JP5688798B2 - α−１，３−分枝シクロデキストランの使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、α−１,３−分枝シクロデキストランの使用方法に関する。

α−１,３−分岐シクロデキストランは、数分子のＤ−グルコースがα−１,６−結合で環状に繋がったオリゴ糖であるシクロデキストランに、α−１,３−結合で分岐した１個ないし数個のＤ−グルコースがα−１,６−結合した分枝環状イソマルトオリゴ糖である。

７〜９分子のグルコースがα−１,６−結合により環状に繋がった環状イソマルトオリゴ糖（シクロデキストラン）は公知の物質である。シクロデキストランはバチルス属の微生物により産生されるサイクロデキストラングルカノトランスフェラーゼ（CITase）をデキストラン等の基質に反応させて生成するが、特許文献１（特開平６−１９７７８３号公報）には、医薬化合物や香気成分を包接する包接能を有することが開示されている。また、特許文献２（特開平８−５９４８４号公報）には、シクロデキストランは、虫歯菌であるストレプトコッカス・ミュータンスが産生する不溶性グルカン生成酵素阻害をすることから、抗う蝕の目的で使用され得ることが記載されている。さらに、特許文献３（特開平７−８２７６号公報）には、当該物質を生成する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素（サイクロデキストラングルカノトランスフェラーゼ）が開示されている。

シクロデキストランは、上記の微生物が産生する環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を利用して生産されており、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素による反応液中にはその類縁物質などの副生物がほとんどなく、ほぼ純粋な物質として産生されるものと考えられていた。

ところで、特許文献４（特開平１０−２２９８７６号公報）には、α−１,３−結合の分岐を有する分岐環状イソマルトオリゴ糖に作用し、枝分かれしたグルコースを切り出す新規なα−１,３−多分岐デキストラン水解酵素を、α−１,３−結合の分岐を有する分岐環状イソマルトオリゴ糖に作用させて、分枝のない環状イソマルトオリゴ糖を製造する方法が開示されている。この酵素の使用により、サイクロデキストラングルカノトランスフェラーゼを用いて得られた環状イソマルトオリゴ糖を含む反応液から、高い純度の環状イソマルトオリゴ糖が生産される。

特開平６−１９７７８３号公報 特開平８−５９４８４号公報 特開平７−８２７６号公報 特開平１０−２２９８７６号公報

ところで特許文献４には、１分子のグルコースがα−１,３−結合で枝分かれをした分岐環状イソマルトオリゴ糖から枝分かれしたグルコースが切り出されることが記載されているが、具体的にどのような構造を有する分岐環状イソマルトオリゴ糖からグルコースが切り出されたのか明らかにされていない。

また、α−１,３−結合の分岐を有する分岐環状イソマルトオリゴ糖は、環状イソマルトオリゴ糖の製造における副生物（いわゆる不純物である）とされており、当該分岐環状イソマルトオリゴ糖が有する作用もこれまでのところ明らかではない。

本願発明者らは、環状イソマルトオリゴ糖の製造過程において想定される副生物（不純物）を単離してその構造を特定すべく研究を進めたところ、不純物の多くはα−１,３−結合により１分子のグルコースが環状イソマルトオリゴ糖に結合したα−１,３−分岐環状イソマルトオリゴ糖（α−１,３−分岐シクロデキストラン）であることを突き止めた。また、当該α−１,３−分岐シクロデキストランはフラーレンの可溶化剤や抗う蝕剤として利用できることを見いだした。なお、これまでに１分子のグルコースがα−１,３で分岐した分岐シクロデキストランが具体的に単離され、構造決定がなされた旨の報告は知られていない。

すなわち、本発明の目的は、新規な可溶化剤や新規な抗う蝕剤として利用可能な１分子のグルコースがα−１,３−結合で枝分かれをした分岐シクロデキストランを提供することにある。

本発明のα−１,３−分枝シクロデキストランは、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合した構造を有する。

本発明によると、フラーレンを可溶化しうる新たな可溶化剤及び新規な抗う蝕剤が提供される。

図１は市販のシクロデキストラン混合物のＨＰＥＡＣ−ＰＡＤ分析によるクロマトグラムである。 図２は市販のシクロデキストラン混合物のＯＤＳカラムによる分画を示す図であって、Ａは７容量％メタノールで溶出させたＨＰＬＣクロマトグラム、ＢはＦｒ５以降を８.５容量％メタノールで溶出させたＨＰＬＣクロマトグラムである。 図３は図２におけるＦｒ６のＯＤＳカラムによるクロマトグラムである。 図４は図２におけるＦｒ２−１から得られた分岐シクロデキストラン（ＣＩｂ９）のＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す図である。 図５は分画されたシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランの^１Ｈ−ＭＮＲスペクトルを示す図である。 図６は各種デキストランから調製されたシクロデキストラン混合物のＨＰＥＡＣ−ＰＡＤ分析によるクロマトグラムである。 図７はフラーレンの可溶化能を示す図である。 図８はデキストランスクラーゼ活性阻害効果を示す図である。

本発明の分枝シクロデキストランは、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストラン（シクロデキストラン）に結合した構造を有する。式１に示す分枝シクロデキストランは、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、８分子のグルコースからなるシクロデキストランに結合した構造を有する。

以下の説明において、シクロデキストランとは、Ｄ−グルコースがα−１,６−結合により環状に結合した構造を有するオリゴ糖をいい、シクロデキストラン混合物や分枝鎖を有するシクロデキストランと称する場合など特別な場合を除いては、分枝鎖を有しないシクロデキストランの意味で用いられる。

また、以下の説明において分枝シクロデキストランは、Ｄ−グルコースがα−１,６−結合により環状に結合したシクロデキストランに、１分子のグルコースがα−１,３−結合で結合したオリゴ糖を言う。

本発明の分枝シクロデキストランは、分枝シクロデキストランのうち重合度が８〜１１の分枝シクロデキストラン、すなわち重合度が７〜１０のシクロデキストランに１分子のグルコースがα−１,３−結合で結合したオリゴ糖である。

本発明の分枝シクロデキストランは、例えば特許文献１に記載されたシクロデキストランを生成するバチルス属に属する微生物を用いて製造されうる。また、例えば特許文献３に記載されたバチルス・サーキュランスＴ−３０４０株培養液中のシクロデキストラン合成酵素（環状イソマルトオリゴ糖合成酵素）、Ｔ−３０４０株由来の組換えＣＩＴａｓｅ（特開平８−６６１９１号公報参照）、５９８Ｋ株由来の組換えＣＩＴａｓｅ（特開２００７−１８９９０５号公報参照）やバチルス・サーキュランスＵ−１５５株の組換えＣＩＴａｓｅ（特開平９−２３４０７３参照）を用いて製造されうる。前記微生物やこれらのシクロデキストラン合成酵素を用いて製造した場合には、分枝シクロデキストランの他に分枝鎖を有しないシクロデキストランを含むシクロデキストラン混合物が得られる。本発明の分枝シクロデキストランはこのシクロデキストラン混合物から単離精製される。

