WO2002092630A1 - High density lipoprotein-reactive peptides - Google Patents

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WO2002092630A1
WO2002092630A1 PCT/JP2002/004697 JP0204697W WO02092630A1 WO 2002092630 A1 WO2002092630 A1 WO 2002092630A1 JP 0204697 W JP0204697 W JP 0204697W WO 02092630 A1 WO02092630 A1 WO 02092630A1
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cholesterol
acid sequence
peptide
reactive peptide
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PCT/JP2002/004697
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Manabu Niimi
Kazushi Kanatani
Masakazu Adachi
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Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to peptides having specific binding properties to cholesterol of high-density lipoprotein (HDL), foam cell-reactive peptides, and medicaments containing them.
  • HDL high-density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoproteins
  • LDL low density lipoprotein
  • Enzymes such as lecithin-cholesterol acyltransferase (LC AT), hepatic lipase (HT GL), lipoprotein lipase (LPL) and cholesteryl ester transfer protein (CETP) are known to be effective. Details of their mechanism of action—interactions between lipoproteins or their association with abnormalities in lipid metabolism are not yet clear.
  • LC AT lecithin-cholesterol acyltransferase
  • HT GL hepatic lipase
  • LPL lipoprotein lipase
  • CETP cholesteryl ester transfer protein
  • foam cells are involved in the accumulation of cholesterol in peripheral tissues.
  • foam cells are cells in which macrophages in the blood vessel wall derived from monocytes in the blood phagocytose fat and accumulate large amounts of lipid droplets (mainly CE) in the cells.
  • the modified denatured LDL is taken up into the cell via the scavenger receptor without restriction, and foaming is established.
  • the appearance of foam cells is known to be an important factor in the development and progression of arteriosclerosis in hypercholesterolemia.
  • the present invention provides a specific component of the TG-rich lipoprotein involved in the interaction, the region thereof, and the structural knowledge, and further provides an HDL-reactive peptide having a specific structure. Is what you do.
  • the present invention also seeks to provide new information on the interaction between cholesterol and lipoproteins accumulated in peripheral tissues such as blood vessel walls, particularly on the mechanism of cholesterol extraction.
  • the present invention is useful for understanding and improving lipid metabolism abnormalities that have a significant effect on the occurrence, progress, prognosis, etc. of various arteriosclerotic diseases such as heart diseases such as myocardial infarction and cerebrovascular disorders such as stroke. It is to provide a simple means. Disclosure of the invention
  • the present inventors have been studying lipid metabolism abnormalities for a long time, and have already used remnant-like lipoprotein (RLP) (arterial) as a clinical index reflecting the abnormalities. Curing, 20, 79-88 (1992); Clin. Chim. Acta., 223, 53-71 (1993); see Patent No. 2657225, etc.) and an improved measuring technique of CETP that works in the lipid exchange (Patent No. 3043528) ) has been provided.
  • RLP remnant-like lipoprotein
  • the present invention obtained a new finding that HDL and LDL reacted directly by accident, and confirmed that this was a reaction through a specific region of apoB-100 of LDL. It was completed based on.
  • RLP has been characterized as a serum lipoprotein that does not react with antibodies to apoB-100, which is a component of VLDL, IDL, and LDL, and apoA-I, which is a component of HDL.
  • apoB-100 which is a component of VLDL, IDL, and LDL
  • apoA-I which is a component of HDL.
  • HDL reacts directly with TG-rich VLDL, IDL and LDL via apoB-100 contained therein. It is intended to provide new information and to provide a specific area that is responsible for the response of the determined Apo B-100.
  • an HDL-reactive peptide which is either (a) or (b) below.
  • a peptide comprising an amino acid sequence modified by substitution, deletion, addition or insertion in one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by the above), and which is specific to HDL cholesterol.
  • Peptides having binding properties were conducted on the effects of the above-mentioned peptide and its modified peptide, and it was found that these peptides have an effect of extracting cholesterol from foam cells generated in the early stage of atherosclerosis. . Substances that have the effect of extracting cholesterol from foam cells suppress various reactions such as plaque formation, thrombus formation, and atherosclerosis from foam cells. Useful. '
  • a foam cell-reactive peptide which is either (a) or (b) below.
  • a peptide comprising an amino acid sequence modified by substitution, deletion, addition or insertion in one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in (a) above, and cholesterol from foam cells A peptide having an extracting effect.
  • pharmaceuticals such as peripheral tissue cholesterol withdrawing agents, lipid metabolism ameliorating agents, and arteriosclerosis preventive and therapeutic agents comprising the above HDL-reactive peptide or foam cell-reactive peptide as an active ingredient are disclosed. Provided.
  • a peripheral tissue cholesterol withdrawing drug a lipid metabolism ameliorating drug containing the HDL-reactive peptide or the foam cell-reactive peptide and a pharmaceutically acceptable carrier, an arteriosclerosis preventive agent, Pharmaceutical compositions, such as therapeutic agents, are provided.
  • the above-mentioned HDL-reactive peptide or foam cell-reactive peptide is used for the manufacture of a medicament such as a peripheral tissue cholesterol extractant, a lipid metabolism disorder ameliorating drug, and a therapeutic drug for preventing arteriosclerosis.
  • a medicament such as a peripheral tissue cholesterol extractant, a lipid metabolism disorder ameliorating drug, and a therapeutic drug for preventing arteriosclerosis.
  • a method for treating peripheral tissue cholesterol accumulation, lipid metabolism disorder or arteriosclerosis which comprises administering an effective amount of the HDL-reactive peptide or the foam cell-reactive peptide.
  • amino acid sequence of Apo B_100 and its position number are described in accordance with “apolipoprotein B-100 precursor-human, ACCESSION: LPHUB, PID: g71789, NCBI Sequence Viewer].
  • FIG. 1 is a diagram showing the reactivity of B100 FL with an anti-apo B_100 monoclonal antibody (JI-H).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of lipoprotein analysis (HPLC) of the B 100FL unbound fraction (A) and the unbound fraction (B) in the control gel.
  • FIG. 3 is a view showing the results of protein analysis by SDS gel electrophoresis of the B 100 FL non-binding fraction and the binding fraction.
  • FIG. 4 shows the action of the peptide of the present invention to extract cholesterol from RAW264 cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the effect of the peptide of the present invention on the vascular tissue of the atherosclerotic quail model.
  • a (16-fold) and B (40-fold) indicate the control group, and C (16-fold) and D (40-fold) indicate the peptide-administered group.
  • HDL-reactive peptide of the present invention will be described in detail.
  • the HDL-reactive peptide is characterized by having a specific binding property to HDL cholesterol.
  • HDL-reactive peptide exhibits binding property by having specific affinity for free cholesterol and / or CE held by HDL. And this is HDL Free cholesterol and Z or CE have specific affinity for the peptide and show binding.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a characteristic amino acid sequence showing the binding property of HDL to cholesterol, and the peptide containing the amino acid sequence has specific binding property to HDL cholesterol. This is a preferred example of the HDL-reactive peptide.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence corresponding to a partial region of apoB-100, which is a constituent apoprotein of VLDL, 10 and 100, and This corresponds to a sequence consisting of the 51st amino acid residue from the 2nd 297th to the 2347th.
  • the amino acid sequence region encompasses the putative epitope region of the monoclonal antibody “JI-H”, which is the anti-apoB-100 antibody used for the measurement of RLP (J Cl in. Ligand Assay, 19 (3), 177 (1996)).
  • JI-H the anti-apoB-100 antibody used for the measurement of RLP
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence in which a part of the amino acid or the amino acid sequence is modified as long as the binding property of HDL to cholesterol is maintained. You may.
  • the modification of the amino acid sequence that is, the degree of “substitution, deletion, addition or insertion” and the position thereof are the same as those of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the variant may be a peptide of about 100 amino acid residues, preferably a peptide of about 6 to 60 amino acid residues, more preferably a peptide of about 20 to 50 amino acid residues. Petit Doka.
  • Examples of the modification include a peptide containing the 30 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a peptide containing the 30 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the like.
  • a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is particularly preferred.
  • the peptide retains the binding property of HDL to cholesterol by testing the binding property according to a conventional method.
  • One specific example of the test example is shown in Examples below.
