WO2002097090A1 - Genes with es cell-specific expression - Google Patents

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WO2002097090A1
WO2002097090A1 PCT/JP2002/005350 JP0205350W WO02097090A1 WO 2002097090 A1 WO2002097090 A1 WO 2002097090A1 JP 0205350 W JP0205350 W JP 0205350W WO 02097090 A1 WO02097090 A1 WO 02097090A1
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cells
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dna
protein
sequence
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PCT/JP2002/005350
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English (en)
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Inventor
Shinya Yamanaka
Hideko Kaiho
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an ECAT gene (ES cell associated transcript gene) that is specifically expressed in ES cells (embryonic stem cells) and its use.
  • ECAT gene ES cell associated transcript gene
  • Embryonic stem (ES) cells are isolated from early mammalian embryos and proliferate semipermanently while maintaining the ability to differentiate into all cells in the body, that is, totipotency. ES cells were first established in mice in 1981, and brought a revolutionary technology of gene function analysis using knockout mice. Furthermore, since the establishment of human ES cells was reported in 1998, application to regenerative medicine has been greatly expected. The aim is to transplant the myocardium and nerve cells differentiated from ES cells into patients with myocardial infarction and neurodegenerative disease to recover their function.
  • Cell transplantation therapy as exemplified by bone marrow transplantation for leukemia, has two issues: securing sufficient transplanted cells and suppressing rejection.
  • securing sufficient transplanted cells By using semi-permanently dividing ES cells, the problem of securing sufficient cells can be solved at once.
  • somatic cell cloning technology rejection can be overcome. If ES cells are established from cloned embryos produced from the patient's somatic cells and used for transplantation, rejection cannot occur because they have the same gene as the patient. Thus, ES cells have the potential to overcome both challenges in cell transplantation therapy.
  • ES cells have such great potential, human ES cells are more difficult to establish and maintain than mouse ES cells, and it is necessary to develop reliable establishment and culturing techniques. In addition, embryos must be sacrificed to establish human ES cells. Furthermore, when combined with somatic cell cloning technology, it can be easily linked to the production of cloned humans. In order to solve such ethical problems, there is a demand for the development of a technology for directly producing ES-like cells having totipotency from somatic cells without passing through embryos.
  • a gene that plays an important role in the development of these technologies is a gene that is specifically expressed in totipotent cells such as ES cells (ES cell associated transcript gene, hereinafter referred to as EC AT gene).
  • the ECAT gene is a marker for determining whether a cell is an ES cell.
  • ES cells can be efficiently selected from a mixed culture of many types of cells (Table 9-500004). No. 6,146,888).
  • the conversion to ES-like cells can be promoted by inducing the expression of the ECAT gene in somatic cells.
  • ECAT The only reported ECAT gene so far is the transcription factor Oct3 (Oct4, also called POU5 ⁇ 1; hereafter Oct_3Z4) gene.
  • Oct3 also called POU5 ⁇ 1; hereafter Oct_3Z4 gene.
  • hOct_3Z4 gene Takeda et al., Nucleic Acids Res. 20: 4613-4620, 1992.
  • hOct_3 / 4 is a transcription specifically expressed in ES cells and EG cells (embryonic germ cells). It is a factor that loses its expression as the cells differentiate, and is used as a marker for ES cells.
  • Oct_3Z4 is expressed not only in totipotent cells but also in trophectoderm cells in addition to totipotent cells. (Biol Reprod 63: 1698-1705, 2000), using only the Oct-3 / 4 gene as an index. In order to prevent this risk, it is desirable to identify multiple ECAT genes and use them in combination.
  • An object of the present invention is to provide a novel ECAT gene. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for screening ES cells using a new ECAT gene and a gene product peptide encoded by the gene, and a probe for ES cell selection.
  • hECAT human homologous gene
  • an ES cell selection probe comprising any one of the DNAs having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • An ES cell selection probe comprising a DNA encoding a protein that is specifically expressed and a DNA that can hybridize under stringent conditions.
  • a probe for selecting an ES cell which comprises at least one of a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, or 41 .
  • ES cell selection probe comprising DNA encoding a protein that is specifically expressed.
  • the probe for selecting an ES cell according to the above (6) which comprises a DNA encoding a protein expressed in E. coli.
  • ES cell selection probe comprising a DNA that can hybridize under mild conditions.
  • (9) It consists of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 9, 13, 15, 17, 19, 21 or 23, and is used for ES cells.
  • the probe for selecting an ES cell according to the above (8) which comprises a DNA encoding a protein that is specifically expressed and a DNA that can hybridize under stringent conditions.
  • a probe for selecting ES cells which comprises any one of DNAs comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 or 43.
  • a gene comprising any one of the following DNAs (a) to (c):
  • (c) a DNA consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of (a), and which encodes a protein specifically expressed in ES cells.
  • a gene comprising any one of the following DNAs (a) to (c).
  • nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein specifically expressed in ES cells.
  • (c) D comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of (a), and encoding a protein specifically expressed in ES cells.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and which is specifically expressed in ES cells (26) DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23 or 41, or SEQ ID NO: 10, 14, 16, 18, 20, 20, '
  • a method for screening ES cells comprising analyzing the expression status of a protein comprising the amino acid sequence described in 22, 24 or 42 in a cell.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, 13, 15, 17, 19, 21 or 23, or SEQ ID NO: 10, 14, 16, 18, 20, 22, or 24
  • a method for screening ES cells comprising analyzing the state of expression of a protein comprising the amino acid sequence to be expressed in a cell.
  • (31) DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35 or 37, or described in SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36 or 38 (30) The method for screening ES cells according to (30) above, wherein the state of expression of the protein comprising the amino acid sequence in the cell is analyzed.
  • An ES cell selection probe comprising a continuous partial sequence of 20 bases or more that does not contain a repetitive sequence in the sequence, and comprising a DNA having a sequence specific to a gene specifically expressed in ES cells.
  • the present invention relates to a recombinant vector having a DNA encoding a gene specifically expressed in an ES cell or a protein specifically expressed in an ES cell, particularly a betater for forced expression of a differentiation inhibitory gene, and a vector comprising the vector.
  • the present invention further provides a recombinant vector comprising a gene specifically expressed in ES cells or a genomic DNA fragment containing DNA encoding a protein specifically expressed in ES cells, and a selection gene such as a drug resistance gene incorporated into a genomic DNA fragment.
  • the present invention relates to a vector for selecting ES cells, and a transformed cell transformed with the vector.
  • FIG. 1 shows the results of Northern blot analysis of the expression of each ECAT gene in ES cells and 12 kinds of organs of adult mice.
  • Figure 2 shows ES cells, mesenchymal stem cells, and ECA in 13 types of human adult organs.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression of T gene analyzed by Northern blot.
  • the present invention relates to a gene specifically expressed in ES cells (hereinafter, also referred to as ES cell-specific expression gene), that is, an ECAT gene. It is possible to determine whether the cells are ES cells using the presence or absence of the expression of the ECAT gene as an index.
  • the present invention provides a probe for selecting ES cells suitable for determining whether such ES cells are correct or not. Specific examples of the probe include a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 (hereinafter, ECAT 1 gene), DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing
  • ECAT2 gene (Hereinafter referred to as the ECAT2 gene), consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing.
  • ECAT3 gene DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing (hereinafter ECAT4 gene), DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the Sequence Listing (hereinafter ECAT5 gene) ),
  • ECAT6 gene DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 19
  • ECAT7 gene DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 21
  • ECAT9 gene A polynucleotide comprising a DNA having the described nucleotide sequence (hereinafter referred to as the ECAT8 gene) or a DNA having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 41 (hereinafter referred to as the ECAT9 gene) is exemplified.
  • the ECAT8 gene DNA having the described nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 41
  • the base sequence described above may have undergone modification such as substitution, deletion or addition.
  • a polynucleotide containing a DNA encoding a protein that hybridizes to the ECAT gene under stringent conditions and is specifically expressed in ES cells, or one or several bases in the base sequence of the ECAT gene The present invention also relates to a polynucleotide comprising a DNA comprising a base sequence having deletion, substitution, or addition of DNA and capable of hybridizing under stringent conditions with DNA encoding a protein specifically expressed in ES cells.
  • hECAT2 gene a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 of the Sequence Listing
  • a DNA comprising the sequence hereinafter referred to as hECAT3 gene
  • hECAT4 gene a DNA comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 31
  • hECAT5 gene DNA consisting of the base sequence described below
  • hECAT7 gene DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 in the Sequence Listing
  • hECAT8 gene a polynucleotide comprising a DNA comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 43
  • hECAT9 gene a polynucleotide comprising a DNA comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 43
  • DNA having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 25 in the Sequence Listing that is, DNA encoding Oct-3Z4, or DNA having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 39 in the Sequence Listing, ie, hOct-3 /
  • a polynucleotide containing DNA encoding 4 can also be used as a probe for ES cell selection.
