WO2002080909A1 - Empleo de derivados de pirazolinas en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares - Google Patents

Empleo de derivados de pirazolinas en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares Download PDF

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WO2002080909A1
WO2002080909A1 PCT/ES2002/000137 ES0200137W WO02080909A1 WO 2002080909 A1 WO2002080909 A1 WO 2002080909A1 ES 0200137 W ES0200137 W ES 0200137W WO 02080909 A1 WO02080909 A1 WO 02080909A1
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trifluoromethyl
dιhιdro
dihydro
methylsulfonylphenyl
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PCT/ES2002/000137
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María Rosa CUBERES-ALTISENT
Juana María BERROCAL-ROMERO
María Montserrat CONTIJOCH-LLOBET
Jordi Frigola-Constansa
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Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to the use of pyrazolines derivatives of general formula (I), as well as their physiologically acceptable salts, in the preparation of drugs useful in human and / or veterinary therapeutics for the prevention or treatment of cell proliferative diseases, especially for the treatment of preneoplastic or neoplastic processes, of tumor angiogenesis, of cachexia and processes related to tumor necrosis factor (TNF) and, in general, of those processes that may benefit from the inhibition of gene expression responsible for the synthesis of cyclooxygenase-2 (COX-2), either alone or in combination with other products, producing in this case a synergy.
  • pyrazolines derivatives of general formula (I) as well as their physiologically acceptable salts
  • COX-2 c ⁇ cloox ⁇ genasa-2
  • COX-2 inhibitors as potential chemopreventive agents in colorectal cancer (CRC).
  • CRC colorectal cancer
  • a cell line comprising a construction is described of DNA comprising all or part of a promoter sequence of the COX-2 gene and a control gene, operatively linked to each other, such that said promoter sequence of the COX-2 gene directs the expression of said control gene in response to an adequate stimulus.
  • the test method comprises contacting said cell line with the compound to be tested and determining the existence of a signal indicative of the expression of activity due to the control gene. This method is claimed as suitable for the search for selective inhibitors of transcriptional induction of COX-2 by appropriate stimuli.
  • the compounds of general formula (I), as well as their physiologically acceptable salts are especially useful for the preparation of medicaments, useful in human and / or veterinary therapeutics for the prevention or treatment of cell proliferative diseases, especially for the treatment of preneoplastic or neoplastic processes, of angiogenesis, of cachexia and processes related to tumor necrosis factor (TNF) and, in general, of those processes that may benefit from the inhibition of the expression of the gene responsible for the synthesis of cyclooxygenase-2 (COX-2), either alone or in combination with other products, producing in this case a synergy.
  • TNF tumor necrosis factor
  • the present invention relates to the use of pyrazolines derived from ⁇ 2 -pyrazoline, also known as 4,5-dihydro-lH-pyrazoles, of the general formula (I)
  • R x represents a hydrogen atom, a methyl group, fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, carboxylic acid, lower alkyl carboxylate of 1 to 4 carbon atoms, carboxamide or cyano,
  • R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 3 , R 4 , R 7 and R 8 represent a hydrogen, chlorine, fluorine atom, a methyl, trifluoromethyl or methoxy group
  • R s represents a hydrogen atom, chlorine, fluorine, a methyl group, trifluoromethyl, methoxy, trifluoromethoxy, methylsulfonyl, aminosulfonyl or acetylaminosulfonyl
  • R 6 represents a hydrogen atom, chlorine, fluorine, a methyl group, trifluoromethyl, methoxy, trifluoromethoxy, methylsulfonyl, aminosulfonyl or acetylaminosulfonyl with the proviso that one of the substituents R 5 or
  • R s is a methylsulfonyl, aminosulfonyl or acetylaminosulfonyl group, and with the proviso that when R, ⁇ represents a methyl group R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group,
  • R 3 and R 8 represent a hydrogen atom, chlorine, fluorine, a methyl group, or trifluoromethyl
  • R 4 represents a hydrogen atom, fluorine, a methyl group, trifluoro-methyl or methoxy
  • R 5 represents a fluorine atom, trifluoromethyl group, trifluoromethoxy, methylsulfonyl, aminosulfonyl or acetylaminosulfonyl
  • R6 represents a hydrogen atom, chlorine, fluorine, a methyl, trifluoromethyl, methoxy, trifluoromethoxy, methylsulphonyl, aminosulphonyl or acetylaminosulphonyl, with condition that one of the substituents R 5 or R s is a methylsulfonyl, aminosulfonyl or acetylaminosulfonyl group, and
  • R 7 represents a hydrogen, chlorine, fluorine atom, a methyl, trifluoromethyl or methoxy group.
  • the compounds of general formula (I) have a stereogenic center and therefore can be prepared enantiomerically pure or as racemates.
  • the racemates of the compounds (I) can be resolved in their optical isomers by conventional methods, such as separation by chiral chromatography or by fractional crystallization of their salts diastereoisomers, which can be prepared by reacting the compounds (I) with enantiomically pure acids or bases. Likewise, they can also be obtained by enantioselective synthesis using enantiomerically pure chiral precursors.
  • the present invention also relates to the physiologically acceptable salts of the compounds of general formula (I), both the addition salts of mineral acids and organic acids and the salts formed with alkali metals.
  • COX-2 as demonstrated using a cellular system of stable transfectants of JURKAT cells with the promoter of the COX-2 gene associated with the luciferase gene following the method described in our patent application PCT / ES00 / 00245.
  • the compounds of general formula (I) can be used, by administering a therapeutically effective dose, in mammals, including man, as agents for the prevention or treatment of preneoplastic or neoplastic processes, partially or totally inhibiting growth, propagation or metastasis. of the neoplasia, as well as the partial or total destruction of the neoplastic cells.
  • the compounds of the general formula (I) can be used in malignancies such as gastrointestinal cancer, liver cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, lung cancer, skin cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cancer cervical and breast cancer, or for the prevention or treatment of adenomatous polyps including familial polyposis
  • the compounds of general formula (I) can be used, by administering a therapeutically effective dose, in mammals, including man, as agents for the prevention or treatment of diseases related to angiogenesis, such as tumor growth and metastasis that are dependent on an angiogenic process, and other disorders such as retinopathies and endometriosis.
  • diseases related to angiogenesis such as tumor growth and metastasis that are dependent on an angiogenic process, and other disorders such as retinopathies and endometriosis.
  • the compounds of general formula (I) can be used, by administering a therapeutically effective dose, in mammals, including man, as agents for the prevention or treatment of cachexia and other disorders in which tumor necrosis factor- ⁇ is implicated. (TNF- ⁇ ).
  • the derivatives of general formula (I) can be prepared according to the methods described in our patent application WO 99/62884.
  • enantiomers Examples 79 and 80.
  • Tables 1 and 2 indicate a family of compounds of particular interest that respond to the general formula (I), as well as the physicochemical properties that characterize them.
  • racemic mixture ( ⁇ ) -1- (4-aminosulfonylphenyl) -5- (2, 4-difluorophenyl) -4, 5-dihydro-3 -trifluoromethyl-lH- pyrazole is resolved into its enantiomers by high performance liquid chromatography using a CHIRALPAK AS column of 10 ⁇ of particle size and dimensions of 25 x 2 cm (Daicel), 0.1% mobile phase of diethylamine in methanol and flow of 8 ml / min.
  • the dose of administration of the compounds of the present invention is a function of the severity of the condition to be treated. Normally it will be between 10 and 500 mg / day.
