WO2002057011A1

WO2002057011A1 - Agent deshydratant et procede de deshydratation d'un article humide a l'aide dudit agent et article deshydrate ainsi obtenu

Info

Publication number: WO2002057011A1
Application number: PCT/JP2002/000288
Authority: WO
Inventors: Michio Kubota; Tomoyuki Nishimoto; Hajime Aga; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2002-07-25
Also published as: KR20030071803A; AU2002228330B2; KR100820482B1; CN1209188C; CA2434284A1; JPWO2002057011A1; JP4147109B2; EP1360988A1; EP1360988A4; CN1487854A; TWI265790B; EP1360988B1; DE60215310D1; US20060008791A1; ATE342125T1; DE60215310T2; US7186701B2

Description

明細書脱水剤及びそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品技術分野

本発明は、サイクロ {→ 6 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) — α — D—ダルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — α — D—ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → } の構造を有する糖質（当該糖質を、その構造にちなんで、本明細書では、以下, 「環状四糖」と称する。）を有効成分とする脱水剤及びそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品に関する。背景技術

糖質を用いる脱水方法は、先に、本発明者等が、特開昭 6 2 — 1 3 6 2 4 0号公報、特開昭 6 2 — 1 5 2 5 3 6号公報、特開昭 6 2 — 1 5 2 5 3 7号公報、特開平 6 — 1 7 0 2 2 1 号公報などで開示したように、無水糖質が、水分を捕捉して含水結晶に変換される途上に脱水力を発揮させる方法である。この方法は、加熱乾燥などとは違って、苛酷な条件を必要としないので、含水物を変質、劣化させること無く，脱水物品に変換する特微を有している。

しかしながら、これら方法のうち、特開昭 6 2 — 1 5 2 5 3 6号公報で開示した、無水グルコース、無水ガラク卜一スなどの無水アルドへキソースを用いる場合には、脱水量が比較的大きいものの還元性糖質であることから反応性に富み、アミノ酸、ペプチドなどと褐変反応を起こし易く、脱水物品の保存安定性に不安のあることが判明した。また、無水アルドへキソースは、比較的高湿度においても含水結晶-に変換せず、脱水力の乏しいことが判明した。また特開昭 6 2 — 1 3 6 2 4 0号公報で開示した無水マル卜ースを用いる場合や、特開昭 6 2 一 1 5 2 5 3 7号公報で開示した無水パラチノースを用いる場合には、その還元力が弱いものの基本的には還元性糖質であり、脱水物品の長期安定性に、なお不安が残ることが判明した。その上、捕捉できる水分量がどちらの場合も糖質の約 5 w w %と比較的少ないことから、脱水剤として多量の無水マル卜ースあるいは無水パラチノースを必要とする欠点のあることも判明した。

一方、特開昭 6 2 — 1 5 2 5 3 7号公報で開示した無水ラフイノース、無水エルロース、無水メレチ卜ースなどの非還元性無水グリコシルフルク卜シドは還元力を持たないためアミノ酸、ペプチドなどとの褐変反応もなく、長期保存安定性において優れていると考えられる。しかしながら、その分子内に耐酸性の小さいフルク卜シド結合を持つていることから、酸性含水物の脱水剤としては、必ずしも適していないことが想定され、得られる脱水物品の安定性にも不安が残る。また、特開平 6 — 1 7 0 2 2 1 号公報で開示した無水 α， ο: — 卜レハロースは還元力を持たないので長期保存安定性に優れており、さらに捕捉できる水分量は糖質の約 1 0 w / w %と比較的多いことから脱水剤として上記の糖質よりも適しているといえる。しかしながら、依然として多量の無水 α， α — 卜レハロースを必要としているため、さらに脱水及び Ζ又は乾燥効率の高い脱水剤が求められている。発明の開示

本発明者等は、糖質を用いる脱水方法における欠点を解消することを目的として、天然型の非還元性糖質の無水物を検索し、更に優れた脱水剤の確立とその利用について鋭意検討を続けてきた。

—方、本発明者等は、先に実験室レベルでの製造方法が知られていた環状四糖を工業レベルで澱粉質を原料として比較的安価に大量生産する方法を確立した。併せて、環状四糖には少なくとも含水形態としての 5乃至 6含水結晶及び 1 含水結晶、及び無水形態としての無水結晶及び無水非晶質の形態が存在することを明らかにし、その後の硏究により、無水結晶、 Ί 含水結晶及び無水非晶質の環状四糖は水分を吸収し、含水形態である 5乃至 6含水結晶に容易に変換し得ることを発見した。

この特徴を脱水剤に利用すべくさらに研究を重ねたところ、上記した無水結晶、 1 含水結晶及び無水非晶質から選ばれる環状四糖は、優れた脱水能を有しており、加えて、得られる脱水物品が極めて安定であることから広範囲に適用でき、従来知られていた糖質よりも脱水剤として好適であることを見出した。即ち、脱水能を有する環状四糖、つまり無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖から選ばれる糖質を含水食品、含水医薬品などの含水物に含有、接触又は共存させて 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させることにより、環状四糖の結晶水として多量の水分を捕捉し、かっきわめて強力な脱水剤として作用すること、及び安定性に優れるため酸性含水物を含めて広範囲の含水物に適用できることを見出し、風味良好な高品質の脱水食品や、高活性で安定な脱水医薬品などの脱水物品を容易に製造し得ることを確認して、本発明を完成した。

したがって、本発明は、従来、脱水剤として全く注目されなかった環状四糖を選択したものであり、とりわけ脱水能を有する環状四糖を脱水剤として含有、接触又は共存させ、含水物を脱水する方法は、本発明をもって嚆矢とする。図面の簡単な説明

第 1 図は、 α —イソマル卜シル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パターンを示す図である。

第 2図は、 α —イソマル卜シル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル Η — N M Rスペクトル）を示す図である。

第 3 図は、 α —イソマル卜シル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（ ^{1 3} C — N M Rスペクトル）を示す図である。

第 4図は、環状四糖の構造が、サイクロ {→ 6 ) — a — D —ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) — 0；— D —ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) — a — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) — a — D —ダルコビラノシル ― ( 1 →} であることを示す図である。

第 5図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 6図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす p Hの影響を示す図である。

第 7國は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 8図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の p H安定性を示す図である。

第 9 図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の a —イソマル卜シル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度影響を示す図である。第 1 0図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。

第 1 1 図は、バチルスグロビスポルス C 9由来の α —イソマル卜シル転移酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 2図は、バチルスグロビスポルス C 9由来の α —イソマル卜シル転移酵素の Ρ Η安定性を示す図である。

第 1 3図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 1 4図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。

第 1 5図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 6図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の ο; —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 7 図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 1 8図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の酵素活性に及ぼす Ρ Ηの影響を示す図である。

第 1 9 図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の温度安定性を示す図である。

第 2 0図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 2 1 図は、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α —イソマルトシルマル卜トリオースの ¹ Η - N M Rスぺク卜ルを示す図である。

第 2 2図は、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α —イソマル卜シルマルトテ卜ラオースの ¹ H — N M Rスぺク卜ルを示す図である。

第 2 3図は、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α —イソマソレ卜シルマル卜トリオースの ^{1 3} C — N M Rスぺク卜ルを示す図である。

第 2 4図は、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α —イソマソレ卜シルマル卜テ卜ラオースの ^{1 3} C — N M Rスぺク卜ルを示す図である。

第 2 5図は、 5乃至 6含水結晶環状四糖の顕微鏡写真をディスプレ一上に表示した中間調画像である。

第 2 6図は、 5乃至 6含水結晶環状四糖状粉末を粉末 X線回折法で解析したときの回折スぺク卜ルを示す図である。

第 2 7 図は、 5乃至 6含水結晶環状四糖状粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。

第 2 8図は、本発明の 1 含水結晶環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したときの回折スぺクトルを示す図である。

第 2 9 図は、本発明の 1 含水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。

第 3 0図は、 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末を 4 0 °Cで真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したときの回折スぺクトルを示す図である。

第 3 1 図は、 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末を 1 2 0 °Cで真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したときの回折スぺク卜ルを示す図である。第 3 2図は、本発明の無水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。

第 3 3図は、環状四糖水溶液を凍結乾燥及び真空乾燥して得られる無水非晶質環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したときの回折スぺク卜ルを示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明における含水物の脱水方法は、水分を含有しているもの、とりわけ、結晶水のような結合水分とは違った遊離水分を含有しているものの脱水方法として好ましく、例えば、本発明の脱水剤を乾燥食品などを封入した防湿容器内に共存させることで、雰囲気に含まれる水分を低減する場合、更には、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品、これらの原材料又は加工中間物など各種含水物に含有若しくは接触させることで、含水物の遊離水分を低減させる場合などに有利に適用できる。

これら含水物に脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させると、脱水能を有する環状四糖は、その重量の約 1 1 乃至 1 5 w / w % (以下、本明細書では、特にことわらない限り、「w Z w % J を単に Γ %」と略記する。）もの水分を 5乃至 6含水結晶環状四糖の結晶水として含水物から強力に取り込み（この値は無水マルトースの場合の 2 . 2乃至 3倍量、若しくは無水 α， α — トレ八ロースの場合の 1 . 1 乃至 1 . 5倍量に相当する。）、含水物の水分を実質的に低減し、脱水及び/又は乾燥できる。

例えば、味付け海苔、クッキーなどの乾燥食品を封入した防湿容器内に、紙製などの透湿小袋に充填した脱水能を有する環状四糖を共存させておくことにより、容器内の相対湿度を極度に低減させ、乾燥食品、粉末状物などを高品質かつ安定に長期間維持し得ることが判明した。この際、脱水能を有する環状四糖は、水分を捕捉して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換される途上及び変換された後においても、ベとついたり、流れたりすることがなく、乾燥食品や防湿容器を汚染する心配はない。

さらに、例えば、プランディー、食酢、ローヤルゼリー、生クリー厶、マヨネーズなどの液状、ペースト状などの高水分食品の場合には、脱水能を有する環状四糖を含有させて、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分の低減された高品質の脱水食品、例えば、マスキッ卜状、粉末状などの食品をきわめて容易に製造することができる。

この場合、脱水能を.有する環状四糖が食品原材料などに含まれる水分を充分に脱水可能な量以上加えられると、脱水能を有する環状四糖の一部が 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換される。この結果、本発明により得られた脱水食品は、遊離水分が減少しているので、微生物汚染、加水分解、酸敗、褐変などによる変質、劣化を防止し、風味良好で高品質な商品を長期に安定に維持し得る。

本発明の脱水方法は、環状四糖が非還元性糖質で安定であり、かつ、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要としないので、液状又はペース卜状の高水分食品を変質、劣化させることなく、風味良好で、水分の低減された脱水食品に容易に変換し得る特徴を有している。また、環状四糖自体は、蔗糖の約 2 0 %の甘味度を持つ、無毒、無害の甘味料であり、なんら危険性はない。

また、リンホカイン、抗生物質などの水溶液、薬用人参エキス、スツボンエキスなどのペースト状医薬品の場合にも、これらに脱水能を有する環状四糖を含有させて、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分の低減された高品質の脱水医薬品、例えば、マスキット状、粉末状などの医薬品をきわめて容易に製造することができる。この方法は、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要とせず、また、脱水能を有する環状四糖が脱水剤としてのみならず、医薬品の有効成分の安定剤としても作用するので、高品質で安定な脱水医薬品を製造することができる。

例えば、バイアル瓶に、充分量の脱水能を有する環状四糖を採り、これに、例えば、リンホカイン、ホルモンなどの生理活性物質を含有する水溶液を加え、密栓して固形製剤などを製造することも有利に実施できる。この場合には、脱水能を有する環状四糖が、生理活性物質を含有する水溶液を脱水することは勿論のこと、バイアル瓶内の雰囲気を防湿乾燥し得る。このようにして得られる脱水固形医薬品は、その製造工程が容易であるだけでなく、その高品質を長期に安定に維持し得ること、更には、使用時に水に速やかに溶解するなどの特徴を有している。

また、充分量の脱水能を有する環状四糖を撹拌しながら、これに生理活性物質を含有する水溶液の所定量を混合し、得られる粉末をそのまま容器に封入して、高品質で安定な固体製剤にすることも、更に、この粉末を、常法にしたがって顆粒、錠剤などに成形して利用することも有利に実施できる。

本発明の脱水能を有する環状四糖を用いる脱水剤は、従来知られているシリカゲル、酸化カルシウムなどの脱水剤とは違って、可食性であり、経口摂取されて難消化性で無力口リー乃至低カロリーの糖質脱水剤であるのみならず、各種生理活性物質などの安定剤としても有利に利用できる。

本発明で用いる環状四糖及び脱水能を有する環状四糖は、その由来、製法については問わない。また、脱フ k能を有する環状四糖としては、後述のように、環状四糖の無水物である無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖が水分を取り込み 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換されることから好適である。同様に 1 含水結晶環状四糖もまた水分を取りこみ 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換され、含水物の脱水作用を発揮する。よって、本発明で用いる脱水能を有する環状四糖はその完全な無水物に限らず、例えば、含水結晶物であっても脱水能を有するものであれば有利に用いることができる。したがって、本発明の脱水能を有する環状四糖を定義するには、それに含まれる水分量で判断することができ、その水分量はカール · フィッシヤー法などの公知技術によつて測定できる。本発明の脱水剤の有効成分である環状四糖に含まれる水分量は、当然、少ないほどよく、好ましくは 4 %未満、さらに好ましくは 3 %未満である。 4 %以上 1 0 %未満の水分を含有している場合は脱水能を有しているものの脱水剤としての機能及び効率が低下する。

本発明者等は、本発明に先立って脱水能を有する環状四糖、とりわけ、無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖、及び無水非晶質環状四糖の製造方法について研究した。

まず、環状四糖の製造方法としては、例えば、『ョ一口ピアン · ジヤーナル ' 才ブ ' ノィォケミストリ一（ E u r o p i a n J o u r n a I o f B i o c h e m i s t r y )』、第 2 2 6巻、 6 4 1 乃至 6 4 8 ( 1 9 9 4年）で開示されたアルテルナン（ a I t e r n a n ) に加水分解酵素アルテルナナ一ゼ（ a I t e r n a n a s e ) を作用させる製造方法の他に、本発明者等が、先に特願 2 0 0 0 — 2 2 9 5 5 7号明細書及び特願 2 0 0 0 - 2 3 4 9 3 7号明細書に開示した、澱粉を用いて製造したパノースを α—イソマル卜シル転移酵素によって環状四糖に変換して製造する方法、及び澱粉を α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及び一イソマル卜シル転移 «を組み合わせて環状四糖を製造する方法などの澱粉質を原料とした酵素法による製造方法がある。さらに、これら先願明細書に記載したように、本発明者等は、環状四糖の製造方法として、アルテルナンよりも豊富で安価である澱粉質を原料とした酵素法による方法が、高効率かつ安価に製造できることから、工業的に有利に実施できることを明らかにし、更に、環状四糖の形態として⁵乃至⁶含水結晶、無水結晶、 1含水結晶、無水非晶質などが在することも初めて明らかにした。

なお、 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素及び α—ィソマルトシル転移酵素を産生する微生物として、平成 1 2年 4月 2 5日付けで、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に、受託番号 F E RM Β Ρ— 7 1 4 3として寄託されているバチルスグロビスポルス C 9株、及び、平成 1 2年 4月 2 5日付けで、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に、受託番号 F E RM B P— 7 1 4 4として寄託されているバチルスグロビスポルス C 1 1株が挙げられる。

次に、本発明者等は、無水結晶環状四糖粉末の製造方法について検討し、その方法を確立した。即ち、その方法は、例えば、前述の方法で澱粉質から瞧法により得た環状四糖水溶液を、水分約 1 5 %未満、望ましくは、 2. 0 %以上"！ 20/0未満の高濃度シラップとし、このシラップを無水結晶環状四糖の種晶共存下で 5 0乃至 1 8 0°C の温度範囲に維持しつつ、無水結晶環状四糖を晶出させ粉末化して itする。

