JPWO2002072594A1 - 分岐環状四糖とその製造方法ならびに用途 - Google Patents

Abstract

サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖の新規なグリコシル誘導体を提供することを課題とし、環状四糖の水酸基における水素原子の１個又は２個以上が置換基を有することのあるグリコシル基で置換された分岐環状四糖（ただし、該水素原子のうちの、６位の炭素に結合した水酸基における水素原子の１個のみが置換されている場合、該置換基はＤ−グルコシル基を除くグリコシル基から選ばれる基である。）を提供することにより解決する。

Description

技術分野
本発明は、新規な分岐環状四糖に関するものであり、詳細には、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖のグリコシル誘導体である新規な分岐環状四糖とその製造方法ならびに用途に関するものである。
背景技術
グルコースを構成糖とする環状糖質としては、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グリコシル結合で連結して環状構造を形成しているα−、β−及びγ−シクロデキストリンが従来からよく知られている。これらのシクロデキストリンは、還元力を示さない、呈味を示さない、疎水性物質を包接するなどの特性を有し、これらの特性を生かして、現在、諸種の分野で利用が進んでいる。また、シクロデキストリンの物性の改善や、シクロデキストリンへの新規な機能の付与などを目指した研究も盛んに進められている。例えば、特開平６−９７０８号公報、特開平６−１４７８９号公報、特開平６−１６７０５号公報、特開平６−２９８８０６号公報、特開平１０−２５３０５号公報などにはシクロデキストリンにグルコシル基、ガラクトシル基、マンノシル基、グルコサミニル基、Ｎ−アセチルグルコサミニル基などのグリコシル基を結合させて分岐構造をもたせた分岐シクロデキストリンとその製造方法や用途が種々提案されている。
一方、比較的近年報告された環状糖質としては、グレゴリー・エル・コテら、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている、グルコースがα−１，３及びα−１，６結合で交互に連結した環状四糖がある。この環状四糖の構造は、原子どうしの結合様式を表す化学式Ａ、ならびに、グルコシル基どうしの結合様式を表す化学式Ｂに示すとおりである。なお、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝は、化学式Ａ及びＢと同じく上記環状四糖を意味するものである。本明細書を通じて、単に「環状四糖」という場合、この環状四糖を意味するものとする。
化学式Ａ：

化学式Ｂ：

上記のコテらの論文には、グルコース残基がα−１，３結合及びα−１，６結合で交互に連結した多糖アルテルナンに加水分解酵素アルテルナナーゼを作用させることにより環状四糖が生成することが報告されている。この報告を契機として、環状四糖に対しても、シクロデキストリンと同様に、あるいはそれ以上に多方面で利用されることに期待がもたれ始めることとなった。しかしながら、この論文に記載された方法の場合、原料たるアルテルナンが入手容易ではなく、しかも、該原料からの環状四糖の生成率が工業的観点からすれば十分ではないことなどから、この方法は、環状四糖の工業的製造方法に有利に利用できるといえるものではなかった。
先に、同じ特許出願人は、特願２０００−１４９４８４号ならびにこの特許出願を基礎とする優先権主張出願である特願２０００−２２９５５７号（国際公開番号第ＷＯ ０１／９０３３８ Ａ１号）の明細書に、非還元末端にイソマルトシル基を有し、非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質（以下、「α−イソマルトシルグルコ糖質」という場合がある。）に作用して環状四糖を生成する新規酵素であるα−イソマルトシル転移酵素を、また、特願２０００−２３３３６４号ならびにこの特許出願を基礎とする優先権主張出願である特願２０００−２３４９３７号（国際公開番号第ＷＯ ０２／１０３６１ Ａ１号）の明細書に、グルコース重合度が３以上のマルトオリゴ糖に作用してα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する新規酵素であるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を開示した。そして、特願２０００−２３３３６４号ならびに特願２０００−２３４９３７号（国際公開番号ＷＯ ０２／１０３６１ Ａ１号）の明細書においては、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて用いることにより、食品製造用原料として汎用されている澱粉から環状四糖を主産物として生成させる方法を提案した。この提案により環状四糖の工業的製造への道が拓かれた。
このように環状四糖に関する研究は近年始まったばかりという状況であり、未知の機能の解明や新規な用途の開発など、今後の研究の進展に大いに期待がもたれる。一方、環状四糖のグリコシル誘導体に関しては、上記のとおり環状四糖が現在までに公知であったとはいえ、その入手が必ずしも容易ではなかったことなどから、該誘導体の製造を主たる目的とした研究は現在のところ皆無である。唯一、化学式Ｃで示される６−Ｏ−グルコピラノシル誘導体が、アルテルナンへのアルテルナナーゼの作用において極微量生成する副産物として単離・同定されたことが、上記のコテらの論文に記載されているのみである。なお、因みに、この６−Ｏ−グルコピラノシル誘導体の構造をグルコシル基どうしの結合様式で表す化学式は、化学式Ｄに示すとおりである。
化学式Ｃ：

化学式Ｄ：

シクロデキストリンの場合と同様に、環状四糖についてもグリコシル誘導体が多種に亙って提供されれば、それぞれについての特性の解析をとおして、環状四糖の用途開発に有用な知見がもたらされるとともに、環状四糖の物性・機能を改良ないしは改変した新規糖質の用途開発にも大きく貢献できるものと考えられる。
発明の開示
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、第一に環状四糖の新規なグリコシル誘導体を提供することにあり、第二に該グリコシル誘導体の製造方法を提供することにあり、第三に該グリコシル誘導体の用途を提供することにある。
上記の課題を解決するため、本発明者等は、先ずはじめに、澱粉部分分解物にα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて環状四糖を生成させる本発明者等が確立した反応において、環状四糖の関連糖質が副生成することを見出し、これらの副生成物の単離と同定を試みた。その結果、これらはいずれも環状四糖の新規なグリコシル誘導体であることが確認された。引き続き、上記の両酵素による反応で調製した環状四糖を用いて、上記の両酵素ならびに公知の糖質関連酵素を用いて、諸種のグリコシル基供与体の共存下、酵素反応を行った。その結果、上記の両酵素や、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、リゾチームやその他の糖転移酵素、糖加水分解、糖加リン酸分解酵素などの糖質関連酵素を用いることにより、新規なグリコシル誘導体が極めて多岐にわたって得られることが見出された。そして、以上のようにして得られた環状四糖のグリコシル誘導体を単離し、それらの性状を調べたところ、飲食品、化粧品、医薬品などの諸分野で有利に利用できることも確認された。本発明は、本発明者等による全く独自の以上の知見に基づいて為されたものである。
すなわち、本発明は、上記第一の課題を、環状四糖のグリコシル誘導体であって、一般式１で表される構造を有する分岐環状四糖を提供することにより解決するものである。
一般式１：

一般式１において、Ｒ_１乃至Ｒ_１２は、それぞれ独立に、置換基を有することのあるグリコシル基又は水素原子である。ただし、Ｒ_１乃至Ｒ_１２の全てが水素原子であることはなく、また、Ｒ_４及びＲ_１０のいずれか一方のみが置換基を有することのあるグリコシル基である場合、該グリコシル基であるＲ_４又はＲ_１０はＤ−グルコピラノシル基を除くグリコシル基から選ばれる基である。
また、本発明は、上記第二の課題を、環状四糖への単糖、オリゴ糖又は多糖からのグリコシル基の転移能を有する酵素の作用を利用する製造方法であって、該環状四糖と該単糖、オリゴ糖又は多糖との混合物に該酵素を作用させて本発明の分岐環状四糖を生成させる工程と、生成した分岐環状四糖を採取する工程とを含むことを特徴とする分岐環状四糖の製造方法を提供することにより解決するものである。
さらに、本発明は、上記第三の課題を、上記の本発明の分岐環状四糖を含んでなる、飲食物、化粧品、医薬品などとしての組成物を提供することにより解決するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を個々に詳述する。
１．分岐環状四糖
本発明が提供する新規分岐環状四糖は、一般式１で表される構造を有する。
一般式１：

