WO2002033073A1

WO2002033073A1 - Anticorps agoniste degrade

Info

Publication number: WO2002033073A1
Application number: PCT/JP2001/009260
Authority: WO
Inventors: Naoshi Fukushima; Masayuki Tsuchiya; Shinsuke Uno; Toshihiko Ohtomo; Naohiro Yabuta; Hiroyuki Tsunoda
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2002-04-25
Also published as: EP1327681A1; CA2424371A1; AU2002210918B2; AU1091802A; EP1327681A4

Description

明細書

低分子化ァゴニスト抗体技術分野

本発明は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、モノクロ ^ナル抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2っ以上含む改変抗体に関する。当該改変抗体は、細胞表面分子を架橋することにより細胞内にシグナルを伝達しうるァゴニスト作用を有しており、種々の医薬として有用である。背景技術

特開平 9— 295999号公報は、脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として当該脾臓間質細胞株を感作抗原とするモノクロ一ナル抗体の作製を試み、抗原としてマウス Integrin Associated Protein (マウス I A P) を認識する新規モノクロナル抗体の取得を記載している。また、特開平 9 - 295999号公報は、モノクロナル抗体が骨髄系細胞にアポト一シスを誘起する特性を有することを開示している。

WO 99/12973は、ヒ卜の Integrin Associated Protein (以下ヒ卜 I APとする； J. Cell Biol. , 123， 485-496, 1993にアミノ酸配列及び塩基配列が記载；： Tournal of Cell Science, 108， 3419-3425, 1995) を抗原とするモノクローナル抗体であって、当該ヒト I APを有する有核血液細胞（骨髄系細胞及びリンパ球）にアポトーシスを誘起させる特性を有するモノクローナル MAB L— 1抗体、 MABL— 2抗体、これを産生するハイブリド ^マ、 MAB L— 1 (F ERM BP— 6100) 及び MABL— 2 (FERM B P- 6101 ) を記载している。

特願平 1 1— 63557号は、ヒト I APを抗原とするモノクローナル抗体から、ヒト I APを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する一本鎖の F V領域を有する一本鎖 F Vを得たことを開示している。しかし、 I A Pを抗原とするモノクロナル抗体の投与は、 I A Pを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起するものの、 in vitroで赤血球の凝集作用をもたらす。これは、 I A Pを抗原とするモノクローナノレ抗体を多量に生体内に投与した場合、赤血球の凝集という弊害が生じる可能性があることを示唆するものである。

本発明者らは、ヒト I A Pを抗原とするモノクローナル抗体を用いて、上記の血液疾患の治療薬等として利用するべく鋭意研究した結果、ヒト I A Pを有する有核血液細胞にアポト"シスを誘起する特性を有する一本鎖の F V領域を有する —本鎖 F Vを得た。

一方、改変抗体、特に低分子化抗体、例えば一本鎖 F vは、その低分子化により組織、腫瘍等への移行性を改善し、遺伝子工学的に調製する目的で開発されたものであるが、近年、一本鎖 F vのダイマ^"、特に、二重特異性 [bispecific] のダイマーが細胞同士の架橋を目的として使用されている。このようなダイマ一としては、代表的には癌細胞抗原と N K細胞や好中球など宿主細胞抗原を認識する一本鎖 F Vのへテロダイマ^が知られている（Kipriyanov et al. , Int. J.

Cancer, 77， 9763 - 9772, 1998)。これらは、細胞間架橋を誘導させることにより癌を治療するためのより効率的な改変抗体として、一本鎖 F Vの構築技術から作成されたものである。このため、抗体およびその断片（例えば F a b断片など）および二重特異性の改変抗体、さらには単一特異性である一本鎖 F Vのダイマーでも細胞間の架橋が誘導されると考えられていた。

また、細胞表面分子を架橋してシグナルを伝達しうるモノクローナル抗体として、例えば細胞の分化 ·増殖に関与する E P O受容体に対する抗体（特開 2 0 0 0— 9 5 8 0 0号公報）、 M u S K受容体に対する抗体（Xie et al. , Nature Biotech. 15， 768-771, 1997) などが知られている。しかし、低分子化した改変抗体については報告はない。