  • Foam cell reactive peptide of the present invention will be described in detail. Foam cell-reactive peptides are characterized by having a cholesterol-extracting action from foam cells.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a partial amino acid sequence or an amino acid sequence in which the amino acid sequence is modified as long as the action of extracting cholesterol from the foam cells is maintained. It may be hot.
  • the modification of the amino acid sequence that is, the degree of “substitution, deletion, addition or insertion” and the position thereof are the same as those of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the variant may be a peptide of about 100 amino acid residues, preferably a peptide of about 6 to 60 amino acid residues, more preferably a peptide of about 20 to 50 amino acid residues.
  • No. In the modification it is important to include the 6 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and preferably the 20 amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Examples of the modification include a peptide containing the 30 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a peptide containing the 30 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the like.
  • a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is particularly preferred.
  • the foam cell-reactive peptide has an action of extracting cholesterol from the foam cells according to Examples described later.
  • these HDL-reactive peptide and foam cell-reactive peptide may be collectively referred to as “the peptide of the present invention”.
  • the peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to its amino acid sequence.
  • the method includes a conventional liquid phase method and a solid phase method for peptide synthesis.
  • such a peptide synthesis method includes a stepwise erosion method in which amino acids are sequentially linked one by one based on amino acid sequence information to extend the chain, and a fragment consisting of several amino acids is used.
  • a fragment condensing method in which each fragment is synthesized in advance and then each fragment is subjected to a coupling reaction, and the peptide of the present invention may be synthesized by any of them.
  • the condensation method employed in the above peptide synthesis can also follow various conventional methods. '' Specifically, for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, oxidation reduction method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1-hydroxybenzotriazole) , N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norpolonene-2,3-dicarboximide) method, the Woodward method and the like.
  • the solvent that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this kind of peptide condensation reaction.
  • Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • the hydroxyl group in the amino acid or peptide not involved in the reaction is generally converted into a lower alkyl ester such as a methyl ester, an ethyl ester or a tertiary butyl ester by esterification; -Can be protected as methoxybenzyl ester, p-nitro benzyl ester and aralkyl ester.
  • Amino acids having a functional group on the side chain, for example, the hydroxyl group of T yr may be an acetyl group, a benzyl group, or a benzyloxy group.
  • the guanidino group of Arg is a nitro group, a tosyl group, a 2-methoxybenzenesulfonyl group, a methylene-2-sulfonyl group, a benzyloxycarbonyl group, an isopornyloxycarbonyl group, an adamantyloxycarbonyl group. It can be protected by a suitable protecting group such as a group.
  • the deprotection reaction of these protecting groups in the amino acid having the above-mentioned protecting group, the peptide and the finally obtained peptide of the present invention can also be carried out by a conventional method, for example, a catalytic reduction method, liquid ammonia sodium, hydrogen fluoride or the like. , Hydrogen bromide, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid, and the like.
  • the thus-obtained peptide of the present invention can be obtained by a conventional method, for example, by using an ion-exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography (HPLC), or countercurrent distribution method. Purification can be performed as appropriate according to a method commonly used in the field of chemistry.
  • the peptide of the present invention can be produced according to a genetic engineering technique utilizing a DNA sequence encoding the peptide.
  • DNA encoding the peptide of the present invention can be prepared according to a conventional method based on the amino acid sequence information of the HDL-binding peptide provided by the present invention (for example, Science, 224, 1431). (1984); Biochem. Biophys. Res. Co Maraud., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983), etc.).
  • the DNA can be synthesized by a chemical synthesis using a phosphoramidite method or a triester method.
  • the DNA can be synthesized on a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer. Double-stranded fragments are chemically synthesized by synthesizing a complementary strand and either annealing the strands together under appropriate conditions or adding a complementary strand using a DNA polymerase with an appropriate primer sequence. It can also be obtained from chain products.
  • the amino acid sequence to be encoded can be modified if desired.
  • site-directed mutagenesis using oligonucleotides Zaller, M., et al., Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982)
  • cassette mutagenesis Well, J., et al., Gene, 34, 315-323 (1985)).
  • the production and expression of the desired peptide using the DNA can be performed according to conventional techniques well known in the art (for example, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Co., 130, 692). (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 5990 (1983), etc.).
  • the DNA encoding the peptide of the present invention can also be prepared using an existing DNA encoding apoB-100.
  • the desired peptide obtained is subjected to various separation operations utilizing its physical and chemical properties (“Biochemical Data Book II”, pp. 1175-1259, 1st edition, 1st print, June 23, 1980) Biochemistry, 25 (25), 8274-8277 (1986); see Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987), etc.).
  • the peptides of the present invention include peptides having a specific binding property to HDL cholesterol and peptides having an action of extracting cholesterol from peripheral tissues, especially foam cells. Therefore, the peptide of the present invention utilizes these actions to provide a mechanism for lipid transcription and metabolism, a mechanism for atherosclerosis in peripheral tissues, and a thrombus generation. It is used as a research reagent for various purposes such as biomechanism, and can be further used, for example, in a pharmaceutical composition containing it as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition uses the action of the active ingredient of the present invention to specifically bind to the cholesterol of HDL to produce an abnormal lipoprotein or TG in which metabolism such as RLP is stagnated.
  • It can be used for imparting or promoting reactivity with HDL to rich lipoproteins. Further, it can be used for the purpose of improving lipid metabolism in coronary arteries, large arteries, peripheral arteries, etc., and preventing or treating arterial sclerosis by utilizing the action of extracting cholesterol from peripheral cells. .
  • the pharmaceutical composition is a medicine for improving lipid metabolism, preventing or treating arteriosclerosis.
  • As a medicament As a medicament.
  • the pharmaceutical composition is used so that the active ingredient is effectively presented to the target RLP or TG-rich lipoprotein or artery (particularly the blood vessel wall).
  • Oral administration of a preparation prepared to be absorbed can be exemplified. All of these preparations and forms of use can be carried out according to a conventional method.
  • the active ingredient, the peptide of the present invention can be lipidated, if desired.
  • the use of a system (DDS) using a drug delivery substance capable of binding to a target RLP or TG-rich lipoprotein can also be preferably exemplified.
  • Examples of the drug-delivery substance include an antibody (preferably a polyclonal antibody) against an apoprotein component such as apoB-100, which is a component present in the target lipoprotein, and the like.
  • the peptide of the present invention can be effectively targeted to a target lipoprotein.
  • compositions contain a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention as an active ingredient, and are prepared according to a conventional method together with this and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a DNA comprising a sequence encoding the peptide of the present invention is provided.
  • the DNA is useful for the above-described production of the peptide of the present invention by genetic engineering techniques, and the DNA is useful for use in a pharmaceutical composition containing the DNA as an active ingredient.
  • This pharmaceutical composition is used as a medicine targeting RLP or TG-rich lipoproteins and arteries, and is useful in the same use as the above-mentioned pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention activates the above-mentioned reverse transfer of cholesterol by reacting it with HDL by utilizing the action of extracting various lipids such as cholesterol and / or TG from HDL (ef flux).
  • various lipids such as cholesterol and / or TG from HDL (ef flux).
  • ef flux For the purpose of promoting the metabolism of HDL.
  • Such a means of use may be, for example, as a pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention or its DNA as an active ingredient, or by extracting cholesterol from HDL by utilizing the peptide of the present invention, thereby obtaining a cholesterol-free HDL (Curr).
  • Lipid free apo A-1 can be positively generated in blood by the reaction of the peptide of the present invention with HDL, and thus cholesterol is deposited on the tissue via HDL. It is very useful for prevention, prevention of arteriosclerosis by forcible removal of cholesterol, or prevention of vascular restenosis.
  • the peptide of the present invention utilizes the action of directly extracting cholesterol from foam cells during exercise I to extract cholesterol from a blood vessel already having arteriosclerosis. It is extremely useful for preventing and treating the progression of blood vessels, or preventing vascular restenosis.
  • the use as the above-mentioned pharmaceutical composition includes the use of the peptide of the present invention in vitro.
  • Lipid free apo A_l can be produced by subjecting the peptide of the present invention to a reaction with HDL, and the Lipid free apo A_l is It is useful for prevention and treatment of diseases and conditions.