一般式１において、Ｒ_１乃至Ｒ_１２は、それぞれ独立に、置換基を有することのあるグリコシル基又は水素原子である。ただし、Ｒ_１乃至Ｒ_１２の全てが水素原子であることはなく、また、Ｒ_４及びＲ_１０のいずれか一方のみが置換基を有することのあるグリコシル基である場合、該グリコシル基であるＲ_４又はＲ_１０はＤ−グルコピラノシル基を除くグリコシル基から選ばれる基である。なお、本発明でいうグリコシル基とは、糖質の分子構造からアノマー水酸基が除かれた構造として表される原子団を意味する。本発明でいう糖質とは、ポリアルコールのアルデヒド、ケトン、酸、さらには、ポリアルコール自身のほか、アミノ糖などこれらの誘導体、ならびに、オリゴ糖や多糖などこれらの縮合体を含めた化合物群を総称する用語である。また、本発明でいう、置換基を有することのあるグリコシル基における置換基とは、糖質分子における非アノマー水酸基の１個以上、又は、糖質分子がアミノ糖の場合はその非アノマー水酸基及びアミノ基の１個以上における水素原子を置換しうる基を意味し、具体的には、例えば、アルキル基、アシル基、アセチル基、リン酸基、硫酸基などが挙げられる。
本発明の分岐環状四糖がその分岐部分に有するグリコシル基（一般式１におけるＲ_１乃至Ｒ_１２から選ばれる１個又は２個以上の位置にあるグリコシル基）の例としては、具体的には、置換基を有することのある｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、置換基を有することのあるα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、置換基を有することのあるα−Ｄ−ガラクトピラノシル基、及び置換基を有することのあるβ−Ｄ−キトサミニル基を挙げることができる。本発明の分岐環状四糖は、以上のグリコシル基から選ばれる１種又は２種以上をその分子内に有し得る。
当該分岐環状四糖のより具体的な第一の例としては、一般式１におけるＲ_１及び／又はＲ_７が、置換基を有することのある｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１及びＲ_７の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造式としては、具体的には、後記実験３−４及び実験４−３に示す化学式１及び化学式２を例示することができる。
当該分岐環状四糖のより具体的な第二の例としては、一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのあるα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_２及びＲ_８の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造式としては、具体的には、後記実験３−４に示す化学式３及び化学式４を例示することができる。
当該分岐環状四糖のより具体的な第三の詳細な例としては、一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_２及びＲ_８の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造式としては、具体的には、後記実験４−４に示す化学式６を例示することができる。
当該分岐環状四糖のより具体的な第四の例としては、一般式１におけるＲ_４及び／又はＲ_１０が置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_４及びＲ_１０の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造式としては、具体的には、後記実験４−５に示す化学式７及び化学式８を例示することができる。
当該分岐環状四糖のより具体的な第五の例としては、一般式１におけるＲ_４及び／又はＲ_１０が、置換基を有することのあるα−Ｄ−ガラクトピラノシル基である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造式としては、具体的には、後記実験４−６に示す化学式９を例示することができる。
当該分岐環状四糖のより具体的な第六の例としては、一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのあるβ−Ｄ−キトサミニル基（「キトサミニル基」は一般に「グルコサミニル基」とも呼ばれる。）である当該分岐環状四糖が挙げられる。その構造としては、具体的には、後記実験４−７に示す化学式１０を例示することができる。
なお、以上の例は、本発明の分岐環状四糖を、その分岐部分の構成糖及び結合様式によって分類して個々に示したものであるけれども、当該分岐環状四糖はこのように分類される分岐部分をそれぞれ単独で有するのみならず、その２種以上を適宜組み合わせて有する場合もある。例えば、上記の第一の例に示される分岐部分の構造と、上記の第二乃至第六の例のいずれかに示される分岐部分の構造とを組み合わせて有する分岐環状四糖はその一例であり、その構造式としては、具体的には、後記実験３−４に示す化学式５を例示することができる。
以上のような本発明の分岐環状四糖は、以上説明したような構造を有する限り、特定の製造方法によるものに限定されず、例えば、有機合成法によって得られるものであっても、また、酵素反応によって得られるものであってもよい。しかしながら、下記に詳述する、本発明が開示する分岐環状四糖の製造方法によれば当該分岐環状四糖を効率的に製造することができるので、当該分岐環状四糖の諸種の分野での利用においては、本発明の製造方法によるものが有利である。本発明の分岐環状四糖は、例えば、糖質成分として実質的に当該分岐環状四糖のみが含まれる状態、通常、純度９０％以上、望ましくは純度９５％以上、より望ましくは、純度９７％以上に精製された状態で、溶液、非晶質粉末、含蜜結晶などの状態で、また、単離された結晶の状態で提供される。当該分岐環状四糖の結晶は、水や、低級アルコール、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒もしくは、これらの溶媒から適宜選ばれる２以上を混合した溶媒から晶出させ、常法にしたがって分蜜することにより単離することができる。水から晶出される当該分岐環状四糖の結晶は、無水結晶又は含水結晶として得られ、斯かる含水結晶の具体例としては、化学式１、化学式２、化学式３、化学式６ならびに化学式７で表される当該分岐環状四糖の結晶を挙げることができる。これらの含水結晶は、常圧下で加熱したり、常温下で減圧環境下におくことなどの操作により無水結晶に変換することができる。当該分岐環状四糖の結晶の特定は、通常の粉末Ｘ線回折法によることができる。例えば、化学式１、化学式２、化学式３、化学式６ならびに化学式７で表される分岐環状四糖の含水結晶は、この方法によるとき、主たる回折角（２θ）として、通常、それぞれ、（１）８．１°、１２．２°、１４．２°及び１５．４°、（２）５．６°、８．８°、１６．９°及び２１．９°、（３）７．９°、１２．１°、１７．９°及び２０．２°、（４）１１．０°、１２．３°、１２．８°及び２４．９°、及び（５）８．７°、１３．０°、２１．７°及び２６．１°を示す。また、当該分岐環状四糖は、これを主成分のひとつとして含む糖組成物としても提供される。当該分岐環状四糖を含む糖組成物は、当該分岐環状四糖を、そのいずれか１種のみ又は２種以上の合計として、全糖質成分あたり固形物重量換算で、通常、５０％以上、好適な場合には、６０％以上、より好適な場合には、７０％以上、さらに好適な場合には、８０％以上含有し、溶液、シラップ、ブロック、顆粒、含水結晶及び／又は無水結晶を含有する結晶質粉末、非晶質粉末、含蜜結晶などの適宜の状態で提供される。
２．分岐環状四糖の製造方法
本発明が提供する分岐環状四糖の製造方法は、環状四糖に単糖、オリゴ糖又は多糖からグリコシル基を転移する作用を有する酵素の作用を利用するものであり、環状四糖と該単糖、オリゴ糖又は多糖との混合物に該酵素を作用させて当該分岐環状四糖を生成させる工程と、生成した分岐環状四糖を採取する工程とを含むことを特徴とする。
２．１．環状四糖の調製
本発明による製造方法で用いる環状四糖の調製方法は問わず、例えば、（１）グレゴリー・エル・コテら、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載された、多糖アルテルナンに加水分解酵素アルテルナナーゼを作用させて環状四糖を生成させる方法や、（２）α−イソマルトシルグルコ糖質にα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させる方法、（３）還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質、例えば、澱粉部分分解物などにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて作用させて環状四糖を生成させる方法などによることができる。なお、本発明でいうα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素とは、それぞれ、下記（Ａ）及び下記（Ｂ）の酵素活性を有する酵素を意味するものであり、ここに示される以外の酵素活性の有無や、理化学的性質、起源は問わない。
（Ａ） 非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ（ｎは２以上の整数を表す。）の糖質に作用して、還元力を実質的に増加することなく、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ＋１の糖質を生成する。
（Ｂ） 非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外のの結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用して、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖を生成する。
因みに、上記（３）の方法による環状四糖の生成メカニズムは、概略としては以下のとおり推測される。
Ｉ） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖を生成する。
ＩＩ） α−イソマルトシル転移酵素が、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖を生成する。
ＩＩＩ） 続いて、α−イソマルトシル転移酵素が、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖を生成する。
ＩＶ） 切り離されたα−１，４グルカン鎖が、再度、Ｉ）からＩＩＩ）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。
環状四糖の工業的製造を目的とする場合、かかるコスト及び労力の点で、上記（２）及び（３）の方法が比較的優れており、特に（３）の方法が望ましい。以下、上記（３）の方法による環状四糖の製造方法を中心に説明する。
２．１．１．α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素
α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、例えば、両酵素の一方又は両方を産生する微生物を培養し、その培養物に酵素の調製のための通常の方法を適用することにより得ることができる。同じ特許出願人により、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された微生物バチルス・グロビスポルスＣ９（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）、及び、同じく平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された微生物バチルス・グロビスポルスＣ１１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）は、共に、両酵素の産生能を有するので両酵素の給源としてとりわけ有用である（以下、両微生物をそれぞれ「微生物Ｃ９」及び「微生物Ｃ１１」という場合がある）。
微生物Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）又は微生物Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を用いる場合の培地ならびに培養条件は、培地については、炭素源としては、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、これらの部分分解物や、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、Ｌ−ソルビトール、糖蜜などの糖質、クエン酸、コハク酸などの有機酸が適宜利用できる。培地中の炭素源の濃度は、用いる炭素源の種類に応じて適宜選択される。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物や、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素化合物が適宜利用できる。無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類が適宜利用できる。さらに必要に応じてアミノ酸類やビタミン類なども適宜利用できる。
培養条件については、温度は、通常、４℃乃至４０℃、好ましくは、２０℃乃至３７℃、ｐＨは、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至９で、通常、好気的条件下で、１０時間乃至１５０時間に亙り行うのが好適である。培養に際して溶存酸素濃度を制御することもでき、例えば、０．５乃至２０ｐｐｍの範囲となるように、通気量や撹拌速度を調節したり、通気に用いる気体の酸素濃度を加減したり、ファーメンター内の圧力を加減することも有利に実施できる。また、微生物が生育でき、α−イソマルトシル転移酵素を産生しうる条件を保持できる限り、回分培養、連続培養、半連続培養などいずれの培養方式を採用してもよい。
上記のような培養の結果得られる微生物Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）及び微生物Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）の培養物は、通常、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を含んでいる。したがって、環状四糖の製造においては、目的に応じて、この培養物をそのままの状態で酵素剤として利用することも、また、両酵素を共に含むように、あるいは、両酵素をそれぞれ分離するように培養物から精製して酵素剤として利用することもできる。例えば、培養物から通常の固液分離によって菌体を除去して培養上清を採取し、この培養上清を、必要に応じて、蛋白質の濃縮のための慣用の方法、例えば、硫安塩析、アセトン又はアルコール沈澱、減圧濃縮、膜濃縮などにさらに供すれば、両酵素を共に含む部分精製された酵素剤を得ることができる。このように部分精製された酵素剤に、さらに必要に応じて、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの酵素精製のための慣用の方法を適宜組み合わせて適用し、分離される画分から、所期の酵素活性を示す画分をそれぞれ別個に採取すれば、所望のレベルにまで精製されたそれぞれの酵素剤を得ることもできる。
α−イソマルトシル転移酵素活性は以下のようにして測定することができる。パノースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、３５℃で３０分間保持し、パノースからの環状四糖の生成反応を進行させる。この際、パノースから環状四糖とともにグルコースが生成する。該反応の後、反応液を１０分間煮沸して反応を停止する。反応停止後の反応液をグルコースオキシダーゼ法に供し、反応液中に生成したグルコース量を定量する。本発明において、α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、この条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は以下のようにして測定することができる。マルトトリオースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、３５℃で６０分間保持し、マルトトリオースからのイソマルトシルマルトースの生成反応を進行させる。この際マルトトリオースから、イソマルトシルマルトースとともにマルトースも生成する。該反応の後、反応液を１０分間煮沸して反応を停止する。反応停止後の反応液をマルトースを検出する通常のＨＰＬＣに供し、反応液中に生成したマルトース量を定量する。本発明において、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の１単位は、この条件下で１分間に１μｍｏｌのマルトースを生成する酵素量と定義する。
因みに、微生物Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）及び微生物Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）から得られる両酵素の、上記で定義される両酵素活性を指標として確認される理化学的性質は、下記表１にまとめたとおりである。