シクロデキストリン混合物からの単離精製には、公知である各種の単離方法、例えばカラムクロマトグラフィや分取用高速液体クロマトグラフィが単独で使用され、あるいは必要に応じて公知の単離方法が組みあわせて使用される。これらのクロマトグラフィに使用されるカラムとしては、例えばＯＤＳカラムが例示される。より具体的には、シクロデキストラン混合物をカラムに吸着させた後、溶離液を当該カラムに流し、目的とする分枝シクロデキストランを含む画分（溶液）を分取する。

溶離液は、水または水と混和性のある有機溶媒と水との混合液が用いられうる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。溶離液が水と有機溶媒の混合液である場合、有機溶媒の濃度が例えば９５容量％以下であり、好ましくは９０容量％以下であり、好ましくは８０容量％以下であり、好ましくは７０容量％以下であり、好ましくは６０容量％以下であり、好ましくは５０容量％以下であり、さらに好ましくは４０容量％以下、さらに好ましくは３０容量％以下、さらに好ましくは２０容量％以下であり、望ましくは１０容量％以下である。有機溶媒は１種のみならず２種以上であってもよい。

単離は室温で行えばよく、例えば１〜３５℃、好ましくは１０〜３０℃で行う。もちろん、分離が行える条件であれば、１℃より低い環境下や３５℃を超える環境下で操作することもできる。

目的とする分枝シクロデキストランを含む分画により得られた溶液から溶媒を除去する。溶媒の除去は公知の方法によればよく、大気圧若しくは減圧下で溶媒を留去する。減圧とは大気圧よりも低い気圧条件を意味し、例えば０.５気圧以下、好ましくは０.１気圧以下、より好ましくは０.０１気圧以下で溶媒を留去する。留去は室温で行うか、必要により分枝シクロデキストランを含む溶液を加温して行う。加温する際の温度は、分枝シクロデキストランが分解されない温度であればよく、好ましくは９０℃以下、好ましくは８０℃以下、好ましくは７０℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。また、凍結乾燥により、溶媒を除去してもよい。凍結乾燥の条件も適宜定められる。

得られた分枝シクロデキストランは、７〜１０分子のグルコースがα−１,６−結合により環状につながった構造を有しており、シクロデキストランと同様に包接能が期待される。そして、当該分枝シクロデキストランは、フラーレンを親水系溶媒に溶解するための可溶化剤として利用され得る。また、デキストランスクラーゼ活性阻害剤としても利用され得る。

フラーレンが溶解される親水系溶媒は、水又は水と混和性のある任意の有機溶媒であり、水と当該有機溶媒との混合液を含み得る。フラーレンを溶解する親水系溶媒は、好ましくは水である。有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、スルホラン、ニトロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。

水と有機溶媒との混合液の場合、有機溶媒の濃度が５０容量％以下であり、好ましくは４０容量％以下であり、好ましくは３０容量％以下であり、好ましくは２０容量％以下であり、より好ましくは１０容量％以下、より好ましくは５容量％以下である。有機溶媒は１種のみならず２種以上であってもよい。

本発明の分枝シクロデキストランを用いてフラーレンを溶解する場合には、重合度が８〜１１である分枝シクロデキストランのいずれか１種を用いてもよく、また、２種以上を混合した混合物を用いてもよい。特に重合度が９である分枝シクロデキストラン、すなわち式１に示す１分子のグルコースがα−１,３−結合で、８分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランが最も好ましく用いられる。

フラーレンは、基本的には炭素原子のみから構成される安定炭素同位体であり、５員環と６員環からなる多面体球状構造を有する分子である。フラーレンの炭素数は通常６０〜１２０であり、具体的には炭素数が６０、７０、７６、７８、８２、８４、９０、９４、９６及びそれより大きなものの存在が確認されている。これらは単一でも混合物であってもよい。

フラーレンは、例えば黒鉛から希ガス（主としてＨｅ、Ａｒ等）でアーク放電、パルスレーザー照射等により炭素蒸気を調製し、そのガスを冷却する際に生成する炭素スス中から分離して製造される。本発明で用いられるフラーレンは、市販のものであっても、前記方法など公知の任意の方法によって製造されたものであってもよい。

フラーレンは本発明の分枝シクロデキストランによって親水系溶媒に可溶化され、フラーレンが可溶化された溶液が提供される。本明細書において可溶化されるとは、本発明の分枝シクロデキストランを含む親水系溶媒に溶解されうる単位容量当たりのフラーレン量が、当該分枝シクロデキストランを含まない親水系溶媒に溶解されうる単位容量当たりのフラーレン量よりも増大することを意味する。

可溶化剤である本発明の分枝シクロデキストランは前記親水系溶媒に溶解される。当該分枝シクロデキストランの濃度は、当該分枝シクロデキストランが溶解できる濃度であればよく、２０℃において例えば０.０１ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは０.０５ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは０.１ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは０.５ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは１.０ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは２.０ｍｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは５.０ｍｇ／ｍｌ以上である。また、当該分枝シクロデキストランの濃度は例えば１００ｍｇ／ｍｌ以下であり、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下である。

添加されるフラーレンの量は、前記親水系溶媒に溶解可能なフラーレンの量を超える量であればよく、任意に設定され得る。添加されるフラーレンの量は、例えば、溶媒１００質量部に対して０.１質量部以上、０.２質量部以上、０.５質量部以上、１質量部以上、または５質量部以上である。添加されるフラーレンの量は、例えば、溶媒１００質量部に対して１０質量部以下、５質量部以下、３質量部以下、または１質量部以下である。

フラーレンの可溶化をするに当たり、本発明の分枝シクロデキストランの溶液にフラーレンを添加する、あるいはフラーレンと本発明の分枝シクロデキストランを予め混合した後、これに溶媒を添加してフラーレンと本発明の分枝シクロデキストランと溶媒を含む混合液を得る。その混合液に超音波を投射する、あるいは攪拌するなどの機械的手段によって十分に混合する。超音波を投射する方法は、分枝シクロデキストランの溶液にフラーレンを均一に溶解させ得る方法である限り、その超音波の投射方法、周波数、出力、時間などの条件は特に限定されるものではない。超音波を投射する際の温度および圧力も、分枝シクロデキストラン及びフラーレンを含む溶液が、液体状態を保つ条件であればよい。例えば、分枝シクロデキストラン及びフラーレンを含む溶液をガラス容器に入れ、バス型ソニケーターを使用して、室温で超音波を投射することが行われる。