  • extracorporeal circulation using a force ram containing the peptide of the present invention as an active ingredient can be exemplified.
  • the extracorporeal circulation is not particularly limited as long as it enables effective contact between the peptide of the present invention and the blood to be treated (HDL).
  • any carrier having the peptide of the present invention immobilized thereon is suitable.
  • Can be used for Extracorporeal circulation can be performed according to, for example, the extracorporeal circulation described in Japanese Patent No. 2835923, except that a carrier having the peptide of the present invention immobilized thereon is used as a carrier.
  • the peptide (B100FL) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was chemically synthesized according to a conventional method.
  • the peptide was synthesized by Fmoc method from Fmoc-H-SAL resin (Watanabe Chemical) according to the above amino acid sequence.
  • the protected peptide resin was deprotected by treatment with TFA: phenol: thioanisole: 1,4-butanedithiol: water (82.5: 5: 5: 2.5: 5) for 3 hours.
  • the target peptide thus obtained was analyzed by mass spectrometry (Perseptive Biosysteis; Voyager DE / matrix assisted laser desorption ionization-time oi f 1 ight: MALDI-TOF / mat r ix: alp a-cyano-4-hydroxyc innamic acid) and amino acid analysis (hydrolysis in a sealed tube with constant boiling point hydrochloric acid at 110 ° C for 24 hours Z Hitachi L-1 8500 amino acid analyzer).
  • mass spectrometry Perseptive Biosysteis; Voyager DE / matrix assisted laser desorption ionization-time oi f 1 ight: MALDI-TOF / mat r ix: alp a-cyano-4-hydroxyc innamic acid
  • amino acid analysis hydrolysis in a sealed tube with constant boiling point hydrochloric acid at 110 ° C for 24 hours Z Hitachi L-1 8500 amino acid analyzer.
  • B100FL showed specific reactivity to JI_H (FIG. 1: vertical axis shows absorbance (OD450), horizontal axis shows concentration of immobilized peptide (ng / mL)).
  • HDL To 2 mL of affinity gel of anti-Apo A-I monoclonal antibody, 1 mL of human plasma was added to specifically adsorb HDL. The adsorbed HDL was eluted with 3 M sodium thiocyanate, and the eluate was buffer-exchanged with PBS using a desalting column to prepare HDL.
  • affinity gels for each of the anti-apo A-I monoclonal antibody and the anti-apo B-100 monoclonal antibody were prepared according to a conventional method (Japanese Patent Publication No. 7-104351).
  • the HDL (20 g as apo A-I amount) and the B100 FL affinity gel were allowed to react at room temperature for 30 minutes, and then allowed to stand for 15 minutes to sediment the gel, thereby separating the gel.
  • Total cholesterol content was measured by an automatic analyzer (TBA20R; Toshiba) using a cholesterol content measuring reagent L-TC II (Kyowa Medex).
  • Lipoprotein analysis Analyzed by HPLC of Tosoichi Lipoprotein Analysis System (Lipopropax XL / Eluent: TSK eluent LP-1, lmLZmiii .; Tosoichi). The sample was made up to 100 L and monitored for cholesterol color development.
  • Protein content Measured by luminosity ( ⁇ D 280) or color reaction (Lowry method) after sample delipidation (ethanol-ether).
  • Protein analysis Analyzed by SDS gel electrophoresis. After degreasing, the sample is solubilized with 1 SDS, treated with buffer (2 SDS / 10% Glycerol / 0.005% BPB / 20% 2-Mercaptoethanol) to make a sample, and subjected to normal electrophoresis (4-20% gradient). Gel).
  • FIG. 2 shows the results of lipoprotein analysis of the unbound fraction of B100FL (FIG. 2A) and the unbound fraction of the control gel (FIG. 2B).
  • the solid line shows the analysis results for these samples
  • the dashed line shows the results (baseline) for HDL samples.
  • Table 1 below shows the total amount of cholesterol in the unbound fraction of B100FL (“B100FL” in Table 1) and the unbound fraction in the control gel (“PBS” in Table 1) (Table 1).
  • FIG. 3 shows the results of protein analysis by SDS gel electrophoresis.
  • each lane is as follows.
  • HDL-4 Same as above HDL-4 fraction
  • A-1 which is a major apoprotein of HDL is recognized as a main band around 28,000 molecular weight by the treatment with B100FL (same as untreated), and apoprotein which is another component protein of HDL. (:, Apo A_II, Apo E, Apo A-IV, etc. were confirmed, and there was no difference in their composition ratio, etc.
  • the mouse monocytic leukemia cell line RAW264 was prepared at a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / mL in a DMEM medium supplemented with 10% FBS, and the ImL was spread on a 12-well plate at 37 ° C for 2 days. They were cultured in a C0 2 incubator scratch. Remove the medium in each well, wash the cells in each well once with ImL of DMEM (containing 0.2% BSA and 2 OmM glutamine, the same applies hereinafter), and transfer ImL of 40 g / inL acetylated LDL DMEM solution to each well. , And cultured in the same manner for 24 hours to incorporate acetilui-dani LDL into the cells. 0.2%: 63 Yoka? After washing the cells twice with 83 solution, ImL of DMEM solution of 0.3 mM dibutyl cAMP was added to each well, and the cells were cultured in the same manner for 2 hours.
  • test peptide was added to a final concentration of 202.0 or 0.2 ng ZmL, and the cells were cultured similarly for 24 hours.
  • each test peptide was dissolved in DMSO (5 mg / mL) to a concentration of 1 mg / mL.
  • DMSO fetal calf serum
  • a concentration of 1 mg / mL was diluted with DMEM as described above, and further diluted 10 times and 100 times with DMEM for the test.
  • a solution prepared by diluting only DMSO in the same DMEM final concentration: 0.4, 0.004, 0.004%
  • a positive control containing 2.5, 5.0, or 10 gZmL of defatted HDL were added. Each solution was used.
  • Fig. 4 shows the results.
  • P51 B-100FL, SEQ ID NO: 1
  • PS505 SEQ ID NO: 2
  • PS509 SEQ ID NO: 3
  • peptides P21, PS506, PS507, and PS508 that do not contain the 6amino acid sequence 232-1326 of B-100 did not show this cholesterol extraction activity.
  • a peptide containing the 6 amino acid sequence of 2321-2326 of B-100 (SEQ ID NO: 4) and a peptide containing the 20 amino acid sequence of 2307-2326 of B-100 (SEQ ID NO: 5) have the effect of extracting cholesterol. It was considered to have an anti-atherosclerotic effect.
  • Cholesterol (Wako Pure Chemical Industries) and corn oil (corn oil germ 100; Ajinomoto Co.) are mixed with commercially available foods (natural pet food "chick and quail") to a final concentration of 2% cholesterol and A cholesterol-loaded diet was prepared by adjusting to 15% corn oil.
  • test peptide (B-100FL) saline solution of 1.Omg / mL saline twice a week (intermediate administration 2 to 3 days) into the upper arm (under wing) vein (200 g / body).
  • test peptide (B-100FL) saline solution of 1.Omg / mL saline twice a week (intermediate administration 2 to 3 days) into the upper arm (under wing) vein (200 g / body).
  • physiological saline was similarly administered to be a control group.
  • a tissue specimen of the aortic arch which is considered to be the site with the highest incidence of atherosclerotic lesions, was prepared with a 4 / m-thick frozen section.
  • the tissue was subjected to hematoxylin-eosin staining, which is a general staining, and oil-red staining, which was a fat staining, and then examined under a microscope.
  • FIG. 5 shows a typical image of these tissues.
  • a (XI6) and B (X40) represent the control group
  • C (XI6) and D (X40) represent the histological images of the test group.
  • the peptide of the present invention can prevent the infiltration of lipids into blood vessels, thereby preventing the occurrence of arterial sclerosis at an early stage, and on the other hand, by extracting the infiltrated lipids from blood vessels, the progression of lesions It was shown to have the effect of suppressing
  • Example 2 The HDL reactivity of PS509 synthesized in Example 2 was tested according to Example 1 (3) (B_100 FL or PS509 was used as the test peptide.
  • the total cholesterol of the applied HDL was 12%). 7mg / dl).