  • the compounds of the invention can be administered as the sole active ingredient or together with another product, in order to cause synergy.
  • the compounds of the invention, with a suitable pharmaceutical formulation will be administered by various routes such as oral, transdermal, parenteral, subcutaneous, intranasal, intramuscular or intravenous.
  • Pharmaceutical compositions containing compounds of general formula (I) are described in our patent application WO 99/62884.
  • the products of general formula (I) are useful for the treatment of preneoplastic or neoplastic processes, angiogenesis, cachexia and processes related to tumor necrosis factor (TNF) and, in general, those processes that can benefit by inhibiting the expression of the gene responsible for the synthesis of cyclooxygenase-2 (COX-2).
  • TNF tumor necrosis factor
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • a cellular system of stable transfectants of JURKAT cells has been used with the promoter of the COX-2 gene associated with the luciferase gene.
  • Three independent clones (C3, C7 and F9) have been used that differ in baseline luciferase activity between values of 4500 to 180,000 RLUs / 10 5 cells, which are increased in response to proinflammatory stimulating agents that activate cell signaling pathways such as esters of forbol (TPA) and ionophores (ionomycin).
  • the cells were pretreated for 1 hour with the compounds to be tested and then stimulated with TPA + ionomycin for 6 hours. Cell extracts were then obtained in which luciferase activity was tested, and the protein concentration was determined. Inhibition of luciferase activity gives an index of inhibition of COX-2 induction.
  • the antitumor activity of the compounds of general formula (I) has been studied, determining their effect on human colon carcinoma cell lines (TD 20 and NC 59).
  • TD20 contains a mutation in the p53 suppressor gene, while NC59 has the wild-type p53 protein.
  • Both cell lines were cultured in DMEM medium (Life Technologies) supplemented with 10% fetal bovine serum (Life Technologies) at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • Cytotoxicity assays were carried out using the XTT kit (Boehringer-Manheim) that measures the cellular ability to metabolize a tetrazolium salt to formazan.
  • Example 3 1 99, 64 ⁇ 0.51 98, 58 ⁇ 2, 83 20 76, 52 ⁇ 8, 70 84.46 ⁇ 3, 05 30 56, 50 ⁇ 0, 25 66.34 ⁇ 5, 84 40 16, 74 ⁇ 10, 53 27.38 ⁇ 4, 12 60 1, 16 ⁇ 0, 83 1.79 ⁇ 2.09 100 0 ⁇ 0 0.69 ⁇ 0.01
  • Example 10 1 92, 09 ⁇ 9.35 95.03 ⁇ 8, 87 20 76, 14 ⁇ 7, 17 90.24 ⁇ 5, 97 40 15.77 ⁇ 9.37 43.13 ⁇ 13.77 60 2, 59 ⁇ 1.54 5.42 ⁇ 4.11 80 1.66 ⁇ 1.57 3.22 ⁇ 3.46
  • the compounds of examples 3 and 10 showed cytotoxic activity on both human colon carcinoma cell lines. Its IC50 on the NC59 cell line was 30 ⁇ M and 27 ⁇ M and on the TD20 line it was 34 ⁇ M and 38 ⁇ M, respectively.
  • the ability to induce apoptosis of the compound of example 3 (100 ⁇ M dose) in the tumor cell line TD20 was studied. Under these conditions, 20% apoptotic cells were obtained at 24 h and 80% at 48 h, while in the cells Vehicle-treated apoptotic cells did not exceed 1%. The cytotoxicity levels, measured by XTT, were similar to those of apoptosis, suggesting that the cytotoxic activity of the compound of Example 3 is due to its ability to induce apoptosis.
  • the compounds of examples 3 and 10 are effective antitumor agents in human colon carcinoma, which suggests the possibility of using the compounds of general formula (I) not only as chemopreventives, but in established colon cancer.
  • their tumor effect is mediated by apoptosis and the activation of the transduction pathways is given by signals other than p53, JNK or p38, which suggests that these compounds may constitute an addition to the current chemotherapy protocols because they have a mechanism of action. different cytotoxic.
  • the antitumor activity of the compounds of general formula (I) has been studied, determining their effect on a breast carcinoma cell line (MDAMB 453).
  • MDAMB 453 breast carcinoma cell line
  • This cell line was grown in DMEM medium (Life Technologies) supplemented with 10% fetal bovine serum (Life Technologies) at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • Cytotoxicity assays were carried out using the XTT kit (Boehringer-Manheim) that measures the cellular ability to metabolize a tetrazolium salt to formazan.
  • the compounds of Examples 3 and 10 had cytotoxic activity on the breast carcinoma cell line, their IC50 being 3 ⁇ M (Example 3), and 18 ⁇ M ( Example 10).
  • the compounds of examples 3 and 10 are effective antitumor in breast carcinoma, which suggests the possibility of using the compounds of general formula (I) not only as preventive chemo, but in established breast cancer.
  • VEGF vascular-endothelial growth factor
  • C0X-2 can regulate the process of angiogenesis induced by colon cancer cells, increasing the expression of proangiogenic factors by them. The inhibition of C0X-2 can block this process, inhibiting the expression of some of these factors, such as VEGF.
  • VEGF in turn induces the expression of Tissue Factor (TF) in the monocyte membrane, epithelial cells and endothelium.
  • TF Tissue Factor
  • the main function of TF is the onset of the coagulation cascade, it has the capacity to transduce intracellular signals, participating in tumor-associated metastasis and angiogenesis.
  • TF facilitates tumor growth in vivo, favoring angiogenesis. It has been proven that tumor cells transiected with TF produce greater vascularization.
  • the products of general formula (I) have been tested for the expression of the VEGF promoter at baseline and stimulated using the Caco-2 cell line of human colon carcinoma transiently transfected with a vector containing the human VEGF gene promoter. Once the test conditions have been established, the inhibitory capacity of the expression of the VEGF and TF genes of the product under study has been analyzed, by measuring the luciferase activity of its promoters.
  • Tumor necrosis factor- ⁇ is a cytokine, potent proinflammatory and immunomodulator involved in different inflammatory conditions, such as rheumatoid arthritis, CROHN disease, multiple sclerosis and in cancer-associated cachexia and also in human immunodeficiency associated with viral infections.
  • TNF- ⁇ was first described for its ability to induce hemorrhagic necrosis of certain tumors in animals treated with lipopolysaccharide (LPS). It was also called caquectin, being a circulating mediator of attrition syndrome, related to certain parasitic diseases.
  • LPS lipopolysaccharide
  • caquectin being a circulating mediator of attrition syndrome, related to certain parasitic diseases.
  • the cachexia, or wear caused by TNF is related to its property of increasing lipoprotein lipase and therefore depletes fat cells.
  • TNF- ⁇ is predominantly produced by macrophages when activated by a wide variety of stimuli, such as the presence of bacterial or myco
  • TNF- ⁇ is one of the mediators of Grara-bacterial endotoxic shock, and seems to be responsible for causing fever, metabolic acidosis, diarrhea, hypertension, disseminated vascular coagulation and in some cases even death.
  • TNF- ⁇ can cause neutrophil activation, induce gene expression of IL-1, increase the expression of MHC antigens (of major histocompatibility of class I) in endothelial cells and is involved in bone marrow resorption and in the PGE 2 and collagenase production of synovial cells and human fibroblasts. Therefore, products capable of antagonizing activity This mediator can be of clinical value in combating its fatal effects (C. A. Me Intyre et al: Drugs News and
  • TNF- ⁇ inhibitory activity For the study of TNF- ⁇ inhibitory activity, the method described by P. Klemen and cois has been followed. (Europ. J. Pharmacol. 1995 281: 69-74), consisting in determining the production of TNF- ⁇ in the localized area where inflammation occurs acutely, using in particular the model of the air bag inflamed with zymosan in mouse. TNF- ⁇ was determined in the inflammatory exudate produced in said pouch, as a consequence of zymosan stimulation. The analytical determination of TNF- ⁇ was performed by ELISA.