  • the Oct-3 / 4 gene is also expressed in vegetative ectoderm cells, so it preferably contains an ECAT gene other than the Oct-3 / 4 gene or the hOct-3 / 4 gene.
  • the novel ES cell selection probe of the present invention such as a polynucleotide, in combination. Further, even in the case of the novel ES cell selection probe containing the ECAT gene, it is preferable to use several types of probes in order to more accurately determine whether or not the probe is an ES cell.
  • the term "stringent conditions" refers to conditions under which a DNA having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more in a nucleotide sequence can hybridize. The stringency can be adjusted by appropriately changing the temperature, salt concentration, and the like during the hybridization reaction or washing. More preferred conditions are conditions under which DNA having a homology of 95% or more can hybridize.
  • the ECAT2 gene is reported as a gene whose expression decreases when EC cells are stimulated with retinoic acid, pH34 (D ferentiation 46: 61-67, 1991), and according to the database of RIKEN (ES cell specific gene) 1.
  • the ECAT3 gene is a gene encoding a mouse protein having an F box, and its expression has been reported to be observed in testis and ovaries (Current Biology 9: 1180-1182, 1999).
  • the ECAT7 gene has been reported as DNMT3, a protein similar to DNMT3 that performs DNA methylation (Genomics 65: 293-298, 2000).
  • the ECAT 9 gene is a growth factor called GDF3 in mice, Jones CM et al., Mol Endocrinol.
  • the term “gene having extremely high homology” specifically means a gene that hybridizes with the ECAT 5 gene under stringent conditions, and if this requirement is satisfied.
  • the base sequence of the ECAT5 gene (SEQ ID NO: 17 in the Sequence Listing) one or several bases may be deleted, substituted or added. Specifically, it is a gene having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably 95% or more homology with the ECAT5 gene.
  • “a protein that behaves similarly” means a protein having the characteristics of the ECAT 5 protein that is specifically expressed in ES cells. In the sequence listing SEQ ID NO: 18), one or several amino acids may be deleted, substituted or added.
  • the ES cell selection probe of the present invention includes various ECAT genes and hECA T gene sequences, which are constructed based on the sequences of SEQ ID NOS: 9, 11, 13, 15, 15, 17, 19, 21, 23 or 41, and a DNA fragment comprising a continuous partial sequence of 20 or more bases which does not include a repeated sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 or 43 is included.
  • the DNA fragment is not particularly limited as long as it can hybridize with the ECAT gene or the hECAT gene.
  • Preferred examples thereof include the NA fragments described in SEQ ID NOs: 1 to 8 in the sequence listing.
  • ECAT2 ECAT3, ECAT4, ECAT5, ECAT7, ECAT8 and ECAT9
  • human ECAT gene was present (described below: hECAT 2, hECAT 3, hEC AT 4, hECAT 5, h ECAT 7, and hECAT 8, and hEC AT 9 genes, respectively).
  • the nucleotide sequence of the CAT 8 gene and the protein encoded by the nucleotide sequence The quality amino acid sequence has not yet been determined. Accordingly, the present invention provides hECAT3, hECAT5, and hECAT8 genes and proteins, genes having extremely high homology to them, and proteins exhibiting similar behavior.
  • the term “genes with extremely high homology” and “proteins exhibiting similar behavior” specifically refer to those that hybridize with the hECAT3, hECAT5 or hECAT8 gene under stringent conditions. Means the gene, and if this requirement is satisfied, one or several of the nucleotide sequences of the hECAT3, hECAT5 or hECAT8 gene (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, respectively) Bases may be deleted, substituted or added. Specifically, they are genes having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably 95% or more homology with those genes.
  • a protein having the same behavior means a protein having the characteristics of the hECAT3 protein, hECAT5 protein or hECAT8 protein.
  • One or several amino acids may be deleted, substituted or added in the acid sequence (SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 38).
  • the probe of the present invention can be prepared by a technique known in the art.
  • this probe uses DNA isolated from EST of the corresponding ECAT gene by digestion with restriction enzymes, and complementary DNA (cDNA) prepared from genomic DNA or mRNA derived from ES cells as a ⁇ -type PCR. It can be prepared as DNA obtained by amplification by a method, DNA synthesized chemically, or DNA constructed by appropriately combining these methods.
  • the present invention provides a method for screening ES cells, which comprises analyzing the expression status of a gene that is specifically expressed in ES cells.
  • genes specifically expressed in ES cells is synonymous with the above-mentioned ECAT gene or hECAT gene, and specifically, ECAT1, ECAT2, and ECAT3 genes. , ECA
  • T4 gene ECAT5 gene, ECAT6 gene, ECAT7 gene, ECAT 8 genes, ECAT9 gene, hECAT2 gene, hECAT3 gene, hECAT4 gene, hECAT5 gene, hECAT7 gene, hECAT8 gene and hECAT9 gene, and Oct-3 / 4 gene HOct-3 / 4 gene.
  • ES cell screening is carried out by analyzing the expression status of ES cell-specific expressed genes or ES cell-specific expressed proteins encoded by them.
  • the above-described probe for ES cell selection can be used.
  • a probe comprising a polynucleotide containing DNA encoding Oct-3Z4 in combination.
  • Such a probe may be labeled with a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, or the like.
  • the antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to the protein, and may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a functional fragment thereof. These antibodies or fragments thereof may be labeled with a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, or the like.
  • these may be commercially available ones, and can be appropriately prepared according to a conventional method.
  • the present invention also relates to an expression vector containing the ES cell-specific expression gene or the gene encoding the ES cell-specific expression protein.
  • the ES cell-specific expressed gene is as described above, and the gene coding for the ES cell-specific expressed protein is specifically a gene encoding ECAT 1 (SEQ ID NO: 10). , ECAT2 (SEQ ID NO: 12) or hECAT 2 (SEQ ID NO: 2)
  • ECAT4 (SEQ ID NO: 16), which encodes (SEQ ID NO: 30) Or a gene encoding hECAT4 (SEQ ID NO: 32), a gene encoding ECAT 5 (SEQ ID NO: 18) or hECAT5 (SEQ ID NO: 34), ECAT6 (SEQ ID NO: 20) Genes encoding ECAT7 (SEQ ID NO: 22) or hECAT7 (SEQ ID NO: 36), genes encoding ECAT8 (SEQ ID NO: 24) or hECAT8 (SEQ ID NO: 38) and E CAT 9 (SEQ ID NO: 42) or h E CAT 9
  • Such an expression vector preferably has a function of suppressing differentiation by being expressed in a cell, particularly an ES cell, due to the nature of the gene contained therein. That is, it is a vector for forcibly expressing a differentiation-suppressing gene (hereinafter, also referred to as a differentiation-forcing gene forced expression vector).
  • the expression vector of the present invention can maintain the replication or autonomously propagate in various animal cells,
  • the expression vector can be prepared based on a conventional genetic engineering technique, for example, according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (198 9 ).
  • it is a viral vector, for example, a DNA or RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a henorevirus, a vaccinia virus / less, a box inoles, a polio inoles, or a sylbis virus.
  • a DNA or RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a henorevirus, a vaccinia virus / less, a box inoles, a polio inoles, or a sylbis virus.
  • It is prepared by incorporating ES cell-specific expressed genes into the cell.
  • it is also possible to introduce a desired promoter region, drug resistance gene region, and expression control region
  • Introduction of the expression vector of the present invention into cells is carried out by a conventionally known method such as transfection, ribophenetion, microinjection, impact missile, and electorifice poration.
  • the produced expression vector of the present invention is integrated and expressed in a host cell is determined by, for example, determining the amount of the protein (polypeptide) produced by the expression of the introduced ECAT gene, for example, EL. It can be confirmed by measuring by the ISA method or the like. Further, the ECAT gene can be used not only as a probe for determining whether or not the cell is an ES cell, but also for selectively separating the ES cell from a mixture of the ES cell and other types of cells. The present inventors have prepared a targeting vector for knocking in a drug selection gene into the protein translation region of each ECAT gene, and have established ES cells that have undergone homologous recombination using the vector.
  • the method was carried out according to the method described in Japanese Patent Publication No. 9-500000 (corresponding to U.S. Pat.
  • ECAT4 gene or ECAT5 gene were cultured in the presence of G418, no differentiated cells were found in the selected cells.
  • EST is a method in which a large number of cDNA clones are randomly extracted from cDNA libraries derived from various cells and organs, and the sequence of the 5 'or 3' stump is analyzed for only one reaction and registered in the public database. It is. EST can be said to be a catalog of genes expressed in each cell and organ. More than 1 million clones have been registered from mice and more than 30,000 clones have been registered only from mouse ES cells.
  • Each set consists of at least one EST or known gene.
  • Digital differential display method was used as an analysis method. This method calculates the frequency of each set in a library of specified cells or organs, that is, the number of EST clones contained in each set divided by the total number of EST entries from that library, and calculates This is a method for examining the frequency of expression between organs.
