KR20040010667A - 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자 및 그 제조 방법 - Google Patents

시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR20040010667A
KR20040010667A KR10-2003-7015599A KR20037015599A KR20040010667A KR 20040010667 A KR20040010667 A KR 20040010667A KR 20037015599 A KR20037015599 A KR 20037015599A KR 20040010667 A KR20040010667 A KR 20040010667A
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유키오 나가사키
나오야 시바타
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나노캐리어 코포레이션 리미티드
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Abstract

(1) 불수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지는 코어 부분과 (2) 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 구성되며, 또한, 상기 코어 부분과 상기 쉘 부분이 전체적으로 불수용성 고분자와 수용성 고분자의 블록공중합체로 이루어진 코어-쉘형 입자에 있어서, 상기 코어 부분에 시그널 생성 물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자 및 그 제조 방법을 개시한다.
상기 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자는, 취급에 제한을 받는 방사성 물질, 안정성에 문제가 있는 효소를 이용하지 않고, 형광물질보다 고감도이고 비특이적인 흡착을 일으키지 않는 표지 물질로서 유용하다.

Description

시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자 및 그 제조 방법{CORE-SHELL TYPE PARTICLES HAVING SIGNAL-GENERATING SUBSTANCE ENCLOSED THEREIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
미량의 물질을 시각화 또는 정량하기 위해서 다양한 표지물이 개발되어 왔다. 특히 고감도를 필요로 하는 분야에서는, 방사성동위원소(radioisotope)가 대표적인 표지물이고 트리티움이나 방사성요오드 등이 대표예로서 사용되며, 필름에 의한 감광 혹은 신치레이션 카운터(Scintillation Counter)에 의한 방사능 측정이라는 형태로 검출되어 왔다.
이어서, 방사성 물질의 취급 제한에 영향을 받지 않는 방법으로서 효소 표지법이 개발되었다. 페르옥시다제, 알칼리포스파타제, 글루코스옥시다제 또는 β-D-갈락토시다제 등의 항원 또는 항체에 대한 표지법이 개발되고, 조직절편의 염색법에 의한 관찰이나 효소 면역 측정법에 적용한 정량법이 확립되었다.
한편, 조직절편의 염색법으로서, 형광물질(예를 들면, 플루오레세인 또는 로다민 등)을 항체에 표지하고 반응 후 형광현미경으로 관찰하는 방법이 알려져 있다. 이 방법은 방사성 물질을 이용하지 않아 사용에 제한을 받지 않는 점이나 효소와 같이 기질(基質)을 첨가하여 반응하는 단계를 필요로 하지 않는 점 등, 편리한 점이 많지만 표지로서의 절대적 감도가 부족하다는 결점이 있다.
이 형광물질 표지법의 발전형 중 하나로 시간분해 형광측정이 있다. 유로퓸킬레이트로 대표되는 형광 소광 시간이 긴 형광물질에 펄스의 여기광을 쬐고, 직접의 여기광이나 주변물질에 기인하는 짧은 형광이 소광해버리는 일정시간 후에 형광을 측정하여 유로퓸 특이적 형광을 측정함으로써, 측정의 정밀도 및 감도를 상승시키는 방법이다.
더욱 감도를 올리기 위해서, 이 유로퓸킬레이트를 폴리스틸렌 입자에 넣고 1입자당 형광물질량을 늘려서 감도를 상승시키는 시도도 이루어져 왔다. 이 방법으로는 확실히 입자당 형광량은 늘지만, 폴리스틸렌은 소수성이기 때문에 입자 표면도 소수성이 되며, 생물학적 반응에 이용하기 위해서는 환경에 존재하는 많은 소수성 물질과 끈적하게 달라붙는다는 불리한 점을 양해하고 사용하여야 한다는 결점을 갖는다.
한편, 감도의 향상보다도 오히려 조작의 용이함을 추구하는 수단으로서 색소를 폴리스틸렌 입자에 넣어, 폴리스틸렌 입자의 표면에 항원 또는 항체를 코트하여시약으로 하고, 항원항체반응에 의해서 고정화된 폴리스틸렌 입자를 시각적으로 검출하려는 시도도 이루어지고 있다.