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Abstract

Los derivados de pirazolina (I), donde R1 es hidrógeno, metilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ácido carboxílico, carboxilato de alquilo inferior de 1 a 4 átomos de carbono, carboxamida o ciano, R2 es hidrógeno o metilo, R3, R4, R7 y R8, independientemente son hidrógeno, cloro, flúor, metilo, trifluorometilo o metoxi, R5 y R6, independientemente entre sí, son hidrógeno, cloro, flúor, metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o R6 es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y con la condición de que cuando R1 es metilo, entonces R2 es hidrógeno o metilo, R3 y R8 , independientemente, son hidrógeno, cloro, flúor, metilo, o trifluorometilo, R4 es hidrógeno, flúor, metilo, trifluorometilo o metoxi, R5 es flúor, trifluorometilo, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, R6 es hidrógeno, cloro, flúor, metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o R6 es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y R7 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi; son útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares.

Description

EMPLEO DE DERIVADOS DE PIRAZOLINAS EN LA ELABORACIÓN DE
UN MEDICAMENTO PARA LA PREVENCIÓN Y/O EL TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES PROLIFERATIVAS CELULARES
Campo de la invención
La presente invención se refiere al empleo de derivados de pirazolinas de fórmula general (I), así como de sus sales fisiológicamente aceptables, en la elaboración de medicamentos útiles en terapéutica humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis tumoral , de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), bien solos o en combinación con otros productos, produciendo en este caso una sinergia.
Antecedentes de la invención
En nuestra solicitud de patente WO 99/62884 se describen compuestos de fórmula general (I) y sus sales fisiológicamente aceptables,
Figure imgf000003_0001
como inhibidores de la enzima cιclooxιgenasa-2 (COX-2), con aplicación en Medicina como antunflamatorios .
El interés creciente de la regulación del gen responsable de la síntesis de COX-2 deriva de su aplicación no solo en la respuesta inflamatoria, sino en otros procesos patológicos importantes, como proliferación celular y cáncer, regulación de la respuesta inmune, enfermedades degenerativas del cerebro, etc., como se pone de manifiesto a través de la creciente literatura al respecto. Un conjunto de observaciones ha llevado a considerar a los inhibidores de la COX-2 como potenciales agentes quimiopreventivos en el cáncer colorectal (CCR) . La elección de la COX-2 como diana se basa en la frecuencia de su sobreexpresión : hasta un 90% de los carcinomas y un 40% de los adenomas de colon poseen niveles elevados de mRNA y de proteína COX-2
(Eberhart et al . : Gastroenterology 1994 107 : 1183 -
1188 ; Du Boi s et al . : Gastroenterology 1996 110 : 1259 - 1262 ; Prescott et al . , Cell 1996 82 : 783 - 786) . Además parece claro que esta sobreexpresión contribuye al fenotipo tumoral en CCR: a) la sobreexpresión de COX-2 se ha asociado con inhibición de apoptosis (Tsu ii et al :
Cell 1995 83_ : 493 -501 ) ; b) la inactivación de COX-2 en ratones Apc (-) se asocia a inhibición del crecimiento tumoral; c) dos de las alteraciones genéticas más frecuentes en el cáncer colorrectal, las mutaciones en el gen supresor de tumor Apc y las mutaciones en los oncogenes ras se asocian a sobreexpresión de COX-2 (Boolbol et al : Cáncer Res . 1996 5_6 : 2556-2560 ; Sheng H. et al : J. Biol . Chem . 1998 273 (34) : 2120 -2127) .
En nuestra solicitud de patente PCT/ES00/00245 se describe una línea celular que comprende una construcción de DNA que comprende la totalidad o parte de una secuencia promotora del gen de la COX-2 y un gen testigo, unidos operativamente entre sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen de la COX-2 dirige la expresión de dicho gen testigo en respuesta a un estímulo adecuado. El método de ensayo comprende poner en contacto dicha línea celular con el compuesto a ensayar y determinar la existencia de una señal indicativa de la expresión de actividad debida al gen testigo. Este método se reivindica como adecuado para la búsqueda de inhibidores selectivos de la inducción a nivel transcripcional de la COX-2 por estímulos apropiados.
Nosotros hemos descubierto ahora que los compuestos de fórmula general (I) , así como sus sales fisiológicamente aceptables, son especialmente útiles para la elaboración de medicamentos, útiles en terapéutica humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis , de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), bien solos o en combinación con otros productos, produciendo en este caso una sinergia.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al empleo de pirazolinas derivadas de Δ2-pirazolina, también conocidas como 4 , 5-dihidro-lH-pirazoles, de fórmula general (I)
Figure imgf000006_0001
( en la elaboración de un medicamento, útil en terapéutica humana y/o veterinaria para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis , de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2), bien solos o en combinación con otros productos, produciendo en este caso una sinergia.
En la fórmula (I)
Rx representa un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ácido carboxílico, carboxilato de alquilo inferior de 1 a 4 átomos de carbono, carboxamida o ciano,
R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
R3, R4, R7 y R8, iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi,
Rs representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo
R6 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o
Rs es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y con la condición de que cuando R,^ representa un grupo metilo R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
R3 y R8, iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, o trifluorometilo, R4 representa un átomo de hidrógeno, flúor, un grupo metilo, trifluoro-metilo o metoxi,
R5 representa un átomo de flúor, un grupo trifluorometilo, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, R6 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o Rs es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y
R7 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi.
Los compuestos de fórmula general (I) tienen un centro estereogénico y por lo tanto pueden ser preparados enantioméricamente puros o como racematos. Los racematos de los compuestos (I) pueden ser resueltos en sus isómeros ópticos por métodos convencionales, como por ejemplo separación mediante cromatografía quiral o por cristalización fraccionada de sus sales diastereoisómeras , las cuales pueden prepararse por reacción de los compuestos (I) con ácidos o bases enantioméπcamente puros. Asimismo, también pueden obtenerse por síntesis enantioselectiva utilizando precursores quirales enantioméricamente puros.
La presente invención se refiere igualmente a las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de fórmula general (I), tanto las sales de adición de ácidos minerales y ácidos orgánicos como las sales formadas con metales alcalinos.
Los compuestos de fórmula general (I), así como sus sales fisiológicamente aceptables, inhiben la expresión del gen responsable de la síntesis de cιclooxιgenasa-2
(COX-2) como se demuestra utilizando un sistema celular de transfectantes estables de células JURKAT con el promotor del gen COX-2 asociado al gen de la luciferasa siguiendo el método descrito en nuestra solicitud de patente PCT/ES00/00245.
Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente efectiva, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, inhibiendo parcialmente o totalmente el crecimiento, la propagación o la metástasis de la neoplasia, así como la destrucción parcial o total de las células neoplásicas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse en neoplasias tales como cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, cáncer de ve iga, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical y cáncer de mama, o para la prevención o el tratamiento de pólipos adenomatosos incluyendo poliposis familiar.
Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente efectiva, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como el crecimiento tumoral y de las metástasis que son dependientes de un proceso angiogénico, y otros desórdenes tales como retinopatías y endometriosis .
Los compuestos de fórmula general (I) pueden utilizarse, administrando una dosis terapéuticamente efectiva, en mamíferos, incluido el hombre, como agentes para la prevención o el tratamiento de la caquexia y otros desórdenes en los que esté implicado el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) .
Los derivados de fórmula general (I) se pueden preparar según los métodos descritos en nuestra solicitud de patente WO 99/62884. A continuación se indica, a título de ejemplo, la preparación de 1- (4- aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 - trifluorometil-lH-pirazol (Ejemplo 3) y sus enantiómeros (Ejemplos 79 y 80) . En las tablas 1 y 2 se indica una familia de compuestos de particular interés que responden a la fórmula general (I) , así como las propiedades físico-químicas que los caracterizan.
Ejemplo 3. - Preparación de 1- (4-aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 -trifluorometil-lfí- pirazol CH3COCF3
