KR20200111168A - 암 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명자는 배아 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 신규한 치료학적 전략을 제공한다. 따라서, 본 발명은
조합 제제로서, i) 암 관련된 태아 신생-항원을 지니는 유래되고 가공된 태아 줄기 세포의 집단, 및 ii) 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물의 치료학적 유효량을 암을 앓고 있는 대상체에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 방법 및 조성물

발명의 분야

본 발명은 종양학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 본 발명은 항암 백신 조합 치료요법(combined therapy)에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 암 세포 백신을 제조하는데 유용한 다수의 신생-항원(neo-antigen)을 나타내는(presenting) 태아 줄기 세포를 포함하는 조성물을 생산하는 방법 및 이의 용도에관한 것이다.

발명의 배경

암 줄기 세포(CSC)는 통상의 치료에 대해 내성인 경향이 있으므로 종양 지속성 및 재발에 대해 반응성인 자가-재생 암 세포의 소수 집단을 나타낸다. 이러한 CSC는 유방, 결장 두경부 암종을 포함하는 다양한 기원으로부터의 고형 종양에서 최근에 입증되었으며 새로운 치료학적 표적을 나타낸다. 이러한 CSC는 사람 배아 줄기 세포(hESC) 또는 사람 유도된 다능성 줄기 세포(human Induced Pluripotent Stem Cell: hiPSC)를 사용한 발현을 공유하는 다수의 배아 항원을 발현함이 밝혀졌다. 일부 이러한 배아 항원의 발현은 또한 종양형성 및/또는 종양 진행과 관련된 분화된 암 세포에서 발견되었다. 더욱이, 암은 또한 다능성 세포 내에서 발현되지 않는 태아 항원을 발현한다.

최근 10년 동안, 암 치료 접근법은 표적화된 치료요법으로부터 면역 개입 전략까지 생존 뿐만 아니라 암 관련된 이환율 및 치사율에 있어서 전례없는 획득으로 진행되어 왔다. 그러나, 면역 체크포인트 억제제의 입증된 효능 및 임상적 이익에도 불구하고, 다수의 부분적인 반응자 및 종양-특이적인 면역 반응 및 암-세포-자율적인 단서에 영향을 미치는 면역-조절 인자에 의해 유발된 주요 내성 종양("선천성 내성")이 존재한다. PD-1/PD-L1 차단에 대한 초기 반응 후, 후천성 내성은 진행 및 재발 시 많은 수의 암에서 발생한다. PD1/PDL-1 차단에 대한 후천성 내성의 근본적인 메카니즘은 후천성의 체세포 돌연변이(뮤타놈(mutanome))를 사용한 신생항원 전망(neoantigen landscape)의 발전, 고갈된 T 세포의 후생적 안전성을 지닌 발전된 종양 면역 미세-환경(tumor immune micro-environment: TIME)에 의해 유발된다.

암 배선 항원(cancer germline antigen)은 배아 및 태아 발달 동안 발현되는 단백질을 나타내며 이러한 후생적으로 제어된 항원은 많은 암 중 다양한 비율에서 재-발현될 수 있다. 지금까지 수개의 사람 암 백신 시험을 마련하여 암배아 항원(CEA), 알파 페토단백질 또는 암/고환 항원(NY-ESO-1)과 같은 배아 항원을 표적화시켰다. 자가조직 림프구를 사용한 입양 세포 전달은 유전적으로 가공되어 암 배선 항원 NY-ESO-1의 HLA*0201 에피토프(epitope)에 대한 T 세포 항원 수용체(TCR)을 발현하며, 전이성 흑색종을 지닌 일부 환자에서 영속성있는 종양 회귀를 야기한다. 불행하게도, 하나의 항원만을 표적화하는 것은, 탈출 돌연변이체(escape mutant) 및 신생 체세포 신생-항원의 신속한 출현 및 1가 암 백신의 일반적인 비효율로 인하여, 종양 거부를 매개하기 위한 강력한 항종양 면역 반응을 생성하기에 충분히 효율적이지 않은 것으로 밝혀졌다.

재생 의약에서 줄기 세포의 잠재능에 있어서의 최근의 관심은 광범위하게 이용가능한 잘-정의된 분화되지 않은 ESC 세포주 뿐만 아니라 ESC와 표현형적으로 및 기능적으로 유사한 분화되지 않은 iPSC에 있어왔다.

암이 지닌 줄기능 특징(cancer harboring stemness signature)은 고유의 경로에 대해 부차적인 크로마틴 전망의 깊은 변화를 지닌 게놈 가소성(genomic plasticity) 및 강력한 면역억제성 종양 미세-환경으로부터의 유도 인자를 나타낸다. 미성숙 선조세포(immature progenitor)로 탈-분화하는 이들의 능력은 CMH 제I 부류의 하향-조절 및 공-억제 분자 발현의 상향-조절과 함께 태아 발달로부터 유전자의 재-발현을 종양 클론에 부여한다.

따라서, 줄기 세포 특징을 갖는 암을 예방하고/하거나 치료하기 위한 새로운 접근법에 대한 요구가 지속되고 있다. 줄기 세포 돌연변이체 신생-에피토프에 대한 예방접종은 입양 전달된 T 세포 및 면역학적 체크포인트 차단을 통해 활성화된 세포의 면역 반응을 강화하는데 사용될 수 있었다.

이러한 및 다른 요구는 본원에 현재 개시된 주제에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 집중된다.

발명의 요약

본 발명은 치료학적 양의 (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물을 상기 대상체에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 면역원성 성분은 불활성화된 태아 세포의 집단이며, 이러한 태아 세포는 유리하게는 치료될 암보다는 동일한 세포 분화 계통으로 존재한다. 본 발명은 특히 청구범위에 의해 정의된다.

일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 암의 치료 시 사용하기 위한, (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 불활성화된 태아 세포의 집단을 함유하는 백산 조성물의 조합에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 백신은 불활성화된 태아 세포의 집단으로 이루어진다. 특히, 집단의 세포는 대상체의 암 세포에 의해 또한 발현된 하나 이상의 목적한 항원(들)을 발현한다. 구체적인 구현예에서, 불활성화된 태아 세포의 집단은 오가노이드(organoid)이거나 오가노이드로부터 유래된다(즉, 오가노이드의 3D 구조를 파괴함으로써 수득된다).

태아 줄기 세포가 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된 것이 바람직하다:

a. 환자의 특정 암에 관한 경로를 향한 다능성 세포의 집단의 분화단계,

b. 이렇게 분화된 세포의 확장 단계,

c. 임의로 확장 동안 돌연변이 유인제(mutagenic agent)를 노출시켜, 상기 집단의 세포 내에서 유전자의 돌연변이유발을 유도시키는 단계,

d. 집단의 세포의 적어도 70%가 태아 마커(fetal marker)를 발현함을 입증하는 단계,

e. 임의로 집단의 세포가 대상체의 암 세포 내에 존재하는 적어도 하나의 종양 관련 항원(TAA) 또는 신생-항원을 발현함을 입증하는 단계,

f. 세포를 불활성화시켜, 세포가 분열하는 이의 능력을 상실하도록 하는 단계.

돌연변이유발을 수행하는 경우, 돌연변이 유인제가 화학적 돌연변이 유인제 및 방사선 돌연변이 유인제(X-선, UV 방사선)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경우가 바람직하다. 특히, 돌연변이 유인제는 ENU, 반응성 산소종, 탈아민화제, 폴리사이클릭 방향족 탄화수소, 방향족 아민 및 나트륨 아지드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 발프로산(VPA), 보리노스타트, 파노비노스타트, 기비노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 모세티노스타트, 프락티노스타트, 키다미드, 퀴시노스타트 및 아벡시노스타트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 iPS-유래된 태아 조혈 계통으로부터 수득된 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 세포의 조성물에 관한 것이며, 여기서, 상기 집단 내 세포는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 내에, 확장 후 적어도 0.1%의 돌연변이율을 나타낸다: ARHGEF10L, TRIM66, NKAIN, ITGAGGT1, PDZD, MUC4, MUC2, NECAB3, MNT, GLTSCR1, COPZ2, ZFP36, MIB2, ABCC12, IGFN1, LRRK2, RIN3, GGT1, ANK2, HDAC7, MUC20, SDCCAG3, DNAI1, BTNL9, ABTB2, MC2R, DOCK4, FSD1L, CRP, PPP1R3A, SLC22A17, PITPNM1, A2M, CTDSP2, IFNA14, KIF5C, THNSL2, GTF3C3, NRXN1, MED26, FNBP1, TMCO3, ING1, ZNF292, RBL1, CD109, FOXRED2, PLIN2, ZNF85, SESN1, CENPE, BTBD7, STOM, ZNF317, TET1, LRBA, MED4, CDC27, BCR, HPRT1, NASP, 및 MSH2. 이러한 유전자는 급성 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병에서 일반적으로 발현된다.

본 발명은 또한 iPS-유래된 신장 오가노이드 내 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 태아 세포의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 집단 내 세포는 다음의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 태아 항원을 발현한다: TRAPPC4, MX1, ITSN1, DNAJC7, TAF15, TMEM88, CRYM, PRTG, TYRO3 C12ORF60, FJX1, ADM, FAM45A, ASS1, CA2, ZFHX4, CLVS1, NRG1, EZH2, SLC22A23, MSH5, FBN2, GTF2H2, LIX1, HESX1, FZD5, LRP2, RHOQ, NUAK2, ILF2, ACP6, RPL5, NMNAT1, ID1, U2AF2, KLHL14, CDH2, GREB1L, ARRDC4, THBS1, BMP4, LRIG3, SOX5, SF1, LGR4, MGEA5, BCORL1, STOM, GLIS3, ANXA1, KDM4C , SDC2 , TMEM130, MAGI2, GLI3, HEY2, TPBG, ID4, MYLIP, ENC1, EGR1, CDH6, NPY1R, SEL1L3, LRAT, CLDN1, CEP97, BHLHE40, ARL5A, ARL4C, ZNF385B, LYPD1, B3GNT7, INSIG2, ARHGAP29, NOTCH2, 및 IFI16. 이러한 유전자는 c-Met 돌연변이와 관련되거나 관련되지 않은 1차 성체 신장 암종 내에서 일반적으로 발현된다.

본 발명은 또한 iPS-유래된 폐 오가노이드 내 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 태아 세포의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 집단 내 세포는 다음의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 태아 항원을 발현한다: AIM2, AQP4, AURKA, BMP5, CDCA7, CEP55, CYP4B1, DACH1, EMP2, EPB41L4A, GJB2, MAOA, MELK, MKI67, NEBL, NFIA, PHF19, RNF144B, 및 UHRF1. 이러한 유전자는 성체 폐 암종 내에서 일반적으로 발현된다.

본 발명은 또한:

a. 불활성화된 태아 줄기 세포의 집단 및

b. 면역 반응 및/또는 MHC I 발현을 자극하는 제제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

특히, 불활성화된 태아 줄기 세포는 돌연변이유발된 태아 줄기 세포를 함유한다. 이는 특히 암이 태아 줄기 세포 특징을 갖는 경우, 대상체 내에서 암의 치료에 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 부분은 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물 및 면역화를 위한 설명서를 제공하는 정보 전단을 포함하는 키트(kit)이다.

본 발명은 또한 대상체 내에서 암을 치료하기 위해 동시의, 별도의 또는 순차적인 투여에 의해 사용하기 위한, i) 불활성화된 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 화합물의 배합 제제에 관한 것이다. 이는, 암이 방광 암종, 유방 암종, 자궁경부 암종, 담관암종, 직장결장 암종, 위 육종, 신경교종, 폐 암종, 림프종, 급성 및 만성 림프종 및 골수 백혈병, 흑색종, 다발 골수종, 골육종, 난소 암종, 췌장 암종, 전립선 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 종양, 및 고형 종양 및 조혈 악성종양의 모든 아형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우 사용될 수 있다.

치료량의 조성물(불활성화된 태아 세포 집단 및 보조제)이 이를 필요로 하는 환자에게 투여되는 치료 방법이 또한 개시되어 있으며 본 발명의 부분이다.

본 출원에서, 모든 유전자는 당해 분야의 기술자에게 공지된 바와 같은 이의 명칭과 함께 나타낸다. 이러한 명칭으로부터, 임의의 조사 엔진(전문가 조사 엔진(generalist search engine) 포함)을 사용함으로써 또는 암 유전자의 라이브러리를 유지하는데 특이적인 데이타베이스, 예를 들면, COSMIC 데이타베이스(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer, 영국에서 Sanger Institute에 의해 개발됨) 또는 Cancer Genome Atlas(TCGA, 미국 NCBI에 의해 유지됨) 내에서 유전자 및 단백질의 서열을 찾을 수 있다. 이러한 데이타베이스는 암 세포 내에서 발현된 항원을 암호화하는 다양한 서열을 재그룹화한다.

발명의 상세한 설명

본 발명자는 태아 줄기 세포의 집단과 함께 HDACi의 사용이 종양 세포에 대한 면역계의 상승효과 및 효율적인 반응을 초래하였음을 나타내었다. 본 발명자는 또한 베리노스타트, 엔티네스타트, 레비테라세탐 및 발프로산을 포함하는, 다양한 HDAC 억제제(HDACi)는 태아 줄기 세포의 집단과 상승적으로 작용함으로써 종양 세포에 대해 효율적인 면역 반응을 유발할 수 있었다. 본 발명자는 또한 (i) 태아 줄기 세포, 예를 들면, 조사된 내배엽성 선조 세포(EndoPC) 및 (ii) HDACi, 예를 들면, 발프로산의 조합물로 췌장암과 같은 암으로 영향받은 개인의 예방접종이 종양의 놀라운 억제 및 생존율의 유의적인 증진을 초래하였음을 입증하였다.

실제로, 본 발명자는 태아 신생-항원의 공급원으로서 가공된 iPSC로부터 유래된 태아 줄기 세포가 백신으로 사용되어 종양 세포에 의해 공유되는 다양한 태아 항원에 대해 면역 반응을 생성시킬 수 있고, 이러한 반응은 다능성 세포로 수득된 반응보다 더 특이적일 수 있다고 가설을 세웠다. 본 발명자는 또한 HDACi(즉, 발프로산)과 조합된 태아 줄기 세포를 사용한 마우스의 예방접종이 면역계를 강화할 수 있다고 가설을 세웠으며 이것이 부작용 및 자가면역 질환의 증거없이 효율적인 면역 및 항-종양 반응을 유도하였음을 입증할 수 있었다.

선행 기술 문헌의 설명

제WO 2012/122629호는 종양 항원: AFP), 암배아 항원(CEA), CA 125, Her2, 도파크롬 타우토머라제(DCT), GP100, MARTI, MAGE 단백질, NY-ESOl, HPV E6 및 HPV E7으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원을 발현하는 바이러스 종양붕괴성 백신과 HDACi의 조합물을 개시하고 있다. HDACi는 바이러스 항원(바이러스로부터 유래되거나 바이러스에 의해 발현됨)에 의해 유도된 1차 면역 반응 후 2차 면역 반응을 증가시키는 면역조절인자(immunomodulateor)이다.

바틀렛(Bartlett) 등(Molecular Cancer 2013, 12:103)은 치료학적 암 백신으로서 종양붕괴성 바이러스(oncolytic virus: OV)를 개시하고 있다. OV 아암된(armed) 면역-조절 유전자는 특히 선천성 면역성을 일시적으로 억제하여 OV의 감염 및 확산을 촉진시키는 HDAC 억제제와 동시 투여하여, 동물 모델 및 사람 환자 내에서 강력한 항-종양 면역성을 유도한다. 따라서, HDAV 억제제(HDACi)의 역활은 백신이 보다 효율적으로 증식하도록 함으로써 면역 반응을 증가시킨다.

브리들(Bridle) 등(Molecular Therapy vol. 21 no. 4, 887-894 apr. 2013)은 HDAC 억제가 1차 면역 반응을 억제하고, 2차 면역 반응을 향상시키며, 종양 면역요법 동안 자가면역성을 파괴함을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 결과는 다양한 악성종양에 적용가능한 치료제로서 종양붕괴성 바이러스(OV)의 맥락에서 수득되며, 단지 HDACi가 종양붕괴성 백신 벡터에서 지시된 1차 면역 반응을 손상시킬 수 있었으며 후속적인 2차 반응을 향성시킬 수 있었음을 나타낸다.

우(Wu) 등(J Ovarian Res. 2015 Oct 24;8:68)은 임의의 보조제를 사용하지 않고, 주어진 암에 대한 백신으로서 줄기 세포 내에서 풍부한 확립된 난소 암 세포주를 사용한다.

제WO 2016/065330호는 (i) 세포독성 페이로드(cytotoxic payload); (ii) 야생형 또는 유전적으로 변형된 바이러스; (iii) 야생형 또는 유전적으로 변형된 세균; 또는 (iv) 대상체 내에서 고형 종양 또는 조혈 악성종양을 치료하기 위한 이의 2개 이상의 조합물을 포함하는 변형된 줄기 세포의 용도를 개시하고 있다. 기술내용은 이러한 세포의 실제 특성 또는 특징에 관한 임의의 세부사항없이, 잠재적으로 사용될 수 있는 줄기 세포의 목록을 제공한다. 이러한 문서는 암에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여 HDACi의 첨가를 기술하거나 시사하고 있지 않다.

제WO 2017/027757호는 대상체 내에서 암을 치료하기 위한 천연두 백신의 용도를 개시하고 있으며 여기서 줄기 세포는 당해 백신에 첨가될 수 있었다. 이러한 기술은 이러한 세포의 실제 특성 또는 특징에 관한 어떠한 세부사항없이, 잠재적으로 사용될 수 있는 줄기 세포의 목록을 제공한다. 이러한 문서는 HDACi를 첨가하여 암에 대한 면역 반응을 생성시키는 것을 기술하거나 시사하지 않는다.

제EP 2 599 860호는 유도된 전-암 줄기 세포 또는 유도된 악성 줄기 세포인 유도된 암 줄기 세포를 개시하고 있으며, 여기서 유도된 암 줄기 세포는 6개의 유전자 POU5F1, NANOG, SOX2, ZFP42, LIN28, 및 TERT를 발현하며; (a) 내인성 종양 억제인자 유전자 내의 돌연변이 또는 (b) 내인성 암-관련 유전자의 증가된 발현인 이상(aberration)을 갖는다. 발현된 유전자의 측면에서, 이러한 세포는 태아 세포가 아니다. 특히, POU5F1 및 NANOG는 비-분화 및 다능성의 마커이다.

쳉(Zheng) 등(Oncol Rep. 2017 Mar;37(3):1716-1724)은 간 줄기 세포(HSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 사용한 예방접종을 비교하고 있다. HSC는 성체 마우스의 간으로부터 단리되었으므로 태아 세포가 아니다. 또한, 다른 보조제, 특히 HDACi를 이러한 연구에 사용하지 않았다.

제WO 2017/202949호는 암을 치료하기 위한 다능성 세포와 HDACi의 용도를 개시하고 있다. 다능성 세포는 태아 세포와는 상이하며, 태아 세포 및 암에서 발현되는 일부 항원을 발현하지 않는다.

요약하면, 상기 문헌 중 어느 것도 암에 대한 치료학적 또는 예방학적 백신으로서 보조제(특히, HDACi 또는 자극하는 MHC-I 발현)과 함께 불활성화된 태아 세포(잠재적으로 돌연변이됨)의 집단의 특정 조합을 개시하고 있다.

태아 세포 조성물 및 사용 방법

본 발명은 면역원으로서 태아 세포의 집단을 사용하며, 또한 이에 관한 것이다.

본 맥락에서, 태아 세포의 집단은 세포 배양물로서 유지되는 세포의 집단에 상응하지만, 또한 오가노이드(organoid)를 포함하며, 여기서 세포는 기관을 생성하기 시작하며 여기서 세포의 3D 공간 조직화가 관찰될 수 있다.

분화는 보다 구체화된 세포가 덜 구체화된 세포로부터 형성되는 공정임을 상기한다. 이는 지속적인 공정이다. 다능성 세포(배아 줄기 세포, 또는 iPS)로부터 출발하여, 세포는 다능성을 상실할 것이며, 분화의 하나의 방식으로 관여될 것이고 여기서 이는 완전히 분화된 구체화된 세포로 성숙할 것이다. 일부 기관에서, 다수의 세포는 분화 공정 동안 오가노이드를 생성할 것이다.

다능성 세포의 분화를 유도하고 지시하는 것은 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 다능성 세포로부터의 발달 또는 오가노이드를 기술하는 우(Wu) 등(Cell. 2016 Jun 16;165(7):1572-1585), 파테훌라(Fatehullah) 등(Nat Cell Biol. 2016 Mar;18(3):246-54) 또는 사사키(Sasaki) 및 클레버스(Clevers)(Curr Opin Genet Dev. 2018 Sep 24;52:117-122)를 인용할 수 있다. 다양한 목적한 조직내에서 다능성 세포가 분화하도록 하는 방법 및 조건을 설명하고 교시하는 다수의 기타 문헌이 존재한다.

태아 세포 집단의 정의

태아 세포는 분화 경로(내배엽, 중배엽, 외배엽)에 관여하기 시작하면서 이의 다능성을 상실한 세포이다.

세포가 태아 마커를 발현하고(하기 참고) 다능성 마커를 발현하지 않으므로 세포의 집단이 태아 세포의 집단인지를 측정하는 것이 가능하다.

본 발명에 따라서, 집단은 다수의 세포(적어도 0.5x10⁶개의 세포, 보다 바람직하게는 적어도 1x10⁶개의 세포, 보다 바람직하게는 적어도 2x10⁶개의 세포 또는 5x10⁶개의 세포 또는 5x10⁶개 이상의 세포를 함유한다.

세포의 집단이 태아 세포의 집단인지 여부를 측정하기 위하여,

(a) 집단의 세포는 필수적으로 다능성 유전자(또는 마커)를 발현하지 않음이 측정되어야 하고,

(b) 집단의 세포에 의해 발현된 태아 유전자(또는 마커)의 존재를 측정하여야만 한다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포 집단의 세포는

(a) 분화되지 않은 다능성 자가-재생 세포(배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포) 내에서 전형적으로 발현된 유전자를 발현하는 세포가 존재하지 않거나 10% 미만의 세포 만이 발현하도록 하여야 하고, 이는 바람직하게는 유동 세포분석법 및 보다 구체적으로 FACS(형광-활성화된 세포 분류)에 의해 측정되며,

(b) 집단이 3개의 배선 층으로부터 유도된 헌신적인 분화된 선조세포 또는 3D-오가노이드 조직의 형태인지의 여부에 상관없이, 집단 내 세포의 적어도 70%, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상이 선조세포/태아 마커를 발현하도록 한다.

세포의 10% 미만이 성체 조직 마커를 발현하는 경우가 또한 바람직하다. 성태 조직 마커는 성체 세포 내에서 발현되는 마커(단백질 또는 유전자)이다.

상기 언급된 퍼센트는 주어진 마커를 발현하는 집단 내 세포의 퍼센트에 관한 것이다. 나타낸 바와 같이, 분화되지 않은 다능성 자가-재생 세포 내에서 전형적으로 발현된 마스터 유전자(master gene)의 낮은 발현률(<10%)은 집단의 세포의 10% 미만이 하기에 추가로 설명된 바와 같이, 검토하는 유전자를 발현함을 나타낸다.

발현되는 마커는 분화 공정 동안 변함이 주목된다. 결과적으로, 세포의 태아 특성과 관련된 일부 마커는 분화 공정에서 조기(즉, 다능성의 상실 직후)에 발현되는 반면 일부 마커는 공정의 말기(즉, 성체 세포 내에서 성숙 전)에 발현된다. 이러한 태아 마커의 발현의 결여는 세포가 이들의 태아 특징을 상실하고, 유사하게 이들이 분화된 성체 세포로 성숙됨을 나타내는 표현형을 획득하였음을 나타낸다.

(a) 다능성 유전자가 집단의 세포에 의해 발현되지 않음을 측정하기 위하여, 유전자 발현 및/또는 면역화학 평가를 사용하는 것이 가능하다. 목표는 분화되지 않은 다능성 자가-재생 세포(배아 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포) 내에서 전형적으로 발현된 마스터 유전자의 부재 또는 낮은 발현을 나타내는 것이다.

특히,

a) 다능성 마커에 대한 양성 대조군으로서 iPS 세포의 집단을 사용하고,

b) 표적 집단 내 및 iPS 세포 집단 내에서 다능성 유전자 세트의 발현 수준을 비교할 수 있다.

다능성 유전자의 발현 수준이 iPS 세포 집단 내 이러한 유전자의 발현 수준의 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만인 경우, 또는 세포의 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만이 유전자를 발현하는 경우 표적 집단의 세포는 다능성 유전자를 발현하지 않음을 고려한다. 임의의 정량분석 방법, 예를 들면, RT PCR 또는 유동 세포 분석법, 또는 면역-조직-마킹(immune-histo-marking)을 사용할 수 있다. 세포의 FACS(형광-활성화된 세포 분류)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 방법을 사용하여, 집단의 세포의 10% 미만은 이러한 다능성 유전자를 발현할 것이다.

다능성 세포에 의해 발현된 다수의 마커가 존재한다. 실제로, 세포가 이의 다능성 특성을 상실하는 경우, 이러한 다능성 마커의 발현이 관련되므로, 이는 또한 이러한 마커의 발현을 상실할 것이다. 결과적으로, 다능성 세포에 의해 발현된 다수의 유전자(다능성 유전자)가 당해 분야에 공지되어 있지만, 이를 다수 연구하는 것이 필수적이지 않다.