また、 1含水結晶環状四糖粉末を製造するには、例えば、 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末をさらに約 1 0 0乃至 1 8 0°Cの温度で適度に乾燥して製造する。

さらに、無水非晶質環状四糖粉末を製造するには、例えば、前述の方法で得た環状四糖水溶液を、例えば、凍結乾燥及び約"！ 0 0乃至 1 8 0°Cの温度で常圧乾燥又は真空乾燥した後、粉砕して製造する。また、当該環状四糖水溶液を濃度約 4 0乃至 8 5 % のシラップとして、凍結乾燥及び真空乾燥した後、粉砕して製造するか、又は、高圧ノズル法又は回転円盤法などの噴霧乾燥法によリ粉末を直接製造することもできる。粉末化の方法としては、上記の噴霧乾燥法以外にも、例えば、プロック粉砕方法、押出造粒方法、流動造粒方法などの公知の方法を適宜採用すればよい。

このようにして製造される本発明の脱水能を有する環状四糖粉末は、上品な低甘味を有する非還元性の流動性を有する白色粉末で、その水分含量は低く実質的に無水で、カール · フィッシャー法により、通常、 4 %未満、好ましくは 3 %未満である。さらにその形態は無水結晶粉末、 Ί 含水結晶粉末又は無水非晶質粉末とすることも可能である。

本発明の脱水能を有する環状四糖粉末は、用途に応じて粒径をサイズ分けを利用することも有利に実施できる。例えば、医薬品のような少量の分封若しくは錠剤などを製造する場合では、粒径が小さいほど有効成分が均一に分散されるため、好都合である。本発明の脱水剤の粉末の粒径はメッシュなどを用いた通常行われている分級手段によつて、適宜選択でき、通常、 2 0 ii m乃至 5 0 0 t m、好ましくは 5 Ο ΓΤΙ乃至 2 0 0 mも有利に調製できる。

更に、本発明でいう脱水能を有する環状四糖粉末は、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換され強力な脱水作用を発揮する実質的な無水物であればよく、例えば、脱水能を有する環状四糖の 5乃至 6含水結晶環状四糖への変換を促進し脱水剤としての効果を高めるため、種晶としてできるだけ少量、通常 5 %未満、望ましくは、 1 %未満の 5乃至 6含水結晶環状四糖を脱水剤に混合させた粉末を利用することも有利に実施できる。

このようにして得られる脱水能を有する環状四糖粉末は、これを、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品などの含水物に含有させると、それに含まれる遊離水分を 5乃至 6含水結晶環状四糖の結晶水として捕捉し、固定し、含水物に対して強力な脱水剤として作用する。本発明の脱水剤が有利に適用できる場合として、防湿容器内に共存させて、防湿容器内の雰囲気を除湿、乾燥する場合、または、加熱乾燥、真空乾燥などの工程で変質、劣化を伴い易い含水物又は乾燥困難な含水物に含有若しくは接触させることで、高品質のマスキッ卜状、粉末状、固体状などの脱水物品を製造する場合などがある。

本発明の脱水剤を除湿、乾燥する場合に適用する場合としては、例えば、味付け海苔、クッキーなどの吸湿防止に利用できる。更には、吸湿して固結し易い粉末状物、例えば、米粉、小麦粉，大豆粉などの穀粉、はつたい粉、きな粉、すりゴマなどの加工穀粉、プリンミックス粉、ホットケーキミックス粉などのプレミックス粉、食塩、砂糖などの微細結晶調味料、粉末醤油、粉末味噌、粉末寿司酢、粉末ダシの素、粉末複合調味料などの粉末調味料、粉末パプリカ、粉末にんにく、粉末シナモン、粉末ナツメグ、粉末ペパー、粉末セージなどの粉末香辛料、粉末酵母エキス、粉末ミルク、粉末ヨーグルト、粉末チーズ、粉末ジュース、粉末ハープ、粉末ビタミン、顆粒スープ、顆粒ブイョン、魚粉、血粉、骨粉、粉末乳酸菌剤、粉末酵素剤、顆粒消化剤などの粉末状物品に脱水能を有する環状四糖を配合して包装封入することにより、包装容器内の相対湿度を低減させ、粉末状物品の付着、固結を防止できるので、製造直後の流動性良好な高品質を長期間維持するなどの目的にも利用することができる。

また、本発明の脱水剤を含水物を脱水する場合に適用させる場合としては、例えば、動物、植物、微生物由来の器官、組織、細胞、摩砕物、抽出物、成分、又はこれらからの調製物など各種含水物を脱水する場合に有利に利用できる。

例えば、食品、その原材料又は加工中間物の場合には、生果、ジュ —ス、野菜エキス、豆乳、ゴマペース卜、ナッツペース卜、生あん、糊化澱粉ペース卜、小麦粉などの農産品、ゥニペース卜、力キエキス、イワシペース卜などの水産品、生卵、レシチン、牛乳、乳清、生クリー厶、ヨーグルト、バター、チーズ、などの畜産品、メ一プルシラップ、蜂蜜、味噌、醤油、マヨネーズ、ドレッシング、カツ才エキス、ミー卜エキス、昆布エキス、チキンエキス、ビーフエキス、酵母ェキス、きのこエキス、甘草エキス、ステビアエキス、これらの酵素処理物、漬物用調味液などの含水調味料、日本酒、ワイン、ブランディー、ウィスキー、薬用酒などの酒類、緑茶、紅茶、コーヒーなどの嗜好飲料、八ッ力、ヮサビ、ニンニク、力ラシ、サンショウ、シナモン、セージ、ローレル、ペパー、柑橘類などから抽出される含水香辛料、セィヨウァカネ、ベニノキ、ゥコン、パプリカ、レッドビー卜、ベニバナ、クチナシ、サフラン、紅麹菌などから抽出される含水着色料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル及びソルビタン脂肪酸エステルなどから調製される含水乳化剤、燻液、醱酵液などの保存料などの液状乃至ペース卜状物から安定で風味良好な脱水食品を容易に製造することができる。

このようにして得られた脱水食品、例えば、粉末農水畜産品、粉末油脂、粉末香料、粉末着色料、粉末乳化剤、粉末保存料などは、風味良好な天然型バルクフレーバーなどとして、マヨネーズ、スープの素などの調味料、ハードキャンディー、ケーキ、などの菓子類、ホットケーキミックス、即席ジュースなどのプレミックスなども各種飲食物の加工材料として有利に使用することができる。

また、本発明の脱水剤を医薬品、その原料又は加工中間物の場合に適用させる場合としては、インターフェロン一 α，インターフェロン一 β , インターフェロンーァ、ッモア · ネクロシス · ファクタ—— ，ッモア ■ ネクロシス · ファクタ—— ）8、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン I I などのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリ卜ロポェチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、 B C Gワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風卜キソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロプリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフエニコ一ル、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、 L一ァスコルビン、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、卜コフエロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エラス夕一ゼ、ゥロキナーゼ、プ口テアーゼ、一アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スツボンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのェキス類、ウィルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの液状乃至ペース卜状物も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の脱水医薬品、脱水健康食品などを容易に製造できる。

また、本発明の脱水剤を化粧品、その原料又は加工中間物の場合に適用させる場合には、前記食品、医薬品の場合と同様に、生卵、レシチン、生クリーム、ハチミツ、甘草エキス、香料、着色料、酵素などを脱水すれば、高品質の脱水化粧品が容易に得られる。本化粧品は、美肌剤、美毛剤、育毛剤などとして有利に利用できる。

また、本発明の脱水剤を脱水物品として酵素の場合に適用させる場合には、食品、医薬品、工業原料などの加工用触媒として、また、治療剤、消化剤などとして、更には酵素洗剤などとしても有利に利用でさる。 .

含水物に脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させる方法としては、目的の脱水物品が完成されるまでに、例えば、混和、混捏、溶解、浸透、散布、塗布、噴霧、注入などの公知の方法が、適宜に選ばれる。

含水物に対する脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させる量は、含水物に含まれる水分量と、目的とする脱水物品の性状によつても変わり、必要ならば、含水物を他の公知の方法で部分的に脱水又は濃縮した後に、脱水能を有する環状四糖を含有、接触又は共存させてもよく、通常、含水物 1 重量部に対して、 0 . 0 0 1 乃至 2 0 0 重量部、望ましくは 0 . 0 1 乃至 5 0重量部である。

本発明で得られる脱水物品、例えば、食品、医薬品、化粧品などは品質を更に向上させるために、適宜な着香料、着色料、呈味料、安定剤、増量剤などを併用することも有利に実施できる。とりわけ、安定剤について、本発明が脱水能を有する環状四糖による強力な脱水方法であることから、抗酸化剤などの低分子化合物に限る必要はなく、従来、乾燥が困難とされていた水溶性高分子化合物、例えば、可溶性澱粉、デキストリン、プルラン、エルシナン、デキストラン、ザンタンガム、アラビアガム、ローカス卜ビーンガム、グァガム、卜ラガン卜ガム、タマリンドガ厶、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ぺクチン、寒天、ゼラチン、アルブミン、カゼインなどの物質も安定剤として有利に利用できる。

これら水溶性高分子化合物を用いる場合には、例えば、液状乃至べ一スト状含水物に、予め水溶性高分子化合物を均一に溶解させ、ついで、これに脱水能を有する環状四糖を混和、混捏などの方法で均一に含有させることにより、微細な 5乃至 6含水結晶環状四糖を析出させた脱水物品が得られる。

本品は含水物由来の香気成分、有効成分などが高分子化合物の皮膜で被膜されているか、又は、該皮膜で囲まれたマイクロカプセル中に微細な 5乃至 6含水結晶環状四糖とともに内包されるか、更には、香気成分、有効成分などが環状四糖と包接化合物を形成して安定化されており、その揮散、品質劣化が防止されることから、含水物由来の香気成分、有効成分の安定保持に極めて優れている。この際、必要ならば水溶性高分子として、香気成分などと包接化合物を形成する α—、 β 一又は Τ ーシクロデキス卜リンを併用することも有利に実施できる。

シクロデキス卜リンとしては、高純度の物に限る必要はなく、乾燥しにくく粉末化の困難な低純度のシクロデキストリン、例えば、多量のマル卜デキス卜リンとともに各種シクロデキストリンを含有した水飴状の澱粉部分加水分解物、更にはシクロデキス卜リンのダルコ一ス誘導体なども有利に利用できる。

本発明の脱水物品、とりわけ、粉末状物品を製造する方法は、種々の方法が採用できる。例えば、食品、医薬品、化粧品、それらの原材料又は加工中間物などの比較的高水分の含水物に、脱水能を有する環状四糖を脱水物品の総重量当り水分約 5 0 %以下、望ましくは 1 0乃至 4 0 %になるように均一に含有させた後、バッ卜などに約 0 . 1 乃至 5 日間、約 1 0乃至 5 0 °C、例えば、室温に放置し、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させて、例えばブロック状に固化し、これを切削、粉砕などの方法により製造すればよい。必要ならば、切削、粉砕などの粉末化工程の後に乾燥工程、分級工程などを加えることもできる。

また、噴霧する方法などにより、直接、粉末品を製造することができる。例えば、脱水能を有する環状四糖粉末を流動させながら、これに液状乃至ペースト状の含水物を所定量噴霧して、接触させて造粒し、ついで、必要に応じて約 3 0乃至 6 0 °Cで約 0 . 1 乃至 1 0時間熟成して、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させるか、又は、脱水能を有する環状四糖を液状乃至ペース卜状含水物に混和、混捏などした後、これを、直ちに、若しくは、 5乃至 6含水結晶環状四糖への変換を開始させて、噴霧して得られる粉末品を、必要に応じて同様に熟成し、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させる方法は、粉末状脱水物品を大量生産する方法として好適である。

このようにして得られた粉末状脱水物品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤、安定剤などを併用して、更には、顆粒、錠剤、カプセル剤、棒状、板状、立方体形など適宜な形状に成型して利用することも自由にできる。

また、一般に、澱粉は、その膨潤、糊化のために、多量の水分を必要としている。したがって、糊化澱粉は極めて微生物汚染を受けやすい。脱水能を有する環状四糖は、このような糊化澱粉の脱水剤としても有効に利用できる。例えば、求肥などの糊化澱粉は、これに脱水能を有する環状四糖を含有させ 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させることにより、実質的に水分が低減され、微生物汚染を防止することができる。

さらに、脱水能を有する環状四糖は、糊化澱粉に対して容易に均一に混和し、後述するように老化防止剤としても作用することから、糊化澱粉を含有する各種加工食品の商品寿命を大幅に延長することができる。

また、脱水能を有する環状四糖は、例えば、皮むきバナナ、オレンジ、スライスした蒸し芋、開いた鰺、秋刀魚、生麵、ゆで麵、餅菓子などの表面に微生物汚染を受けやすい高水分含有食品に用いられる場合には、その表面に、例えば、脱水能を有する環状四糖粉末をまぶして接触させ、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させ、その表面の水分を実質的に低減し、これら食品の日持ちを向上し、品質を改良することから食品の防腐剤、安定剤、品質改良剤などとして有利に利用できる。この際、必要ならば、例えば、乳酸、クェン酸、エタノールなどを併用して、また、真空包装、ガス充填包装、冷蔵などして、その商品寿命を更に延長させることも自由である。

また、脱水能を有する環状四糖は、アルコールに対し高い親和力を示す。この性質から、メタノール、エタノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコールなどのアルコール又はアルコール可溶物などに含まれる水分の脱水剤としても有利に利用できる。

例えば、清酒、焼酎、ワイン、ブランディー、ウィスキー、ゥ才ッ力などの酒類を脱水能を有する環状四糖で脱水し、生成した 5乃至 6 含水結晶環状四糖にその有効成分、香気などを保持したマスキッ卜状、粉末状などとして有利に製造することができる。このようにして製造した粉末酒類は菓子、プレミックスなどに利用でき、水で復元して飲用に供することもできる。

本発明の脱水能を有する環状四糖は、脱水剤、安定剤としてだけでなく、脱水物品中に含有させることで、上品な甘味質、ボディー、適度な粘度付与剤などとしての効果をも発揮することができる。

また、ヨウ素などのアルコール溶液を脱水能を有する環状四糖と混合し、これに水溶性高分子などを含有する水溶液に加えて 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させることにより、ヨウ素などの有効成分を揮発、変質させることなく安定に保持し、かつ、適度の粘度、延び、付着性を有するマスキット状の膏薬などを製造することも有利に実施できる。

また脱水能を有する環状四糖に含水油溶性物質、乳化物、ラテックスなどを含浸、混合などして脱水能を有する環状四糖を 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させ、粉末状の油脂、香辛料、香料、着色料などの食品、化粧品、粉末状のビタミン、ホルモンなどの医薬品などを製造することも有利に実施できる。

この場合には、脱水能を有する環状四糖は脱水剤としてのみならず、 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換した後においても、安定剤、保持剤、賦形剤、担体などとしても作用する。

また、チョコレート、クリームなどの水分を嫌う油溶性物質含有食品の場合にも、脱水能を有する環状四糖は有利に利用される。この場合には、脱水剤としてのみならず、加工適性、口溶け、風味などが良好になることに利用される。更に、得られた製品は、その高品質を長期にわたって安定に維持し得る特徴を有している。

以上述べたように、本発明の非還元性糖質である脱水能を有する環状四糖が各種含水物の水分を強力に脱水する、加えて、得られる脱水物品が極めて安定であることを見いだしたことによって達成されたものであり、その脱水能を有する環状四糖を脱水剤として利用することにより、液状乃至ペース卜状などの含水物から、環状四糖の特徴である包接作用によって、その風味、香気を劣化、揮散させることなく、水分の低減された高品質の食品、化粧品や、また、その有効成分、活性を分解低下させることなく、水分の低減された高品質の医薬品、化粧品などを有利に製造することができる。