なお、酵素剤がα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を共に含む組成物の場合、該酵素剤は澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性を有する。澱粉部分分解物からの環状四糖生成活性（以下、単に「環状四糖生成活性」という場合、本活性を意味するものとする。）は以下のとおり測定することができる。澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２％（ｗ／ｖ）となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、３５℃で６０分間保持し、環状四糖生成反応を進行させる。この反応の後、反応液を１０分間煮沸して反応を停止する。反応停止後の反応液に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製造）を７０単位／ｍｌで、及びグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を２７単位／ｍｌで含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加え、５０℃で６０分間処理した後、１０分間煮沸してα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ処理を停止する。この後、反応液を、環状四糖を検出する通常のＨＰＬＣに供し、反応液中に生成した環状四糖を定量する。本発明において、澱粉部分分解物からの環状四糖生成活性の１単位は、この条件下で１分間に１μｍｏｌの環状四糖を生成する酵素量と定義する。
以上に示したような微生物からの調製方法以外に、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、例えば、組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる。同じ特許出願人は、特願２０００−３５０１４２号及び特願２００１−５４４１号の明細書に、それぞれ、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をコードする微生物Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）のＤＮＡの塩基配列を開示している。これらの開示された塩基配列は、それぞれの出願明細書に記載のとおり、Ｎ末端にシグナルペプチドを有するそれぞれの酵素の前駆体に対応するコード領域の塩基配列とともに、５′非翻訳領域及び３′非翻訳領域の塩基配列を含んでいる。本明細書の配列表においては、特願２０００−３５０１４２号明細書に開示された微生物Ｃ１１の塩基配列から、α−イソマルトシル転移酵素の前駆体に対するコード領域の塩基配列を抄出して配列番号１に、また、特願２００１−５４４１号明細書に開示された微生物Ｃ１１の塩基配列から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の前駆体に対するコード領域の塩基配列を抄出して配列番号２にそれぞれ示している。これらの塩基配列を参照し、斯界において慣用の組換えＤＮＡ技術、例えば、ＤＮＡのクローニング法、部位特異的変異導入法、微生物などの細胞の形質転換法、ＤＮＡの人為的発現法などを適用すれば、両酵素は得ることができる。慣用の組換えＤＮＡ技術は、例えば、ジェイ・サムブルックら、『モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル，第３版』（２００１年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）に種々詳述されている。
２．１．２．α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いる環状四糖の調製
α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて澱粉部分分解物などの基質から環状四糖を製造するには、基質、通常は、基質の水溶液に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を一旦作用させた後、α−イソマルトシル転移酵素を作用させるか、該基質に両酵素を同時に作用させればよく、環状四糖の生成効率の点では両酵素を同時に作用させるのが比較的望ましい。この方法で利用できる基質は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質であればよく、例えば、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンなどが例示できる。製造コストを考慮すると、始発原料として、例えば、とうもろこし、小麦、米などに由来する地上澱粉や、馬鈴薯、サツマイモ、タピオカなどの地下澱粉を用い、斯かる澱粉の懸濁液に液化型α−アミラーゼを作用させるか、又は、澱粉懸濁液を酸性条件下で加熱して得られる液化澱粉に両酵素を作用させるのが好適である。環状四糖をより効率的に生成させるためには、液化澱粉のＤＥ（デキストロース・エクイバレント）は低いほどよく、通常、ＤＥ２０以下、望ましくはＤＥ１２以下、さらに望ましくはＤＥ５以下が好適である。液化澱粉へのα−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の作用に先立ち、又は該作用と並行して、澱粉枝切り酵素、例えば、プルラナーゼやイソアミラーゼを作用させると、環状四糖の生成効率が向上する場合があるので、これらの酵素を利用することも有利に実施できる。
基質濃度は、環状四糖を生成するものである限り特に制限はない。１回の操作あたりの環状四糖の収量を高める上では基質濃度は高いほど好適であり、固形物濃度として、通常、０．１％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、１％（ｗ／ｗ）以上が好適である。基質は、水への溶解度を大きく超える濃度で含有する溶液の状態で用いることもできるけれども、上記液化澱粉の場合、通常、固形分濃度４０％（ｗ／ｗ）以下、望ましくは、３５％（ｗ／ｗ）以下が、操作のし易さなどの点で好適である。
反応条件は、環状四糖を生成するものである限り特に制限はない。例えば、温度は、通常、常温から５０℃まで、望ましくは、３０℃乃至４５℃が好適であり、ｐＨは、通常、ｐＨ４．５乃至８、望ましくは、ｐＨ５．５乃至７が好適である。反応液中に、用いる酵素のいずれかを安定化する金属イオン、例えば、Ｃａ^２＋やＭｇ^２＋を共存させることも有利に実施できる。反応時間は、用いる酵素量に応じて、反応の進行状況を勘案して適宜選択することができる。
基質にα−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させる際に、必要に応じて、他の糖転移酵素を併用することも有利に実施できる。例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを併用すると、環状四糖の生成効率が、併用しない場合に比べて向上する場合がある。
また、基質にα−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させる際に用いる酵素剤として、両酵素を産生する微生物を利用することもできる。微生物を酵素剤として利用するには、例えば、両酵素の産生能を有する、微生物Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）及びＣ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）などの微生物を、それが生育する条件下で所期の菌体数になるまで培養する。両微生物の培養のための条件は、酵素の製造のための上述の培養条件が有利に利用できる。そして培養の結果得られる培養物を、上記で述べた酵素剤の場合と同様に基質に作用させればよい。
以上のようにして酵素を作用させた反応液には環状四糖が生成している。この反応液をそのまま、環状四糖溶液として利用できる一方、反応液から環状四糖を精製して利用することもできる。環状四糖の精製には、公知の糖質の精製方法を適宜採用することができ、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどを用いるカラムクロマトグラフィーによる分画（通常、クロマト分離とも呼ばれる。）、アルコールやアセトンなどの有機溶媒を用いる分別沈澱、適度な分離性能を有する膜による分離、さらには、混在もしくは残存している他の糖質の分解・除去処理、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどのアミラーゼやα−グルコシダーゼなどの酵素処理、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などを必要に応じて適宜組み合わせて、環状四糖の精製度を高めることも有利に実施できる。以上のようにして精製された環状四糖もしくはこれを含む糖組成物は、濃縮、結晶化、乾燥、粉砕、溶解などの処理を適宜組み合わせて適用することにより、溶液、シラップ、ブロック、粉末、顆粒、結晶など所望の性状とすることができる。
以上、α−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を組み合わせて利用する環状四糖の製造方法を概説した。一方、α−イソマルトシル転移酵素を単独で用いる方法（上記で述べた環状四糖の製造方法（２））においては、同様に当該酵素を製造した後、これを、上記の酵素反応条件に準じて、市販の又は常法により調製したパノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質に作用させ、必要に応じて、生成する環状四糖を上記と同様に精製すればよい。
２．２．環状四糖にグリコシル基を転移する酵素
本発明による製造方法で用いる酵素は、環状四糖に対して、単糖、オリゴ糖又は多糖（以下、当該製造方法で用いられる該単糖、オリゴ糖及び多糖を総称して「グリコシル基供与体」という。）からグリコシル基を転移して、上記で述べた一般式１で表される分岐環状四糖を生成する作用を有するものである限り、他の作用の有無や、起源は問わない。具体的には、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−イソマルトシル転移酵素、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びリゾチームが挙げられる。以下、環状四糖へのグリコシル基の転移（以下、「グリコシル基の転移」を単に「グリコシル転移」という場合がある。）の観点から、それぞれの酵素の特性について概略を示す。
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９．）は、結合様式としてα−１，４グルコシル結合を含むグルコース重合度２以上の糖質、例えば、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、グリコーゲンなどを、通常、グリコシル基供与体とし、該供与体からグリコシル基を環状四糖に転移して、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第一の例に示される分岐環状四糖を生成する。
α−イソマルトシル転移酵素は、通常、パノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質をグリコシル基供与体とし、該供与体からグリコシル基を環状四糖に転移して、通常、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第二の例に示される分岐環状四糖、特に、化学式３又は化学式４で示される分岐環状四糖を比較的効率的に生成する。
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、結合様式としてα−１，４グルコシル結合を含むグルコース重合度３以上の糖質、例えば、重合度３以上のマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、グリコーゲンなどを、通常、グリコシル基供与体とし、化学式１で示される分岐環状四糖を通常は生成する。
β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２３．）は、通常、ラクトースをグリコシル基供与体とし、該供与体からグルコシル基を環状四糖に転移して、通常、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第三及び第四の例に示される分岐環状四糖を生成する。なお、β−ガラクトシダーゼは、起源によって、生成する分岐環状四糖の種類や組成が異なる場合がある。例えば、バチルス・サーキュランス起源の該酵素は、化学式６に示される分岐環状四糖を比較的効率的に生成する一方、アスペルギルス・ニガー起源の同酵素は化学式６乃至８に示されるものいずれをも生成する。
α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２．）は、通常、メリビオースをグリコシル基供与体とし、該供与体からグリコシル基を環状四糖に転移して、通常、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第五の例に示される分岐環状四糖、特に、化学式９で示される分岐環状四糖を比較的効率的に生成する。
リゾチーム（ＥＣ ３．２．１．１７．）は、Ｎ−アセチルキトサミン（別名Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成糖とし、結合様式としてβ−１，４グリコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖、例えば、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖やキチンなどを通常はグリコシル基供与体とし、該供与体からグリコシル基を環状四糖に転移して、通常、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第六の例に示される分岐環状四糖、特に、化学式１０で示される分岐環状四糖を比較的効率的に生成する。
なお、上記では、個々の酵素を環状四糖に単独で作用させた際にそれぞれが主として触媒する転移反応を述べたけれども、以上のような酵素を２種以上組み合わせて利用することにより、さらに別の分岐環状四糖を生成させることもできる。例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとα−イソマルトシル転移酵素とを組み合わせて用いて、両酵素による反応においてグリコシル基供与体となる適宜の糖質と環状四糖との共存下に両酵素を作用させれば、化学式５で示される分岐環状四糖が生成する場合がある。さらに別の酵素の組合わせにより多種多様な分岐環状四糖の生成が可能である。また、例えば、同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８２号公報に開示されたコージビオースホスホリラーゼや、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１．）、マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．８．）、α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０．）、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．１０．）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１．）などの上記で例示した以外の糖質関連酵素であっても、環状四糖に対してグリコシル基供与体からグリコシル基を転移して、上記で述べた一般式１で表される分岐環状四糖を生成する作用を有するものである限り、本発明による製造方法に有利に利用できる。とりわけ、上記のコージビオースホスホリラーゼは、反応条件によっては、単糖の１種であるグルコース１−リン酸をグリコシル基供与体として環状四糖にグリコシル基を転移して、一般式１におけるＲ_３、Ｒ_６、Ｒ_９及びＲ_１２から選ばれる１個又は２個以上がグリコシル基やコージビオシル基などのα−１，２グルコシル結合を有するオリゴグルコシル基である分岐環状四糖を生成し得るので、目的に応じて有利に利用できる。
以上例示した酵素はいずれも公知の酵素であって、本発明の実施においては、目的に応じて市販の酵素剤を利用するか、あるいは、各酵素の調製についての報告例にしたがって調製すればよい。
２．３．環状四糖からの分岐環状四糖の製造
本発明による製造方法を実施するには、先ず、目的とする分岐環状四糖の構造に応じて用いる酵素（以下、本項２．３．においては、「グリコシル転移酵素」という。）を選択し、これを、市販の酵素剤を購入したり常法により調製するなどして入手する。また、用いる酵素の特性にしたがって、グリコシル基供与体としての糖質を市販の調製品を購入したり常法により調製するなどして入手する。環状四糖は、上記２．１．の項に示したいずれかの方法にしたがって調製する。
上記のように入手される基質（環状四糖とグリコシル基供与体）とグリコシル転移酵素を用いて、基質の混合物、通常は、両者を共に含む水溶液に、グリコシル転移酵素を添加して反応させれば、反応混合物中に目的とする分岐環状四糖を生成させることができる。グリコシル転移酵素の作用条件は、所期の分岐環状四糖生成が起こる限り制限はない。水系で反応を行う場合、基質の濃度は、反応温度におけるそれぞれの水への溶解度にもよるけれども、環状四糖については、通常、１％（ｗ／ｗ）乃至４０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、５％（ｗ／ｗ）乃至３５％（ｗ／ｗ）とし、グリコシル供与体については、これが溶解する範囲で可能な限り高濃度とするのが好適であり、例えば、環状四糖の濃度に対して、可能であれば、１／２倍の濃度以上、望ましくは、等濃度以上、さらに望ましくは、２倍の濃度以上とするのが好適である。反応温度及びｐＨは、反応中にグリコシル転移酵素が完全に失活する程度のものでなければよく、用いる酵素の酵素学的性質を勘案して適宜選択される。酵素量は、基質濃度と実施する反応時間に応じて、反応終了時点で所期の生成物が得られるよう、適宜選択される。
斯くして得られる分岐環状四糖を含む反応混合物は、そのまま、当該分岐環状四糖を含む糖組成物として利用することもできるけれども、通常は、反応混合物から糖質を精製して利用される。糖質の精製は、一般的な方法にしたがえばよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などが適宜採用でき、さらに必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどを用いるカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールやアセトンなどの有機溶媒を用いる分別沈澱、適度な分離性能を有する膜による分離、さらには、混在もしくは残存している他の糖質の分解・除去処理、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどのアミラーゼや、α−グルコシダーゼなどの酵素による処理、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などを適宜組み合わせて、目的とする分岐環状四糖の精製度を高めることも有利に実施できる。以上のようにして精製された分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物は、濃縮、結晶化、乾燥、粉砕、溶解などの処理を適宜組み合わせて適用したり、さらに、必要に応じて、本発明の分岐環状四糖以外の適宜の糖質と混合して、溶液、シラップ、ブロック、含水結晶及び／又は無水結晶を含有する結晶質粉末、非晶質粉末、顆粒、単離された結晶、含蜜結晶など所望の状態とすることができる。
なお、因みに、上記２．１．２．の項に示した、α−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の作用による環状四糖の生成反応や、α−イソマルトシル転移酵素のα−イソマルトシルグルコ糖質への作用による環状四糖の生成反応においては、反応条件によりその生成量の増減はあるものの、通常、本発明の分岐環状四糖が副生成される。ここで副生成する分岐環状四糖のうち量的に主要なものは、化学式１で示されるもののほか、上記「１．分岐環状四糖」の項で述べた第二の例に示される分岐環状四糖、特に、化学式３及び化学式４で示されるもののや、化学式５で示されるものである。したがって、目的に応じて、上記の両酵素による反応産物やα−イソマルトシル転移酵素による反応産物から、分岐環状四糖を環状四糖と分離するように採取することにより、本発明の分岐環状四糖を得ることもできる。
３．分岐環状四糖の用途
本発明の分岐環状四糖は、その基本構造が環状四糖と共通であることから、通常、環状四糖と同等の特性・機能を有する。したがって、当該分岐環状四糖は、基本的に、環状四糖と同様の目的で利用することができる。以下、同じ特許出願人による特願２０００−２３４９３７号（国際公開番号第ＷＯ ０２／１０３６１ Ａ１号）の明細書に開示された環状四糖の用途に準じて利用することができる本発明の分岐環状四糖の利用例を概説する。
本発明の分岐環状四糖は、その分岐構造を構成するグリコシル基の種類や数によって異なるものの、通常、低甘味もしくは無甘味で上品な味質を示す非還元性の白色粉末で、安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。したがって、本発明の分岐環状四糖は、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする諸種の分野で、素材、基剤などとして配合して利用することができる。
本発明の分岐環状四糖は、包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止し、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要ならば、シクロ（環状）デキストリン類、分岐シクロデキストリン類、シクロデキストラン類、シクロフラクタン類など他の環状糖質を併用することで、包接能による安定化を強化することも有利に実施できる。シクロデキストリン類などの環状糖質としては、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種のシクロデキストリンを含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。
環状四糖は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。また、環状四糖は、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用でき、さらに、口腔内での固形物の付着、固結を防止する機能をも併せもっている。一方、本発明の分岐環状四糖は、その基本構造が環状四糖と共通であることから、カロリーのある、又は虫歯誘発菌によって発酵されやすい通常の糖質と比べると、低カロリー糖質や低う蝕性糖質としての有用性が高い。しかも、本発明の分岐環状四糖自体は、無毒、無害の糖質であり、危険性がなく、安定な素材・基剤などとして有用であることにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤又は糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、本発明の分岐環状四糖は、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難醗酵性などの性質を具備している。したがって、本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物は、糖質調味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物は、そのまま、上品な味質を不要するための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの他の甘味料と併用することも、又、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ及びスクラロースなどの１種又は２種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして好適に利用することができる。
本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物が呈する上品な味質は、甘味、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステら、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウに、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などの嗜好性向上や物性改善などをの目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への嗜好性向上剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類またはローヤルゼリーなどの各種生理活性物質、更には、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペーストなどの有効成分や活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
以上述べたような各種組成物に、本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その割合は、全重量に対する当該分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物の固形物重量の占める百分率として、通常、０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
以上に示した、環状四糖と同様の用途以外に、本発明の分岐環状四糖は、ビフィズス活性を示す場合があるので、ビフィズス因子として、飲食物、健康食品、健康補助食品、医薬品などに配合して利用することもできる。この際に、ビフィズス活性を示す他の糖質、例えば、乳化オリゴ糖、Ｎ−アセチル−Ｄ−キトサミン（Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン）、ラクツロースなどを併用することも有利に実施できる。また、本発明の分岐環状四糖は、環状四糖の水溶液中での晶出を抑制する機能があることから、環状四糖の晶出抑制剤として利用することもできる。例えば、上記のいずれかの方法で得られた環状四糖の水溶液、又は、環状四糖とともに、グルコース、マルトース、パノースなどの還元性糖質を含有する水溶液に、本発明の分岐環状四糖もしくはこれを含む糖組成物を添加すると、得られる溶液を濃縮することにより、環状四糖を、その本来の溶解度を超える濃度で含む環状四糖高含有溶液を得ることができる。また、必要に応じて、斯かる溶液は、更に水素添加処理して、溶液中に含まれる還元性糖質を糖アルコールに変換して用いることもできる。斯くして得られる環状四糖高含有溶液は、本発明の分岐環状四糖を含まない環状四糖溶液に比べて、タンク貯蔵、ポンプ輸送、タンクローリー輸送をより効率的に行うことが可能となる。したがって、本発明の分岐環状四糖は、環状四糖の工業的な取扱において極めて有用である。
以下、実験及び実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
実験１：微生物の培養物からの環状四糖の単離と同定
パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）５％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、冷却した。この培地に、バチルス グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍの条件で４８時間回転振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清を得た。得られた培養上清を、１２０℃で１５分間オートクレーブし、放冷した後、不溶物を遠心分離して除去し、上清を回収した。この上清中には、硫酸−メタノール法で陽性で、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質の存在が確認された。
上記のオートクレーブ後の上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１ｇ当り１５００単位とグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１ｇ当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整し、２時間煮沸して、本上清中の還元糖を分解した。この処理後の液を、濾過により不溶物を除去した後、イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』及び『ＷＡ３０』、三菱化学工業株式会社製造）を用いて脱色・脱塩し、更に、活性炭で脱色した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）で再度脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、凍結真空乾燥して固形物として約０．５ｇの非還元性糖質の粉末を得た。
上記で粉末として得た非還元性糖質の純度を高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）で調べた。ＨＰＬＣにおいて、カラムには『Ｓｈｏｄｅｘ ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用い、溶離液には水（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、カラム内温度を６０℃とし、溶出される糖質の検出を示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製造）を用いて行なった。第１図に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークが検出された。このピーク面積から、本糖質の純度は９９．９％以上と求められた。
上記の方法で得た非還元性糖質を、高速原子衝撃法による質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）に供した。質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数は６４８であることが判明した。
上記の方法で得た非還元性糖質を、硫酸を用いて加水分解し、通常のガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、上記で求めた質量数と非還元性という特性を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であると考えられた。
上記の方法で得た非還元性糖質を核磁気共鳴法（以下、「ＮＭＲ」と略記する）に供した。その結果、第２図に示す^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、第３図に示す^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られた。既知糖質のものとの異同を検討したところ、グレゴリー・エル・コテら、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載された環状四糖のスペクトルと一致した。
以上の結果により、上記の方法で単離した非還元性糖質を環状四糖、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝と同定した。
実験２：α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素
実験２−１：α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を含む酵素剤
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、冷却した。この培地に、バチルス・グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍの条件で４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の液体培地を約２０Ｌ入れ、加熱滅菌後、冷却して温度２７℃に調整した後、種培養を１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保持しつつ、４８時間通気撹拌培養した。この培養液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、培養上清約１８Ｌを回収した。回収した培養上清のα−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌ、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであった。
この培養上清を、限外濾過膜（商品名『ＡＰＩ−２０１３』、旭化成工業株式会社製造）を用いて液量２Ｌにまで濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵を含む酵素剤を得た。本酵素剤の環状四糖生成活性は約８．５単位／ｍｌであった。
実験２−２：精製α−イソマルトシル転移酵素
実験２−１の方法で得た、バチルス・グロビスポルスＣ９の培養上清約１８Ｌ（α−イソマルトシル転移酵素活性２６，９００単位）を、４℃の条件下、８０％飽和硫安で２４時間塩析した。生成した沈殿を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、透析内液を回収した。
上記の硫安塩析後の透析内液を、イオン交換樹脂（商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』、三菱化学株式会社製造、樹脂量１０００ｍｌ）を充填したカラムに負荷し、非吸着画分を採取した。
上記のイオン交換樹脂精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに供した。ゲルは、『セファクリル ＨＲ Ｓ−２００ゲル』（アマシャム・バイオテク株式会社製造、ゲル量５００ｍｌ）を用い、溶出は、濃度１Ｍから０Ｍまで直線的濃度勾配をもたせた硫安溶液の通液により行った。硫安濃度０Ｍ付近で溶出された、α−イソマルトシル転移酵素活性を示す画分を採取した。
上記のアフィニティーカラム精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、疎水カラムクロマトグラフィーに供した。ゲルは、『ブチルトヨパール ６５０Ｍゲル』（東ソー株式会社製造、ゲル量３５０ｍｌ）を用い、溶出は、濃度１Ｍから０Ｍまで直線的濃度勾配をもたせた硫安溶液の通液により行った。硫安濃度０．３Ｍ付近で溶出された、α−イソマルトシル転移酵素活性を示す画分を採取した。
上記の疎水カラム精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、再度上記と同じ条件でアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、活性画分を採取した。
上記の２度目のアフィニティーカラム精製画分は、アクリルアミド濃度７．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量１１２，０００±２０，０００ダルトンの位置に単一の蛋白質バンドを示した。また、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定と蛋白質定量により求めた比活性は約２６．９単位／ｍｇ蛋白質であった。斯くしてα−イソマルトシル転移酵素の精製標品を得た。
実験２−３：精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素
実験２−１の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９の培養上清約１８Ｌ（α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性８，１１０単位）を、実験２−２の方法にしたがって、８０％飽和硫安による塩析、透析、イオン交換樹脂による精製に供した。
上記のイオン交換樹脂精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに供した。ゲルは、『セファクリル ＨＲ Ｓ−２００ゲル』（アマシャム・バイオテク株式会社製造、ゲル量５００ｍｌ）を用い、溶出は、濃度１Ｍから０Ｍまで直線的濃度勾配をもたせた硫安溶液の通液に続いて濃度０ｍＭから１００ｍＭまで直線的濃度勾配をもたせたマルトテトラオース溶液の通液により行った。マルトテトラオース濃度３０ｍＭ付近で溶出された、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を示す画分を採取した。
上記のアフィニティーカラム精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、疎水カラムクロマトグラフィーに供した。ゲルは、『ブチルトヨパール ６５０Ｍゲル』（東ソー株式会社製造、ゲル量３５０ｍｌ）を用い、溶出は、濃度１Ｍから０Ｍまで直線的濃度勾配をもたせた硫安溶液の通液により行った。硫安濃度０．３Ｍ付近で溶出された、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を示す画分を採取した。
上記の疎水カラム精製画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、遠心分離により不溶物を除去した後、再度上記と同じ条件でアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、活性画分を採取した。
上記の２度目のアフィニティーカラム精製画分は、アクリルアミド濃度７．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量１４０，０００±２０，０００ダルトンの位置に単一の蛋白質バンドを示した。また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定と蛋白質定量により求めた比活性は約１３．６単位／ｍｇ蛋白質であった。斯くしてα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製標品を得た。
なお、以上の実験２−１乃至実験２−３では、バチルス・グロビスポルスＣ９からの酵素の調製結果を示したけれども、バチルス・グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）からも、上記の方法に準じて操作することにより両酵素の精製標品を得ることができる。因みに、実験２−１乃至実験２−３に準じて微生物Ｃ１１から精製した両酵素の性質は以下のとおりであった。
（Ａ） α−イソマルトシル転移酵素
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量：１０２，０００±２０，０００ダルトン
比活性：約２９．６単位／ｍｇ蛋白質
（Ｂ） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量：１３７，０００乃至２０，０００ダルトン
比活性：１３．４単位／ｍｇ蛋白質
実験３：澱粉部分分解物への酵素作用による環状四糖の生成とこれに副生成する分岐環状四糖
実験３−１：酵素反応
３．７ｋｇの澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製造）を、３５Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、この溶液に、実験２−１の方法で得た酵素剤を、環状四糖生成活性として１７５００単位相当加え、３０℃で２日間保持して反応させ、その後反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。この反応液を４５℃に調整した後、１１ｇ（１３７，５００単位）のα−アミラーゼ剤（商品名『ネオスピターゼＰＫ２』、ナガセ生化学工業株式会社製造）及び４４ｇ（１４０，８００単位）のグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製造）を加え、ｐＨ６．０に調整した後、４５℃で１日間保持して反応させ、その後反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。この反応液を常法により濾過し、濾液を逆浸透膜を用いて固形物濃度約１６％（ｗ／ｗ）にまで濃縮した。この濃縮液を常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮に供し、約３．５ｋｇの固形物を含む糖液を約６．１ｋｇ得た。
この糖液を、実験１の方法で単離した環状四糖と公知の糖質を標準試料として用いて、以下のＨＰＬＣにより分析した。すなわち、クロマトグラフ装置『ＣＣＰＭ』（東ソー株式会社製造）、カラム『ＡＱ−３０３ ＯＤＳ』（株式会社ワイエムシー製造、内径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ）、溶離液として水（流速０．５ｍｌ／分）を用い、カラム温度を４０℃とし、溶出される糖質を示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製造）により検出した。この分析により検出された成分のうちピーク面積が比較的大きいものを、保持時間と、個々に付した名称及びピーク面積の相対値とともに表２に示す。