そこで、先ず本発明者は上記 MA B L— 1および MA B L - 2抗体から作製した一本鎖 F Vのモノマーは細胞にアポ卜シスを誘起せず、一本鎖 F Vのダイマ一が I A Pを有する細胞に対してアポトーシスを誘導することに注目し、これらが細胞表面上の I A P受容体を架橋（2量体化）することにより当該細胞にシグナルが伝達されて、その結果アポトーシスが誘導されたことを突き止めた。即ち、これは、単一特異性の一本鎖 F Vダイマーが細胞表面上の分子（例えば受容体）を架橋することにより、リガンドと同様にシグナルを伝達し、これによりァゴ- スト作用を示しうること示唆するものである。

次に細胞間の架橋形成に注目したところ、前記モノク口ーナル抗体は赤血球凝集を引き起こすが、前記一本鎖 F Vのダイマは赤血球凝集を起こさないことを見出した。同様の結果は、一本鎖 2価抗体（2っのH鎖V領域及び2っのL鎖V 領域を含む一本鎖ポリペプチド）でも観察された。即ち、これはモノクロ^ナル抗体では細胞間で架橋が形成される可能性があるのに対して、一本鎖 F vダイマまたは一本鎖 2価抗体等の改変抗体では、細胞表面上の分子を架橋するが、細胞間の架橋を形成しないことを示唆するものである。

本発明者は、これらの結果から、一本鎖 F Vダイマーや一本鎖 2価抗体等の改変抗体が、従来知られていた細胞間の架橋への使用に限らず、同じ細胞の細胞表面分子あるいは細胞内分子を架橋する、当該分子に対するリガンド（特に天然のリガンドの作用を模倣するようなリガンド）として特に適していることを初めて見出した。

さらに、本発明者は、抗体分子（w h o l e I g G ) を一本鎖 F vダイマ一または一本鎖 2価抗体などの改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して、細胞に所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明の改変抗体は、 T P O、 E P O、 G— S C Fなどの天然のリガンドまたは当該改変抗体と同じ V領域を有する w h o 1 eの抗体（I g G ) と比較して顕著に高い活性を有しており、さらに抗体分子に比べ分子量が小さく、定常領域を有しないという特徴から、組織移行性が向上しているという特徴を有している。発明の開示

本発明の課題は、細胞表面分子または細胞内の分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む低分子化ァゴニスト改変抗体を提供することである。

従って、本発明は、細胞表面分子または細胞內の分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上、好ましくは各々 2〜 6、さらに好ましくは各々 2〜 4、特に好ましくは各々 2つ含む改変抗体に関する。

本明細書において「改変抗体」とは、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V 領域を 2つ以上含み、これら各 V領域を直接的あるいはリンカ一等を介して共有結合およびノまたは非共有結合により結合した任意の物質を意味する。具体的には、抗体の各 V領域をぺプチドリンカ一、化学架橋剤等のリンカで結合したポリペプチドまたは化合物等があげられる。なお、本発明の改変抗体において、抗体由来の 2つ以上の H鎖 V領域及び L鎖 V領域は各々、同一または異なる抗体由来の H鎮 V領域及び L鎖 V領域であってもよい。

本発明の改変抗体は、好ましくは 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F vのダイマー、トリマー、テトラマ"等のマルチマ^であるか、又は 2つ以上の H鎖 V領域及び 2つ以上の L鎖 V領域を含む一本鎖ポリぺプチドである。本発明の改変抗体が 1つの H鎮 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F Vのダイマー、トリマー、テトラマー等のマルチマーである場合、同じ鎖上の H 鎖 V領域及び L鎖 V領域は互レ、に連合して 1つの抗原結合部位を形成していないものが好ましい。

特に好ましくは、 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F Vのダイマ^"、又は 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む一本鎖ポリぺプチドである。該改変抗体中において、 H鎖 V領域及び L鎖 V領域は、好ましくはリンカ^"を介して連結されている。