보다 상세하게는, NANOG, POU5F1(Oct4), SSEA4, Tra-1-81, 및 Tra-1-60으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다능성 유전자의 발현을 연구하는 것이 바람직하다.

일 구현예에서 하나의 세포내(예컨대, OCT4 또는 Nanog) 및 하나의 세포외(예컨대, SSEA-4 또는 Tra-1-60 또는 Tra-1-81)를 사용하여 측정의 정확성을 증진시킬 수 있었다.

그러나, 이는 이러한 유전자들 중 3개, 4개 또는 심지어 5개의 유전자를 고찰하는 경우 또한 가능하다.

집단 내에서 이러한 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 측정하는 것은 당해 분야에서 이용가능한 항체를 사용하는, FACS 방법에 의해 용이하게 수행된다. 심지어 멀티플렉스(multiplex) 실험에서 이러한 분석을 수행하는 것이 가능하다.

다수의 유전자를 연구하는 경우, 집단 내에서 다능성으로 고려된 세포의 퍼센트는 각각의 마커를 지닌 세포의 퍼센트의 평균을 취함으로써 측정된다.

나타낸 바와 같이, 유전자 (1)을 발현하는 주어진 집단의 세포의 퍼센트가 6%이고, 유전자 (2)를 발현하는 주어진 집단의 세포의 퍼센트가 5%인 경우, 집단은 5.5%의 다능성 세포(5%와 6%의 평균)를 함유하는 것으로 고려되며 주어진 집단은 상기 통과 조건 (a)를 가진 것으로 고려될 것이다.

집단의 세포가 태아 유전자를 발현하고 조건 (b)를 충족하는지를 측정하기 위하여, 이들이 분화 경로 중 하나에 도입된 경우 세포에 의해 발현된 유전자(마커, 단백질 또는 항원)을 검출하는 것이 필수적이다.

신경 태아 세포:

조기 신경 외배엽 선조세포: TP63, MASH1, Notch1, Sox1, Sox2, Musashi 2, Musashi 1, Nestin, Pax6, MUC18, BMI1, Mash1, FABP7, 뉴클레오스테민,

조혈 태아 세포

조혈 중배엽 선조세포: Brachyury(T), MIXL1, cryptic, GATA1, LMO2, ACE, SCL(Tal1), HoxA9, Fli1

신장 태아 세포:

신장 중배엽 선조세포: WT1, HOXD11, SIX2, SALL1, WT1, PAX2, OSR1, PAX8, LHX1, GATA3, HOXB7

간 태아 세포:

간 내배엽 선조세포: SOX17, HNF3B, HNF6, Fox-A2, HNF1B , GATA4, AFP, LGR5

췌장 태아 세포:

췌장 내배엽 선조세포 SOX17, Fox-A2, CXCR4, GATA4, HNF1B, HNF4A, PDX1, HNF6, PROX1, Ngn3, NeuroD1, PAX6, , SYP, SOX9, NKX2-2, NKX6-1, P48, LGR5, HB9

소장 태아 세포:

소장 내배엽 선조세포: CDX2, TCF-2, SOX 9, NMYC, ID2, SOX2, PAX8, Nkx2.1, LGR5

폐 태아 세포:

폐 내배엽 선조세포: CXCR4, SOX17, FOXA2, NKX2.1, PAX9, TBX1, SOX2 SOX9, ID2, Foxj1, Scgb1a1, Foxj1

갑상선 태아 세포

갑상선 내배엽 선조세포: CXCR4, SOX17, FOXA2, Pax8, HHEX, Nkx2-1

기타 태아 세포

근아세포 선조세포: Pax7, Pax3, Myf5

연골세포 선조세포: Osteonectin, Sox9.

골아세포 선조세포: Runx2, ALP, Osx, 오스테오폰틴, 오스테오칼신.

상기 언급된 유전자는 당해 분야에 공지된 모든 것이며 각각의 분화 경로에 대해 및 각각의 조직 오가노이드에 대해 특이적이다. 조기 또는 말기 선조세포 내 이러한 태아 유전자는 나타낸 바와 같이, 완전히 분화된 성체 세포 내에서는 발현되지 않으며, 이의 서열은 광범위하게 이용가능한 공공 데이타베이스에서 발견될 수 있다.

결과적으로, 이러한 마커는 조기 개체발생성 발달의 마커이며 이러한 마커를 지닌 세포가 완전히 성숙한 성체 세포가 아니라는 사실을 반영한다. 이들은 여전히 태아 발달 상으로부터의 선조세포이며, 이는 이들이 여전히 다양한 유형의 성숙한 세포를 생산할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 맥락에서, 태아 세포 집단을 수득하기 위하여, 당해 분야의 기술자는 당해 분야에 공지된 방법에 따라서, 분화 경로 중 하나 내에서 다능성 세포(예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포)의 분화를 유도할 것이다.

다능성의 상실은 상기 나타낸 바와 같은 마커의, 세포의 적어도 90%에서, 발현 상실을 점검함으로써 입증될 것이다.

당해 분야의 기술자에 의해 선택된 분화 경로에 따라서, 세포 집단 내에서, 상기 나타낸 특이적인 태아 마커의 존재를 점검하는 것이 가능하다.

이를 위해, 당해 분야의 기술자는 FACS 분석을 사용하여 주어진 경로의 태아 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 측정할 것이며, 세포의 적어도 70%가 이러한 마커 중 적어도 하나를 발현함을 입증함으로써 퍼센트를 계산할 것이다. 멀티플렉스 FACS 분석을 사용하여 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 수를 확인하는 것이 또한 가능하다. 다시 말해서, 이는 임의의 이러한 마커를 발현하지 않는 세포의 퍼센트가 30% 이상이 아님을 의미한다. 이는 또한 FACS 분석에 의해 용이하게 측정된다.

세포 집단이 세포의 분화 경로의 사진 지식이 없다고 해도, 태아의 것인지 여부를 측정하는 것이 또한 가능하다.

세포 집단이 본 발명에 따른 태아 세포 집단인지의 여부를 점검하기 위하여, 세포가 상기 언급한 다능성 마커 중 하나 이상을 발현하는지의 여부(및 집단 내 상기 마커를 발현하는 세포의 퍼센트)를 우선 고찰할 것이다. 세포 중 10% 미만이 상술한 바와 같은 마커를 발현하는 경우, 당해 분야의 기술자는 집단의 세포에 의한 태아 마커의 발현을 고찰할 수 있다.

세포의 형태학/조직학은 당해 분야의 기술자에게 세포 계통 연루(cell leneage commitment)에 대한 정보를 제공할 수 있으므로, 첫번째 점검을 위한 소수의 마커를 선택하는 것을 가능하도록 한다. 그러나, 세포 계통 연루의 사전-지식없이 세포의 태아 천연 단계를 입증하는 것도 또한 가능하다.

이를 위해서, 집단의 세포로부터의 RNA를 추출하고, 역 전사시키고, 임의로 증폭시키며, 상술한 바와 같은 태아 마커에 대한 프로브(probe)를 함유하는 임의의 DNA 칩(chip) 또는 배열에 적용할 수 있다. 특히 저 밀도 배열(Low Density Array: LDA)을 사용할 수 있다. 이는 태아 마커의 존재를 측정할 수 있도록 할 뿐 아니라, 이러한 마커를 정량화, 즉, 집단의 세포의 분화 경로를(세포 집단으로부터의 RNA에 의해 "턴-온된(turned on)" 프로브에 따라) 측정할 수 있도록 한다.

일단 분화 경로가 공지되면, 이러한 구체적인 세포 계통 분화 경로의 구체적인 마커를 사용한 FACS 분석을 수행하여 집단내 이러한 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 정량화할 수 있다.

태아 세포 집단의 용도

태아 항원이 종양 세포 내에서 발현될 수 있음이 오랫동안 시사되어 왔다(Ting et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1972 Jul; 69(7): 1664-1668).

본 발명자들은 본 발명에 이르러 대상체 내에서 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 본원에 개시된 바와 같은 태아 세포의 집단을 사용하는 것이 가능함을 입증하였다. 본 발명자들은 탈-분화(de-differentiation)를 유도하고 이들을 분화 경로에서 퇴행시켜 "태아-유사" 특징에 도달하도록 하고 이의 증식을 야기하는 대상체 세포 내에서의 돌연변이에 기인할 수 있거나 이에 의해 촉진될 수 있다는 가설을 세웠다. 결과적으로, 이러한 세포는 태아 마커를 발현하며, 이는 성숙되고, 완전히 분화된 성체 세포 내에서 발현되지 않는다. 또한, 이러한 세포는 고속으로 분열하므로, 이는 신생-항원으로 또한 불리는, 돌연변이된 항원을 생성하는, 돌연변이를 유도한다. 태아 항원 또는 종양 세포의 신생-항원이 암 사이에서, 적어도 동일한 분화 경로(외배엽, 내배엽 또는 중배엽)로부터 기원하는 기관의 암 사이에서 일반적으로 공유됨이 실제로 주목되어야 한다.

외배엽 경로로부터, 기관은 상피 피부 세포, 뉴우런, 교질 세포, 신경관(neural crest); 색소 세포이다.

중배엽 경로로부터, 기관은 심장 근육, 골격근 세포, 신장(세관), 적혈 세포, 평활근(위 내)이다.

내배엽 경로로부터, 폐 세포(특히, 폐포), 갑상선 세포, 췌장 세포, 간 세포를 언급할 수 있다.

최종적으로, 암 세포의 미세환경은 T 림프구의 작용을 억제할 것이므로 일반적으로 면역계에 대해 호의적이다.

바람직하게는 HDACi와 함께 또는 MHC-I 분자의 발현을 증가시키는 화합물과 함께 이러한 태아 세포 집단의 불활성화된 세포의 투여는 대상체(바람직하게는 사람, 그러나 개, 고양이, 소 또는 말과 같은 다른 동물일 수 있다) 내 집단의 세포 상에 존재하는 태아 항원(들), 및 따라서 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있을 것이므로, 암의 회귀를 야기할 수 있다. 이는 고형 종양 및 혈액 종양 둘 다에 대해 유효하다.

실제로, 암 세포는 본원에 개시되고 특징화된 태아 집단의 세포에 의해 발현된 것과 같은 항원(마커)을 발현할 수 있다.

결과적으로, 태아 세포의 집단(태아 집단)을 사용하여 환자의 면역계를 프라임(prime)함으로써, 암과 적절하게 및 효율적으로 싸울 수 있도록 할 수 있다.

본 발명자는 HDACi(또는 MHC-I 발현을 증가시키는 제제) 및 불활성화된 태아 세포의 집단 둘 다를 사용하는 경우 상승 효과의 존재를 주목하였으며, 이는 다음 중 하나에 기인하는 것으로 여겨진다:

i) 면역 반응을 활성화/증강시기 위한(태아 및 신생-항원의 보다 우수한 제시) 태아 세포 및 종양 세포 상에서 MHC 제I 부류 발현의 증가

ii) 이러한 항원/신생 항원에 대한 구체적인 면역 반응을 유도하기 위한 탈메틸화에 의한 암 줄기 세포(CSC) 및 종양 세포 내 태아 항원/신생 항원의 증가

iii) 종양이 면역-반응성이 되도록 하는 종양 내로 CD4+ 및/또는 CD8+, 및/또는 CD8+ PD1-T 림프구를 보충하기 위한 케모킨 발현의 증가

iv) 종양이 면역-반응성이 되도록 하는 종양 미세 환경 속에서 조절성 T 림프구 및 골수구-유도된 억제인자 세포(MDSC)의 감소.

상이한 경로의 측면에서, 태아 세포의 집단은 폐, 췌장, 신장, 유방, 혈액, 위장, 갑상선, 전립선, 뇌(특히 교아세포종), 위, 간, 골, 난소 암의 치료에 사용될 수 있다. 기술자는 치료될 암보다 동일한 세포 분화 계통에 관여하는 태아 세포의 집단을 선택할 것이다.

이러한 태아 세포 집단을 사용하는 것은 주어진 암 내에서 발현되거나 상이한 암에 대해 일반적인 적어도 10개, 보다 일반적으로 적어도 50개, 또는 적어도 100개, 500개, 또는 심지어 1000개의 태아 또는 신생-항원을 전달하는 것이 가능하도록 할 수 있다.

태아 세포는 이러한 돌연변이(BRCA, cMET, RET, APC 등)에 의해 하향조절된 태아 유전자를 발현하고 세포계통의 암에서 공유된 가족성 암에 걸리기 쉬운 돌연변이를 함유할 수 있는데, 예를 들면, c-Met 돌연변이를 함유하는 혈액 세포로부터 수득된 iPS 세포는 신장 암 내에 존재하는 c-Met 돌연변이를 함유하는 신장 오가노이드로서 유래될 수 있다.

태아 세포 조성물을 제조하는 경우 돌연변이 유인제의 사용(하기 참고)은 집단의 세포의 유전자 내에 돌연변이(예를 들면, 미스센스(missense) 또는 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이), 및 따라서 신생-항원의 발현을 도입할 것이다.

특히, 본 발명자는 만성 골수 백혈병(CML)의 세포로부터 수득되고, ENU로 돌연변이되며 조혈 태아 세포 내에서 유래된 iPS 세포는 급성 골수 백혈병(AML) 내에 존재하는 항원을 함유함을 밝혀내었다.

환자를 치료하기 위하여,

i) 이러한 암의 생검으로부터, 대상체의 암의 항원 특이적인 특징을 수득하고,

ii) 단계 i)에서 측정된 항원 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 함유하는 불활성화된 태아 세포의 집단을 선택하며,

iii) HDACi 또는 MHC-I 발현을 증가시키는 제제(agent)와 함께, 이러한 집단을 환자에게 투여할 수 있다.

단계 i)는 당해 기술분야에서 이용가능한 도구를 이용하여, 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수득된다.

특징은 특히

- 암 세포(엑솜 서열분석(exome sequencing)) 내에서 발현된 유전자를 측정하는 단계,

- 유전자를 암 특이적인 유전자의 데이타베이스(특히 COSMIC 데이타베이스(영국의 Sanger Institute에 의해 개발된, 암 내의 체세포 돌연변이의 카탈로그) 또는 Cancer Genome Atlas(미국 NCBI에 의해 유지된, TCGA)를 언급할 수 있다)와 비교하는 단계(이러한 데이타베이스는 암 세포 내에서 발현된 항원을 암호화하는 다양한 서열을 재그룹화한다),

- 암의 항원 특이적인 특성으로서 엑솜 및 데이타베이스 둘 다 내에 존재하는 유전자를 선택하는 단계에 의해 수득된다.

단계 ii)는 태아 세포 집단의 엑솜을 수행하고 암의 항원 특이적인 특징의 유전자들 중 적어도 하나가 태아 세포 집단으로부터 수득된 엑솜 내에 존재함을 입증함으로써 수행된다.

다른 구현예에서,

i) 이러한 암의 생검으로부터, 대상체의 암의 항원 특이적인 특징을 수득하고,

ii) 단계 i)에서 측정된 항원 중 적어도 하나를 일반적으로 발현하는 세포를 함유하는 불활성화된 태아 세포의 집단을 선택하며,

iii) HDACi 또는 MHC-I 발현을 증가시키는 제제와 함께, 이러한 집단의 추출물을 환자에게 투여할 수 있다.

이러한 구현예에서, 추출물은 총 RNA, mRNA, DNA, 단백질 추출물, 용해물(lysate), 동결-건조된 추출물, 동결건조물 또는 데시케이트 세포(dessicate cell), 엑소좀(exosome), 세포외 미세소낭, 및 세포자멸사체(apoptotic body)로부터 선택된다.

다른 구현예에서,

i) 이러한 암의 생검으로부터, 대상체의 암의 항원 특이적인 특징을 수득하고,

ii) 단계 i)에서 측정된 항원 중 적어도 하나를 일반적으로 발현하는 세포를 함유하는 불활성화된 태아 세포의 집단을 선택하며,

iii) HDACi 또는 MHC-I 발현을 증가시키는 제제의 존재하에서, ii)의 집단 또는 이러한 집단의 추출물로 시험관내(in vitro)에서 프라임된 항원 제시 세포 또는 T-세포의 집단을 환자에게 투여할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 집단은:

a. 환자의 특정 암에 관한 경로를 향한 다능성 세포 집단의 분화(여기서 다능성 세포는 돌연변이 유인제에 의해 임의로 확장되었다),

b. 이렇게 분화된 세포의 확장,

c. 임의로, 상기 집단의 세포 내 유전자의 돌연변이유발을 유도하기 위해, 확장 동안 돌연변이 유인제에 대한 노출,

d. 집단의 세포의 적어도 70%가 태아 마커를 발현하는 것의 입증,

e. 임의로 집단의 세포가 적어도 하나의 암 또는 대상체의 암 세포 내에 존재하는 신생 항원을 발현한다는 것의 입증.

f. 세포가 분열하는 이의 능력을 상실하도록 하기 위한, 세포의 불활성화에 의해 수득되었다.

본 발명에 따른 태아 세포 집단을 사용하는 것이 특히 흥미롭다. 실제로, 이러한 세포는 암 세포에 의해 발현되기 쉬운 다수의 태아 항원을 함유한다.

본 발명은 또한 환자 내에서 암의 치료를 위해 사용되도록 의도된 세포의 집단을 개발하여 생산하는 방법에 관한 것이다.

이러한 방법은 다음 a) 내지 f)의 단계를 포함한다:

a) 임의로 암의 생검을 수행하는 단계,

b) 환자로부터의 암 생검으로부터 회수된 세포를 분석하여 암 세포에 의해 발현된 태아 및 암 마커를 확인하는 단계,

c) 환자의 특수 암에 관한 경로를 통해 다능성 세포의 집단을 분화시키는 단계(예를 들면, 환자가 신장 암인 경우, 신장 경로에서의 분화가 유도될 것이다),

d) 임의로, 분화된 세포의 집단 내에서 돌연변이를 유도시키는 단계로서: 이러한 단계는 선택적이지만 바람직하게 수행되는 단계. 이는 집단의 세포에 의해 발현된 항원의 다양성을 증가시키고, 세포에 대한 노출시, 면역계의 능력을 증진시키고, 이의 세포의 돌연변이의 존재하에서 조차 암 세포를 제어하기 위해 의도된다. 돌연변이율은 세포 집단의 하나 이상의 유전자의 서열을 점검함으로써 제어될 수 있다. 집단 내에서 주어진 유전자의 돌연변이된 서열의 존재를 확인하고 정량분석화, 예를 들면, 집단 내 유전자의 서열과 비교하는 것이 가능하다. 예를 들면, 주어진 유전자에 대한 0.1%의 돌연변이율은 집단 내, 이러한 유전자에 대해 확인된 서열의 0.1%가 돌연변이를 나타냄을 나타낸다.

e) 임의로, 집단의 세포가 적어도 하나의 암 또는 대상체의 암 세포 내에 존재하는 신생-항원을 발현하는 것을 입증하는 단계,

f) 세포를 불활성화시켜 세포가 분열하는 이의 능력을 상실하도록 하는 단계. 이는 세포 집단의 모두 또는 일부가 환자에게 투여된 후 생체내에서 세포의 증식을 피하기 위한 것이다.

일단 세포 집단이 수득되면, 이들 모두 또는 이의 일부를 동물(바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람)에게, 바람직하게는 HDACi 또는 MHC-I의 발현을 자극시키는 화합물의 존재하에서 투여할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 모든 방법에서, 불활성화된 태아 세포 집단, 또는 이의 추출물, 또는 집단 또는 이의 추출물로 프라임된 항원 제시 세포 또는 T-림프구를 투여할 수 있다.

구체적인 구현예에서, 단계 c)의 다능성 세포는 환자의 세포로부터 개발된 iPS 세포(유도된 다능성 줄기 세포)이다. 이는 태아 세포가 환자에게 투여되는 경우 교차-면역성의 위험을 감소시킬 수 있다. 실제로, 비-태아 항원은 면역계에 의해 인식되지 않지만, 태아 항원(집단의 세포 상에 또는 암 세포 상에 존재하는)은 인식될 것이다.

대안적으로, 본 발명은

a) 암의 생검을 임의로 수행하는 단계,

b) 환자로부터의 암 생검으로부터 회수된 세포를 분석함으로써 암 세포에 의해 발현된 태아 및 암 마커를 확인하는 단계,

c) 환자의 특이적인 암에 관한 분화 경로에 관여된 불활성화되고 임의로 돌연변이유발된 태아 세포의 집단을 선택하는 단계,

d) 환자에게 세포, HDACi 또는 MHC-I 발현을 자극하거나 증가시키는 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 폐 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 폐에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 폐암의 치료를 위해 채택된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 갑상선 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 갑상선에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 갑상선 암의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 신장 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 신장에 대해 상기 나타낸 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 신장 암의 치료를 위해 특별히 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 조혈 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 조혈 세포에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 혈액암(백혈병)의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 간 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 간에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 간 암의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 장 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 장에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 위-장 암의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 췌장 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 췌장에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 췌장 암의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 신경 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 뉴우런 또는 뇌에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 뇌 암(특히 교아종)의 치료를 위해 조정된다.

구체적인 구현예에서, 태아 세포는 골 분화 경로에 관여한다. 따라서, 이들은 골아세포에 대해 상기 나타낸 바와 같은 마커를 발현할 수 있다. 이러한 세포는 특히 골 암의 치료를 위해 조정된다.

면역 반응을 증진시키기 위한 HDACi

제1 양태에서, 본 발명은 백신 조성물과 함께 HDACi를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체 내에서 백신 조성물의 효능을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 특히, HDACi는 백신 조성물에 첨가된다.

본 발명은 또한 대상체 내에서 암의 치료 시 사용하기 위한, (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 대상체 내에서 암의 치료시 사용하기 위한 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물의 조합물에 관한 것이다. 일부 구현예에 따라서, 본 발명은 대상체 내에서 암의 치료 시 사용하기 위한, 동시의, 별도의 또는 순차적인 투여에 의한, (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물의 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 대상체 내에서 암 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물의 배합물의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에 따라서, 본 발명은 대상체 내에서 암 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 동시의, 별도의 또는 순차적인 투여를 위한, (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi) 및 (ii) 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물의 배합물의 용도에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가된 효능"은 백신 조성물의 면역원성을 증가시키거나, 백신 조성물에 대한 면역 반응을 증가시키거나, 백신 조성물에 의해 생성된 면역 반응을 증가시키는 것을 지칭한다. 이는 HDACi의 부재하에서 생성된 면역 반응과 비교될 수 있다.

백신 조성물은 대상체가 하나 이상의 목적한 항원(들)에 대한 면역 반응을 개발하도록 하기 위해 의도된 면역원성 성분(element)을 함유한다. 목적한 항원은 면역 반응이 요구되는 임의의 항원이며, 임의의 펩타이드, 자가(예를 들면, 암 세포로부터의 항원) 또는 세균, 바이러스, 또는 기생충 단백질과 같은 외인성으로부터의 단백질, 핵산, 당, 지다당류 등과 같은 다른 종류의 항원을 포함한다.

따라서, 본 발명은 특히 백신 조성물에 대해 면역 반응을 증가시키기 위한, 보조제로서의 HDACi의 용도 뿐만 아니라, 보조제로서 이의 용도를 위한, 또는 백신 조성물에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 HDACi에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체가 목적한 항원(들)에 대해 면역 반응을 개발하도록 의도된, 하나 이상의 목적한 항원(들)을 함유하는 백신 조성물의 제조를 위한 HDACi의 용도에 관한 것이다.

본원에 개시된 방법 및 용도는 백신 조성물이 암 백신 조성물인 경우, 즉, 암 세포에 의해 발현된 목적한 항원(들)을 함유하는 경우 특히 흥미롭다. 특히, 이러한 방법 및 용도는 특히 면역억제성 종양 미세-환경을 지닌 종양에 대해 매우 적합해진다(즉, 사이토킨 및 분자 신호가 발현되고, 암 항원에 대해 면역 세포의 잠재능이 감소되는 면역 내성 세포가 보충된다). 이러한 이론에 얽메이지 않고, HDACi의 존재는 종양 미세-환경을 변형시킬 것이며 면역 세포가 강화되어 아마도 종양 속, 근처 또는 주변에 존재하는 세포 내에서 면역억제성 효과를 갖는 유전자의 발현을 변형시킴으로써, 암 세포와 싸우도록 하는 것으로 추정된다.

본원에 기술된 방법은 또한 백신 조성물의 투여 후 수일 동안 HDACi를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. HDACi의 이러한 연속적인 투여는 면역 세포가 종양을 "장악"할 수 있기에 충분히 긴 시간 동안 미세환경 변형을 유지시키는데 유용할 수 있다. 일반적으로, HDACi의 이러한 추가의 연속 투여는 적절한 용량의 HDACi를, 백신 투여 후 적어도 1일 동안, 및 1개월까지 매일 투여하는 것으로 이루어질 것이다. 그러나, 추가의 HDACi 투여는 적어도 1주, 보다 바람직하게는 적어도 또는 약 2주 동안 수행되는 것이 바람직하다.

백신 조성물은 대상체가 하나 이상의 목적한 항원(들)에 대해 면역 반응을 개발하도록 의도된 면역원성 성분(또한 본원에서 면역원성 화합물로 명명됨)을 함유한다.

면역원성 성분은 항원(또는 다수의 항원)일 수 있다. 이러한 항원은 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 표적 세포(이는 숙주 세포 뿐만 아니라, 세균 세포, 기생충 병원체 또는 바이러스 입자를 포함하는 것으로 의도된다)에 따라서, 임의의 형태일 수 있다. 이는 또한 명반 또는 프로인드 완전 또는 불완전 보조제(Freund's complete or incomplete adjuvant)와 같은 당해 분야에 공지된 임의의 보조제(면역-자극인자)와 함께 제형화될 수 있다.