例えば、超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり例えば０.１ワット／ｃｍ^２以上であり、好ましくは０.５ワット／ｃｍ^２以上であり、好ましくは１.０ワット／ｃｍ^２以上であり、より好ましくは１０ワット／ｃｍ^２以上であり、より好ましくは５０ワット／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１００ワット／ｃｍ^２以上である。また、超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり例えば１５００ワット／ｃｍ^２以下である、好ましくは７５０ワット／ｃｍ^２以下であり、好ましくは約５００ワット／ｃｍ^２以下であり、より好ましくは約３００ワット／ｃｍ^２以下である。発振周波数は例えば１０ＫＨｚ以上であり、好ましくは１５ＫＨｚ以上であり、さらに好ましくは２０ＫＨｚ以上であって、望ましくは２０から５０ＫＨｚの範囲である。振幅は、例えば２０μｍ以上であり、好ましくは３０μｍ以上である。また、振幅は、好ましくは４０μｍ以下である。また、超音波の投射時間は約１分間〜約３時間が好ましく、より好ましくは約３分間〜約３０分間である。超音波を投射する際またはその前後に、ボルテックスミキサー、ホモジナイザー、スパイラルミキサー、プラネタリーミキサー、ディスパーサー、ハイブリットミキサーなどの撹拌装置を用いてもよい。混合液の温度は、溶解させる物質が分解または変質せず、溶媒が揮発しすぎない温度であれば任意の温度であり得る。混合液の温度は、例えば、５℃以上であり、好ましくは１０℃以上であり、さらに好ましくは１５℃以上であり、さらに好ましくは２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。混合液の温度は、例えば、１００℃以下であり、好ましくは９０℃以下であり、さらに好ましくは８０℃以下であり、さらに好ましくは７０℃以下であり、最も好ましくは６０℃以下である。

十分に混合された後、この溶液中の未溶解のフラーレンをろ過、遠心分離などにより取り除き、フラーレンが均質に溶解された溶液を得る。溶液から未溶解のフラーレンを取り除く方法は、フィルターによるろ過、遠心分離など、溶解したフラーレンとそうでないフラーレンとを分離できる限りにおいて特に限定されるものではない。フィルターによるろ過の場合、フィルターは溶解したフラーレンは通過し、未溶解のフラーレンは通過しない孔径を有するものを使用する。好ましくは、孔径１μｍ〜数百μｍ程度のフィルターを用いる。遠心分離の場合、溶解したフラーレンが上清に残り、未溶解のフラーレンが沈澱に分かれる条件を選択する。好ましくは、１,０００〜７,０００×ｇ、５〜３０分間と同等の遠心力をかけることにより分離する。このようにして、カーボンナノチューブが均質に溶解している溶液が得られる。

フラーレンが溶液中に均質に溶解していることは、フラーレン溶液を約７,０００ｇで５〜３０分間の遠心分離して沈殿が生じなければ溶解していると言える。また、フラーレン溶液中のフラーレンを遠心分離などにより回収し、溶媒で洗浄して回収物中に存在する分枝シクロデキストランを除いた後、原子間力顕微鏡を用いて確認することもできる。

溶液中に溶解しているフラーレンの量は、例えば、７０,０００×ｇ、１５分間遠心分離してフラーレンを回収し、その質量を測定することにより測定することができる。あるいは、フラーレンの濃度は、２６８ｎｍでの吸光度と極めて良好な相関があり、本発明の分枝シクロデキストランやシクロデキストランはこの波長での吸収はほとんどない。それゆえ、フラーレンの濃度は、２６８ｎｍ付近での吸収を有する何らかの他の物質を含む場合以外は、溶液の２６８ｎｍでの吸光度を測定することにより容易に決定される。

溶液中のフラーレンの濃度は、フラーレンが溶解可能である限り、任意に設定され得る。溶液中のフラーレンの濃度は、２０℃において好ましくは１ｍｇ／L（約０.０００１質量％）以上であり、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ（約０.００１質量％）以上であり、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ（約０.００３質量％）以上であり、さらに好ましくは５０ｍｇ／Ｌ（約０.００５質量％）以上であり、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ（約０.０１質量％）以上であり、さらに好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ（約０.０１５質量％）以上である。フラーレンが溶解し得る限り、フラーレンの溶液中に含まれるフラーレンの濃度に上限はないが、通常、その上限は１００ｇ／Ｌ（約１０.０質量％）であり、７０ｇ／Ｌ（約７.０質量％）であり、５０ｇ／Ｌ（約５.０質量％）であり、３０ｇ／Ｌ（約３.０質量％）であり、１０ｇ／Ｌ（約１質量％）であり、５ｇ／Ｌ（約０.５質量％）であり、２ｇ／Ｌ（約０.２質量％）であり、１ｇ／Ｌ（０.１質量％）以下であり得る。溶解度は、２０℃における溶解度である。また、ここに示す濃度は、１ｍｇ／ｍｌの分枝シクロデキストランを含む溶液を用いた場合である。

上記により得られた溶液は、フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含み、かつ、分枝を有しないシクロデキストランを含まない溶液である。この溶液はフラーレン及び本発明の分枝シクロデキストラン以外に、公知である種々の物質を含みうる。例えば、ポリマーなどのフィルム形成用又は皮膜形成用材料、顔料、可塑剤、分散剤、流動性調整剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保存安定剤、接着助剤、増粘剤、成形用の樹脂材料などが例示される。

フィルムなどの基材や皮膜形成用材料として、ポリビニルアルコール、プルラン、デキストラン、デンプンおよびデンプン誘導体、セルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、デオキシリボ核酸、リボ核酸、グアーガム、キサンタンガム、アルギン酸、アラビアガム、カラギーナン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、カードラン、キチン、キトサン、ゼラチンなどのポリマーが挙げられる。これらの物質の添加量は適宜定められる。

フラーレンは導電性物質である。従って、本発明の溶液は、その導電性を更に向上させるためにフラーレン以外の導電性物質をさらに含有し得る。導電性物質の例としては、炭素系物質（例えば、炭素繊維、導電性カーボンブラック、黒鉛など）、金属酸化物（例えば、酸化錫、酸化亜鉛など）、金属（例えば、銀、ニッケル、銅など）が挙げられる。これらの物質の添加量も適宜定められる。上記の例示された物質は本発明の溶液に添加しうる例であって、当該溶液に添加しうる物質は上記物質に限られるものではない。