공지기술로서 알려져 있는 색소나 형광물질을 폴리스틸렌 입자에 넣어 표지물질로 하는 방법은 조작이 용이하거나 어느정도의 감도를 얻을 수 있다는 의미에서 우수하지만, 표면이 소수성 폴리스틸렌이라는 특질때문에 (1) 코트하고자 하는 항원 또는 항체 등의 기능성 분자를 결합한 후 비결합 표면에 단백질이나 여러가지의 생체물질의 유사물질을 코트하여 폴리스틸렌의 소수성을 덮어서 숨기는 방법, 혹은 (2) 반응시에 액체 중에 계면활성제를 첨가하여 폴리스틸렌 입자가 서로 영향을 주는 것을 방지하는 방법 등을 연구하여 이용하여 왔지만, 그래도 비특이적인 반응에 의한 판정의 오류가 발생될 수 있었다.
이와 같이, 폴리스틸렌 입자를 담체로 이용하여 그 입자를 블로킹제로 안정화시키는 방법, 혹은 반응시의 완충액에 첨가제를 부가하여 비특이적 반응을 억제하는 방법 등의 대응으로는 감도와 특이성의 점에서 문제가 있다.
본 발명은 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 코어-셸형 입자는, 표층에 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물[예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG)]을 브러시 형상으로 담지하는 입자의 내부에 검출 가능한 물질을 봉입(封入)하여 포함하고, 최외피에 다른 물질과 결합성을 갖는 활성잔기를 갖고 있기 때문에, 간단하고 또한 고감도의 표지(標識) 물질로서 사용할 수 있다.
도 1은 실시예 1(1)에서 조제한 블록공중합체의1H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 1(2)에서 얻어진 알데히드 말단 PEG 피복 입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 3은 실시예 1(2)에서 얻어진 비교용 알데히드 말단 PEG 피복 입자의 SEM 사진이다.
도 4는 유로퓸킬레이트 봉입 입자를 이용한 면역측정법(immunoassay)에 의한 CRP 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 과제는, 표지물질로서 사용할 수 있는 시그널 생성 물질 봉입 입자로써, 예를 들면 환경물질이나 생체성분 등의 비특이적 반응의 영향을 받지 않고 더구나, 고감도이고 또한 간편하게 조제할 수 있는 상기 시그널 생성 물질 봉입 입자 및 그 제조 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제는, 본 발명에 의하면,
(1) 불수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지는 코어 부분과 (2)반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 구성되며, 또한, 상기 코어 부분과 상기 쉘 부분이 전체적으로 불수용성 고분자와 수용성 고분자의 블록공중합체로 이루어지는 코어-쉘형 입자에 있어서,
상기 코어 부분에 시그널 생성 물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자에 의해 해결할 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) (1)불수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지는 코어 부분과 (2)반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 구성되며, 또한, 상기 코어 부분과 상기 쉘 부분이 전체적으로 불수용성 고분자와 수용성 고분자의 블록공중합체로 이루어지는 코어-쉘형 입자와 (b) 시그널 생성 물질을 상기 불수용성 고분자 화합물을 팽윤시킬 수 있는 유기용매를 함유하는 용액 속에 침지함으로써, 코어 부분에 상기 시그널 생성 물질을 봉입시키는 것을 특징으로 하는 상기 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 조제 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
(1) 불수용성 고분자 화합물을 주성분으로 하는 코어 부분과 (2) 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물을 주성분으로 하고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 이루어지는 코어-쉘형 입자, 즉, 불수용성 고분자 화합물을 주성분으로 하는 코어 부분의 표면에, 표층에 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물 브러시를 갖는 코어-쉘형 입자 그 자체는 공지이다.
본 발명에 있어서, 코어 부분을 형성하는 데 이용할 수 있는 불수용성 고분자 화합물은 물에 용해되지 않는 고분자 화합물이고, 또한, 코어 부분 형성시에 그 내부에 시그널 생성 물질을 봉입 할 수 있는 고분자 화합물이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 불수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면 소수성폴리머[예를 들면, 폴리스틸렌, 폴리메타크릴산메틸, 폴리(메타크릴산2-히드록시에틸), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)폴리이소프렌, 폴리염화비닐, 폴리유산, 폴리락톤 또는 폴리락탐 등], 수용성폴리머(예를 들면, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리알릴아민 또는 폴리아크릴산 등)의 가교겔 혹은 불수용성 천연 고분자 화합물(예를 들면, 젤라틴 또는 다당(多糖) 등) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기한 코어 부분은 상기한 불수용성 고분자 화합물 1종류만으로 실질적으로 형성되어 있거나 또는 상기한 불수용성 고분자 화합물 2종류 이상의 조합으로 실질적으로 형성되어 있을 수 있다.