次に本発明の脱水剤の使用例について述べる。

脱水能を有する環状四糖は低甘味であって、虫歯誘発、血中コレステロール及びノ又は血糖値の上昇などの懸念がない調味料としても使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ぶどう糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、 α， α — 卜レハロース、蜂蜜、メープルシュガ一、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、 a—グリコシルステビオシド、ラカン力甘味物、グリチルリチン、ソ一マチン、 L ーァスパラチルフエ二ルァラニンメチルエステル、ァセスルファム K、スクラロース、サッカリン、グリシン、ァラニンなどのような他の甘味料と、また、デキス卜リン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。

脱水能を有する環状四糖は、非還元性糖質であって環状四糖本来の上品な低甘味を有し、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、 —般食品への脱水剤としてのみならず、甘味付に、また呈味改良、品質改良、風味改善などに利用することも有利に実施できる。

例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麵つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールゥ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料への脱水剤として、更には、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、風味改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんベい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタ一クリー厶、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケ —キ、ドーナツ、チョコレー卜、チューインガム、キャラメル、ヌガ一、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーぺース卜、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペース卜類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べつたら漬、千枚漬、らつきよう漬などの漬物類、たくあん潰の素、白菜潰の素などの漬物の素類、八厶、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉八厶、魚肉ソーセージ、力マボコ、チクヮ、天ぶらなどの魚肉製品、ゥニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、ェビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、果実酒、酒などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒ一、即席しるこ、即席スープなどの即席飲料などの各種食品への脱水剤として、更には甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、風味改善などとして利用することも有利に実施できる。

以下、本発明で用いられる環状四糖の製造方法及び性質について述ベる。

実験 1 培養物からの環状四糖の調製

澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 』、松谷化学株式会社製造） 5 w / V % , 酵母抽出物（商品名『アサヒミース卜』、アサヒビール株式会社製造） 1 . 5 w/ v %、リン酸二カリウム 0. l w / %、リン酸一ナトリウム 1 2含水塩 0. 0 6 w/ v %、硫酸マグネシゥ厶 7含水塩 0. 0 5 w / V %、及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m l 容三角フラスコに 1 0 0 m l を入れ、才一卜クレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 9 ( F E R M B P— 7 1 4 3 ) を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清を才ー卜クレープ（ 1 2 0 °C、 1 5分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。

得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒として n —ブ夕ノール、ピリジン、水混液（容量比 6 ： 4 ： 1 )、薄層プレー卜としてメルク社製『キーゼルゲル 6 0』（アルミプレー卜、 2 0 X 2 0 c m ) を用い 2 回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、 Γ T L C」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸一メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフエニルァミンーァニリン法で発色して調べたところ、 R f 値が約 0 . 3 1 の位置に硫酸—メタノール法で陽性、かつ、ジフエニルァミン一ァニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。

先に得た上清約 9 0 m I を p H 5 . 0、温度 4 5 °Cに調整した後、 —ダルコシダーゼ (商品名『卜ランスダルコシダーゼし Γァマノ」』、ァマノ製薬株式会社製造）を固形物 1 グラム当り 1 ， 5 0 0単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製造）を固形物 1 グラム当り 7 5単位添加して 2 4時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムで 1~1を 1 2 に調整し 2時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイアイ才ン P K 2 1 8』と『ダイアイ才ン W A 3 0』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイアイオン S K — 1 B』とオルガノ製ァ二オン交換樹脂『 I R A 4 1 1 』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレー夕で濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約 0 . 6 gの糖質粉末を得た。

得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、 H P L Cと略称する。）で調べたところ、國 1 に示すように、溶出時間 1 0 . 8 4分に単一ピークのみが検出され、純度は 9 9 . 9 %以上で極めて高純度であることが判明した。なお、 H P L Cは、『ショウデックス（ S h 0 d e x ) K S - 8 0 1 カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度 6 0 °C、流速 0. 5 m I /m i n水の条件で行い、検出は示差屈折計『 R I 一 8 0 1 2』（東ソ一株式会社製造）を用いて行なった。

また、還元カをソモギー · ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断される。

実験 2 環状四糖の構造解析

実験 1 の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「 F A B— M S」）したところ、質量数 6 4 9のプロ卜ン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が 6 4 8 であることが判明した。

また、常法にしたがって、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマ卜グラフィ一法で構成糖を調べたところ、 D—グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖は D—グルコースであることも判明し、質量数をも考慮すると、本糖質はグルコース 4分子からなる環状糖質であることが推測された。

さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称 N M R ) を行ったところ、図 2 に示す ¹ H— N M Rスペクトルと、図 3 に示す ' ³ C— N M R スぺクトルが得られ、これらスぺクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ョ一口ピアン · ジャーナル . 才ブ . バイオケミストリ一 ( E u r o p i a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y )』、 6 4 1 乃至 6 4 8頁（ 1 9 9 4年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ {→ 6 ) — α— D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) 一 a— D—ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) — a— D—ダルコピラノシル一（ Ί → 3 ) — α— D—ダルコビラノシルー（ 1 → } のスぺクトルと一致し、本糖質の構造が図 4 に示す環状四糖、即ち、サイク口 {→ 6 ) — α— D—ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) — α— D—グルコピラノシルー（ 1 → 6 ) — α— D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) 一 α— D—ダルコピラノシル— （ 1 → } であることが判明した。

実験 3 バチルスグロビスポルス C 9 からの α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の生産

澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 4 JI、松谷化学株式会社製造） 4. 0 w/ V % , 酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』（ァサヒビール株式会社製造） 1 . 8 w/ v %、リン酸二カリウム 0. 1 w / V % , リン酸一ナ卜リウ厶 1 2含水塩 0. 0 6 wZ v %、硫酸マグネシゥ厶 7含水塩 0. 0 5 w / V %、及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、オートクレープで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 9 ( F E R M B P— 7 1 4 3 ) を接種し、 2 7 °〇、 2 3 0 「ロで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。

容量 3 0 I のフアーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 I 入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 v Z v %を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 8. 0 に保ちつつ、 4 8時間通気撹拌培養した。培養後、培養液中の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は約 0. 4 5単位/ m I で、一イソマル卜シル転移酵素活性は約 1 . 5単位/ m l で、環状四糖生成活性は約 0. 9 5単位/ m I であり、遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 I の酵素活性を測定したところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は約 0. 4 5単位/ m I の活性（総活性約 8 , 1 1 0単位）で、 α—イソマルトシル転移酵素は約 1 . 5単位 /m I の活性（総活性約 2 6， 9 0 0単位）で、環状四糖生成活性は約 0. 9 5単位/ m I (総活性約 1 7， 1 0 0単位）であった。なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性の測定は、マル卜トリオースを濃度 2 w / ν %となるよう 1 O O m M酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させて基質液とし、その基質液 0. 5 m I に酵素液 0. 5 m I 加えて、 3 5 °C で 6 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマル卜シルマル卜一スとマル卜一スのうち、このマル卜ース量を、実験 1 に記載の H P L C法で定量することによって行った。 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の活性〗単位は、上記の条件下で 1 分間に 1 ^モルのマルトースを生成する酵素量とした。

また、 α—イソマル卜シル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度 2 w/ v %となるよう 1 O O m M酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させ基質液とし、その基質液 0. 5 m l に酵素液 0. 5 m l 加えて、 3 5 °Cで 3 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコース才キシダーゼ法で定量することによって行った。 α—イソマル卜シル転移酵素の活性 1 単位は、上記の条件下で 1 分間に 1 ^モルのグルコースを生成する酵素量とした。環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製造）を濃度 2 w/ v %となるよう 5 0 m M酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させ基質液とし、その基質液 0. 5 m I に酵素液 0. 5 m I 加えて、 3 5 °Cで 6 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して反応を停止させた後、更に、 α—ダルコシダ一ゼ（商品名『卜ランスダルコシダーゼ L 「ァマノ」』、天野製薬製造） 7 0単位/ m I とダルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売） 2 7単位/ m I とを含む 5 O m M酢酸緩衝液（ P H 5. 0 ) 1 m l を加えて、 5 0 °Cで 6 0分間処理し、その液を Ί 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験 1 に記載の H P L C法で定量することによって行った。環状四糖生成活性 1 単位は、上記の条件下で 1 分間に 1 ^モルの環状四糖を生成する酵素量とした。

実験 4 バチルスグロビスポルス C 9 由来酵素の調製

実験 4 一 1 バチルスグロビスポルス C 9由来酵素の精製実験 3で得られた培養上清約 1 8 I を 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4 °C、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0 , 0 O 0 r p m、 3 0分間）して回収し 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 5 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 0 0 m I を得た。この粗酵素液は、 a—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を 8， 1 1 0単位と、 α—イソマル卜シル転移酵素活性を 2 4， 7 0 0 単位と、環状四糖生成活性を約 1 5， 6 0 0単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量 1 ， 0 0 0 m I ) に供した。この際、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素、 α -イソマル卜シル転移酵素及び環状四糖のいずれも、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A I 3』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を 1 M硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不純物を除き、アマシャム · フアルマシア ■ バイオテク株式会社製『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィー（ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェン卜、更に続いて、マル卜テ卜ラオース O m Mから Ί O O m Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α—イソマル卜シル転移酵素とは分離して溶出し、 α—イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジェン卜でその濃度が約 0 Μ付近に溶出し、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性は、マル卜テトラオースのリ二アグラジェン卜でその濃度が約 3 0 m M付近に溶出した。そこで、 α—イソマル卜シル転移酵素活性画分と α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマ卜グラフィ一のいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られた α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素画分と α—イソマル卜シル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性は 0； —イソマルトシル転移酵素と α 一イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。

以下、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。

実験 4 一 2 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の精製

実験 4 一 1 で得た α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素画分を 1 Μ硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ P H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『プチルー卜ョパール（ B u t y l — T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素は、『ブチル一トヨパール（ B u t y I — T o y o p e a r Ι ) 6 5 0 Μ』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 0 m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S 一 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表 1 に示す。

表 1

精製した α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を 7. 5 w / V %濃度ポリァクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった実験 4一 3 α—イソマル卜シル転移酵素の精製

実験 4 — 1 に記載のァフィ二ティークロマトグラフィ一によつて α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素画分と分離した α —イソマル卜シル転移酵素画分を、 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μ リン酸緩衝液（ ρ H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、東ソ一株式会社製『ブチル— トヨパール（ B u t y I - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素は、『プチルー卜ョパール（ B u t y I 一 T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリ二アグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α—イソマル卜シル転移酵素活性量、比活性、収率を表 2 に示す。表 2

実験 5 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素及び α—イソマル卜シル転移酵素の性質

実験 5 — 1 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の性質

実験 4 一 2 の方法で得た精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を S D S -ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 5 wノ V % ) に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ - ラッド · ラボラ卜リーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 4 0 ， 0 0 0 ± 2 0 ， 0 0 0ダル卜ンであつた。

精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を 2 w / V %ァンフ才ライン（アマシャム · フアルマシア · バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの ρ Ηを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p i 約 5 . 2 ± 0. 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 p Hの影響を活性測定の方法に準じて調ベた。なお、温度の影響については、 C a ^{2 +}非存在下と 1 m M存在下で測定した。これらの結果を図 5 (温度の影響）、図 6 ( p Hの影響）を示した。酵素の至適温度は、 p H 6 . 0 、 6 0分間反応で約 4 0 °C ( C a ^{2 +}非存在）、約 4 5 °C ( C a ^{2 +} 1 m M存在）、至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0乃至 6 . 5であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 0 m M酢酸緩衝液、 p H 6 . 0 ) を C a ^{2 +} 非存在下又は 1 m M存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 m M緩衝液中で 4 °C、 2 4時間保持した後、 p H を 6 . 0 に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図 7 (温度安定性）、図 8 ( p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 3 5 °Cまで（ C a ² +非存在）、約 4 0 °Cまで ( C a ^{2 +} 1 m M存在）で、 p H安定性は約 4 . 5乃至 9 . 0であつた。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 m Mの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 3 に示す。

表 3 金属イオン相対活性（％) 金属イオン相対活性（％) 無添加 100 H g 4

Zn^{2 +} 92 B a^{2 +} 65

Mgⁱ⁺ 100 S r^{2 +} 80

Ca^{2 +} 115 Pb^{2 +} 103

Co" 100 F e 98

Cu^{! +} 15 Fe^{3 +} 97

i^{2 +} 98 Mn^{2 +} 111

Al^{3 +} 99 EDTA 20 表 3の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ² +、 C u ² +、 E D T Aで著しく阻害され、 B a ^{2 +}、 S r ^{2 +}で阻害された。 C a ^{2 +} M n ² +で活性化されることも判明した。

本酵素の N末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサーモデル

4 7 3 A (アプライドバイ才システムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号 1 に示すアミノ酸配列チロシン—バリン —セリンーセリン一口イシン一グリシン一ァスパラギン一ロイシン —イソロイシンの N末端アミノ酸配列を有していることがわかった。実験 5 - 2 α—イソマル卜シル転移酵素の性質

実験 4 一 3 の方法で得た精製 a —イソマル卜シル転移酵素標品を

5 D S -ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 . 5 w / V % ) に供し、同時に泳動した分子量マ一カー（日本バイオ ·ラッド · ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 1 2， 0 0 0 ± 2 0， 0 0 0ダル卜ンであった。精製 _α —ィソマル卜シル転移酵素標品を 2 w / V %アンフォライン（アマシャム · フアルマシア ' バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの ρ Ηを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は ρ I 約 5. 5 ± 0. 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 P Hの影響を活性測定の方法に準じて調ベた。結果を図 9 (温度の影響）、図 1 0 ( p Hの影響）を示した。酵素の至適温度は、 p H 6. 0、 3 0分間反応で約 4 5 °C、至適 p H は、 3 5 °C、 3 0分間反応で約 6. 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 0 m M酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 m M緩衝液中で 4 °C、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0 に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図 1 1 (温度安定性）、図 1 2 ( p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 °Cまでで、 P H安定性は約 4. 0乃至 9. 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 m Mの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 4 に示す。

表 4

表 4の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ^{2 +}で著しく阻害され、 C u ^{2 +}で阻害された。また、 C a ² +で活性化されないことも、 E D T Aで阻害されないこともわかった。

本酵素の N末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサール 4 7 3 A』（アプライドバイ才システムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号 2 に示すアミノ酸配列のイソロイシンーァスパラギン酸一グリシン一バリン一チ口シン— ヒスチジン一ァラニン—プロリン一ァスパラギン一ダリシンの N末端アミノ酸配列を有していることがわかった。

実験 6 バチルスグロビスポルス C 1 1 からの α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の生産

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 w / V %、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 8 w/ v %、リン酸二カリウム 0. 1 w/ v %、リン酸一ナトリウム 1 2含水塩 0. 0 6 w/ v %、硫酸マグネシゥ厶 7水塩 0. 0 5 w V %、及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m l 容三角フラスコに 1 0 0 m l ずつ入れ、才ートクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 1 1 ( F E R M B P— 7 1 4 4 ) を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。

容量 3 0 I のフアーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 I 入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 v / v %を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 8. 0 に保ちつつ、 4 8時間通気撹拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約 0. 5 5単位/ m I で、 α—イソマル卜シル転移酵素活性は約 1 . 8単位 / m I で、環状四糖生成活性は約 1 . 1 単位/ m I であり、遠心分離 ( 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 1 の酵素活性を測定したところ、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は約 0. 5 1 単位ノ m I の活性（総活性約 9 、 1 8 0単位）で、 α—イソマル卜シル転移酵素は約 1 . 7単位/ m I の活性（総活性約 3 0， 4 0 0単位）で、環状四糖生成活性は約 1 . 1 単位/ m I (総活性約 1 9 ， 4 0 0単位）であった。