本発明の分枝シクロデキストランは、フラーレンを含む乳化組成物の調製にも用い得る。本発明の乳化組成物は、フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含み、かつ、好ましくは分枝を有しないシクロデキストランを含まない。ここで、好ましくは分枝を有しないシクロデキストランを含まないとは、実質的に分岐を有しないシクロデキストランを含まないとの意味であり、分岐を有しないシクロデキストランの存在比が分岐を有するシクロデキストランの１／１０以下、好ましくは１／１００以下、望ましくは１／１０００以下であり得る。

乳化組成物は水と界面活性剤と油性成分を含む組成物であり、当業者が通常用いるエマルジョンの意味として把握される。本発明の乳化組成物はＯ／Ｗ型エマルジョンやＷ／Ｏ型エマルジョン、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンなど種々のタイプのエマルジョンを含み得る。乳化組成物は、水を主体とする水相と油性成分を主体とする油相が界面活性剤によって乳化されたものである。フラーレンは本発明の分枝シクロデキストランによって水に可溶化されるので、本発明は分枝シクロデキストランとフラーレンは水相に配合される。水相は、上記フラーレンが可溶化された溶液の調製方法と同様にして調製され得る。乳化組成物は、調製された水相、すなわち本発明に係るフラーレンが親水系溶媒に溶解した溶液と界面活性剤と油相との撹拌混合により調整される。乳化組成物の調製には、公知である任意の方法が採用されうる。

乳化組成物に用いられる界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、非イオン性及び両性の界面活性剤である。アニオン性界面活性剤としては、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸トリエタノールアミン等の脂肪酸セッケン、アルキルエーテルカルボン酸及びその塩、アミノ酸と脂肪酸の縮合等のカルボン酸塩、アルキルスルホン酸、アルケンスルホン酸塩、脂肪酸エステルのスルホン酸塩、脂肪酸アミドのスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩とそのホルマリン縮合物のスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、第二級高級アルコール硫酸エステル塩、アルキル及びアリルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸エステルの硫酸エステル塩、脂肪酸アルキロールアミドの硫酸エステル塩、ロート油等の硫酸エステル塩類、アルキルリン酸塩、エーテルリン酸塩、アルキルアリルエーテルリン酸塩、アミドリン酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸系活性剤等が例示される。カチオン性界面活性剤としては、アルキルアミン塩、ポリアミン及びアミノアルコール脂肪酸誘導体等のアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、芳香族四級アンモニウム塩、ピリジウム塩、イミダゾリウム塩等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンプロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンフィトスタノールエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロールエーテル、ポリオキシエチレンコレスタノールエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、ポリオキシアルキレン変性オルガノポリシロキサン、ポリオキシアルキレン・アルキル共変性オルガノポリシロキサン、アルカノールアミド、糖エーテル、糖アミド等が挙げられる。両性界面活性剤としては、ベタイン、アミノカルボン酸塩、イミダゾリン誘導体等が挙げられる。

油性成分は、当業者が通常用いる油分又は油剤の意味として把握される。油性成分は、天然油、合成油、半合成油のいずれの油性成分を含み、固体油、半固体油、液体油のいずれであってもよい。油性成分は炭化水素類、ロウ類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル油、シリコーン油類、フッ素系油類を含み得る。例えば、スクワラン、セレシン、パラフィン、パラフィンワックス、流動パラフィン、プリスタン、ポリイソブチレン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリン等の炭化水素類；ミツロウ、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、鯨ロウ等のロウ類；牛脂、牛骨脂、硬化牛脂、硬化油、タートル油、豚脂、馬脂、ミンク油、肝油、卵黄油等の動物油；ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、ラノリンアルコール、硬質ラノリン、酢酸ラノリン、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ＰＯＥラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリンアルコールアセテート、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、ＰＯＥ水素添加ラノリンアルコールエーテル等のラノリン誘導体、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸、オレイン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、イソステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等の脂肪酸類が例示される。

また、油性成分として、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ヘキサデシルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、ヘキシルドデカノール、オクチルドデカノール、セトステアリルアルコール−２−デシルテトラデシノール、コレステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、ＰＯＥコレステロールエーテル、モノステアリルギリセリンエーテル（バチルアルコール）等の高級アルコール；アジピン酸ジイソブチル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、イソステアリン酸イソセチル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール−２−エチルヘキサン酸セチル、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール、オクタン酸セチル、オクチルドデシルガムエステル、オレイン酸オレイル、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸デシル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、クエン酸トリエチル、コハク酸２−エチルヘキシル、酢酸アミル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ステアリン酸イソセチル、ステアリン酸ブチル、セバシン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジ２−エチルヘキシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、１２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチドデシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、ミリスチン酸ミリスチル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、ラウリン酸エチル、ラウリン酸ヘキシル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸２−オクチルドデシルエステル、リンゴ酸ジイソステアリル等のエステル油が例示される。

さらに油性成分として、アセトグリセライド、トリイソオクタン酸グリセライド、トリイソステアリン酸グリセライド、トリイソパルミチン酸グリセライド、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセライド、モノステアリン酸グリセライド、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、トリミリスチン酸グリセライド等のグリセライド；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサシロキサン、テトラメチルテトラハイドロジェンシクロテトラシロキサン、ステアロキシシリコーン等の高級アルコキシ変性シリコーン、高級脂肪酸変性シリコーン、シリコーン樹脂、シリコンゴム、シリコーン油等のシリコーン系油剤；パーフルオロポリエーテル、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクタン等のフッ素系油が例示される。

本発明の乳化組成物は、フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストラン、水、油性成分及び界面活性剤以外に、公知である種々の物質を含みうる。例えば、炭素数が１〜６であるアルコール類、皮膜形成用材料、顔料、着色剤、可塑剤、分散剤、流動性調整剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保存安定剤、増粘剤などが例示される。

フラーレンは、肌の細胞死抑制作用やその抗酸化力に基づく肌の老化抑制作用があることから、しわの予防効果や肌の老化防止効果が期待される。また、メラニンの抑制効果もあることから、美白効果も期待される。さらに、フラーレンは、その誘導体も含めて、活性酸素の消去能力を有するものとして注目されており、皮膚に対する安全性も期待できることから、医薬品、医薬部外品、化粧料の各分野において皮膚外用剤としての利用が期待されている。従って、本発明の分枝シクロデキストランは、フラーレン及び親水系溶媒を含む皮膚外用剤の調製にも用い得る。