  • a peptide having a novel amino acid sequence showing specific binding property of HDL to cholesterol Also, according to the present invention, co- There is provided a peptide having an action of extracting resterol. These peptides are useful as drugs for various diseases caused by, for example, arteriosclerosis, lipid metabolism disorder, cholesterol accumulation in peripheral tissues, and the like.

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Description

明 細 書 高密度リポ蛋白質反応性べプチド 技術分野
本発明は、 高密度リポ蛋白質 （HDL) のコレステロールに特異的な結合性を 有するぺプチド、 泡沫細胞反応性べプチド及びこれらを含有する医薬に関する。 背景技術
脂質は、 血液中では常にリポ蛋白質として存在し、 リポ蛋白質を介した脂質の 転送機構とその代謝機構が明らかにされてきている。
肝臓で合成されたトリグリセリド （TG) 、 コレステロールおよびコレステロ ールエステル （CE) は、 超低密度リポ蛋白質 （VLDL) として血液中に分泌 される。 VLDLは、 TGの一部を脂肪酸として抹梢組織に与え、 また脂質の一 部を HDLとの間で転送 ·交換して中間密度リポ蛋白質 （IDL) となり、 これ は HDLとの脂質交換によりさらに TGを失い CEに富んだ低密度リポ蛋白質
(LDL) となり、 肝臓および抹梢組織へ取り込まれてコレステロールを供給す る。
一方、 抹梢組織で不要となったコレステロールは、 HDLに引き抜かれて CE に変換された後、 上記 TGに富む VLDL、 I DLおよび LDLの TGと交換さ れ、 最終的には肝臓に逆転送される。 この血管壁などの抹梢組織から肝臓へのコ レステロール転送の過程がコレステロール逆転送 （R C T ： reverse cholesterol transport) であり、 これによつて抹梢組織へのコレステロールの 過剰な蓄積が防御されているものと考えられている （Medical Practice, vol.18, No.3， 473-480(2001)) 。
かかる H D Lと T Gに富むリポ蛋白質間の脂質交換或いは逆転送系に重要な働 きをするものとして、 レシチン ·コレステロールァシルトランスフェラーゼ (L C AT) 、 肝性リパーゼ （HT G L) 、 リポ蛋白リパーゼ （L P L) およびコレ ステリルエステル転送蛋白 （C E T P) などの酵素が知られているが、 それらの 作用機序ゃリポ蛋白質間の相互作用あるいは脂質代謝異常との関連についての詳 細は、 未だ明らかではない。
また、 抹梢組織におけるコレステロールの蓄積に関しては、 泡沫細胞が関与し ている。 すなわち、 泡沫細胞は、 血液中の単球に由来する血管壁内マクロファー ジが脂肪を貪食し、 細胞内に大量の脂肪滴 （主に C E) を蓄積した細胞であり、 L D Lがィ匕学修飾を受けた変性 L D Lがスカベンジャー受容体を介して制限なく 細胞内に取り込まれ、 泡沫化が成立する。 泡沫細胞の出現は、 高コレステロール 血症において動脈硬化が発症、 進展する重要な要因として知られている。
本発明の目的は、 脂質の転送と代謝機構における、 前記 HD Lと T Gに富むリ ポ蛋白質間の相互作用を明らかにする新規な情報を提供しょうとするものである。 また、 本発明は、 当該相互作用に関与する T Gに富むリポ蛋白質の特定の成分 とその領域および当該構造的知見を与えるものであり、 ひいては、 特定の構造か らなる H D L反応性べプチドを提供するものである。
また、 本発明は、 血管壁等の抹梢組織に蓄積したコレステロールとリポ蛋白質 間の相互作用、 特にコレステロール引き抜き機構に対する新規な情報を提供しよ うとするものである。
さらに、 本発明は、 心筋梗塞等の心疾患や脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈 硬化性疾患等の発生、 進展、 予後等に重大な影響を及ぼす脂質代謝異常の把握と その改善に有用な手段を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 かねてより脂質代謝異常にかかる研究を重ねてきており、 既に 当該異常を反映する臨床指標としてのレムナント様リポ蛋白質 （R L P ) (動脈 硬化、 20, 79-88(1992); Clin. Chim. Acta., 223, 53- 71 (1993)；特許第 2657225 号等参照） および前記脂質交換に働く CETPの改良測定技術 （特許第 3043528 号） 等を提供してきている。
本発明は、 これに引き続く研究過程において、 偶然にも、 HDLと LDLが直 接に反応するとの新規な知見を得、 これが LDLのアポ B— 100の特定領域を 介した反応であるとの確認に基づいて完成されたものである。
HDLが TGに富むリポ蛋白質と直接に反応して脂質交換をするという新知見 により、 リポ蛋白質代謝において停滞し血中にうっ滞する異常なリポ蛋白質と考 えられている上記 R LPの成因とその特性がうまく説明できた。 RLPは、 VL DL、 I DLおよび LDLの構成アポ蛋白であるアポ B— 100と HDLの構成 アポ蛋白であるアポ A— Iに対する抗体と反応しない血清リポ蛋白質として特徴 付けられている。 而して、 RLPは、 正常な TGに富むリポ蛋白質とは異なって、 上記した HDLとの反応に関与するアポ B— 100の特定領域を提示していない ことから、 HDLとの反応ができず、 脂質交換とその代謝が滞っているものと考 えられる。
即ち、 本発明は、 前記した脂質の転送機構ないしリポ蛋白質の代謝機構におい て、 HDLが、 TGに富む VLDL、 I D Lおよび L D Lと直接に、 それらが有 するアポ B— 100を介して反応するとの新規な情報を提供するものであり、 さ らに、 決定されたアポ B— 100の当該反応を担う特定領域の提供にかかるもの である。
而して、 本発明によれば、 下記 （a) または （b) のいずれかである HDL反 応性ペプチドが提供される。
(a) 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
(b) 上記 ) に示されるアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸残 基が置換、 欠失、 付加もしくは挿入により改変されたアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって、 且つ HDLのコレステロールに特異的な結合性を有するぺプチド。 さらに、 上記のペプチド及びその改変ペプチドの作用について種々検討したと ころ、 これらのぺプチドは動脈硬ィヒ症の初期段階において生成する泡沫細胞から コレステロールを引き抜く作用を有していることが判明した。 泡沫細胞からコレ ステロールを引き抜く作用を有する物質は、 泡沫細胞からプラーク生成、 血栓の 生成、 動脈硬化等の各種の反応を抑制することから、 脂質代謝異常改善薬、 動 R 硬化症予防治療薬として有用である。 '
従って、 本発明によれば、 下記 ( a ) または （b ) のいずれかである泡沫細胞 反応性べプチドが提供される。
( a ) 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
( b) 上記 （a) に示されるアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸残 基が置換、 欠失、 付加もしくは挿入により改変されたアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって、 且つ泡沫細胞からのコレステロール引き抜き作用を有するペプチド。 また、 本発明によれば、 上記 HD L反応性ペプチド又は泡沫細胞反応性べプチ ドを有効成分とする抹梢組織コレステロール引き抜き薬、 脂質代謝異常改善薬、 動脈硬化症予防治療薬等の医薬が提供される。
さらに、 本発明によれば、 上記 HD L反応性ペプチド又は泡沫細胞反応性ぺプ チド及び薬学的に許容される担体を含有する抹梢組織コレステロール引き抜き薬、 脂質代謝異常改善薬、 動脈硬化症予防治療薬等の医薬組成物が提供される。
さらに、 本発明によれば、 上記 HD L反応性ペプチド又は泡沫細胞反応性ぺプ チドの抹梢組織コレステロール引き抜き薬、 脂質代謝異常改善薬、 動脈硬化症予 防治療薬等の医薬製造のための使用が提供される。
さらにまた、 本発明によれば、 上記 HD L反応性ペプチド又は泡沫細胞反応性 ぺプチドの有効量を投与することを特徴とする抹梢組織コレステロール蓄積、 脂 質代謝異常又は動脈硬化症の処置方法が提供される。