다른 구현예에서, 면역원성 화합물은 세포 조성물로부터의 추출물이며, 여기서 상기 조성물의 세포는 목적한 항원을 발현한다. 세포 추출물은 원심분리되어 불용성 물질, 예를 들면, 막 단편, 소낭, 및 핵을 제거함으로서 주로 세포질로 이루어진 분해된 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 추출물은 특수한 기술을 사용하여 구체적인 성분이 고갈시키거나 농축되도록 할 수 있다(예를 들면, 초음파처리를 사용하여 거대 막 단편을 추출물 속에 남아있는 작은 입자로 파괴시키거나, 고속 원심분리를 사용하여 가장작은 불용성 구성성분을 제거할 수 있다). 세포 추출물은 압력, 증류, 증발 등에 의해서와 같은 임의의 화학적 또는 기계적 작용에 의해 수득된다.

다른 구현예에서, 면역원성 성분은 세포 조성물이며, 여기서 상기 조성물의 세포는 목적한 항원을 발현한다. 특수한 구현예에서, 세포의 막은 보존된다(따라서 항원의 제시는 MHC-I 경로를 통하여 이루어진다). 특수한 구현예에서, 세포는 후술된 바와 같이 불활성화된다. 특수한 구현예에서, 세포는 후술한 바와 같은 태아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 바이러스-감염된 세포 또는 세균 세포이다. 다른 구현예에서, 면역원성 성분은 목적한 항원에 의해 시험관내에서 프라임된 항원-제시-세포(APC)를 포함하는 세포 조성물이다. 이러한 조성물은 항원 및 항원-제시 세포(APC)로 제조된 항원-제시 세포 백신이다. 항원-제시 세포는 이의 표면 위에서 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 항원을 나타내는 세포이다. 수지 세포(DC)는 헬퍼 및 세포독성 T 세포 둘 다, 대식구, 또는 B 세포에 대해 항원을 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 맥락에서 바람직한, 수지 세포를 언급할 수 있다. 이러한 APC는 천연 세포, 또는 가공된 세포(engineered cell)일 수 있다. 특히 에거몬트(Eggermont) 등의 문헌(Trends in Biotechnology, 2014, 32, 9, 456-465)을 언급할 수 있으며, 이는 인공의 항원-제시 세포를 개발하는데 있어서의 진전을 검토한다. APC를 사용하여 항-암 백신을 개발하는 방법은 당해 분야에서 광범위하게 제안되어 왔으며 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다.

다른 구현예에서, 면역원성 성분은 실제로 항원을 함유하지 않지만, 예를 들면, 목적한 항원을 나타내는 항원-제시-세포(Antigen-Presenting-Cell)에 대한 노출에 의해, 목적한 항원에 대해 시험관 내에서 프라임된 T 세포 림프구의 조성물로 이루어진다. 결과적으로, 이러한 조성물은 목적한 항원에 대해 생체내에서 면역 반응을 개시할 수 있다. 이러한 전략은 "T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)"로 불릴 수 있으며, 이러한 입양적으로 전달된 T 세포는 생체내(in vivo)에서 오랜 기간 동안 지속하며 림프구와 소낭 구획 사이에서 용이하게 이주한다(Bear et al, J Biomed Biotechnol. 2011;2011:417403; Melief et al, J Clin Invest. 2015;125(9):3401-3412).

일부 구현예에서, HDACi는 면역원성 성분을 함유하는 백신 조성물과 함께 투여된다. 상기 투여는 구현예에 대해 후술된 바와 같은, 동시에, 별도로 또는 순차적일 수 있으며 여기서 면역원성 성분은 태아 줄기 세포의 조성물이다. 태아 줄기 세포의 조성물에 대해 개시된, 하기 모든 설명은 상기 개시된 바와 같이, 임의의 면역원성 성분을 포함하는 백신에 동등하게 적용가능함을 주목하여야 한다.

본 명세서는 이러한 태아 줄기 세포가, 위에서 상기시킨 바와 같이, 매우 공격성인 암에서 또한 발견되므로, 태아 줄기 세포의 조성물과 함께, HDAC 억제제(특히 발프로산)을 강조한다. 결과적으로, 면역원성 성분에 상관없이, 목적한 항원이 상기 및 또한 하기에 기술된 바와 같이, 암 세포에 의해 발현된 신생-항원인 경우가 바람직하다.

특수한 구현예에서, 면역원성 성분은 세포 조성물이며, 여기서 태아 세포 조성물은 하기에 상세히 추가로 개시된 바와 같이, 다능성 줄기 세포 및 태아 세포의 불활성화로부터 수득되었다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성 성분"은 면역게를 자극하는 화합물을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 면역원성 성분은:

a. 목적한 항원,

b. 태아 줄기 세포 조성물,

b. 세포 조성물로부터의 추출물(여기서 상기 조성물의 세포는 목적한 항원을 발현한다),

c. 세포 조성물(여기서 상기 조성물의 세포는 목적한 항원을 발현한다),

d. 목적한 항원에 의해 시험관내에서 프라임된 항원-제시 세포를 포함하는 세포 조성물, 또는

e. 목적한 항원을 제시하는 항원-제시 세포에 대한 노출에 의해 목적한 항원에 대해 시험관내에서 프라임된 T 세포 림프구로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특수한 구현예에서, 면역원성 성분은 세포 조성물이며, 여기서 세포 조성물은 다능성 줄기 세포(ESC 및 iPSC)의 시험관내 분화에 의해 수득된다. 보다 특히, 면역원성 성분은 분화에 의해 ESC 및 iPSC로부터 수득된 태아 줄기 세포의 집단이다.

본 발명에 따른 방법에서, 치료는 치료학적 치료이다.

본 발명에 따른 방법에서, 치료는 예방학적 치료이다.

조합된 제제를 사용하여 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법

제2 양태에서, 본 발명은 상기 대상체에게 치료학적 양의 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) 조합 제제로서, MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물을 동시에, 별도로 또는 연속적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

특수한 구현예에서, 세포는 MHC I 경로를 통해 신생-항원을 나타내도록 배양되며, 특히, 집단의 일부 세포는 돌연변이된다. 태아 세포와 함께 사용된 화합물은 다능성 줄기 세포의 다능성을 보호하지 않는다. 특수한 구현예에서, 태아 세포의 투여는 MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시켜 면역 반응을 향상시키는 화합물(바람직하게는 초기에 함께 투여되는 것보다는 동일하지만, 잠재적으로 다른 것)의 투여를 수반한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 예방학적 또는 방지적 치료 뿐만 아니라 치유적 또는 질환 개질 치료, 예를 들면, 유전성 가족 암 증후군과 같은 암을 수축시키는 고 성향의 위험(high predisposed risk)에 처해 있거나 암이 수축된 것으로 예측된 대상체 뿐만 아니라 아프거나 암 또는 의학적 상태로 고생하는 것으로 진단된 대상체의 치료를 지칭하며, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 암을 가지거나 궁극적으로 암을 가질 수 있는 대상체에게 투여됨으로써, 암 또는 재발하는 암의 발병을 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 대상체의 생존을 이러한 치료의 부재하에서 예측된 것 이상으로 연장시킬 수 있다. "치료학적 요법"은 질병의 치료 패턴, 예컨대, 치료요법 동안 사용된 투여 패턴을 의미한다. 치료학적 요법은 유도 요법 및 유지 요법을 포함할 수 있다. 어구 "유도 요법" 또는 "유도 기간"은 질환의 초기 치료를 위해 사용된 치료학적 요법(또는 치료학적 요법의 일부)를 지칭한다. 유도 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 초기 기간 동안 대상체에게 고 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 "부하 요법(loading regimen)"을 사용할 수 있으며(부분적으로 또는 전체적으로), 이는 주치의가 유지 요법 동안 사용할 수 있는 약물의 용량보다 더 많은 용량을 투여하거나, 주치의가 유지 요법 동안에 약물을 투여할 수 있는 것보다 더 빈번하게 약물을 투여하거나, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 어구 "유지 요법" 또는 "유기 기간"은 질병의 치료 동안 대상체의 유지를 위해, 예컨대, 대상체를 오랜기간 동안(수개월 또는 수년 동안) 유지하기 위해 사용된 치료학적 요법(또는 치료학적 요법 중 일부)를 지칭한다. 유지 요법은 연속 치료요법(예컨대, 약물을 규칙적인 간격(예컨대, 매주, 매달, 매년 등)에서 투여하는 것) 또는 간헐적 치료요법(예컨대, 비연속된 치료, 간헐적 치료, 재발시 치료, 또는 특수한 예정된 기준(예컨대, 통증, 질환 징후 등)의 달성 시 치료)를 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시에 투여"는 동일한 경로에 의해서 및 동시에 또는 실질적으로 동시에 2개의 활성 성분의 투여를 지칭한다. 용어 "별도로 투여"는 동시에 또는 실질적으로 동일한 시기에 상이한 경로에 의한 2개의 활성 성분의 투여를 지칭한다. 용어 "순차적으로 투여"는 상이한 시간에 2개의 활성 성분의 투여를 지칭하며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 동물, 예를 들면, 설치류, 고양이과, 개과, 및 비-사람 및 사람 영장류를 지칭한다. 특히, 본 발명에서, 대상체는 태아-유사 줄기 세포 항원의 발현을 갖는 암으로 고통받거나 고통받을 가능성이 있는 사람이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "집단"은 세포의 집단을 지칭하며, 여기서 세포의 총 수 중 대부분(예컨대, 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 90%)은 목적한 세포의 구체적인 특성(예컨대, 태아 줄기 세포 마커)를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "태아 줄기 세포의 집단"은 조기 발달 단계 동안에 나타나는 일시적인 선조세포인 태아 세포의 집단을 지칭한다. 이러한 유형의 집단은 동종이계, 이종이계 또는 동계의 다능성 줄기 세포(ESC 및 iPSC)의 분화에 의해 시험관내에서 재생산될 수 있다. 태아 집단 세포는 다음의 유전자 중 적어도 20% 상실인 다능성과 관련된 유전자의 상실에 의해 특징화된다: NACC1, BLM, WDR33, DAZAP1, CDK1, CDC45, ZNF165, XRCC5, SMARCAD1, AIMP2, CKS1B, NANOG, ZFP42, U2AF1, CCNB2, DCTPP1, TGIF1, SUPT3H, AURKB, GEMIN7, SRSF1, PNP, SIGLEC12, POU5F1, PSMA3, RMND5B, GDF9, STXBP2, BAG6, GMPS, PCNA, NME1, POP7, RCHY1, SMARCC1, HNRNPK, PTMA, NPM1, SNRPA, MYBBP1A, CDT1, HSPD1, TRIM28, PHF10, GRB7, HSPE1, DAXX, FAM136A, KPNA2, FUS, PNN, RFC3, HPRT1, PA2G4, SNRPE, RBPMS, PRMT5, PIAS2, BYSL, POLD2, LSM5, TDGF1, NOP56, EPPK1, TARBP2, MRE11A, CDC7, SRSF3, TNNI3, NUDT1, DIAPH1, PPID, CDA, GADD45A, MCM6, SNURF, CDC25C, TNFRSF8, STIP1, ACTA1, POLR1D, TUBA3C, RPA1, VAMP8, UNC119, COIL, BIK, PARP1, SP1, CHEK2, NLE1, RPA2, HDAC1, KPNB1, LSM7, TMSB4Y, HMGA1, POLR1C, LSM1, EXO1, MCM5, ITGB3BP, LSM6, UNG, PSMA6, CCNE1, SMNDC1, SET, FKBP3, TK1, CTBP2, POLQ, PLSCR1, GMNN, RND1, NUP153, PHGDH, SNRPB, HSPA14, HSPH1, TCOF1, ANP32A, PELP1, MBD2, HIST1H2BC, TMPO, SPAG5, DNMT3B, LCK, ARMC6, COPS6, MCM3, PPAP2C, LSM4, NME1-NME2, EWSR1, POLG2, BCL2, NFKBIB, SALL4, PXN, EXOSC8, HSPA2, HMGB1, RUVBL1, GOT2, PPM1B, ATIC, DHCR24, APEX1, RFC2, WDYHV1, NTHL1, EXOSC7, SNRPD1, DPPA2, MRPS12, FBL, POLD1, MCM10, EXOSC3, NOP58, TPX2, PAK3, HNRNPAB, ANXA2, BUB1B, SEPHS1, WDR77, LUC7L3, VASP, MCM4, PAK1, PMAIP1, PBX1, NOLC1, PCYT1B, NCL, ORC6, GPRIN2, ORC1, RAD51, HSPA8, ANXA3, NUP50, SNRPC, HAUS1, MATK, BIRC5, MYC, GEMIN6, PSIP1, DSCC1, STRBP, SMN1, EXOSC9, TOE1, GEMIN2, TRIP13, ORC2, MSH3, MNAT1, KIT, RFC5, FOXO4, AATF, RBM14, ZNF281, NPPB, RPA3, APOE, PFDN6, COPS3, CCND1, CXADR, MCM2, ANAPC1, SUMO1, SSB, HSP90AB1, TRAIP, PHC1, LRIF1, LSM3, SNRPN, RPP40, MSH2, FBP1, PFN1, OTX2, STX3, STXBP3, GTF2H2, ELAC2, TCERG1, ERCC5, PASK, ZNF593, PSME3, WRN, ARID3B, ERBB3, POP1, KAT7, PTPN6, SYNCRIP, SIRT1, SLC19A1, ARL4A, CEBPZ, MSH6, AURKA, BAK1, MTHFD1, HSPA9, MYBL2, POP5, RFC4, CHEK1, BCCIP, SOCS1, PHB, PMF1, MPP6, NOC2L, HDAC2, CENPE, RECQL4, CASP6, GNL3, SRSF2, BRIX1, MYB, RNMTL1, DHFR, FEN1, SNRPF, MUTYH, PRNP, MT1G, PSMD11, GAR1, DDX11, FUBP1, CDK7, WRAP73, CASP9, RASL11B, CHAF1A, CCNB1, CKS2, CCNA2, PPAN, WEE1, TP53, HMMR, TDP2, RAD9A 또는 RAD54L. 특히, 태아 줄기 세포는 또한 성체 분화된 세포의 계통 특이적인 유전자의 발현의 부재에 의해 특징화된다.

특수한 구현예에서, 태아 줄기 세포의 집단은 탈-분화 과정에 의해 또는 소 분자를 사용하는 트랜스-분화(trans-differentiation) 기술에 의해 및/또는 특수한 전사 인자의 과발현에 의해 수득될 수 있다. 이러한 명명법 ≪ 유도된 태아 집단 세포 ≫는 태아 유전자의 획득에 의해 및 성체 세포의 계통 특이적인 유전자의 상실에 의해 특징화된다. 모든 태아 집단 세포는 각각 3개의 배아 층, 외배엽, 내배엽 및 중배엽 선조세포에서 기원한다. 이러한 태아 유전자는 다음과 같이 나타낸다:

1) 내배엽 선조 세포에서는, 적어도 SOX17, CXCR4, FOXA1, FOXA2, FOXA3, HHEX, GATA4, GATA6, HNF1B, HNF4A, TF, ALB, TBX3, AFP, TTR, CER1, MIXL1, LHX1, GSC, PAX9, NEPN, SHH, PYY, MNX1, KITL, CLDN4, CLDN8, GFPT2, KRT19, SORCS2, EPPK1, NEDD9, PLAT, VTN, PDX1, TMPRSS4, CLIC6, RIPK4, CLDN8, ST1A으로 나타내어지고;

2) 외배엽 선조 세포에서는, 적어도 PCGF4, PAX6, PAX7, CXCR4, SOX1, SOX2, SOX10, ITGB1, FABP7, NES, FUT4, PROM1, MELK, MSI1, MAP2, DCX, NCAM1, TUBB3, SLC1A3, CD44, S100B, VIM, GFAP, CNP, OLIG2, CA2, CSPG4, TAZ, MSX1, SPARC, ID2, NES, NKX2.2, NKX6-1, FOXP2, FOXD3, ZIC1로 나타내어지며;

3) 중배엽 선조 세포에서는, 적어도 Brackury(T), MIXL1, SNAI1, SNAI2, HLX, EOMES, MESP1, MESP2, TBX6, MEST, NKX2-5, KDR로 나타내어진다.

전형적으로, 태아 집단 세포는 성체 단계에서 발현되지 않는 태아 발달 유전자를 발현한다. 이러한 태아 유전자는 수임된 태아 세포 계통(committed fetal cellular lineage) 또는 분화된 조직, 예를 들면, 3D 오가노이드 구조 또는 배아체 또는 회전타원체 또는 세포 응집체에 연결되어 있다. 이러한 태아 세포는 신경 줄기 세포, 뉴우런, 간세포-유사 세포, 간모세포, 내프론 신장 선조세포, 췌장 내배엽 선조세포, 담관세포, 조혈 선조세포, 혈관모세포, 간엽성 줄기 세포, 내피 세포, 심근세포, 신경관 선조세포(neural crest progenitor), 유선 상피 세포, 장 또는 결장 오가노이드, 폐 오가노이드, 신장 오가노이드, 뇌 오가노이드일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성"은 적절한 조건 하에서, 특수한 세포 계통 특성을 지닌 3개의 배아 층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽)으로부터 기원한 모든 세포형으로 분화할 수 있는 자손을 생성하는 능력을 지닌 세포를 지칭한다. 용어 "다능성"은 정상의 배아 줄기 세포(ESC), 또는 성체 체세포(ASC)의 모든 공급원 및 세포 기원으로부터 재프로그램된, 매우 작은 배아-유사 줄기 세포(VSEL) 또는 가공된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다.

다능성 줄기 세포는 출산전, 출산후 또는 성체 유기체의 조직의 태아 발달에 기여한다. 표준의 당해 분야에 허용된 시험을 사용하여 세포 집단의 다능성, 예를 들면, 8 내지 12주령 SCID 마우스 내 기형종, 및 다양한 다능성 줄기 세포 특성을 확립시킨다. 보다 구체적으로, 사람 다능성 줄기 세포는 다음의 비-제한적인 목록으로부터의 마크의 적어도 일부(적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 4개 또는 5개), 및 임의로 모두를 발현한다: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, 알칼린 포스파타제(ALP), Sox2, E-카드헤린, UTF-I, Oct4, Lin28, Rex1, Nanog, TERC, TERT.

다능성 줄기 세포는 전통적으로 배아 발달의 미분화세포는 배아 발달의 미분화세포 단계로부터 발생하며 아마도 태반을 제외하고는 모든 유형의 태아 및 성체 세포로 발달하는 능력을 갖는다. 배아 다능성 줄기 세포(ESC)는 일반적으로 수정 후 4 내지 5일된 50 내지 150개 세포의 배반포로부터 단리될 수 있다. ESC는 생체외(ex vivo)에서 무한히 증식할 수 있지만, 이들은 배발생 동안 생체내에서 일시적으로만 존재한다. 다양한 동물(사람 포함) ESC 세포주, 예를 들면, NIH 승인된 세포주 WAO9 사람 ESC는 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 사람 ESC 세포주, 예를 들어, Cecol-14는 예를 들면, 세콜페스, 보고타, 콜롬비아로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 물론, 다른 배아 줄기 세포주를 경우에 따라 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배아 줄기 세포"는 사람의 다능성 세포(즉, hESC)를 지칭한다. hESC는 예비-배반포 단계 배아로부터 단리된다. 다른 구현예에서, hES 세포는 적어도 부분적으로 분화된 세포(예컨대, 다능성 세포)의 탈분화에 의해 제조되며 실제로 분화전능성이다. hESC를 제조하는 방법은 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호, 제7,029,913호, 제5,453,357호, 제5,690,926호, 제6,642,048호, 제6,800,480호, 제5,166,065호, 제6,090,622호, 제6,562,619호, 제6,921,632호, 및 제5,914,268호, 미국 공개 특허원 제2005/0176707호, 국제 출원 제WO2001085917호에 교시되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 사람 배아 줄기 세포(hESC)는 Chung et al 2008에 기술된 기술에 따라 배아 파괴없이 생성된다.

특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 태아 집단 세포는 시험관내 방법, 예를 들면 ESC 및 iPSC와 같은 다능성 줄기 세포의 분화에 의해 수득된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도된 다능성 줄기 세포"는 당해 분야에 공지되고 야마나카(Yamanaka)(특히 제WO2012/060473호, 제PCT/JP2006/324881호, 제PCT/JP02/05350호, 제US 9,499,797호, 제US 9,637,732호, 제US 8,158,766호, 제US 8,129,187호, 제US 8,058,065호, 제US 8,278,104호)에 초기에 개시된 방법을 사용하여, 재프로그래밍 과정에 의해 비-다능성 세포로부터 인공적으로 유래된 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 짧게 말해서, 체세포는 Oct4, Sox2, Klf4 and c-My, 또는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nanog와 같은 정의된 인자의 이소성 발현(ectopic expression)에 의해 유도된 다능성 줄기 세포로 재프로그램화된다. 특수한 구현예에서, 유도된 다능성 줄기 세포는 포유동물, 특히(이에 한정되지 않는) 설치류, 돼지, 고양이, 개, 및 비-사람 영장류, 및 사람으로부터 유래한다.

iPSC는 다양한 기원(섬유아세포, 혈액 세포, 각질형성세포…)로부터 및 다양한 질환, 예를 들면, 체강 암 또는 유전성 암(백혈병, 교아종, 흑색종, 유방암,..) 및 유전 질환으로부터 성공적으로 생성되었다. 세포 재프로그램화는 작은 화학적 화합물을 사용하거나 사용하지 않는 다양한 기술(예를 들면, 통합성 렌티바이러스/레트로바이러스 및 비 통합성 벡터, 예를 들면, 센다이 바이러스(sendai virus), 에피솜 벡터, 합성 mRNA, 아데노바이러스, rAAV, 재조합 단백질…)에 의해 수행될 수 있다. 소 분자는 후생적 변형인자로서 작용함으로써(즉, 일부 유전자의 발현을 변형시킴으로써) 마우스 및 사람 iPSC의 유도 및 품질을 향상시키는데 사용될 수 있다.

나타낸 바와 같이, BIX01294(BIX, G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제), 나트륨 부티레이트(NaB, 히스톤 데아세틸라제 HDAC 억제제) 또는 S-아데노-실호모시스테인(sylhomocysteine)(SAH, DNA 탈메틸화제), 5-아자사이티딘(5-AZA, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제), 발프로산(VPA, 다른 히스톤 데아세틸라제 억제제)은 또한 정상의 iPSC의 재프로그래밍 및 품질을 증진시킨다. 완전히 재프로그램화된 선의의(bona-fide) iPSC는 자가 재생능으로 배아 줄기 세포보다 유사하게 다능성인 유전자를 발현하며 제한되지 않은 줄기 세포(또는 줄기 세포 유사체) 자원을 나타낸다. ESC 및 IPSC는 다수의 및 제한된 계대배양 동안 반복적으로 증폭되어 확장가능한 줄기 세포 자원을 허용한다. 다능성 잠재능은 다능성 유전자의 고 수준 발현을 보존함으로써, 허용되는 배양 조건에서 활성적으로 유지된다. 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 특수한 배양 조건 및 방법은 안정한 게놈을 복제하도록 하지만, 그럼에도 불구하고, 일부 엑솜 돌연변이 및 후생유전자 변형이 기술되어 있다(Gore A and al. Nature 2011).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "체세포"는 생식계열 세포(정자 및 난자)를 제외하고는 신체의 임의의 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이형 세포(allogeneic cell)"는 동일한 종으로부터 그러나 유전적으로 명백한 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동계 또는 자가 세포"는 동일한 종 및 동일한 유전적 배경으로부터의 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 세포"는 상이한 종으로부터 및 유전적으로 명백한 세포를 지칭한다. 특수한 구현예에서, 줄기 세포는 포유동물로부터 유래할 수 있지만 설치류, 돼지, 고양이, 개, 및 사람을 포함하는 영장류에 한정되지 않는다.

태아 줄기 세포 조성물을 생산하는 방법:

제3 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 태아 세포 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다:

· i) 다능성 줄기 세포 분화 후 상기 집단 내에서 항원의 MHC-I 제시를 유도하는 제제의 존재하에서 태아 줄기 세포를 제조하는 단계,

· ii) 세포를 불활성화시킬 불활성화제에 태아 줄기 세포를 노출시키는 단계,

· iii) 분화되고 불활성화된 태아 줄기 세포를 회수하고 조건화(conditioning)하는 단계.

구체적인 구현예에서 태아 줄기 세포 엔벨로프 통합성(envelope integrity)은 단계 ii)에서 유지된다. 다른 구현예에서, 태아 줄기 세포는 불활성화되며 세포 유래된 생성물, 예를 들면, 세포 추출물이 수득된다. 상기 방법에 따라 생산된 세포 조성물은 본원에 개시된 방법에 따라 암 치료용으로 사용될 수 있다.