因みに、上記ＨＰＬＣにおいては、多くの場合、分子量の大きいものほど保持時間が長くなるという傾向がある。このことから、表１にまとめた結果は、本実験による酵素反応が、通常、環状四糖とともに、環状四糖より分子量の大きい、すなわち、構成糖の数がより多い糖質を副生成することを示している。
実験３−２：環状四糖の調製
実験３−１の方法で得た糖液６．１ｋｇを、イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０』、Ｎａ型、オルガノ製造、樹脂量約２２５Ｌ）を充填したカラム（内径１３．５ｃｍ×長さ１６０ｃｍのカラムを１０本直列に連結）を用いてクロマト分離に供した。移動相には水（流速４５Ｌ／ｈ）を用い、カラム温度は６０℃とした。カラムからの溶出液を分画し、各画分の糖組成を以下の実験３−１に示したＨＰＬＣにより求めた。環状四糖を比較的多く含む画分を合一し、１５３０ｇの固形物を含む糖液を得た。上記と同じ条件によるＨＰＬＣで分析し、ピーク面積に基づいて計算したところ、この合一した画分（環状四糖高含有画分）は、全糖質あたり、環状四糖を７９．８％、イソマルトースを６．１％の割合で含むものであった。
環状四糖高含有画分の固形物として１３１０ｇ相当を、ｐＨ５．０、５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１ｇ当り１０００単位とグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１ｇ当り６０単位添加して２０時間処理した。この処理後の液を、濾過により不溶物を除去した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）を用いて脱塩し、濃縮した。この濃縮液を上記のクロマト分離の条件にしたがって分画し、環状四糖の純度が９７％以上の画分を採取した。採取した画分を常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮し、固形物約１２６０ｇを含む糖液を得た。この糖液を、固形物濃度約５０％（ｗ／ｗ）に調整した後、円筒状のプラスチック容器に入れ、穏やかに回転させながら、温度を６５℃から２０℃にまで約２０時間かけて降下させ、結晶を析出させた。分蜜により析出した結晶を採取し、６０℃で３時間常圧乾燥し、５４４ｇの結晶粉末を得た。本品は、純度９９．９％の環状四糖の結晶であり、水分を１２．７％含むものであった。実験３−３：副生成物の単離
実験３−１の方法で得た糖液６．１ｋｇを、実験３−２に記載したクロマト分離にしたがって分画し、各画分の糖組成を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析した。副生成物１及び副生成物２を比較的多く含む画分を合一する（画分１）一方、副生成物３及び副生成物４を比較的多く含む画分を別途合一した（画分２）。画分１は固形物３２０ｇを含み、画分２は固形物１５０ｇを含んでいた。ＨＰＬＣによるクロマトグラムのピーク面積より両画分の糖組成を求めた。画分１は、全糖質あたり、副生成物１を４７．９％、副生成物２を１４．９％含んでいた。画分２は、上記ＨＰＬＣにおける保持時間が副生成物２より長い成分（副生成物３及び４を含む）を、全糖質あたり２５％以上含んでいた。
上記の画分１を水酸化ナトリウムでｐＨ１１以上に保ちつつ、９５℃以上に１時間保持して還元糖を分解した。この後、常法にしたがって、脱色、脱塩、濾過、濃縮した。濃縮液のうち、固形物重量として５０ｇ相当を、分取用液体クロマトグラフィーに供した。分取用カラムとして『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５ Ｓ−１５ １２０Ａ』（株式会社ワイエムシー製造）を、移動相として精製脱イオン水を用いた。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、副生成物１を純度９７％以上で含む画分を固形物として２０ｇと、副生成物２を純度９６％以上で含む画分を固形物として５ｇ得た。
上記の画分２を、画分１の場合と同様に、還元糖の分解に供した後、脱色、脱塩、濾過、濃縮した。濃縮液のうち、固形物重量として１０ｇ相当を、引き続き画分１の場合と同様にして、分取用クロマトグラフィーに供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、副生成物３を純度９７％以上で含む画分を固形物として７７ｍｇと、副生成物４を純度９７％以上で含む画分を固形物として７７ｍｇ得た。
実験３−４：副生成物の同定
実験３−３で得た副生成物１乃至４の高含有画分を次に示す分析の全て又は一部に供した。（１）質量数の決定は高速原子衝撃法による質量分析により、（２）還元力の測定はソモジ−ネルソン法により、（３）構成糖の決定は硫酸による加水分解の後、糖質を分析するための通常のガスクロマトグラフィーにより、（４）生化学的解析はα−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社）処理の後、実験３−１に記載のＨＰＬＣにより、（５）結合様式の推定は常法によるメチル化分析により、（６）比旋光度の測定は常法により、（７）^１３Ｃ−ＮＭＲは常法により行った。結果を以下に示す。
副生成物１は、質量数８１０であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースのみであり、質量数を考慮すると、副生成物１はＤ−グルコース５分子からなると考えられた。α−グルコシダーゼ処理によって、環状四糖とグルコースを等モル生成した。メチル化分析では、２，３−ジメチル化物、２，３，４−トリメチル化物、２，４，６−トリメチル化物、及び２，３，４，６−テトラメチル化物が０．８３：１．０２：１．６９：１のモル比で確認され、これらの構成比は１：１：２：１と考えられた。比旋光度は［α］^２５ｄ＋２４６°であった。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第４図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験３−４及び実験４−３における他の糖質についての帰属の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表４に示している。
以上の結果から、副生成物１を化学式１に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式１：