상기 코어 부분의 형상은 특별히 한정되어 있는 것은 아니지만 일반적으로는 거의 구형 혹은 거의 스페로이드(spheroid)형이다. 또한, 상기 코어 부분의 치수도 특별히 한정되는 것이 아니고 용도에 따라서 적절하게 변화시킬 수 있는데, 거의 구형의 코어 부분의 직경은 일반적으로는 5nm∼500nm 정도이다.
본 발명에 있어서, 쉘 부분을 형성하는 데 이용할 수 있는 수용성 고분자 화합물은 직쇄상의 고분자 화합물이고, 그 한쪽의 말단(결합말단)에서 코어 부분의 표면과 결합할 수 있는 동시에, 다른 한쪽의 말단(자유말단)에 반응성 관능기를 갖거나 혹은 반응성 관능기를 도입할 수 있으며, 또한, 상기 코어 부분의 표면에 브러시 형상으로 배치하는 것이 가능하다면 특별히 한정되는 것이 아니다. 본 명세서에 있어서, 「코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 덮는 쉘부」란, 쉘부가 다수의 직쇄상 수용성 고분자 화합물로 이루어지고 이들 직쇄상 수용성 고분자 화합물의 각각이 한쪽의 결합말단에서 코어 부분의 표면과 결합하고, 또한, 다른 한쪽의 자유말단이 적어도 수용성 고분자 화합물과 도입물(예를 들면, 항원 또는 항체)을 반응시키는 반응액 속에서 그 반응액의 계중에 실 형상 또는 막대 형상으로 표면으로부터 돌출되어 있는 것을 의미한다. 또한, 이들 브러시 형상의 수용성 고분자 화합물쇄의 자유말단에는 각각 도입물[예를 들면, 생리 활성 물질(예를 들면, 항체, 효소, 또는 DNA)]과 결합가능한 반응성 관능기가 존재하기 때문에, 쉘 부분의최외피는 다수의 반응성 관능기로 피복되어 있다.
상기 수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아미노산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산디메틸아미노에틸 또는 폴리알릴아민 등을 들 수 있고, PEG 또는 폴리비닐알콜이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 쉘부를 구성하는 수용성 고분자 화합물쇄는, 각 수용성 고분자 화합물쇄가 상기한 수용성 고분자 화합물 1종류만으로 실질적으로 형성되어 있거나 또는 각 수용성 고분자 화합물쇄가 서로 다른 상기한 불수용성 고분자 화합물 2종류 이상의 조합으로 실질적으로 형성되어 있을 수 있다.
상기 쉘 부분을 구성하는 수용성 고분자 화합물쇄는 상기한 코어 부분의 전 표면을 실질적으로 완전하게 피복하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 쉘 부분을 구성하는 각 수용성 고분자 화합물쇄는 각각 실질적으로 동일한 길이이고, 각 수용성 고분자 화합물쇄의 자유말단에 의해서 거의 구형 또는 거의 스페로이드형의 쉘 부분 외피 표면이 형성되는 것이 바람직하다.
상기 코어 부분의 직경과 상기 쉘 부분의 두께의 비율은 용도에 따라서 적절하게 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 코어 부분의 직경을 예를 들면 5nm∼500nm으로 할 수 있으며, 또한 쉘 부분의 두께를 예를 들면 5nm∼500nm으로 할 수 있다.
상기 수용성 고분자 화합물쇄의 자유말단에 존재하는 반응성 관능기는, 상기 수용성 고분자 화합물의 한쪽의 말단(결합말단)을 코어 부분 표면에 결합시키기 전부터 다른 한쪽의 말단(자유말단)에 존재하거나 혹은 상기 수용성 고분자 화합물의한쪽의 말단(결합말단)을 코어 부분 표면에 결합시킨 후부터 다른 한쪽의 말단(자유말단)에 도입할 수 있다. 이들 반응성 관능기는 어느것이나 물(또는 수계용매) 속에서 안정되고, 또한, 본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자를 표지물질로서 사용할 때의 도입물[예를 들면, 생리 활성 물질(예를 들면, 항체, 효소 또는 DNA)]과 반응 가능한 관능기이면 특별히 한정되는 것이 아니며, 예를 들면, 알데히드기, 카르복실기, 메르캅토기, 아미노기, 말레이미드기, 비닐설폰기 또는 메탄설포닐기 등을 들 수 있고, 알데히드기, 아미노기, 카르복실기 또는 말레이미드기가 바람직하다.