  • Gene expression frequency analysis was performed on a group of libraries derived from the following five cells and organs by the digital differential display method. The number in parentheses in each group indicates the number of clones analyzed. All corresponding libraries from Groups 1 to 5 were analyzed. Since the data amount of the six groups was enormous, 23 libraries were extracted to include as many organs and cells as possible.
  • ESII was present only in cell-derived libraries.
  • the URL of the database and horn analysis program used are as follows.
  • nttp // www. ncbi. nlm. nin. gov / UniGene / Mm. Home, html
  • Oct_3 / 4 DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 25 prepared by cutting out plasmid C1 in BS KS (Cell 60: 461-472, 1990) with EcoRI.
  • ECAT 1 a DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 1 prepared by cutting out Mm. 31054EST (#AI 467128) with SalI / NotI.
  • ECAT2 DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 2 prepared by cutting out pH34EST (# AA473473) with SalI / NotI. .
  • ECAT 3 DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 3 prepared by cutting out FBX15EST (# AA571680) with SalI / NotI.
  • ECAT 4 DNA fragment containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 prepared by cutting out the home box coding region by PCR and excising it from a TA-cloned plasmid for use as a gateway with EcoRI.
  • ECAT 5 a DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 5 prepared by cutting out a plasmid obtained by RT-PCR using ER as S118 / RACE11 and excising it from TA-cloned plasmid with EcoRI.
  • ECAT6 DNA fragment containing the sequence shown in SEQ ID NO: 6 which is a keratin-E PCR product (48927 SZ48927AS).
  • ECAT7 a DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 7 prepared by cutting out from the DNMT3 LEST clone (AA 895770, pBSSK-dnmt31) with EcoRI / XhoI.
  • ECAT 8 MNA. 77010 A DNA fragment containing the sequence described in SEQ ID NO: 8 prepared by cutting out the ECE product from the TA C cloning plasmid with EcoRI.
  • Labeling of the probe with 32 P-d CTP was performed using Amersham Pharmacia's megalabeling kit. Hybridization was performed using Funakoshi Quickhyb. The signonole analysis after washing was performed using BAS5000 of Fuji Film.
  • ECAT4 gene As a result of attempting to identify the full-length cDNA by the RACE method, translation regions were identified for the ECAT4 gene, ECAT5 gene, and ECAT6 gene.
  • ECAT4 gene As a result of searching the predicted amino acid sequence using B1astP, it was found that the ECAT4 gene had a homeobox, the ECAT5 gene had homology to the oncogene H-Ras, The CAT 6 gene was found to be similar to keratin, and the ECAT 9 gene, which was newly confirmed to be an ECAT gene, was found to be a growth factor called GDF-3.
  • the CAT 5 gene was not included in the database.
  • the ECAT2 gene is listed as ES cell specific gene (ESG) 1 in the RIKEN database, but there was no information on the expression of the other eight genes in ES cells.
  • ECAT 9 As for the gene, the hECAT9 gene exists as hGDF3 (Caricasole et al., Supra). No human orthologs could be identified for the EC AT1 and EC AT6 genes.
  • RNA from 13 types of human adult organs purchased from Saturation Technology or Funakoshi
  • total RNA from human mesenchymal stem cells purchased from Takara
  • monkey ES cells not available
  • Total RNA derived from differentiation and induced by retinoic acid provided by Prof. Nakatsuji at the Institute of Regenerative Medicine at Kyoto University, was analyzed by Northern blotting.
  • hECAT2, 4, 7, 8, 9 and h O ct 3/4 the total length c DNA of the corresponding EST clones in was used as a probe.
  • Hybridization was carried out in the same manner as in the analysis of mouse ECAT in Example 1 above, but the reaction and washing temperature were set low (50 ° C) so that monkey RNA could be detected with a human probe.
  • ECAT genes that are specifically expressed in mouse ES cells can be provided.
  • seven corresponding human ECAT genes are provided.
  • selective cell markers for ES cells can be obtained.
  • drug resistance In the selection of ES cells by combining them with genes, trials of inducing ES cell-like cells from somatic cells, etc., it is more effective than when the Oct_3 / 4 gene or its fragment is used alone, and regeneration It is considered useful in medical and other settings.

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Description

E S細胞特異的発現遺伝子
技術分野
本発明は、 E S細胞 （embryonic stem cells) に特異的に発現している E C A T 遺伝子 （ES cell associated transcript gene) およびその利用に関する。
背景技術
胚性幹 （E S ) 細胞は哺乳動物の早期胚より分離された細胞で、 体内のすべての 細胞に分化する能力、 すなわち分化全能性を維持したまま、 半永久的に増殖する。 E S細胞は 1 9 8 1年にまずマウスで樹立され、 ノックァゥトマウスによる遺伝子 機能解析という画期的な技術をもたらした。 さらに、 1 9 9 8年にヒト E S細胞の 樹立が報告されてからは、 再生医学への応用が大きく期待されるようになった。 E S細胞から分化させた心筋や神経細胞を心筋梗塞や神経変性疾患の患者へ移植して 機能回復を計ろうというものである。
白血病に対する骨髄移植に代表されるように細胞移植療法は既に実施されている 力 十分な移植細胞の確保と拒絶反応の抑制という 2つの課題を抱えている。 半永 久的に分裂する E S細胞を用いると、 十分な細胞の確保という問題を一気に解決で きる。 さらに体細胞クローン技術と組み合わせると、 拒絶反応も克服することが可 能である。 患者の体細胞から作製したクローン胚から E S細胞を樹立し移植に用い れば、 患者と同じ遺伝子を持っため拒絶は起こり得ない。 したがって、 E S細胞は 細胞移植療法における 2つの課題をともに克服する可能性を持つ。
このように大きな可能性を秘めた E S細胞であるが、 ヒト E S細胞はマウスの E S細胞に比べて樹立と維持が困難であり、 確実な樹立技術および培養技術の開発が 必要である。 さらにヒト E S細胞を樹立するためには胚を犠牲にする必要がある。 さらに体細胞クローン技術と組み合わせた場合は、 クローン人間の作製に容易につ ながる。 このような倫理的問題点を解決するために、 分化全能性を持った E S様細 胞を体細胞から胚を経ずに直接作り出す技術の開発が望まれている。 これらの技術開発において重要な役割を果たすのが E S細胞等分化全能性細胞で 特異的に発現する遺伝子 （ES cell associated transcript gene、 以下 EC AT遺 伝子） である。 ECAT遺伝子は、 細胞が E S細胞であるかどうかのマーカーとな る。 また EC AT遺伝子の ES細胞特異的発現を引き起こす調節領域と薬剤耐性遺 伝子を組み合わせることにより、 多種類の細胞の混合培養から E S細胞を効率よく 選択することができる （特表平 9— 500004号公報；対応米国特許第 6146 888号公報） 。 さらに体細胞において EC AT遺伝子を発現誘導することにより E S様細胞への変換を促進させうる可能性もある。