태아 줄기 세포의 제조 단계:

태아 줄기 세포 또는 태아 오가노이드는 전통적인 방법(예컨대, 2D 또는 3D 배양 시스템에서 소 분자, 형태형성 및 성장 인자를 사용하는 정의된 배양 조건에서)에 의해, 분화를 유도한 후 다능성 줄기 세포로부터 수득된다. 태아 줄기 세포 또는 오가노이드는 다능성 마커를 상실한다. 전형적으로, 태아 줄기 세포 또는 오가노이드는 다능성의 특징인 다음의 유전자 중 적어도 20%를 고갈한다: NACC1, BLM, WDR33, DAZAP1, CDK1, CDC45, ZNF165, XRCC5, SMARCAD1, AIMP2, CKS1B, NANOG, ZFP42, U2AF1, CCNB2, DCTPP1, TGIF1, SUPT3H, AURKB, GEMIN7, SRSF1, PNP, SIGLEC12, POU5F1, PSMA3, RMND5B, GDF9, STXBP2, BAG6, GMPS, PCNA, NME1, POP7, RCHY1, SMARCC1, HNRNPK, PTMA, NPM1, SNRPA, MYBBP1A, CDT1, HSPD1, TRIM28, PHF10, GRB7, HSPE1, DAXX, FAM136A, KPNA2, FUS, PNN, RFC3, HPRT1, PA2G4, SNRPE, RBPMS, PRMT5, PIAS2, BYSL, POLD2, LSM5, TDGF1, NOP56, EPPK1, TARBP2, MRE11A, CDC7, SRSF3, TNNI3, NUDT1, DIAPH1, PPID, CDA, GADD45A, MCM6, SNURF, CDC25C, TNFRSF8, STIP1, ACTA1, POLR1D, TUBA3C, RPA1, VAMP8, UNC119, COIL, BIK, PARP1, SP1, CHEK2, NLE1, RPA2, HDAC1, KPNB1, LSM7, TMSB4Y, HMGA1, POLR1C, LSM1, EXO1, MCM5, ITGB3BP, LSM6, UNG, PSMA6, CCNE1, SMNDC1, SET, FKBP3, TK1, CTBP2, POLQ, PLSCR1, GMNN, RND1, NUP153, PHGDH, SNRPB, HSPA14, HSPH1, TCOF1, ANP32A, PELP1, MBD2, HIST1H2BC, TMPO, SPAG5, DNMT3B, LCK, ARMC6, COPS6, MCM3, PPAP2C, LSM4, NME1-NME2, EWSR1, POLG2, BCL2, NFKBIB, SALL4, PXN, EXOSC8, HSPA2, HMGB1, RUVBL1, GOT2, PPM1B, ATIC, DHCR24, APEX1, RFC2, WDYHV1, NTHL1, EXOSC7, SNRPD1, DPPA2, MRPS12, FBL, POLD1, MCM10, EXOSC3, NOP58, TPX2, PAK3, HNRNPAB, ANXA2, BUB1B, SEPHS1, WDR77, LUC7L3, VASP, MCM4, PAK1, PMAIP1, PBX1, NOLC1, PCYT1B, NCL, ORC6, GPRIN2, ORC1, RAD51, HSPA8, ANXA3, NUP50, SNRPC, HAUS1, MATK, BIRC5, MYC, GEMIN6, PSIP1, DSCC1, STRBP, SMN1, EXOSC9, TOE1, GEMIN2, TRIP13, ORC2, MSH3, MNAT1, KIT, RFC5, FOXO4, AATF, RBM14, ZNF281, NPPB, RPA3, APOE, PFDN6, COPS3, CCND1, CXADR, MCM2, ANAPC1, SUMO1, SSB, HSP90AB1, TRAIP, PHC1, LRIF1, LSM3, SNRPN, RPP40, MSH2, FBP1, PFN1, OTX2, STX3, STXBP3, GTF2H2, ELAC2, TCERG1, ERCC5, PASK, ZNF593, PSME3, WRN, ARID3B, ERBB3, POP1, KAT7, PTPN6, SYNCRIP, SIRT1, SLC19A1, ARL4A, CEBPZ, MSH6, AURKA, BAK1, MTHFD1, HSPA9, MYBL2, POP5, RFC4, CHEK1, BCCIP, SOCS1, PHB, PMF1, MPP6, NOC2L, HDAC2, CENPE, RECQL4, CASP6, GNL3, SRSF2, BRIX1, MYB, RNMTL1, DHFR, FEN1, SNRPF, MUTYH, PRNP, MT1G, PSMD11, GAR1, DDX11, FUBP1, CDK7, WRAP73, CASP9, RASL11B, CHAF1A, CCNB1, CKS2, CCNA2, PPAN, WEE1, TP53, HMMR, TDP2, RAD9A 또는 RAD54L.

MHC I 항원 제시를 위한 제제

가공된 iPSC 또는 ESC 세포로부터 수득된 바와 같은 태아 줄기 세포 또는 오가노이드는 분화 후, MHC I 경로를 통해 항원의 제시를 증진시킬 제제의 존재하에서, 유지된다. 이러한 증진된 발현은 제제의 존재 또는 부재하에서 세포의 표면에서 MHC I 분자의 수를 비교함으로써 점검할 수 있다.

이러한 제제는 당해 분야에 공지되어 있으며 특히 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi)를 언급할 수 있다. 이러한 활성을 갖는 다수의 생성물은 이러한 HDACi 중에서 당해 분야에 공지되어 있으며, 특히 발프로에이트(VPA 또는 발프로산, CAS 번호 99-66-1)를 언급할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 HDACi(이들은 VPA보다 동일한 작용 방식을 갖기 때문임)는 특히 보리노스타트, 로미뎁신 키다미드, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 파노비노스타트, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, SB939, 레스미노스타트, 기비노스타트 또는 퀴시노스타트이다.

이러한 제제는 태아 줄기 세포에 대해 허용되는 세포 배양 배지 속에 및 다능성 줄기 세포 분화 후에 존재한다.

태아 세포의 불활성화 단계

본 발명에서 사용되는 태아 줄기 세포는 불활성화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불활성화된", 및 이의 문법적 변형은 살아있지만 증식할 수 없도록 된(즉, 유사분열적으로 불활성인) 세포를 지칭한다. 당해 분야의 기술자는 화학제(chemical agent)에 대한 노출, 조사(irradiation) 및/또는 동결건조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 태아 줄기 세포는 불활성화됨으로써 대상체에게 투여 시 태아 세포는 분열할 수 없으므로 대상체 내에서 태아 조직을 형성할 수 없다. 다수의 세 맥락에서, 모든 세포는 증식할 수 없음이 요구되지 않음이 이해된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이 어구 "대상체 내에서 조직 형성을 방지하기에 충분한 정도로 불활성화된"은 전체적으로 대상체에게 투여 후, 조사된 태아 줄기 세포가 시험관내 배양에 의해 확인되는 바와 같이 더 이상 분열할 수 없도록 하는 집단 내 불활성화 정도를 지칭한다. 다수의 세포 내 하나 이상의 세포가 실제로 대상체 내에서 증식할 수 있는 경우에도, 숙주의 면역계는 태아 조직이 형성될 수 있기 전에 이러한 세포를 파괴할 것으로 추정된다. 이러한 증식 및 조직 형성의 불능은 기능성 및 비-기능성 면역계를 갖는 마우스 내에서 시험함으로써 확인할 수 있다.

일부 구현예에서, "불활성화된" 세포는 사멸된 세포이다. 다른 구현예에서, 불활성화된 세포는 전체 세포 분해물, 태아 줄기 세포 또는 오가노이드 유래된 엑소좀, 농축된 암 줄기 신생-항원, 전체 정제된 암 줄기 신생-항원, DNA, mRNA 및 단백질 추출물, 동결건조된 전체 세포 현탁액, 막 분획과 같은 세포 분해물의 분획, 세포질 분획, 또는 이의 조합물이다. 불활성화된 태아 줄기 세포는 마우스의 예방접종이 발프로산 또는 다른 HDACi와 함께 태아 줄기 세포로 수행되는 경우 면역 반응을 자극할 수 있도록 남는다. 이러한 예방접종은 또한 부작용 및 자가면역 질환의 증거없이 암종에 대해 효율적인 면역 및 항-종양 반응을 유도할 수 있다.

전형적으로, 태아 줄기 세포를 불활성화하기 위하여, 이들은 치사 선량(lethal dose)의 방사선(예컨대, 5 내지 100 Gy 단일 분획)에 노출될 수 있다. 태아 세포에 전달된 정확한 방사선량 및 선량 길이는 세포가 생존불가능하게 남아있는 한 중요하지 않다.

세포의 회수 및 조건화 단계

방법의 회수 단계는 세포 배양물의 세척 및 세포를 임의의 적절한 배지, 예를 들면, 임의의 임상 등급의 세포 배지 속에 재현탁시키는 하나(또는 다수의) 단계(들)을 포함한다. 세포의 조건화는 세포를 동결시키거나 동결건조시켜, 사용 전에 세포 조성물을 저장할 수 있도록 함을 포함할 수 있다.

태아 줄기 세포의 돌연변이 및 신생-항원의 발현 단계

다능성 세포는 유전적으로 매우 안정한 세포임이 상기된다. 실제로, 이들은 배아 발달 공정에서 매우 조기에 존재하며 이들은 배아 발달을 위해 증가하여야 하므로, 이러한 세포가 돌연변이되기 쉽지 않아서, 배아 속에서 동질성을 가져야 함이 중요하다.

결과적으로, 다능성 세포의 집단 속에 존재하는 세포는 일반적으로 이들의 유전 내용물을 고려하는 경우 매우 균일하다(즉, 집단의 세포의 95% 이상이 동일한 유전적 배경을 나타낸다).

iPSC를 제조하는 경우, 일부 세포의 선택적인 장점은 다수의 계대배양 동안 발생하며, 이는 말기 계대배양에서 특수한 돌연변이를 나타내는 iPSC 클론의 집단을 생성하지만, 세포 게놈의 서열은 100%에 매우 근접한다.

그러나, 수회의 계대배양 후, iPSC는 hESC로서 안정하다(Hussein SM and al, Nature 2011). 배양-유도된(조정된) 돌연변이는 장기간 배양 시 극소수의 유전적 변화로 획득될 것이다(Hussein SM and al, Bioessays, 2013).

그러나, 처리된 세포 물질 상에서 배아 신생-항원의 다양성을 증가시키기 위하여 다능성 줄기 세포 내에서 돌연변이를 유도할 수 있는 것이 유리하다. 돌연변이된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 줄기 세포는 대부분 공격성 암에서 발견되는 조직 특이적인 태아 신생-항원에 사용된다. 이러한 방식으로, 이는 면역계에 대한 가능성을 증가시켜 이러한 돌연변이된 태아 세포로 나타낸 태아 신생-항원에 대해 T 세포를 생성시키고, 암 세포 뿐만 아니라 종양의 성장 동안 말기 변이를 겪을 수 있는 것들과 싸울 수 있는 면역계에 대한 가능성을 증가시킬 것이다.

이는 암 줄기 세포의 증식 및 진행 동안 DNA 복제 오류 및/또는 환경적 손상으로부터 생성된 체세포 유전적 변경의 축적으로부터 야기되는 암과 싸우는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 변경은 발암 및 게놈 탈안정화 돌연변이를 개시하는 암 드라이버 돌연변이(cancer driver mutation)를 포함한다. 이러한 증가된 게놈 불안전성은 클론 진화를 야기하여 증가된 약물 내성을 지닌 보다 공격적인 클론의 선택을 초래한다.

따라서, 세포는 돌연변이 유인제, 즉, 유기체의 유전 물질, 일반적으로 DNA를 변화시킴으로써 천연 배경 수준 이상으로 돌연변이 빈도를 증가시키는 물리적 또는 화학적 제제에 노출될 수 있다.

돌연변이유발원(mutagen)은 물리적 돌연변이유발원 및 화학적 돌연변이유발원으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:

물리적 돌연변이유발원 중에서, 다음을 언급할 수 있다:

- DNA 절단 및 다른 손상을 유발할 수 있는 X-선, 감마선 및 알파 입자와 같은 이온화 방사선. 특히 코발트-60 및 세슘-137로부터의 방사선을 언급할 수 있다. 조사 선의 수준은 세포 불활성화를 위해 사용된 것보다 훨씬 낮아야 하며 당해 분야의 기술자에 의해 설계될 수 있다;

- 파장이 260 nm를 초과하는 자외선 방사선(이는 교정되지 않고 남는 경우 복제시 오류를 유발할 수 있다);

- 방사성 붕괴, 예를 들면, DNA 내 14C.

화학적 돌연변이유발원 중에서, 다음을 언급할 수 있다:

- 반응성 산소 종(ROS), 예를 들면, 슈퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼, 과산화수소;

- 탈아민화제, 예를 들면, 사이토신을 우라실로 전환시킴으로서 전이 돌연변이를 유발할 수 있는 질산;

- 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(PAH)(이는 디올-에폭사이드에 대해 활성화되는 경우 DNA에 결합할 수 있다);

- 알킬화제, 예를 들면, 에틸니트로소우레아(ENU, CAS 번호 759-73-9), 머스타드 가스 또는 비닐 클로라이드;

- 방향족 아민 및 아미드, 예를 들면, 2-아세틸아미노플루오렌;

- 식물로부터의 알칼로이드, 예를 들면, 빈카 종(Vinca species)으로부터의 것;

- 브롬 및 브롬을 함유하는 일부 화합물;

- 나트륨 아지드;

- 블레오마이신;

- 자외선 방사선과 조합된 소랄렌;

- 벤젠;

- 염기 유사체(이는 복제 동안 DNA 염기를 치환시켜 전이 돌연변이를 유발할 수 있다);

- 인터컬레이팅제(Intercalating agent), 예를 들면, 에티디움 브로마이드, 프로플라빈, 다우노루비신;

- 금속, 예를 들면, 돌연변이유발원성일 수 있는 비소, 카드뮴, 니켈 및 이들의 화합물.

특수한 구현예에서, 다능성 세포의 집단을 수득할 것이며, 여기서 세포는 무작위 돌연변이(일반적으로 세포 간에 상이함으로써, 이종 집단을 야기한다), 특히, 암 관련된 신생-항원을 갖는다.

본 발명자는 DNA 손상-의존성 세포자멸사를 개시하지 않고 다능성 줄기 세포 내에서 DNA 복제 오류를 유도할 수 있도록 하는 배양 조건을 설계하는 것이 가능함을 밝혀내었다.

이는 상기 나타낸 바와 같이, 배아형성의 조기 단계 동안에 돌입된 돌연변이가 가능한 적은 수로 존재하기 때문에 다능성 세포가 자연히 매우 안정하므로, 특히 놀라운 것이다. 이로부터 DNA 복구 머쉬너리(repair machinery)가 이러한 세포 내에서 매우 효율적이어서, 이러한 결함을 교정할 수 없는 경우에, 대부분의 결함을 교정하고/하거나 세포자멸사를 유도함이 야기된다.

특수한 구현예에서, 출발 집단의 다능성 줄기 세포는 확장되고 2D 또는 3D 오가노이드 배양 시스템(당해 분야에 공지된 바와 같음) 내에서 허용되는 배지를 사용하여 태아 계통으로 분화되어 태아 특이적인 조직 발달을 유도한다. 이러한 조건에서, 일반적으로 소량의 엑솜 돌연변이(엑솜당 5 내지 10개의 돌연변이)를 관찰할 수 있다.

이후에, 다능성 줄기 세포는 시험관내에서 돌연변이유발 화합물 방법으로 배양하여, 상기 나열된 것과 같은, 다능성 줄기 세포 내에서 게놈 불안전성을 유발시키고 증가시킨다. DNA 손상은 이중 가닥 브레이크(Double-Strand Breaks (DSB)에 대한 마커로스 γH2AX의 인산화에 의해 잘 확인된다. γH2AX 양성 세포의 비율 및 γH2AX 초점의 빈도 둘 다는 ESC 또는 IPSC 뿐만 아니라 게놈 불안전성의 마커로서 보다 높은 수의 미세핵 내에서 증가하였다. 돌연변이된 다능성 줄기 세포는 이후에 증폭되고 2D 또는 3D 오가노이드 배양 시스템의 태아 계통 내로 분화되어 태아 특이적인 조직 발달을 유도한다. 분화 동안에, 체세포 돌연변이의 세트는 태아 세포 내에서 선택적으로 발현된다. 이러한 세포 또는 계통 특이적인 체세포 돌연변이는 성장 및 생존 장점을 촉진시키며 계통에 대해 특이적이다.

일 구현예에서, 분화 후 수득된 태아 세포는 또한 체세포 돌연변이를 유도하는 돌연변이 화합물과 함께 시험관내에서 배양시킬 수 있다.

바람직한 제제는 블레오마이신, ENU, 알킬화제, 악티노마이신 D, ROS-조절제, UV, H2O2, 이온화 방사선(감마선, X 선)이며, 이는 모두 배양 동안 축적되는 다능성 줄기 세포 내 돌연변이 율의 유도 및 향상을 허용한다.

특수한 구현예에서, N-에틸-N-니트로소우레아(ENU)는 <50 μg/ml의 용량에서 적어도 7 내지 60일 동안의 장기간 배양 동안 처리된 다능성 줄기 세포 내에서 신규한 돌연변이를 생성하고 신생-항원의 수준을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 태아 줄기 세포내에서 선택적으로 발현된 이러한 체세포 돌연변이는 암에서 보고된 것과 유사하다. 따라서, 특히 세포를 배지 속에서 HDACi와 함께 배양하는 경우 세포의 다능성을 유지하면서, 장기간 배양 시 선택적인 장점으로부터 높은 돌연변이율로 다능성 줄기 세포 내에서 DNA 손상에 대한 반응 시 돌연변이의 다양성을 축적하는 것이 가능하다. HDAC의 존재는 배양물 속에서 활성 히스톤(H3K4me3 및 H3K9ac) 증가를 보존한다. 분화 후, 돌연변이된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 세포는 허용되는 배양 배지 및 HDACi 속에서 유지된다. 고 수준의 신생-항원을 발현하는 세포는 돌연변이되지 않은 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 세포와 비교된다.

본원에 기술된 다른 구현예, 조성물 및 방법에서, 돌연변이는 세포를 고 수준의 게놈 불안전성을 촉진하는 유전자를 사용한 유전적 변형을 통해 다능성 줄기 세포 내에서 유도된다. 특히, 적절한 억제제, 예를 들면, NER/BER/DSBR/MMR 억제제를 사용하여, DNA 복구 및 복제에 관련된 유전자 또는 신호전달 경로(signaling pathway)의 활성을 결실시키거나 감소시킬 수 있다. 증가된 DNA 손상과 연결된 게놈 불안전성을 유도하는 이러한 방법은 "벡터"를 사용하거나 DNA 손상 관련된 유전자 또는 신호전달 경로, 예를 들면, DNA 폴리머라제 델타 복합체, 미스매치 복구(MMR), 염기 절개 복구(BER), 뉴클레오타이드 절개 복구(NER), 상동성 재조합(HR), DSBR 또는 NEJH를 불활성화시키거나 녹 다운(knock down)시키는 "유전적 변형"에 의해 수행할 수 있다. DNA 복구 유전자의 다른 예는 DNApkC, Ku70, Rad 51, Brca1 또는 Brca2이다.

다른 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 변형되어 유전적 변형 또는 화학적 p53, 예를 들면, 피피트린-mu, 누틀린(Nutlin)-3에 의해, 또는 세포 생존을 향상시키는 화합물, 예를 들면, Y-27632, p160-Rho-관련 코일된 키나제(p160-Rho-associated coiled kinase: ROCK)를 사용함으로써 세포자멸사-관련 유전자, 예를 들면, p53을 억제하도록 한다.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포의 집단은 다음에 연결된 게놈 변경을 이미 함유한 환자로부터 단리된 세포와 같은 체세포로부터 생성되었다:

i) DNA 복구 질환, 예를 들면, 모세혈관확장성 운동실조(Ataxia telangiectasia), 블룸 증후군(Bloom syndrome), 코케인 증후군(Cockayne's syndrome), 판코니 빈혈(Fanconi's anaemia), 베르너 증후군(Werner syndrome), 색소 피부건조증(Xeroderma pigmentosum), 니즈메겐 파괴 증후군(Nijmegen breakage syndrome);

ii) 게놈 불안전성을 지닌 유전성 가족 암 증후군, 예를 들면, 린치 증후군(Lynch syndrome)(MMR 유전자 내에 돌연변이, 예를 들면, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, 및 PMS2를 지닌 유전성 비-폴립증 결장직장암), TP53 유전자 또는 CHEK2 내에 돌연변이를 지닌 리-프라우메니증후군(Li-Fraumeni), BRCA1/2 유전자 내에 결실 또는 돌연변이를 지닌 유전성 유방 및 난소암(HBOC) 증후군, APC 유전자 내에 돌연변이를 지닌 가계성 대장 폴립증(familial adenomatous polyposis: FAP); c-Met 돌연변이를 지닌 신장 세포 암종; RET 돌연변이를 지닌 중상 갑상선 암;

iii) 전좌(T 9;22), Jak 돌연변이를 지닌 CML에서와 같은 체세포 종양유전자 유발된 게놈 불안전성.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 질환에 연결된 게놈 변경을 함유하는 체세포로부터 유래된다. 전형적으로, 게놈 변경은 전좌(t9:22), 결실(BRCA1/2) 또는 돌연변이(BRCA, RET, c-Met)이다. 이러한 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 줄기 세포는 태아 수준에서 게놈 변경을 재생산한다.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포(iPSC)의 집단은 암 세포주 또는 환자-특이적인 암 세포로부터 생성된다. 유래된 태아 줄기 세포 또는 오가노이드는 원발성 암에서 보고된 것과 유사하게, 태아 수준에서 암 표현형 및 유전형을 재생산한다. 다른 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 유전적으로 변형되어 <<벡터>>를 사용함으로써 다수의 비-무작위 암 줄기 관련 신생 항원을 과발현한다. 특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포, 태아 줄기 세포 또는 오가노이드의 집단은 유전적으로 변형되어 "게놈 편집(genome editing) 기술에 의해 다수의 돌연변이 및 암 줄기 세포 특이적인 신생-항원(적어도 1개)을 발현한다. 유전적으로 변형된 태아 줄기 세포 또는 오가노이드는 원발성 암에서 보고된 것과 유사한 암 유전형을 재생산한다. 본 발명은 RNA-안내된 멀티플렉스 게놈 편집, 변형, 발현의 억제 및 다른 RNA-기반 기술에 의해 다수의 이의 신생-항원을 도입함으로써 다능성 줄기 세포 및 태아 세포 또는 오가노이드를 제공하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "게놈 편집"은 특히, cas9-매개된 게놈 편집에 대한 가이드 RNA를 포함하는 RNA 매개된 유전 조작을 지칭한다. 이러한 가이드 RNA(gRNA)는 엔도뉴클레아제 cas9를 따라 형질감염된다. 가이드 RNA는 표적에 대해 상보성인 스캐폴드(scaffold) 및 스페이서 서열을 제공한다. 다른 구현예에서, 유전적 조작 서열은 Crispr-Cas 9 시스템의 사용에 의해 당해 분야에서 표준 방법에 따라 유전자 사일런싱(silencing)을 위해 설계된 siRNA 또는 microRNA 서열일 수 있다. Crispr-Cas 시스템을 제조하고 사용하는 조성물 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 특히 제8,697,359호에 기술되어 있다.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포 또는 유래된 태아 세포의 집단은 알킬화제로 처리된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬화제"는 하나의 분자로부터의 하나 이상의 알킬 그룹을 다른 분자에 첨가하는 물질을 지칭한다. 이러한 처리는 TIL 및 Th1/Th2 세포 면역성의 올리고 클로날 확장을 증가시킴으로써 우수한 면역 반응을 제공하는 신생-항원에 있어서 신규한 돌연변이를 생성한다. 본 발명에서, 알킬화제는 질소 무스타드, 니트로소우레아, 알킬 설포네이트, 트리아진, 에틸렌이민, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 질소 무스타드의 비-제한적 예는 메클로르에타민(Lundbeck), 클로람부실(GlaxoSmithKline), 사이클로포스파미드(Mead Johnson Co.), 벤다무스틴(Astellas), 이포스파미드(Baxter International), 멜팔란(Ligand), 멜팔란 풀루펜아미드(Oncopeptides), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 니트로소우레아의 비-제한적 예는 스트렙토조신(Teva), 카르무스틴(Eisai), 로무스틴(Sanofi), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 알킬 설포네이트의 비-제한적 예는 부설판(Jazz Pharmaceuticals) 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 트리아진의 비-제한적 예는 다카르바진(Bayer), 테모졸로마이드(Cancer Research Technology), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 에틸렌이민의 비-제한적 예는 티오테파(Bedford Laboratories), 알트레트아미드(MGI Pharma), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 다른 알킬화제는 프로린닥(ProLindac)(Access), Ac-225 BC-8(Actinium Pharmaceuticals), ALF-2111(Alfact Innovation), 트로포스파미드(Baxter International), MDX-1203(Bristol-Myers Squibb), 티오우레이도부티로니트릴(CellCeutix), 미토브로니톨(Chinoin), 미톨락톨(Chinoin), 니무스틴(Daiichi Sankyo), 글루포스파미드(Eleison Pharmaceuticals), HuMax-TAC 및 PBD ADC 조합물(Genmab), BP-C1(Meabco), 트레오설판(Medac), 니푸르티목스(Metronomx), 임프로설판 토실레이트(Mitsubishi tanabe Pharma), 라니무스틴(Mitsubishi tanabe Pharma), ND-01(NanoCarrier), HH-1(Nordic Nanovector), 22P1G 세포 및 이포스파미드 조합물(Nuvilex), 에스트라무스틴 포스페이트(Pfizer), 프레드니무스틴(Pfizer), 루르비넥테딘(PharmaMar), 트라벡테딘(PharmaMar), 알트레아타민(Sanofi), SGN-CD33A(Seattle Genetics), 포테무스틴(Servier), 네다플라틴(Shionogi), 헵타플라틴(Sk Holdings), 아파지쿠온(Spectrum Pharmaceuticals), SG-2000(Spirogen), TLK-58747(Telik), 라로무스틴(Vion Pharmaceuticals), 프로카르바진(Alkem Laboratories Ltd.), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 다른 구현예에서, 알킬화제는 메클로르에타킨(Lundbeck), 클로람부실(GlaxoSmithKline), 사이클로포스파미드(Mead Johnson Co.), 스트렙토조신(Teva), 다카르바진(Bayer), 티오테파(Bedford Laboratories), 알트레타민(MGI Pharma), 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 알킬화제는 ProLindac(Access), Ac-225 BC-8(Actinium Pharmaceuticals), ALF-2111(Alfact Innovation), 벤다무스틴(Astellas), 이포스파미드(Baxter International), 트로포스파미드(Baxter International), MDX-1203(Bristol-Myers Squibb), 테모졸로마이드(Cancer Research Technology), 티오우레이도부티로니트릴(CellCeutix), 미토브로니톨(Chinoin), 미톨락톨(Chinoin), 니무스틴(Daiichi Sankyo), 카르무스틴(Eisai), 글루포스파미드(Eleison Pharmaceuticals), HuMax-TAC 및 PBD ADC 조합물(Genmab), 부설판(Jazz Pharmaceuticals), 멜팔란(Ligand), BP-C1(Meabco), 트레오설판(Medac), 니푸르티목스(Metronomx), 임프로설판 토실레이트(Mitsubishi tanabe Pharma), 라니무스틴(Mitsubishi tanabe Pharma), ND-01(NanoCarrier), HH-1(Nordic Nanovector), 22P1 G 세포 및 이포스파미드 조합물(Nuvilex), 멜팔란 플루펜아미드(Oncopeptides), 에스트라무스틴 포스페이트(Pfizer), 프레드니무스틴(Pfizer), 루르비넥테딘(PharmaMar), 트라벡테딘(PharmaMar), 알트레아타미드(Sanofi), 로무스틴(Sanofi), SGN-CD33A(Seattle Genetics), 포테무스틴(Servier), 네다플라틴(Shionogi), 헵타플라틴(Sk Holdings), 아파지쿠온(Spectrum Pharmaceuticals), SG-2000(Spirogen), TLK-58747(Telik), 라로무스틴(Vion Pharmaceuticals), 프로카르바진(Alkem Laboratories Ltd.), 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포 집단은 N-에틸-N-니트로소우레아(ENU, CAS 번호 759-73-9)로 처리된다. ENU는 다음의 화학식 C₃H₇N₃O₂를 가지며, 에틸 그룹을 핵산 내 핵염기에 이전시킴으로써 매우 강력한 돌연변이원이다.

