｌ1は式 【化３】 （ここで、ｑは１〜６の整数である）の連結基を表し、
Ｌ2は原子価結合または−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−の連結基の
連結基を表し、Ｌ3はカルボニル基、メチレン基、 【化４】 の基を表し、Ｒは水素原子またはメチル基を表し、ｍ
は、１０〜２０，０００の整数であり、そしてｎは、０
〜１０，０００の整数である、で表される、請求項１記
載の組成物。 - 【請求項３】 一般式（Ｉ）におけるｎが０である請求
項２記載の組成物。 - 【請求項４】 一般式（Ｉ）におけるｎが１０以上であ
る請求項２記載の組成物。 - 【請求項５】 一般式（Ｉ）における、Ａ−Ｌ1−が 【化５】 （ここで、ｒは２〜５の整数である）を表し、Ｌ2が原
子価結合であり、Ｂが 【化６】 を表し、そして−Ｌ3−ＣＲ＝ＣＨ2が 【化７】 である、請求項２または４記載の組成物。 - 【請求項６】 高分子ミセルの平均粒径が１０〜５００
ｎｍの範囲内にある請求項１〜５のいずれかに記載の組
成物。 - 【請求項７】 高分子ミセルが、親水性ホモポリマーま
たは親−疎水性ブロックコポリマーを適当量のスチレン
に溶解した後、こうして得られる溶液を水性液中に分散
させてＯ／Ｗ型エマルジョンを形成し、次いでブロック
コポリマーのω−末端の重合可能なエチレン性不飽和二
重結合とスチレンとの間での付加重合を行って得られた
ものである請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146391A JP2001324507A (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | イムノナノスフェアーを含有する免疫測定用組成物 |
| PCT/JP2001/004065 WO2001088541A1 (fr) | 2000-05-18 | 2001-05-16 | Composition contenant des immuno-nanospheres et destinee a un dosage immunologique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146391A JP2001324507A (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | イムノナノスフェアーを含有する免疫測定用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001324507A true JP2001324507A (ja) | 2001-11-22 |
Family
ID=18652757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000146391A Pending JP2001324507A (ja) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | イムノナノスフェアーを含有する免疫測定用組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001324507A (ja) |
| WO (1) | WO2001088541A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002097436A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Core-shell type particles having signal-generating substance enclosed therein and process for producing the same |
| WO2005036172A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Japan Science And Technology Agency | 生物学的被検体の高速検出方法 |
| JP2007526471A (ja) * | 2004-03-02 | 2007-09-13 | ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ | Ｌｎ２Ｏ３コアを伴い生物学的リガンドを担持するハイブリッドナノ粒子及びその調製方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11801229B2 (en) * | 2019-07-29 | 2023-10-31 | Northwestern University | Molecular entrapment via homopolymer self-assembly |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07117542B2 (ja) * | 1987-05-01 | 1995-12-18 | 工業技術院長 | 免疫センサー、その形成方法および免疫センサーによる抗原の濃度の測定方法 |
| CA2167920A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Abraham J. Domb | Nonoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers |
| JPH08133990A (ja) * | 1994-11-10 | 1996-05-28 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 反応性マイクロスフェアー |
-
2000
- 2000-05-18 JP JP2000146391A patent/JP2001324507A/ja active Pending
-
2001
- 2001-05-16 WO PCT/JP2001/004065 patent/WO2001088541A1/ja active Application Filing
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002097436A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Core-shell type particles having signal-generating substance enclosed therein and process for producing the same |
| US6881484B2 (en) | 2001-05-30 | 2005-04-19 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Core-shell particle including signal-generating substance enclosed therein and process for producing the same |
| WO2005036172A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Japan Science And Technology Agency | 生物学的被検体の高速検出方法 |
| US7732158B2 (en) | 2003-10-10 | 2010-06-08 | Japan Science And Technology Agency | Method of high-speed detection for biological analyte |
| JP2007526471A (ja) * | 2004-03-02 | 2007-09-13 | ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ | Ｌｎ２Ｏ３コアを伴い生物学的リガンドを担持するハイブリッドナノ粒子及びその調製方法 |
| JP4847439B2 (ja) * | 2004-03-02 | 2011-12-28 | ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ | Ｌｎ２Ｏ３コアを伴い生物学的リガンドを担持するハイブリッドナノ粒子及びその調製方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001088541A1 (fr) | 2001-11-22 |
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