尚、 本明細書におけるアミノ酸、 ペプチド、 塩基配列、 核酸等の略号による表 示は、 I U P A C、 I U Bの規定、 「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書 等の作成のためのガイドライン」 （特許庁編） および当該分野における慣用記号 に従うものとする。
また、 アポ B_ 100のアミノ酸配列とその位置番号は、 「apolipoprotein B-100 precursor-human, ACCESSION: LPHUB, PID: g71789, NCBI Sequence Viewer] に従い表記する。 図面の簡単な説明
図 1は、 B 100 FLと抗アポ B_ 100モノクローナル抗体 ( J I— H) と の反応性を示す図である。
図 2は、 B 100FL非結合分画 （A) と対照ゲルにおける非結合分画 (B) のリポ蛋白質解析 （HPLC) 結果を示す図である。
図 3は、 B 100 F L非結合分画および結合分画の S D Sゲル電気泳動による 蛋白質解析結果を示す図である。
図 4は、 本発明ペプチドの RAW264細胞からのコレステロール引き抜き作 用を示す図である。
図 5は、 動脈硬化うずらモデルの血管組織に対する本発明べプチドの効果を示 す図である。 A (16倍） 及び B (40倍） は対照群を、 C (16倍） 及び D (40倍） はペプチド投与群を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の H D L反応性べプチドにっき詳述する。
HD L反応性べプチドは、 HD Lのコレステロールに特異的な結合性を有する ことを特徴とする。
ここで 「HDLのコレステロールに特異的な結合性を有する」 とは、 HDL反 応性ペプチドが HDLの保持する遊離コレステロールおよび/または CEに特異 的な親和性を有することにより結合性を示すことを意味し、 また、 これは HDL の遊離コレステロールおよび Zまたは C Eが当該べプチドに特異的な親和性を有 することにより結合性を示す場合を包含する。
配列番号： 1に示されるアミノ酸配列は、 HD Lのコレステロールとの結合性 を示す特徴的なアミノ酸配列であり、 当該アミノ酸配列を含むペプチドは、 HD Lのコレステロールに特異的な結合性を有し、 HD L反応性べプチドの好適な具 体例である。
尚、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列は、 V L D L、 1 0 ぉょび1^ 0し の構成アポ蛋白であるアポ B— 1 0 0の一部領域に相当するアミノ酸配列であつ て、 その第 2 2 9 7番から 2 3 4 7番目の 5 1アミノ酸残基からなる配列に相当 する。
興味深いことに、 当該アミノ酸配列領域は、 R L Pの測定に使用されている抗 アポ B—1 0 0抗体であるモノクローナル抗体 「J I一 H」 の推定されるェピト ープ領域を包含している (J. Cl in. Ligand Assay, 19 (3) , 177 (1996) ) 。 而し て、 R L Pが代謝停滞し血中にうっ滞する T Gに富む異常なリポ蛋白質であつて、 これが当該モノクローナル抗体との反応性を持たないとの事実は、 本発明の知見 によく一致する。
HD L反応性ペプチドにおいて、 上記配列番号： 1に示されるアミノ酸配列は、 HD Lのコレステロールとの結合性が保持される限りにおいて、 その一部アミノ 酸またはアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列であってもよい。
ここで、 アミノ酸配列の改変、 即ち 「置換、 欠失、 付加もしくは挿入」 の程度 およびそれらの位置等は、 改変されたアミノ酸配列が、 配列番号： 1で示される アミノ酸配列と同様の性質を有する同効物であれば、 即ち、 HD Lのコレステロ ールとの結合性が保持される限りにおいて特に制限はない。 その改変体としては 約 1 0 0アミノ酸残基程度のペプチドであってもよく、 好ましくは 6〜6 0アミ ノ酸残基程度のペプチド、 より好ましくは 2 0〜5 0アミノ酸残基程度のぺプチ ドカ挙げられる。 その改変においては、 配列番号： 4の 6アミノ酸配列を含むこ とが重要であり、 好ましくは配列番号： 5の 2 0アミノ酸配列を含むものである。 改変例としては配列番号： 2の 3 0アミノ酸配列を含むぺプチド、 配列番号： 3 の 3 0アミノ酸配列を含むペプチド等が挙げられる。 HD L反応性ペプチドのう ち、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に好ましい。 尚、 HD L反応性ペプチドにおいて、 これが HD Lのコレステロールとの結合 性を保持していることの確認は、 当該結合性を常法に従い試験することにより行 い得る。 当該試験例の一具体例は、 後記実施例に示されている。
本発明の泡沫細胞反応性べプチドにっき詳述する。 泡沫細胞反応性べプチドは、 泡沫細胞からのコレステロール引き抜き作用を有することを特徴とする。
泡沫細胞反応性ペプチドにおいて、 上記配列番号： 1に示されるアミノ酸配列 は、 泡沫細胞からのコレステロール引き抜き作用が保持される限りにおいて、 そ の一部ァミノ酸またはァミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列であつてもよい。 ここで、 アミノ酸配列の改変、 即ち 「置換、 欠失、 付加もしくは挿入」 の程度 およびそれらの位置等は、 改変されたアミノ酸配列が、 配列番号： 1で示される アミノ酸配列と同様の性質を有する同効物であれば、 即ち、 泡沫細胞からのコレ ステロ一ル引き抜き作用が保持される限りにおいて特に制限はない。 その改変体 としては約 1 0 0アミノ酸残基程度のペプチドであってもよく、 好ましくは 6〜 6 0アミノ酸残基程度のペプチド、 より好ましくは 2 0〜5 0アミノ酸残基程度 のべプチドが挙げられる。 その改変においては、 配列番号： 4の 6アミノ酸配列 を含むことが重要であり、 好ましくは配列番号： 5の 2 0ァミノ酸配列を含むも のである。 改変例としては配列番号： 2の 3 0アミノ酸配列を含むぺプチド、 配 列番号： 3の 3 0アミノ酸配列を含むペプチド等が挙げられる。 HD L反応性べ プチドのうち、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に好 ましい。
なお、 泡沫細胞反応性べプチドにおいて、 これが泡沫細胞からのコレステロ一 ルの引き抜き作用を有することの確認は、 後記実施例に従い行うことができる。 以下、 これらの HD L反応性ペプチド及び泡沫細胞反応性ペプチドを併せて 「 本発明ペプチド」 ということがある。
本発明ペプチドは、 そのアミノ酸配列に従って、 一般的な化学合成法により製 造することができる。 該方法には、 通常の液相法および固相法によるペプチド合 成法が包含される。
かかるペプチド合成法は、 より詳しくは、 アミノ酸配列情報に基づいて、 各ァ ミノ酸を 1個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲ一ショ ン法と、 アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、 次いで各フラグメン トをカツプリング反応させるフラグメント ·コンデンセ一ション法とを包含し、 本発明ペプチドの合成は、 そのいずれによってもよい。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、 各種常法方法に従うことができる。' 具体的には、 例えばアジド法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性エステル法、 酸 化還元法、 D P P A (ジフエニルホスホリルアジド） 法、 D C C +添加物 （1一 ヒドロキシベンゾトリァゾ一ル、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキ シ— 5—ノルポルネンー 2 , 3—ジカルボキシイミド等) 法、 ウッドワード法等 を例示できる。 これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用 されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。 そ の例としては、 例えばジメチルホルムアミド （DM F) 、 ジメチルスルホキシド (DM S O) 、 へキサホスホロアミド、 ジォキサン、 テトラヒドロフラン （TH F) 、 酢酸ェチル等およびこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