本明細書において「ァゴ二スト作用」とは、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより細胞内にシグナルが伝達されて該細胞に生じる生物学的作用をレ、い、具体的には、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導、細胞周期調節作用等の作用をいう。本発明において、ァゴニスト作用の ED50値は、公知のァゴニスト作用の測定法より求めることができる。具体的には、ァゴニスト特異的な細胞死、細胞増殖、細胞分化特異的なタンパク質（例えば特異的抗原）の発現の検出、細胞周期特異的なキナゼ活性の測定などが挙げられ、反応容量曲線の最大活性を 1 0 0 %とし、その反応率 5 0 %となる用量を E D 5 0 °/₀値とする。

本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同一の抗原結合領域を有する抗体、即ち. 当該改変抗体の抗原結合領域を形成する H鎖 V領域と L鎖 V領域の対と同一の H 鎖 V領域と L鎖 V領域の対を有する I g G等の wholeの抗体（以下、親抗体という）と比較して同等以上のァゴニスト作用（ED50値）を示すものが好ましい。さらに、親抗体と比較して 2倍以上、好ましくは 5倍以上、さらに好ましくは 1 0 倍以上のァゴ-スト作用（ED50値）を示すものが好ましい。また、標的の細胞表面分子または細胞内分子には結合するが、該分子に対するァゴニスト作用を実質的に有さない親抗体と同一の抗原結合領域を形成する H鎖 V領域と L鎖 V領域の対を有する改変抗体であって、当該改変抗体はァゴニスト作用を有するものも本発明に含まれる。

本発明の抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む化合物とは、細胞表面分子または細胞内分子に結合する天然のリガンドと比較して同等以上のァゴニスト作用（ED50値）を示し、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V 領域を 2つ以上含む化合物であればいかなるものでもよく、当該分子に結合する天然のリガンドと比較して 2倍以上、好ましくは 5倍以上、さらに好ましくは 1 0倍以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す化合物が好ましい。

ここでいう「化合物」とは、本発明の改変抗体に限らず、 w h o l eの抗体、 F ( a b ' ) ₂等、 2つ以上、好ましくは 2〜 6、さらに好ましくは 2〜4、特に好ましくは 2つの抗原結合部位を有するものであればいかなるものも含まれる。

本発明の抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体または化合物は、細胞間接着作用を実質的に有さないものが好ましい。また、本発明の改変抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域が同一のモノクロ一ナル抗体由来である場合、もとのモノクローナル抗体と比較して、 1/ 1 0以下の細胞間接着作用（ED 値）を示すものが好ましい。

本発明において、細胞間接着作用の ED50値とは、公知のァゴニスト作用の測定法より求めることができる。具体的には、前記細胞表面分子を発現する細胞の凝集作用、例えば赤血球作用の測定が挙げられる。

本発明は前記改変抗体をコードする D N Aに関する。

本発明は前記改変抗体を産生する動物細胞または微生物に関する。

本発明は前記改変抗体のァゴニストとしての使用に関する。

本発明は前記改変抗体を用いて細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより細胞内にシグナル伝達を起し、該細胞にアポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導、細胞周期調節作用等のァゴニスト作用を生じさせる方法に関する。

本発明は、上記改変抗体を有効成分として含む医薬に関する。

本発明は、上記改変抗体の医薬としての使用に関する。

本発明は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体のスタリユング方法又は測定方法であって、 1 ) 当該分子に特異的に結合する抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体を作製し、 2 ) 当該分子を発現している細胞と該改変抗体とを接触させ、 3 ) 当該分子を架橋することにより該細胞に生ずるァゴニスト作用を測定する、工程を含むスクリ一二ング方法又は測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の改変抗体を医薬品として製造する場合の品質管理に用いることができる。

前記一本鎖 F vのダイマーは、非共有結合によるダイマー、架橋基を介した共有結合によるダイマ一、さらに前記一本鎖 F Vと結合しうる架橋剤（抗体、抗体断片、又は 2価の改変抗体）を介したダイマーが包含される。ダイマを形成させる架橋基は、ペプチドの架橋に用いられている公知の架橋基を用いることができるが、例えばシスティン残基によるジスルフィド架橋、他の架橋基、例えば C₄ 〜C ₁₀アルキレン（例えば、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、または C₄〜C _t。アルケニレン（cisZ trans— 3—ブテニレン、 cisZtrans— 2—ペンテ二レン、 cisZtrans— 3—ペンテニレンおよび cis/trans— 3 —へキセニレンなど）である。