불수용성 고분자 화합물을 주성분으로 하는 코어 부분의 표면에, 표층에 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물 브러시를 갖는 코어-쉘형 입자를 조제하는 방법으로서는 지금까지 보고되어 있는 여러가지 공지방법이 적용 가능하다. 상기 공지 방법으로서는 예를 들면,
(1) (a)반응성 관능기를 갖는 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트를 결합한 블록공중합체(친-소수형 블록공중합체)와 (b)소수성폴리머를 혼합하여 입자를 조제하는 에멀젼법;
(2) 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 매크로모노머를 분산제로 하여 소수성모노머를 중합시키는 분산중합법; 또는
(3) 하이드로겔 입자 표면에 수용성 고분자 화합물 브러시를 도입하는 방법 등을 들 수 있다.
상기한 에멀젼법(1)에 이용하는 친-소수형 블록공중합체의 합성방법 및 상기한 분산중합법(2)에 이용하는 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 매크로모노머의 합성방법으로서는, 예를 들면 이미 본 발명자 및 그 공동연구자가 개발한 방법(예를 들면, WO96/33233호 공보, WO99/571743호 공보 또는 특개평11-322917호 공보)을 이용할 수 있다.
상기한 친-소수형 블록공중합체 또는 수용성 고분자 매크로모노머로서 사용할 수 있는 화합물로서는, 예를 들면 WO96/33233호 공보에 기재된 식(IA):
[식 중, R1A및 R2A는 독립적으로 탄소수 1∼1O의 알콕시기, 아릴옥시기 또는 아릴-(탄소수 1∼3의 알킬옥시)기이거나 혹은 R1A및 R2A는 함께하여 탄소수 1∼6의 알킬기로 치환되어 있어도 되는 식:
-O-CH(R')-CH-O-
(여기서 R'는 수소원자 또는 탄소수 1∼6의 알킬기이다)
로 표시되는 에틸렌디옥시이거나 혹은 R1A및 R2A는 함께하여 옥시(=0)이고,
L은, 식:
-CH(R3A)-O-CO-CH(R4A)-
또는
-(CH2)r-
으로 표시되는 2가의 기이고, 여기서 R3A및 R4A는 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼10의 알킬기, 아릴기 또는 아릴-(탄소수 1∼3의 알킬옥시)기이고, r은 2∼5의 정수이고, mA는 2∼10,000의 정수이고, nA는 2∼10,000의 정수이고, pA는 1∼5의 정수이고, q는 0 또는 1∼20의 정수이고, 그리고 ZA는 q가 0일 때 수소원자, 알칼리금속, 아세틸기, 아크리로일기, 메타크리로일기, 신나모일기, p-톨루엔설포닐기, 2-메르캅토프로피오닐기, 2-아미노프로피오닐기, 알릴기 또는 비닐벤질기이고, q가 1∼20의 정수일 때 탄소수 1∼6의 알콕시카르보닐기, 카르복실메르캅토기 또는 아미노기이다]
로 표시되는 헤테로텔레켈릭 블록공중합체를 예로 들 수 있다. 상기한 식(IA)로 표시되는 헤테로텔레켈릭 블록공중합체는 예를 들면 WO96/33233호 공보에 기재된 제조 방법에 의해 조제할 수 있다.
또한, 상기한 친-소수형 블록공중합체 또는 수용성 고분자 매크로모노머로서 사용할 수 있는 화합물로서는 예를 들면 WO99/571743호 공보에 기재된 식(IB):
(식 중, A' 및 B'는 서로 독립적으로 유기실릴형의 아미노 보호기를 나타내거나 혹은 이들이 결합하는 질소원자와 함께 4∼7원의 디실라아자시클로헤테로환식환을 형성할 수 있는 유기실릴형의 아미노 보호기이고,
Y는 수소원자, 알칼리금속 또는 적당한 반응에 의해 알카리금속 대신에 도입 가능한 유기기이고,
R은 수소원자 또는 탄소수 1∼6의 알킬기이고,
nB는 1∼20,000의 정수이고, 그리고,
mB는 0∼20,000의 정수이다)
로 표시되는 폴리옥시에틸렌유도체를 들 수 있다. 상기한 식(IB)에서 나타내는 폴리옥시에틸렌유도체는 예를 들면 WO99/571743호 공보에 기재된 제조 방법에 의해 조제할 수 있다.