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Preparación, vía acetimidoilo, de (E) -1 , 1 , 1-trif luoro-4- (2 , 4-dif luorof enil) -3-buten-2-ona
En un balón con atmósfera seca e inerte se introducen 260 mi de THF anhidro, se enfría a -78°C y se adicionan 225 mi de solución de LDA 2M en THF/n-heptano a una velocidad que permita mantener la temperatura por debajo de -65 °C. A continuación se añade, con goteo rápido, dietilmetilfosfonato (34,25 g, 0,225 moles) disuelto en 30 mi de THF y se agita durante 30 minutos a -78 °C. Se adiciona, gota a gota, cloruro de N- feniltrifluoroacetimidoilo (46,7 g, 0,225 moles) disuelto en 40 mi de THF y se continúa la agitación en las mismas condiciones durante 1 hora. Se añade una solución del 2 , 4-difluorobenzaldehido (33,6 g, 0,236 moles) en 40 mi de THF, se separa el baño frío y se deja que la temperatura vaya subiendo hasta temperatura ambiente . Se agita durante toda la noche en estas condiciones. A la mañana siguiente se añaden 450 mi de HCl 2N y se continúa la agitación durante 24 horas. Se elimina el THF en el rotavapor y la solución acuosa resultante se extrae con AcOEt ( 2x200 mi) , se lava con solución de NaHC03 al 5% y con solución saturada de NaCl , se seca sobre sulfato sódico, se filtra y se evapora el disolvente al rotavapor. Se obtiene así 54,6 g de líquido crudo rojizo que solidifica. El crudo se destila a una presión de 35 mbar y se recoge una fracción de {E) -1 , 1 , 1-trifluoro-4-
(2,4-difluorofenil) -3-buten-2-ona a 107-14°C (43 g, 81%).
Punto de fusión : 50-l°C IR (KBr, cm"1) : 1717, 1602, 1583, 1277, 1146, 1059, 706
'H-RMN (CDC13) : 6,9 (m, 2H) , 7,05 (d, J=16 Hz, 1H) , 7,6
(m, 1H) , 8,0 (d, J=16Hz, 1H)
13C-RMN (CDCI3) : 105,1 (t,J=26Hz), 112, 6 (dd, J=4 , 22Hz) ,
116,4 (q, J=291Hz) , 118,2, 118,5, 131,5 (dd, J=4 , 11Hz) , 141,5, 162,5 (dd, J=13, 193Hz), 165,7 (dd, J=13, 190Hz),
180 (q, J=36Hz)
Preparación, vía condensación aldólica, de (£0-1,1,1- trifluoro-4- (2 , 4-difluorofenil) -3-buten-2-ona
En un balón se disuelve 2 , 4-difluorobenzaldehido
(250 g, 1,76 moles), ácido acético glacial (152,5 g, 2,54 moles) y piperidina (152,5 g, 1,79 moles) en 3 1 de THF.
Se enfría la solución a 5-10°C y se burbujea en su interior CF3COCH3 (≡140 g, 1,2 moles). Se separa el baño frío, se deja subir la temperatura hasta temperatura ambiente y se mantiene en agitación, a esta temperatura, durante 2 horas. Se adiciona de nuevo CF3COCH3 (≤40 g,
0,36 moles) y se deja en agitación 2 horas. Se añade de nuevo otros ≡40 g y se agita durante otras 2 horas, y así sucesivamente hasta la adición total de unos 415 g
(3,7 moles) de CF3COCH3. Se añade solución de cloruro amónico 20% (600 mi) y se elimina el disolvente a presión reducida (50 °C, 80 mbar) . Se añaden 300 mi de agua y se extrae con AcOEt. La fase orgánica se lava con agua,
H2S04 5%, agua y se seca sobre sulfato sódico anhidro. Se filtra y se evapora. El crudo resultante se destila recogiéndose (30 mbar) una fracción (281,4 g, 68%) de
(E) -1, 1, 1-trifluoro-4- (2 , 4-difluorofenil) -3 -buten-2 -ona de punto de fusión 50-1 °C. IR, 'H-RMN y 13C-RMN iguales a los del producto obtenido vía acetimidoilo .
Preparación de 1- (4-aminosulfonilfenil) -5- (2,4- difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 -trifluorometil-lH-pirazol
Una solución de clorhidrato de 4- (aminosulfonil) fenilhidrazina (243,8 g, 1,09 moles) y (£0-1,1, l-trifluoro-4- (2 , 4-difluorofenil) -3 -buten-2 -ona
(281,4 g) en 1600 mi de ácido acético se refluye durante 24 horas en atmósfera de nitrógeno. Se enfría, se vierte lentamente sobre agua-hielo (10-12 1) manteniendo una fuerte agitación y se filtra. Se lava con tolueno (500 mi) y se seca. Se obtienen 328 g de producto crudo
(pureza: 95,6%) que se cristaliza de dioxano. Se obtienen 216,7 g de 1- (4 -aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4 - difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3-trifluorometil-líí-pirazol con una pureza del 98,1%. Las aguas madres de cristalización, una vez concentradas, proporcionan otros 69,3 g del 97,5% de pureza. La reunión de estas dos fracciones se recristaliza de isopropanol obteniéndose
267.8 g (61%) de producto molido, con un tamaño de partícula < 100 μm, pureza del 99,5% y punto de fusión
161-2°C
Análisis elemental: % C %H %N %F Calculado 47,41 2,98 10,37 23,43
Hallado 47,42 2,77 10,35 23,57
IR (KBr, cm'1) : 3315, 3232, 1617, 1593, 1506, 1326, 1179, 1099, 1067
'H-RMN [300 MHz, CDC13, 25°C, δ (ppm) ] : 3,0 (dd, J=6,3 y 11,4 Hz, 1H) ; 3,80 (dd, J=ll,4 y 12,6 Hz, 1H) ; 4,79 (s ancho, 2H) ; 5,70 (dd, J=6,3 y 12,6 Hz, 1H) ; 6,8-6,95 (m, 2H) ; 7,01-7,09 (m, 3H) ; 7,74 (d, J=8,7 Hz , 2H) *H RMN [300 MHz, DMS0-d6, 25°C, δ (ppm)]: 3.13 (dd, J=18, 5 Hz, 1H) ; 3.89 (t, J=16 Hz , 1H) ; 5.96 (dd, J=13, 6 Hz , 1H) ; 7.03-7.16 (m, 5H) ; 7.33 (m, 2H) ; 7.64 (d, J=9 Hz, 2H) 13C-RMN [75 MHz, CDCl3, 25°C, δ (ppm)]: 40,2, 57,9, 104,9 (t, J=25Hz) , 112,4 (dd, J=4 , 22Hz) , 113,5, 120,4 (q, J=269Hz) , 122,1 (d, J=17Hz) , 128, 128,2, 133,5, 139,5 (q, J=38Hz) , 145,8, 159,6 (dd, J=12, 245Hz) , 163 (dd, J=12, 248Hz) 13C RMN [75 MHz, DMS0-d6, 25°C, δ (ppm)]: 39.7, 58.8, 105.1 (t, JC"F=26 Hz) , 112.1 (dd, JC"F=22, 3 Hz) , 113.3,
120.9 (q, JC"F=268 Hz) , 123.1 (dd, JC_F=14, 4 Hz) , 127.4, 130.0 (dd, JC~F=10, 5 Hz) , 135.9, 139.0 (q, JC"F=37 Hz) , 144.6, 160.0 (dd, JC"F=247, 13 Hz) , 162.3 (dd, JC"F=246, 13 Hz) MS [El, -70 eV, m/z (%)]: 405 (M\ 100), 386 (4), 341
(7), 292 (14), 156 (26), 139 (16)
Preparación de ( + ) - 1 - (4 -aminosulf onilf enil ) - 5 - (2 , 4 - dif luorof enil ) -4 , 5 -dihidro- 3 -trif luorometil - lH-pirazol (Ejemplo 79) y (-) -1- (4-aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4- difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 -trifluorometil-lH-pirazol
(Ejemplo 80)
La mezcla racémica (±) -1- (4-aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 -trifluorometil-lH- pirazol se resuelve en sus enantiómeros por cromatografía líquida de alta resolución utilizando una columna CHIRALPAK AS de 10 μ de tamaño de partícula y dimensiones de 25 x 2 cm (Daicel) , fase móvil 0,1% de dietilamina en metanol y flujo de 8 ml/min. Con un tiempo de retención de 7,4 minutos se obtiene (+) -1- (4 -aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3-trifluorometil-lH- pirazol como un sólido blanco de p.f.: 173-4°C; pureza enantiomérica 99,9 % ; [α]D=+183,9 (c=l CH30H) . Con un tiempo de retención de 9,2 minutos se obtiene (-)-l-(4- aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) -4 , 5-dihidro-3- trifluorometil- lH-pirazol como un sólido blanco de p.f.:
173-4°C; pureza enantiomérica >99,9%; [α]D=-189,4 (c=l CH,0H) .
Tabla 1
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Tabla 1 (continuación)
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Tabla 2
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Figure imgf000020_0001
10
15
20
25
J0
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35
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En terapéutica humana, la dosis de administración de los compuestos de la presente invención es función de la gravedad de la afección a tratar. Normalmente estará comprendida entre 10 y 500 mg/día. Los compuestos de la invención se pueden administrar como único principio activo o junto con otro producto, con el objeto de provocar una sinergia. Los compuestos de la invención, con una formulación farmacéutica adecuada, se administrarán por diversas vías tales como oral, transdérmica, parenteral, subcutánea, intranasal, intramuscular o intravenosa. Composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula general (I) se describen en nuestra solicitud de patente WO 99/62884.
Evaluación biológica
Los productos de fórmula general (I) son útiles para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis, de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2). Con el fin de demostrar estas actividades se indican a continuación, a título de ejemplo, algunas pruebas farmacológicas .
Inhibición de la inducción de la COX-2
Para determinar la capacidad de inhibición de la inducción transcripcional de la ciclooxigenasa-2 se ha utilizado un sistema celular de transíectantes estables de células JURKAT con el promotor del gen COX-2 asociado al gen de la luciferasa. Se han utilizado 3 clones independientes (C3, C7 y F9) que difieren en la actividad luciferasa basal entre valores de 4500 a 180.000 RLUs/105 células, que se incrementan en respuesta a agentes estimuladores tipo proinflamatorio activadores de vías de señalización celular como esteres de forbol (TPA) e ionóforos (ionomicina) .
Para el ensayo las células se pretrataron durante 1 hora con los compuestos a ensayar y a continuación se estimularon con TPA + ionomicina durante 6 horas. A continuación se obtuvieron extractos celulares en los que se ensayó la actividad luciferasa, y se determinó la concentración de proteína. La inhibición de la actividad luciferasa da un índice de inhibición de la inducción de la COX-2.
Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), damos a continuación los resultados obtenidos con el compuesto del Ejemplo 10, que demuestran una clara inhibición de la inducción de la COX-2.
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Actividad antitumoral en carcinoma de colon humano
Se ha estudiado la actividad antitumoral de los compuestos de fórmula general (I) , determinando su efecto sobre líneas celulares de carcinoma de colon humano (TD 20 y NC 59) . Las dos líneas celulares poseen la proteína K-Ras silvestre. La TD20 contiene una mutación en el gen supresor p53, mientras que la NC59 posee la proteína p53 silvestre .