尚、 上記ペプチド合成反応に際して、 反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチド における力ルポキシル基は、 一般にはエステル化により、 例えばメチルエステル、 ェチルエステル、 第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル；例えばベン ジルエステル、 p—メ卜キシベンジルエステル、 p—ニト口べンジルエステルァ ラルキルエステル等として保護することができる。 また、 側鎖に官能基を有する アミノ酸、 例えば T y rの水酸基は、 ァセチル基、 ベンジル基、 ベンジルォキシ カルポニル基、 第三級プチル基等で保護されてもよいが、 必ずしもかかる保護を 行う必要はない。 さらに例えば A r gのグァニジノ基は、 ニトロ基、 トシル基、 2—メトキシベンゼンスルホニル基、 メチレン— 2—スルホニル基、 ベンジルォ キシカルポニル基、 ィソポルニルォキシカルポニル基、 ァダマンチルォキシカル ポニル基等の適当な保護基により保護することができる。
上記保護基を有するアミノ酸、 ぺプチドおよび最終的に得られる本発明べプチ ドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、 慣用される方法、 例えば接触還元 法や、 液体アンモニアノナトリウム、 フッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 トリフ ルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、 実施す ることができる。
かくして得られる本発明ペプチドは、 通常の方法に従って、 例えばイオン交換 樹脂、 分配クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロ マトグラフィ一、 高速液体クロマトグラフィー （H P L C) 、 向流分配法等のぺ プチド化学の分野で汎用されている方法に従って、 適宜その精製を行うことがで 'きる。
また、 本発明ペプチドは、 当該ペプチドをコードする D NA配列を利用した遺 伝子工学的手法に従い製造することができる。
これら手法は、 常法に従うことができ、 例えば、 D NAの合成、 当該 D NAの 発現を可能とする発現べクタ一の製造、 該ベクタ一の宿主細胞における発現方法 等は、 いずれも一般的な遺伝子工学的手法に準ずることができる （Molecular Cloning 2d. Ed. , Cold Spr ing Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I、 Π、 I I I」 、 日本生化学会編 (1986)等参照） 。 例えば、 本発 明ペプチドをコードする D NAは、 本発明により提供される HD L結合性べプチ ドのアミノ酸配列情報に基づいて、 常法に従い調製することができる （例えば、 Science, 224, 1431 (1984)； Biochem. Biophys. Res. Co匪. , 130, 692 (1985)； Proc. Nat l. Acad. Sci . , USA. , 80, 5990 (1983) 等参照） 。 より具体的には、 DNAの合成は、 ホスホルアミダイド法またはトリエステル 法による化学合成によることができ、 例えば、 市販されている自動オリゴヌクレ ォチド合成装置上で行うこともできる。 二本鎖断片は、 相補鎖を合成し、 適当な 条件下で該鎖を共にァニーリングさせるか、 または適当なプライマー配列と共に DNAポリメラ一ゼを用い相補鎖を付加するかによって、 化学合成した一本鎖生 成物から得ることもできる。
上記 DNAにおいては、 所望により、 そのコ一ドするアミノ酸配列の改変を行 うことができ、 例えば、 オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法 (Zoller, M.， et al.， Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982)) 、 カセット 変異誘発法 (Well, J., et al.， Gene, 34, 315-323 (1985)) 等の公知の方法を 採用することができる。
当該 D N Aを利用した所望べプチドの製造および発現は、 この分野で周知慣用 の技術に従うことができる （例えば、 Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Co腿.， 130, 692 (1985)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80， 5990 (1983)等参照) 。
また、 本発明ペプチドをコードする DNAは、 既存のアポ B— 100をコード する DN Aを利用して調製することもできる。
得られた所望のペプチドは、 その物理的性質、 化学的性質等を利用した各種の 分離操作 （「生化学データーブック II」、 1175- 1259頁、 第 1版第 1刷、 1980年 6 月 23日株式会社東京化学同人発行； Biochemistry, 25 (25), 8274-8277(1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987)等参照） により分離、 精製することがで きる。
本発明べプチドには、 HDLのコレステロールに特異的な結合性を有するぺプ チド、 及び抹梢組織、 特に泡沫化細胞からコレステロールを引き抜く作用を有す るペプチドが含まれる。 従って、 本発明ペプチドは、 これらの作用を利用して、 脂質の転写機構や代謝機構、 抹梢組織における動脈硬化症の発生機構、 血栓の発 生機構等の各種目的の研究用試薬として利用されるが、 さらに、 例えばこれを有 効成分として含有する医薬組成物に利用できる。 例えば、 当該医薬組成物は、 有 効成分である本発明べプチドが、 HD Lのコレステロールと特異的に結合する作 用を利用して、 R L P等の代謝がうっ滞した異常リポ蛋白質あるいは T Gに富む リポ蛋白質に HD Lとの反応性を付与あるいは促進させる目的で使用できる。 ま た、 抹梢化細胞からコレステロールを引き抜く作用を利用して、 冠状動脈、 大動 脈、 抹梢動'脈等における脂質代謝改善、 動脈硬ィ匕症の予防治療等の目的で使用し 得る。
而して、 それらリポ蛋白質の代謝を正常化ないし促進するとともに動脈硬化症 の進展を防止することができ、 当該医薬組成物は、 脂質代謝を改善するための医 薬、 動脈硬化を予防又は治療するための医薬として使用し得る。
当該医薬組成物は、 標的とする R L Pや T Gに富むリポ蛋白質や動脈 （特に血 管壁） に有効成分が効果的に提示されるように使用され、 例えば、 食事性投与や 有効成分が腸管から吸収されるように調製された製剤の経口投与等を例示できる。 これらの製剤化と使用形態は、 いずれも常法に従い行うことができ、 その際に、 有効成分である本発明べプチドは、 所望により例えば脂質化することもできる。 また、 上記医薬組成物においては、 標的とする R L Pや T Gに富むリポ蛋白質 に結合性の薬物送達性物質を利用したシステム （D D S ) の採用も好適に例示で きる。
当該薬物送達性物質としては、 例えば標的リポ蛋白質に存在する成分であるァ ポ B- 1 0 0等のアポ蛋白成分に対する抗体 （好ましくはポリクロ一ナル抗体） 等を例示でき、 これらで修飾された本発明ペプチドは、 標的とするリポ蛋白質に 効果的にターゲティングされ得る。
これらの医薬組成物は、 薬学的有効量の本発明べプチドを有効成分として含有 し、 これと薬学的に許容される担体とともに常法に従い調製される。
さらに、 本発明によれば、 本発明ペプチドをコードする配列からなる D NAが 提供される。 当該 D NAは、 前記した、 本発明ペプチドの遺伝子工学的手法によ る製造に有用であり、 また、 当該 D NAは、 これを有効成分とする医薬組成物へ の利用に有用である。 この医薬組成物は、 R L Pあるいは T Gに富むリポ蛋白質 や動脈を標的とする医薬として使用され、 前記した本発明ペプチドを有効成分と する医薬組成物と同様の使用において有用である。
また、 本発明ペプチドは、 HD Lからコレステロールおよび/または T G等の 各種脂質を引き抜く （ef f lux) 作用を利用して、 これを HD Lに反応させること により、 前記したコレステロールの逆転送を賦活する目的であるいは HD Lの好 適な代謝を促進する目的で利用することができる。 当該利用手段としては、 例え ば、 本発明ペプチドまたはその D NAを有効成分として含有する医薬組成物とし て、 或いは、 本発明ペプチドの利用により HD Lからコレステロールを引き抜く ことによりコレステロールのない H D L ( Curr. Opin. Lipidol. , 7, 82 - 87 (1986)等参照、 以下、 「Lipid free apo A- 1」 とする。 ） を生成させる方法等 を例示することができる。
当該利用によれば、 本発明ペプチドと H D Lとの反応により血中で積極的に Lipid free apo A- 1を生じさせることができ、 而して、 HD Lを介してコレステ ロールの組織への沈着予防、 コレステロールの強制的な引き抜きによる動脈硬化 の予防、 或いは血管再狭窄の予防等に極めて有用である。
また、 前述のように本発明ペプチドは、 動 I中の泡沫細胞からコレステロール を直接引き抜く作用を利用して、 既に動脈硬ィ匕症になっている血管からのコレス テロールの引き抜きによる動脈硬ィ匕の進展防止及び治療、 あるいは血管再狭窄の 予防等に極めて有用である。