또한, 상기한 친-소수형 블록공중합체 또는 수용성 고분자 매크로모노머로서 사용할 수 있는 화합물로서는, 예를 들면 특개평11-322917호 공보에 기재된 식(IC):
(식 중, R1C, R2C및 R3C는 서로 독립적으로 직쇄 혹은 분기의 알킬기 또는 아랄킬기를 나타내고,
ZC는 수소원자, 아크리로일기, 메타크리로일기, 비닐벤질기, 알릴기, 파라톨루엔설포닐기, 모노 혹은 디-저급알킬치환아미노기, 카르복실기 혹은 그 에스테르기를 갖는 알킬기, 알데히드기 혹은 그 아세탈기를 갖는 알킬기 및 알칼리 금속으로 이루어진 군에서 선택되고,
mC는 O 또는 1이고,
nC는 0∼20,000의 정수이고, 그리고,
pC는 양수 2 또는 3인데,
다만, mC과 nC는 동시에 O이 되지 않는다)
로 표시되는 유기실릴설피드기 함유 화합물 또는 폴리옥시에틸렌유도체를 예로 들 수 있다. 상기한 식(IC)에서 나타내는 유기실릴설피드기 함유 화합물 또는 폴리옥시에틸렌유도체는 예를 들면 특개평11-322917호 공보에 기재된 제조 방법에 의해 조제할 수 있다.
코어-쉘형 입자의 상기 에멀젼법(1)에 따르면, 상기 식(IA), 식(IB) 또는 식(IC)에서 나타내는 각 화합물(즉, 친-소수형 블록공중합체)과 소수성폴리머를 혼합함으로써 코어-쉘형 입자(즉, 시그널 생성 물질을 봉입하기 전의 입자)를 조제할 수 있다. 또한, 코어-쉘형 입자의 상기 분산중합법(2)에 따르면, 상기 식(IA), 식(IB) 또는 식(IC)에서 나타내는 각 화합물(즉, 수용성 고분자 매크로모노머)을 분산제로 하여 소수성모노머를 중합시킴으로써 코어-쉘형 입자(즉, 시그널 생성 물질을 봉입하기 전의 입자)를 조제할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 시그널 생성 물질은, 코어-쉘형 입자의 코어 부분에 봉입한 상태라도 그 시그널을 코어-쉘형 입자의 외측으로부터 분석(검출 및측정을 포함한다)할 수 있는 물질이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 형광물질, 발광물질 또는 색소를 들 수 있다.
상기 형광물질로서는, 예를 들면 란타노이드킬레이트(예를 들면, 란탄킬레이트, 세륨킬레이트, 프라세오디뮴킬레이트, 네오디뮴킬레이트, 프로메튬킬레이트, 사마륨킬레이트, 유로퓸킬레이트, 가돌리늄킬레이트, 테르븀킬레이트, 디스프로슘킬레이트, 홀뮴킬레이트, 에르븀킬레이트, 툴륨킬레이트, 이테르븀킬레이트 또는 루테튬킬레이트, 바람직하게는 유로퓸킬레이트 또는 테르븀킬레이트), 플루오로세인이소시아네트, 디클로로트리아디닐플루오로세인 또는 테트라메틸로다민이소시아네트를 들 수 있다.
또한, 상기 색소로서는 예를 들면 메틸옐로우, 솔벤트블루35, 오일오렌지SS 또는 오일레드EGN을 들 수 있다.
시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 직경도 용도에 따라서 적절하게 변화시킬 수 있지만, 거의 구형의 입자인 경우 1Onm∼1mm 정도일 수 있다.
본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자는 예를 들면 본 발명의 제조 방법에 의해 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에서는, 예를 들면 먼저 설명한 여러가지의 공지방법에 의해 조제한 코어-쉘형 입자(즉, 시그널 생성 물질을 봉입하기 전의 입자)에 시그널 생성 물질을 봉입하는데, 우선, 코어-쉘형 입자의 코어 부분을 형성하는 불수용성 고분자 화합물을 팽윤시키는 유기용매(예를 들면, 아세톤 또는 톨루엔 등)가 일정비율로 포함되는 용액 속에 상기 코어-쉘형 입자 및 시그널 생성 물질(예를들면, 소수성을 갖는 색소 또는 형광물질 등)을 침지시킨다. 상기 침지에 의해 상기 불수용성 고분자 화합물은 팽윤되고, 그 팽윤에 따라서 시그널 생성 물질이 코어 부분에 들어가게 된다. 이어서, 이 혼합물에서 유기용매를 제거하면 상기 불수용성 고분자 화합물은 수축하지만, 소수성의 시그널 생성 물질은 코어 부분으로부터 밖으로 나올 수 없으며 코어 부분에 봉입된다. 희망에 따라 코어 부분에 입력되지 않은 시그널 생성 물질을 제거함으로써, 본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 혼합물에서 유기용매를 제거하는 방법으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 에바포레이트 등에 의해 유기용매를 증발/건고시키는 방법 혹은 비용매 속에서 수축시키는 방법(예를 들면, 유기용매를 함유하는 용액을 상기 유기용매를 함유하지 않는 용액으로 치환하는 방법) 등을 들 수 있다.