これまでに EC AT遺伝子として唯一報告されているのは転写因子 O c t 3 (O c t 4、 POU 5 ί 1とも呼ばれる。 以下 O c t _ 3Z4という） 遺伝子である。 また、 同様な遺伝子がヒトでも報告されているが （以下 hOc t_3Z4遺伝子と いう ： Takeda et al. , Nucleic Acids Res. 20： 4613-4620, 1992、 配歹 (J表配歹 (J番 号 39) 、 hOc t— 3/4遺伝子については ES細胞特異的な発現を証明したと いう報告はない。 Oc t _ 3/4は E S細胞や EG細胞 （embryonic germ cells) で特異的に発現する転写因子であり、 細胞の分化に伴いその発現が消失する。 そこ で E S細胞のマーカーとして利用されているし、 またその遺伝子座にネオマイシン 耐性遺伝子をノックインすることにより、 E S細胞樹立の効率化が図られている (特表平 9一 500004号公報；対応米国特許第 6146888号公報） 。 しか し、 O c t _ 3 Z 4は分化全能性細胞以外に栄養外胚葉細胞でも発現しているとい う報告 （Biol Reprod 63： 1698-1705, 2000) もあり、 Oc t— 3/4遺伝子のみ を指標とすると E S細胞以外の細胞も選択してしまうことになる。 この危険性を防 ぐためには、 EC AT遺伝子を複数同定し、 それらを組み合わせて使用することが 望ましい。
また Oc t— 3ノ4のみを体細胞で発現誘導しても E S様細胞への変換は認めら れない。 また、 Oc t— 3/4を恒常的に発現させても L I F (leukemia inhibitor factor, 白血病阻止因子） 除去に伴う E S細胞の分ィヒ （原始内胚葉、 原 始外胚葉への分化） は抑制できない。 それどころか、 Oc t— 3/4の発現量を通 常のレベルのわずか 1. 5倍程度増加させることによつても、 逆に L I F除去の際 と同様の分化が誘導されるという興味深い結果が報告されている （実験医学、 19、 330— 338、 2001年） 。 このように O c t— 3 Z4の作用は単純ではなく、 O c t一 3Z4のみを体細胞で発現させて、 ES細胞へ誘導することは困難である。 かかる点からも、 複数の EC AT遺伝子を組み合わせて、 ES細胞を解析する必要 があると考えられる。
し力 しながら、 Oc t— 3/4遺伝子以外に EC AT遺伝子は見出されておらず、 再生医学、 ES細胞の細胞移植への応用という観点から、 新たな ECAT遺伝子の 提供が強く求められていた。
発明の開示
本発明は、 新規な ECAT遺伝子を提供することを目的とする。 さらに詳しくは、 本発明は、 新たな E CAT遺伝子およびそれがコードする遺伝子産物べプチドを用 いた E S細胞のスクリ一ユング方法、 ならびに E S細胞選択用プローブを提供する ことを目的とする。
本発明者らは、 EC ATの候補遺伝子を同定するために E ST (Expressed
Sequence tag) データベース （詳細は後述） を利用し、 コンピューター解析による 候補遺伝子の同定を行って 10遺伝子を同定した。 この 10遺伝子のうち、 8遺伝 子に関してノザンプロットを行い、 ES細胞ならびに 12種類の臓器 （マウス） に おける発現を解析した。 結果、 8遺伝子全ての発現が ES細胞に特異的であること がわかった。 また、 これらの遺伝子の発現は ES細胞をレチノイン酸で刺激誘導す る、 すなわち分化誘導することにより速やかに消失することがわかった。 以上の結 果から本発明者らは、 これらの 8つの遺伝子が EC AT遺伝子であることを見出し て本発明を完成した。 さらに残る 2つのうち、 1つの遺伝子についてもノザンプロ ット等を行い角军析し、 EC AT遺伝子であることがわかった。
さらに、 EC AT遺伝子のヒト相同遺伝子 （以下 hECAT) を同定し、 ES細 胞ならびに 13種類の臓器 （ヒト） における発現を解析した。
即ち本発明は下記の通りである。 (1) 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列からなる D N Aのいずれか一つを含むことを特徴とする E S細胞選択用プローブ。
(2) 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 且つ E S 細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特徴とする E S細 胞選択用プローブ。
(3) 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジヱントな条件下 でハイプリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする E S細胞選択用プローブ。
(4) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 1 9、 21、 23または 41に記載 の塩基配列からなる D N Aのレ、ずれか一つを含むことを特徴とする ES細胞選択用 プローブ。
(5) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載の塩基 配列からなる DNAのいずれか一つを含むことを特徴とする上記 （4) 記載の ES 細胞選択用プローブ。
(6) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21、 23または 41に記載 の塩基配列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むこと を特徴とする ES細胞選択用プローブ。
(7) 配列表配列番号 9、 13、 15、 1 7、 19、 21または 23に記載の塩基 配列からなる D N Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ し、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特徴 とする上記 (6) 記載の ES細胞選択用プローブ。
(8) 配列表配列番号 9、 1 3、 15、 17、 19、 21、 23または 41に記載 の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配 列からなり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリ 'ェントな条件下でハイプリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする E S細 胞選択用プローブ。
(9) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載の塩基 配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列から なり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズし得る DNAを含むことを特徴とする上記 (8) 記 載の E S細胞選択用プローブ。
(10) マウス ES細胞の選択用である、 上記 (1) 〜 （9) のいずれか一つに記 載の E S細胞選択用プローブ。
(1 1) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の 塩基配列からなる D N Aのいずれか一つを含むことを特徴とする E S細胞選択用プ ローブ。
(12) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配 列からなる DNAのいずれか一つを含むことを特徴とする上記 （11) 記載の ES 細胞選択用プローブ。
(13) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の 塩基配列からなる D N Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを 特徴とする E S細胞選択用プローブ。
(14) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配 列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特徴とす る上記 （13) 記載の ES細胞選択用プローブ。
(15) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の 塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列 力 らなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする ES細胞 選択用プローブ。
(16) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配 列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付カ卩された塩基配列からな り、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジェン トな条件下でハイプリダイズし得る DN Aを含むことを特徴とする上記 （15) 記 載の E S細胞選択用プローブ。
(17) ヒト ES細胞の選択用である、 上記 (11) 〜 （16) のいずれか一つに 記載の E S細胞選択用プローブ。
(18) 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DNAからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 17に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DN A
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコ一ドする D
N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A
(19) 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 18に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つ ES細胞特異的に発現する蛋白質
(20) 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DNAからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 29に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D
N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A (21) 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 30に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列からなり、 且つ E S細胞特異的に発現する蛋白質 (22) 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DNAからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 33に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコ ドする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D
NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A
(23) 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 34に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つ ES細胞特異的に発現する蛋白質
(24) 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DN Aからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 37に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A
(25) 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 38に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列からなり、 且つ E S細胞特異的に発現する蛋白質 ( 26 ) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21、 23または 41に記 載される塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 10、 14、 16、 1 8、 20、 '22、 24または 42に記載されるアミノ酸配^ fからなる蛋白質の細胞 内での発現状況を角?析することを特徴とする、 E S細胞のスクリ一ユング方法。 (27) 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載され る塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 10、 14、 16、 18、 2 0、 22または 24に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状 況を解析することを特徴とする、 上記 （26) 記載の ES細胞のスクリーニング方 法。