本発明の皮膚外用剤は、フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含み、かつ、好ましくは分枝を有しないシクロデキストランを含まない。ここで、好ましくは分枝を有しないシクロデキストランを含まないとは、実質的に分岐を有しないシクロデキストランを含まないとの意味であり、分岐を有しないシクロデキストランの存在比が分岐を有するシクロデキストランの１／１０以下、好ましくは１／１００以下、望ましくは１／１０００以下であり得る。

本発明の皮膚外用剤は、溶液（ローションタイプの組成物）、増粘溶液、ゲル、軟膏、乳剤（乳液）、パウダー、濃密パウダー又は固体剤のような種々の形態を含み得る。具体的な形態として、頬紅、クリーム（美顔用クリーム、ハンドクリーム、日焼け止めクリーム等）、クリームパウダー、アイライナー、アイシャドウ、ペンシル型眉墨、ファンデーション、ローション、マスカラ、マイクロエマルジョン、軟膏、ボディーソープ等が例示される。

親水系溶媒は、水又は水と混和性のある任意の有機溶媒であり得る。有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、スルホラン、ニトロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。親水系溶媒は、好ましくは水又は水とエタノールとの混合液である。フラーレンは本発明の分枝シクロデキストランによって親水系溶媒に可溶化されるので、本発明の分枝シクロデキストランとフラーレンは親水系溶媒に含まれ、上記フラーレンが可溶化された溶液の調製方法、つまり本発明に係るフラーレンが親水系溶媒に溶解した溶液の調整方法と同様にしてフラーレンが親水系溶媒に溶解される。本発明の皮膚外用剤は、公知である任意の製造方法に従って調製され得る。乳液やクリームの乳化組成物であれば、上記乳化組成物の調整方法に従って調整され得る。

本発明の皮膚外用剤は、フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストラン以外に、医薬品、医薬部外品、化粧品に配合され得る公知である種々の物質を含み得る。例えば、紫外線吸収剤、ビタミンＡ，ビタミンＢ群，ビタミンＣやその誘導体，ビタミンＥなどのビタミン類、酸化亜鉛などの収斂剤、殺菌剤や抗菌剤、抗生物質、鎮痒剤などの皮膚治療剤その他の治療用薬物、皮膚老化防止剤、しわ防止剤、美白剤、保湿剤、抗酸化剤、キレート剤、顔料、着色剤、緩衝剤が例示される。

本発明の乳化組成物又は皮膚外用組成物中における本発明の分枝シクロデキストランの配合量は、本発明の分枝シクロデキストランが配合可能である限り、任意に設定され得る。当該分枝シクロデキストランの配合量の下限は、例えば０.００１ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.０００１質量％）であり、０.００５ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.０００５質量％）であり、好ましくは０.０１ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.００１質量％）であり、０.０５ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.００５質量％）であり、０.１ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.０１質量％）であり、０.５ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.０５質量％）である。また、その上限は、例えば１００ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約１０.０質量％）であり、５０ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約５.０質量％）であり、１０ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約１.０質量％）であり、５ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.５質量％）、２ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.２質量％）であり、１.０ｍｇ／ｍｌ（ｇ）（約０.１質量％）であり得る。

本発明の乳化組成物又は皮膚外用組成物へのフラーレンの配合量は、フラーレンが配合可能である限り、任意に設定され得る。各組成物におけるフラーレンの配合量の下限は、例えば０.０１ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.０００００１質量％）であり、０.０３ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.０００００３質量％）であり、０.０５ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.０００００５質量％）あり、０.１ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.００００１質量％）であり、０.５ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.０００５質量％）であり、１ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.００１質量％）であり、５ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.００５質量％）であり、１０ｍｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.０１質量％である。また、フラーレンの配合量の上限はないが、通常、その上限は１００ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約１０.０質量％）であり、７０ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約７.０質量％）であり、５０ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約５.０質量％）であり、３０ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約３.０質量％）であり、１０ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約１質量％）であり、５ｇ／Ｌ（ｋｇ）（約０.５質量％）であり、２ｇ／Ｌ（ｋｇ）（０.２質量％）であり、１ｇ／Ｌ（０.１質量％）であり得る。なお、フラーレンは、配合したフラーレンの全部又は一部が水相中溶解していればよく、配合したフラーレンの一部が油相に存在してもよい。

本発明の分枝シクロデキストランは、デキストリンスクラーゼの活性阻害作用を有し、抗う蝕剤として利用し得る。デキストリンスクラーゼはスクラーゼを基質としてデキストリンを生成する酵素である。口腔に存在するストレプトミュータンス菌はそれ自身が産生するデキストリンスクラーゼを利用してスクラーゼからデキストリンを合成し、う蝕の原因である歯垢を形成する。従って、デキストリンスクラーゼの活性を阻害すれば、う蝕は防止される。

本発明の抗う蝕剤は、本発明の分枝シクロデキストラン、すなわち、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを有効成分とする。当該分枝シクロデキストランは、そのまま口腔内に適用してもよく、有効量の分枝シクロデキストランを含む組成物として口腔内に適用してもよい。当該組成物は、口腔内に適用可能な形態であり、例えば、練り歯磨きや粉歯磨き、液状歯磨きなどの歯磨剤、含嗽剤、トローチ剤、スプレー剤、チューイングガムや飴などの菓子類である。これらの形態は、公知である種々の賦形剤と混合され、公知である任意の方法により製造され得る。また、本発明の抗う蝕剤は、有効成分である分枝シクロデキストランの他に、他の抗う蝕作用を有する有効成分、安定剤、保存剤、甘味剤、着色剤、着香料などを含み得る。

本発明の分枝シクロデキストランの適用量はその効果が発揮されるように適宜調整されうる。例えば、口腔内の濃度が０.００１ｍＭ以上であり、好ましくは０.０１ｍＭ以上であり、好ましくは０.０５ｍＭ以上であり、好ましくは０.１ｍＭ以上であり、好ましくは１ｍＭ以上であり、好ましくは５ｍＭ以上であり、好ましくは１０ｍＭ以上であり、好ましくは２０ｍＭ以上であり、好ましくは２５ｍＭ以上である。また、口腔内濃度が例えば１Ｍ以下であり、好ましくは０.５Ｍ以下であり、好ましくは０.２５Ｍ以下であり、好ましくは１００ｍＭ以下であり、好ましくは７５ｍＭ以下であり、好ましくは５０ｍＭ以下である。本発明の抗う蝕剤の有効成分は、重合度が８〜１１である分枝シクロデキストランのいずれか１種であってもよく、２種以上であってもよい。