또한, 코어 부분을 팽윤시키는데 이용하는 상기 유기용매 함유 용액의 유기용매의 비율은, 시그널 생성 물질이 불수용성 고분자 화합물에 들어가는 정도까지, 상기 불수용성 고분자 화합물을 팽윤시킬 수 있는 비율이면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들면 40∼60(vo1/vol)%일 수 있다.
본 발명에 있어서는, 본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 표면에 존재하는 반응성 관능기에 다시 상기 반응성 관능기와 반응가능한 도입물(예를 들면, 생리 활성 물질)을 결합시킬 수 있다.
상기 도입물은 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 표면에 존재하는 반응성 관능기와 반응가능하면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 생리 활성 물질, 예를 들면 단백질(예를 들면, 항체 또는 효소) 혹은 핵산(예를 들면, DNA 또는 RNA) 또는 세포 등을 들 수 있다.
도입물과 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 표면에 존재하는 반응성 관능기를 결합시키는 방법은, 공지의 결합 방법 중에서 상기 도입물 및 반응성 관능기의 종류에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
예를 들면, 반응성 관능기가 알데히드기인 경우에는 생리 활성 물질[예를 들면, 단백질(예를 들면, 항원, 항체 또는 레셉터 등), 펩티드, 저분자 호르몬 또는 DNA 등]의 아미노기와 시프염기(schiff base)를 형성시킴으로써 결합할 수 있다.
또한, 반응성 관능기가 카르복실기인 경우에는 생리 활성 물질의 아미노기 사이를 축합제(예를 들면, 카르보디이미드 등)를 이용하여 결합할 수 있다. 혹은, 미리 카르복시기를 숙신이미드 또는 말레이미드 등으로 활성화하여 그 상태 그대로 생리 활성 물질과 혼합함으로써 결합시킬 수도 있다.
실시예
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 아세탈-PEG-PLA-메타크리로일의 합성
아르곤하에서 실온의 반응용기에 용매로서 테트라히드로푸란(THF) 40mL을 넣은 후 3,3'-디에톡시-1-프로파놀 0.32mL(2mmo1)을 첨가하고, 다시 0.3263mo1/L 칼륨나프탈렌의 THF용액 6.2mL(2mmol)을 첨가하고 15분간 교반하여 메탈화를 행하였다. 다시, 냉각한 실린지로 에틸렌옥시드 12mL(240mmol)을 첨가한 후 실온에서 2일간 교반하여 개환중합을 행하였다. 다음에, 1mo1/L의 DL-락티드 THF용액 84mL(84mmoL)을 첨가하여 실온에서 3시간 중합하였다. 그 후, 무수메타크릴산 4.5mL(28mmol)을 첨가하여 실온에서 2일간 교반한 후 정지반응을 행하였다.
얻어진 블록공중합체 용액을 -15℃로 냉각한 2-프로파놀에 재침전시킨 후, 원심분리(6000rpm, 40분간, -10℃)를 행하여 용매를 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하여 블록공중합체를 정제한 후 벤젠에 용해하여 동결건조하였다.
도 1에 블록공중합체의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 분자량은 GPC 측정의 결과로부터 산출하였다. 폴리유산(PLA)의 분자량은1H-NMR의 결과로부터 GPC 측정으로 얻어진 PEG 분자량을 이용하여 산출하였다. PEG의 분자량은 약5000이고 PLA의 분자량은 약500이었다.
(2) 알데히드 말단 PEG 피복 입자의 조제
아르곤하에서 실온의 반응용기에 아르곤 치환한 초순수 160mL을 첨가한 후 아조비스이소부틸로니트릴(AIBN) 30mg 및 블록공중합체[실시예 1(1)에서 조제한 것] 3.4g의 스틸렌용액 2mL를 아르곤 치환하여 교반하(400rpm)에서 적하하였다.