尚、 上記の医薬組成物としての利用は生体外 (in vi tro) での本発明ペプチド の利用を包含するものである。
生体外での利用においては、 例えば、 本発明ペプチドを HD Lとの反応に供す ることにより Lipid free apo A_lを生成でき、 当該 Lipid free apo A_lは上記の 疾患乃至病態の予防および処置に有用である。 具体的利用手段としては、 本発明 ぺプチドを有効成分とする力ラムを利用した体外循環を挙げることができる。 当 該体外循環は、 本発明ペプチドと被処理血液 （HDL) との有効な接触を可能と する態様であれば特に限定はなく、 例えば本発明べプチドが固定ィ匕された任意の 担体を好適に利用することができる。 体外循環は、 担体として本発明ペプチドが 固定化された担体を利用する以外は、 例えば特許第 2835923号に記載の体 外循環に準じて行うことができる。 実施例
以下、 本発明をさらに詳しく説明するため、 実施例を挙げるが本発明はこの範 囲に限定されるものではない。
実施例 1
(1) ペプチドの合成
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチド （B100FL) は、 常法に 従い化学合成した。
ペプチド合成は、 Fmoc- H- SAL樹脂 （渡辺化学） より、 上記アミノ酸配列に従 つて Fmoc法により合成した。 保護ペプチド樹脂は、 TFA：フエノール：チオア ニソ一ル： 1， 4一ブタンジチォ一ル：水 （82. 5 : 5 : 5 : 2. 5 : 5) で 3時間処理した脱保護した。
粗生成物からの目的べプチドの精製は、 以下の逆相 H P L Cにより行つた。 (逆相 H PLC)
カラム： Cosmosil 5C18MS(10X 250mm;Nacalai tesque)
溶離液： 0.1%TFAを含む水 Zァセトニトリル （ァセトニトリルのリニアグラジェ ント； 2.5mL/min. )
かくして得た目的ペプチドは、 質量分析 (Perseptive Biosysteis; Voyager DE/matrix assisted laser desorption ionization - time oi f 1 ight： MALDI-TOF /mat r ix： alp a-cyano-4-hydroxyc innami c acid) およびアミノ酸分析 （定沸点 塩酸にて封管中 110 °C 24時間加水分解 Z日立 L一 8500ァミノ酸分析計） により確認した。
(2) 抗アポ B- 100モノクローナル抗体 ( J I -H： J. Clin. Ligand Assay, 19 (3), 177 (1999)) との反応性 '
前記で得たペプチド （B 100FL) をコートしたプレートを用いた EL I S Aにて常法に従い確認した （特開平 4— 104798号参照） 。
B 100 FLは J I _Hに特異反応性を示した （図 1 ：縦軸は吸光度 （OD4 50) を横軸は固相化したペプチド濃度 (ng/mL) を示す） 。
(3) HDLとの反応性試験
抗アポ B— 100モノクローナル抗体 (J I -H) のァフィ二ティーゲル 25 に前記 （1) で得たペプチド （B 100FL) の 0. lmgを添加して B 10 0 FLのァフィ二ティーゲルを調製した。 B 100 FLを含まない PBSで同じ く処理したゲルを対照ゲルとして調製した。
抗アポ A— Iモノクローナル抗体のァフィ二ティ一ゲル 2 mLにヒト血漿 lmLを 添加して HD Lを特異的に吸着させた。 吸着した HD Lを 3 Mチォシアン酸ナ卜 リウムを用いて溶出し、 溶出液を脱塩カラムにて PBSにバッファー交換して、 HDLを調製した。
尚、 以上において、 抗アポ A— Iモノクローナル抗体および抗アポ B— 100 モノクローナル抗体 (J I一 H) のそれぞれのァフィ二ティ一ゲルは常法に従い 調製した （特公平 7— 104351号） 。
上記 HDL (アポ A— I量として 20 g) と B 100 FLァフィ二ティーゲ ルとを室温で 30分間反応させ、 その後 15分間静置してゲルを沈降させること によりゲルを分離した。
ゲルに結合しなかった分画 （B 100 FL非結合分画） と結合した分画 （B 1 00 FL結合分画） にっきそれぞれ常法に従って以下の解析を行った。 総コレステロール量：コレステロール量測定試薬 L一 TC II (協和メデックス ) を用いて自動分析装置 （TBA20R ;東芝） により測定した。
リポ蛋白質解析：東ソ一リポタンパク質分析システム （Lipopropax XL/溶離 液： TSK eluent LP-1， lmLZmiii.；東ソ一） の HP L Cにより解析した。 試料は 100 Lとし、 コレステロールの発色にてモニターした。
蛋白質量： 光度 （〇D 280) または試料の脱脂操作 （エタノール—エーテ ル） 後の呈色反応 （ローリ一法） により測定した。
蛋白質解析： SDSゲル電気泳動により解析した。 試料は脱脂操作後、 1 S D Sで可溶化しバッファ一 （2 SDS/10%Glycerol/0.005 %BPB/20%2- Mercaptoethanol)処理してサンプルとし、 通常の電気泳動 （4一 20%グラジェ ン卜ゲル) に付した。
(結果）
図 2に、 B 100FL非結合分画 （図 2A) と対照ゲルにおける非結合分画 (図 2B) のリポ蛋白質解析結果を示す。 図 2において、 実線はこれら試料にお ける解析結果を、 波線は HDLを試料とした場合の結果 （ベースライン） を示す。 また、 下記表 1に、 B 100FL非結合分画 （表 1中 「B 100FL」 ） と対 照ゲルにおける非結合分画 （表 1中 「PBS」 ） における、 総コレステロ一リレ量 (表 1中 「Cholesterol」 ) 、 リポ蛋白質解析 （図 2) での HDL—コレステロ ール （表 1中 「HDL_ ( 」 ） 、 P及光度および呈色反応による蛋白質量 （表 1中 「0. D. 280および 「Delipid Protein」 ) の解析結果を示す。
Figure imgf000017_0001
表 1より、 B 100 FLで処理された HDLの総コレステロール量は 0. 25 mgZdlであり、 対照に比べ、 約 1/15に減少していることが分かる。 リポ蛋白 質解析においても、 対照では HDL溶出画分にコレステロール （HDL— C) の ピークが認められるのに対して、 B 100FLで処理された HDLではコレステ 口一ルのピ一クはどこにも認められなかった。
一方、 蛋白質に関しては、 P及光度および呈色反応による蛋白質量において、 H
DLを B 100FLで処理しても殆ど変化は認められなかつた （表 1 ) 。
SDSゲル電気泳動による蛋白質解析の結果を図 3に示す。
図 3において、 各レーンは次のとおりである。
S t andard (Low) ：低分子量ス夕ンダード
B100FL (+) Unbound ： B 100 FL非結合分画
B100FL (!) Bound ： B 100 F L結合分画
B100FL (-) Unbound ：対照ゲルの非結合分画
B100FL (-) Bound ：対照ゲルの結合分画
B100FL (-) /Ge 1 (-)： HDL ：ゲルと未処理の H D L
HDL-4 ：同上 HDL— 4分画
LDL-3 ：同上 LDL— 3分画
Standard (High) ：高分子量スタンダード
図 3より、 B 100 FLによる処理によっても （未処理と同じく） 分子量 28 000付近に HDLの主要アポ蛋白質である A— 1がメインバンドとして認めら れ、 また HDLの他の構成蛋白質であるアポ (：、 アポ A_II、 アポ E、 アポ A— IV等が確認でき、 それらの構成比率等にも差は認められなかった。
以上より、 HDLを B 100FLと反応させると、 反応後には HDLのアポ A - Iをメインとした蛋白質のみが残り、 コレステロールおよびコレステロールェ ステルは殆ど認められなくなることが分かる。 これらのことから、 B100FL は、 HD Lのコレステロールおよびコレステロールエステルと相互作用を持ち、 これらを HDLのアポ蛋白質粒子から引き抜く作用を有するものと考えられる。 実施例 2 ペプチドの合成 実施例 1と同様にして表 2に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。 表 2
Figure imgf000019_0001
実施例 3 コレステロール引き抜き試験
粥状動脈硬化のモデルである RAW 264細胞からのコレステロール引き抜き 作用を試験した。
即ち、 マウス単球性白血病細胞株 RAW264を、 10%FBS加 DMEM培 地にて、 4X 105細胞/ mL濃度に調製し、 その ImLずつを 12ゥエルプレート にまき、 2日間 37°Cの C02インキュベータ一で培養した。 各ゥエルの培地を 取り除き、 ImLの DMEM (0. 2 %B S A及び 2 OmMグルタミンを含む。 以下 同じ） で各ゥエルの細胞を 1回洗い、 40 g/inLァセチル化 LDLの DMEM 溶液 ImLを各ゥエルに添加して、 同様に 24時間培養し、 細胞内にァセチルイ匕 L DLを取り込ませた。 0. 2%：63八加？83溶液にて細胞を2回洗浄後、 0. 3mMジブチル c AMPの DMEM溶液 ImLを各ゥエルに加えて同様に 2時間培養 した。