상기 나타낸 바와 같이, 돌연변이 유인제의 목적은 확장 동안 다능성 줄기 세포의 유전자 내에 무작위 돌연변이를 도입시키는 것이다(돌연변이의 도입은 세포의 복제 및 분열 동안 발생한다). 다능성 줄기 세포의 집단은 성장 장점을 제공할 수 있는 돌연변이를 획득하며 배양 조정을 촉진시키기 위해 선택된다. 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 세포의 집단은 허용되는 배양 배지 속에서 태아 세포의 성장 및 생존을 촉진시키는 돌연변이를 획득한다.

특수한 구현예에서, ENU를 사용하는 경우, 이는 적어도 7일, 보다 바람직하게는 적어도 15일, 보다 바람직하게는 적어도 20일, 보다 바람직하게는 적어도 30일, 보다 바람직하게는 적어도 40일, 보다 바람직하게는 적어도 50일 또는 심지어 적어도 60일 동안 적용될 수 있다.

돌연변이유발원의 적용 후, 세포를 세척하고(돌연변이유발원이 화학적 제제인 경우), MHC-I 발현, 특히 HDACi를 선호하는 제제의 존재하에서 추가로 항온처리할 수 있다. 이러한 제제는 바람직하게는 또한 돌연변이 유인제의 적용 동안 제공된다.

따라서, 돌연변이유발원은 태아 세포내에서 발현된 일부 태아 유전자 내에서 돌연변이(즉, 비-유사, 넌센스(nonsense), 프레임쉬프트(frameshift), StopGain, 스플라이스 변이체, CNVs, SNV)를 유도할 것이므로, 태아 항원(전체 게놈 내에 새로운 신생-항원)의 다양성을 증가시킬 것이다. 따라서, 이는 향상된 면역원성을 지닌 백신 조성물의 가능성을 증가시키며, 신속하고 빈번한 돌연변이가 존재하는 공격적인 암에 대해 광범위한 면역 반응을 자극시킬 수 있다.

효율적인 면역 반응은 실제로 일부 암의 경우 수득하기 어려울 수 있으며 여기서 클론 진화는 진행 동안 종양 세포에 의해 발현된 항원 내 신규한 체세포 돌연변이로 발생한다. 따라서 면역 반응은 암의 돌연변이 부하(load) 및 면역원성 신생-항원에 의존할 수 있다. 따라서, 돌연변이유발원의 사용에 의한 태아 세포 집단 내 특이적인 돌연변이의 생성은 예방접종 시 면역계에 대해 나타낸 항원의 다양성을 증가시킬 수 있다.

결과적으로, 이러한 세포의 분열 동안 암 세포내에 나타날 수 있는 돌연변이된 태아 항원에 대해 프라임된 T-세포가 이미 존재할 수 있으며, 이는 이러한 세포에 대한 면역 반응을 가속화시키고 증진시킬 수 있다.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 전통적인 방법(예컨대, 2D 또는 3D 배양 시스템에서 소 분자, 모르포겐 및 성장 인자를 사용한 배양 조건을 정의하는데 있어서)에 의해 우선 분화될 수 있고 이후에 돌연변이유발원(예컨대, ENU)으로 처리하여 태아 신생-항원을 발현시킨다.

태아 줄기 세포의 변형

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포의 집단은 유전적으로 변형되어 다능성 세포 게놈 내에 유전자 통합을 사용함으로서 면역 반응을 자극하는 화합물을 과-발현한다. 전형적으로, 제1 단계에서, 다능성 줄기 세포의 집단은 단리되어 확장된다. 제2의 단계에서, 목적한 유전자는 통합성 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 패키지된다. 제3 단계에서, 목적한 유전자를 함유하는 통합성 바이러스 벡터는 다능성 줄기 세포의 집단으로 이전되어 태아 줄기 세포로 분화된다.

특수한 구현예에서, 태아 줄기 세포 또는 오가노이드의 집단은 MHC 발현 및/또는 면역 반응을 자극하는 단백질의 유전자로 변형된다. 이러한 화합물은 인터페론 알파(IFN-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터루킨 2(IL-2), 및 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 12(IL-12), 종양 괴사 인자(TNF), 및 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 이의 기능성 단편, 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에 의해 고려된 인터페론(IFN)은 일반적인 유형의 IFN, IFN-알파(IFN-α), IFN-베타(IFN-β) 및 IFN-감마(IFN-γ)를 포함한다. IFN은 예를 들면, 이들의 성장을 지연시키고/시키거나, 보다 일반적인 거동을 지닌 세포로의 이들의 발달을 촉진하고/하거나, 이들의 항원 생산을 증가시킴으로써 암 세포가 면역계를 인식하여 파괴하기에 보다 용이하도록 함으로써, 암 세포 상에서 직접 작용할 수 있다. IFN은 또한 예를 들면, 혈관형성을 지연시키고/시키거나, 면역계를 부스트(boost)시키고/시키거나 천연 킬러(NK) 세포, T 세포 및 대식구를 자극함으로써, 암 세포 상에서 간접적으로 작용할 수 있다. 재조합 IFN-알파는 로페론(Roferon)(Roche Pharmaceuticals) 및 인트론(Intron) A(Schering Corporation)로서 상업적으로 이용가능하다.

본 발명에 의해 고려된 인터루킨은 IL-2, IL-4, IL-11 및 IL-12를 포함한다. 상업적으로 이용가능한 재조합 인터루킨의 예는 Proleukin®(IL-2; Chiron Corporation) 및 Neumega®(IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)이다. Zymogenetics, Inc.(워싱톤주 시애틀)는 현재 IL-21의 재조합 형태를 시험중에 있으며, 이는 또한 본 발명의 조합물에서 사용하기 위해 고려된다.

본 발명에 의해 고려된 콜로니-자극 인자(CSF)는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF 또는 필그라스팀), 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF 또는 사르그라모스팀) 및 에리트로포이에틴(에포에틴 알파, 다르베포이에틴)을 포함한다. 하나 이상의 성장 인자를 사용한 치료는 전통적인 화학요법을 받는 대상체 내에서 신규 혈액 세포의 생성을 자극하는데 도움을 줄 수 있다. 따라서, CSF를 사용한 치료는 화학요법과 관련된 부작용을 감소시키는데 도움을 줄 수 있으며 보다 고 용량의 화학치료제가 사용되도록 할 수 있다. 다양한-재조합 콜로니 자극 인자는 예를 들면, Neupogen^®(G-CSF; Amgen), 네울라스타(Neulasta)(펠필그라스팀; Amgen), 류킨(GM-CSF; Berlex), 프로크릿(Procrit)(에리트로포이에틴; Ortho Biotech), 에포겐(에리트로포이에틴; Amgen), 아르네스프(Arnesp)(에리트로포이에틴)과 같이 상업적으로 이용가능하다.

이의 가장 광범위한 의미에서, "벡터"는 올리고뉴클레오타이드를 세포로 전달하는데 용히할 수 있는 임의의 비히클(vehicle)이다. 바람직하게는, 벡터는 벡터의 부재를 야기할 수 있는 분해 정도와 관련하여 감소된 분해로 핵산을 세포에 수송한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 벡터는 네이키드 플라스미드(naked plasmid), 비-바이러스 전달 시스템(전기천공, 소노포레이션(sonoporation), 양이온성 형질감염제, 리포좀 등), 파아지미드, 바이러스, 핵산 서열의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된 바이러스 또는 세균 공급원으로부터 유래된 다른 비히클을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터는 바람직한 유형의 벡터이며 다음의 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: RNA 바이러스, 예를 들면, 레트로바이러스(예를 들면, 몰리니 쥐 백혈병 바이러스 및 렌티바이러스 유래된 벡터), 하비 쥐 육종 바이러스(harvey murine sarcoma virus), 쥐 유방 종양 바이러스, 및 로우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스; SV40-형 바이러스; 폴리오마 바이러스; 엡슈타인-바르 바이러스; 파필로마 바이러스; 헤르페스 바이러스; 박시니아 바이러스; 폴리오 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 명명되지는 않으나 당해 분야에 공지된 다른 벡터를 용이하게 사용할 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 맥락에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 및 아데노-관련(AAV) 바이러스를 포함하며, 이는 유전자 치료요법에서 사람용으로 이미 승인된 DNA 바이러스이다. 실제로, 12개의 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 12)이 공지되어 있으며, 각각은 상이한 조직 향성(tropism)을 지닌다(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). 재조합 AAV는 의존성 파르보바이러스 AAV로부터 유래된다(Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07). 아데노-관련 바이러스 제1형 내지 제12형은 복제 결핍성으로 가공될 수 있으며 광범위한 세포 유형 및 종을 감염시킬 수 있다(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). 이는 또한 열 및 지질 용매 안전성; 조혈 세포를 포함하는, 다양한 계통의 세포 내에서의 높은 형질도입 빈도; 및 초감염 억제의 결여를 가지며; 따라서 초감염 억제의 결여는 다중 시리즈의 형질도입을 허용한다. 또한, 야생형 아데노-관련 바이러스 감염은 선택적인 압력의 부재하에서 100회 이상의 계대배양 동안 조직 배양물 속에서 수반되었으며, 아데노-관련 바이러스 게놈 통합이 비교적 안정한 현상임을 내포한다. 아데노-관련 바이러스는 또한 염색체외 양식으로 작용할 수 있다.

다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당해 분야에서 집중적으로 기술되었으며 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예컨대, Sambrook et al., 1989를 참고한다. 과거 수년 동안, 플라스미드 벡터는 항원-암호화 유전자를 생체내에서 세포로 전달하기 위한 DNA 백신으로서 사용되어 왔다. 이들은 많은 바이러스 벡터를 사용하는 바와 동일한 안전성 관심을 가지고 있지 않으므로 이들은 이에 특히 유리하다. 그러나, 숙주 세포와 혼용성인 프로모터를 갖는, 이러한 플라스미드는 플라스미드 내에서 작동적으로 암호화된 유전자로부터 펩타이드를 발현할 수 있다. 일부 일반적으로 사용된 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUCl9, pRC/CMV, SV40, 및 pBlueScript를 포함한다. 다른 플라스미드는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 또한, 플라스미드는 제한 효소 및 연결 반응을 사용하여 통상적으로 설계됨으로써 DNA의 특정 단편을 제거하고 첨가할 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로에 의해 전달될 수 있다. 예를 들면, DNA 플라스미드는 근육내, 피내, 피하, 또는 다른 경로에 의해 주사될 수 있다. 이는 또한 비강내 스프레이 또는 점적제(drop), 직장 좌제 및 경구적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA 플라스미드는 안구내 방식(유리체내, 망막하, 맥락막위공간...)을 통해 주사된다. 이는 또한 유전자-총(gene-gun)을 사용하여 표피 또는 점막 표면 내로 투여될 수 있다. 플라스미드는 수용액으로 제공되어, 금 입자 상에 또는 리포좀, 덴드리머(dendrimer), 코클레이트 및 미세캡슐화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 DNA 전달 시스템과 함께 건조될 수 있다.

특수한 구현예에서, 태아 줄기 세포의 집단은 동종 재조합에 의해 19번 염색체의 AAVS1 유전자자리 내로 siRNA와 같은 전이유전자의 도입에 의해 변형된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "동종 재조합"은 염색체 또는 게놈 상의 특수한 유전자를 인공적으로 변형시키기 위한 유전자 표적화 수단을 지칭한다. 염색체 상에서 표적 서열의 부분에 대해 상동성인 부분을 갖는 게놈 단편이 세포 내로 도입되는 경우, 이러한 용어는 도입된 게놈성 단편과 염색체 상에서 이에 상응하는 유전자자리 사이의 뉴클레오타이드 서열 상동성을 기반으로 일어나는 재조합을 지칭한다.

또한, 용어 "유전적 변형"은 염색체 상의 목적한 유전자의 유전자자리 내에서, 외인성 DNA의 삽입, 유전자의 일부 또는 전체의 외인성 DNA로의 치환, 또는 유전자의 결실을 지칭한다. 보다 구체적으로, 유전적 변형은 외인성 DNA 단편의 삽입(즉, "녹-인(knock-in)")을 지칭하지만 내인성 DNA 서열은 이러한 단편이 특수한 유전자자리에서의 유전자의 발현과 함께 발현되도록 또는 구성적으로 발현되도록 하는 방식으로 유지되거나, 또는, 유전자 서열의 일부 또는 전체의 치환, 결실, 또는 파괴(즉, "녹-아웃(knock-out)")로 외인성 DNA 서열을 변형하도록 하는 방식으로 유지된다.

인공 염색체를 세포내로 도입시키는 방법의 예는 인산칼슘 침전법(Graham et al., (1973) Virology 52: 456-467, Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 1373-1376 and Current Protocols in Molecular Biology Vol.1, Wiley Inter-Science, Supplement 14, Unit 9.1.1-9.1.9 (1990)), 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 융합법(미국 특허 제4,684,611호), 지질 담체를 사용하는 방법, 예를 들면, 지질감염(Teifel et al., (1995) Biotechniques 19: 79-80, Albrecht et al., (1996) Ann. Hematol. 72: 73-79; Holmen et al., (1995) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31: 347-351, Remy et al., (1994) Bioconjug. Chem. 5: 647-654, Le Bolc'h et al., (1995) Tetrahedron Lett. 36: 6681-6684, Loeffler et al., (1993) Meth. Enzymol, 217: 599-618 및 Strauss (1996) Meth. Mol. Biol. 54: 307-327), 전기천공(electroporation), 및 미세세포(microcell)과의 융합법(미국 특허 제5,240,840호, 제4,806,476호, 제5,298,429호, 및 제5,396,767호, Fournier (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 6349-6353 및 Lambert et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 5907-59)을 포함한다.

태아 줄기 세포의 집단

따라서, 상술한 바와 같은 방법을 사용하여, 본 발명자는 보다 효율적인 항종양 면역성을 개시할 부분적이거나 모든 태아 유전자 내에서 신규한 태아 에피토프(epitope)를 발현하는 태아 줄기 세포의 집단을 수득하였다. 따라서, 제4 양태에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 방법에 따라 수득된 줄기 세포의 집단에 관한 것이다. N-에틸-N-니트로소우레아(ENU)로 예비-처리된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 줄기 세포의 집단은 돌연변이되지 않은 다능성 줄기(즉, ENU에 의한 예비-처리없이)로부터 유래된 태아 세포의 집단과 비교하여 증가된 수의 신규 돌연변이를 나타낸다. 이러한 태아 신생-항원은 원발성 암과 관련된다. 따라서, 이러한 집단이 또한 본 발명의 주제이다.

따라서, 수득된 집단은 특히 태아 줄기 세포가 다음의 유전자 중 적어도 20%를 사용한 다능성과 관련된 유전자를 상실하였다는 점에서 특징화된다: NACC1, BLM, WDR33, DAZAP1, CDK1, CDC45, ZNF165, XRCC5, SMARCAD1, AIMP2, CKS1B, NANOG, ZFP42, U2AF1, CCNB2, DCTPP1, TGIF1, SUPT3H, AURKB, GEMIN7, SRSF1, PNP, SIGLEC12, POU5F1, PSMA3, RMND5B, GDF9, STXBP2, BAG6, GMPS, PCNA, NME1, POP7, RCHY1, SMARCC1, HNRNPK, PTMA, NPM1, SNRPA, MYBBP1A, CDT1, HSPD1, TRIM28, PHF10, GRB7, HSPE1, DAXX, FAM136A, KPNA2, FUS, PNN, RFC3, HPRT1, PA2G4, SNRPE, RBPMS, PRMT5, PIAS2, BYSL, POLD2, LSM5, TDGF1, NOP56, EPPK1, TARBP2, MRE11A, CDC7, SRSF3, TNNI3, NUDT1, DIAPH1, PPID, CDA, GADD45A, MCM6, SNURF, CDC25C, TNFRSF8, STIP1, ACTA1, POLR1D, TUBA3C, RPA1, VAMP8, UNC119, COIL, BIK, PARP1, SP1, CHEK2, NLE1, RPA2, HDAC1, KPNB1, LSM7, TMSB4Y, HMGA1, POLR1C, LSM1, EXO1, MCM5, ITGB3BP, LSM6, UNG, PSMA6, CCNE1, SMNDC1, SET, FKBP3, TK1, CTBP2, POLQ, PLSCR1, GMNN, RND1, NUP153, PHGDH, SNRPB, HSPA14, HSPH1, TCOF1, ANP32A, PELP1, MBD2, HIST1H2BC, TMPO, SPAG5, DNMT3B, LCK, ARMC6, COPS6, MCM3, PPAP2C, LSM4, NME1-NME2, EWSR1, POLG2, BCL2, NFKBIB, SALL4, PXN, EXOSC8, HSPA2, HMGB1, RUVBL1, GOT2, PPM1B, ATIC, DHCR24, APEX1, RFC2, WDYHV1, NTHL1, EXOSC7, SNRPD1, DPPA2, MRPS12, FBL, POLD1, MCM10, EXOSC3, NOP58, TPX2, PAK3, HNRNPAB, ANXA2, BUB1B, SEPHS1, WDR77, LUC7L3, VASP, MCM4, PAK1, PMAIP1, PBX1, NOLC1, PCYT1B, NCL, ORC6, GPRIN2, ORC1, RAD51, HSPA8, ANXA3, NUP50, SNRPC, HAUS1, MATK, BIRC5, MYC, GEMIN6, PSIP1, DSCC1, STRBP, SMN1, EXOSC9, TOE1, GEMIN2, TRIP13, ORC2, MSH3, MNAT1, KIT, RFC5, FOXO4, AATF, RBM14, ZNF281, NPPB, RPA3, APOE, PFDN6, COPS3, CCND1, CXADR, MCM2, ANAPC1, SUMO1, SSB, HSP90AB1, TRAIP, PHC1, LRIF1, LSM3, SNRPN, RPP40, MSH2, FBP1, PFN1, OTX2, STX3, STXBP3, GTF2H2, ELAC2, TCERG1, ERCC5, PASK, ZNF593, PSME3, WRN, ARID3B, ERBB3, POP1, KAT7, PTPN6, SYNCRIP, SIRT1, SLC19A1, ARL4A, CEBPZ, MSH6, AURKA, BAK1, MTHFD1, HSPA9, MYBL2, POP5, RFC4, CHEK1, BCCIP, SOCS1, PHB, PMF1, MPP6, NOC2L, HDAC2, CENPE, RECQL4, CASP6, GNL3, SRSF2, BRIX1, MYB, RNMTL1, DHFR, FEN1, SNRPF, MUTYH, PRNP, MT1G, PSMD11, GAR1, DDX11, FUBP1, CDK7, WRAP73, CASP9, RASL11B, CHAF1A, CCNB1, CKS2, CCNA2, PPAN, WEE1, TP53, HMMR, TDP2, RAD9A 또는 RAD54L.

성체 분화된 세포의 계통 특이적인 유전자의 발현의 부재

따라서, 본 발명은 태아 줄기 세포를 포함하는 세포의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 집단 내 세포는 태아 신생-항원을 나타낸다. 태아 신생-항원의 체세포 돌연변이율은 돌연변이 유인제에 대한 노출 후 다능성 줄기 세포의 마스터 뱅크(master bank)로부터 유래된 태아 줄기 세포 집단 내에서 정량화된다. 이러한 추가의 확장이 수행되는 경우, 이러한 체세포 태아 신생-항원의 안전성은 추가의 확장 전 또는 후에 정량화된다. 태아 줄기 세포 또는 오가노이드에서 돌연변이율은 유래된 태아 세포 또는 오가노이드 내에서 발현된 태아 신생-항원으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 중 적어도 0.1%, 바람직하게는 적어도 1%, 보다 바람직하게는 적어도 2%, 보다 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%이다. 주어진 유전자에 대한 돌연변이율은 유전자에 대해 DNA를 서열분석하고, 천연 서열(이는 필수적으로 및 주로 제시되는 서열이다(우세한 서열은 천연의 "야생형" 서열이므로))과 관련하여 돌연변이를 함유하는 카피의 퍼센트를 계산함으로써 명백하게 계산된다.

사람 유래된 태아 조혈 줄기 세포(즉, 돌연변이유발원 제제에 의한 생체외 처리 후 유래된 사람 조혈 배아체로부터)는 태아 신생-항원을 발현하였다. 이러한 태아 신생항원은 적어도 다음을 지닌 수반 그룹 내에서 특징화된다: ARHGEF10L:221656_s_at, TRIM66:213748_at, ARHGEF10L:1570511_at, NKAIN3:1553241_at, ITGA7:216331_at, GGT1:211417_x_at, PDZD7:220555_s_at, MUC4:235055_x_at, GGT1:215603_x_at, MUC2:204673_at, NECAB3:210720_s_at, GGT1:208284_x_at, MNT:204206_at, GGT1:207131_x_at, ITGA7:209663_s_at, BTNL9:230992_at, FNBP1:230086_at, GLTSCR1:219445_at, NECAB3:223954_x_at, COPZ2:219561_at, ZFP36:201531_at, MIB2:241541_at, ABCC12:1553410_a_at, IGFN1:1563098_at, LRRK2:229584_at, MNT:236749_at, RIN3:220439_at, GGT1:233837_at, KIF5C:1557089_at, ANK2:202921_s_at, HDAC7:236326_at, MUC20:1558220_at, SDCCAG3:230058_at, GGT1:209919_x_at, RIN3:1562005_at, DNAI1:233195_at, DNAI1:220125_at, BTNL9:241496_at, ABTB2:232624_at, MC2R:208568_at, DOCK4:244840_x_at, FSD1L:230904_at, HDAC7:217937_s_at, CRP:205753_at, PPP1R3A:206895_at, SLC22A17:221106_at, PITPNM1:203826_s_at, BTBD7:224943_at, MIB2:241377_s_at, A2M:1558450_at, CTDSP2:208735_s_at, IFNA14:208182_x_at, KIF5C:203130_s_at, MUC20:243774_at, THNSL2:239949_at, KIF5C:203129_s_at, GTF3C3:1555439_at, NRXN1:1558708_at, MED26:1559593_a_at, FNBP1:230389_at, TMCO3:230317_x_at, PPP1R3A:211169_s_at, ING1:208415_x_at, ZNF292:1562991_at, RBL1:1555004_a_at, CD109:239719_at, CD109:229900_at, FOXRED2:233250_x_at, PLIN2:209122_at, ZNF85:1554445_at, SESN1:218346_s_at, TMCO3:220240_s_at, MED26:231724_at, CD109:226545_at, CENPE:205046_at, ING1:210350_x_at, TMCO3:226050_at, FOXRED2:220707_s_at, GTF3C3:222604_at, BTBD7:224945_at, CDC27:217881_s_at, STOM:201061_s_at, CDC27:217880_at, ZNF317:1555337_a_at, TET1:228906_at, LRBA:214109_at, MED4:217843_s_at, CDC27:217879_at, ZNF317:225296_at, ZNF292:212366_at, MED4:222438_at, BCR:226602_s_at, STOM:201060_x_at, BCR:202315_s_at, ZNF85:206572_x_at, BCR:217223_s_at, HPRT1:202854_at, LRBA:212692_s_at, GTF3C3:218343_s_at, NASP:201969_at, NASP:201970_s_at, MSH2:209421_at.