실온에서 30분간 교반한 후 60℃에서 18시간 다시 80℃에서 6시간 교반(400rpm)함으로써 중합을 행하였다. 중합반응 종료 후, 여과지[Filter paper2(직경=185mm);Advantec사]에 의한 여과를 행함으로써 수지덩어리나 먼지 등을 분별하여 표층부에 아세탈기를 갖는 파티클(acetal functionalized particle)을 얻었다. 이 파티클을 수중에 분산시킨 후 1mo1/L-HCI를 이용하여 상기 파티클 분산액을 pH2.0로 조정한 후 2시간 교반하였다. 그 후, 1mo1/L-NaOH를 이용하여 pH5.0로 하여 보호기인 아세탈기를 탈보호하여 표층부에 알데히드기를 도입하였다.
그 후, 탈염을 위해 이 파티클 분산액 1OOmL를 증류수 2L에 대하여 1일 투석[분획분자량(MWCO)=12000∼14000, 증류수를 4회 교환]을 행한 후, 여과지[Filter paper2(직경=185mm);Advantec사]에 의한 여과를 행하여 표층부에 알데히드기를 갖는 파티클(aldehyde functionalized particle) 즉 말단알데히드 블록폴리머스틸렌 입자(입경=65nm)를 얻었다. 얻어진 입자(PEG분자량=약5000, PLA분자량=약500)의 주사전자현미경(SEM) 사진을 도 2에 나타낸다.
또한, 실시예 1(1)에 있어서, 에틸렌옥시드의 개환중합을 행한 후 DL-락티드 THF 용액을 첨가하지 않고 무수메타크릴산을 첨가한 것 이외는 실시예 1(1) 및 실시예 1(2)의 조작을 반복함으로써 PLA 유닛의 길이를 변화시킨 비교용 입자(PEG분자량=약5000, PLA분자량=O)를 조제하였다. 얻어진 비교용 입자의 SEM 사진을 도 3에 나타낸다.
(3) 유로퓸킬레이트 봉입 입자의 조제
염화유로퓸6수화물의 수용액(22mg/mL, 증류수) 1mL에 테노일트리플루오로아세톤(TTA)의 아세톤용액(37mg/mL) 1mL을 첨가하고 다시 트리옥틸포스핀옥사이드(TOPO)의 아세톤용액(43.5mg/mL) 2mL을 첨가하여 유로퓸킬레이트 용액을 조제하였다.
한편, 실시예 1(2)에서 조제한 말단알데히드 블록폴리머 스틸렌 입자(입경=65nm)의 현탁액(18mg/mL, 증류수) 5mL에 아세톤 5mL를 첨가하여 교반하였다. 이 혼합액에 먼저 조제한 유로퓸킬레이트 용액 O.12mL를 첨가하고 다시 10초간 교반하였다. 교반종료 후 차광하에서 실온에서 30분간 정치하고나서 질소가스를 분무하여 아세톤을 제거하였다. 그 후, 입자로 들어가지 않고 아세톤을 제거하였기 때문에 침전된 유로퓸킬레이트를 0.2미크론의 필터를 통과시켜 제거함으로써, 본 발명의 유로퓸킬레이트 봉입 입자를 얻었다.
실시예 2
(1) 유로퓸 봉입 입자 표지 항CRP항체의 조제
실시예 1에서 조제한 유로퓸 봉입 입자 O.5mL에 0.2mo1/L 인산완충액(pH8.0) 0.5mL를 첨가하여 교반한 후, 항C반응성단백질(CRP) 토끼항체F(ab')2분획(2Omg/mL, 생리식염수) O.1mL를 첨가하여 혼화하여 실온에서 한시간 정치반응을 실시하였다. 또한, 상기 항CRP토끼항체F(ab')2분획은 통상적인 방법에 따라서 항CRP토끼항체(Dako사)로부터 조제하였다. 이 반응액에 NaBCNH312mg를 첨가하여 실온에서 15시간 혼화반응을 실시하였다.
반응액을 O.15M 염화나트륨 함유 5OmM 트리스염산완충액(pH7.8)으로 평형화한 세파크릴 S-300 컬럼(1cm x 45cm; 팔마시아)에 어플라이하고 1OmL/시간의 유속으로 1mL/튜브로 분획하였다.
최초로 용출된 입자의 피크를 자외부의 흡광도로 모니터하고 모아서 유로퓸봉입 입자 표지 항CRP항체로 하였다.