また、一本鎖 F Vと結合しうる架橋剤は、例えば F V中に随意に導入しうるァミノ酸配列、例えば F L A G配列等に対する抗体もしくはその断片、またはその抗体由来の改変抗体、例えば一本鎖 F Vである。

本発明はまた、細胞表面分子または細胞内分子に結合する第 1のリガンドと第 2のリガンドを投与し、さらに第 1及び第 2のリガンドに結合して、前記第 1及び第 2のリガンドを架橋する物質を投与することを特徴とする、細胞にァゴニスト作用を誘導する方法に関する。ここで、第 1及び第 2のリガンドは、当該分子に対する結合部位を 1つ有し、架橋されることによりァゴニスト作用を誘導しうるものであればいかなるものでもよいが、好ましくは同一又は異なる一本鎖 F V モノマ^"、抗体断片等の一価の改変抗体である。また、前記リガンドを架橋する物質は、第 1のリガンドと第 2のリガンドを架橋して細胞にァゴニスト作用を誘導する物質であればいかなるものでもよいが、好ましくは抗体、抗体断片、 F ( a b ) ₂又は 2価の改変抗体である。ここで、 2価の抗体の例としては、 F ( a b ) ₂、 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F vのダイマーである力 \ 又は 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む一本鎖ポリぺプチドが挙げられる。本方法は、架橋されてシグナルを細胞に伝達する受容体の探索に有効なだけでなく、薬剤のターゲット分子への D D Sへの応用も期待でき、副作用の抑制や、所望の時期に所望の時間薬剤の効力を発揮させうる薬剤投与システムとして有用である。

本発明の改変抗体はまた、抗体（例えば、 MA B L— 1抗体、 MA B L— 2抗体、 1 2 B 5抗体、 1 2 E 1 0抗体など）の L鎖 V領域及び H鎖 V領域を含み、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質）、または前記蛋白質もしくは細胞膜タンパク質の糖鎖を特異的に認識して当該分子を架橋し、これにより細胞内にシグナルを伝達しうるものであればいかなるものでもよく、さらには、この V馈域のアミノ酸配列の一部を改変した改変抗体も包含される。本発明の改変抗体は、結合する細胞表面分子または細胞内分子、具体的には個々の細胞表面分子または細胞内分子の構造や作用機序等に応じて、単一特異性 (mono-specific) 改変抗体でも、二重特異性（bi- specif ic) 改変抗体等の多重特異性（multi- specific) 改変抗体であってもよい。結合する分子が homodimer 化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、エリスロポエチン受容体、トロンボポェチン受容体、 G— C S F受容体、 S C F受容体、 E G F受容体、 I A P ( C D 47) など）の場合は、 mono- specificな改変抗体であることが好ましく、結合する分子が heterodimer化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、 I L - 6受容体、 L I F受容体。 I L _ l 1受容体）の場合は、 bi- specificな改変抗体が好ましい。結合する分子が heterotrimer化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、 I L— 2受容体、 C N T F受容体、〇S M受容体）の場合は、 tri-specificな改変抗体が好ましい。二重特異性の一本鎖 F Vダイマの製造方法は、たとえば W09413804号等により公知である。

本発明はまた、改変抗体の H鎖 V領域及び Z又は L鎮 V領域が、ヒト抗体由来の H鎖 V領域及び Z又はヒト抗体由来の L鎖 V領域である改変抗体に関する。ヒト抗体由来の H鎖 V領域及び L鎖 V領域は、例えば WO 9 9 / 1 0 4 9 4号公報に記載された方法のように、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーをスクリー二ングすることにより得ることができる。また、トランスジエニックマウス等から作製されたヒトモノクローナル抗体由来の H鎖 V領域及び L鎖 V領域も包含される。