実験 7 バチルスグ口ビスポルス C 1 1 由来酵素の調製

実験 7 — 1 バチルスグロビスポルス C 1 1 由来酵素の精製実験 6で得られた培養上清約 1 8 I を 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4 °C、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収し 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 1 6 m I を得た。この粗酵素液は、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を 8 , 4 4 0単位、 a _イソマル卜シル転移酵素活性を約 2 8 ， 0 0 0 単位、環状四糖生成活性を約 1 7 , 7 0 0単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験 4 — 1 に記載の『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲルを用いたイオン交換クロマ卜グラフィ一に供した。 a —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性、 α —ィソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成いずれも、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を 1 M硫安を含む 1 0 m M リン酸緩衝液（ p H 7 . 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム - フアルマシア ' バイオテク株式会社製『セフアクリル（ S e P h a c r y I ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィー（ゲル量 5 0 0 m I ) に供した。酵素活性は、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェン卜、更に続いて、マルトテトラオース O m Mから 1 0 O m Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 a - イソマル卜シル転移酵素と α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、 α —イソマル卜シル転移酵素活性は硫安のリニアグラジェン卜でその濃度が約 0 . 3 Μ付近で溶出し、 _α —ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性は、マル卜テ卜ラオースのリニアグラジェン卜でその濃度が約 3 0 m M付近で溶出した。そこで、 α 一イソマル卜シル転移酵素活性画分と α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験 4 に記載の C 9株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られた α—イソマル卜シル転移酵素画分と α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性は α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素と α—イソマル卜シル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。

以下、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α—イソマル卜シル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。

実験 7 - 2 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の精製

α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素画分を 1 Μ硫安を含む 1

0 m Μリン酸緩衝液（ p H 7 . 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『プチルートヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマ卜グラフィー（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素は、『プチルー卜ョ / ール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲソレに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるな一イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表 5 に示す。

表 5

精製したな一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を 7 . 5 w / V %濃度ポリァクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった, 実験 7 — 3 α—イソマル卜シル転移酵素の精製

実験 7 — 1 に記載のァフィ二ティークロマ卜グラフィ一によつて α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素画分と分離した α—イソマル卜シル転移酵素画分を、 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μリン酸緩衝液（ p H 7 . 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソ —株式会社製『プチルートヨパール（ B u t y I 一 T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素は、『プチルー卜ョパール（ B u t y I 一 T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリ二アグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0 . 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を違心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α—イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表 6 に示す。表 6

実験 8 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の調製

実験 8 — Ί α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の性質

実験 7 - 2 の方法で得た精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 5 w/ V % ) に供し、同時に泳動した分子量マーカ一（日本バイ才 ■ ラッド ■ ラボラ卜リーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 3 7 , 0 0 0 ± 2 0 ， 0 0 0ダルトンであつた。

精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を 2 w / V %ァンフ才ライン (アマシャム · フアルマシア ' バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの P Hを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p i 約 5. 2 ± 0. 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 P Hの影響を活性測定の方法に準じて調ベた。なお、温度の影響については、 C a ² +非存在下と 1 m M存在下で測定した。これらの結果を図 Ί 3 (温度の影響）、図 1 4 ( p H の影響）を示した。酵素の至適温度は、 p H 6. 0、 6 0分間反応で約 4 5 °C (C a ^{2 +}非存在）、約 5 0 °C ( C a ^{2 +} 1 m M存在）、至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 0 m M酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を C a ^{2 +}非存在下又は 1 m M存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 m M緩衝液中で 4 °C、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図 1 5 (温度安定性）、図 1 6 ( p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 ⁿCまで（ C a ^{2 +}非存在）、約 4 5 °C まで（ C a ^{2 +} l m M存在）で、 p H安定性は約 5. 0乃至 1 0. 0 であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 I m Mの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 7 に示す。

表 7

表 7の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ² +、 C u ² +、 E D T Aで著しく阻害され、 B a ^{2 +}、 S r ^{2 +}で阻害された。 C a ^{2 +} M n ^{2 +}で活性化されることも判明した。

本酵素の N末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサ一モデル 4 7 3 A』（アプライドバイ才システムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号 1 に示すアミノ酸配列 N末端チロシン一 /、リンーセリン一セリン一口イシン一グリシンーァスパラギン —ロイシン一イソロイシンの N末端アミノ酸配列を有していることがわかった。

この N末端アミノ酸配列結果を実験 5 — 1 のバチルス . グロビシポルス C 9 由来の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の Ν末端配列と比較すると同一であることが判明し、 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の共通する Ν末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号 Ί に示すアミノ酸配列チロシン—バリンーセリンーセリン一口イシン一グリシン—ァスノラギン一口イシン一イソロイシンの Ν末端アミノ酸配列であることが判明した。

実験 8 — 2 α —イソマル卜シル転移酵素の性質

実験 7 — 3の方法で得た精製 _α —イソマル卜シル転移酵素標品を S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 . 5 w / V % ) に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイ才■ラッド · ラボラ卜リーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 0 2 ， 0 0 0 ± 2 0， 0 0 0ダルトンであった。精製 α —イソマル卜シル転移酵素標品を 2 wノ V %アンフォライン（アマシャム · フアルマシア ' バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの ρ Ηを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は ρ I 約 5 . 6 ± 0 . 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 ρ Ηの影響を活性測定の方法に準じて調ベた。結果を図 1 7 (温度の影響）、図 1 8 ( ρ Ηの影響）を示した。酵素の至適温度は、 Ρ Η 6. 0 、 3 0分間反応で約 5 0 °C、至適 ρ Η は、 3 5 °C、 3 0分間反応で約 5 . 5乃至 6 . 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 O m M酢酸緩衝液、 p H 6 . 0 ) を各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 m M緩衝液中で 4 °C、 2 4時間保持した後、 p Hを 6 . 0 に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図 1 9 (温度安定性）、図 2 0 ( p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 °Cまでで、 p H安定性は約 4 . 5乃至 9 . 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 m Mの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 8 に示す。

表 8 金属イオン相対活性（％) 金属イオン相対活性（％) 無添加 100 H s 2

Ζη^{ί +} 83 B a^{2 +} 90

Mg^{s +} 91 S r^{2 +} 93

Ca^!+ 91 Pb^{i +} 74

Co^{! +} 89 F e 104

Cu^2t 56 Fe^{3 +} . 88

N i ^{! +} 89 Mn^{2 +} 93

A 89 EDTA 98 表 8の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ² +で著しく阻害され、 C u ^{2 +}で阻害された。また、 C a ^{2 +}で活性化されないことも、 E D T Aで阻害されないこともわかった。

本酵素の N末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサーモデル 4 7 3 A』（アプライドバイ才システムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号 3 に示すアミノ酸配列のイソ口イシン—ァスパラギン酸一グリシン一バリンーチ口シン一ヒスチジン一ァラニン一プロリンーチ口シン—ダリシンの N末端アミノ酸配列を有していることがわかった。この N末端アミノ酸配列結果を実験 5 — 2のバチルスグロビスポルス C 9 由来の α —イソマル卜シル転移酵素の Ν末端配列と比較して、 α —イソマルトシル転移酵素の共通する Ν末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号 4 に示すアミノ酸配列のイソロイシンーァスパラギン酸ーグリシン—バリン―チ口シン— ヒスチジン—ァラニン一プロリンの Ν末端アミノ酸配列であることが判明した。

実験 9 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列実験 9 一 1 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の内部部分ァミノ酸配列実験 7 — 2の方法で得られた精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品の一部を 1 O m M 卜リス—塩酸緩衝液（ p H 9. 0 ) に対して、透析した後、同緩衝液で約 1 m g Z m I の濃度になるように希釈した。この試料液（ 1 m I ) に 1 0 gの卜リブシン（和光純薬株式会社販売）を加え、 3 0 °C、 2 2時間反応させることによリぺプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相 H P L Cを行なつた。マイクロボンダパック C 1 8カラム（直径 2 . I m m X長さ 1 5 0 m m, ウォーターズ社製）を用い、流速 0. Θ ΓΠ Ι Ζ分、室温で 0. 1 % トリフルォロ酢酸一 8 %ァセ卜二卜リル溶液から 0. 1 % 卜リフル才ロ酢酸一 4 0 %ァセトニ卜リル溶液の 1 2 0分間のリニアグラジェン卜の条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長 2 1 0 n mの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した 3ペプチド [ P 6 4 (保持時間約 6 4分）、 P 8 8 (保持時間約 8 8分）、 P 9 9 (保持時間約 9 9分）] を分取し、それぞれを真空乾燥した後、 2 0 0 I の 0 . 1 % トリフル才ロ酢酸一 5 0 % ァセ卜二卜リル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシ一ケンサ一に供し、それぞれ 8残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号 5乃至 7 に示すアミノ酸配列が得られた < 得られた内部部分ァミノ酸配列を表 9 に示す。

表 9 ぺプチド名内部部分アミノ酸配列

P 64 ァスパラギン酸ーァラニンーセリンーァラニン一ァスハラギン一ハ'リンースレオニンースレオニン

P 88 トリプトファン一セリン一口イシンーグリシン一フヱニァラニン一メチォニン一ァスパラギン一フエ二ルァラニン

P 99 ァスパラギンーチロシンースレオニンーァスパラギン酸ーァラニン一トリプトファンーメチォニンーフニノレアラニン実験 9 一 2 a—イソマル卜シル転移酵素の内部部分アミノ酸配列実験 7 — 3 の方法で得られた精製一イソマル卜シル転移酵素標品の一部を 1 O m M 卜リス一塩酸緩衝液（ p H 9. 0 ) に対して、透祈した後、同緩衝液で約 1 m g / m I の濃度になるように希釈した。この試料液（ 1 m I ) に 1 0 At gのリジルエンドぺプチダ一ゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、 3 0 °C、 2 2時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相 H P L Cを行なった。マイクロボンダパック C 1 8カラム（直径 2. I m m X長さ 1 5 0 m m、ウォーターズ社製）を用い、流速 0. 9 m l /分、室温で 0 . 1 % トリフル才ロ酢酸一 8 %ァセ卜二卜リル溶液から 0 . 1 % トリフル才ロ酢酸一 4 0 %ァセ卜二卜リル溶液の 1 2 0分間のリニアグラジェン卜の条件で行なった。カラムから溶出したぺプチドは、波長 2 1 0 n mの吸光度を測定することにより検出した。他のぺプチドとよく分離した 3ペプチド [ P 2 2 (保持時間約 2 2分）、 P 6 3 (保持時間約 6 3分）、 P 7 1 (保持時間約 7 1 分）] を分取し、それぞれを真空乾燥した後、 2 0 0 I の 0. 1 % トリフル才ロ酢酸一 5 0 %ァセ卜二卜リル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロティンシーケンサーに供し、それぞれ 8残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号 8乃至 1 0 に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表 1 0に示す。

表 1 0 ぺプチド名内部部分ァミノ酸配列

Ρ 22 グリシンーァスパラギン一グルタミン酸ーメチォニン—アルギニンーァスパラギン一グゾレ夕ミンーチ口シン

Ρ63 イソロイシンースレオニン一スレオニン一トリプトファン一プロリンーイソ口イシン—グルタミン酸—セリン

Ρ71 リプトフアンーァラニン一フヱニルァラニン—グリシン一口イシン一トリプトファンーメチォニン一セリン実験 1 0 各種糖質への作用

各種糖質を用いて、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マル卜トリオース、マルトテトラオース、マル卜ペン夕オース、マル卜へキサオース、マルトヘプ夕オース、イソマルトース、イソマル卜トリオース、パノ一ス、イソパノース、 α， α— 卜レハロース、コージビオース、ニゲロース、ネ才卜レハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチ卜ール、マル卜卜リイトール、ラク卜ース、スクロース、エルロース、セラギノース、マル卜シルダルコシド、イソマル卜シルグルコシドを含む溶液を調製した。

これらの溶液に、実験 4一 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 9 由来の精製 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品、又は実験 7 — 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を基質固形物 1 グラム当たりそれぞれ 2単位ずつ加え、基質濃度を 2 w / V %になるように調整し、これを 3 0 °C、 p H 6 . 0で 2 4時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験 1 記載の T L C法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表 1 1 に示す。

表 1 1

酵素作用酵素作用基質 C11酵素其質 C9酵素 C11酵素マルト一ス + + ニゲロース + + マルトトリオース ++ ++ ネオトレノゝロース + + マルトテ卜ラオ一ス +++ +++ セロビ才ース

マルトペンタオ一ス +++ +++ ゲンチビオース

マルトぺキサ才ース +++ +++ マルチトール

マルトへプタオス +++ +++ マルトトリイトール + + イソマルト一スラク卜ース

イソマルトトリオ- -ススクロース

ハ。ノースエルロース + + イソ、°ノース ++ ++ セラキソース

or, α -トレハロースマルトシルク、、ルコシド ++ ++ コージビ才ース + + ィソマノレ卜シ

ノレク'、ルコシド

注)酵素反応前後で、「一Jは、変化無しを示し、

Γ+Jは、基質のスポットが僅かに減少し、他の生成物が認められるを示し、 Γ++」は、基質のスポットがかなり減少し、他の生成物が認められるを示し、「+++」は、基質のスポッ卜がほとんど消失し、他の生成物が認められるを示す。表 1 1 の結果から明らかなように、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度 3以上で非還元末端にマル卜ース構造を有する糖質によく作用することが判明した。また、グルコース重合度が 2の糖質では、マル卜ース、コ一ジビオース、ニゲロース、ネオ卜レハロース、マルト卜リイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。

実験 1 1 マルト才リゴ糖からの生成物

実験 Ί 1 一 1 生成物の調製

濃度 1 %のマルトース、マル卜トリオース、マル卜テ卜ラオース、マル卜ペン夕オースのそれぞれ水溶液に実験 7 — 2 の方法で得た精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物 1 ダラ厶当たり 2単位（マルトース及びマル卜トリオース）、 0 . 2単位（マル卜テトラオース）、 0. 1 単位（マル卜ペン夕オース）加え、 3 5 °C、 P H 6. 0で 8時間作用させ、 1 0 0 °Cで 1 0分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、 H P L C法を用いて測定した。 H P L Cは、『丫 M C P a c k O D S — A Q 3 0 3』カラム（株式会社ワイ ' ェ厶 ' シ一製造）を用いカラム温度 4 0 °C、流速 0. 5 m I /m i n水の条件で行い、検出は示差屈折計『 R I - 8 0 1 2』

(東ソ一株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表 1 2 に示す。表 1 2

反応で生成した糖質の種類 *^， >しレへ⁰、 ― マ

マノレ k卜一一 Λ マノレ卜卜リースノレ卜ァ卜フ；一マノレ卜へノタ一人人マ

グルコース o . 0 Π

U · 丄 1 u · u

マルトース / ο . U 1 ( . S U . o U . U マルトトリオ—ス η υ - ο ¾ λ o ς . 1 1

1 q マルトテトラオース π υ . π υ 1 ft 1

Ό * X

マルトペンタオース η η η η <¾ 5 4 4 マル卜へキサオース 0. 0 0. 0 0. 0 4. 6 イソマルト—ス 0. 5 0. 0 0. 0 0. 0 グノレコシノレマノレトース 8. 2 1. 2 0. 0 0， 0 グルコシルマノレトトリオース 2. 4 3 1. 5 6. 8 0. 0

X 0. 0 2. 1 30. 0 1 1. 4

Y 0. 0 0. 0 1. 4 26. 8

Z 0. 0 0. 0 0. 0 1. 7 その他 0. 6 0. 1 0. 2 0. 0 表中の

グルコシノレマルトースは、イソマルトシルダルコ一ス（別名、 6²— Ο—α—ダルコシルマノレ卜ース、ハ。ノース）で、グルコシルマルトトリオースは、 _α fソマルトシルグノレコス（別名、 6 —0—な—グノレコシルマル卜トリオース）で、

Xは、実験 1 1 -2で記載の α—イソマルトシルグルコトリオ-ス（別名、 6 一 0- a—グルコシルマノレトテ卜ラオース）で、 Yは、実験 1 1一 2で記載の c一イソマル卜シルグルコテトラオース（別名、 6 — 0—α—ダルコシルマルトペンタオース)で、 Ζは、未同定のである。