(28) さらに配列表配列番号 11に記載される塩基配列からなる DNA、 あるい は配列表配列番号 12に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現 状況を解析することを含む、 上記 （26) または （27) 記載の ES細胞のスクリ 一二ング方法。
(29) さらに配列表配列番号 25に記載される塩基配列からなる DNA、 あるい は配列表配列番号 26に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現 状況を解析することを含む、 上記 （26) 〜 （28) のいずれか一つに記載の ES 細胞のスクリーニング方法。
(30) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載さ れる塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 28、 30、 32、 34、 36、 38または 44に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現 状況を解析することを特徴とする、 ES細胞のスクリーニング方法。
(31) 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載される塩 基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 28、 30、 32、 34、 36ま たは 38に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析す ることを特徴とする、 上記 (30) 記載の E S細胞のスクリ一-ング方法。
(32) さらに配列表配列番号 39に記載される塩基配列からなる DNA、 あるい は配列表配列番号 40に記載されるァミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現 状況を解析することを含む、 上記 （30) または （31) 記載の ES細胞のスクリ 一ユング方法。
( 33 ) 配列表配列番号 9、 1 1、 13、 15、 17、 19、 21、 23または 4 1、 若しくは配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記 載の塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する 20塩基以上の部分配列か らなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する遺伝子に特異的な配列を有する DNAを 含むことを特徴とする ES細胞選択用プローブ。 '
(34) 上記 (1) 〜 （17) および （33) のいずれか一つに記載の E S細胞選 択用プローブを用いて、 E S細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析する ことを含む、 E S細胞のスクリーニング方法。
(35) さらに配列表配列番号 2または 1 1に記載の塩基配列からなる D N Aを含 む ES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、 上記 (34) 記載の ES細 胞のスクリーユング方法。
(36) さらに配列表配列番号 25に記載の塩基配列からなる D N Aを含む E S細 胞選択用プローブを用いることを特徴とする、 上記 (34) または （35) 記載の
E S細胞のスクリ一ユング方法。
(37) さらに配列表配列番号 27に記載の塩基配列からなる D N Aを含む E S細 胞選択用プローブを用いることを特徴とする、 上記 (34) 記載の ES細胞のスク リーニング方法。
( 38 ) さらに配列表配列番号 39に記載の塩基配列からなる D N Aを含む E S細 胞選択用プローブを用いることを特徴とする、 上記 （34) または （35) 記載の
E S細胞のスクリ一ユング方法。
さらに本宪明は、 E S細胞に特異的に発現する遺伝子あるいは E S細胞に特異的 に発現する蛋白質をコードする DNAを有する組換えベクター、 特に分化抑制遺伝 子強制発現用のベタター、 ならびに当該ベクターで形質転換された形質転換細胞に 関する。 さらに本発明は、 E S細胞に特異的に発現する遺伝子あるいは E S細胞に特異的 に発現する蛋白質をコードする DNAを含むゲノム D N A断片に薬剤耐性遺伝子等 の選択用遺伝子を組み込んだ組換えべクター、 特に E S細胞選択用べクター、 なら びに当該ベクターで形質転換された形質転換細胞に関する。
図面の簡単な説明
図 1は、 ES細胞と成体マウスの 12種類の臓器における各 EC AT遺伝子の発 現をノザンブロットにより解析した図である。
図 2は、 E S細胞、 間葉系幹細胞とヒト成人の 13種類の臓器における各 E C A
T遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した図である。
発明の詳細な説明
本発明は、 ES細胞に特異的に発現する遺伝子 （以下、 ES細胞特異的発現遺伝 子ともいう） 、 即ち EC AT遺伝子に関する。 EC AT遺伝子の発現の有無を指標 にして ES細胞であるかどうかを判断することが可能である。 本発明は、 このよう な E S細胞の当否を判断するのに好適な E S細胞選択用プローブを提供する。 この プローブとして、 具体的には配列表配列番号 1乃至 8のいずれかに記載される塩基 配列からなる DNA、 配列表配列番号 9に記載される塩基配列からなる DNA (以 下 E C A T 1遺伝子） 、 配列表配列番号 1 1に記載される塩基配列からなる D N A
(以下 ECAT2遺伝子） 、 配列表配列番号 13に記載される塩基配列からなる D
NA (以下 ECAT3遺伝子） 、 配列表配列番号 1 5に記載される塩基配列からな る DNA (以下 ECAT4遺伝子） 、 配列表配列番号 17に記載される塩基配列か らなる DNA (以下 EC AT 5遺伝子） 、 配列表配列番号 19に記載される塩基配 列からなる DNA (以下 ECAT6遺伝子） 、 配列表配列番号 21に記載される塩 基配列からなる DNA (以下 ECAT7遺伝子） 、 配列表配列番号 23に記載され る塩基配列からなる DNA (以下 ECAT8遺伝子） または配列表配列番号 41に 記載される塩基配列からなる DNA (以下 EC AT 9遺伝子） を含むポリヌクレオ チドが例示される。 さらに、 本発明においては、 E S細胞選択用プローブは ECA
T遺伝子の発現の有無を確認するという目的を達成し得るものであればいかなるも のでもよく、 上記の塩基配列に置換、 欠失または付加等の修飾を受けていてもよい。 具体的には E CAT遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダィズし且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aを含むポリヌクレオチド、 あ るいは ECAT遺伝子の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若し くは付加された塩基配列からなり且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコード する D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る D N Aを含むポリ ヌクレオチドも、 本発明において E S細胞選択用プローブとして好適に使用できる c 具体的には、 配列表配列番号 27に記載される塩基配列からなる D N A (以下 h E CAT 2遺伝子） 、 配列表配列番号 29に記載される塩基配列からなる DN A (以 下 h E CAT 3遺伝子） 、 配列表配列番号 31に記載される塩基配列からなる DN A (以下 h ECAT 4遺伝子） 、 配列表配列番号 33に記載される塩基配列からな る DNA (以下 hECAT5遺伝子） 、 配列表配列番号 35に記載される塩基配列 からなる DNA (以下 hECAT7遺伝子） 、 配列表配列番号 37に記載される塩 基配列からなる D N A (以下 h E C A T 8遺伝子） または配列表配列番号 43に記 載される塩基配列からなる DN A (以下 h EC AT 9遺伝子） を含むポリヌクレオ チドが例示される。
また、 配列表配列番号 25に記載される塩基配列からなる DNA、 すなわち Oc t一 3Z4をコードする DNA、 あるいは配列表配列番号 39に記載される塩基配 列からなる DNA、 すなわち hOc t— 3/4をコードする DNAを含むポリヌク レオチドも、 E S細胞選択用プローブとして使用することができる。 上述のように Oc t-3/4遺伝子は栄養外胚葉細胞でも発現しているという報告があるので、 好ましくは Oc t— 3/4遺伝子あるいは hO c t— 3/4遺伝子以外の ECAT 遺伝子を含むポリヌクレオチド等の、 本発明の新規 E S細胞選択用プローブを併用 することが好ましい。 また、 上記 EC AT遺伝子を含む新規 ES細胞選択用プロ一 ブであっても、 より正確に E S細胞であるかどうかを判断するためには数種類のプ 口ーブを併用することが好ましい。 本明細書中、 「ストリンジェントな条件」 とは、 塩基配列において約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 特に好ましくは約 90 %以上の相同性を有する D N Aが ハイプリダイズし得る条件をいい、 ストリンジエンシーはハイブリダイズ反応や洗 浄の際の温度、 塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる。 より 好適な条件は 95 %以上の相同性を有する DNAがハイブリダイズし得る条件であ る。
ECAT 2遺伝子は、 EC細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減少する遺， 伝子 pH34として報告され （D ferentiation 46:61- 67， 1991) 、 また理化学研 究所のデータベースによれば E SG (ES cell specific gene) 1として記載され ている。 また、 E CAT 3遺伝子は Fボックスを有するマウス蛋白質をコードする 遺伝子であり、 その発現が精巣と卵巣で認められているものとして報告されている (Current Biology 9： 1180-1182, 1999) 。 また、 E CAT 7遺伝子は DNAメチ ル化を行う DNMT 3に似た蛋白質 DNMT 3 として報告されている （Genomics 65:293-298， 2000) 。 ECAT 9遺伝子は、 GD F 3とよばれる增殖因子として、 マウスでは Jones CM et al. , Mol Endocrinol. 6： 1961-1968， 1992に、 ヒ トでは Caricasole et al. , Oncogene 16： 95-103， 1998に報告されている。 ES細胞特異 的発現の報告はない。 ECAT 4遺伝子、 ECAT 5遺伝子および EC AT 6遺伝 子に関しては、 文献上報告はないが蛋白質データベースの検索により、 ECAT 4 遺伝子がホメォボックスを有していること、 ECAT 5遺伝子が癌遺伝子 H— R a sに相同性を有していること、 ECAT 6遺伝子がケラチンに類似していることが 明らかとなった。 また、 ECAT 5遺伝子はその部分配列が知られてはいるものの c DNA配列そのものならびに当該 DNA配列がコードする蛋白質のアミノ酸配列 は未だ決定されていなかった。 従って、 本発明は ECAT 5遺伝子ならびに ECA T 5蛋白質、 およびそれらと極めて相同性の高い遺伝子ならびに同様の挙動を示す 蛋白質を提供する。
ここで 「極めて相同性の高い遺伝子」 とは、 具体的には ECAT 5遺伝子とスト リンジヱントな条件下でハイプリダイズする遺伝子を意味し、 この要件を満たせば ECAT5遺伝子の塩基配列 （配列表配列番号 17 ) において 1若しくは数個の塩 基が欠失、 置換若しくは付加されていてもよい。 具体的には ECAT5遺伝子と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 特に好まし くは 95%以上の相同性を有する遺伝子である。 また、 「同様の挙動を示す蛋白 質」 とは、 ES細胞に特異的に発現するという E CAT 5蛋白質の特徴を有する蛋 白質を意味し、 その要件を満たせば ECAT 5蛋白質のアミノ酸配列 （配列表配列 番号 18) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されてい てもよい。