副生成物２は、質量数９７２であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースのみであり、質量数を考慮すると、副生成物２はＤ−グルコース６分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，４−ジメチル化物、２，３，４−トリメチル化物、２，４，６−トリメチル化物、及び２，３，４，６−テトラメチル化物が０．９４：２．０１：１．７２：１のモル比で確認され、これらの構成比は１：２：２：１と考えられた。比旋光度は［α］^２５ｄ＋２４６°であった。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第５図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験３−４及び実験４−３における他の糖質についての帰属の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表４に示している。
以上の結果から、副生成物２を化学式３に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式３：

副生成物３は、質量数１２９６であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースのみであり、質量数を考慮すると、副生成物３はＤ−グルコース８分子からなると考えられた。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第６図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験３−４及び実験４−３における他の糖質についての帰属の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表４に示している。
以上の結果から、副生成物３を化学式４に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式４：

副生成物４は、質量数１１３４であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースのみであり、質量数を考慮すると、副生成物４はＤ−グルコース７分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，３−ジメチル化物、２，４−ジメチル化物、２，３，４−トリメチル化物、２，４，６−トリメチル化物、及び２，３，４，６−テトラメチル化物が、０．７８：０．７８：１．４７：１．６０：２のモル比で確認され、これらの構成比は１：１：１：２：２と考えられた。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第７図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験３−４及び実験４−３における他の糖質につての帰属の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表４に示している。
以上の結果から、副生成物４を化学式５に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式５：

以上実験３−４で同定された分岐環状四糖の分岐部分の構成糖ならびに結合様式を総合すると、実験３−１の酵素反応による場合、副生成する分岐環状四糖は、通常、次の特徴を示すと考えられる。すなわち、該分岐環状四糖は、一般式１に示される基本構造を有し、一般式１におけるＲ_１乃至Ｒ_１２の１個又は２個以上が、置換基を有することのあるα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）であり、比較的多くの場合は、Ｒ_２及び／又はＲ_８がα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_２及びＲ_８の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である。
実験４：単離酵素による環状四糖へのグリコシル転移
実験４−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるグリコシル転移
実験３−２の方法で得た環状四糖を２０％（ｗ／ｗ）で、マルトペンタオース（株式会社林原生物化学研究所製造）を１０％（ｗ／ｗ）で含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、実験２−３の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトペンタオース１ｇあたり３単位加えて、３０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液をｐＨ５．０に調製した後、反応液中の固形物１ｇあたり５００単位のグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）５００単位を加え、５０℃で１時間反応させ、その後、反応液を１０分間煮沸して酵素を失活させた。
グルコアミラーゼ処理後の反応液を、常法により、メンブラン濾過、脱塩した後、実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣでの保持時間により実験３−３及び実験３−４で単離・同定した分岐環状四糖との異同を調べたところ、この反応液には、全糖質あたり、化学式１で表される分岐環状四糖が１７．３％（ＨＰＬＣにおけるピーク面積比による）含まれていることが判明した。この結果は、環状四糖にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させることにより本発明の分岐環状四糖を効率よく生成させることができることを示している。
実験４−２：α−イソマルトシル転移酵素によるグリコシル転移
実験３−２の方法で得た環状四糖を２０％（ｗ／ｗ）で、パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）を１０％（ｗ／ｗ）で含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、実験２−２の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素をパノース１ｇあたり３０単位加えて、３０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
この反応液を、常法により、メンブラン濾過、脱塩した後、実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣでの保持時間により実験３−３及び実験３−４で単離・同定した分岐環状四糖との異同を調べたところ、この反応液には、全糖質あたり、化学式３で表される分岐環状四糖が４．９％（ＨＰＬＣにおけるピーク面積比による）含まれていることが判明した。この結果は、環状四糖にα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより本発明の分岐環状四糖を効率よく生成させることができることを示している。
実験４−３：シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）によるグリコシル転移
実験４−３（ａ）：酵素反応
実験３−２の方法で得た環状四糖１０ｇとα−シクロデキストリン（株式会社林原生物化学研究所製造）１０ｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）３０ｇに溶解し、バチルス・ステアロサーモフィラスのＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をα−シクロデキストリン１ｇあたり１０単位加えて５０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液に５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）３５０ｇとグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）２０００単位を加え、４０℃で４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の方法で得たＣＧＴａｓｅによる反応液及び、ＣＧＴａｓｅに続いてグルコアミラーゼを作用させた反応液を実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。別途、これと同じ条件で、環状四糖及びグルコースを分析し、両反応液中に含まれる成分の特定を試みた。ＣＧＴａｓｅ反応液の分析結果を第８ａ図に、グルコアミラーゼ反応液の分析結果を第８ｂ図にそれぞれ示す。
第８ａ図及び第８ｂ図に共通して認められる保持時間約１０分のピークＸは環状四糖のピークであり、第８ｂ図に特有の保持時間約６分のピークＧはグルコースのピークである。第８ａ図及び第８ｂ図に示すとおり、ＣＧＴａｓｅ反応液には、環状四糖より保持時間の長い諸種の新たな成分が含まれ（第８ａ図）、グルコアミラーゼ反応液においては、これらの成分は、２つの成分（ピーク１及びピーク２）を除いてほぼ完全に消失していた（第８ｂ図）。以上の結果は、第８ａ図に認められる環状四糖以外のピークは、環状四糖にグルコシル基が１個以上結合したグリコシル誘導体のピークであり、第８ｂ図において環状四糖より長い保持時間の位置に認められる２個のピーク（ピーク１及びピーク２）は、環状四糖に対して、グルコシル基が１箇所に１個結合したグルコシル誘導体であることを示唆している。グルコアミラーゼ反応液中のこれら２個の成分の保持時間を、個々に付した名称及びピーク面積の相対値とともに表３に示す。

実験４−３（ｂ）：反応生成物の単離と同定
実験４−３（ａ）の方法で得たグルコアミラーゼ反応液を膜濾過した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）を用いて脱塩し、濃縮した。この濃縮液を実験３−２に示したクロマト分離の条件にしたがって分画し、各画分を実験３−１に示したＨＰＬＣで分析し、ＣＧＴａｓｅ生成物１及び２をそれぞれ純度９７％以上で含む画分を採取した。
上記のＣＧＴａｓｅ生成物１の高含有画分を常法により^１３Ｃ−ＮＭＲに供したところ、得られたスペクトルは、実験３−４に結果を示した副生成物１（化学式１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（第４図）と一致した。このことから、ＣＧＴａｓｅ生成物１を、化学式１で表される分岐環状四糖と同定した。
上記のＣＧＴａｓｅ生成物２の高含有画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。ＣＧＴａｓｅ生成物２は、質量数９７２であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースのみであり、質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース６分子からなると考えられた。α−グルコシダーゼ処理によって、環状四糖とグルコースを１：２のモル比で生成した。メチル化分析では、２，３−ジメチル化物、２，４，６−トリメチル化物、及び２，３，４，６−テトラメチル化物が０．８９：１：１．２４のモル比で確認され、これらの構成比は１：１：１と考えられた。比旋光度は［α］^２５ｄ＋２４１°であった。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第９図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属を、上記実験３−４で述べた他の糖質ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて表４に示す。

以上の結果から、ＣＧＴａｓｅ生成物２を化学式２に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式２：

以上実験４−３（ｂ）で同定された分岐環状四糖の分岐部分の構成糖ならびに結合様式、実験４−３（ａ）に示した酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果を総合すると、実験４−３（ａ）の酵素反応による場合、生成する分岐環状四糖は、通常、次の特徴を示すと考えられる。すなわち、該分岐環状四糖は一般式１で表される基本構造を有し、一般式１におけるＲ_１乃至Ｒ_１２の１個又は２個以上、比較的多くの場合、Ｒ_１及び／又はＲ_７が、置換基を有することのある｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である。
実験４−４：バチルス・サーキュランスのβ−ガラクトシダーゼによるグリコシル転移
実験４−４（ａ）：酵素反応
実験３−２の方法で得た環状四糖２０ｇとラクトース（試薬特級、和光純薬工業株式会社製造）２０ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）９３．３ｇに溶解し、バチルス・サーキュランスのβ−ガラクトシダーゼ（商品名『ビオラクタン５』、大和化成株式会社製造）をラクトース１ｇあたり３単位加えて４０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液と環状四糖の水溶液とを実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。その結果、反応液中に、環状四糖（保持時間約１０分）とは保持時間の異なる新たな成分の生成が少なくとも３種類認められた。この３種類の新たに認められた成分の保持時間を、個々に付した名称及びピーク面積の相対値とともに表５に示す。