さらに本発明は、改変抗体の H鎖 V領域及び Z又は L鎖 V領域が、ヒト型化 H 鎖 V領域及び Z又はヒト型化 L鎖 V領域である改変抗体に関する。詳細には、ヒトモノクローナノレ抗体 L鎖 V領域のフレ^ "ムワーク領域（F R ) とヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥシ、ヒッジ、サルなど）のモノクローナル抗体の L鎖 V領域の相補性決定領域（complementarity determining region；以下 C D Rとする）を含むヒト型化 L鎖 V領域及び/又はヒトモノクローナル抗体 H鎖 V領域の F Rとヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥシ、ヒッジ、サルなど）モノクローナル抗体の H鎖 V領域の C D Rを含むヒト型化 H鎖 V 領域から構成される。この場合、 C D Rおよび F Rのアミノ酸配列を一部改変

(例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。

本発明はまた、改変抗体の H鎖 V領域及び/又は L鎖 V領域が、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ゥシ、ヒッジ、サル、ニヮトリなど）のモノクロ ^ナル抗体由来の H鎖 V領域及び Z又は L鎖 V領域も包含される。この場合、 C D Rおよび F Rのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。

本発明はまた、前記種々の改変抗体をコードする D NA、該 D NAを含んで成る組換えベクターを製造する遺伝子工学的方法に関する。

本発明はまた、該組換えベクターにより形質転換された宿主に関する。宿主は、例えばヒト細胞、マウス細胞などの動物細胞、又は大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物である。

本発明はまた、上記の宿主を培養し、培養物から改変抗体を採取することを特徴とする、改変抗体の製造方法に関する。

さらに本発明は、一本鎖 F Vを産生する宿主動物細胞を無血清培地で培養して該培地中に一本鎖 F Vを分泌させ、該培地中で形成された一本鎖 F Vのダイマ" を含む該培地上清を精製することを特徴とする一本鎖 F Vのダイマ^"の製造方法に関する。

本発明はまた、改変抗体のァゴニストとしての使用に関する。即ち、前記得られた改変抗体を有効成分として含有するシグナル伝達ァゴニストに関する。本発明において改変抗体は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋して、これによりシグナノレ伝達を誘起しうるものであるため、当該分子は、リガンドと結合して、オリゴマ"化、例えば 2量体化が促進され、その結果シグナルを細胞内に伝達しうる分子であればいかなるものもよい。

そのような細胞表面分子には、例えばホルモン受容体やサイトカイン受容体が包含される。ホルモン受容体には、例えばエストロゲン受容体等が包含される。サイトカイン受容体等には、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体等が包含される。サイトカイン受容体の例としては、エリスロポエチン（EPO) 受容体、トロンボポェチン（TPO) 受容体、顆粒球コロニ刺激因子（G— CSF) 受容体、マクロフア^"ジコロニー刺激因子（M— CSF) 受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM—CS F) 受容体、腫瘍壊死因子（TNF) 受容体、インターロイキン一 1 (I L一 1) 受容体、インターロイキン一 2 ( I L- 2) 受容体、インタロイキン一 3 ( I L- 3) 受容体、インタロイキン一 4 (I L一 4) 受容体、インタロイキン一 5 (I L— 5) 受容体、インタ^"ロイキン— 6 ( I L-6) 受容体、インタロイキン _7 ( I L- 7) 受容体、インタ^"ロイキン一 9 (I L—9) 受容体、インタロイキン一 10 (I L— 10) 受容体、インタ"ロイキン一 11

(I L—l 1) 受容体、インタロイキン一 1 2 (I L— 12) 受容体、インタ一ロイキン一 13 ( I L- 13) 受容体、インタロイキン一 15 (I L— 1 5) 受容体、インタ一フエロン一α (I FN—α) 受容体、インターフェロン一 β ( I FN-β) 受容体、インターフェロン一 γ (I FN— γ) 受容体、成長ホルモン (GH) 受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（SCF) 受容体、血管内皮増殖因子（VEGF) 受容体、上皮細胞増殖因子（EGF) 受容体、神経成長因子（NGF) 受容体、線維芽細胞増殖因子（FGF) 受容体、血小板由来増殖因子（PDGF) 受容体、トランスフォーミング増殖因子一 β (TGF-β) 受容体、白血球遊走阻止因子（L I F) 受容体、毛様体神経栄養因子（CNT F) 受容体、オンコスタチン M (OSM) 受容体および No t c hファミリー受容体等を挙げることができる。