表 1 2の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マル卜一スからは、主にグルコースと α —イソマル卜シルグルコース（別名、 6 ²— 0 — α—ダルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マル卜卜リオースからは、主にマル卜一スと α —イソマル卜シルグルコース（別名、 6 ³— 0— α —ダルコシルマル卜卜リオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マル卜テトラオース、 α —イソマルトシルグルコース (別名、 6 ²— 0— α —ダルコシルマル卜一ス、パノース）、生成物 Xが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマル卜トリオースと生成物 Xとが生成し、少量ながらマルトース、マル卜ペンタ才一ス、 α —イソマル卜シルダルコ一ス（別名、 6 ³ — Ο— α —ダルコシルマル卜トリオース）、生成物 Υが生成することが判明した。基質マル卜ペンタオースからは、主にマル卜テ卜ラオースと生成物 Υとが生成し、少量ながらマル卜トリオース、マル卜へキサオース、生成物 X、生成物 Ζが生成することが判明した。基質マル卜テ卜ラオースからの主生成物である生成物 X、並びに基質マルトペン夕オースからの主生成物である生成物 Υの単離■精製を行った。分取用 H P L Cカラム『丫 M C — P a c k O D S — A R 3 5 5 - 1 5 S - 1 5 1 2 A』（株式会社ワイェ厶シィ製）を用いて精製し、上記のマル卜テ卜ラオースからの反応物、マル卜ペン夕才 —スからの反応物それぞれから、純度 9 9 . 9 %以上の生成物 X標品を固形物収率約 8 . 3 %で、純度 9 9 . 9 %以上の生成物 Yを固形物収率約 1 1 . 5 %で単離した。

実験 1 1 一 2 生成物の構造解析

実験 1 1 一 1 の方法で得た生成物 X標品及び生成物 Y標品を用いて、常法にしたがってメチル化分析と N M R分析を行なった。メチル化分析の結果は表 1 3 にまとめた。 N M R分析の結果については、 ¹ H — N M Rスペクトルを図 2 1 (生成物 X )、図 2 2 (生成物 Y ) に、 1³ C — N M Rスペクトル及び帰属を図 2 3 (生成物 X )、図 2 4 (生成物 Y )、表 1 4 にまとめた。

表 1 3

これらの結果から、 a —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素によるマル卜テトラオースからの生成物 Xは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にグルコース基が _α結合した 5糖で、構造式 1 で表わされる α —イソマル卜シルマル卜トリオース（別名、 6 ⁴ 一 Ο — α —ダルコシルマル卜テトラオース）であることが判明した。構造式 1 ：

α - D - G I c p — ( 1 → 6 ) - α - D - G I c p - ( 1 → 4 ) - a - D - G I c p — ( 1 → 4 ) - a - D - G I c p — ( 1 → 4 ) — D — G I c p

また、マル卜ペン夕オースからの生成物 Yは、マル卜ペン夕オースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にダルコシル基が _a結合した 6糖で、構造式 2で表わされる a —イソマル卜シルマル卜テ卜ラオ一ス（別名、 6 ^s — O — a —ダルコシルマル卜ペン夕オース）であることが判明した。

構造式 2 ：

a - D - G I c p - ( 1 → 6 ) - a - D - G I c p — ( 1 → 4 ) — a 一 D — G I c p - ( 1 → 4 ) - a - D - G I c p - ( 1 → 4 ) — a — D - G I c p - ( 1 → 4 ) — D - G l c p

表 1 4

以上のことから、 a —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素のマルト才リゴ糖に対する作用は以下のように判断された。

( 1 ) 本酵素は、基質として、 α — 1 , 4結合からなるグルコース重合度が 2以上のマル卜オリゴ糖に作用し、その非還元性末端のダルコシル残基を他の分子の非還元性末端のダルコシル残基の 6位に転移する作用を有する分子間の 6 —ダルコシル転移を触媒して、非還元末端に 6 _ 0— α —ダルコシル基を有するグルコース重合度が 1 増加した α —イソマル卜シルダルコ糖質（別名、 6 — 0— α —ダルコシルマル卜才リゴ糖）と、グルコース重合度が 1 減じたマルト才リゴ糖とを生成する。

( 2 ) 本酵素は、 4 —ダルコシル転移も僅かに触媒し、マル卜オリゴ糖から、グルコース重合度が 1 増加したマル卜才リゴ糖と、ダルコース重合度が 1 減じたマル卜才リゴ糖とを僅かに生成する。

実験 1 2 還元力生成試験

ο: —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度 1 %のマル卜テ卜ラオース水溶液に実験 4 — 2 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 9 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及び実験 7 — 2 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を、基質固形物 1 グラム当たり 0 . 2 5単位加え、 3 5 °C、 p H 6 . 0で作用させ、その反応液の一部を絰時的に採り、 1 0 0 °Cで 1 0分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギー · ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアン卜ロン硫酸法で測定し、還元力生成率 ( % ) は以下の計算式を用いて算出した。

数 1 計算式

、

反応後の還元糖量反応前の還元糖量

還元力生成率（％) 100 反応後の全糖量 J 反応前の全糖量」結果を表 1 5 に示す。

表 1 5

表 Ί 5の結果から明らかなように、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は、マル卜テ卜ラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。

実験 1 3 デキス卜ラン生成試験

α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス · バイオテクノロジー · アンド * ノィ才ケミス卜リー（ B i o s c i e n c e B i o t e c h n o I o g y n d B i o c h e m i s t r y )』、第

5 6巻、 1 6 9乃至 1 7 3 ( 1 9 9 2年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度 1 %のマル卜テトラオース水溶液に実験 4 — 2の方法で得た C 9株由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素及び実験 7 — 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 株由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を、基質固形物 1 グラム当たり 0 . 2 5単位加え、 3 5 °C、 p H 6 . 0で 4時間及び 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の 5 0 IX I を遠心管に入れ、それに 3倍量のエタノールを加え十分に撹拌した後、 4 °Cで 3 0分間静置した。次いで、遠心分離 ( 1 5 , 0 0 0 r p m、 5分間）し、その上清を除去した後、 1 m l の 7 5 %のエタノールを加え撹拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、 1 m I の脱イオン水を加え十分に撹拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフ： i:ノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理し失活させたバチルスグロビスポルス C 9 由来又はバチルスグロビスポルス C 1 t 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキス卜ラン生成量は以下の計算式で計算した。

計算式：

デキストラン生成量（m g Z m l ) = [ (試験の全糖量）一（ブランクの全糖量）] X 2 0

結果を表 1 6 に示す。

表 1 6 反応時間生成デキス卜ラン（ra g/m l )

(時間) C 9酵素 C 1 1酵素

4 0 . 0 0. 0

8 0 . 0 0. 0 表 Ί 6の結果から明らかなように、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素をマル卜テ卜ラオースに作用させてもデキス卜ランを生成しないこと、つまリ、当該 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素はデキストラン生成作用を実質的に有さないか、その生成量は検出限界以下であることが判明した。

実験 1 4 転移受容体特異性

各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。 D —グルコース、 D—キシロース、 L ーキシロース、 D -力' ラク卜一ス、 D —フラク卜ース、 D —マンノース、 D —ァラビノース , D —フコース、 L 一ソルボース、 L—ラムノース、メチル一 α—グルコシド、メチル— 3 —ダルコシド、 Ν —ァセチルーダルコサミン、ソルビトール、， a - 卜レノヽロース、イソマル卜ース、イソマル卜卜リオース、セロビ才一ス、ゲンチビオース、マルチトール、ラク卜一ス、スクロース、 α —サイクロデキス卜リン、 β 一サイクロデキス卜リン、アーサイクロデキス卜リンの溶液を調製した。

これらの受容体溶液（濃度 1 . 6 % ) に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』（濃度 4 % ) を加え、実験 4 一 2 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 9 由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品又は実験 7 — 2 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物 1 グラム当たりそれぞれ 1 単位ずつ加え、これを 3 0 °C、 p H 6 . 0で 2 4時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖又は二糖の場合はガスクロマ卜グラフィ一法（以下、 Γ G L C法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合は H P L C法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、 G L Cにおいて、 G L C装置は『 G C — 1 6 A J (株式会社島津製作所製）、カラムはジー · エル · サイエンス株式会社製『 2 %シリコン 0 V — 1 7ノクロモゾルブ W』を充填したステンレス製カラム（ 3 m m ci) X 2 m)、キャリアーガスは窒素ガスを流量 4 0 m I ノ分で Ί 6 0 °Cから 3 2 0 °Cまで 7 . 5 °C /分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン化検出器で分析した。 H P L Cでは、 H P L Cの装置は東ソー株式会社製『 C C P D』、カラムは『O D S — A Q— 3 0 3』（株式会社ワイェムシィ一社製）、溶離液は水を流速 0 . 5 m I /分で、検出は示差屈折計で分析した。結果を表 1 7 に示す。表 1 7

1 □ s 厂

J ΓΧ. 1

R -- 転移生成物糖質転移生成物暫

1 1

C 9酵素 C11酵素

A T □ 94 3

D -グルコース + + ソルビトール一

1 m

ゝ

ノ >i Mm D—キシロース + + + + or , a-卜レハロース + + + +

C V □ Lーキシロース + + イソマルトース +十 + +

1 m Φ

？ ί S D—ガラク卜ース + + イソマルトトリオース + + +十

<— ^- σ' D—フラクトース + + セロビオース + +

d 1 Λ 1 fV

V： R C" D—マンノースゲンチビオース + + + + σ Λ 1 r\ D—ァラビノースマルチトール +十 + +

1 - tTttm '.

丁 V η D—フコース + + ラクトース十十 +十

1 u Q L—ソルボース + + スクロース +十

U 丁ヾ' Ρ

n 1 Lーラ厶ノース

1 1 なーシクロテ 'キストリン

Λ ¾ メチルー α—グレコース + + + + —シクロテ 'キストリン

： . H

o VII メチルーーグ1 /コース + + + + γ—シクロデキストリン

1 V" Ν—ァセチルグルコサミン + +

丁丁 1 (¾■ τ

to 表中の

1 丁 V

1 「-」は、受容体への糖転移物が検出されなかったを示し、

丁 n ,

「土」は、受容体への糖転移物が検出されたが，その生成量が 1 %未満であったを示し、

1 1

u Ό 「+」は、受容体への糖転移物が 1以上 1 0 96未満であったを示し、

ヾ' 1 識「 + +」は、受容体への糖転移物が 1 0 96以上であったを示す。

D \

—フコース、 L一ソルボース及び N—ァセチルダルコサミンに転移し. 更には、 D—ァラビノースにも転移することが判明した。

以上に述べた a —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている.6 —ダルコシル転移作用を有する酵素、

『バイオサイエンス ' バイオテクノロジ一 · アンド ' バイオケミス卜 U— ( B i o s c i e n c e B i o t e c h n o l o g y a n d B i o c h e m i s t r y )Jl、第 5 6巻、第 1 6 9乃至 1 7 3頁（

9 9 2年）に記載のデキス卜リン ' デキス卜ラナーゼ及び『日本農芸化学会誌』、第 3 7巻、第 6 6 8乃至 6 7 2頁（ Ί 9 6 3年）に記載のトランスダルコシダーゼと比較した。その結果を表 1 8 にまとめた表 1 8

表 1 8から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、既知のデキス卜リン · デキストラナーゼや卜ランスダルコシダ一ゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。実験 1 5 環状四糖の生成

各種糖質を用いて、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素及び α 一イソマル卜シル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マル卜一ス、マルトトリオース、マル卜テ卜ラオース、マル卜ペン夕オース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製）又はグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。

これらの水溶液（濃度 0 . 5 % ) に、実験 7 — 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を固形物 1 グラム当たり 1 単位と、実験 7 — 3の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマル卜シル転移酵素標品を固形物 1 グラム当り 1 0単位とを加え、これらを 3 0 °C、 p H 6 . 0で作用させた。作用条件は、以下の 4つの系で行った。

( 1 ) α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、 α —イソマルトシル転移酵素を 2 4 時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 2 ) α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素とを同時に 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 3 ) α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素のみを 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( ) α —イソマル卜シル転移酵素のみを 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験 1 と同様の α—ダルコシダーゼ，ダルコアミラーゼ処理し、残存する還元性才リゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した < それらの結果を表 1 9 に示す。

表 1 9 環状四糖生成量（％)

or-イソマル卜シルグルコ -イソマルトシルグルコ α-イソマルト α-イソマルト基質 J| し"！

シル転移酵素 -イソマルトシル転移 -イソマルトシル転移糖質生成酵素

酵素を作用酵素とを同時作用のみの作用のみの作用 I^s Λ 4. 0 4. 2 0. 0 0. 0 マルトトリオース 1 0. 2 1 2. 4 0. 0 0. 0 トフ 1 1. 3 21. 5 0. 0 0. 0 マルトペン夕才ース 1 0. 5 37. 8 0. 0 0. 0 アミロース 3. 5 31. 6 0. 0 0. 0 可溶性澱粉 5. 1 38. 2 0. 0 0. 0 澱粉部分分解物 6. 8 63. 7 0. 0 0. 0 グリコーゲン 10. 2 86. 9 0. 0 0. 0 表 1 9の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、 α — イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素のみの作用及び α イソマル卜シル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、 α イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α イソマルトシル転移酵素を同時併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、 α イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を作用させた後に α—ィソマル卜シル転移酵素を作用させた場合には、約 1 1 %以下と比較的に低いのに対して、 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素と《—ィソマル卜シル転移酵素とを同時に作用させると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約 8 7 %に増加し澱粉部分分解物では約 6 4 %に増加することが判明した。

この α イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α イソマル卜シル転移酵素との同時併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。

( 1 ) α イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などの α— 1 , 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他の α — 1 ， 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基の 6位水酸基に分子間転移させ、非還元末端に α — イソマル卜シル基を有する α — 1 ， 4グルカン鎖が生成する。

( 2 ) α—イソマル卜シル転移酵素は、非還元末端にイソマル卜シル基を有する α — 1 ， 4グルカン鎖に作用し、そのイソマル卜シル基を、他の非還元末端にイソマル卜シル基を有する α — 1 ， 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基の 3位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマル卜シルー 1 ， 3 —イソマル卜シル基を有する α — 1 ， 4グルカン鎖が生成する。

( 3 ) 続いて、 α—イソマル卜シル転移酵素は、その非還元末端にイソマル卜シルー 1 ， 3—イソマルトシル基を有する α — 1 , 4ダルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシルー 1 ， 3 — イソマル卜シル基を α — 1 ， 4グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。

( 4 ) 切り離された α — 1 ， 4グルカン鎖は、再度、（ 1 ) から（ 3 ) の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。な—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマル卜シル転移酵素との同時併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。

実験 1 6 澱粉液化程度の影響

とうもろこし澱粉を濃度 1 5 %澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを 0 . 1 %加えて ρ Η 6 . 0 に調整し、 a—アミラーゼ（商品名『夕一マミール 6 0 L』（ノボ社製）を澱粉 1 グラム当り 0 . 2乃至 2 . 0 %を加え、 9 5 °Cで 1 0分間反応させ、次いで、 1 2 0 °Cで 2 0分間才一卜クレープし、約 3 5 °Cに急冷して、 D E 3 . 2乃至 2 0 . 5 の液化溶液を得、これに、実験 7 — 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を固形物 1 グラム当たり 2単位と、実験 7 — 3の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシル転移酵素標品を固形物 1 グラム当り 2 0単位とを加え、 3 5 °Cで 2 4時間反応させた。 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験 1 と同様に α—ダルコシダーゼ及びダルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性才リゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 2 0 に示す。

表 2 0

表 2 0の結果から明らかなように、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α —イソマル卜シル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、 D Ε が低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、 D Εが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約 2 0以下、望ましくは、 D Ε約 1 2以下、更に望ましくは、 D Ε約 5以下が適していることが判明した。

実験 Ί 7 澱粉部分分解物濃度の影響澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』（ D E約 2乃至 5 ) の最終濃度 0 . 5乃至 4 0 %の水溶液を調製し、それぞれに、実験 7 —

2 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α — イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を固形物 1 グラム当たり Ί 単位と、実験 7 — 3の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシル転移酵素標品を固形物 1 グラム当り

1 0単位加え、両酵素を同時併用して 3 0 °C、 p H 6 . 0で 4 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験 1 と同様に α—ダルコシダ一ゼ及びダルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性才リゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 1 8 に示す。