実験４−４（ｂ）：反応生成物の単離と同定
実験４−４（ａ）の方法で得た反応液に水酸化ナトリウム４．８ｇを加え、１００℃で１時間保持して還元糖を分解した。この反応液を常法により脱塩、濾過、濃縮した後、分取用液体クロマトグラフィーに供した。分取用カラムとして『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱＲ３５５−１５ＡＱ，Ｓ−１０／２０μｍ，１２０Ａ』（株式会社ワイエムシー製造）を、移動相として精製脱イオン水を用いた。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、β−ガラクトシダーゼ生成物１を純度９７％以上で含む画分を採取した。
上記の画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。β−ガラクトシダーゼ生成物１は、質量数８１０であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースとＤ−ガラクトースであり、その構成比は４：１であった。質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース４分子とＤ−ガラクトース１分子からなると考えられた。比旋光度は［α］^２５ｄ＋２００°であった。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第１０図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験４−５乃至実験４−７における他の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表７に示している。
以上の結果から、β−グルコシダーゼ生成物１を化学式６に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式６：

実験４−５：アスペルギルス・ニガーのβ−ガラクトシダーゼによるグリコシル転移
実験４−５（ａ）：酵素反応
実験３−２の方法で得た環状四糖２０ｇとラクトース（試薬特級、和光純薬工業株式会社製造）２０ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）９３．３ｇに溶解し、アスペルギルス・ニガーのβ−ガラクトシダーゼ（商品名『ラクターゼＹＡ−Ｏ』、ヤクルト薬品工業株式会社製造）をラクトース１ｇあたり１０単位加えて４０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液と環状四糖の水溶液とを実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。その結果、反応液中に、環状四糖（保持時間約１０分）とは保持時間の異なる新たな成分の生成が少なくとも３種類認められた。この３種類の新たに認められた成分の保持時間を、個々に付した名称及びピーク面積の相対値とともに表６に示す。

実験４−５（ｂ）：反応生成物の単離と同定
実験４−５（ａ）の方法で得た反応液に水酸化ナトリウム４．８ｇを加え、１００℃で１時間保持して還元糖を分解した。この反応液を常法により脱塩、濾過、濃縮した後、分取用液体クロマトグラフィーに供した。分取用カラムとして『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱＲ３５５−１５ＡＱ，Ｓ−１０／２０μｍ，１２０Ａ』（株式会社ワイエムシー製造）を、移動相として精製脱イオン水を用いた。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、β−ガラクトシダーゼ生成物４を純度９４％以上で含む画分と、β−ガラクトシダーゼ生成物５を純度９９％以上で含む画分を採取した。
上記のβ−ガラクトシダーゼ生成物４の高含有画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。β−ガラクトシダーゼ生成物４は、質量数９７３であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースとＤ−ガラクトースであり、その構成比は２：１であった。質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース４分子とＤ−ガラクトース２分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，４−ジメチルグルコース、２，３，４−トリメチルグルコース、２，４，６−トリメチルグルコース、２，３，４−トリメチルガラクトース、及び２，３，４，６−テトラメチルガラクトースが、１：１．８６：０．９６：１．３４：１．１２のモル比で確認され、これらの構成比は１：２：１：１：１と考えられた。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第１１図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験４−５乃至実験４−７における他の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表７に示している。
以上の結果から、β−グルコシダーゼ生成物４を化学式８に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式８：

上記で得たβ−ガラクトシダーゼ生成物５の高含有画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。β−ガラクトシダーゼ生成物５は、質量数８１０であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースとＤ−ガラクトースであり、その構成比は４：１であった。質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース４分子とＤ−ガラクトース１分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，４−ジメチルグルコース、２，３，４−トリメチルグルコース、２，４，６−トリメチルグルコース、及び２，３，４，６−テトラメチルガラクトースが、１：２．０２：１．００：１．０４のモル比で確認され、これらの構成比は１：２：１：１と考えられた。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第１２図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験４−５乃至実験４−７における他の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表７に示している。
以上の結果から、β−グルコシダーゼ生成物５を化学式７に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式７：

以上実験４−５（ｂ）で同定された分岐環状四糖の分岐部分の構成糖ならびに結合様式を総合すると、実験４−５（ａ）の酵素反応による場合、生成する分岐環状四糖は、通常、次の特徴を示すと考えられる。すなわち、該分岐環状四糖は一般式１で表される基本構造を有し、一般式１におけるＲ_１乃至Ｒ_１２の１個又は２個以上、比較的多くの場合、Ｒ_６及び／又はＲ_１２が、置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である。
実験４−６：α−ガラクトシダーゼによるグリコシル転移
実験４−６（ａ）：酵素反応
実験３−２の方法で得た環状四糖５ｇとメリビオース（試薬特級、和光純薬工業株式会社製造）５ｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１５ｇに溶解し、モルティエレラのα−ガラクトシダーゼ（商品名『メリビアーゼ』、北海道糖業株式会社製造）をメリビオース１ｇあたり１００単位加えて４０℃で３０時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液と環状四糖の水溶液とを実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。その結果、反応液中に、環状四糖（保持時間約１０分）とは保持時間の異なる、保持時間１３．３分の、少なくとも１種類の新たな成分の生成が認められた。このＨＰＬＣ分析において、全ピーク面積に対する新たに認められた成分のピーク面積の百分率は約１．０％であった。
実験４−６（ｂ）：反応生成物の単離と同定
実験４−６（ａ）の方法で得た反応液を常法により脱塩、濾過、濃縮した後、実験４−５（ｂ）の方法にしたがって分取用液体クロマトグラフィーに供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、上記で確認したα−ガラクトシダーゼ生成物を純度９８％以上で含む画分を採取した。
上記のα−ガラクトシダーゼ生成物の高含有画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。β−ガラクトシダーゼ生成物４は、質量数８１０であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースとＤ−ガラクトースであり、その構成比は４：１であった。質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース４分子とＤ−ガラクトース１分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，４−ジメチルグルコース、２，３，４−トリメチルグルコース、２，４，６−トリメチルグルコース、及び２，３，４，６−テトラメチルガラクトースが、１：２．０９：１．０２：１．０２のモル比で確認され、これらの構成比は１：２：１：１と考えられた。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第１３図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属は、実験４−５乃至実験４−７における他の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて後記表７に示している。
以上の結果から、本実験で得たα−グルコシダーゼ生成物を化学式９に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式９：

実験４−７：リゾチームによるグリコシル転移
実験４−７（ａ）：酵素反応
実験３−２の方法で得た環状四糖２０ｇとキチンオリゴ糖（商品名『ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ』、焼津水産化学工業株式会社製造、重合度２乃至６のキチンオリゴ糖を乾燥重量換算で約５５％含む）１０ｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）４５ｇに溶解し、卵白リゾチーム（生化学工業株式会社製造）を２．８ｇ加えて６０℃で９日間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液を、ＨＰＬＣの前処理として、遠心分離し、その上清を限外濾過膜（商品名『ＳＥＰ−００１３』、旭化成工業株式会社製造）を用いて濾過して除タンパクした後、常法により脱塩した。この前処理液と環状四糖の水溶液とを実験３−１に示したＨＰＬＣにより分析した。その結果、反応液中に、環状四糖（保持時間約１０分）とは保持時間の異なる、保持時間３６．６分の、少なくとも１種の新たな成分の生成が認められた。このＨＰＬＣ分析において、全ピーク面積に対する新たに認められた成分のピーク面積の百分率は約７．３％であった。
実験４−７（ｂ）：反応生成物の単離と同定
実験４−７（ａ）の方法で得た反応液を、実験４−７（ａ）に記載のＨＰＬＣの前処理と同様に処理した後、実験４−５（ｂ）の方法にしたがって分取用液体クロマトグラフィーに供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、上記で確認したリゾチーム生成物を純度９９％以上で含む画分を採取した。
上記のリゾチーム生成物の高含有画分を実験３−４に示した７項目の分析に準じて分析した。リゾチーム生成物は、質量数８５１であり、実質的に非還元性の糖質であった。構成糖はＤ−グルコースとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−アセチル−Ｄ−キトサミン）であり、その構成比は４：１であった。質量数を考慮すると、同生成物はＤ−グルコース４分子とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１分子からなると考えられた。メチル化分析では、２，４−ジメチルグルコース、２，３，４−トリメチルグルコース、及び２，４，６−トリメチルグルコースが、１．０２：１：１．６７のモル比で確認され、これらの構成比は１：１：２と考えられた。比旋光度は［α］^２５ｄ＋２４６°であった。^１３Ｃ−ＮＭＲでは第１４図に示すスペクトルが得られた。シグナルの帰属を、上記実験４−４乃至４−６で述べた他の結果ならびに環状四糖についての帰属の結果とあわせて表７に示す。

以上の結果から、本実験で得たリゾチーム生成物を化学式１０に示す構造を有する分岐環状四糖と同定した。
化学式１０：

実験５：分岐環状四糖の結晶
実験３−３の方法で得た副生成物１（化学式１で表される分岐環状四糖。以下、化学式番号をもって、本発明による個々の分岐環状四糖を示すものとする。）及び副生成物２（化学式３）、実験４−３（ｂ）の方法で得たＣＧＴａｓｅ生成物２（化学式２）、実験４−４（ｂ）の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ生成物１（化学式６）、実験４−５（ｂ）の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ生成物５（化学式７）のそれぞれの高含有画分を濃縮したところ、いずれも結晶の析出が認められた。十分に結晶を析出させた後、個々に、常法により分蜜して結晶を採取した。採取した結晶を常温で乾燥させ、以上５種類の分岐環状四糖の結晶粉末を得た。実験３−１に示したＨＰＬＣで分析したところ、化学式１、化学式２、化学式６及び化学式７の結晶は純度９９％以上、化学式３の結晶の純度は９８％以上であった。
上記で得た結晶粉末を結晶の形状、Ｘ線回折、色、水分、融点、熱特性の全て又は一部についてそれぞれ調べた。結晶の形状は光学顕微鏡により観察した。Ｘ線回折は、通常の粉末Ｘ線回折法により調べた。水分はカールフィッシャー法により、融点は市販の融点測定装置（商品名『ＭＰ−２１型』、ヤマト科学株式会社製造）により測定した。熱特性は、市販のデジタル熱分析計（商品名『ＴＧ／ＤＴＡ２２０型』、セイコー電子工業株式会社製造）を用いて熱重量分析を行うことにより調べた。
化学式１、化学式２及び化学式３を顕微鏡で観察したところ、化学式１は柱状、化学式２は針状、化学式３は柱状であった。
上記の全ての結晶のＸ線回折図形を、それぞれ、第１５図乃至第１９図に示す。Ｘ線回折において認められた主たる回折角（２θ）と、色、水分、融点について調べた結果とともに表８にまとめて示す。