특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 사람 태아 신장 오가노이드는 원발성 성체 신장 암종에서 보고된 암 유전자와 일반적으로 관련된 신장 선조세포 내에서 태아 항원을 발현한다. 이러한 특성화된 태아 유전자는 적어도 다음을 지닌 후속된 그룹에 상응한다: TRAPPC4, MX1, ITSN1, DNAJC7, TAF15, TMEM88, CRYM, PRTG, TYRO3 C12ORF60, FJX1, ADM, FAM45A, ASS1, CA2, ZFHX4, CLVS1, NRG1, EZH2, SLC22A23, MSH5, FBN2, GTF2H2, LIX1, HESX1, FZD5, LRP2, RHOQ, NUAK2, ILF2, ACP6, RPL5, NMNAT1, ID1, U2AF2, KLHL14, CDH2, GREB1L, ARRDC4, THBS1, BMP4, LRIG3, SOX5, SF1, LGR4, MGEA5, BCORL1, STOM, GLIS3, ANXA1, KDM4C , SDC2 , TMEM130, MAGI2, GLI3, HEY2, TPBG, ID4, MYLIP, ENC1, EGR1, CDH6, NPY1R, SEL1L3, LRAT, CLDN1, CEP97, BHLHE40, ARL5A, ARL4C, ZNF385B, LYPD1, B3GNT7, INSIG2, ARHGAP29, NOTCH2, IFI16.

돌연변이 유인제에 대한 다능성 세포의 노출은 이러한 세포의 게놈 내에서 무작위 돌연변이의 환영(apparition)을 개시할 것이다. 따라서, 이러한 노출로부터 생성된 집단은 필수적으로 보다 동종성이고 원발성 암 게놈 내에 보고된 암 신생-항원에 제한된 태아 줄기 세포와 비교하여, 이종성일 것이다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 태아 줄기 세포를 포함하는 세포의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 집단 내 세포는 다음의 특징 중 하나 이상을 포함하는 태아 줄기세포의 집단 내에서 돌연변이 랜드스케이프(mutational landscape)를 나타낸다:

1) 게놈 변형에 의해 태아 줄기 세포 내에서 유전적으로 도입된 적어도 하나(또는 상기 알 수 있는 바와 같이 하나 이상)의 암 관련된 신생-항원 돌연변이.

2) 돌연변이유발원 제제에 의해 도입되고 배양된 태아 줄기 세포 내에서 선택적인 장점이 풍부한 암 게놈에 한정된 돌연변이 유형의 조합.

돌연변이유발원 공정은 태아 줄기 세포주 내에서 신규한 게놈 돌연변이 및 유전적 모자이크(genetic mosaicism)의 증가된 수준을 유발한다. 유전자 내 돌연변이의 분석은 바람직하게는 NGS, Exome, RNAseq 또는 전체-게놈 서열분석, CGH 배열, SNP 배열에 의해, 태아 줄기 세포 집단 내에서, 유도된 암 관련 "뮤타놈(mutanome)"의 대규모 게놈 분석에 의해 수행된다. 전사체(transcriptome) 프로파일링과 함께 전체-엑솜 서열분석은 발현된 단백질 암호화 뮤타놈의 설명을 가능하도록 한다.

게놈성 체세포 이상 및 신생-항원은 당해 분야에 공지된 생물정보학 분석을 위한 적어도 2개의 알고리즘을 사용함으로써 확인된다. 돌연변이유발원 제제의 적용 후 전체 게놈 내 총 돌연변이의 보급(prevalence)은 산출된 태아 줄기 세포내 보다 높은 돌연변이 및/또는 CNV 부하를 입증할 것이다.

정성적 및 정량적 기준은 기술된 바와 같이 태아 줄기 세포 내에서 유전적 모자이크 현상(genetic mosaicism) 내 각각의 세포 집단을 정의할 것이다:

정성적 기준은 다음을 포함한다:

- 돌연변이유발 후 태아 줄기 세포 게놈 내에서 이들의 존재 및 돌연변이유발의 존재 및 부재하에서 모 다능성 줄기 세포 내 이들의 부재에 관하여 정의된 획득된 신규 분자 체세포 변경(돌연변이, CNV 또는 SNV)의 확인;

- 원발성 환자 특이적인 암 또는 암 게놈(데이타 베이스로부터, 즉, TCGA, ICGC, COSMIC)과 정상의 성체 세포 또는 조직 내에 부재하는, 태아 줄기 세포 유전자 사이에서 이들의 오버랩핑 검출에 의한 각각의 신규한 돌연변이(즉, 동일하지 않은, 넌센스, 스플라이스 변이체, CNV, SNV)의 분류 및 입증.

이러한 정량적 기준은 다음을 포함한다:

- 전체 게놈 내에서 이러한 신규한 체세포 돌연변이의 보급(거짓 발견율 신뢰값(false discovery rate confidence value) FDR < 0.05) 및 신규 CNV/SNV(FDR< 10%를 지님)은 각각의 태아 줄기 세포 집단 또는 오가노이드에 대해 정의된다;

- 적어도 > 3개의 상이한 태아 유전자 내에서 입증된 돌연변이의 존재;

- 적어도 > 0.1%로부터의 대립유전자 빈도, 또는 클론 선택 및 확장 후 50% 이하의, 상기 관찰한 바와 같은 다른 퍼센트를 지니거나, 계대배양의 수에 관한 각각의 신규하고 안정한 체세포 돌연변이의 돌연변이율(50X 깊이 내지 100X 깊이 및 80 내지 98%의 표적 엑솜 포함);

- 돌연변이유발 또는 유전적 변형 전에 유입된 태아 줄기 세포와 비교하여 안정한 태아 줄기 세포 마커의 발현 및 적어도 >90%의 발현율을 사용한 유전자-발현 기반한 검정;

- HDACi, 특히 VPA의 부재하에서 유지된 태아 세포 집단과 비교하여, 적어도 50%, 및 일반적으로 90% 이하로 증가된 세포 표면에서 MHC I 분자의 발현(예를 들면, FACS에 의해 측정된 바와 같음).

백신 조성물

상기 기술된 바와 같은 태아 줄기 세포의 집단을 백신 조성물에서 사용할 수 있다. 따라서, 제5 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은, 태아 줄기 세포의 집단 및 면역 반응 및/또는 MHC I 발현을 자극하는 제제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

특히, 이러한 태아 줄기 세포는 불활성화되며, 이들의 증식 능력을 억제하고 임의로 세포 추출물을 수득하기 위해 임의로 돌연변이된다.

면역 반응을 자극하는 제제는 당해 분야에 공지된 바와 같은 보조제(adjuvant)(면역자극인자)일 수 있다. 이는 바람직하게는 HDACi(0.2mM 내지 4mM를 포함하는 용량 범위로 사용됨)이다. 이러한 HDACi를 사용하는 경우, 다른 보조제가 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 이러한 백신 조성물을 함유하는 장치(예를 들면, 주사기)에 관한 것이며, 이는 HDACi 화합물 및 세포 조성물의 동시 투여에 사용될 수 있다.

이러한 백신 조성물은 대상체의 치유를 위한, 암 세포(면역원성 신생-항원, 드라이버 또는 패신저 돌연변이(passenger mutation)를 발현하는 암 세포; 후성적으로 탈-분화된 세포로서의 선조세포, 태아 및 배아 유전자를 발현하는 종양 개시 세포)에 대한 치료학적 백신으로서, 또는 특히 이러한 암에 걸리기 쉬운 대상체 내에서 이러한 암의 발병을 방지하기 위한 예방학적 백신으로서 사용될 수 있다.

소질 유전자(predisposition gene)는 예를 들면, 다음과 같다(또한 Lindor et al, 2008 Journal of the National Cancer Institute Monographs, No. 38, Concise Handbook of Familial Cancer Susceptibility Syndromes, 제2판):

유방/난소: BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD51

린치 증후군(Lynch syndrome): MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM

유전성 유상 신장 세포 암종: FH, MET

코든 병(Cowden disease): PTEN, PIK3CA

판코니 병(Fanconi disease): FANC

폰 히펠-린다우 병(Von Hippel-Lindau disease): VHL

악성 흑색종: CDKN2A, MITF, BAP1, CDK4

내분비 종양(Endocrine Neoplasia): MEN1, RET, CDKN1B

신경섬유종증: NF1, NF2, LZTR1, SMARCB1, SPRED1

유전성 크롬 친화세포종(Hereditary pheochromocytome paragangliome): SDH, TMEM127, MAX, EPAS1

가족성 대장 폴립증(Familial adenomatous polyposis): APC, MUTYH

망막아종: RB1

빌트-호그-두베 증후군(Birt-hogg-dube syndrome): FLCN

블룸 증후군(Bloom syndrome): BLM

카니 증후군(Carney syndrome): PRKAR1A

골린 증후군(Gorlin syndrome): PTCH1

리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome): TP53, CHEK2

니즈메겐 증후군(Nijmegen syndrome): NBN

포이츠-제거스 증후군(Peutz-Jeghers Syndrome): STK11

가족성 청소년 폴립증(Familial Juvenile Polyposis): BMPR1A, SMAD4

색소성 건피증: XP

이러한 목록은 제한적이지 않다.

특정의 구현예에서, 암 줄기 세포 백신 생성물은 동결건조 후 세포 분해물, 농축된 다중-암 줄기 신생항원, 정제된 암 줄기 신생-항원, 태아 줄기 세포로부터 유래된 엑소좀, 가공된 태아 줄기 세포 및 오가노이드로부터의 DNA, RNA, 단백질 또는 다수의 펩타이드의 혼합물을 포함한다. 이들은 상기 개시된 바와 같은 면역원성 제제이며, 이는 HDACi의 존재하에서 제형화된다.

다른 구현예에서, 암 줄기 세포 백신 생성물은 보조제 효과인자로서 사용된 가공된 조사된 태아 줄기 세포로부터 상층액 GMP 배지와 혼합된다.

특수한 구현예에서, 이러한 조성물 속의 유래된 태아 세포는 불활성화된다(즉, 더 이상 증식할 수 없다).

본 발명의 유래된 태아 줄기 세포 및 오가노이드의 조성물은 상기 개시된 방법 중 어느 것에 의해 수득되도록 허용된다.

이러한 조성물 속의 유래된 태아 세포는 유전적으로 이종성이어서, 돌연변이유발원이 사용되는 경우 특이적인 체세포 돌연변이를 수반하므로, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 생산된 유래된 태아 세포 조성물과는 상이하며, 이는 유전적으로 보다 균질하다.

돌연변이유발원의 부재하에서 배양하는 경우, 배양 배지 속에서 태아 유전자의 발현을 유지하고 MHC I 제시를 증가시키는 제제의 존재는 이들의 표면에서 이러한 MHC I 분자를 보다 더 갖는 세포를 생성할 것이므로, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 생산된 유래된 태아 세포의 집단과는 상이하다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "MHC I 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물"은 면역원성을 자극할 수 있는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물은 MHC 발현 및/또는 면역 반응의 활성인자로 불린다. 용어 "MHC"는 세포 표면 상에 제시되어 항원으로 불리는 외부 분자를 인식하는 주요 조직적합성 복합체를 지칭한다. MHC는 항원에 결합하며 이들을 림프구 T 및 B와 같은 면역 분자에 대해 나타낸다. 용어 "면역 반응"은 항원에 대한 면역계의 면역학적 반응을 지칭한다. 면역 반응을 활성화시킴으로써, FoxP3 아집단 및 골수종-유래된 억제인자 세포(MDSC)의 집단은 감소되며, 반대로 NK 집단은 증가한다. 본 발명의 맥락에서, 종양에 대한 면역 반응은 종양의 세포 내 또는 세포 상에 나타난 항원에 대한 세포독성 T 세포 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 반응은 CD8+ T 세포에 의해 매개된다. 전형적으로, 본 발명의 맥락에서, MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 항원은 상기 기술한 바와 같은 태아 세포의 집단 상에 나타난 분자에 상응한다. MCH 발현 및/또는 면역계를 활성화시키는 화합물은 태아 유전자 또는 면역원성 신생-항원이다. 용어 "신생-항원" 또는 "신생-항원성"은 게놈 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키는 적어도 하나의 돌연변이로부터 발생하는 항원의 부류를 의미한다.

본 발명의 맥락에서, 화합물은 사이토킨, 히스톤 데아세틸라제 억제제, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 및 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특수한 구현예에서, MHC 발현 및/또는 면역 반응의 활성인자는 히스톤 데아세틸라제 억제제이다.

본원에 사용된 바와 같이, 또한 HDACi로 불리는, 용어 히스톤 "히스톤 데아세틸라제 억제제"는 히스톤 데아세틸라제의 기능을 방해하는 화합물의 부류를 지칭한다. 히스톤 데아세틸라제(HDAC)는 암의 전사 조절 및 발병에 있어서 중요한 역활을 담당한다. 전형적으로, HDAC의 억제제는 전사를 조절하고 세포 성장 정지, 분화 및 세포자멸사를 유발한다. HDACi는 또한 방사선 및 화학치료학적 약물을 포함하는, 암 치료에 사용된 치료제의 세포독성 효과를 향상시킨다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 발프로산(VPA)이다.

용어 "발프로산"은 당해 분야에서 다음의 CAS 번호 및 식 99-66-1을 갖는 산-2-프로필펜타노익(C₈H₁₆O₂)을 지칭한다:

발프로산의 생물학적 활성은 다중이다(Chateauvieux et al, J. Biomed. Biotechnol, 2010, pii: 479364. doi: 10.1155 / 2010/479364). 발프로산은 신경전달인자 GABA(감마 아미노 부티레이트) 효능화 억제 활성에 영향을 미친다. 수개의 작용 메카니즘이 제안된다. 발프로산은 특히 GABA 물질대사이며: GABA, GABA 트랜스아미노부티레이트(LAMP)의 분해, GABA 합성의 아크로이세먼트(acroissement)를 억제하며, 이의 회전(turnover)을 변형시킨다. 또한, 발프로산은 특정의 이온 채널을 차단하고, N-메틸-D-아스파르테이트에 의해 매개된 흥분을 감소시키며, Na⁺ 및 Ca²⁺(전압-의존성 L-형 CACNA1 C, D, N, 및 F 형)을 포함하는 이온 채널의 활성을 차단한다.

본 발명의 맥락에서, 발프로산은 면역-자극인자로서 사용되어 태아 줄기 세포와 공유된 암 태아 줄기 세포 신생-항원을 발현하는 암에 대한 면역 반응을 증강시킨다.

보다 특히, VPA는 암 줄기 세포 구획에서 MHC-1의 발현을 자극하고 향상시켜, 일부 종양 세포내에서 신생-항원 함량을 증가시키는데 사용된다. 태아 줄기 세포 상에서 MHC-I의 보다 높은 발현은 APC/수지 세포에 대한 MHC-I과 관련한 신생-항원의 제시를 향상시켜 TH1 면역 반응을 유발하도록 한다. 보다 높은 수준의 케모킨(CXCL9, CXCL10)은 T 세포의 종양 내로의 보충이 향상되도록 한다.

본 발명은 VPA 및/또는 5 아자사이티딘과 같은 HADCi의 존재하에 유래된 태아 줄기 세포 내에서 및 크로마틴 리모델링을 통한 태아 항원의 발현 뿐만 아니라 케모킨 발현(CXCL9, CXCL1)을 사용하여 종양 세포 내에서 신생-항원 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

특히, 대상체를 생체내에서 치료하는데 사용하는 경우, 본 조성물 및 백신은 종양 미세환경을 변형시켜 T 세포의 종양 내로의 보충을 촉진함으로써, 종양 용적의 장기간 지속적인 감소를 수득할 수 있도록 한다.

이는 HDACi가 환자에게 백신 주사 후 일정 기간 동안(예를 들면, 적어도 15일) 추가로 투여되는 경우 추가로 증진되는, 태아 줄기 세포 백신 및 VPA 동시-투여의 상승 효과에 기인한다.

실시예는 태아 줄기 세포 백신과 VPA 둘 다에 의한 조합된 치료가 Th1/Th2 세포 면역성을 지닌 TIL을 증가시켜, FoxP3 TReg 아집단을 감소시키지만, 종양 면역 억제를 역전시키고 TReg를 감소시키며(종양 및 비장 내에서) T CD4+ 및 CD8+ 림프구를 비장 내에서 PD-1을 발현하는 T CD4 및 CD8의 비율이 거의 없는 종양 내로 보충함으로써 우수한 항-종양 반응을 제공함을 나타낸다.

VPA는 CMyc 발현 수준을 하향 조절하고 잠재적으로 암 세포 및 종양 개시 세포의 세포자멸사 및 자기소모작용을 잠재적으로 유도할 수 있다. VPA는 자가포식소체 교차-제시를 통해 적응 면역 반응을 증강시킬 수 있다.

VPA의 다른 잘 공지된 작용은 림프절 내에서 염증 사이토킨, 예를 들면, IL6, IL8, TNFa 인터류킨(IL)-1베타, IL-17을 감소시키는 것이다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 또한 보리노스타트(N-하이드록시-N'-페닐옥탄디아미드)로 불리는 수베로일아닐리드 하이드록삼산이며 이는 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration: FDA)에 의해 2006년에 승인된 최초의 히스톤 데아세틸라제 억제제이었다(Marchion DC et al 2004; Valente et al 2014).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 FDA에 의해 2015년에 승인되고 Valente et al 2014에 기술된 바와 같은 구조를 갖는 파노비노스타트(LBH-589)이다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 유럽 연합에서 오르판 약물로서 승인된 기비노스타트(ITF2357)이다(Leoni et al 2005; Valente et al 2014).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 2014년에 FDA 승인된 벨리오다크(Beliodaq)(PXD-101)로 또한 불리는 벨리노스타트이다(Ja et al 2003; Valente et al 2014).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275로서)이다. 이러한 분자는 다음의 화학식(C₂₁H₂0N₄O₃)을 가지며 Valente et al 2014에 기술된 구조를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식(C₂₃H₂₀N₆O)을 갖는 모세티노스타트(MGCD01030)이다(Valente et al 2014).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식(C₂₀H₃₀N₄O₂)을 갖고 Diermayr et al 2012에 기술된 구조를 갖는 프락티노스타트(SB939)이다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식(C₂₂H₁₉FN₄O₂)을 갖는 치다미드(CS055/HBI-8000)이다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식 (C₂₁H₂₆N₆O₂)을 갖는 퀴시노스타트(JNJ-26481585)이다.

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식 (C₂₁H₂₃N₃O₅)을 갖는 아벡시노스타트(PCI24781)이다(Valente et al 2014).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식(C₂₀H₁₉FN₆O₂)을 갖는 CHR-3996이다(Moffat D et al 2010; Banerji et al 2012).

특수한 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 다음의 화학식 (C₁₈H₂0N₂O₃)을 갖는 AR-42이다(Lin et al 2010).

특수한 구현예에서, MHC 발현의 활성인자는 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제"는 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)와 상호작용하여 이의 활성을 억제할 수 있는 화합물을 지칭한다. DNMT는 메틸 그룹의 DNA로의 전달을 촉매하는 효소이다. DNA 메틸화는 광범위한 생물학적 기능을 제공한다. 모든 공지된 DNA 메틸트랜스퍼라제는 메틸 공여체로서 S-아데노실 메티오닌(SAM)을 사용한다.

특수한 구현예에서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제는 또한 다음의 화학식(C₈H₁₂N₄O₅) 및 당해 분야에서의 구조를 갖는 5-아자-2-데옥시사이티딘으로서 공지된 아자사이티딘이다(Kaminskas et al 2004; Estey et al 2013).

특수한 구현예에서, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제는 다음의 화학식(C₈H₁₂N₄O₄)을 갖는, 5-아자-2'-데옥시사이티딘으로서 또한 공지된 데시타빈이다(Kantarjian et al 2006).

특수한 구현예에서, MHC 발현 및/또는 면역 반응의 활성인자는 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제, 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제"는 DNA 메틸화에 관여하는 제스테 동족체의 인핸서 1(Enhancer of zeste homolog 1: EZH1) 및 2(EZH2) 유전자에 의해 암호화된 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소와 상호작용할 수 있는 화합물을 지칭한다. EZH2는 보조인자 S-아데노실-L-메티오닌을 사용함으로써 라이신 27에서 메틸 그룹의 히스톤 H3에 대한 첨가를 촉매한다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 3-데아잔에플라노신 A(DZNep, C-c3Ado)이다. DZNep, C-c3Ado는 당해 분야에서 다음 화학식 C₁₂H₁₄N₄O₃ 및 CAS 번호 102052-95-9를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 UNC1999이며 불활성 유사체 화합물이다. UNC1999는 당해 분야에서 다음의 화학식 C₃₃H₄₃N₇O₂ 및 CAS 번호 1431612-23-5를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 UNC2400 및 불활성 유사체 화합물이다. UNC2400는 당해 분야에서 다음 화학식 C₃₅H₄₇N₇O₂ 및 CAS 번호 1433200-49-7을 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 타제메토스타트(EPZ6438, E7438)이다. 타제메토스타트는 당해 분야에서 다음 화학식 C₃₄H₄₄N₄O₄ 및 CAS 번호 1403254-99-8을 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 트리플루오로아세테이트(EPZ011989)이다. 트리플루오로아세테이트는 당해 분야에서 다음의 화학식 CF₃COONa 및 CAS 번호 2923-18-4를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 EPZ005687이다. EPZ005687은 당해 분야에서 다음의 화학식 C₃₂H₃₇N₅O₃ 및 CAS 번호 1396772-26-1을 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 GSK343이다. GSK343은 당해 분야에서 다음 화학식 C31H39N7O2 및 CAS 번호 1346704-33-3을 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 GSK126이다. GSK126은 당해 분야에서 다음 화학식 C₃₁H₃₈N₆O₂ 및 CAS 번호 1346574-57-9를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 GSK2816126이다. GSK2816126은 당해 분야에서 다음 화학식 C₃₁H₃₈N₆O₂ 및 CAS 번호 1346574-57-9를 갖는다.

특수한 구현예에서, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 효소 억제제는 ZLD1039이다. ZLD1039는 당해 분야에서 다음 화학식 C₃₆H₄₈N₆O₃ 및 CAS 번호 1826865-46-6을 갖는다.

특수한 구현예에서, HDACi 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제 둘 다가 사용된다. 실제로, VPA 및 5-아자사이티딘(DNA 및 RNA내로 혼입될 수 있는 뉴클레오시드 사이티딘의 유사체)의 조합된 사용은 신생 항-배아 항원의 재-발현에 있어서 상승 효과를 생성한다.

HDACi는 치료학적 유효량으로 투여된다. VPA의 경우, 이는 10 내지 15 mg/kg/일, 60 mg/kg/일 이하일 수 있다. VPA의 혈장 수준은 바람직하게는 일반적으로 허용된 치료학적 범위(50 내지 100 μg/mL) 이내이어야 한다.

추가의 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 사람 태아 줄기 세포(예컨대 NACC1, BLM, WDR33, DAZAP1, CDK1, CDC45, ZNF165, XRCC5, SMARCAD1, AIMP2, CKS1B …)와 발현을 공유하는 다수의 태아 항원을 발현하는 암을 치료하는데 적합하다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "태아 줄기 세포를 발현하는 암"은 본원에 개시된 방법, 백신 및 조성물에 의해 바람직하게 표적화된 암이며, 사람 태아 줄기 세포와 발현을 공유하는 다수의 태아 항원을 발현하는 암 세포를 지칭한다. 전형적으로, 암은 방광 암종, 유방 암종, 경부 암종, 담관암종, 결장직장 암종, 위육종, 신경교종, 폐 암종, 림프종, 급성 및 만성 림프종 및 골수종 백혈병, 흑색종, 다발 골수종, 골육종, 난소 암종, 췌장 암종, 전립선 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 종양, 및 모든 고형 종양 및 조혈 악성암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이러한 조성물 속의 세포는 천연적으로 이종성임에 주목하여야 한다. 보다 특히, 돌연변이유발원이 사용된 경우 당해 분야에 공지된 방법에 따라 배양된 다능성 세포 조성물과는 상이하며, 이는 균질하다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 신체의 외부에 존재하는 물질을 대상체 내로, 점막내, 피내, 정맥내, 피하, 근육내 전달 및/또는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해 주사하거나 그렇지 않으면 물리적으로 전달하는 작용을 지칭한다. 질환, 또는 이의 증상이 치료되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발병 후 발생한다. 질환 또는 이의 증상이 예방되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발생 전에 일어난다.

특수한 구현예에서, 백신 조성물(태아 줄기 세포 + MHC 제시를 자극하는 제제)는 피하 주사된다. 주사는 동일한 주사 지점 또는 상이한 주사 지점에서, 동일한 주사기, 또는 별도의 주사기로 동시, 연속, 또는 별도일 수 있다.

특수한 구현예에서, 후속 치료(MHC I 및/또는 면역계, 예를 들면, HDACi, 특히 VPA를 자극하는 화합물의 투여)는 경구 경로에 의해 투여된다.