表 2 1

表 2 1 の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が 0 . 5 %の低濃度では、環状四糖の生成量は約 6 4 %であるのに対し、濃度 4 0 %の高濃度では、環状四糖の生成量は約 4 0 %と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。

実験 1 8 シクロデキス卜リングルカノ卜ランスフェラーゼ添加効果澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』水溶液（濃度 1 5 % ) を調製し、実験 7 — 2の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を固形物 1 グラム当たり 1 単位と、実験 7 — 3の方法で得た C 1 1 株由来の精製 _α—イソマル卜シル転移酵素標品を固形物 1 グラム当り 1 0単位と、バチルス · ステアロザーモフィルス由来シクロデキストリングルカノ卜ランスフェラーゼ（ C G T a s e ) を固形物 1 グラム当り 0乃至 0 . 5単位加え、両酵素を同時併用して 3 0 °C、 p H 6 . 0で 4 8 時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた, 続いて、実験 1 と同様に α—ダルコシダーゼ及びダルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性才リゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 2 2 に示す。

表 2 2

表 2 2の結果から明らかなように、 C G T a s eを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。

実験 1 9 環状四糖の調製

トウモロコシ由来フィ卜グリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約 1 0 0 を濃度 4 w / v %、 p H 6 . 0、温度 3 0 °Cに調整した後、実験 7 — 2の方法で得た精製 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素標品を固形物 1 グラム当たり 1 単位と、実験 7 — 3の方法で得た精製な —イソマル卜シル転移酵素標品を固形物 1 グラム当リ 1 0単位加え、 4 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、 H P L Cで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約 8 4 %であった。この反応液を p H 5 . 0、温度 4 5 °Cに調整した後、実験 1 と同様に α —ダルコシダーゼ及びダルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性才リゴ糖などを加水分解し、さらに、水酸化ナトリウムで ρ Ηを 5 . 8 に調整し温度 9 0 °Cで 1 時間保持して、酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この瀘液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約 1 6 %まで濃縮した後、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約 3， 7 0 0 _gを含む糖液約 6 . 2 k gを得た。

得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂『アンバーライ卜 C R - 1 3 1 0 ( N a型）』を充填したカラム（ゲル量約 2 2 5 I ) に供し、カラム温度 6 0 °Cで流速約 4 5 I / hの条件でクロマ卜分離を行なった。溶出液の糖組成を実験 1 に記載の H P L C法でモニターし、環状四糖の純度が 9 8 %以上の画分を回収し、常法にしたがって脱塩、脱色、濾過、濃縮したところ、固形分約 2， 5 0 0 _gを含む糖液約 7 . 5 k gを得た。得られた糖液の糖組成を H P L C法で測定したところ、環状四糖の純度は約 9 9 . 5 %であった。

実験 2 0 環状四糖の水溶液からの結晶化実験 1 9 の方法で得られた純度約 9 8 %以上の環状四糖画分をェバポレーターで固形物濃度約 5 0 %に濃縮した後、この濃縮糖液約 5 k gを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約 2 0時間で温度を 6 5 °Cから 2 0 °Cまで降下させることにより晶析させたところ、白色の結晶状粉末が得られた。その顕微鏡写真の 1 例を図 2 5 に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し結晶状物を湿重量として 1 ， 3 6 0 gを回収した。さらに、 6 0 °Cで 3時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を 1 ， 1 7 0 g得た。得られた結晶粉末の糖組成を H P L C法で測定したところ、環状四糖の純度は 9 9 . 9 %以上と極めて高純度であった。

この環状四糖の結晶状粉末を粉末 X線回折法で解析したところ、図 2 6 に示すように、主な回折角（ 2 0 ) として 1 0 . 1 ° 、 1 5 . 2 ° 、 2 0 . 3 ° 及び 2 5 . 5 ° を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール · フィッシャー法で測定したところ、水分は 1 3 . 0 %であることがわかり、環状四糖 1 分子当たり 5乃至 6分子の水を含む結晶であることが判明した。

さらに、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、図 2 7 に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度 1 5 0 °Cまでの上昇で 4乃至 5分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、温度 2 5 0 °C付近で 1 分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度 2 8 0 °C付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、 5乃至 6含水結晶環状四糖は、常圧において、温度を 1 5 0 °Cまで上昇させることにより結晶分子当たり 4乃至 5分子の水が離脱して 1 分子の水を含む結晶になり、さらに温度 2 5 0 °Cまでに 1 分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。実験 2 1 1 含水結晶環状四糖への変換

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末をガラス容器に入れ、予め温度 1 4 0 °Cに保温したオイルバス中にそのガラス容器を 3 0分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したところ、熱処理前の 5乃至 6含水結晶の粉末 X線回折とは全く異なり、図 2 8 に示すように、主な回折角（ 2 0 ) として、 8 . 3 ° 、 1 6 . 6 ° 、 Ί 7 . 0 ° 及び Ί 8 . 2 ° を特徴とする回折スぺクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール · フイツシヤー法で測定したところ、水分が約 2 . 7 %であることがわかり、環状四糖 Ί 分子当たり 1 分子の水を含むことが判明した。さらに、この結晶粉末を熱重量測定したところ、図 2 9 に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度 2 7 0 °C付近で 1 分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度 2 9 0 °C付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、この環状四糖結晶状物は 1 含水結晶であることが判明した。

実験 2 2 無水結晶への変換

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末を温度 4 0 °C乃至 1 2 0 °Cでそれぞれ 1 6時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール，フィッシヤー法で測定したところ、真空乾燥温度 4 0 °Cの場合は水分が約 4 . 2 %であり、真空乾燥温度 1 2 0 °Cの場合は水分が約 0. 2 %で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末 X線回折法で解析したところ、真空乾燥前の 5乃至 6含水結晶の粉末 X線回折及び 1 含水結晶のものとは全く異なり、図 3 0 (真空乾燥温度 4 0 °C)、図 3 1 (真空乾燥温度 1 2 0 °C ) に示すように、主な回折角（ 2 0 ) として、 1 0 . 8 ° 、 Ί 4 . 7 ° 、 1 5 . 0 ° 、 1 5 . 7 ° 及び 2 1 . 5 ° を特徴とする回折スぺクトルが得られた。両回折スぺク卜ル間でのピーク強度の強弱は認められるものの、基本的にピークの回折角度は同一で、結晶学的に同一無水結晶と推察された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の 5乃至 6含水結晶環状四糖のもの及び 1 含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥 4 0 °Cの場合の水分を約 4 . 2 %含む環状四糖粉末は、その水分を含む無水非晶質環状四糖と、無水結晶環状四糖とが混在する粉末と推察された。以上のことから、 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末を真空乾燥することにより、 5乃至 6含水結晶は水分子を失い、無水非晶質と無水結晶に変換することがわかった。なお、水分 0 . 2 %の無水結晶環状四糖粉末について、実験 2 0 と同様に熱重量分析したところ、図 3 2 に示すように、温度 2 7 0 °C付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。

実験 2 3 環状四糖の水に対する飽和濃度

温度 1 0乃至 9 0 °Cでの水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水 1 0 m I を入れ、それに実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度 1 0乃至 9 0 °Cで保温しながら 2 日間撹拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状四糖を除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ、各温度での飽和濃度を求めた。結果を表 2 3 に示す。

表 2 3 淵度 (°C) 飽禾 Π濃度 (%)

1丄 πリ t リ♦

30

50 42. 6

70 53. 0

90 70. 5 実験 2 4 熱安定性

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を水に溶解し濃度 1 0 w/ v %の環状四糖水溶液を調製し、その溶液 8 m I をガラス製試験管に採り、密封した後、〗 2 0 °Cで 3 0乃至 9 0分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、 H P L C法による純度測定を行った。着色度は、 4 8 0 n mにおける 1 c mセルでの吸光度により評価した。結果は表 2 4 に示す。

表 2 4

表 2 4の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は 1 2 0 °Cの高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。実験 2 5 p H安定性

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を各種の緩衝液（ 2 0 m M ) に溶解し、環状四糖を濃度 4 w/ v %、 p Hを 2乃至 1 0 に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液 8 m I をガラス製試験管に採り、密封した後、 1 0 0 °Cで 2 4時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、 H P L C法による純度測定を行った。着色度は、 4 8 0 n mにおける 1 c mセルでの吸光度により評価した。結果は表 2 5に示す。

表 2 5

表 2 5の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は 1 2 0 °Cの高温で 2 4時間加熱しても、 p H 2乃至 1 0の広範囲で着色はなく、 p H 2 において糖組成の純度は僅かに低下するものの、 p H 3乃至 1 0 の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広い p H範囲、換言すれば、 p H 3乃至 5の酸性側、 p H 6乃至 8の中性側、 p H 9 乃至 1 0 のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。実験 2 6 ァミノカルボニル反応

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を水に溶解し、さらに、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、 5 0 m M リン酸緩衝液で p H 7. 0 に調整した 1 w / v %グリシンを含む 1 0 w/ v %環状四糖溶液を調製した。その溶液 4 m 1 をガラス製試験管に採り、密封した後、 1 0 0 °Cで 3 0乃至 9 0分間加熱した室内で放冷後、それらの着色度を測定しァミノカルボニル反応性を調ベた。着色度は、 4 8 0 n mにおける 1 c mセルでの吸光度により評価した。結果を表 2 6 に示す。

表 2 6

表 2 6の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、ァミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。

実験 2 7 ァミノカルボニル反応

実験 2 0 の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、 5 w/ v %ポリべプトンを含む 1 O w/ v %環状四糖溶液を調製した。その溶液 4 m I をガラス製試験管に採り、密封した後、 1 2 0 °Cで 3 0乃至 9 0分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しァミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、 4 8 0 n mにおける 1 c mセルでの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値に基づいて評価した。結果を表 2 7 に示す。

表 2 7

表 2 7の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、ァミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。

実験 2 8 包接作用

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を脱イオン水に溶かし、 2 0 %水溶液を調製した。その水溶液 1 0 0 g当たり、メタノールは 2 g、エタノールは 3 g、酢酸は 4 . 6 gを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝シクロデキス卜リン（商品名『イソエリ一卜 P』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。

凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末 1 gを 5 m I の水に溶かし、それに 5 m I のジェチルエーテルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジェチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表 2 8 に示す。

表 2 8

表 2 8の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しておりその包接能は、分枝サイクロデキストリンと比べ、重量当たり約 2倍も高いことが判明した。

実験 2 9 甘味度

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を脱イオン水に溶かし、固形物濃度 1 0 %水溶液を調製し、この環状四糖 1 0 % 水溶液を基準とし、蔗糖（市販グラニュー糖）の濃度を変え、パネラ一 5名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約 2 0 %であった。

実験 3 0 消化性試験

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第 4 3巻、第 2 3乃至 2 9頁（ 1 9 9 0年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、脬液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行なった。結果を表 2 9 に示す。

表 2 9 消化酵素消化酵素による分解率（％)

環状四糖マルチトール（対照）唾液ァミラーゼ 0. 0 0. 0

合成胃液 0. 0 0. 0

薛液アミラーゼ 0. 0 0. 0

小腸粘膜酵素 0. 74 4. 0 表 2 9の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、脖液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は 0. 7 4 %と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの値と比較すると 1 ノ 5以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。

実験 3 1 醱酵性試験

実験 2 0の方法で得られる 5乃至含水結晶環状四糖を用いて、『ジヤーナル ' 才プ ' ニュー卜リショナル · サイエンス · アンド · ビタミノロシ一、 J o u r n a l o f N u t r i t i o n a l S c i e n c e a n d V i t a m i n o l o g y )』、第 3 7巻、第 5 2 9乃至 5 4 4頁（ 1 9 9 1 年）に記載の O k u等の方法に準じて、ラッ卜盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ゥイス夕一系雄ラッ卜をエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、 4倍量の 0. 1 M炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約 7 %を添加し、添加直後及び 1 2時間後に残存する環状四糖量はガスクロマ卜グラフィ一法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物 g当たり 6 8. 0 m g、 1 2時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物 g当たり 6 3. 0 m gであり 9 3 %が醱酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醱酵されにくい糖質であることが判明した。実験 3 2 資化性試験

実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（ 1 9 8 4年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌の資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を 0. 5 %添加した P Y F培地 5 m l に約 1 0 ⁷ C F U接種し、嫌気条件下で 3 7 °C、 4 日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いて行なった。資化性の判定は、培養後の培養液の p Hが、 6. 0以上の場合、資化されない（一）とし、 6. 0未満の場合、資化される（+ ) とした。さらに、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を確認した。結果を表 3 0 に示す。表 3 0

の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されなく、対照のグルコースはいずれにも資化されることがわかり、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。

実験 3 3 急性毒性試験

マウスを使用して、実験 2 0の方法で得られる 5乃至 6含水結晶環状四糖を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。したがって、正確な値とはいえないが、その L D 5 0値は、 5 0 g / k gマウス体重以上であった。

以上の実験 3 0乃至 3 3の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエツ卜甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエツ卜飲食^)の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとしての利用が期待できる。

実験 3 4 非還元性糖質による脱水量の大きさと脱水物品の粉末化の比較実験

実験に用いた非還元性糖質は、無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖、無水非晶質環状四糖、 5乃至 6含水結晶環状四糖、無水結晶 α， a — 卜レハロース、無水非晶質 α， ο: — トレハロース及び 2含水結晶 , α — 卜レハロースである。 5乃至 6含水結晶環状四糖は実験 2 0 の方法で調製した。無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、それぞれ実施例 Α— 1 、実施例 A— 2及び実施例 A— 3の方法で調製した。 2含水結晶 α， a — 卜レハロースは市販のもの（商品名『トレ八』、株式会社林原商事販売）を用いた。無水結晶 α， α — 卜レハロース及び無水非晶質 α , α — 卜レ八ロースは市販の 2含水結晶 α， a - トレハロースから特開平 6 — 1 7 0 2 2 1 号公報参考例 1 及び参考例 3 に開示される方法で調製した。

水分含量約 7 7 %のプレーンヨーグルト 4重量部に、上記の糖質をそれぞれ 1 1 乃至 1 6重量部を混合し得られる混合物をバッ卜にとり、 2 5 °Cで室内に 2 4時間静置後、その混合物の状態変化を観察した。その判定は、充分に脱水して固化し、これを切削機にかけて粉末化が容易である場合を〇、脱水がやや不充分で固化したけれども切削機による粉末化が困難である場合を△、脱水が不充分で固化しなかつたことにより切削機にかけて粉末化することができなかった場合を Xとした。結果は、表 3 1 に示す。

表 3 1

表 3 1 の結果から、無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、無水結晶 α ， 0：— 卜レハロース、無水非晶質 α a - 卜レハロースよりも少ない重量部で固化することができ、切削機による粉末化が容易であることが判明した。また、得られる粉末の性状も優れていた。この結果から、無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は脱水能を有する環状四糖で脱水剤として好適であり、とりわけ、無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖が脱水能に優れていることが判明した。

実験 3 5 脱水能を有する環状四糖による脱水作用

無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖、無水非晶質環状四糖及び 5乃至 6含水結晶環状四糖の脱水作用、具体的には、糖質に対する吸水量とその経時変化について詳細に実験した。比較実験には糖質として無水結晶 α， α — トレ八ロース、無水非晶質 a , 0： — 卜レハロース及び 2含水結晶卜レハロースを用いた。実験は、実験 3 4で述べた方法で調製したそれぞれの環状四糖及び α， a - 卜レハロースをふるい分けして粒径約 1 0 0乃至 1 5 O j mの粉末品とし、直径 5 c mのプラスチックシャーレにそれぞれ 1 gずつ採り、相対湿度 6 0 %又は 7 5 %に調整されたデシケ一ター内に入れ、 2 5 °Cの雰囲気に 1 週間放置し、経時的に糖質中に含まれる水分（％ ) をカール · フィッシャー法で測定した。結果は表 3 2 に示す。

表 3 2

処理時の相径過日数

対湿度（％) 0 1 2 3 7

60 0.2 10.2 10.3 10.3 10.4 無水結晶環状四糖

75 0.2 13.9 ■ t.