上記の全ての結晶の熱特性についての分析結果を、それぞれ、第２０図乃至第２４図に示す。第２０図に示すとおり、化学式１は、１５０℃までの上昇により４分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、３００℃前後からは化学式１自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。このことから、化学式１の５乃至６含水結晶は、常圧において温度を１５０℃まで上昇させると、１分子あたり１乃至２分子の結晶水を含む結晶に変換されると考えられる。
第２１図に示すとおり、化学式２は、昇温に伴って、約１５０℃までに６乃至７分子の水に相当する重量減少が認められた。さらに、３００℃前後からは化学式２自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。このことから、化学式２の１１乃至１２含水結晶は、常圧において温度を１５０℃まで上昇させると、１分子あたり４乃至５分子の結晶水を含む結晶に変換されると考えられる。
第２２図に示すとおり、化学式３は、昇温に伴って、約１１０℃までに６乃至７分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、３００℃前後からは化学式３自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。このことから、化学式３の１０乃至１１含水結晶は、常圧において温度を１１０℃まで上昇させると、１分子あたり３乃至４分子の結晶水を含む結晶に変換されると考えられる。
第２３図に示すとおり、化学式６は、昇温に伴って、約１２０℃までに７乃至８分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、３００℃前後からは化学式６自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。このことから、化学式６の９乃至１０含水結晶は、常圧において温度を１２０℃まで上昇させると、１分子あたり１乃至２分子の結晶水を含む結晶に変換されると考えられる。
第２４図に示すとおり、化学式７は、昇温に伴って、約１３０℃までに５乃至６分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、３００℃前後からは化学式７自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。このことから、化学式７の５乃至６含水結晶は、常圧において温度を１３０℃まで上昇させると、１分子あたり０乃至１分子の結晶水を含む結晶に変換されると考えられる。
実施例Ａ−１：化学式１及び２で表される分岐環状四糖含有シラップ
実験３−２の方法で得た環状四糖１重量部とα−シクロデキストリン（株式会社林原生物化学研究所製造）１重量部を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）３重量部に溶解し、バチルス・ステアロサーモフィラスのＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をα−シクロデキストリン１ｇあたり１０単位加えて５０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の反応液に５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）３５０ｇを加え、さらに、グルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）をα−シクロデキストリンの始発添加量１ｇあたり２００単位加え、４０℃で４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
上記の酵素失活後の反応液を膜濾過した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）を用いて脱塩し、濃縮した。この濃縮液を実験３−２に示したクロマト分離の条件にしたがって分画し、各画分を実験３−１に示したＨＰＬＣで分析し、化学式１及び化学式２で表される分岐環状四糖をそれぞれ純度８５％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮し、固形物濃度約５０％（ｗ／ｗ）のシラップを得た。
本品は、得られたそのままの形態で、あるいは、さらに濃縮や、乾燥、結晶化、粉砕等の処理を施した上で、非晶質粉末、含蜜結晶、ブロックなどの形態で、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−２：化学式３で表される分岐環状四糖含有シラップ
実験３−２の方法で得た環状四糖２重量部、パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）１重量部、及び１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）７重量部を混合、溶解し、実験２−２の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素をパノース１ｇあたり３０単位加えて、３０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
この酵素失活後の反応液を膜濾過した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）を用いて脱塩し、濃縮した。この濃縮液を実験３−２に示したクロマト分離の条件にしたがって分画し、各画分を実験３−１に示したＨＰＬＣで分析し、化学式３で表される分岐環状四糖を純度８０％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮し、固形物濃度約４０％（ｗ／ｗ）のシラップを得た。
本品は、得られたそのままの形態で、あるいは、さらに濃縮や、乾燥、結晶化、粉砕等の処理を施した上で、非晶質粉末、含蜜結晶、ブロックなどの形態で、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−３：化学式６で表される分岐環状四糖含有シラップ
実験３−２の方法で得た環状四糖２重量部、ラクトース２重量部、及び２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）９重量部を混合、溶解し、バチルス・サーキュランスのβ−ガラクトシダーゼ（商品名『ビオラクタン５』、大和化成株式会社製造）をラクトース１ｇあたり３単位加えて４０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
この酵素失活後の反応液に水酸化ナトリウム０．５重量部加え、１００℃で１時間保持して還元糖を分解した。この反応液を常法により脱塩、濾過、濃縮した後、分取用液体クロマトグラフィーに供した。分取用カラムとして『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱＲ３５５−１５ＡＱ，Ｓ−１０／２０μｍ，１２０Ａ』（株式会社ワイエムシー製造）を、移動相として精製脱イオン水を用いた。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式６で表される分岐環状四糖を純度８５％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮し、固形物濃度約４０％（ｗ／ｗ）のシラップを得た。
本品は、得られたそのままの形態で、あるいは、さらに濃縮や、乾燥、結晶化、粉砕等の処理を施した上で、非晶質粉末、含蜜結晶、ブロックなどの形態で、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−４：化学式７で表される分岐環状四糖含有シラップ
実験３−２の方法で得た環状四糖２重量部、ラクトース２重量部、及び２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）９重量部に溶解し、アスペルギルス・ニガーのβ−ガラクトシダーゼ（商品名『ラクターゼＹＡ−Ｏ』、ヤクルト薬品工業株式会社製造）をラクトース１ｇあたり１０単位加えて４０℃で２４時間反応させ、その後、反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。
この酵素失活後の反応液に水酸化ナトリウム０．５重量部を加え、１００℃で１時間保持して還元糖を分解した。この反応液を常法により脱塩、濾過、濃縮した後、分取用液体クロマトグラフィーに供した。分取用カラムとして『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱＲ３５５−１５ＡＱ，Ｓ−１０／２０μｍ，１２０Ａ』（株式会社ワイエムシー製造）を、移動相として精製脱イオン水を用いた。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式７で表される分岐環状四糖を純度８５％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮し、固形物濃度約４５％（ｗ／ｗ）のシラップを得た。
本品は、得られたそのままの形態で、あるいは、さらに濃縮や、乾燥、結晶化、粉砕等の処理を施した上で、非晶質粉末、含蜜結晶、ブロックなどの形態で、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−５：化学式１及び２で表される分岐環状四糖の結晶
実施例Ａ−１にしたがって、ＣＧＴａｓｅ反応に続いてグルコアミラーゼ反応を行い、酵素失活させた反応液を、実施例Ａ−１と同様にクロマト分離に供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式１及び２で表される分岐環状四糖を純度９７％以上で含む画分をそれぞれ採取した。採取した画分を濃縮後、それぞれに、実験５で得た化学式１及び２の結晶を種晶として加え、結晶を十分に析出させた。常法により分蜜し、結晶を採取し、採取した結晶を常温で乾燥させて、化学式１及び化学式２で表される分岐環状四糖それぞれの結晶（いずれも純度９９％以上）を得た。実験５に示した水分測定により、化学式１の結晶が５乃至６含水であり、化学式２の結晶が１１乃至１２含水であることを確認した。
本品は、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−６：化学式３で表される分岐環状四糖の結晶
実施例Ａ−２にしたがって、β−ガラクトシダーゼ反応を行い、酵素失活させた反応液を、実施例Ａ−２と同様にクロマト分離に供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式３で表される分岐環状四糖を純度９７％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮後、この濃縮液に、実験５で得た化学式３の結晶を種晶として加え、結晶を十分に析出させた。常法により分蜜し、結晶を採取し、採取した結晶を常温で乾燥させて、化学式３で表される分岐環状四糖の結晶（純度９９％以上）を得た。実験５に示した水分測定によりこの結晶が１０乃至１１含水であることを確認した。
本品は、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−７：化学式６で表される分岐環状四糖の結晶
実施例Ａ−３にしたがって、α−イソマルトシル転移酵素による反応を行い、酵素失活させた反応液を、実施例Ａ−３と同様にクロマト分離に供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式６で表される分岐環状四糖を純度９６％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮後、この濃縮液に、実験５で得た化学式６の結晶を種晶として加え、結晶を十分に析出させた。常法により分蜜し、結晶を採取し、採取した結晶を常温で乾燥させて、化学式６で表される分岐環状四糖の結晶（純度９９％以上）を得た。実験５に示した水分測定によりこの結晶が９乃至１０含水であることを確認した。
本品は、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−８：化学式７で表される分岐環状四糖の結晶
実施例Ａ−４にしたがって、β−ガラクトシダーゼによる反応を行い、酵素失活させた反応液を、実施例Ａ−４と同様にクロマト分離に供した。溶出液を実験３−１に記載のＨＰＬＣにより分析し、化学式７で表される分岐環状四糖を純度９７％以上で含む画分を採取した。採取した画分を濃縮後、この濃縮液に、実験５で得た化学式７の結晶を種晶として加え、結晶を十分に析出させた。常法により分蜜し、結晶を採取し、採取した結晶を常温で乾燥させて、化学式７で表される分岐環状四糖の結晶（純度９９％以上）を得た。実験５に示した水分測定によりこの結晶が５乃至６含水であることを確認した。
本品は、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−９：分岐環状四糖含有シラップ
３．７ｋｇの澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製造）を、３５Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、この溶液に、実験２−１の方法で得た酵素剤を、環状四糖生成活性として１７，５００単位相当加え、３０℃で２日間保持して反応させ、その後反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。この反応液を４５℃に調整した後、１１ｇ（１３７，５００単位）のα−アミラーゼ剤（商品名『ネオスピターゼＰＫ２』、ナガセ生化学工業株式会社製造）及び４４ｇ（１４０，８００単位）のグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製造）を加え、ｐＨ６．０に調整した後、４５℃で１日間保持して反応させ、その後反応液を２０分間煮沸して酵素を失活させた。この反応液を常法により濾過し、濾液を逆浸透膜を用いて固形物濃度約１６％（ｗ／ｗ）にまで濃縮した。この濃縮液を常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮して、固形物当り分岐環状四糖１２％、環状四糖４４％、グルコース２５％、及びオリゴ糖１９％からなる固形分を３．５ｋｇ含むシラップを約６．１ｋｇ得た。
本品は、工業的に安価かつ容易に製造できる難晶出性のシラップであり、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−１０：分岐環状四糖含有シラップ
実験３−１の方法で得た糖液６．１ｋｇを、イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０』、Ｎａ型、オルガノ製造、樹脂量約２２５Ｌ）を充填したカラム（内径１３．５ｃｍ×長さ１６０ｃｍのカラムを１０本直列に連結）を用いてクロマト分離に供した。移動相には水（流速４５Ｌ／ｈ）を用い、カラム温度は６０℃とした。カラムからの溶出液を分画し、各画分の糖組成を実験３−１に示したＨＰＬＣにより求めた。環状四糖を比較的多く含む画分を合一し、１５３０ｇの固形物を含む糖液を得た。上記と同じ条件によるＨＰＬＣで分析し、ピーク面積に基づいて計算したところ、この合一した画分（環状四糖高含有画分）は、全糖質当り、環状四糖を７９．８％、イソマルトースを６．１％の割合で含むものであった。
環状四糖高含有画分の固形物として１，３１０ｇ相当を、ｐＨ５．０、５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１ｇ当り１０００単位とグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１ｇ当り６０単位添加して２０時間処理した。この処理後の液を、濾過により不溶物を除去した後、カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＰＫ２１８』、三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂（商品名『ＩＲＡ４１１』、オルガノ株式会社製造）を用いて脱塩し、濃縮した。この濃縮液を上記のクロマト分離の条件にしたがって分画し、環状四糖の純度が９７％以上の画分を採取した。採取した画分を常法にしたがって脱色、脱塩、濾過、濃縮し、固形物約１，２６０ｇを含む糖液を得た。この糖液を、固形物濃度約５０％（ｗ／ｗ）に調整した後、円筒状のプラスチック容器に入れ、穏やかに回転させながら、温度を６５℃から２０℃にまで約２０時間かけて降下させて結晶を析出させ、常法にしたがって分密し、得られる母液を精製・濃縮して、固形分当り分岐環状四糖４％、環状四糖９４％、グルコース１％、及びその他の糖質１％からなる固形物濃度約４５％のシラップを得た。
本品は、工業的に安価かつ容易に製造できる難晶出性のシラップであり、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−１１：分岐環状四糖含有シラップ
実施例Ａ−９で得た分岐環状四糖含有シラップ（４００ｇ）を常法に従って、アルカリ展開したラネーニッケル（商品名『Ｎ１５４』、日揮化学社製）を固形物グラム当たり０．１グラム加えオートクレーブにいれ、水素圧を１００ｋｇ／ｃｍ^２に保ち、１００℃にて４時間攪拌して、続いて１２０℃にて２時間攪拌して水素添加を行った。放冷後、オートクレーブから水素添加物を取り出し、厚さ約１ｃｍの活性炭層に通液することでラネーニッケルを濾過除去し、得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４０％に濃縮し、固形物当り分岐環状四糖１２％、環状四糖４４％、ソルビトール２５％、及びその他の糖質１９％からなる実質的に非還元性で難晶出性のシラップを得た。
本品は、工業的に安価かつ容易に製造できるシラップであり、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ａ−１２：分岐環状四糖含有シラップ
実施例Ａ−９で得た分岐環状四糖含有シラップ（４００ｇ）を実施例Ａ−１０で得た分岐環状四糖含有シラップ（４００ｇ）で置き換えた以外は実施例Ａ−１１と同様に処理して、固形物当り分岐環状四糖４％、環状四糖９４％、ソルビトール１％、及びその他の糖質１％からなる固形物濃度約５５％の実質的に非還元性で難晶出性のシラップを得た。
本品は、工業的に安価かつ容易に製造できるシラップであり、飲食品、化粧品、医薬品などの諸種の分野の製品に配合する素材として有利に利用できる。
実施例Ｂ−１：甘味料
実施例Ａ−５の方法で得た、化学式１で表される分岐環状四糖の５乃至６含水結晶０．８重量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２重量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスィート』）０．０１重量部、およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品のカロリーは、分岐環状四糖が難消化性、難発酵性で実質的に無カロリーであることから、甘味度当たり蔗糖の約１０分の１である。しかも、本品は、室温保存下、変質劣化の懸念が無く、安定である。従って、本品は、高品質の低カロリー、低う蝕性甘味料として好適である。
実施例Ｂ−２：ハードキャンディー
実施例Ａ−３の方法で得た、化学式６で表される分岐環状四糖含有シラップ５０重量部と、固形物濃度約５５％（ｗ／ｗ）の蔗糖溶液１００重量部を加熱しつつ混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
実施例Ｂ−３：乳酸菌飲料
実施例Ａ−４の方法で得た、化学式７で表される分岐環状四糖含有シラップ５０重量部と、脱脂粉乳１７５重量部、及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０重量部を水１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、環状四糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
実施例Ｂ−４：練歯磨
実施例Ａ−１の方法で得た、化学式１で表される分岐環状四糖含有シラップを固形物濃度約３０％（ｗ／ｗ）に調整した。このシラップ１５重量部と第二リン酸カルシウム４５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２５重量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、サッカリン０．０２重量部および防腐剤０．０５重量部を水１３重量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
実施例Ｂ−５：浴用剤
実施例Ａ−５の方法で得た、化学式２で表される分岐環状四糖の１１乃至１２含水結晶１０重量部に対してユズの皮ジュース１重量部の割合で混合し、乾燥させた後、粉末化して、ユズの皮エキス含有粉末を得た。本粉末５重量部に、焼塩９０重量部、トレハロース含水結晶２重量部、無水ケイ酸１重量部およびα−グルコシル ヘスペリジン（株式会社林原販売、商品名αＧヘスペリジン）０．５重量部を混合して浴用剤を得た。本品は、上品な香りを穏やかに呈し、皮膚の保湿性に優れた浴用剤である。
実施例Ｂ−６：化粧用クリーム
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−６の方法で得た、化学式３で表される分岐環状四糖の１０乃至１１含水結晶２重量部、α−グルコシル ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部および精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
実施例Ｂ−７：錠剤
実施例Ａ−７の方法で得た、化学式６で表される分岐環状四糖の９乃至１０含水結晶１４重量部と、アスピリン５０重量部、及びコーンスターチ４重量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、分岐環状四糖の賦形性を利用したもので、吸湿性が極めて低く、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
産業上の利用の可能性
以上説明したとおり、本発明は、本発明者等が先に見出した新規酵素、α−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とを澱粉部分分解物に作用させてたとき、環状四糖とともに、環状四糖のグリコシル誘導体が副生成すること、ならびに、環状四糖に上記の両酵素やシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、リゾチームなどの糖質関連酵素を作用させることによって、極めて多岐にわたるグリコシル誘導体が得られることを見出した、本発明者等による全く独自の知見に基づくものである。本発明が提供するグリコシル誘導体、すなわち、分岐環状四糖は、物質の包接能や難消化性など環状四糖の本来の性質を有しているので、環状四糖と同様に飲食品、化粧品、医薬品などの諸分野で有利に利用するとができる。また、本発明の分岐環状四糖を用いて、その物性や機能についての解析を進めることにより、環状四糖の新たな用途開発や、環状四糖の性質・機能の改良につながる重要な知見が得られるといえる。
この発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、環状四糖のＨＰＬＣによるクロマトグラムである。
第２図は、環状四糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
第３図破、環状四糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第４図は、本発明の分岐環状四糖（化学式１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第５図は、本発明の分岐環状四糖（化学式３）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第６図は、本発明の分岐環状四糖（化学式４）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第７図は、本発明の分岐環状四糖（化学式５）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第８ａ図、第８ｂ図はそれぞれ、環状四糖とα−シクロデキストリンの混合液にＣＧＴａｓｅを作用させた反応液のＨＰＬＣによるクロマトグラム（ａ）と、該ＣＧＴａｓｅ作用後にグルコアミラーゼを作用させた反応液のＨＰＬＣによるクロマトグラム（ｂ）である。
第９図は、本発明の分岐環状四糖（化学式２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１０図は、本発明の分岐環状四糖（化学式６）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１１図は、本発明の分岐環状四糖（化学式８）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１２図は、本発明の分岐環状四糖（化学式７）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１３図は、本発明の分岐環状四糖（化学式９）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１４図は、本発明の分岐環状四糖（化学式１０）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第１５図は、本発明の分岐環状四糖（化学式１）の結晶のＸ線回折図形である。
第１６図は、本発明の分岐環状四糖（化学式２）の結晶のＸ線回折図形である。
第１７図は、本発明の分岐環状四糖（化学式３）の結晶のＸ線回折図形である。
第１８図は、本発明の分岐環状四糖（化学式６）の結晶のＸ線回折図形である。
第１９図は、本発明の分岐環状四糖（化学式７）の結晶のＸ線回折図形である。
第２０図は、本発明の分岐環状四糖（化学式１）を熱重量分析により熱特性を分析した結果を示す図である。
第２１図は、本発明の分岐環状四糖（化学式２）を熱重量分析により熱特性を分析した結果を示す図である。
第２２図は、本発明の分岐環状四糖（化学式３）を熱重量分析により熱特性を分析した結果を示す図である。
第２３図は、本発明の分岐環状四糖（化学式６）を熱重量分析により熱特性を分析した結果を示す図である。
第２４図は、本発明の分岐環状四糖（化学式７）を熱重量分析により熱特性を分析した結果を示す図である。