Ambas líneas celulares se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Life Technologies) a 37°C y 5% de C02.
Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo usando el kit de XTT (Boehringer-Manheim) que mide la capacidad celular de metabolizar una sal de tetrazolio a formazan .
Concentración (μM) % Viabilidad de células de cáncer colorrectal + SD
NC59 TD 20
Ejemplo 3 1 99 , 64 ± 0 , 51 98, 58 ± 2, 83 20 76 , 52 ± 8 , 70 84,46 ± 3, 05 30 56 , 50 ± 0 , 25 66,34 ± 5, 84 40 16 , 74 ±10 , 53 27,38 ± 4, 12 60 1 , 16 ± 0 , 83 1,79 ± 2,09 100 0 ± 0 0,69 ± 0,01
IC-50 = 29,87 IC-50 = 33,87
Ejemplo 10 1 92, 09 ± 9,35 95,03 ± 8, 87 20 76, 14 ± 7, 17 90,24 ± 5, 97 40 15,77 ± 9,37 43,13 ±13,77 60 2, 59 ± 1,54 5,42 ± 4,11 80 1,66 ± 1,57 3,22 ± 3,46
IC-50 = 27,18 μM IC-50 = 37,92 μM
Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I) , los compuestos de los ejemplos 3 y 10 mostraron actividad citotóxica sobre ambas líneas celulares de carcinoma de colon humano. Su IC50 sobre la línea celular NC59 fue de 30μM y 27μM y sobre la línea TD20 fue 34 μM y 38 μM, respectivamente.
Con el objeto de profundizar en el mecanismo de acción de estos compuestos se estudió la capacidad de inducir apoptosis del compuesto del ejemplo 3 (dosis 100 μM) en la línea celular tumoral TD20. En estas condiciones se obtuvo un 20% de células apoptóticas a las 24 h y del 80% a las 48 h, mientras que en las células tratadas con vehículo las células apoptóticas no superaron el 1%. Los niveles de citotoxicidad, medidos por XTT, fueron similares a los de apoptosis, lo que sugiere que la actividad citotóxica del compuesto del ejemplo 3 se debe a su capacidad de inducir apoptosis.
Posteriormente se analizaron las vías de transducción de señal asociadas al proceso apoptótico. Tras exponer las células NC59 a una concentración 100 μM del compuesto del ejemplo 3, se estudiaron los niveles de expresión de p53, FAK y β-actina y el nivel de activación de MAP quinasas, JNK y PKB/Akt, a las 5 y 20 horas de exposición. Los resultados demostraron la activación de vías de transducción de señales distintas a p53 , JNK o p38, que son las vías activadas por los fármacos genotóxicos convencionales (p.e. 5-FU) .
Resumiendo podemos decir que los compuestos de los ejemplos 3 y 10 son efectivos antitumorales en el carcinoma de colon humano, lo que sugiere la posibilidad de usar los compuestos de fórmula general (I) no sólo como quimiopreventivos, sino en el cáncer de colon establecido. Además su efecto tumoral está mediado por apoptosis y la activación de las vías de transducción se da por señales distintas a p53 , JNK o p38, lo que sugiere que estos compuestos pueden constituir una adición a los protocolos de quimioterapia actual por poseer un mecanismo de acción citotóxica diferente.
Actividad antitumoral en carcinoma mamario
Se ha estudiado la actividad antitumoral de los compuestos de fórmula general (I), determinando su efecto sobre una línea celular de carcinoma de mama (MDAMB 453) . Esta línea celular se cultivó en medio DMEM (Life Technologies) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Life Technologies) a 37°C y 5% de C02.
Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo usando el kit de XTT (Boehringer-Manheim) que mide la capacidad celular de metabolizar una sal de tetrazolio a formazan.
Concentración (μM) % Viabilidad de células de cáncer de mama ± SD
MDAMB 453
Ejemplo 3 1 94, 76 ± 8,71
20 31,52 ± 9,12
40 12,77 ± 4,80
60 5,97 ± 5,06
80 2,84 ± 1,71
IC-50 = 12,87 μM
Ejemplo 10 1 97,53 ± 3,25
20 42,75 ± 9,31
40 33,30 ± 7,34
60 8,25 ± 6, 82
80 5,8± 4,76
IC-50 = 17,88 μM
Co o ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), los compuestos de los Ejemplos 3 y 10 tuvieron actividad citotóxica sobre la linea celular de carcinoma de mama, siendo su IC50 del 3μM (Ejemplo 3) , y 18 μM (Ejemplo 10) . Resumiendo podemos decir que los compuestos de los ejemplos 3 y 10 son efectivos antitumorales en el carcinoma de mama, lo que sugiere la posibilidad de usar los compuestos de fórmula general (I) no sólo como quimio preventivos, sino en el cáncer de mama establecido.
Actividad antiangiogénica
Dicha actividad se ha estudiado determinando la inhibición de la inducción de la expresión del VEGF. La expresión incrementada del factor de crecimiento vasculo- endotelial (VEGF) ha sido implicada en la progresión tumoral y angiogénesis . VEGF es un factor proangiogénico, promoviendo mitogénesis, migración y un incremento de la permeabilidad vascular en células endoteliales in vitro. Recientemente se ha puesto de manifiesto que la C0X-2 puede regular el proceso de angiogénesis inducido por células de cáncer de colon, incrementando la expresión de factores proangiogénicos por parte de éstas. La inhibición de la C0X-2 puede bloquear este proceso, inhibiendo la expresión de algunos de estos factores, como el VEGF.
El VEGF a su vez induce la expresión del Factor Tisular (TF) en la membrana de monocitos, células epiteliales y endotelio. A pesar de que la función principal del TF es el inicio de la cascada de coagulación, posee capacidad para transducir señales intracelulares, participando en metástasis y angiogénesis asociada a tumores. El TF facilita el crecimiento del tumor in vivo favoreciendo la angiogénesis. Se ha comprobado que células tumorales transíectadas con TF producen mayor vascularización.
Para el estudio de la actividad antiangiogénica de los productos de fórmula general (I) se ha ensayado la expresión del promotor de VEGF en situación basal y estimulada usando la línea celular Caco-2 de carcinoma de colon humano transfectada de forma transitoria con un vector que contiene el promotor del gen VEGF humano. Una vez establecidas las condiciones del ensayo, se ha procedido al análisis de la capacidad inhibitoria de la expresión de los genes VEGF y TF del producto en estudio, mediante la medida de la actividad luciferasa de sus promotores .
Para el ensayo se usaron 1,25 x 105 células Caco-2 transíectadas transitoriamente con los DNA correspondientes en 500 μl de medio DEMEM-10% FCS en placas de 24 pocilios. Las células se pretrataron durante 1 hora con los compuestos a ensayar, y a continuación se estimularon con TPA durante 16 horas. Posteriormente se obtuvieron extractos celulares en los que se ensayó la actividad luciferasa, y se determinó la concentración de proteína .
Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), damos a continuación los resultados obtenidos con los compuestos de los ejemplos 3 y 10, que demuestran un claro efecto antiangiogénico, al inhibir tanto el VEGF como el TF .
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Inhibición del factor de necrosis tumoral- (TNF-α)
El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) es una citoquina, potente proinflamatorio e inmunomodulador implicado en diferentes condiciones inflamatorias, tal como artritis reumatoide, enfermedad de CROHN, esclerosis múltiple y en la caquexia asociada al cáncer y también en la inmunodeficiencia humana asociada a infecciones víricas. El TNF-α se describió por primera vez por su capacidad de inducir necrosis hemorrágica de ciertos tumores en animales tratados con lipopolisacárido (LPS) . También se le llamó caquectina, al ser un mediador circulante del síndrome de desgaste, relacionado con ciertas enfermedades parasitarias. La caquexia, o desgaste que ocasiona el TNF se relaciona con su propiedad de aumentar la lipasa de lipoproteína y por ello agota las células adiposas. El TNF-α se produce de modo predominante por macrófagos al activarse por una gran variedad de estímulos, tales como la presencia de proteínas bacterianas o micobacterianas , antígenos fúngicos, virus, complemento C5a o interferón gamma.
El TNF-α es uno de los mediadores del shock endotóxico bacteriano Grara- , y parece ser responsable de provocar fiebre, acidosis metabólica, diarrea, hipertensión, coagulación vascular diseminada y en algunos casos incluso la muerte. Además el TNF-α puede causar activación de neutrófilos, inducir la expresión génica de IL-1, aumentar la expresión de antígenos MHC (de histocompatibilidad mayor de clase I) en células endoteliales y está implicado en la resorción de la médula ósea y en la producción de PGE2 y de colagenasa de las células sinoviales y de los fibroblastos humanos. Por tanto, los productos capaces de antagonizar la actividad de este mediador pueden ser de valor clínico al combatir sus efectos fatales (C. A . Me Intyre et al : Drugs News and
Perspectives 1992 5 (4 ) : 207-213 ; A . J. H. Gearing et al :
Nature 1994 370 : 555 -557; M. A . P hlavaní : Drugs of Today
1993 29 (8) : 525-533 ) .
Para el estudio de la actividad inhibitoria del TNF- α se ha seguido el método descrito por P. Klemen y cois. (Europ . J. Pharmacol . 1995 281 : 69- 74 ) , consistente en determinar la producción de TNF-α en la zona localizada en la que se da la inflamación de forma aguda, usando de forma particular el modelo de la bolsa da aire inflamada con zymosan en ratón. Se determinó el TNF-α en el exudado inflamatorio producido en dicha bolsa, como consecuencia de la estimulación por zymosan. La determinación analítica del TNF-α se realizó por ELISA.
Como ejemplo de la actividad de los compuestos de fórmula general (I), damos los resultados obtenidos con el compuesto del Ejemplo 10, que demuestra una notable actividad inhibitoria del TNF-α, muy bien correlacionada con la dosis.
Figure imgf000041_0001
i.p.: intraperitoneal