"치료학적 유효량"은 대상체에게 치료학적 이점을 부여하는데 필요한 활성제의 최소량을 의도한다. 예를 들면, 대상체에 대한 "치료학적 유효량"은 장애에 압도당하는 것과 관련되거나 또는 이에 대해 내성인 병리학적 증상, 질환 진행 또는 생리학적 상태에 있어서의 개선을 유도하거나, 완화시키거나 그렇지 않으면 유발하는 양이다. 본 발명의 화합물의 총 1일 사용은 건전한 의학적 판단 영역내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 특수 대상체에 대한 특수한 치료학적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특수 화합물의 활성; 사용된 특수 조성물, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로, 및 사용된 특수한 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특수한 화합물과 조합으로 또는 동시에 사용된 약물; 의학 분야에 잘 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 목적한 치료학적 효과를 달성하는데 필요한 용량보다 더 낮은 수준에서 화합물의 용량을 출발하고 목적한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다. 그러나, 생성물의 1일 투여량은 1일당 성인당 0.01 내지 1,000 mg의 광범위한 범위에 걸쳐서 변할 수 있다. 전형적으로, 조성물은 치료될 대상체에게 투여량의 증상적 판단을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 의약은 전형적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분, 바람직하게는 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유한다. 약물의 유효량은 1일당 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 체중, 특히 1일당 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg의 체중의 투여량 수준에서 통상적으로 공급된다.

특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 방사선 치료요법, 표적화된 치료요법, 면역 치료요법, 또는 화학 치료요법을 추가로 포함한다. 전형적으로, 주치의는 대상체에게 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) 방사선 치료요법, 표적화된 치료요법, 면역 치료요법, 또는 화학 치료요법과 조합된 제제로서, MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물을 투여하는 것을 선택할 수 있다.

일부 구현예에서, 대상체에게 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) 조합 제제 및 화학치료제로서 MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물을 투여한다.

용어 "화학치료제"는 종양 성장을 억제하는데 효과적인 화학적 화합물을 지칭한다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 사이클로포스파니드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설팜; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들면, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라니드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌(특히 불라테신 및 불라타시논); 카른프토테신(예를 들면, 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(예를 들면, 이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(예를 들면, 합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰기스타틴; 질소 무스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이소포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스 티네(tine), 트로포스파미드, 우라실 무스타드; 니트로소우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생제(예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신(11 및 칼리케아미신 211, 예컨대, Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) 참고; 다이네미신, 예를 들면, 다이네미신 A; 에스페라미신 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 칸니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신(예를 들면, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이단르비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙톰그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예를 들면, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토 스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK^®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로겐나늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아르닌; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브롬톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스톤 소재) 및 도세탁셀(TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 카펙시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 이러한 정의에는 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호므론 제제, 예를 들면, 항-에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤); 및 항-안드로겐, 에를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류플로라이드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

일부 구현예에서, 대상체에게는 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) 조합된 제제 및 표적화된 암 치료요법으로서, MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물이 투여된다.

표적화된 암 치료요법은 암의 성장, 진행, 및 확산에 관여하는 특정 분자("분자 표적")로 방해함으로써 암의 성장 및 확산을 차단하는 약물 또는 다른 물질이다. 표적화된 암 치료요법은 때때로 "분자적으로 표적화된 약물", "분자적으로 표적화된 치료요법", "정밀 의약", 또는 유사한 명칭으로 불린다. 일부 구현예에서, 표적화된 치료요법은 대상체에게 타이로신 키나제 억제제를 투여하는 단계로 이루어진다. 용어 "타이로신 키나제 억제제"는 수용체 및/또는 비-수용체 타이로신 키나제의 선택적인 또는 비-선택적인 억제제로서 작용하는 임의의 다양한 치료제 또는 약물을 지칭한다. 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 미국 특허 공보 제2007/0254295호에 기술되어 있고, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 당해 분야의 기술자는 타이로신 카나제 억제제와 관련된 화합물이 타이로신 키나제 억제제의 효과를 개괄할 것임을, 예를 들면, 관련 화합물이 이러한 타이로신 키나제의 타이로신 카나제 억제제와 동일할 수 있는 효과를 생산하는 상이한 수의 타이로신 키나제 신호전달 경로에 작용할 것임을 인식할 것이다. 본 발명의 구현예의 방법에서 사용하기에 적합한 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물의 예는 다사티닙(BMS-354825), PP2, BEZ235, 사라카티닙, 게피티닙(이레싸(Iressa)), 수니티닙(수텐트(Sutent); SU11248), 에를로티닙(타르세바(Tarceva); OSI-1774), 라파티닙(GW572016; GW2016), 카네르티닙(CI 1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 소라페닙(BAY 43-9006), 이마티닙(글리벡(Gleevec); STI571), 레플루노마이드(SU101), 반데타닙(작티마(Zactima); ZD6474), 베박키주맙(아바스틴(avastin), MK-2206 (8-[4-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 하이드로클로라이드), 이의 유도체, 이의 유사체, 및 이의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 추가의 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 예를 들면, 미국 특허 공보 제2007/0254295호, 미국 특허 제5,618,829호, 제5,639,757호, 제5,728,868호, 제5,804,396호, 제6,100,254호, 제6,127,374호, 제6,245,759호, 제6,306,874호, 제6,313,138호, 제6,316,444호, 제6,329,380호, 제6,344,459호, 제6,420,382호, 제6,479,512호, 제6,498,165호, 제6,544,988호, 제6,562,818호, 제6,586,423호, 제6,586,424호, 제6,740,665호, 제6,794,393호, 제6,875,767호, 제6,927,293호, 및 제6,958,340호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 특정의 구현예에서, 타이로신 키나제 억제제는 경구 투여되었고 적어도 하나의 제I상 임상 시험, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 제II상 임상, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 제III상 임상 시험의 대상이었고, 가장 바람직하게는 적어도 하나의 혈액학적 또는 종양학적 처방을 위해 FDA에 의해 승인된 소 분자 키나제 억제제이다. 이러한 억제제의 예는 게피니닙, 에를로티닙, 라파니팁, 카네르티닙, BMS-599626(AC-480), 네라티닙, KRN-633, CEP-11981, 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, 수니티닙, 바탈라닙, CP-547632, 반데타닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 탄두티닙, 미도스타우린, 엔자스타우린, AEE-788, 파조파닙, 악시티닙, 모타세닙, OSI-930, 세디라닙, KRN-951, 도비티닙, 셀리시클립, SNS-032, PD-0332991, MKC-I(Ro-317453; R-440), 소라페닙, ABT-869, 브리바닙(BMS-582664), SU-14813, 텔라티닙, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541, 및 PD-0325901을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 대상체에게 조합된 제제 및 면역 체크포인트 억제제로서, i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물을 투여한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 체크포인트 억제제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소시키거나, 억제하거나, 방해하거나 또는 조정하는 분자를 지칭한다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 다수의 체크포인트 단백질, 예를 들면, CTLA-4 및 이의 리간드 CD80 및 CD86; 및 PD1와 이의 리간드 PDLl 및 PDL2(Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012)는 공지되어 있다. 이러한 단백질은 T-세포 반응의 공-자극성 또는 억제성 상호작용에 관여한다. 면역 체크포인트 단백질은 자가-내성 및 생리학적 면역 반응의 기간 및 크기를 조절하고 유지한다. 면역 체크포인트 억제제는 항체를 포함하거나 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA4 항체 (예컨대, 이필리무맙), 항-PD1 항체(예컨대, 니볼루맙, 펨브롤리주맙), 항-PDL1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-BTLA 항체, 및 항-B7H6 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체이다. 항-CTLA-4 항체의 예는 미국 특허 제5,811,097호; 제5,811,097호; 제5,855,887호; 제6,051,227호; 제6,207,157호; 제6,682,736호; 제6,984,720호; 및 제7,605,238호에 기술되어 있다. 하나의 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙, 티킬리무맙, CP-675,206)이다. 일부 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 CTLA-4에 결합하는 완전한 사람 모노클로날 IgG 항체인, 이필리무맙(또한 10D1, MDX-D010으로서 공지됨)이다. 다른 면역 체크포인트 단백질은 프로그램화된 세포 사멸 1(PD-1)이다. PD-1 및 PD-L1 차단제의 예는 미국 특허 제7,488,802호; 제7,943,743호; 제8,008,449호; 제8,168,757호; 제8,217,149호, 및 PCT 공개된 특허원 제WO03042402호, 제WO2008156712호, 제WO2010089411호, 제WO2010036959호, 제WO2011066342호, 제WO2011159877호, 제WO2011082400호, 및 제WO2011161699호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, PD-1 차단제는 항-PD-Ll 항체를 포함한다. 특정의 다른 구현예에서, PD-1 차단제는 항-PD-1 항체 및 유사한 결합 단백질, 예를 들면, 니볼루맙(MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), 이의 리간드 PD-Ll 및 PD-L2에 의해 PD-1에 결합하여 이의 활성화를 차단시키는 완전한 사람 IgG4 항체; 람브롤리주맙(MK-3475 또는 SCH 900475), PD-1에 대한 사람화된 모노클로날 IgG4 항체; PC-1에 결합하는 사람화된 항체인 CT-011; B7-DC의 융합 단백질인 AMP-224; 항체 Fc 부위; PD-Ll(B7-H1) 차단을 위한 BMS-936559(MDX-1105-01)을 포함한다. 다른 면역-체크포인트 억제제는 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 억제제, 예를 들면, IMP321, 가용성 Ig 융합 단백질(Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211)을 포함한다. 다른 면역-체크포인트 억제제는 B7 억제제, 예를 들면, B7-H3 및 B7-H4 억제제를 포함한다. 특히, 항-B7-H3 항체 MGA271(Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834)을 포함한다. 또한 TIM3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3) 억제제(Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86 및 Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94)이 포함된다. 일부 구현예에서, 면역치료학적 치료는 니콜라스 피. 게스티포(Nicholas P. Restifo), 마크 이. 두들리(Mark E. Dudley) 및 스티븐 에이. 로젠버그(Steven A. Rosenberg)에 의해 기술된 바와 같이("Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012), 입양 면역치료요법으로 이루어진다. 입양 면역치료요법에서, 환자의 순환하는 림프구, 또는 종양-침윤된 림프구는 시험관 내에서 단리되고 IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되어 재투여된다(Rosenberg et al., 1988; 1989). 활성화된 림프구는 가장 바람직하게는 혈액 샘플로부터 일찍이 단리되어 시험관내에서 활성화(또는 "확장")된 환자 자체의 세포이다.

일부 구현예에서, 대상체에게는 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) 조합된 제제 및 방사치료제로서, MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물이 투여된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "방사선치료제"는 제한없이, 암을 치료하거나 완화시키는데 효과적인 것으로 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방사선치료제를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 방사선치료제는 방사선물질주입 치료요법(branchytherapy) 또는 방사핵 치료요법에서 투여된 것과 같은 제제일 수 있다. 이러한 방법은 임의로 하나 이상의 추가의 암 치료요법, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 화학치료요법, 및/또는 다른 방사선치료요법을 추가로 포함할 수 있다.

약제학적 및 백신 조성물

MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 화합물 및 상술한 바와 같은 태아 줄기 세포의 집단은 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의로 지속된-방출 매트릭스, 예를 들면, 생분해가능한 중합체와 조합되어, 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.

"약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용되는"은 적절하게는, 포유동물, 특히 사람에게 투여된 경우 부작용, 알레르기 또는 다른 원치않은 반응을 생산하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 무-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조제를 지칭한다. 활성 물질을 단독으로 또는 다른 활성 물질과 함께, 경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 국소 또는 직장 투여하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 약제학적 지지체와의 혼합물로서 동물 및 사람에게 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여형은 경구-경로 형태, 예를 들면, 정제, 겔 캅셀제, 산제, 과립제 및 경구 현탁제 또는 액제, 설하 및 볼내 투여형, 에어로졸제, 임플란트, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피, 척추강내 및 비강내 투여형 및 직장 투여형을 포함한다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)을 함유한다. 이는 특히 등장성, 멸균성, 염수 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라서, 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가 시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 무수, 특히 동결-건조된 조성물을 함유할 수 있다. 주사가능한 용도로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성 액제 또는 분산제; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 모든 경우에, 이러한 형태는 멸균되어야만 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야만 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야만 하며 미생물, 예를 들면, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 본 발명의 화합물을 포함하는 용액은 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로즈와 적합하게 혼합된 물 속에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일 속에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 함유한다. 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 핵산)은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가 염(단백질의 유리 아미노 그룹과 함께 형성됨)을 포함하며 이는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화제2철, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 기원할 수 있다. 담체는 또한 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 산제의 경우에, 필요한 입자 크기를 유지시키고 표면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 속에서 사용함으로써 달성할 수 있다. 멸균 주사가능한 액제는 적절한 용매 속에서 필요한 양의 활성 펩타이드를 상기 나열한 수개의 다른 성분과 혼입한 후, 필요할 경우 여과된 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산제는 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 액제의 제조를 위한 멸균 산제의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이미 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 제형시, 용액은 투여량 제형과 혼화성인 방식으로 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여형, 예를 들면, 상기 기술된 주사가능한 액제의 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캅셀제 등을 또한 사용할 수 있다. 수용액으로 비경구 투여하기 위해서, 예를 들면, 액제는 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하며 액체 희석제는 우선 충분한 염수 또는 글루코즈와 등장성이 되도록 한다. 이러한 특수한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용의 측면에서 당해 분야의 기술자에게 잘 공지될 것이다. 예를 들면, 하나의 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고 1000 ml의 피하주입 유액에 가하거나 제안된 주입 부위에서 주사할 수 있다. 투여량에 있어서의 일부 변화는 치료되는 대상체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여에 관여하는 개인은 어떠한 상황에서도, 개인 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다.

보다 특히, 태아 줄기 세포의 집단 및 MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 화합물은 백신 조성물로 제형화된다. 따라서, 본 발명은 i) 태아 줄기 세포의 집단 및 ii) MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 i) 태아 줄기 세포 및 ii) 발프로산을 포함한다.

특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 i) 신생-항원을 발현하는, 특히 돌연변이유발원 제제 또는 유전적 변형에 의해 향상된 태아 줄기 세포 및 ii) 발프로산을 포함한다.

조성물은 또한 5 아자사이티딘을 포함할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 백신 조성물은 상술한 바와 같이 암을 앓고 있는 대상체에서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 면역원성 조성물에서와 동일한 방식으로 상기 설정된 생리학적 부형제와 함께 제형화할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 비히클은 인산염 완충된 염수 용액, 증류수, 오일/물 유액과 같은 유액, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 무라밀 펩타이드, 예를 들면, MDP, IL-12, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 명반(Alum) 및/또는 몬타나이드(R)와 같은 보조제를 백신에서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 피하(s.c), 피내(i.d.), 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 주사, 경구 투여 및 비강내 투여 또는 흡입 투여될 수 있다. 백신의 투여는 일반적으로 단일 용량이다. 대안적으로, 본 발명의 백신의 투여는 제1회(초기 예방접종)에 이어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100회 반복(후속 투여)으로, 줄기 세포의 동일한 집단, 면역계를 자극시키는 화합물 또는 이의 조합 및/또는 추가로 하나 이상의 방사선 치료요법, 표적화된 치료요법, 면역치료요법, 또는 화학치료요법으로 이루어진다.

백신 조성물은 또한 키트(kit)로 제공된다. 키트는 백신 조성물 및 면역화를 위한 설명서를 제공하는 정보 전단을 포함한다. 키트는 또한 생성물의 투여를 위한 모든 물질을 포함한다.

본 발명은 또한 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 나타낼 것이다. 그러나, 이러한 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도면:
도 1: c-MET-돌연변이된 IPSC의 신장 오가노이드 구체화 동안 확인된 전사체. PB56(c-MET 매개된 IPSC)과 EB56(모 c-Met IPSC로부터 배아체 기원한 태아 신장 오가노이드) 사이에 차등적으로 발현된 유전자의 발현 히트맵(유클리드 거리(Euclidean distance)).
도 2: cMET-IPSC의 전사체와 원발성 유두상 신장 암종(PRCC) 샘플의 전사체 사이의 메타-분석의 벤다이어그램. PRCC 발현 프로파일에서 배아체 태아 신장 오가노이드 전사체 특징의 p-값은 피셔(Fisher)의 초기하 시험(hypergeometric test)으로 계산하였다;
도 3: IPSC의 분화 후 수득된 배양된 사람 조혈 태아 줄기 세포(EB) 내에서 HADCi(VPA)의 존재 및 부재 시 CMH 제I 및 제II 부류의 발현.
도 4: BCR-ABL 양성 IPSC에서 돌연변이유발원 제제에 의해 유도된 사람 유래된 조혈 태아 줄기 세포내 게놈 변이체. 유전자의 벤다이어그램은 모 BCR-ABL 양성 IPSC와 비교하여 엑솜 서열분석에 의해 게놈 변이체에 의해 영향받는 것으로 밝혀졌으며, 3개의 상이한 실험 조건을 시험하였다: 게놈 불안전성이 없는 조혈 EB(청색), ENU에 의해 유도된 게놈 불안정성을 지닌 조기 계대배양에서 유도된 태아 조혈 EB(녹색), ENU에 의해 유도된 게놈 불안전성을 지닌 말기 계대배양에서 유래된 태아 조혈 EB(적색).
도 5: AML 전사체(GSE10358)와 비교하여 ENU로 처리한 IPSCS BCR-ABL의 전사체 실험에서 123개 유전자에서 수행된 감독되지 않은 기본 구성성분 분석.
AML 환자 아세포 전사체에 통합된 AML 환자 "디쉬내 아세포 발증(blast crisis in dish)" 모델에서 영향받은 123개 유전자는 진단 식별력을 예측한다(로그 순위(log rank) p 값=1E-4).
작은 회색 점: G2 우수한 예후 AML. 큰 검정색 점: G1 불량한 예후 AML.
가로좌표: 요인 분석(기본 구성성분 분석)의 임의 단위로 나타낸 제1의 치수; 세로좌표: 요인 분석의 임의 단위로 나타낸 제2의 치수(기본 구성성분 분석).
도 6: 우수한 및 불량한 예후 특징을 지닌 AML 환자의 전체적인 생존.
상단 곡선: 우수한 예후 AML(G2). 하단 곡선: 불량한 예후 AML(G1).
가로좌표: 전체 생존 가능성; 세포좌표: 개월로 나타낸 시간.
도 7: iPSC로부터 수득된 폐와 19개의 일반적인 유전자를 나타내는 폐암 사이의 특징
도 8: MHC1 HLA-ABC의 발현을 평가하기 위해 사용된 HDACi의 농도.
도 9: CML-유래된 IPSC(PB32)에서 HADCi의 존재 및 부재하에서 MHC1 HLA ABC의 발현.
좌측 패널: APC와 커플링된 MHC I HLA-ABC 모노클로날 항체를 사용하여 4개의 상이한 HDACi로 처리한 iPSC(PB32)의 DMSO 대조군에 대한 RFI MEAN의 표준화. 세로좌표: 형광성의 RF/MHC1 배.
우측 패널: 4개의 상이한 HDACi에 노출된 CML-유래된 IPSC(PB32)의 DMSO 대조군에 대해 표준화된 MHC1 발현의 %. 세로 좌표: DMSO 대조군에 대해 표준화된 양성 APC 형광성의 %.
도 10: 게놈 변경(PB33)이 없는 IPSC 상에서 HADCi의 존재 및 부재하에서 MHC1 HLA ABC의 발현.
좌측 패널: APC와 커플링된 MHC I HLA-ABC 모노클로날 항체를 사용하여 4개의 상이한 HDACi로 처리된 IPSC(PB33)의 DMSO 대조군에 대한 RFI MEAN의 표준화. 세로 좌표: 형광성의 RF/MHC1 배.
우측 패널: 4개의 상이한 HDACi에 노출된 IPSC(PB33)의 DMSO 대조군에 대해 표준화된 MHC1 발현의 %. 세포 좌표: DMSO 대조군에 대해 표준화된 양성 APC 형광성의 %.
도 11: 쥐 IPSCS, 쥐 ESC, 이식체(engraft) Pan02 및 쥐 내배엽 선조세포 세포(EndoPC)의 전사체 실험에서 392개 유전자에서 수행된 무감독 기본 구성성분 분석.
가로 좌표: 요인 분석(기본 구성성분 분석)의 임의 단위로 나타낸, 제1의 치수; 세로 좌표: 요인 분석(기본 구성성분 분석)의 임의 단위로 나타낸, 제2의 치수.
도 12: 쥐 IPSCS, 쥐 ESC, 이식체 Pan02 및 쥐 내배엽 선조세포 세포(EndoPC) 사이의 359개 유전자로 수행된 유전자 발현 히트맵 및 무감독 분류.
도 13: 쥐 섬유아세포, iPSC, 및 EndoPC에서 RT PCR에 의한 다능성 유전자의 발현.
쥐 iPSC 및 1차 쥐 C57BL/6 섬유아세포와 비교하여 EndoPC에서 정량적 RT-PCR에 의한 iPSC-농축된 유전자의 발현. OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, CMYC, KLF4 및 알칼린 포스파타제(ALP)를 포함하는 7개의 상이한 인자를 정량화하고 후속적으로 miPSC에서 발견된 mRNA에 대해 표준화하였다(100의 값). 세로 좌표: 임의 단위로 나타낸, mRNA의 상대적인 발현. 가로 좌표, 좌측으로부터 우측까지 바아(bar)의 그룹: (i) m 섬유아세포; (ii) EndoPC; (iii) miPSC. 좌측으로부터 우측까지 바아의 각각의 그룹의 경우: (i) OCT4, (ii) SOX2, (iii) NANOG, (iv) LIN 28, (v) cMYC, (vi) KLF4, (vii) ALP.
도 14: ESC와 비교한 유동 세포분석법에 의한 EndoPC에서 mESC 마커 SSEA-1의 발현.
좌측 패널: mESC(CK35); 우측 패널: EndoPC. 세로 좌표: 임의 단위로 나타낸, 형광성 신호 강도(log). 가로 좌표: 신호의 크기.
도 15: 0.5 및 4시간 후 수행된 100 ng/ml의 IL6의 존재 또는 부재하에서 Pan 02에서 STAT3, pSTAT3(Y705) 및 β 액틴에 대한 웨스턴 블롯 분석.
Pan02 세포를 다음과 함께 배양하였다(좌측으로부터 우측까지의 열): (i) IL-6 부재, Jak 억제제 부재, (ii) IL-6 부재, Jak 억제제 부재, (iii) IL-6, Jak 억제제 부재, (iv) IL-6, Jak 억제제 부재, (v) IL-6, Jak 억제제, (vi) IL-6, Jak 억제제. 상단으로부터 하단까지 라인: (i) p-Stat 3 Y705, (ii) Stat 3, (iii) β-액틴.
도 16: 처리되지 않은 마우스(n=8)와 비교하여 EndoPC의 2개 부스트(boost)로 예방접종한 마우스의 전체 생존.
세로 좌표: 생존 퍼센트; 가로 좌표: 일로 나타낸 시간.
도 17: 대조군 마우스와 비교하여 처리된 마우스의 췌장에서 표면 강도를 측정하는 바이오 발광성에 의한 관심 영역(Region of Interest: ROI)의 정량화.
세로 좌표: 임의 단위로 나타낸, 관심 영역(ROI) 표면 강도.
도 18: 당해 도는 다능성 줄기 세포로부터 유래된 태아 줄기 세포를 수득하기 위한 상이한 단계를 나타낸다.

실시예:

실시예 1:

c-MET 돌연변이를 수반하는 유래된 신장 오가노이드로부터의 태아 항원의 특성화.

본 발명자는 센다이 바이러스-매개된 다능성 유전자 전달을 사용하여 제1형 유두상 신장 암종(PRCC)을 지닌 공여자(donor)로부터의 혈액 세포를 재프로그램화시킴에 의한 유전성 c-MET 돌연변이를 지닌 iPSC 세포주를 생성시켰다. 본 발명자는 3D-배양 시스템을 설계하여 태아 세포로 구성된, c-MET iPSC의 신장 오가노이드로의 분화를 유도하였다. 본 발명자는 iPSC-유래된 신장 오가노이드가 사구체 및 관 구조를 지닌 신장 선조세포의 마커를 발현하였음을 입증하였다. 투과 전자 현미경 분석은 관 구조의 강력한 연결부의 존재를 입증하였다. 유전자-배열 분석은 신장 오가노이드(EB56) 및 모(parental) 다능성 줄기 세포(PB56)에서 수행하였다. c-met 돌연변이(PB56)를 지닌 iPSC와 맡겨진 네프론 선조세포를 함유하는 유래된 태아 신장 오가노이드 사이의 생성물 알고리즘을 순위를 매김에 의한 감독된 분석은 196개의 상이한 발현된 유전자 프로브를 확인하도록 하였다: 148개는 IPSC PB56 및 이들 중 대부분과 비교하여, EB56에서 하향 조절된 것으로 밝혀졌으며, 48개는 IPSC PB56과 비교하여 EB56에서 상향 조절된 것으로 밝혀졌다(도 1). 이는 태아 신장 오가노이드가 다능성 유전자 형태 iPSC 및 맡겨진 신장 조직과 관련하여 획득된 태아 유전자를 상실하였음을 입증한다.