組成物中の配合量は、組成物１ｇ中、例えば０.０１μｇ以上であり、好ましくは０.１μｇ以上であり、好ましくは１μｇ以上であり、好ましくは１０μｇ以上であり、好ましくは０.１ｍｇ以上であり、好ましくは１ｍｇ以上であり、好ましくは１０ｍｇ以上であり、好ましく２０ｍｇ以上であり、好ましくは５０ｍｇ以上である。また、その配合量は、組成物１ｇ中、例えば、９００ｍｇ以下であり、好ましくは７００ｍｇ以下であり、好ましくは５００ｍｇ以下であり、好ましくは３００ｍｇ以下であり、１００ｍｇ以下である。

以上の説明においては、本発明の分枝シクロデキストランを利用してフラーレンを可溶化する方法並びに抗う蝕剤として使用する方法について説明したが、本発明の分枝シクロデキストリンの用途は上記用途に限られず、種々の組成物に配合され得るのは言うまでもない。

以下、本発明について下記実施例に基づいて説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
図１は市販されているシクロデキストラン混合物（株式会社シー・アイ・バイオ 商品名「ＣＩリッチ」 Lot.０９０７００２）（Ｃｉｍｉｘ）のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によるクロマトグラムである。シクロデキストラン混合物を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む水溶液の２５μｌをＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１００カラム（２５０ｍｍ×２ｍｍＩ．Ｄ．、ＤＩＯＮＥＸ）に注入し、下記の条件でＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析した。
（分析条件）
装置：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ−３０００システム
検出方法：ＰＡＤ
溶離液：１００ｍＭＮａＯＨ／０−５ｍＭＮａＯＡｃ（濃度勾配０−６０ｍｉｎ）
流量：１.０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３５℃

市販のシクロデキストラン混合物には、公知である分枝を有しないシクロデキストランに由来すると思われるピーク（ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１３）の他に、分枝を有するシクロデキストランに由来すると思われるピーク（ＣＩｂ−９、ＣＩｂ−１０、ＣＩｂ−１１）が見られた。これらのピークは下記の分析によりそれぞれ分枝を有しないシクロデキストラン及び分枝を有するシクロデキストランに由来するものと同定された。

（市販シクロデキストランからの分画）
分取カラムクロマトグラフィ及びリサイクリングＨＰＬＣシステムを用いて、シクロデキストラン混合物からシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランを分取した。前記シクロデキストラン混合物の水溶液を、ＯＤＳカラム（ＤａｉｓｏｐａｋＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰ、２５０ｍｍ×２０ｍｍＩ．Ｄ．、ダイソー（株））に導入し、７容量％メタノール水溶液で溶出させて１〜５番目のピーク画分（Ｆｒ１〜Ｆｒ４）を分取し、その後８.５容量％メタノール水溶液で溶出させて６〜１３番目のピーク画分（Ｆｒ５〜１１）を分取して、各画分を得た（図２参照。なお、１０〜１３番目（Ｆｒ８〜１１）のピークは示されていない。）。

次に、図２に示したＦｒ６の画分をリサイクリングＨＰＬＣシステム（島津製作所社製）を使用してさらに分画した。Ｆｒ６として得られた溶液をＯＤＳカラム（前述のダイソー（株）のカラムと同じ）に導入し、１０容量％メタノール水溶液で溶出した。第３サイクルにて現れた１〜４番目のピーク（Ｆｒ６−１〜Ｆｒ６−４）を分取して、各画分を得た（図３参照）。また、Ｆｒ７の画分もリサイクリングＨＰＬＣシステムを使用してさらに分画し、第３サイクルにて現れた１〜４番目のピーク（Ｆｒ７−１〜Ｆｒ７−４）を分取して、各画分を得た（図示せず）。

（ＴＯＳ−ＭＳ測定）
上記で得られた各画分の溶液を凍結乾燥して、シクロデキストラン及び分枝シクロデキストランを得た。ＴＯＦ−ＭＳにより、得られたシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランの質量分析を行い、各シクロデキストランを構成する糖の重合度を算出した。ＴＯＦ−ＭＳ測定は以下の方法で行った。サンプルの少量を５０μｌのマトリックス溶液（０.１Ｍ ＤＨＢＡ／１０容量％メタノール）に懸濁し、０.８μｌをサンプルスライドに滴下してドライヤーで乾燥させた。このサンプルスライドを、ＴＯＦ−ＭＳ分析装置（ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ ａｕｔｏｆｌｅｘ２、Ｂｒｕｋｅｒ社製）で分析した。図４に、その一例として、Ｆｒ２−１から得られた分枝シクロデキストラン（ＣＩｂ−９）のスペクトルを示す。

その結果、Ｆｒ１の化合物の重合度は８、Ｆｒ２−１の化合物の重合度は９、Ｆｒ２−２の化合物の重合度は９、Ｆｒ３の化合物の重合度は１０、Ｆｒ４の化合物の重合度は７、Ｆｒ６−４の化合物の重合度は１１、Ｆｒ７−３の化合物の重合度は１３、Ｆｒ１０の化合物の重合度は１０、Ｆｒ１１の化合物の重合度は１１であることが分かった。

（ＮＭＲ測定）
分取されたシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランをそれぞれＤ_２Ｏに溶解し（１０ｍｇ／０.６ｍｌ）、４００ＭＨｚ ＮＭＲ装置（ＪＮＭ ＡＬ−４００、ＪＥＯＬ社製）を用いて８０℃で^１Ｈ ＮＭＲ測定を行った。その結果を図５に示す。なお、図５にはＦｒ６−４、Ｆｒ７−３、Ｆｒ１１画分のチャートは示されていない。各画分には、そのアノメリック領域のメインピークが４.９５ｐｐｍに観察された。この４.９５ｐｐｍのピークは→６）−α−Ｇｌｃｐ−（１→残基に由来する。また、Ｆｒ２−１及びＦｒ３の画分には、４.９５ｐｐｍのメインピーク以外に、５.２９ｐｐｍと４.９７ｐｐｍの小さなピークが観察された。さらに^１Ｈ−^１Ｈ二次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹスペクトル、ＨＯＨＡＨＡスペクトル）と^１３Ｃ−^１Ｈ二次元ＮＭＲスペクトル（ＨＭＱＣスペクトル、ＨＭＢＣスペクトル）を用いて^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのピークの帰属を行った。また、既報の^１Ｈ ＮＭＲ分析（Norman W. H. Cheetham, Gwen J. Walker, Barbara J. Pearce, Eva Fiala-Beer and Catherine Taylor, Structures of water-soluble α- -glucans synthesized from sucrose by glucosyltransferases isolated from Streptococcus sobrinus culture filtrates. Carbohydrate Polymers 14, 3）により、５.２９ｐｐｍのピークはα−Ｇｌｃｐ−（１→残基に由来するピークであり、４.９７ｐｐｍのピークは→３,６）−α−Ｇｌｃｐ−１（→残基に由来するピークであると帰属された。また、図５中Ｈ−１〜Ｈ−６'はグルコース残基を構成する１位から６位の各炭素原子に結合した水素原子を意味している。