さらに、 本発明の ES細胞選択用プローブには、 各種 E CAT遺伝子、 hECA T遺伝子の配列を基に構築される、 配列表配列番号 9、 1 1、 13、 15、 1 7、 19、 21、 23または 41、 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 3 7または 43に記載の塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する 20塩基 以上の部分配列からなる DNA断片が包含される。 該 DNA断片は、 EC AT遺伝 子あるいは hECAT遺伝子とハイプリダイズし得るものであれば特に限定されな いが、 具体的には、 各配列表配列番号の塩基配列中、 少なくとも検出を目的とする 各種の E C A T遺伝子あるいは hECA T遺伝子に特異的な配列を含み、 繰り返し 配列のみで構成されることのない、 通常約 20塩基以上、 好ましくは約 100塩基 以上、 より好ましくは約 200塩基以上の連続した部分配列を有する DN A断片で ある。 これらの好適な例としては、 配列表配列番号 1乃至 8に記載のひ N A断片が 挙げられる。
上述した 9種のマウス E CAT遺伝子のうち E CAT 2遺伝子、 E CAT 3遺伝 子、 E CAT 4遺伝子、 EC AT 5遺伝子、 ECAT 7遺伝子、 ECAT 8遺伝子 および EC AT 9遺伝子の 7種について対応するヒト ECAT遺伝子が存在するこ とがわかった （後述：それぞれ hECAT 2遺伝子、 hECAT 3遺伝子、 hEC AT 4遺伝子、 hECAT 5遺伝子、 h ECAT 7·遺伝子、 hECAT 8遺伝子、 および hEC AT 9遺伝子） 。 そのうち、 hECAT 3、 11£〇 丁 5ぉょび11£
CAT 8の遺伝子についてはその塩基配列ならびに当該塩基配列がコードする蛋白 質のアミノ酸配列については未だ決定されていなかった。 従って、 本発明は h EC AT 3、 hE CAT 5および h EC AT 8の遺伝子ならびに蛋白質、 およびそれら と極めて相同性の高い遺伝子ならびに同様の挙動を示す蛋白質を提供する。
ここで 「極めて相同性の高い遺伝子」 および 「同様の挙動を示す蛋白質」 とは、 具体的には h EC AT 3、 hE CAT 5または hE CAT 8の遺伝子とストリンジ ェントな条件下でハイプリダイズする遺伝子を意味し、 この要件を満たせば h E C AT 3, hECAT5または hECAT8の遺伝子の塩基配列 （それぞれ配列表配 列番号 29、 配列表配列番号 33、 配列表配列番号 37) において 1若しくは数個 の塩基が欠失、 置換若しくは付カ卩されていてもよい。 具体的にはそれらの遺伝子と 約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 特に好ま しくは 95 %以上の相同性を有する遺伝子である。 また、 「同様の挙動を示す蛋白 質」 とは、 hECAT3蛋白質、 hECAT5蛋白質または hECAT8蛋白質の 特徴を有する蛋白質を意味し、 その要件を満たせば h EC AT 3蛋白質、 hECA T5蛋白質または hECAT8蛋白質のァミノ酸配列 （それぞれ配列表配列番号 3 0、 配列表配列番号 34、 配列表配列番号 38) において 1若しくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されていてもよい。
本発明のプローブは、 当分野で公知の手法により調製することができる。 例えば、 本プローブは、 対応する EC AT遺伝子の E STを制限酵素で切断し単離した DN A、 ゲノム DNAや E S細胞由来の mRNAから調製される相補 DNA (c DN A) を铸型として PCR法により増幅させて得られる DNA、 さらに化学的に合成 される DNA、 およびこれらの方法を適当に組み合わせて構築される DNAとして 調製することができる。
本発明は、 E S細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析することを特徴 とする ES細胞のスクリーニング方法を提供する。 ここで、 「ES細胞に特異的に 発現する遺伝子」 は、 上述の EC AT遺伝子あるいは h EC AT遺伝子と同義であ り、 具体的には EC AT 1遺伝子、 E CAT 2遺伝子、 E CAT 3遺伝子、 ECA
T4遺伝子、 E CAT 5遺伝子、 E CAT 6遺伝子、 EC AT 7遺伝子、 ECAT 8遺伝子、 EC AT 9遺伝子、 hE CAT 2遺伝子、 hECAT 3遺伝子、 hEC AT 4遺伝子、 hE CAT 5遺伝子、 hE CAT 7遺伝子、 hE CAT 8遺伝子お よび hECAT 9遺伝子、 ならびに Oc t— 3/4遺伝子おょぴ hO c t - 3/4 遺伝子等が挙げられる。
本発明において E S細胞のスクリ一ユングは、 E S細胞特異的発現遺伝子あるい はそれらがコードする E S細胞特異的発現蛋白質の発現状況を解析することにより 実施される。 遺伝子レベルで発現状況を解析するには、 上述の ES細胞選択用プロ ーブを用いることができる。 また、 上述のように Oc t— 3Z4をコードする DN Aを含むポリヌクレオチドからなるプローブも併用することが好ましい。 このよう なプローブは蛍光物質、 酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。 ま た、 蛋白質レベルで発現状況を解析するには、 上記 ES細胞特異的発現蛋白質に特 異的な親和 1生を有する物質、 例えば抗体を用いて、 細胞内での当該蛋白質の発現を 知ることができる。 より具体的には、 ィムノブロットや免疫沈降法等、 当分野で通 常実施される抗原抗体反応を利用した方法が用いられる。 ここで該抗体は、 当該蛋 白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、 ポリクローナル抗体、 モ ノクローナノレ抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。 これらの抗 体またはその断片は、 蛍光物質、 酵素やラジオアイソトープ等で標識されていても よい。
さらに、 これらは市販されているものを用いても良く、 また常法に従って適宜調 製することができる。
本発明はまた、 上記レ、ずれかの E S細胞特異的発現遺伝子あるいは E S細胞特異 的発現蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターに関する。 ここで、 ES細胞 特異的発現遺伝子とは上述のとおりであり、 また E S細胞特異的発現蛋白質をコ一 ドする遺伝子とは具体的には ECAT 1 (配列表配列番号 10) をコードする遺伝 子、 ECAT2 (配列表配列番号 12 ) または hECAT 2 (配列表配列番号 2
8) をコードする遺伝子、 EC AT 3 (配列表配列番号 14) または hEC AT 3
(配列表配列番号 30) をコードする遺伝子、 ECAT4 (配列表配列番号 16) または hECAT4 (配列表配列番号 32) をコードする遺伝子、 E C A T 5 (配 列表配列番号 18) または h EC AT 5 (配列表配列番号 34) をコードする遺伝 子、 ECAT6 (配列表配列番号 20) をコードする遺伝子、 ECAT7 (配列表 配列番号 22) または hECAT7 (配列表配列番号 36) をコードする遺伝子、 ' ECAT8 (配列表配列番号 24) または hECAT8 (配列表配列番号 38 ) を コードする遺伝子および E CAT 9 (配列表配列番号 42) または h E CAT 9
(配列表配列番号 44) をコードする遺伝子が挙げられる。 かかる発現ベクターは、 中に含められる遺伝子の性質上、 当該ベクターが細胞内、 特に ES細胞内で発現す ' ることにより分化を抑制する機能を有することが好ましい。 即ち分化抑制遺伝子を 強制発現するベクターである （以下、 分化抑制遺伝子強制発現用ベクターともい う） 。 本発明の発現ベクターは、 各種動物細胞内で複製保持または自律増殖でき、
• 且つ E S細胞特異的発現遺伝子を発現しうるものであれば特に限定されず、 ウィル スベクターやプラスミドベクター等が包含される。 当該発現ベクターは、 通常の遺 伝子工学的手法に基づき、 例えば Molecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い作製することができる。 好まし くはウィルスベクターであり、 例えばレトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随 伴ウィルス、 へノレぺスウィルス、 ワクシニアウイ/レス、 ボックスゥイノレス、 ポリオ ゥイノレス、 シルビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスに E S細胞特 異的発現遺伝子等を組み込んで作製する。 また、 必要に応じて、 所望のプロモータ —領域や薬剤耐性遺伝子領域、 発現調節領域を導入することも可能である。
本発明の発現ベクターの細胞内への導入は、 トランスフエクシヨン、 リボフエタ . シヨン、 マイクロインジェクション、 衝撃ミサイノレ、 エレクト口ポレーシヨン法等 従来公知の方法によって行われる。
作製された本発明の発現べクタ一が宿主細胞に組み込まれて発現しているか否か は、 例えば導入された EC AT遺伝子が発現して産生する蛋白質 （ポリペプチド）. の量を、 例えば EL I S A法等で測定することによって確認す'ることができる。 さらに EC AT遺伝子は ES細胞であるかどうかを決定するためのプローブとし ての利用に加え、 E S細胞と他種類の細胞の混合物から E S細胞を選択的に分離す ることにも利用できる。 本発明者らは、 各 EC AT遺伝子の蛋白質翻訳領域に薬剤 選択遺伝子をノックインするためのターゲッティングベクターを作成し、 当該べク ターを用いて相同組換えをおこした ES細胞を樹立した。 具体的には、 特表平 9_ 500004号公報 （対応米国特許第 6146888号公報） に記載の手法に準じ て行った。 例えば E CAT 3遺伝子、 E CAT 4遺伝子または E CAT 5遺伝子に ネオマイシン耐性遺伝子をノックインした細胞を G 418存在下に培養すると、 選 択された細胞に分化細胞は全く認められなかった。 力、かる結果は E CAT遺伝子が E S細胞の選択的分離に利用できることを示唆するものである。 より確実に ES細 胞のみを選択するためには、 異なる EC AT遺伝子を組み込んだ複数種のベクター を用いて相同組換えを行うことが好ましい。
実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例によ り何ら限定されるものではない。
実施例 1 マウス EC AT遺伝子の同定
(1) コンピューター解析による候補遺伝子の同定
(手順）
EC ATの候補遺伝子を同定するために E STデータベースを利用した。 EST は各種細胞や臓器由来の cDNAライプラリーから多数の cDNAクローンを無作 為に抽出し、 その 5' または 3' 断端部の配列を 1反応だけ解析し、 公共データべ ースに登録したものである。 ESTは各細胞、 臓器で発現している遺伝子のカタ口 グであるといえる。 マウス由来のもので 100万クローン以上、 マウス ES細胞由 来のものだけでも 3万クローン以上が登録されている。
E S Tデータベースとしでは U n i g e n eを使用した。 U n i g e n eは E S
Tの中で同じ遺伝子に由来すると考えられるものをクラスタリングしたものであり
2001年 3月 5曰現在、 マウス E STデータベースにおいては 79917セット が報告されている。 各セットは少なくとも 1つの E S Tもしくは既知遺伝子からな る。
解析の手法としては、 Digital differential display法を使用した。 この方法は、 指定した細胞や臓器のライブラリーにおける各セットの存在頻度、 すなわち各セッ トに含まれる E S Tクローン数をそのライブラリー由来の全 E S T登録数で割った ものを算出し、 異なる細胞や臓器間での発現頻度を調べる方法である。
Digital differential display法により次に示す 5つの細胞や臓器由来のライブ ラリ一群における遺伝子発現頻度解析を行った。 各群の括弧内の数字は解析したク ローン数を示している。 1群から 5群までは該当するライブラリーをすベて解析し た。 6群はデーター数が膨大であるため、 全身の臓器、 細胞を可及的に含むように 抽出した 2 3ライブラリーを解析した。
1群 1細胞期よりブラストシストまでの受精卵 （4 9 0 5 0クローン）