60 ク 7 ク.7 / ク ft 0 Q 0 Q

1含水結晶環状四糖

75 2.7 14.0 14.0 14.1 14.1

60 0.3 13.7 13.8 13.9 14.1 無水非晶質環状四糖

75 0.3 14.2 13.6 13.7 13.7

60 13.0 13.1 13.1 13.1 13.2

5乃至 6含水結晶環状四糖

75 13.0 13.1 13.1 13.1 13.1

60

無水結晶，な一トレハロース

75 0.3 9.7 9.6 9.8 9.8

60

無水非晶質 α , α—トレハロース

75 0.8 9.8 9.7 9.8 9.7

60

2含水結晶な， or—トレハロース

75 9.7 9.7 9.7 9.8 9.8

：試験せず表 3 2の結果から、相対湿度 6 0 %で放置した場合、 1 含水結晶環状四糖及び 5乃至 6含水結晶環状四糖は 1 週間放置したのちもほとんど吸水は見られなかつたが、無水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は 1 日目でほぼ吸水量が飽和に達した。吸水量は、無水結晶環状四糖ではその重量の約 1 0 %であるのに対して、無水非晶質環状四糖ではその重量の約 1 4 %の値を示した。 1 週間放置した後の各試料を粉末 X線回折法で解析したところ、主な回折角はそれぞれ放置前の試料と同一の回折パターンを示し、結晶型に変化は見られなかった。相対湿度が 6 0 %以下では、水分は取りこむが，結晶水として取り込まれるのではないことが明らかとなった。

一方、相対湿度 7 5 %で放置した場合、無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、無水結晶 α ， α — 卜レハロース及び無水非晶質 α ， α — 卜レハロースを同様に、放置後 1 日でほぼ吸水量が飽和に達した。この際の吸水量は、いずれの環状四糖も、その重量の約 1 4 %であるのに対し、 α ， α — 卜レハロースはその重量の 1 0 %弱であることから、環状四糖の方が脱水能としては優れていることが判明した。また、いずれの試料も粉末状態を維持し、吸湿によってベとついたり、流れたりする現象は見られなかった。更に、 1 週間放置後の無水結晶環状四糖、 1 含水結晶環状四糖及び無水非晶質環状四糖は、粉末 X線回折法で解析したところ、主な回折角はそれぞれ放置前の試料と異なった回折パターンを示し、いずれも 5乃至 6 含水結晶環状四糖の回折パターンに一致した。このことから、相対湿度が 7 5 %以上では、水分は結晶水として取り込まれて、 5乃至 6含水結晶に変換していることが明らかとなった。

上記のように優れた脱水能を有する本発明の環状四糖は、食品、医薬品、化粧品、これら原材料又は加工中間物などの含水物の強力な脱水剤として有利に利用できることが判明した。

実験 3 6 糊化澱粉の微生物汚染に対する無水結晶環状四糖と 5乃至 6含水結晶環状四糖の効果の比較

もち粉 4重量部を水 6重量部に溶いて、木枠に濡れ布きんを敷いたものに流し込み、これを 1 0 5 °Cで 1 0分間蒸して糊化澱粉とする。これに実験 2 0 の方法で調製した 5乃至 6含水結晶環状'四糖又は実施例 A - 1 の方法で調製した無水結晶環状四糖 6重量部をミキサーで混和し、均一になったら、更に水飴 2重量部を加え十分に捏ねて成形し、更に 4 0 °Cの温風で 2時間軽く乾燥して求肥を得た。

本品を 2 5 °Cの室温に開放して放置したところ 5乃至 6含水結晶環状四糖を使用したものは、 1 5 日後に黒カビのコロニーの発生を見たが、無水結晶環状四糖を使用したものは、 3 0 日後においても微生物の汚染が見られなかつた。

また 3 0 日後のものを切断して、その断面を観察したところ、' 無水結晶環状四糖を使用したものは、表層部がやや硬化して結晶が析出しているものの、内部は、製造直後と同様に半透明で適度な艷、粘度を有していた。なお表層部の結晶は、 X線回折図形より、無水結晶環状四糖が 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換しているものであることが判明した。

この結果、脱水能を有する環状四糖は、糊化澱粉の脱水剤として作用し、微生物汚染を防止し、更に糊化澱粉の老化を防止することが判明した。この性質は、求肥、フラワーペース卜などの糊化澱粉を用いる各種製品に対して有利に利用できる。

以下、本発明の脱水能を有する環状四糖を実施例 Aでその用途を実施例 Bで具体的に述べる。

実施例 A— 1 無水結晶環状四糖の製造方法

バチルスグロビスポルス C 1 1 ( F E R M B P - 7 1 4 4 ) を実験 6の方法に準じて、フアーメンターで 4 8時間培養した。培養後、 S F膜を用いて除菌濾過し、約 1 8 I の培養濾液を回収し、更に、その濾液を U F膜濃縮し、 α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素を 9 . 0単位/ m I と a —イソマル卜シル転移酵素を 3 0 . 2単位/ m I とを含む濃縮酵素液約 Ί I を回収した。タピ才力澱粉を濃度約 2 5 %澱粉乳とし、これに α —アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り 0 . 2 %加え、 8 5乃至 9 0 °Cで約 2 0分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間才一卜クレーブし、更に約 3 5 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに上記の方法で調製した α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物 1 グラム当り 0 . 2 5 m I の割合になるように加え、更にシクロマル卜デキス卜リングルカノ卜ランスフェラーゼ (株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物 Ί グラム当り 1 0単位になるように加え、 P H 6 . 0、温度 3 5 °Cで 4 8時間反応させた。その反応液を 9 5 °C で 3 0分間保った後、 p H 5 . 0、温度 5 0 °Cに調整した後、 α—グルコシダーゼ剤（商品名『卜ランスダルコシダーゼ L 「ァマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物 1 グラム当たり 3 0 0単位加え、 2 4 時間反応させ、更にダルコアミラーゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物 1 グラム当たり 3 0単位加え、 1 7時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法にしたがって、活性炭で脱色し、 H型及び 0 H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度 6 0 %の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約 9 0 %で得た。この環状四糖含有シラップを実験 1 9 に記載の方法にしたがって、強酸性力チ才ン交換樹脂（商品名『アンバーライ卜 C R - 1 3 1 0 ( N a型）』、オルガノ株式会社製）を充填したカラム (ゲル量 2 2 5 I ) に供し、カラム温度を 6 0 °Cに維持しつつ、流速約 4 5 I Z hの条件でクロマ卜分離を行った。溶出液の糖組成を実験 1 に記載の H P L C法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、環状四糖高含有液を原料澱粉固形物当たり収率約 2 1 %で得た。本高含有液は、固形物当たり約 9 8 %の環状四糖を含有していた。本溶液を濃度約 9 0 %に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として無水結晶環状四糖約 2 %を加えて、 1 2 0 °Cで 1 6時間維持しつつ真空乾燥し、水分約 0 . 2 %の ^水結晶環状四糖粉末を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。

実施例 A— 2 1 含水結晶環状四糖の製造方法

とうもろこし澱粉を濃度約 2 0 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシゥ厶 0 . 1 %加え、 p H 6 . 5 に調整し、 α —アミラーゼ（商品名『夕一マミール 6 0 し』、ノポ社製）を澱粉グラム当たり 0 . 3重量％加え、 9 5 °Cで 1 5分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間才ートクレーブし、更に約 3 5 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、 α—ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素と α—イソマル卜シル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物 1 グラム当り 0 . 2 5 m I の割合になるように加え、更にシクロマル卜デキス卜リングルカノ卜ランスフエラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物 1 グラム当リ 1 0単位になるように加え、 p H 6 . 0、温度 3 5で 4 8時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cで 3 0分間保った後、 p H 5 . 0、温度 5 0 °Cに調整した後、 α—ダルコシダーゼ剤（商品名『卜ランスダルコシダーゼ L 「ァマノ」、天野製薬株式会社製造』を固形物 1 ダラ厶当たり 3 0 0単位加え、 2 4時間反応させ、更にダルコアミラーゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物 1 グラム当たり 3 0単位加え、 1 7時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる瀘液を、常法にしたがって、活性炭で脱色し、 H型及び 0 H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度 6 0 %の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約 9 0 %で得た。実施例 A— 1 に記載の方法にしたがってクロマ卜分離し、環状四糖の純度が 9 8 %以上の画分を回収した。これを実験 2 0の方法にしたがって、エバポレーターで固形物濃度約 5 0 %に濃縮した後、この濃縮糖液約 5 k gを円筒状のプラスチック容器に入れ、穏やかに回転させながら約 2 0時間で温度を 6 5 °Cから 2 0 °Cまで降下させることにより晶析させたところ、 5乃至 6含水結晶環状四糖粉末が得られた。これをガラス容器に入れ、予め温度 1 4 0 °Cに保温したオイルバス中にそのガラス容器を 3 0分間保持した。得られた乾燥物を粉砕機にて粉砕し、水分約 2 . 7 %の〗含水結晶環状四糖粉末を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。

実施例 A - 3 無水非晶質環状四糖の製造方法

実施例 A— 1 に記載の方法にしたがって得られた環状四糖の純度が 9 8 %以上の画分を、常法にしたがって脱塩、脱色、濾過した後、その濃度を 5 0 %にした。これを一 8 0 °Cで急速に凍結した後、その凍結物を凍結真空乾燥を行い、さらに 8 0 °Cで 3時間真空乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機にて粉砕し、水分約 0 . 3 %の無水非晶質環状四糖粉末を得た。この X線回折図形を図 3 3 に示す。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。実施例 A— 4 パノースから無水結晶環状四糖の製造方法

澱粉から製造されたパノース（株式会社林原生物化学研究所製造）の水溶液（約 1 0 0 I ) を濃度 4 w / v %、 p H 6 . 0、温度 3 0 °C に調整した後、実験 7の方法で得た精製 α —イソマル卜シル転移酵素標品をパノース 1 グラム当たり 2単位加え、 4 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、 H P L Cで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約 4 4 %であった。この反応液を p H 5 . 0、温度 4 5 °Cに調整した後. α —ダルコシダーゼ剤（商品名『卜ランスダルコシダーゼ L 「ァマノ」』. 天野製薬株式会社製）を固形物 1 グラム当たり 1 5 0 0単位を添加し, 更にダルコアミラーゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学ェ業株式会社製）を固形物 1 グラム当たり 7 5単位を添加して、 2 4時間反応させ、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、更に、水酸ィヒナ卜リウ厶で ρ Η 5 . 8 に調整し 9 0 °Cで 1 時間保持して酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約 1 6 %まで濃縮した後、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約 3， 6 5 0 gを含む糖液約 6 . 1 k g を得た。得られた糖液を、実施例 A — 1 に記載の方法にしたがってク口マト分離し、環状四糖の純度が 9 8 %以上の画分を回収し、常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約 1 ， 0 0 0 gを含む糖液約 3 k gを得た。得られた糖液の糖組成を H P し C法で測定したところ、環状四糖の純度は約 9 9 . 2 %であった。得られた環状四糖水溶液をエバポレーターで濃度約 5 0 %に濃縮した後、得られた濃縮糖液約 2 k gを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約 2 0時間で温度を 6 5 °Cから 2 0 °Cまで下げて晶析させ、乾燥して、 5乃至 6含水結晶環状四糖を得た。得られた 5乃至 6含水結晶環状四糖をさらに温度 1 2 0 °Cで 1 6時間真空乾燥し、水分約 0 . 2 %の無水結晶環状四糖を得た。本品は、強力な脱水能を有し、脱水剤として、含水物例えば食品、化学品、医薬品又はその原料、中間品などの含水物の脱水方法に有利に利用できる。

実施例 B — 1 脱水剤

実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末を用いて、紙製の透湿性小袋に 1 5 gずつ充填し、脱水剤を製造した。本品は、味付け海苔、クッキーなどの乾燥食品を封入した防湿容器内雰囲気の脱水剤として有利に利用できる。また、各種乾燥食品、油性食品などに対し、本脱水剤とともに脱酸素剤などを併用して、これら食品などを安定保存することも有利に実施できる。

実施例 B — 2 脱水剤入り砂糖

砂糖 5 0重量部に実施例 A — 4の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 1 重量部を添加し、高速回転ミキサーで混合して得た混合物をそれぞれ 1 k gずつポリエチレン袋に入れ、脱気後ポリエチレン袋の口を熱シールして閉封して、脱水剤入り砂糖を製造した。本品は、本発明の脱水剤が砂糖の微細結晶表面の水分を吸収し、砂糖の固着及び固結を防止するので安定に保存される。また、本品は調味料として各種調理、加工食品の製造などに有利に利用できる。

実施例 B — 3 脱水剤入り食塩

食塩 1 0 0重量部に実施例 A - 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 1 重量部を添加し、高速回転ミキサーで混合して得た混合物をそれぞれ 1 k gずつポリエチレン袋に入れ、脱気後ポリエチレン袋の口を熱シールして閉封して、脱水剤入り食塩を製造した。本品は、本発明の脱水剤が食塩の微細結晶表面の水分を吸収し、食塩の固着及び固結を防止するので安定に保存される。また、本品は調味料として各種調理、加工食品の製造などに有利に利用できる。

実施例 B — 4 そぼろ求肥

餅粉 4重量部を水 6重量部で溶いて、木枠に濡れ布きんを敷いたものに流し込み、これを 1 0 0 °Cで 2 0分間蒸した後、実施例 A— 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 6重量部及び砂糖 1 重量部を捏り込み、次いで水飴 2重量部を加えて、充分に捏ねた後に成形し、更に、室内に 1 6時間放置して、本品の表層において無水結晶環状四糖を 5 乃至 6含水結晶環状四糖に変換させ、これを軽くロール掛けして表面をひび割れさせ、そぼろ風の求肥を得た。本品は、風味良好で、微生物汚染を受けにくく、高品質を長期間に亙って維持した。

実施例 B — 5 いも菓子

さつまいもを厚さ約 1 c mにスライスし、これを蒸した後放冷し、これに実施例 A — 3 の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末をまぶし 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させて脱水し、表面に 5乃至 6含水結晶環状四糖の付着したいも菓子を製造した。本品は風味良好で安定ないも菓子である。

実施例 B — 6 粉末クリーム

生クリーム 1 重量部に実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 3重量部を混合した後バットに移し、 2 日間放置して 5乃至 6 含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して風味良好な粉末クリームを得た。本品は、風味良好な粉末クリームで、コーヒー、紅茶の味付けに、また、プレミックス、冷菓、ケーキ、キャンディ一類などの製菓材料、経管流動食などの治療用栄養剤などとして有利に利用できる。

実施例 B — 7 粉末ブランディー

ブランディー 2重量部にプルラン 1 0重量部を混合し、これに実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 7重量部を混合した後バッ卜に移し、 2 日間放置して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して風味良好な粉末プランディーを得た。本品を口に含めば、適度の甘味を有し、ブランディー香の充分な粉末香料である。本品は紅茶用香リ付けとして、また、プレミックス、キャンディ一類などの製菓材料などとして有利に利用できる。また、本粉末を顆粒成形機、打錠機にかけて成型し、顆粒、錠剤として利用するこも有利に実施できる。実施例 B _ 8 粉末味噌

赤味噌 2重量部に実施例 A — 2 の方法で得た 1 含水結晶環状四糖粉末 4重量部を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、これを室温下で一夜静置して固化し、離型して 1 個当り約 4 gの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調味料としてだけでなく味噌菓子などとしても利用できる。実施例 B — 9 粉末醤油

実施例 A— 3の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末 3 . 5重量部及び実験 2 0の方法で得た 5乃至 6含水結晶環状四糖 0 . 0 2重量部をコンベア上で流動させつつ、これに対して薄口醤油を 1 重量部の割合になるように噴霧し、次いで熟成塔に移し、 3 0 °Cで一夜放置して無水非晶質環状四糖を 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させて粉末醤油を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。