（メチル化分析）
各画分から得られたシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランのメチル分析を行った。なお、^１Ｈ ＮＭＲ測定の結果、ＣＩｂ−１０は、Ｆｒ２−１と同じ結合様式を持つことが明らかとなっているため、メチル化分析には、分枝シクロデキストランを代表してＦｒ２−１を用いた。試料をDMSOに溶解し、水酸化ナトリウムとよう化メチルを加え、１００℃で２時間加熱してメチル化した。メチル化物はクロロホルム抽出により回収し、再度メチル化を行った。得られたメチル化物を、Sephadex LH-20（Pharmacia）カラム（溶離液：クロロホルム−メタノール容量比２：１）で分画した。得られたメチル化糖を、９０質量％ギ酸（１００℃、６時間）、続いて２Ｍ ＴＦＡを用いて加水分解した（１００℃、６時間）。これを水素化ホウ素ナトリウムで還元し、ピリジンと無水酢酸を加えて１１０℃で２時間反応させてアセチル化した。得られた部分メチル化アルジトールアセテートをクロロホルムに溶解し、ＤＢ−２２５カラム（J&W Scientific, ０.２５ｍｍ ｉ.ｄ.×３０ｍ）とＥＩ検出器を装備したＧＣ−ＭＳ装置（GCMS-QP5000、島津製作所）で分析した（キャリアガス：ヘリウム、カラ入口圧：１００ｋＰａ（全流量３４ｍＬ／min）、カラム温度：１７０℃（１ｍｉｎ）から２１０℃まで３℃／ｍｉｎで昇温、気化室温度：２３０℃、検出器温度：２３０℃）。その結果、Ｆｒ２−２は、２,３,４−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｅから得られたアルジトールアセテートのみが検出されたのに対し、Ｆｒ２−１は、２,３,４,６−ｔｅｔｒａ−、２,３,４−ｔｒｉ−、２,４−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｅから得られたアルジトールアセテートが検出された。^１Ｈ ＮＭＲ測定の結果、各フラクションから得られたシクロデキストラン及び分枝シクロデキストランの結合様式は、α結合であることが分かっているため、メチル化分析の結果から、Ｆｒ２−２は、→６）−α−Ｇｌｃｐ−（１→残基のみからなることが分かった。また、Ｆｒ２−１は、非還元末端のα−Ｇｌｃｐ−（１→と、→３,６）−α−Ｇｌｃｐ−（１→残基を有することがわかった。

以上の結果から、図１に示されたようにシクロデキストラン混合物から検出された各ピークの帰属が決定された。

次に、各種デキストランから分枝シクロデキストランを調製した。
（シクロデキストラン混合物の調製）
４種類の市販デキストラン「Batch No.７５２７」、「Batch No.３５２７」、「Batch No.５２７」（いずれもFison Limited社製）、「Ｔ−１０加水分解物」(Ｔ−１０（Pharmacia Fine Chemicals社製）を、０.１Ｎ ＨＣｌで２時間加水分解したサンプル)を原料として環状イソマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼ（ＣＩＴａｓｅ：特許文献５に記載されたＴ−３０４０株由来の組換えＣＩＴａｓｅ）を用いてシクロデキストラン混合物を調製した。１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）（５００μＬ）にデキストラン１０ｍｇをそれぞれ溶解し、ＣＩＴａｓｅ６μｇを加えて４０℃で３７０分間反応させた。反応後、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。エタノール、続いて精製水を流したSep-Pak C18 カートリッジ（ウォーターズ社製）に反応液をそれぞれ流した後、精製水で洗浄し、次いで２０容量％エタノールで生成されたシクロデキストラン混合物を溶出させた。得られた溶出液を減圧下で濃縮した後、濃縮液を凍結乾燥することによりシクロデキストラン混合物を得た。

（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる分枝シクロデキストランの同定）
得られたシクロデキストラン混合物について、実施例１と同様の条件でＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を行い、溶出時間からシクロデキストラン混合物に含まれる成分の同定を行った（図７参照）。すべての反応物で、ＣＩ−７,ＣＩ−８,ＣＩ−９,ＣＩ−１０に相当するピークが検出された。さらに、ＣＩｂ−９,ＣＩｂ−１０,ＣＩｂ−１１に相当するピークも検出された。分枝シクロデキストランは、基質により存在比が異なり、Ｔ−１０加水分解物を基質とした時より、Batch No.７５２７、Batch No.３５２７、Batch No.５２７を基質とした方が、より多くの分枝シクロデキストランを生成した。このことから、基質を変えることにより、分枝シクロデキストランの生成量を調整できることが分かった。

分取した分枝シクロデキストランの可溶化能について調べた。Ｃ６０フラーレン（東京化成社製、Ｂ１６４１）の１ｍｇを、１ｍｇ／ｍｌのサンプル（可溶化剤）を含む水溶液の０.５ｍｌに懸濁した。その後、４,０００ｇで１０分間（２０℃）遠心分離して上清を分取した。上清中のＣ６０フラーレン量は、上清を適宜希釈して２６８ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を用いて定量した。検量線は以下の方法で作成した。１ｍｇ／ｍｌのγシクロデキストリン（ｇＣＤ）水溶液に可溶化した、Ｃ６０フラーレン液を凍結乾燥して秤量し、加えたｇＣＤ質量との差から、可溶化したＣ６０フラーレン質量を算出した。また、この水溶液を適宜希釈（Ｃ６０フラーレン：０.５〜８μｇ／ｍｌ）して、２６８ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。その結果を図７に示した。なお、Ｃ６０フラーレンの添加量は過剰量であり、遠心分離した後には全ての溶液で沈殿を生じていた。