2群 E S細胞または Embryonic carcinoma細胞 （3 2 2 7 7クローン）
3群 受精後 8 . 5日までの胎児 （4 6 7 2 8クローン）
4群 受精後 9日以降の胎児 （1 2 8 8 8 2クローン）
5群 精巣 （6 5 6 8 5クローン）
6群 その他の細胞、 組織 （2 7 2 4 6 0クローン）
Digital differential display法により受精卵と E S細胞等の全能性細胞で特異 的に発現するごとが予想されたセットについては、 マウス由来の E S Tデータべ一 スを B 1 a s t Nにて検索し、 全能性細胞由来のライブラリーでのみ E S ΤΓが存在 するかどうかを検討した。
使用したデータベースおよび角罕析プログラムの U R Lは以下の通りである。
Unigene Mouse Sequence Collection
nttp： //www. ncbi. nlm. nin. gov/UniGene/Mm. Home, html
Digital differential display
http://w w. ncbi. nlm. nih. gov/UniGene/ddd. cgi?0RG=Mm
Blast search http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/
(結果）
Digital differential display法による解析と B 1 a s tNによる ESTデータ ベース検索の結果の候補として 10個の遺伝子を同定した。 これらの遺伝子の ES Tは受精卵と ES細胞において高頻度に存在するが、 第 6群のその他の細胞や組織 では認められない。 胎児や精巣由来のライブラリーに ESTが含まれる遺伝子も存 在したが、 これは分化全能性細胞である始原生殖細胞や精母細胞に由来する可能性 が高いので、 EC AT遺伝子の候補に含めた。 一方 Oc t— 3/4遺伝子は受精卵 •と E S細胞で高頻度に存在するが、 その他の細胞や )3蔵器でも少数であるが含まれて いた。 候補のうち 8遺伝子について、 マウス由来の E STデータベースを B 1 a s tNにて検索した結果を表 1に示す （ECAT1〜8) 。
同様にして残る 2つの遺伝子のうち、 1つの遺伝子 （EC AT 9) についても解 析をすすめた。 結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000021_0001
(2) '口ッ卜解析
(手順) コンピューター解析により同定された候補遺伝子について、 実際に E S細胞特異 的に発現しているかどうかをノザンブロットにより解析した。 未分化 ES細胞およ びレチノィン酸で 5日間分化誘導した E S細胞よりライフテックオリェンタル社の T r i z o 1を用いて全 RNAを抽出した。 成体マウスの各種臓器由来の RN Aは サヮデ一テクノロジーより購入した。 全 RNA (5 μ g) をホルマリンァガロース ゲルにより分離後、 ナイロンメンプランにトランスファーし、 UVクロスリンクに より固定した。 目的遺伝子の ESTが購入可能な場合は同 DNAをプローブとして 用いた。 ESTが入手不可能な場合は、 PCRにて各 ECATに特異的なDNA断 片を增幅し、 プローブとして用いた。 具体的には以下の.プローブを用いて O c t - 3/4、 ECAT 1、 ECAT2、 ECAT3、 ECAT4、' ECAT5、 ECA T6、 ECAT 7および ECAT 8の発現を調べた。 さらに E CAT 9の発現につ いても調べた。
O c t _ 3/4 ：プラスミ ド C 1 in BS KS (Cell 60 :461-472, 1990) を E c o R Iで切り出して調製した配列表配列番号 25に記載の配列を含む DNA断片。 ECAT 1 ： Mm. 31054EST (#AI 467128) を S a l I /N o t Iで切り出して調製した配列表配列番号 1に記載の配列を含む D N A断片。
ECAT2 ： pH34EST (#AA 473366) を S a l I /No t Iで切り 出して調製した配列表配列番号 2に記載の配列を含む DNA断片。.
ECAT 3 ： FBX15EST (#AA571680) を S a l I /N o t Iで切 り出して調製した配列表配列番号 3に記載の配列を含む D N A断片。
ECAT 4 ：ホメォボックスコーディング領域をゲートウェイ用に PC Rで増幅し TAクローユングしたプラスミドから Ec oR Iで切り出して調製した配列表配列 番号 4に記載の配列を含む DN A断片。
ECAT 5 ： E-R a s S 1 18 /RACE 1 1で R T— P C Rしたものを TAク ローニングしたプラスミドから E c oR Iで切り出して調製した配列表配列番号 5 に記載の配列を含む D N A断片。 ECAT6 ：ケラチン一E PC R産物 （48927 SZ48927AS) である配 列表配列番号 6に記載の配列を含む DNA断片。
ECAT7 ： DNMT 3 LE STクローン （AA 895770, p B S SK- d n mt 31) から E c oR I/Xh o Iで切り出して調製した配列表配列番号 7に記 載の配列を含む DN A断片。
ECAT 8 ： Mm. 77010 R AC E産物を T Aクローユングしたプラスミドか ら E c o R Iで切り出して調製した配列表配列番号 8に記載の配列を含む D N A断 片。
EC AT 9 ： GDF 3 (Jones CM. et al. , 上述）を参考にして調製された配列表配 列番号 41に記載の配列を含む DN Α断片。 .
プローブの32 P— d CTPによる標識は、 アマシャムフアルマシア社のメガラべ リングキットを用いて行った。 ハイブリダィゼーションはフナコシ社の Qu i c k h y bを用いて行った。 洗浄後のシグナノレ解析は富士フィルム社の B AS 5000 を用いて行った。
(結果）
コンピューター検索にて同定された 10遺伝子のうち、 これまでに 9遺伝子に関 してノザンプロットを行い、 ES細胞おょぴ 12種類の臓器における発現を解析し た。 即ち ES細胞と成体マウスの 12種類の臓器における各 EC AT遺伝子の発現 をノザンブロットにより解析した結果を図 1に示す。
9遺伝子に関する全ての発現が E S細胞に特異的であることがわかった。 精巣で も若干の発現が認められるものもあるが、 精母細胞に由来すると考えられた。 また これらの遺伝子の発現は E S細胞をレチノイン酸で刺激誘導するとすみやかに消失 することがわかった。 これらの結果から 9遺伝子は EC AT遺伝子であると考えら れた。
(3) EC AT遺伝子の解析
ECAT遺伝子が未知遺伝子である場合全長 cDNAの同定はライフテックオリ ェンタノレ社の 5' RACEシステム、 バージョン 2を使った RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法を用いて行った。 理研マウス完全長 c DNAデー タベースの検索は UR L (http: //genome, gsc. riken. go. jp/) において行った。 実施例 2 取得 E C A T遺伝子の公知状況解析
( 1 ) B l a s t検索
ノザンブロットの結果 E C A T遺伝子であることが確認された 8遺伝子の EST 配列を B 1 a s tで検索した結果、 3遺伝子に関しては既に配列が論文として報告 されていた。 EC AT 2遺伝子は EC細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減 少する遺伝子 ρΗ 34として報告されていた。 E CAT 4遺伝子は Fボックスを有 するマウス蛋白質で、 発現が精巣と卵巣でのみ認められるものとじて報告されてい た。 ECAT 7遺伝子は DNAメチル化を行う DNMT 3に似た蛋白質 DNMT 3 Lとして報告されていた。 RACE法により cDNA全長の同定を試みた結果、 E CAT 4遺伝子、 E CAT 5遺伝子、 E CAT 6遺伝子について翻訳領域を同定し た。 予想されるアミノ酸配列を B 1 a s t Pで検索した結果、 E CAT 4遺伝子は ホメォボックスを有していること、 E CAT 5遺伝子は癌遺伝子 H— R a sに相同 性を有していること、 E CAT 6遺伝子はケラチンに類似していることがわかった, また、 あらたに ECAT遺伝子であることが確認された ECAT 9遺伝子は GDF- 3とよばれる増殖因子であることがわかった。
(2) 理研マウス cDNAデータベースの検索
2001年 2月に理研より公開されたマウス全長 cDNAデータベースを検索し た結果、 ECAT 5遺伝子を除く 8遺伝子は cDN Aの全長が公開されていた。 E
CAT 5遺伝子はデータベースに含まれていなかった。 また EC AT 2遺伝子は理 研のデータベースにおいて ES cell specific gene (ESG) 1として記載されてい るが、 他の 8遺伝子に関しては ES細胞での発現に関する情報は無かった。
実施例 3 ヒト ECAT遺伝子の同定
(1) ヒ トゲノム DNAおよびヒ ト蛋白質データベースの B 1 a s t検索
B i a s t検索した結果、 ECAT2〜5、 7、 8遺伝子においてはアミノ酸配 列が 50 %以上一致するオルソログが存在することがわかった。 また、 E C A T 9 遺伝子についても hGDF 3 (Caricasole et al. , 上述） として hECAT9遺 伝子が存在する。 EC AT 1遺伝子と EC AT 6遺伝子に関してはヒトのオルソロ グは同定できなかった。
B 1 a s t P検索の結果、 hE CAT 3遺伝子、 hE CAT 5遺伝子、 hECA T 8遺伝子の 3遺伝子については hypothetical proteinを含め塩基配列およびァ ミノ酸配列ともに公開されていなかつた。
実施例 4 ヒト相同遺伝子の発現確認
霊長類における E CAT遺伝子の E S細胞特異的な発現を確認した。
.ヒト成人の 13種類の臓器に由来する各全 RN A (サヮデーテクノロジーあるい はフナコシより購入） 、 ヒト間葉系幹細胞 （タカラより購入） 由来の全 RNA、 お よびサル ES細胞 （未分化ならびにレチノイン酸により分化誘導されたもの、 京都 大学再生医学研究所の中辻教授提供） 由来の全 RNAをノザンブロット法により解 析した。 hECAT2， 4， 7, 8, 9および h O c t 3/4に相当する E S Tク ローンの全長 c DNAをプローブとして用いた。 ハイブリダイゼーシヨンは上記実 施例 1のマウス EC ATの解析と同様の手法で行ったが、 ヒトプローブでサル RN Aを検出できるよう、 反応や洗浄温度は低く （50°C) 設定した。 その結果、 すべ ての遺伝子について未分化 E S細胞において強いシグナルを認めた （図 2) 。 ES 細胞の分化にともない、 シグナルは著しく減弱した。 その他の ϋ器 （細胞） におい てスメァ状の薄いシグナルが認められたが、 これは反応および洗浄温度を下げたこ とにより生じた非特異的なものであると考えられる。 以上の結果から、 EC AT遺 伝子はマウスだけではなく霊長類の E S細胞においても選択的に発現しており、 そ のマーカー遺伝子として利用できることが確認、された。
産業上の利用分野
本発明により、 マウス ES細胞において特異的に発現している ECAT遺伝子を 9種新たに提供し得る。 さらにこれらのうち 7種の対応するヒト ECAT遺伝子が 提供される。 更に、 これらの EC AT遺伝子あるいはその断片を組み合わせること により、 ES細胞の選択的細胞マーカーの取得が可能となる。 さらには、 薬剤耐性 遺伝子との組み合わせによる E S細胞の選択方法、 体細胞からの E S細胞様細胞へ の誘導の試み等において、 Oc t _ 3/4遺伝子あるいはその断片を単独で用いる 場合よりも効果的であり、 再生医療等の現場で有用であると考えられる。 本出願は、 日本で出願された特願 2001— 165927を基礎としておりそれ らの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1. 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列からなる D N Aのいずれか一つを含むことを特徴とする E S細胞選択用プローブ。
2. 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列からなる D NAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 且つ E S細 胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aを含むことを特徴とする E S細胞 選択用プローブ。
3. 配列表配列番号 1、 3、 4、 5、 6、 7または 8に記載の塩基配列において 1 若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 且つ E S 細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする ES細胞選択用プローブ。