Claims

REIVINDICACIONES
Empleo de un derivado de pirazolina de fórmula general (I)
Figure imgf000042_0001
(I)
en la cual
R-L representa un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ácido carboxílico, carboxilato de alquilo inferior de 1 a 4 átomos de carbono, carboxamida o ciano,
R, representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
R3, R4, R7 y R8, iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi,
R5 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo,
R6 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o
Rc es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo acetilaminosulfonilo, y con la condición de que cuando Rτ representa un grupo metilo
R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
R] y Re , iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, o trifluorometilo,
R4 representa un átomo de hidrógeno, flúor, un grupo metilo, trifluoro-metilo o metoxi,
R5 representa un átomo de flúor, un grupo trifluorometilo, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo,
R6 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo, metoxi, trifluorometoxi, metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, con la condición de que uno de los sustituyentes R5 o Rs es un grupo metilsulfonilo, aminosulfonilo o acetilaminosulfonilo, y R7 representa un átomo de hidrógeno, cloro, flúor, un grupo metilo, trifluorometilo o metoxi; o una de sus sales fisiológicamente aceptables, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis tumoral, de la caquexia y procesos relacionados con e!> factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre .
2. Empleo según la reivindicación 1, de un compuesto de fórmula general (I) seleccionado entre el grupo formado por :
[I] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4 , 5-dihidro-5- (4-metilfenil) -3-trifluorometil-lH-pirazol [2] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5-metil-5- (4- metilfenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[3] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -5- (2, 4-difluorofenil) -4,5- dihidro-3-trifluorometil-lH-pirazol
[4] 4, 5-Dihidro-l- (4-metilfenil) -5- (4-metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil-lH- pirazol
[5] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4 , 5-dihidro-5-fenil-3 - trifluorometil- 1H-pirazol
[6] 4, 5-Dihidro-5-fenil-l- (4-metilsulfonilfenil) -3- trifluorometil-lH-pirazol [7] 4, 5-Dihidro-5- (4-metilfenil) -1- (4-metilsulfonilfenil) -3 - trifluorometil-lH- pirazol
[8] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (4- fluorofenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[9] 4, 5-Dihidro-5- (4 - fluorofenil ) -1- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil-lH-pirazol
[10] 4,5-Dihidro-l- (4 -fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[II] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -5- (3 , 4-difluorofenil) - 4 , 5-dihidro-3-trifluorometil-lH-pirazol [12] 5- (2 , 4-Diclorofenil) -4, 5-dihidro-l- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil-lH-pirazol
[13] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -5- (2, 4-diclorofenil) - 4 , 5-dihidro-3-trifluorometil-lH-pirazol
[14] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (2- metilfenil) -3-trifluorometil-lH-pirazol
[15] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (3- metilfenil) -3-trifluorometil-lH-pirazol [16] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (2- fluorofenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[17] 4, 5-Dihidro-5- (2 -fluorofenil ) -1- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil-lH- pirazol [18] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (3- fluorofenil) -3 -trifluorometil- 1H-pirazol
[19] 4, 5-Dihidro-5- (3 - fluorofenil) -1- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil-lH- pirazol [20] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (4- metoxifenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[21] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -5- (3-cloro-4- fluorofenil) -4 , 5-dihidro-3 -trifluorometil-lH-pirazol
[22] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-3- trifluorometil-5- (4-trifluorometoxifenil) -lH-pirazol [23] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -5- (2 , 3-difluorofenil) - 4 , 5-dihidro-3-trifluorometil-lH-pirazol
[24] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (2, 4- dimetilfenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[25] 5- (3, 4 -Difluorofenil) -4 , 5-dihidro-l- (4- metilsulfonilfenil) -3 -trifluorometil-lH-pirazol
[26] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5- (4- fluorofenil) -3 -metil-lH-pirazol
[27] 4, 5-Dihidro-5- (4 -fluorofenil) -3-metil-l- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pirazol [28] 1- (4-Aminosulfonilfenil) -4 , 5-dihidro-3-metil-5- (4-metilfenil) -lH-pirazol
[29] 4,5-Dihidro-3-metil-5- (4-metilfenil) -1- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pirazol
[30] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-3 -metil-5- (4-trifluorometilfenil) - 1H- pirazol
[31] 1- (4 -Aminosulfonilfenil) -4, 5-dihidro-5-fenil-lH- pirazol [ 32 ] 4 , 5 -Dιhιdro- 5 - fenι l - l - ( 4 -met ιlsul fom l f enil ) - 1H- pirazol
[33] 4, 5-Dιhιdro-3-metιl-l- (4-metιlsulfonιlfenil) -5- (4-trιfluorometilfenil) - 1H- pirazol [34] Ácido 1- (4-ammosulfonιlfenιl) -4 , 5-dιhιdro-5- (4- metilfenil) -lH-pιrazol-3-car boxílico
[35] Ácido 1- (4-ammosulfonιlfenιl) -4 , 5-dιhιdro-5- fenil - lH-pirazol -3 -carboxílico
[36] Ácido 4, 5-dιhιdro-5- (4-metιlfeml) -1- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pιrazol-3 -car boxílico
[37] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilfenil) -lH-pιrazol-3 -carbo xilato de metilo
[38] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5-fenil-lH- pιrazol-3-carboxιlato de metilo [39] 4, 5-Dιhιdro-5- (4 -metilfenil ) -1- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pιrazol-3-carboxιlato de metilo
[40] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5-fenil-lH- pιrazol-3 -carboxamida
[41] 1- (4-Amιnosulfonιlfenιl) -4 , 5-dιhιdro-5- (4- metilfenil) -lfí-pιrazol-3 - carboxamida
[42] 4, 5-Dιhιdro-5- (4-metιlfenil) -1- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pιrazol-3 - carboxamida
[43] 3-Cιano-4, 5-dιhιdro-5- (4-metιlfenil) -1- (4- metilsulfonilfenil) -IH-pirazol [44] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (3, 4- dimetilfenil) -3-trιfluorometil-lH-pirazol
[45] 1- (4-Amιnosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (3-metιl-4- metoxifenil) -3-trιfluorometil-lH-pirazol
[46] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4 , 5-dιhιdro-5- (3-fluoro-4- metoxifenil) -3-trιfluorome- til-lH-pirazol
[47] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2-fluoro-4- metoxifenil) -3-trιfluorome- til-lH-pirazol ; [48] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2,4- dimetoxif enil) -3 -tπf luorometil-lH-pirazol
[49] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4 , 5-dιhιdro-5- (4-f luoro -
2-metoxιfenιl) -3-trιfluoro metil-lH-pirazol [50] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -3-dιf luorometιl-4 , 5- dιhιdro-5- (2 , 4-dιmetιlf enil) -lH-pirazol [51] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2,3,4- trif luorof enil) -3 -trif luorome til- lH-pirazol
[52] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- (2-cloro-4- f luorof enil) -4 , 5-dιhιdro-3 -tπf luoro metil-lH-pirazol
[53] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2 -f luoro -
4-trιf luorometilf enil) -3 -tπf luorome til- 1H- pira zol
[54] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- [2,4-
(bistrif luorome til) f enil] -4 , 5-dιhιdro-3-trιf luorometil- lfí-pirazol