サンプルには、実施例１で用いられたシクロデキストラン混合物（Ｃｉｍｉｘ）、実施例１で分離されたシクロデキストラン（ＣＩ−７,ＣＩ−８,ＣＩ−９）及び分枝シクロデキストラン（ＣＩｂ−９,ＣＩｂ−１０）を用いた。また、参考のために、重合度の異なる３種類のシクロデキストリン（αシクロデキストリン（ａＣＤ）,βシクロデキストリン（ｂＣＤ）,γシクロデキストリン（ｇＣＤ））、高重合度シクロデキストリン（ＣＡＳＳ,ＣＡＳ,ＣＡＬ）、市販デキストランＴ−１０（ＤｅｘＴ１０：Pharmacia Fine Chemicals社製）、グルクロノキシランナトリウム塩（ＧＸ：江崎グリコ製）、カードラン（Ｃｕｒｄｌ）、塩化ナトリウム、グルコース（Ｇｌｃ）、グルクロノキシランアンモニウム塩（ＧＸＮＨ４：江崎グリコ社製）を用いた。また、各サンプルは２６８ｎｍに吸収を示さないことが確認されている。

この結果によると、シクロデキストラン混合物はシクロデキストランや分枝シクロデキストランよりもフラーレンの可溶化能は低いと言えるが、シクロデキストラン混合物から単離精製したシクロデキストラン（ＣＩ−７,ＣＩ−８,ＣＩ−９）や分枝シクロデキストラン（ＣＩｂ−９,ＣＩｂ−１０）は、フラーレンを包接して可溶化するシクロデキストリンとほぼ同等の可溶化能を示した。特に、ＣＩｂ−９はｇＣＤや他のシクロデキストランと比べて約２倍の可溶化能を示した。

（フラーレンの可溶化能２）
Ｃ７０フラーレン（Strem Chemicals, Inc.製）の０.６ｍｇを、１ｍｇ／ｍｌのサンプルを含む水溶液の０.３ｍｌに懸濁した。その後、実施例２と同様に操作を行い、各サンプルの可能化能を測定した。なお、Ｃ７０フラーレンの添加量は過剰量であり、遠心分離した後には全ての溶液で沈殿を生じていた。

サンプルには、実施例１で分離されたシクロデキストラン（ＣＩ−８、ＣＩ−９）及び分枝シクロデキストラン（ＣＩｂ−９,ＣＩｂ−１０）、γシクロデキストリン（ｇＣＤ）を用いた。この結果から、分離された分枝シクロデキストランは分枝を有しないシクロデキストラン（ＣＩ−８,ＣＩ−９）に比べてＣ７０フラーレンの可溶化能が高いと言える。

このように分枝シクロデキストランはフラーレンを可溶化する性質を有し、分枝を有しないシクロデキストランと同様に各種の物質を包接する可能性があると言える。

（デキストランスクラーゼ阻害活性）
Leuconostoc mesenteroides由来デキストランスクラーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）の０.１８units／ｍｌと試験サンプル（０.１２５ｍＭ）を、４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５.２）中で、３０℃で６０分間インキュベートした。同体積の１００ｍｇ／ｍｌスクロース水溶液を加えて、さらに３０℃で２０分間インキュベートした。水酸化ナトリウム水溶液を最終濃度が０.２Ｍとなるように加えて反応を停止した。反応液中の還元糖量を、Park-Johnson法により定量した。スクラーゼ活性は、試験サンプルがない時に生じる還元糖量を１００％とし、これに対する相対量で示した。その結果を図８に示す。分枝を有するシクロデキストランは、分枝を有しないシクロデキストランとほぼ同様のデキストランスクラーゼ阻害活性を示した。このように、本発明の分枝シクロデキストランはう蝕の発生を防止する抗う蝕剤として利用し得る。

次に本発明の分岐シクロデキストランを用いた各種化粧品を製造した。
（乳液の調製）
油相部として（１）ステアリン酸２.０、（２）セチルアルコール１.５、（３）デカメチルペンタシクロシロキサン３.０、（４）ジメチルポリシロキサン（６ｃｓ）５.０、（５）イソステアリン酸ポリグリセリル３.０、（６）ワセリン０.５、（７）ポリオキシエチレンモノオレイン酸エステル２.０及び水相部として（８）分枝シクロデキストラン（重合度９）０.００１、（９）Ｃ６０フラーレン０.０１、（１０）カルボキシビニルポリマー０.２、（１１）１，３−ブチレングリコール５.０、（１２）グリセリン３.０、（１３）水酸化カリウム１.０、（１４）適量のメチルパラベン、（１５）残部の精製水から乳液１００を調製した（各質量部）。（１５）に（８）を溶かした溶液に（９）を加えて、超音波を投射してフラーレンの溶液を作製した。この溶液に（１０）〜（１４）を加え７０℃で混合し、これに油相部（１）〜（７）を混合溶解したものを添加して乳化を行い、冷却処理をして乳液を得た。
（ローションの調製）
（１）エタノール１０.０、（２）グリセリン１.５、（３）クエン酸ナトリウム０.０９、（４）クエン酸０.０２、（５）パラオキシ安息香酸メチル０.０５、（６）Ｃ７０フラーレン０.００５、（７）分枝シクロデキストラン０.０１、（８）適量の香料、（９）残部の精製水から化粧水１００を調製した。（９）に（７）を溶かした溶液に（６）を加えて、超音波を投射してフラーレンの溶液を得た。ここに（１）〜（５）（８）を加えて混合溶解して化粧水を得た。

本発明は新規な分枝シクロデキストラン及びその用途を提供し、例えば、当該分枝シクロデキストランはフラーレンの可溶化剤及び抗う蝕剤として利用され得る。

Claims (9)

1. フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを混合する工程を含むフラーレンが親水系溶媒に溶解した溶液の調製方法。
2. フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、８分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを混合する工程を含むフラーレンが親水系溶媒に溶解した溶液の調製方法。
3. フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランα−１,３−分枝シクロデキストランを含むフラーレンが可溶化された溶液。
4. フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、８分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含むフラーレンが可溶化された溶液。
5. フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含むシクロデキストランを含まない乳化組成物。
6. フラーレンを含む乳化組成物の調整方法であって、
   フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを混合する工程を含む調整方法。
7. フラーレンと、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを含む皮膚外用剤。
8. フラーレンを含む皮膚外用剤の調整方法であって、
   フラーレンと、親水系溶媒と、１分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを混合する工程を含む調整方法。
9. １分子のグルコースがα−１,３−結合で、７分子から１０分子のグルコースからなる環状デキストランに結合したα−１,３−分枝シクロデキストランを有効成分とする抗う蝕剤。

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