各ゥエルに被検ペプチドの 20 / Lを、 最終濃度が 20 2. 0又は 0. 2 n g ZmLとなるように添加して同様に 24時間培養した。
24時間後、 各ゥエルの上清をマイクロチューブに回収し、 1000 Orpmで 5分間遠心し、 その上清中のコレステロール量を前記の自動分析機で測定した。 尚、 各被検ペプチドは、 DMSOに溶解し (5mg/mL) 1 mg/mL濃度となる ように DMEMにて希釈し、 さらに、 これを、 DMEMにて、 10倍及び 100 倍希釈して試験に供した。 また、 対照として DMSOのみを同じく DMEM希釈 した溶液 （最終濃度： 0. 4、 0. 04、 0. 004%) 及び陽性対照として脱 脂 HDLの 2. 5、 5. 0又は 10 gZmL濃度の DMEM溶液をそれぞれ用い た。
結果を図 4に示す。
P 51 (B— 100FL、 配列番号： 1 ) 、 P S 505 (配列番号： 2) 及び PS 509 (配列番号： 3) の各ペプチドにおいて、 添加した濃度に依存的に、 ァセチル化 LDLにより泡沫化させた RAW264細胞からのコレステロール引 き抜きの強い活性が見られた。 一方、 B— 100の 2321—2326の 6アミ ノ酸配列を含まないぺプチド （P 21、 PS 506、 PS 507及び P S 508 ) では、 このコレステロールの引き抜き活性は見られなかった。
B— 100の 2321— 2326の 6アミノ酸配列を含むぺプチド （配列番号 ： 4) 及び B— 100の 2307— 2326の 20アミノ酸配列を含むぺプチド (配列番号： 5) は、 コレステロールを引き抜き作用を有し、 抗動脈硬化作用を 有することが考えられた。
実施例 4 動脈硬化モデルによる効果試験
コレステロール （和光純薬社） 及びコーン油 （コーン油胚芽 100 ；味の素社 ) を市販フーズ （ナチュラルペットフ一ズ 「ひよこ ·中びな （うずら） 」 ） に混 ぜ込み、 最終濃度が 2%コレステロール及び 15%コーン油となるよう調製して コレステロール負荷食とした。
正常うずらにこの負荷食を自由摂取させて 8週間飼育した。 飼育 5週目より、 被検ペプチド （B— 100FL) の 1. Omg/mL生食溶液を、 1週間に 2回 （投 与間隔は中 2日ないし 3日） 、 上腕 （翼下） 静脈に 200 L (200 g/ body) 投与した。 尚、 生理食塩水のみを同じく投与して対照群とした。
8週間の飼育後、 うずらを断頭し脱血を行い大動脈を摘出した。 摘出した大動 脈は直ちに 10 %ホルマリン固定液で 3日間固定し、 最も動脈硬化巣の発生率の 高い部位とされる大動脈弓の組織標本を 4 / m厚の凍結切片で作成した。 組織は、 一般染色であるへマトキシリン ·ェォジン染色及び旨肪染色であるオイルレツド 染色を施し検鏡した。
対照群において、 著しい血管内膜肥厚、 内膜肥厚部に蓄えられた多くの脂質、 内膜のみならず中膜にまで多く浸潤した脂質及び弾性繊維間に介在する平滑筋細 胞と脂質の共存からなる組織像が認められた。
一方、 被検ペプチド投与群では、 内膜に脂質の蓄積が若干認められるものの、 そのサイズや量は共に少なく、 形態学的な血管内膜障害も認められなかった。 ま た、 これらを反映して、 内膜肥厚、 中膜への脂質の浸潤も認められなかった。 これら代表的な組織像を図 5に示す。 同図において、 A (X I 6) 及び B ( X40) は対照群を、 C (X I 6) 及び D (X40) は試験群における組織像 を示す。
以上より、 本発明ペプチドは、 血管内への脂質の浸潤を防ぐことで、 動脈硬ィ匕 巣の発生を早い段階で防ぎ、 そして一方で浸潤した脂質を血管内から引き出すこ とで病巣の進行を抑える作用を有することが示された。
実施例 5
前記実施例 1 (3) に従い、 実施例 2で合成した PS 509の HDL反応性を 試験した （被検ぺプチドとして、 B _ 100 F L又は P S 509を使用。 ァプラ ィした HDLの総コレステロールは 12. 7mg/dl) 。
B— 100 FL処理による総コレステロール量の減少は約 72%であり、 PS 509ペプチド処理による総コレステロール量の減少は約 48 %であった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 HDLのコレステロールに特異的な結合性を示す新規なアミ ノ酸配列を有するペプチドが提供される。 また本発明によれば、 抹梢組織からコ レステロールを引き抜く作用を有するペプチドが提供される。 これらのペプチド は、 例えば動脈硬化症、 脂質代謝異常、 抹梢組織コレステロール蓄積等に起因す る各種の疾患用医薬として有用である。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （a) または （b) のいずれかである高密度リポ蛋白質反応性ぺプチ ：
(a) 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
(b) 上記 （a) に示されるアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸残 基が置換、 欠失、 付加もしくは挿入により改変されたアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって、 且つ高密度リポ蛋白質のコレステロールに特異的な結合性を有する
2. 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列を含むものである請求項 1記載の高 密度リポ蛋白質反応性べプチド。
3. 配列番号： 5に示されるアミノ酸配列を含むものである請求項 1記載の高 密度リポ蛋白質反応性べプチド。
4. 配列番号： 1、 2又は 3に示されるアミノ酸配列を有するものである請求 項 1記載の高密度リポ蛋白質反応性べプチド。
5. 下記 （a) 又は （b) のいずれかである泡沫細胞反応性ペプチド：
(a) 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
(b) 上記 （a) に示されるアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸残 基が置換、 欠失、 付加もしくは挿入により改変されたアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって、 且つ泡沫細胞からのコレステロ一ル弓 Iき抜き作用を有するぺプチド。
6. 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列を含むものである請求項 5記載の泡 沬細胞反応性ペプチド。
7. 配列番号： 5に示されるアミノ酸配列を含むものである請求項 5記載の泡 沫細胞反応性ペプチド。
8. 配列番号： 1、 2又は 3に示されるアミノ酸配列を有する請求項 5記載の 泡沫細胞反応性ペプチド。 \
9 . 高密度リポ蛋白質のコレステロールに特異的な結合性を有する請求項 5記 載の泡沫細胞反応性べプチド。
10. 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の高密度リポ蛋白質反応性べプチドを有 効成分とする医薬。
11 · 請求項 5〜 9のいずれか 1項記載の泡沫細胞反応性べプチドを有効成分と する医薬。
12. 動脈硬化症予防治療薬、 脂質代謝改善薬又は抹梢組織コレステロール引き 抜き薬である請求項 1 0又は 1 1記載の医薬。
13. 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の高密度リポ蛋白質反応性べプチド及び 薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
14. 請求項 5〜 9のいずれか 1項記載の泡沫細胞反応性べプチド及び薬学的に 許容される担体を含有する医薬組成物。 ，
15. 動脈硬化症予防治療薬、 脂質代謝改善薬又は抹梢組織コレステロール引き 抜き薬である請求項 1 3又は 1 4記載の医薬組成物。
16. 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の高密度リポ蛋白質反応性べプチドの医 薬製造のための使用。
17. 請求項 5〜 9のいずれか 1項記載の泡沫細胞反応性ペプチドの医薬製造の ための使用。
18. 医薬が、 動脈硬化症予防治療薬、 脂質代謝改善薬又は抹梢組織コレステロ —ル引き抜き薬である請求項 1 6又は 1 7記載の使用。
19. 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の高密度リポ蛋白質反応性べプチドの有 効量を投与することを特徴とする動脈硬化症、 脂質代謝異常又は抹梢組織コレス テロール蓄積に対する処置方法。
20. 請求項 5〜 9のいずれか 1項記載の泡沫細胞反応性べプチドの有効量を投 与することを特徴とする動脈硬化症、 脂質代謝異常又は抹梢組織コレステロ一ル 蓄積に対する処置方法。
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