PRCC RNAseq 샘플에서 수행된 c-MET 상태에 의해 감독된 기계 학습은 분류오류의 최소의 오류로 1333개의 예측된 유전자를 특징화하도록 하였다. c-MET-돌연변이된 IPSC 특징과 PRCC 특징 사이의 메타-분석(Meta-analysis)은 c-MET 돌연변이된 PRCC 종양 상태의 예측인자로서 IPSC 프로파일의 유의적인 농축을 나타내었다(농축의 배: 5.68; p-값 <2.2E-16, (도 2). 원발성 성체 신장 암종에 나타난 보고된 암 유전자와 일반적으로 관련된 신장 선조세포로부터 특징화된 태아 유전자는 적어도 다음의 그룹 내에 있다: TRAPPC4, MX1, ITSN1, DNAJC7, TAF15, TMEM88, CRYM, PRTG, TYRO3 C12ORF60, FJX1, ADM, FAM45A, ASS1, CA2, ZFHX4, CLVS1, NRG1, EZH2, SLC22A23, MSH5, FBN2, GTF2H2, LIX1, HESX1, FZD5, LRP2, RHOQ, NUAK2, ILF2, ACP6, RPL5, NMNAT1, ID1, U2AF2, KLHL14, CDH2, GREB1L, ARRDC4, THBS1, BMP4, LRIG3, SOX5, SF1, LGR4, MGEA5, BCORL1, STOM, GLIS3, ANXA1, KDM4C, SDC2, TMEM130, MAGI2, GLI3, HEY2, TPBG, ID4, MYLIP, ENC1, EGR1, CDH6, NPY1R, SEL1L3, LRAT, CLDN1, CEP97, BHLHE40, ARL5A, ARL4C, ZNF385B, LYPD1, B3GNT7, INSIG2, ARHGAP29, NOTCH2, IFI16.

이러한 결과는 c-MET-돌연변이된 IPSC로부터 유래된 태아 신장 오가노이드는 적어도 77개의 일반적인 암 관련된 태아 신생-항원을 발현하는 유두성 신장 세포 암종을 모델화하는 관련 태아 세포이어서 c-met 돌연변이와 관련된 신장 암종에 대한 암 세포 백신 생성물 또는 세포 추출물을 제조하도록 한다.

실시예 2

급성 골수종 백혈병(AML)을 지닌 유래된 태아 조혈 줄기 세포에서 일반적인 뮤타놈(mutanome).

본 발명자는 만성 골수종 백혈병의 유도된 다능성 세포(IPSC)를 개발하여 질환의 진행을 모델화하였다. BCR-ABL 융합 단백질 발현은 만성 골수종 백혈병 진행 동안 증가하며 이러한 현상은 게놈 불안전성을 유도하고 아세포 형질전환과 혼용성인 제2의 게놈 현상의 환영을 촉진하여 급성 골수종 백혈병을 초래하는 것으로 잘 알려져 있다.

Bcr-Abl 종양유전자를 지니는 사람 다능성 줄기 세포를 배양하고 돌연변이유발원 제제(ENU)로 확장시켜 게놈 불안전성을 유도하고 연속적인 분열 동안 체세포 돌연변이를 향상시켰다. 약속된 조혈 후대 태아 세포는 성장 및 모르포겐의 존재하에서 배아체(EB)의 기술을 사용함으로써 생산하였다. 4 내지 20일째에 혈관아세포 단계, 아세포 콜로니, 및 EB에 상응하는, 2 내지 3일째에 배아체(EB)를 분석하였다. 조혈 EB를 FACS 분석에 의해 이들의 조혈 마커 CD34, C43, CD45에 대해 특성화하였다. 조혈 효능은 CFC의 수를 계수하고 CFC의 유형을 분석함으로써 콜로니 형성 검정에 의해 확인하였다. 본 발명자는 ENU가 게놈 불안전성을 유도할 수 있으며 배양물 속의 재생 아세포 조혈 골수 선조세포가 들어있는, 디쉬(dish) 내에서 아세포 발증을 재생산하도록 함을 밝혔다. 배양된 조혈 EB 내에서 VPA의 존재는 CMH 제I 부류의 양을 FACS 분석에 의해 기술된 바와 같이 CMH 제II 부류에 대해 보다 낮은 효율로 향상시키도록 하였다(도 3).

유전자 배열, 엑솜 및 CGH 배열은 조기 계대배양(> 20회 계대배양)에서 IPSC 및 ENU에 대한 노출 후 말기 계대배양(> 100회 계대배양)에서 IPSC로부터 수득한, 16일째에 유래된 태아 조혈 EB 선조세포에서 수행하였다. 전체 엑솜 분석을 게놈 불안전성의 존재 또는 부재하에서 분화된 배아 체, 및 조기 및 말기 계대배양에서 배양된 IPSC로부터의 EB와 비교하여 모 IPSC의 DNA에서 수행하였다. 차세대 서열분석은 쌍 말단 서열분석에 의해서 및 HG19 게놈 버젼에서 정렬된 CASAVA 파이프라인을 사용함으로써 Illumina Technologies에서 수행하였다. 게놈 변이체는 EXAC 데이타베이스에서 일반적인 사람 집단에 대해 0.01 미만의 빈도로 선택되었다.

본 발명자는 조혈성 EB에 있어서의 게놈 변화를 모 IPSC에 대해 0.10 이상의 대립형질 빈도의 차이와 비교하였다. 도 4 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 약간의 게놈 변화를 BCR-ABL 양성 IPSC로부터 생성된 조혈 EB에서 확인하였다: 14개의 유전자는 9개의 미스센스 단일 뉴클레오타이드 변이 및 5개의 프레임쉬프트에 의해 영향받는 것으로 밝혀졌다.

한편, ENU에 대한 노출 후, IPSC(< 20회 계대배양 및 > 100회 계대배양)는 조혈 태아 줄기 세포(EB)로 분화되었으며 뮤타놈 특징을 ENU의 부재하에서 모 IPSC로부터 유래된 EB와 비교하였다. ENU는 조혈 EB에 있어서의 게놈 불안전성, 높은 수의 게놈 변이 및 체세포 돌연변이를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 중요하게는, 본 발명자는 조기 계대배양 및 말기 계대배양에서 IPSC로부터 유래된 조혈 EB에서 유사한 돌연변이를 발견하였으며, 이는 iPSC의 가변적인 확장 동안 안정한 뮤타놈을 나타낸다(도 4 및 표 1).

총 123개의 게놈성 변이는 수득된 암호화 미스센스 및 정지(coding missense and stop gained) 및 프레임쉬프트를 포함하는 ENU로 처리된 IPSC로부터의 EB에서 발견되었다. 이러한 게놈 변이는 적어도 다음을 지닌 원발성 급성 백혈병에서 일반적으로 발현되고 보고된다: ARHGEF10L:221656_s_at, TRIM66:213748_at, ARHGEF10L:1570511_at, NKAIN3:1553241_at, ITGA7:216331_at, GGT1:211417_x_at, PDZD7:220555_s_at, MUC4:235055_x_at, GGT1:215603_x_at, MUC2:204673_at, NECAB3:210720_s_at, GGT1:208284_x_at, MNT:204206_at, GGT1:207131_x_at, ITGA7:209663_s_at, BTNL9:230992_at, FNBP1:230086_at, GLTSCR1:219445_at, NECAB3:223954_x_at, COPZ2:219561_at, ZFP36:201531_at, MIB2:241541_at, ABCC12:1553410_a_at, IGFN1:1563098_at, LRRK2:229584_at, MNT:236749_at, RIN3:220439_at, GGT1:233837_at, KIF5C:1557089_at, ANK2:202921_s_at, HDAC7:236326_at, MUC20:1558220_at, SDCCAG3:230058_at, GGT1:209919_x_at, RIN3:1562005_at, DNAI1:233195_at, DNAI1:220125_at, BTNL9:241496_at, ABTB2:232624_at, MC2R:208568_at, DOCK4:244840_x_at, FSD1L:230904_at, HDAC7:217937_s_at, CRP:205753_at, PPP1R3A:206895_at, SLC22A17:221106_at, PITPNM1:203826_s_at, BTBD7:224943_at, MIB2:241377_s_at, A2M:1558450_at, CTDSP2:208735_s_at, IFNA14:208182_x_at, KIF5C:203130_s_at, MUC20:243774_at, THNSL2:239949_at, KIF5C:203129_s_at, GTF3C3:1555439_at, NRXN1:1558708_at, MED26:1559593_a_at, FNBP1:230389_at, TMCO3:230317_x_at, PPP1R3A:211169_s_at, ING1:208415_x_at, ZNF292:1562991_at, RBL1:1555004_a_at, CD109:239719_at, CD109:229900_at, FOXRED2:233250_x_at, PLIN2:209122_at, ZNF85:1554445_at, SESN1:218346_s_at, TMCO3:220240_s_at, MED26:231724_at, CD109:226545_at, CENPE:205046_at, ING1:210350_x_at, TMCO3:226050_at, FOXRED2:220707_s_at, GTF3C3:222604_at, BTBD7:224945_at, CDC27:217881_s_at, STOM:201061_s_at, CDC27:217880_at, ZNF317:1555337_a_at, TET1:228906_at, LRBA:214109_at, MED4:217843_s_at, CDC27:217879_at, ZNF317:225296_at, ZNF292:212366_at, MED4:222438_at, BCR:226602_s_at, STOM:201060_x_at, BCR:202315_s_at, ZNF85:206572_x_at, BCR:217223_s_at, HPRT1:202854_at, LRBA:212692_s_at, GTF3C3:218343_s_at, NASP:201969_at, NASP:201970_s_at, MSH2:209421_at.

AML 환자 아세포 전사체 분석에서 통합된 "디쉬 내 아세포 발증" 모델에서 이러한 영향받은 123개 유전자는 전체 생존에서 예후 변별(p-값 = 0.00000187, 도 5)을 예측한다(log 순위 p-값 = 1E-4, 도 6).

이러한 결과는 IPSC-유래된 조혈 EB 내에서 게놈 변이에 의해 영향받는 신생-항원이 AML에서 발현된 유사한 태아 신생-항원을 재생산함을 입증한다. 따라서, 조사된 세포 또는 세포 추출물(AND, ARN, 단백질)과 같은 백신 생성물, 또는 신생-에피토프 및 펩타이드 제제는 이러한 변형되고 가공된 태아 조혈 세포로부터 생산될 수 있다. 따라서, 이러한 관련된 태아 조혈 세포를 사용하여 예방접총 처리 전략에 의해 급성 백혈병에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다.

상이한 유형의 유전학의 열 번호(row number)에 의해, 이들이 유래된 모 IPAC의 게놈과 비교하여 각각의 공정 샘플에 대해 기술하였다.

실시예 3

폐암을 지닌 유래된 태아 폐 오가노이드에서 일반적인 유전자 발현

본 발명자는 IPSC로부터 유래된(및 따라서 태아 세포로 구성된) 폐 오가노이드의 전사체 분석을 시험함으로써 폐암 특징을 예측하였다: 거짓 발견율(False discovery rate: FDR)에 의한 다중-시험 교정 후 LIMMA 알고리즘은 분류된 세포와 0 내지 5회 계대배양으로부터의 세포 배양물 사이의 8372개의 가변성 유전자를 확인하였다. 공동으로 SAM 알고리즘은 폐 종양과 정상 폐 조직 사이의 5619개의 차등적으로 발현된 유전자를 발견하였다(FDR<0.05, n=246개의 샘플). 폐포 오가노이드와 폐 암 특징 사이의 교차점에서 형성된 분석(Nested analysis)은 확인된 스탠포드로부터의 알고리즘을 뺀 기계 학습으로 조율하였다. 19개의 예측된 유전자의 일반적인 특징은 9% 미만의 최소의 분류 오차로 발견되었다(도 7).

실시예 4

HDAC 억제제는 백신의 면역원성을 증가시킨다.

백신으로서 사용된 세포내에서 MHC I의 보다 높은 발현은 APC/수지 세포에 대한 MHC-I과 관련된 신생-항원의 제시를 향상시켜 TH1 면역 반응을 유도할 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자는 4개의 상이한 HDACi를 시험하여 2개의 독립된 iPSC에서 MHC 1의 발현을 증가시키는 이의 능력을 점검하였다. 유전적 변경(PB33)을 갖지 않는 하나의 iPSC 및 BCR-ABL의 융합 생성물을 보살피는 하나의 iPSCS를 CML 질환(PB32)을 지닌 환자로부터 생산하였다.

베리노스타트, 엔티네스타트 레비테라세탐 및 발프로산을 포함하는 4개의 HDACi를 1 내지 1.5 μM의 용량에서 시험하였다(도 8). MHC1 HLA ABC의 발현은 24시간의 배양 후 유동 세포분석법 분석으로 정량화하였으며, 이는 MHC1이 IPSC 둘 다에 대해 23 내지 52%까지 증가하였음을 나타낸다(도 9 및 10, 우측 패널). 각각의세포주의 경우 DMSO 대조군에 대한 상대적인 형광성 강도(RFI) 평균의 표준화는 MHC1의 0.84 내지 2.45배까지의 증가를 나타낸다(도 9 및 10 좌측 패널).

실시예 5

발프로산(VPA)와 함께 자가 내배엽 선조 세포를 사용한 예방접종은 관의 췌장 선암종(PDAC)에 대한 항-종양 반응을 생성한다.

본 발명자는 쥐 꼬리 섬유아세포-유래된 iPSC로부터 및 쥐 차등화된 간세포로부터의 내배엽 선조 세포(EndoPC)를 Oct4/Sox2/cMyc/Kfl4 전사 인자를 발현하는 바이러스 벡터를 사용하여 생산하였다. 이러한 선조세포는 태아 세포이다. EndoPC의 췌장 종양 발현 프로파일을 강조하기 위하여, 이의 전사체는 쥐 배아 줄기 세포(D3)와 관련된 꼬리 쥐 섬유아세포로부터 유래된 iIPSC의 줄기 세포 발현 프로파일과 비교하여 동계 C57BL/6 마우스로 이식시킨 Pan02 세포와 관련되었다. 조합되고 교차 배치(cross batch) 표준화된 전사체 매트릭스에서, 4개의 샘플 그룹 사이의 감독된 ANOVA를 10^-4 미만의 p-값 역치(threshold) 및 그룹 사이의 500개 순열의 실행으로 수행하였다. 3230개 유전자 확인인자의 목록에서 4개의 실험 조건 사이에서 유의적인 변수가 발견되었다(데이타는 나타내지 않음). 둘째로, 이러한 가변 발현 프로파일에서 SAM 감독된 알고리즘을 사용하여 다음의 그룹 사이의 유의적인 차등적으로 발현된 유전자를 발견하였다: 1% 미만의 FDR을 지닌 (생체내에서 EndoPC + Pan02) 대 (D3-ES + 쥐_iPSCs). 이러한 분석을 사용하여, EndoPC의 췌장 종양 유전자 발현 프로파일은 비감독된 주요 구성성분 분석에 의해(도 11), 그러나 또한 이러한 프로파일의 유전자 발현 히트맵에서 수행된 비감독된 집단화에 의해(피어슨 거리(Pearson distance), 완전 방법, 도 12), 실험 그룹을 유의적으로 개별화하도록 한 359개 유전자 확인인자를 포함함이 밝혀졌다(P-값 = 1.138249e-10). 이러한 결과는 췌장 종양 발현 프로파일이 EndoPC에서 강조될 수 있음을 시사한다.

본 발명자는 또한 유일한 분자 특징을 가공하는 EndoPC가 쥐 iPSC와 유사하지 않고 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, CMYC, KLF4 및 알칼린 프스파타제(ALP)와 같은 다능성 유지에 연루된 유전자에 대한 정량적 RT-PCR에 의해 음성인 것으로 밝혀졌음을 입증하였다(도 13). 이러한 후자의 결과는 단계-특이적인 배아 항원(SSEA)-1 발현의 부재를 나타내는 유동 세포분석 분석법으로 확인하였다(도 14). 또한, EndoPC는 PDX1, HNF4A, HNF1B, HNF1A, FOXA2, FOXA3를 포함하는 Pan02와 수개의 유전자를 공유하였으며(데이타는 나타내지 않음) 이들의 증식 및 자가-재생능에 대한 IL-6/JAK/STAT3 신호전달 경로에 의존적이다. Pan02 및 EndoPC 둘 다에서 IL-6/JAK/STAT3 축을 평가하기 위하여 본 발명자는 100 ng/ml의 IL-6 및 IL-6로 JAK 억제제의 존재하에서 처리하였다.

세포주 둘 다에서 이러한 경로의 활성화는 IL-6에 대한 반응시 타이로신 705에서 STAT3의 포스포릴화와 관련되었다(Pan02 세포 만에 대한 결과를 나타내는 도 15). 웨스턴 블롯 분석에 의한 Tyr-705-포스포-STAT3의 검출 형태는 노출 30분 및 4시간 후에 JAK 억제제의 첨가 후 강력하게 억제되었다. 또한, IL-6/JAK/STAT3 축의 활성화는 β-카테닌 및 TCF4 mRNA의 상향조절과 관련되었다(데이타는 나타내지 않음).

본 발명자는 이후에 VPA와 함께 조사된 EndoPC를 사용한 예방접종이 동계 PDAC 마우스에서 췌장 암에 대해 효과적인지의 여부를 시험하였다. 예방접종은 80 그레이(grey)의 선량으로 조사한 2x10⁶ EndoPCS의 2개의 현탁액을 피하 경로로 주사하는 단계로 이루어졌다.

세포를 루시퍼라제 유전자를 발현하는 2x10⁶개의 Pan02Luc 세포의 췌장의 꼬리 부분내로 직교 주사(orthotropic injection)하기 7일 및 14일 전에 주사하였다. 마우스(n=8)에게 음료수 속에 0.40 mM의 용량에서 VPA의 챌린지 일(day of challenge)에 제공한 2 부스트의 백신을 제공하였다. 동시에, 예방접종하지 않은 마우스에게 VPA가 없는 동일한 수의 암 Pan02Luc 세포를 제공하였다. 본 발명자는 예방접종하지 않은 마우스와는 대조적으로, 조사된 EndoPC를 사용한 마우스의 주사 전 다음의 생존율의 유의적인 증진을 발견하였다(도 16). 본 발명자는 또한 Pan02 종양이 PBS-대조군 그룹에서 점진적으로 성장하였지만, 놀랍게도, EndoPC를 사용한 면역화가 대조군 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 평균 종양 크기에 있어서 통계적으로 유의적인 차이로 종양 세포를 지연시켰다. 종양-챌린지 후 4일째로부터 백신-처리된 그룹으로부터 종양의 급격한 억제를 나타내는 생물발광성에 의한 표면 강도를 측정하는 관심 영역(ROI)을 전신계적으로 정량화하였다(도 17).

본 명세서 전반에 걸쳐서, 다양한 참고문헌은 본 발명이 속한 당해 기술분야의 상태를 기술한다. 이러한 참고문헌의 개시내용은 본원에 의해 본 개시내용에 참고로 혼입된다.

참고문헌:

특허 참고문헌

EP 2 599 860

PCT/JP2006/324881, PCT/JP02/05350

US 2005/0176707

미국 특허 5,843,780; 6,200,806; 7,029,913; 5,453,357; 5,690,926; 6,642,048; 6,800,480; 5,166,065; 6,090,622; 6,562,619; 6,921,632; 5,914,268; 9,499,797; 9,637,732; 8,158,766; 8,129,187; 8,058,065; 8,278,104; 8,697,359; 4,684,611; 5,240,840; 4,806,476; 5,298,429; 5,396,767; 5,811,097; 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; 6,207,157; 6,682,736; 6,984,720; 7,605,238; 7,488,802; 7,943,743; 8,008,449; 8,168,757; 8,217,149

WO 2012/122629, WO 2016/065330, WO 2017/027757, WO 2017/202949, WO 2001/085917, WO 2012/060473, WO 03/042402, WO 2008/156712, WO 2010/089411, WO 2010/036959, WO 2011/066342, WO 2011/159877, WO 2011/082400, 및 WO 2011/161699

비 특허 참고문헌

Claims (17)

1. 대상체에서 암의 치료시 사용하기 위한, (i) 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi), 및 (ii) 불활성화된 태아 세포의 집단을 함유하는 백신 조성물의 조합물.
2. 제1항에 있어서, 집단의 세포가 대상체의 암 세포에 의해 또한 발현된 하나 이상의 관심 항원(들)을 발현하는, 조합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 불활성화된 태아 세포의 집단이 오가노이드 (organoid)인, 조합물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 태아 줄기 세포가 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득되는, 조합물:
   a. 환자의 특정 암에 관한 경로에 대한 다능성 세포의 집단의 분화 단계,
   b. 분화된 세포의 확장 단계,
   c. 임의로 확장 동안 돌연변이유발원성 제제의 노출로 상기 집단의 세포내 유전자의 돌연변이유발을 유도하는 단계,
   d. 집단의 세포의 적어도 70%가 태아 마커를 발현함을 입증하는 단계,
   e. 임의로 집단의 세포가 대상체의 암 세포 내에 존재하는 적어도 하나의 종양 관련 항원(TAA) 또는 신생-항원을 발현함을 입증하는 단계,
   f. 세포를 불활성화시켜, 세포가 분열하는 이의 능력을 상실시키는 단계.
5. 제4항에 있어서, 돌연변이유발원성 제제가 화학적 돌연변이유발원성 제제 및 방사선 돌연변이유발원성 제제(X-선, UV 방사선)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 조합물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 돌연변이유발원성 제제가 ENU, 반응성 산소종, 탈아민화제, 폴리사이클릭 방향족 탄화수소, 방향족 아민 및 나트륨 아지드로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 조합물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 발프로산(VPA), 보리노스타트, 파노비노스타트, 기비노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 모세티노스타트, 프락티노스타트, 키다미드, 퀴시노스타트 및 아벡시노스타트로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 조합물.
8. iPS-유도된 태아 조혈 계통으로부터 수득된 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 세포의 조성물로서, 상기 집단 내 세포가,
   ARHGEF10L, TRIM66, NKAIN, ITGAGGT1, PDZD, MUC4, MUC2, NECAB3, MNT, GLTSCR1, COPZ2, ZFP36, MIB2, ABCC12, IGFN1, LRRK2, RIN3, GGT1, ANK2, HDAC7, MUC20, SDCCAG3, DNAI1, BTNL9, ABTB2, MC2R, DOCK4, FSD1L, CRP, PPP1R3A, SLC22A17, PITPNM1, A2M, CTDSP2, IFNA14, KIF5C, THNSL2, GTF3C3, NRXN1, MED26, FNBP1, TMCO3, ING1, ZNF292, RBL1, CD109, FOXRED2, PLIN2, ZNF85, SESN1, CENPE, BTBD7, STOM, ZNF317, TET1, LRBA, MED4, CDC27, BCR, HPRT1, NASP, 및 MSH2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 내에서, 확장 후 적어도 0.1%의 돌연변이율을 나타내는 조성물.
9. iPS-유래된 신장 오가노이드 내에 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 태아 세포의 조성물로서, 상기 집단 내 세포가,
   TRAPPC4, MX1, ITSN1, DNAJC7, TAF15, TMEM88, CRYM, PRTG, TYRO3 C12ORF60, FJX1, ADM, FAM45A, ASS1, CA2, ZFHX4, CLVS1, NRG1, EZH2, SLC22A23, MSH5, FBN2, GTF2H2, LIX1, HESX1, FZD5, LRP2, RHOQ, NUAK2, ILF2, ACP6, RPL5, NMNAT1, ID1, U2AF2, KLHL14, CDH2, GREB1L, ARRDC4, THBS1, BMP4, LRIG3, SOX5, SF1, LGR4, MGEA5, BCORL1, STOM, GLIS3, ANXA1, KDM4C , SDC2 , TMEM130, MAGI2, GLI3, HEY2, TPBG, ID4, MYLIP, ENC1, EGR1, CDH6, NPY1R, SEL1L3, LRAT, CLDN1, CEP97, BHLHE40, ARL5A, ARL4C, ZNF385B, LYPD1, B3GNT7, INSIG2, ARHGAP29, NOTCH2, 및 IFI16의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 태아 항원을 발현하는 조성물.
10. iPS-유래된 폐 오가노이드 내에 불활성화된 태아 줄기 세포를 포함하는 불활성화된 태아 세포의 조성물로서, 상기 집단 내 세포가
    AIM2, AQP4, AURKA, BMP5, CDCA7, CEP55, CYP4B1, DACH1, EMP2, EPB41L4A, GJB2, MAOA, MELK, MKI67, NEBL, NFIA, PHF19, RNF144B, 및 UHRF1의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 태아 항원을 발현하는, 조성물.
11. a. 불활성화된 태아 줄기 세포의 집단, 및
    b. 면역 반응 및/또는 MHC I 발현을 자극하는 제제,를 포함하는 백신 조성물.
12. 제11항에 있어서, 불활성화된 태아 줄기 세포가 돌연변이유발된 태아 줄기 세포를 함유하는 백신 조성물.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 대상체에서 암의 치료를 위해 사용하기 위한 백신 조성물.
14. 제13항에 있어서, 암이 태아 줄기 세포 특징(fetal stem cells signature)을 갖는, 백신 조성물.
15. 제11항 또는 제12항에 따른 백신 조성물 및 면역화를 위한 설명서를 제공하는 정보 전단을 포함하는 키트(kit).
16. 대상체에서 암을 치료하기 위한 동시의, 별도의 또는 순차적인 투여에 의해 사용하기 위한, i) 불활성화된 태아 줄기 세포의 집단, 및 ii) MHC 발현 및/또는 면역 반응을 활성화시키는 화합물의 조합된 제제.
17. 제16항에 있어서, 암이 방광 암종, 유방 암종, 자궁경부 암종, 담관암종, 결장직장 암종(colorectal carcinoma), 위 육종, 신경교종, 폐 암종, 림프종, 급성 및 만성 림프종 및 골수 백혈병, 흑색종, 다발 골수종, 골육종, 난소 암종, 췌장 암종, 전립선 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 종양, 및 고형 종양 및 조혈 악성종양의 모든 아형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조합된 제제.

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