(2) 유로퓸 봉입 입자 표지 항CRP항체를 이용한 면역측정법(immunoassay)에 의한 CRP의 측정
ELISA용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각 웰에 생리식염수로 4㎍/mL로 희석한 항CRP 토끼항체F(ab')2분획 5OμL를 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치코트하였다. 1/15mo1/L 인산완충용액(PBS:pH7.4)으로 각 웰을 3회 세정한 후 1% 소혈청 알부민(BSA) 함유 PBS 0.25mL를 각 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 블록하였다.
1/15mo1/L-PBS(pH7.4)로 각 웰을 3회 세정한 후 0.1% 트윈(Tween) 20 및 O.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스염산완충액(pH7.5)으로 희석한 CRP 표준품 50μL를 각 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 정치반응을 실시하였다.
1/15mo1/L-PBS(pH7.4)로 각 웰을 3회 세정한 후, 실시예 2(1)에서 조제한 유로퓸 봉입 입자 표지 CRP항체의 희석액[0.1% 트윈 20, O.2% BSA 및 0.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스염산완충액(pH7.5)으로 1000배로 희석한 것] 50μL를 각 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 정치반응을 실시하였다.
1/15mo1/L-PBS(pH7.4)에서 각 웰을 5회 세정한 후, 플레이트의 시간 분해 형광량을 시간 분해 형광광도계(와락사)로 1초간 측정하였다. 결과를 표 1과 도 4에 나타낸다.
표1
CRP 항원 농도 시간 분해 형광량
(ng/mL)
O 1611
0.14 1713
1.4 2566
14 19259
140 152695
본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 입자는, 생리 활성 물질의 표지 물질로서 사용할 수 있으며, 생리 활성 물질의 활성을 이용하여 결합 반응을 행하게 한 후 시그널 생성 물질로부터 발생되는 시그널로부터 감도 좋게 특이적으로 측정 대상물질을 검출할 수 있다. 따라서, 이 시그널 생성 물질 봉입 입자는 안전하고 또한 간편한 우수한 표지 물질로서 넓은 분야에 응용될 수 있다.
오늘날, 농약이나 환경호르몬 등의 저분자량 물질, 여러가지의 생체가 이상을 일으켰을 때에 체액으로 방출되는 항원 또는 항체, 혹은 생체 내에 침입한 바이러스 유래의 항원, 그것에 대항하는 항체, DNA 또는 RNA 등 고감도로 측정하는 것이 의의가 있는 물질은 매우 많다. 그 때문에 방사성동위원소, 효소, 형광물질 또는 색소 등을 측정 대상물질에 대하여 결합 활성을 갖는 물질에 표지하고, 여러가지의 조작법에 의해서 측정하는 방법이 개발되어 왔다. 그러나, 본 발명의 시그널 생성 물질 봉입 입자는 공지의 표지 물질에 비교하여 감도, 조작의 용이함 및 비특이적 반응이 적음 등의 면에서 우수한 표지 물질이다.
이상, 본 발명을 특정한 형태에 따라서 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (8)

  1. (1) 불수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지는 코어 부분과 (2) 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 구성되고, 또한, 상기 코어 부분과 상기 쉘 부분이 전체적으로 불수용성 고분자와 수용성 고분자의 블록공중합체로 이루어지는 코어-쉘형 입자에 있어서,
    상기 코어 부분에 시그널 생성 물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    수용성 고분자 화합물이 폴리에틸렌글리콜인 것인 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    불수용성 고분자 화합물이 폴리스틸렌인 것인 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 관능기가 알데히드기, 아미노기, 카르복시기, 말레이미드기 또는 숙신이미드기인 것인 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    시그널 생성 물질이 색소인 것인 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    시그널 생성 물질이 형광물질인 것인 시그널 생성 물질 봉입코어-쉘형 입자.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    시그널 생성 물질이 란타노이드킬레이트인 것인 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자.
  8. (a) (1)불수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어진 코어 부분과 (2) 반응성 관능기를 갖는 수용성 고분자 화합물로부터 실질적으로 이루어지고 상기 코어 부분의 표면을 브러시 형상으로 피복하는 쉘 부분으로 구성되며, 또한, 상기 코어 부분과 상기 쉘 부분이 전체적으로 불수용성 고분자와 수용성 고분자의 블록공중합체로 이루어지는 코어-쉘형 입자와 (b)시그널 생성 물질을 상기 불수용성 고분자 화합물을 팽윤시킬 수 있는 유기용매를 함유하는 용액 속에 침지시킴으로써, 코어 부분에 상기 시그널 생성 물질을 봉입시키는 것을 특징으로 하는 청구항 1 기재의 시그널 생성 물질 봉입 코어-쉘형 입자의 조제 방법.
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