実施例 B — 1 0 粉末卵黄

生卵から調製した卵黄を、プレー卜式加熱殺菌機で 6 0乃至 6 4 °C で殺菌し、得られる液状卵黄 1 重量部に対して、実施例 A— 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 3 . 5重量部の割合で混合した後、実施例 B — 7 と同様にブロック化し粉末化して粉末卵黄を得た。本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。また美肌剤、育毛剤などとしても有効に利用できる。実施例 B — 1 1 粉末ヨーグルト

プレーンヨーグルト 1 重量部に実施例 A — 3 の方法で得た無水非晶質環状四糖粉末 3 . 6重量部を混合した後、実施例 B — 7 と同様にブロック化し、粉末化して粉末ヨーグルトを得た。本品は、風味良好であるだけでなく、乳酸菌を生きたまま長期に安定化し得る。また、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとして、更には、例えば、マーガリン、ホイップクリーム、スプレッド、チーズケーキ、ゼリーなどに含有させヨーグルト風味の製品にするなどに有利に利用できる。さらに本粉末を顆粒成型機、打錠機などで成型して乳酸菌製剤とし、整腸剤などとして利用することも有利に実施できる。実施例 B — 1 2 ホットケーキミックス

小麦粉 2 0 0重量部に実施例 B — 1 0の方法で得られた粉末卵黄 6 0重量部、バター 2 5重量部、砂糖 1 0重量部、ベーキングパウダ - 1 2重量部及び食塩 0 . 5重量部を配合してホットケーキミックスを得た。本品は、水、牛乳などで溶いて焼くことにより、簡単に風味良好なホッ卜ケーキを調製することができる。

実施例 B — 1 3 粉末薬用人参エキス

薬用人参エキス 0 . 5重量部に実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 1 . 2重量部を混捏した後、実施例 B — 7 と同様にプロック化し、粉末化して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量のビ夕ミン B 1 及びビタミン B 2粉末とともに顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用できる。また、育毛剤などとしても利用できる。

実施例 B — 1 4 粉末プロポリスエキス

プロポリスを 9 5 V / V %エタノール水溶液で、常法にしたがって抽出し、次いで残渣を少量の水で洗浄し、洗液を合わせて得られたプ口ポリス粗抽出物含有 8 0 v / v %エタノール（固形物約 2 0 w / w %含有）水溶液に、水を加えてエタノール濃度 5 0 V / V %に低減して、 5 0 °Cに 1 時間保ち、プロポリス有効成分を含有する上層と粘着性沈澱物の下層を形成させ、室温で一夜放置し、この上層を分離し採取して、色調、香味、抗菌作用に優れた液状の精製プロポリス抽出液を、粗抽出粗抽出物含有溶液に対して、固形物当り約 4 8 %の収率で得た。この精製プロポリス抽出液 Ί 重量部を、実施例 A— Ί の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 1 0重量部に噴霧混合し、さらに乾燥させて風味良好な粉末プロポリスエキスを得た。本品は、抗菌剤、抗酸化剤、抗炎症剤、免疫調節剤、マクロファージ活性化剤などとして直接利用されるだけでなく、他の適宜な材料と配合して、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。

実施例 B — 1 5 粉末アイエキス

タデ科の一年生草本であるアイ（学名「ポリゴナ厶 · ティンク卜リゥ厶」）の地上部 3 0 k gを破砕した後、 9 0 v Z v %エタノール水溶液で、常法にしたがって抽出し、次いで残渣を少量の水で洗浄し、洗液を合わせて得られたアイ粗抽出物含有水溶液に、水を加えてエタノール濃度 5 0 V V %に低減した。この粗抽出液 1 重量部に対し、実施例 A - 2の方法で得た 1 含水結晶環状四糖 1 2 重量部の割合で混合した後バッ卜に移し、 2 日間放置して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末アイ抽出液を得た。本品は抗菌作用、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、ラジカル捕捉作用、アポ卜一シス調整作用、サイト力イン調整作用などの多彩な生理作用を具備しており、食品、化粧品及び医薬品に配合する生薬として有利に利用できる。

実施例 B — 1 6 粉末中国パセリエキス

セリ科の植物である中国パセリ（英名：コリアンダー、分類：コェンドロ属）の地上部を水洗し、水切りした後、プレンダーを用いて細断した。細断した中国パセリを遠心濾過分離器を用いて 1 5 0メッシュパスした抽出液を回収し、 1 2 1 °Cで 1 0分間処理して、固形物含量 6 0 m g / m ] の中国パセリ抽出液を得た。この抽出液 1 重量部に対し、実施例 A — 4で得た無水結晶環状四糖 9重量部の割合で混合した後バッ卜に移し、 2 日間放置して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末中国パセリ抽出液を得た。本品は鉛などの金属の沈着を抑制する作用を具備しており、直接若しくは食品又は医薬品に配合して有利に利用できる。

実施例 B — 1 7 粉末ローヤルゼリー

未加工のブラジル産ローヤルゼリー（水分 6 5重量％ ) 1 重量部に実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖 7重量部の割合で混合した後バッ卜に移し、 2 日間放置して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末ローヤルゼリーを得た。さらにこれを 1 0 0メッシュパスにより分級した後、打錠機を用いて 1 錠当り 3 0 O m gの錠剤を製造した。本品は強壮作用、細胞賦活作用を具備しており、さらに、劣化しやすいローヤルゼリーを常温下で長期間保存できる。また、風味が改善されており、まろやかな甘味と適度な酸味を示すので、日常的に利用する健康食品として有利に利用できる。

実施例 B — 1 8 流動食用固形製剤

実施例 A - 1 の方法で得た無水結晶環状四糖粉末 4 0 0重量部、実施例 B — 7の方法で得られた粉末卵黄 2 7 0重量部、脱脂粉乳 2 0 9 重量部、塩化ナトリウム 4 . 4重量部、塩化カリウム 1 . 8 5重量部、チアミン 0 . 0 1 重量部、 L —ァスコルビン酸ナトリウム 0 . 1 重量部、ビタミン Eアセテート 0 . 6重量部及びニコチン酸アミド 0 . 0 4重量部からなる配合物を調製し、この配合物 2 5 gずつを防湿性ラミネ一卜小袋に充填し、ヒー卜シールして流動食用固形製剤を製造した。

本固形製剤は、小袋内雰囲気の水分を低減し、低温貯蔵の必要もなく室温下で長期間安定である。また、水に対する分散、溶解は良好である。本固形製剤は、一袋分を約 1 5 0乃至 3 0 0 m I の水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへの経管的投与により利用される。

実施例 B— 1 9 医薬用錠剤状製剤

新生児のハムスターに、ゥサギから公知の方法で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた後、その皮下に B A L L— 1 細胞を移植し、その後通常の方法で 3週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出して細断し、生理食塩水中で分散させてほぐした。得られた細胞を血清無添加の P R M I 1 6 4 0培地（ p H 7. 2 ) で洗浄し、同培地に約 2 X 1 0 ⁶個/ m I になるように懸濁し、 3 5 °Cに保った。

これに部分精製したヒトインターフェロン— αを 2 0 0 I U / m I の割合で加えて約 2時間保った後、更に、センダイウィルスを約 3

0 0赤血球凝集価/ m I の割合で添加し、 2 0時間保ってヒ卜インタ一フエロン一 αを誘導させた。これを、約 4 °C、約 1 ， O O O gで遠心分離して沈殿物を除去し、得られた上清を更に精密濾過し、その濾液を、公知の方法にしたがって、抗インターフェロン一 α抗体を固定化しているカラムにかけ、非吸着画分を除去した後、その吸着画分を溶出し、膜濃縮して濃度約 0. 0 0 1 w / V %、比活性約 2 X 1 0 ⁸

1 U /m g蛋白質の濃縮液をハ厶ス夕——匹当たり約 4 m I の収量で得た。

実施例 A— 1 の方法で得た無水結晶環状四糖 1 k gを粉末化し、 1 5 0メッシュパスさせ、先に得られたインターフェロン一 α濃縮液 0.

2 5 m l (約 1 X 1 0⁶ I U ) を蒸留水 1 0 0 m l に希釈した後、噴霧しながら均一に混ぜ合わせ、常法にしたがい打錠機を用いて 1 錠が 3 0 0 m g ( 1 5 0 I U /錠）の錠剤を製造した。本製造方法は、インターフェ口ン— a含有液を無水結晶環状四糖粉末に噴霧するだけで脱水され、さらに均一に混合され、インターフェロン一 αの安定化にも効果的である。

本品は、水に対して易溶である事から、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、抗リューマチ剤、抗免疫疾患剤などの抗感受性疾患剤として内服用剤、口腔用剤として利用することができる。また、検査用の試験薬に用いることも有利に実施できる。

実施例 Β — 2 0 医薬用顆粒状製剤

ヒ卜由来のリンパ芽球細胞 B A L L — 1 細胞を牛胎児血清を 2 0 %補足した E a g I eの最少基本培地（· ρ Η 7 . 4 ) に接種し、 3 7 °Cで常法に従い生体外（ i n v i t r o ) で浮遊培養した。得られた細胞を血清無添加の E a g I e最少基本培地で（ p H 7 . 4 ) で洗浄し、同培地に約 1 X 1 0 ⁷個 Z m I になるように懸濁した。この懸濁液にセンダイウィルスを m I 当り約〗， 0 0 0赤血球凝集価添加し、 3 8 °Cで 1 日保ってッモア · ネクロシス · ファクタ—— αを誘導生成させた。これを 4 °C、約 1， 0 0 0 gで遠心分離し、得られた上清を P H 7 . 2、 0 . 0 1 Mリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で 1 5時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を常法にしたがって、抗インターフェロン抗体のカラムに流し、その非吸着画分を、抗ツモ 7 · ネクロシス · ファクタ—— a モノクローナル抗体のゲルカラムを用いたァフィ二テイクロマ卜グラフィ一により精製し、濃縮して、濃度約 0 . 0 1 w / V %比活性約 2 X 1 0 ⁶ J R U / m g蛋白質の濃縮液を得た。活性収量は、誘導生成時の懸濁液 1 I 当り約 5 X 1 0 ⁴ J (あじであった。

実施例 A — 1 の方法で得た無水結晶環状四糖 1 k _gを粉末化し、 1 5 0メッシュパスさせ、先に得られたッモア ■ ネクロシス . ファクタ —— α濃縮液 0 · 5 m l (約 1 X 1 0 ⁵ J R U ) 蒸留水 1 0 0 m l に希釈した後、噴霧しながら均一に混ぜ合わせ、常法にしたがい顆粒形成機によって顆粒状のツモァ ' ネクロシス · ファクタ一一 α製剤（約

1 0 0 J R U / g ) を製造した。本製造方法は、ツモァ 'ネクロシス - ファクタ一一 _α含有液を無水結晶環状四糖粉末に噴霧するだけで脱水され、さらに均一に混合され、ッモア ' ネクロシス · ファクタ一— αの安定化にも効果的である。

本品は、水に対して易溶であることから、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、抗リューマチ剤、抗免疫疾患剤などの抗感受性疾患剤として内服用剤、口腔用剤として利用することができる。また、検査用の試験薬に用いることも有利に実施できる。

実施例 Β— 2 1 外傷治療用膏薬

実施例 A— 1 の方法で得た無水結晶環状四糖 4 0 0重量部にヨウ素 3重量部を溶解しメタノール 5 0重量部加えて混合し、更に 1 0 % プルラン水溶液 2 0 0重量部及びマルトース含水結晶 5 0重量部を加えて混合し、室温下で一夜放置して 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させ、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。

本品は、創面に塗るか、又は、ガーゼ、油紙などに塗るなどして使用することにより、切傷、擦り傷、火傷、水虫による漬傷などの外傷を治療することができる。

産業上の利用可能性

上記したことから明らかなように、本発明は、非還元性の環状四糖を有効成分とする脱水剤に関するものであって、脱水能を有する環状四糖を、例えば乾燥食品などを封入した防湿容器内の雰囲気に含まれる水分を低減させる場合、更には、例えば、食品、医薬品、化粧品、工業化学品、これらの原材料、又は加工中間物などの各種含水物の水分を低減させる場合などに有利に利用できる。脱水能を有する環状四糖を 5乃至 6含水結晶環状四糖に変換させて脱水し、実質的に水分を低減させる本発明の方法は、加熱乾燥などの苛酷な条件を必要としないで、各種含水物、例えば、風味、香気を劣化しやすい食品、有効成分の分解、活性低下の伴いやすい医薬品などの品質を低下させること無く、高品質の脱水物品を容易に製造することができる。また、得られた脱水物品は、微生物汚染が防止され、加水分解、酸敗、褐変などの変質、劣化が防止され、その商品の寿命を長期にわたって安定に維持することができる。

本発明は斯くも顕著な作用効果を有する発明でぁリ、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。

Claims

請求の範囲

1 . サイクロ {→ 6 ) — a — D—ダルコピラノシル— （ 1 → 3 ) — α — D—ダルコピラノシルー（ 1 → 6 ) — α — D—ダルコビラノシル - ( 1 → 3 ) 一 α — D—ダルコビラノシルー（ 1 →} の構造を有する糖質を有効成分とする脱水剤。

2 . サイクロ {→ 6 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) ― α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) — α — D—ダルコビラノシル - ( 1 → 3 ) 一 α— D—ダルコビラノシルー（ 1 →} の構造を有する糖質が、無水結晶、 1 含水結晶及び無水非晶質から選ばれる脱水能を有する糖質であることを特徴とする請求項 1 記載の脱水剤。

3. サイクロ {→ 6 ) — a — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) ― α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) — α — D—ダルコビラノシル一 ( 1 → 3 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 →} の構造を有する無水結晶が、水分 1 5 w / w %未満のサイクロ {→ 6 ) — α — D—グルコピラノシル一（ 1 → 3 ) — α — D—グリレコピラノシルー ( 1 → 6 ) 一 α — D—ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → } の構造を有する糖質のシラップを種晶共存下で 5 0 °C乃至 1 8 0 °Cの温度範囲に維持しつつ当該無水結晶を晶出させ、これを採取したものであることを特徴とする請求項 2記載の脱水剤。

4 . 1 含水結晶が、サイクロ {→ 6 ) — な — D—ダルコビラノシル一 ( 1 → 3 ) 一 α — D—ダルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — α — D—グルコピラノシルー（ Ί → 3 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → } の構造を有する糖質のシラップ又は 5乃至 6含水結晶を乾燥して採取したものであることを特徴とする請求項 2記載の脱水剤。

5. サイクロ {→ 6 ) — α — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) — a — D —ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) — a — D—ダルコビラノシル - ( 1 → 3 ) 一 a — D —ダルコビラノシルー ( 1 →} の構造を有する糖質が、澱粉質由来の糖質であることを特徴とする請求項 1 乃至 4のいずれかに記載の脱水剤。

6 . 含水物に、請求項 1 乃至 5のいずれかに記載の脱水剤を含有、接触又は共存させることを特徴とする含水物の脱水方法。

7 . 含水物を脱水することにより、サイクロ {→ 6 ) — a — D —グルコピラノシルー（ 1 → 3 ) — a — D—ダルコビラノシルー（ 1 → 6 ) 一 a — D—ダルコピラノシル一（ Ί → 3 ) — a — D —ダルコビラノシルー（ 1 →} の構造を有する糖質の 5乃至 6含水結晶を生成することを特徴とする請求項 6記載の脱水方法。

8 . 含水物 1 重量部に対して、請求項 1 乃至 5のいずれかに記載の脱水剤を 0 . 0 0 1 乃至 2 0 0重量部の範囲で含有、接触又は共存させることを特徴とする請求項 6又は 7記載の含水物の脱水方法。

9 . 含水物が、糊化澱粉、アルコール、油溶性物質又は生理活性物質を含有していることを特徴とする請求項 6 、 7又は 8記載の含水物の脱水方法。

1 0 . 含水物に、請求項 1 乃至 5のいずれかに記載の脱水剤を含有、接触又は共存させて得られる脱水物品。

1 1 . 脱水物品が、食品、医薬品、化粧品、これら原材料又は加工中間物であることを特徴とする請求項 1 0記載の脱水物品。