4. 配列表配列番号 9、 13、 15、 1 7、 1 9、 21、 23または 41に記載の 塩基配列からなる DNAの！/、ずれか一つを含むことを特徴とする E S細胞選択用プ ローブ。
5. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載の塩基配 列からなる D N Aのいずれか一つを含むことを特徴とする請求の範囲 4記載の E S 細胞選択用プローブ。
6. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21、 23または 41に記載の 塩基配列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DN Aを含むことを 特徴とする E S細胞選択用プローブ。
7. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載の塩基配 列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特徴とす る請求の範囲 6記載の ES細胞選択用プローブ。
8. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21、 23または 41に記載の 塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列 からなり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする E S細胞 選択用プローブ。
9. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 1 9、 21または 23に記載の塩基配 列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からな り、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする請求の範囲 8記 載の E S細胞選択用プローブ。
10. マウス ES細胞の選択用である、 請求の範囲 1〜 9のいずれか 1項に記載の ES細胞選択用プローブ。
1 1. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の塩 基配列からなる D N Aの 、ずれか一つを含むことを特徴とする E S細胞選択用プ口 ーブ。
12. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配列 からなる DN Aのいずれか一つを含むことを特徴とする請求の範囲 11記載の E S 細胞選択用プローブ。
13. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の塩 基酉己列からなる DN Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特 徴とする E S細胞選択用プローブ。
14. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配列 からなる D N Aのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAを含むことを特徴とす る請求の範囲 13記載の E S細胞選択用プローブ。
15. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の塩 基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列か らなり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする ES細胞選 択用プロープ。
16. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載の塩基配列 において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNAとストリンジヱントな 条件下でハイプリダイズし得る D N Aを含むことを特徴とする請求の範囲 15記載 の E S細胞選択用プローブ。
17. ヒト E S細胞の選択用である、 特許請求の範囲 1 1〜； L 6のいずれか 1項に 記載の E S細胞選択用プローブ。
18. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DN Aからなる遺伝子。
(a) 配列表配列番号 17に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A
19. 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 18に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つ ES細胞特異的に発現する蛋白質
20. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DNAからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 29に記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る DNA
21. 以下の （a) または （b) の蛋白質。
( a ) 配列表配列番号 30に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つ E S細胞特異的に発現する蛋白質
22. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DN Aからなる遺伝子。
(a) 配列表配列番号 33に記載の塩基配列からなる DN A
(b) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダ ィズし、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N A
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る DNA
23. 以下の （a) または （b) の蛋白質。
( a ) 配列表配列番号 34に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質
(b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列からなり、 且つ E S細胞特異的に発現する蛋白質
24. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの DNAからなる遺伝子。
( a ) 配列表配列番号 37に記載の塩基配列からなる D N A
( b ) (a) の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダ ィズし、 且つ ES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする DNA
(c) (a) の塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 且つ E S細胞に特異的に発現する蛋白質をコードする D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る D N A
25. 以下の （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 38に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a) のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列からなり、 且つ E S細胞特異的に発現する蛋白質
26. 配列表配列番号 9、 13、 15、 1 7、 1 9、 21、 23または 41に記載 される塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 10、 14、 16、 18、 20、 22、 24または 42に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内で の発現状況を解析することを特徴とする、 E S細胞のスクリ一二ング方法。
27. 配列表配列番号 9、 13、 15、 17、 19、 21または 23に記載される 塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 10、 14、 16、 18、 20、 22または 24に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を 解析することを特徴とする、 請求の範囲 26記載の E S細胞のスクリーェング方法。
28. さらに配列表配列番号 1 1に記載される塩基配列からなる DNA、 あるいは 配列表配列番号 12に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状 況を解析することを含む、 請求の範囲 26または 27記載の ES細胞のスクリー- ング方法。
29. さらに配列表配列番号 25に記載される塩基配列からなる DNA、 あるいは 配列表配列番号 26に記載されるァミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状 況を解析することを含む、 請求の範囲 26〜 28のいずれか 1項に記載の E S細胞 のスクリーニング方法。
30. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載され る塩基配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 28、 30、 32、 34、 3
6、 38または 44に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状 況を解析することを特徴とする、 ES細胞のスクリーニング方法。
31. 配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35または 37に記載される塩基 配列からなる DNA、 あるいは配列表配列番号 28、 30、 32、 34、 36また は 38に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析する ことを特徴とする、 請求の範囲 30記載の E S細胞のスクリ一エング方法。
32. さらに配列表配列番号 39に記載される塩基配列からなる DNA、 あるいは 配列表配列番号 40に記載されるァミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状 況を解析することを含む、 請求の範囲 30または 31記載の ES細胞のスクリー二 ング方法。
33. 配列表配列番号 9、 1 1、 13、 1 5、 17、 19、 21、 23または 41 もしくは配列表配列番号 27、 29、 31、 33、 35、 37または 43に記載の 塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する 20塩基以上の部分配列からな り、 且つ E S細胞に特異的に発現する遺伝子に特異的な配列を有する DN Aを含む ことを特徴とする E S細胞選択用プローブ。
34. 請求の範囲 1〜17および 33のいずれか 1項に記載の E S細胞選択用プロ ープを用いて、 E S細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析することを含 む、 ES細胞のスクリーェング方法。
35. さらに配列表配列番号 2または 1 1に記載の塩基配列からなる D N Aを含む ES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、 請求の範囲 34記載の ES細 胞のスクリーユング方法。
3 6 . さらに配列表配列番号 2 5に記載の塩基配列からなる D N Aを含む E S細胞 選択用プローブを用いることを特徴とする、 請求の範囲 3 4または 3 5記載の E S 細胞のスクリ一二ング方法。
3 7 . さらに配列表配列番号 2 7に記載の塩基配列からなる D N Aを含む E S細胞 選択用プローブを用いることを特徴とする、 請求の範囲 3 4記載の E S細胞のスク リーユング方法。
3 8 . さらに配列表配列番号 3 9に記載の塩基配列からなる D NAを含む E S細胞 選択用プローブを用いることを特徴とする、 請求の範囲 3 4または 3 5記載の E S 細胞のスクリ一エング方法。
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