[55] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2-metιl-
3-f luorofenil) -3-trιfluoro metil-lH-pirazol
[56] 1- (4 -Ammosulf omlf enil ) -4, 5-dιhιdro-5- (2-metιl-
4-metoxιfenιl) -3-trιfluoro metil-lH-pirazol [57] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- (2 , 4-dιf luorof enil) -3- dif luorometιl-4 , 5-dιhιdro-lH-pιrazol
[58] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4-f luoro -
2-trιf luorometilf enil] -3-trιf luorometil-lH-pirazol
[59] 1- (2, 4 -Dif luorof enil) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilsulfonilf enil) -3-trιf luorometil-lH- pirazol
[60] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- (2-clorof enil) -4,5- dιhιdro-3-tπf luorometil-lH-pirazol
[61] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- (4-cloro-2- f luorof enil) -4 , 5-dιhιdro-3-trιf luoro metιl-lN-pιrazol [62] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4-f luoro-
2-metιlfenιl] -3-trιfluoro metil-lfí-pirazol [63] 1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (2-f luoro- 4-metιlfenil] -3-trιfluoro metil-lH-pirazol
[64] 1- (4-Acetιlammosulfonιlfenιl) -5- (2,4- difluorofenil) -4 , 5-dιhιdro-3-trιfluoro metil-lH-pirazol
[65] 1- (4-Clorofenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -tπfluorometil-lH- pirazol
[66] 4 , 5-Dιhιdro-l-fenιl-5- (4-metιlsulfomlfenil) -3- tπfluorometil-lH-pirazol
[67] 4,5-Dιhιdro-l- (2-fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3 - tπfluorometil-lff- pirazol [68] 1- (4-Cloro-2-metιlfenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -tπfluorometil-lH-pirazol
[69] 4, 5-Dιhιdro-l- (3 -fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3-trιfluorometil-líí- pirazol
[70] 4, 5-Dιhιdro-l- (3 -metilfenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3-trιfluorometil-lH- pirazol
[71] 4,5-Dιhιdro-l- (2 , 4-dιmetιlfenil ) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3-trιfluorometil-lH- pirazol
[72] 1- (2-Clorofenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -trifluorometil-l.fi- pirazol [73] 4, 5-Dιhιdro-l- (2 -metilfenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3 - trifluorometil-lH- pirazol
[74] 1- (2, 4-Dιclorofenιl) -4, 5-dιhιdro-5- (4- metilsulfonilfenil) -3 - rifluorometil-lH- pirazol
[75] 4, 5-Dιh dro-5- (4-metιlsulfonilfenil) -3- tπfluorometιl-1- (2-trιfluorometil fenil) -lH-pirazol
[76] 5- (4-Ammosulfonιlfenιl) -4, 5-Dιhιdro-l- (4- fluorofenil) -3 -tπfluorometil-lH-pirazol
[77] 4, 5-Dιhιdro-l-fenιl-3-metιl-5- (4- metilsulfonilfenil) - lN-pirazol [78] 4, 5-Dιhιdro-l- (4-fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -lH-pirazol
[79] (+) -1- (4-Ammosulfonιlfenιl) -5- (2, 4-dιfluorofenil) 4 , 5 -dihidro-3 -trifluorometil -1H-pirazol
[80] (-) -1- (4-Aminosulfonilfenil) -5- (2 , 4-difluorofenil) - 4 , 5 -dihidro-3 -trifluorometil - 1H-pirazol
[81] (+) -4, 5 -Dihidro- 1- (4-fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -trifluorometil -1H- pirazol
[82] (-) -4, 5 -Dihidro- 1- (4 -fluorofenil) -5- (4- metilsulfonilfenil) -3 -trifluorometil -1H- pirazol
[83] (+) -1- (2, 4 -Difluorofenil) -4, 5 -dihidro- 5- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil - 1H-pirazol [84] (-) -1- (2, 4-Difluorofenil) -4 , 5-dihidro-5- (4- metilsulfonilfenil) -3-trifluorometil -lH-pirazol ;
o una de sus sales fisiológicamente aceptables, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para la prevención o el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis tumoral, de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre.
3. Empleo según la reivindicación 1, de un compuesto de fórmula general (I), o una de sus sales fisiológicamente aceptables, junto con otro producto de los usados habitualmente para el tratamiento de neoplasias, produciendo en este caso una sinergia, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, especialmente para el tratamiento de procesos preneoplásicos o neoplásicos, de la angiogénesis tumoral, de la caquexia y procesos relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF) y, en general, de aquellos procesos que pueden verse beneficiados por la inhibición de la expresión del gen responsable de la síntesis de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en mamíferos, incluido el hombre.
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NZ529304A NZ529304A (en) 2001-04-06 2002-03-21 Utilization of pyrazoline derivatives in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of proliferative cell diseases
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DE60211681T DE60211681T2 (de) 2001-04-06 2002-03-21 Verwendung von pyrazolinderivativen bei der herstellung eines medikaments zur prävention und/oder behandlung von proliferativen zellerkrankungen
IL15826902A IL158269A0 (en) 2001-04-06 2002-03-21 Utilization of pyrazoline derivatives in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of proliferative cell diseases
BR0208805-3A BR0208805A (pt) 2001-04-06 2002-03-21 Uso de um derivado de pirazolina
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PL02365220A PL365220A1 (en) 2001-04-06 2002-03-21 Utilization of pyrazoline derivatives in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of proliferative cell diseases
CA2442974A CA2442974C (en) 2001-04-06 2002-03-21 Use of pyrazoline derivatives in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of cell proliferation diseases
EP02714233A EP1384477B1 (en) 2001-04-06 2002-03-21 Utilization of pyrazoline derivatives in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of proliferative cell diseases
IS6973A IS6973A (is) 2001-04-06 2003-10-03 Notkun pýrasólínafleiða í framleiðslu á lyfi til að fyrirbyggja og/eða meðhöndla frumufjölgunarsjúkdóma
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CY20061101088T CY1105523T1 (el) 2001-04-06 2006-08-03 Χρηση παραγωγων της πυραζολινης κατα την παρασκευη ενος φαρμακου για την προληψη και/ή την υποβολη σε θεραπευτικη αγωγη ασθενειων πολλαπλασιασμου των κυτταρων

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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005077911A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-25 Laboratorios Del Dr. Esteve S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
EP1743889A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios del Dr. Esteve S.A. Sustituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
EP1746090A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-24 Laboratorios del Dr. Esteve S.A. Sustituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
WO2007009702A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
WO2007009706A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
JP2007522180A (ja) * 2004-02-16 2007-08-09 ラボラトリオス・デル・ドクトル・エステベ・ソシエダッド・アノニマ 癌を治療するために有用なピラゾリン誘導体
JP2007522252A (ja) * 2004-02-17 2007-08-09 ラボラトリオス・デル・ドクトル・エステベ・ソシエダッド・アノニマ 置換ピラゾリン化合物、その調製および医薬品としてのその使用
EP1849776A1 (en) * 2006-04-26 2007-10-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Azepane- or Azocane-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
EP1849784A1 (en) * 2006-04-26 2007-10-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Indoline-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
ES2327379A1 (es) * 2005-07-15 2009-10-28 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Compuestos de pirazolina indolinsustituidos, su preparacion y su uso como medicamentos.
US7897589B2 (en) 2005-07-15 2011-03-01 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US7968582B2 (en) 2005-07-15 2011-06-28 Laborotorios Del Dr. Esteve, S.A. 5(S)-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US7994200B2 (en) 2005-07-15 2011-08-09 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Cycloalkane-substituted pyrazoline derivatives, their preparation and use as medicaments