Claims (29)

1. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖のグリコシル誘導体であって、一般式１で表される構造を有する分岐環状四糖。
   一般式１：
   

   

   （一般式１において、Ｒ_１乃至Ｒ_１２は、それぞれ独立に、置換基を有することのあるグリコシル基又は水素原子である。ただし、Ｒ_１乃至Ｒ_１２の全てが水素原子であることはなく、また、Ｒ_４及びＲ_１０のいずれか一方のみが置換基を有することのあるグリコシル基である場合、該グリコシル基であるＲ_４又はＲ_１０はＤ−グルコピラノシル基を除くグリコシル基から選ばれる基である。）
2. 一般式１におけるＲ_１乃至Ｒ_１２から選ばれる１個又は２個以上の位置にあるグリコシル基が、それぞれ独立に、下記（１）乃至（５）に示すグリコシル基から選ばれるいずれかの基である請求の範囲第１項に記載の分岐環状四糖：
   （１） 置換基を有することのある｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、
   （２） 置換基を有することのあるα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、
   （３） 置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１乃至Ｒ_１２における２個以上が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）、
   （４） 置換基を有することのあるα−Ｄ−ガラクトピラノシル基、及び
   （５） 置換基を有することのあるβ−Ｄ−キトサミニル基。
3. 一般式１におけるＲ_１及び／又はＲ_７が、置換基を有することのある｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_１及びＲ_７の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である請求の範囲第１項又は第２項に記載の分岐環状四糖。
4. 化学式１又は化学式２で表される請求の範囲第３項に記載の分岐環状四糖。
   化学式１：
   

   

   化学式２：
   

   
5. 一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのあるα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｛α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−｝_ｎα−Ｄ−グルコピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_２及びＲ_８の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の分岐環状四糖。
6. 化学式３、化学式４又は化学式５で表される請求の範囲第５項に記載の分岐環状四糖。
   化学式３：
   

   

   化学式４：
   

   

   化学式５：
   

   
7. 一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_２及びＲ_８の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の分岐環状四糖。
8. 化学式６で表される請求の範囲第７項に記載の分岐環状四糖。
   化学式６：
   

   
9. 一般式１におけるＲ_４及び／又はＲ_１０が置換基を有することのある｛β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−｝_ｎβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基（ただし、ｎは０以上の整数を意味し、Ｒ_４及びＲ_１０の両方が当該基である場合、それぞれの当該基においてｎは互いに独立しているものとする。）である請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の分岐環状四糖。
10. 化学式７又は化学式８で表される請求の範囲第９項に記載の分岐環状四糖。
    化学式７：
    

    

    化学式８：
    

    
11. 一般式１におけるＲ_４及び／又はＲ_１０が、置換基を有することのあるα−Ｄ−ガラクトピラノシル基である請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の分岐環状四糖。
12. 化学式９で表される請求の範囲第１１項に記載の分岐環状四糖。
    化学式９：
    

    
13. 一般式１におけるＲ_２及び／又はＲ_８が、置換基を有することのあるβ−Ｄ−キトサミニル基である請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の分岐環状四糖。
14. 化学式１０で表される請求の範囲第１３項に記載の分岐環状四糖。
    化学式１０：
    

    
15. 溶液、非晶質粉末又は含蜜結晶の状態にある請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖。
16. 請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖の単離された結晶。
17. 化学式１、化学式２、化学式３、化学式６又は化学式７で表される分岐環状四糖の結晶である請求の範囲第１６項に記載の単離された結晶。
18. 含水結晶又は無水結晶である請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の単離された結晶。
19. 粉末Ｘ線回折法において、主たる回折角（２θ）として、下記（１）乃至（５）のいずれかに示す回折角を示す請求の範囲第１６項、第１７項又は第１８項に記載の単離された結晶：
    （１） ８．１°、１２．２°、１４．２°及び１５．４°、
    （２） ５．６°、８．８°、１６．９°及び２１．９°、
    （３） ７．９°、１２．１°、１７．９°及び２０．２°、
    （４） １１．０°、１２．３°、１２．８°及び２４．９°、及び
    （５） ８．７°、１３．０°、２１．７°及び２６．１°。
20. 請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖と該分岐環状四糖以外の糖質とを含んでなる糖組成物。
21. 溶液、非晶質粉末、含蜜結晶又は結晶質粉末の状態にある請求の範囲第２０項に記載の糖組成物。
22. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖への単糖、オリゴ糖又は多糖からのグリコシル基の転移能を有する酵素の作用を利用する分岐環状四糖の製造方法であって、以下の二工程を含むことを特徴とする分岐環状四糖の製造方法：
    （１） 該環状四糖と該単糖、オリゴ糖又は多糖との混合物に該酵素を作用させて請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖を生成させる工程、及び
    （２） 工程（１）で生成した分岐環状四糖を採取する工程。
23. 請求の範囲第２２項に記載の分岐環状四糖の製造方法であって、工程（１）に先だって実施する、環状四糖を製造するための以下の工程をさらに含むことを特徴とする分岐環状四糖の製造方法：
    非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に、下記（Ａ）の酵素活性を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及び下記（Ｂ）の酵素活性を有するα−イソマルトシル転移酵素を作用させて該環状四糖を生成させ、これを採取する工程：
    （Ａ） 非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ（ｎは２以上の整数を表す。）の糖質に作用して、還元力を実質的に増加することなく、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ＋１である糖質を生成する、
    （Ｂ） 非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用して、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖を生成する。
24. 環状四糖への単糖、オリゴ糖又は多糖からのグリコシル基の転移能を有する酵素として、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、下記（Ａ）に示す酵素活性を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、及び下記（Ｂ）に示す酵素活性を有するα−イソマルトシル転移酵素から選ばれる１種又は２種以上を用いる請求の範囲第２２項又は第２３項に記載の分岐環状四糖の製造方法：
    （Ａ） 非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ（ｎは２以上の整数を表す。）の糖質に作用して、還元力を実質的に増加することなく、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度がｎ＋１である糖質を生成する、
    （Ｂ） 非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用して、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖を生成する。
25. 単糖、オリゴ糖又は多糖として、グルコース１−リン酸、マルトオリゴ糖、環状デキストリン、パノース、イソマルトシルグルコ糖質、ラクトース、メリビオース、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖、デキストリン、グリコーゲン、液化澱粉、及びキチンから選ばれる１種又は２種以上を用いる請求の範囲第２２項、第２３項又は第２４項に記載の分岐環状四糖の製造方法。
26. 生成させた分岐環状四糖を、脱色、脱塩、カラムクロマトグラフィー及び結晶化から選ばれる１種又は２種以上の精製方法を含む工程により採取する請求の範囲第２２項乃至第２５項のいずれかに記載の分岐環状四糖の製造方法。
27. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で表される環状四糖への単糖、オリゴ糖又は多糖からのグリコシル基の転移能を有する酵素の作用を利用するグリコシル基の転移方法であって、該環状四糖と該単糖、オリゴ糖又は多糖との混合物に該酵素を作用させて請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖を生成させる工程を含むことを特徴とする環状四糖へのグリコシル基の転移方法。
28. 請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかに記載の分岐環状四糖を含んでなる組成物。
29. 飲食物、化粧品又は医薬品としての請求の範囲第２８項に記載の組成物。

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