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2238923B1 (es) * 2004-02-16 2006-11-01 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Nuevos derivados pirazolinicos sustituidos.
US7998996B2 (en) 2004-02-17 2011-08-16 Laboratorios Del Dr. Esteve S.A. Substituted pyrazoline compounds for reducing triglycerides in blood
EP1637522A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-22 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds for reducing triglycerides in blood
WO2007009691A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Combination of substituted pyrazolines and anti -addictive agent
ES2326857B1 (es) * 2005-07-15 2010-05-11 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Uso de compuestos de pirazolina sustituidos para el tratamiento de los parametros lipidicos del sindrome metabolico.
ES2326725B1 (es) * 2005-07-15 2010-05-11 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Uso de compuestos de pirazolina sustituidos para el tratamiento de trastornos alimentarios, que incluyen la obesidad o el sindrome metabolico en pacientes con diabetes desarrollada.
EP1749527A1 (en) * 2005-07-15 2007-02-07 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazoline compounds for the treatment of the lipid parameters of the metabolic syndrome
EP1743639A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazoline compounds for the treatment of coagulation related diseases
WO2007009693A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr.Esteve, S.A Combination of a substituted pyrazoline compound and a drug used in food-related disorders
EP1743643A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. New formulations of substituted pyrazoline compounds
WO2007009707A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazoline compounds for the treatment of coagulation related diseases
EP1743642A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazoline compounds and their derivatives for the treatment of cannabinoid system-associated diseases
EP1749526A1 (en) * 2005-07-15 2007-02-07 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazoline compounds for the treatment of food disorders, including obesity or metabolic syndrome in patients with developed diabetes
ES2326723B1 (es) * 2005-07-15 2010-05-11 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Uso de compuestos de pirazol sustituidos y combinaciones de los mismos para el tratamiento del sindrome metabolico.
EP1749525A1 (en) * 2005-07-15 2007-02-07 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Combination of substituted pyrazolines and anti-addictive agent
ES2326724B1 (es) * 2005-07-15 2010-05-11 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Nuevas formulaciones de compuestos de pirazolina sustituidos.
EP1743637A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Use of substituted pyrazole compounds and combinations thereof for the treatment of the metabolic syndrome
WO2007009699A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A Use of substituted pyrazoline compounds and their derivatives for the treatment of cannabinoid system-associated diseases
EP1743636A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Combination of a substituted pyrazoline compound and a drug used in food-related disorders
KR101457637B1 (ko) * 2012-10-24 2014-11-20 건국대학교 산학협력단 디히드로피라졸카르보티오아미드 유도체 및 그 제법 및 그 유도체를 포함하는 항암제 조성물
CN103664785A (zh) * 2013-11-04 2014-03-26 南京大学 一类新颖的二氢吡唑磺胺衍生物的合成及在抗癌药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972986A (en) * 1997-10-14 1999-10-26 G.D. Searle & Co. Method of using cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment and prevention of neoplasia
WO2000076503A1 (en) * 1999-06-16 2000-12-21 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education 1-(4-sulfamylaryl)-3-substituted-5-aryl-2-pyrazolines as inhibitors of cyclooxygenase-2

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5604253A (en) * 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
ES2137138B1 (es) * 1998-05-29 2000-09-16 Esteve Labor Dr Derivados de pirazolinas, su preparacion y su aplicacion como medicamentos.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972986A (en) * 1997-10-14 1999-10-26 G.D. Searle & Co. Method of using cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment and prevention of neoplasia
WO2000076503A1 (en) * 1999-06-16 2000-12-21 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education 1-(4-sulfamylaryl)-3-substituted-5-aryl-2-pyrazolines as inhibitors of cyclooxygenase-2

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007522180A (ja) * 2004-02-16 2007-08-09 ラボラトリオス・デル・ドクトル・エステベ・ソシエダッド・アノニマ 癌を治療するために有用なピラゾリン誘導体
JP2007507471A (ja) * 2004-02-17 2007-03-29 ラボラトリオス・デル・デエレ・エステベ・エセ・ア 置換ピラゾリン化合物、それらの製造法、および薬剤としての使用
WO2005077911A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-25 Laboratorios Del Dr. Esteve S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US7524868B2 (en) 2004-02-17 2009-04-28 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
JP2007522252A (ja) * 2004-02-17 2007-08-09 ラボラトリオス・デル・ドクトル・エステベ・ソシエダッド・アノニマ 置換ピラゾリン化合物、その調製および医薬品としてのその使用
ES2336883A1 (es) * 2005-07-15 2010-04-16 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Compuestos de pirazolina sustituidos, con una estereoquimica predeterminada, para la reduccion de trigliceridos en sangre.
EP1746090A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-24 Laboratorios del Dr. Esteve S.A. Sustituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
WO2007009706A3 (en) * 2005-07-15 2007-04-19 Esteve Labor Dr Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
WO2007009706A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
WO2007009702A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
US8207156B2 (en) 2005-07-15 2012-06-26 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US8106085B2 (en) 2005-07-15 2012-01-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Indoline-substituted pyrazoline derivatives, their preparation and use as medicaments
WO2007009702A3 (en) * 2005-07-15 2007-04-05 Esteve Labor Dr Substituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
ES2327379A1 (es) * 2005-07-15 2009-10-28 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Compuestos de pirazolina indolinsustituidos, su preparacion y su uso como medicamentos.
ES2334967A1 (es) * 2005-07-15 2010-03-17 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Compuestos de pirazolina sustituidos, con una estereoquimica predeterminada, para la reduccion de trigliceridos en sangre.
EP1743889A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-17 Laboratorios del Dr. Esteve S.A. Sustituted pyrazoline compounds, having predetermined stereochemistry, for reducing triglycerides in blood
US7897589B2 (en) 2005-07-15 2011-03-01 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US7968582B2 (en) 2005-07-15 2011-06-28 Laborotorios Del Dr. Esteve, S.A. 5(S)-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
US7994200B2 (en) 2005-07-15 2011-08-09 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Cycloalkane-substituted pyrazoline derivatives, their preparation and use as medicaments
EP1849784A1 (en) * 2006-04-26 2007-10-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Indoline-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments
EP1849776A1 (en) * 2006-04-26 2007-10-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Azepane- or Azocane-substituted pyrazoline compounds, their preparation and use as medicaments

Also Published As

Publication number Publication date
IS6973A (is) 2003-10-03
DE60211681T2 (de) 2007-05-16
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CN1299682C (zh) 2007-02-14
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EP1516621A2 (en) 2005-03-23
UA75402C2 (en) 2006-04-17
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AU2002246152B2 (en) 2007-05-31
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US20040034082A1 (en) 2004-02-19
HUP0400918A2 (hu) 2004-07-28
EP1384477A1 (en) 2004-01-28
ES2174757A1 (es) 2002-11-01
CN1698602A (zh) 2005-11-23
MXPA03009124A (es) 2005-04-11
MA27019A1 (fr) 2004-12-20
ATE326966T1 (de) 2006-06-15
ES2264723T3 (es) 2007-01-16
HK1067311A1 (en) 2005-04-08
BR0208805A (pt) 2004-07-13
JP4451599B2 (ja) 2010-04-14
NO20034470L (no) 2003-12-05
DE60211681D1 (de) 2006-06-29
CA2442974C (en) 2010-02-23
CY1105523T1 (el) 2010-07-28
JP2004525166A (ja) 2004-08-19
RU2305545C2 (ru) 2007-09-10
HUP0400918A3 (en) 2004-10-28
NZ529304A (en) 2006-02-24
KR20040025912A (ko) 2004-03-26
RU2003132457A (ru) 2005-04-10
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NO20034470D0 (no) 2003-10-06
PL365220A1 (en) 2004-12-27

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