また、細胞内分子としては、例えば TAK1と TAB 1が挙げられる。 TAK 1と TAB 1は、 TGF— /3のシグナル伝達経路で作用し、へテ口ダイマ一を形成することによりマップキナーゼを活性し、一連のシグナを伝達する。多くの癌細胞では、その増殖を抑制する TGF— J3の受容体に変異があり、 TGF— 3 によるシグナルが伝達されない。このため、 TAK1と TAB 1を架橋することによりシグナルを伝達しうる改変抗体は、 TAK1/TAB 1に結合してァゴニステックに作用して T G F— シグナルを誘導することができる。そのような本発明の改変抗体は T G F— i3抵抗性の癌細胞の増殖を抑制し得るため、本発明により新たな癌の治療法が提供される。他の細胞内分子の例として、細胞増殖に作用する転写因子 E 2 Fホモダイマーおよび E 2 F /D P 1ヘテロダイマーが挙げられる。こうした分子に対しても本発明の改変抗体はァゴニスト作用を誘導しうるものであり、細胞増殖に関連する種々の疾患の治療に用いることができる。また、本発明の改変抗体を用いて、アポトーシス誘導に関わるシグナル伝達に関連する細胞内因子を架橋してァゴニスト作用を誘導し、癌細胞または自己免疫疾患に関わる細胞にアポトーシス細胞死を誘導することができる。

細胞内分子に本発明の改変抗体を作用させる場合、細胞内に当該改変抗体を輸送する手法として、例えば、細胞膜透過機能を有するペプチド（例えば Pegelin や Penetratinなど) を 1可加すること (Martine Mazel etal. , Doxorubicin- peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-Cancer Drugs 2001, 12、 Dcrossi D. et al. ， The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450. ) により本発明の改変抗体を細胞内に輸送させることが可能である _c 故に、本発明のァゴニスト改変抗体を有効成分として含有する医薬製剤は、癌、炎症、ホルモン異常、血液疾患、自己免疫疾患などの治療及び/又は予防に有用である。

受容体タンパク質が形成しうるオリゴマーは、ホモオリゴマであっても、へテロオリゴマーであってもよいし、ダイマ^"、トリマー、テトラマ一、などのいずれのオリゴマーであってもよい。例えば、エリスロポエチン受容体、トロンボポェチン受容体、 G— C S F受容体、 S C F受容体、 E G F受容体などは、ホモダイマーを形成し、 I L一 6受容体、 L I F受容体、 I L一 1 1受容体はへテロダイマーを形成し、 I L一 2受容体、 C N T F受容体、 O S M受容体はへテロトリマーを形成することが知られている。

本発明の改変抗体は、モノクローナル抗体に由来する H鎖 V領域を 2つ以上及びし鎖 V領域を 2つ以上含む。当該改変抗体の構成としては、好ましくは 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F Vのダイマ^"又は 2つの H鎖 V 領域及び 2つの L鎖 V領域を含むポリべプチドとすることができる。該改変抗体中において、 H鎖および L鎖の V領域は、 1個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカ一を介して連結されているのが好ましい。これらの改変抗体は、モノクローナル抗体の可変領域を含有し、もとのモノクロナル抗体と同一の特異性をもつて抗原に結合する。

H鎖 V領域

本発明において、抗体に由来する H鎖 V領域には、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質）、または前記蛋白質もしくは細胞膜上の糖鎖を認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマ"化、例えば 2量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体の H鎖 V 領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥシ、ヒッジ、サルなど）に由来する H鎖 V領域又は前記 H鎖 V領域のアミノ酸配列を一部改変した H鎖 V領域も本発明における H鎖 V領域に包含されるが、ヒトモノクローナル抗体 H鎖 V領域の F Rとマウスモノクローナル抗体の H鎖 V領域の C D Rを含むヒト型化 H鎖 V領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト由来のアミノ酸配列を有する H鎖 V領域も好ましい。また、本発明の H鎖 V領域には、前記 H鎮 V領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。

L鎖 V領域

本発明における L鎖 V領域には、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質)、または前記蛋白質もしくは細胞膜上の糖鎖を認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマー化、例えば 2量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体の L鎖 V領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラッ卜、ゥシ、ヒッジ、サルなど）に由来する L鎖 V領域又は前記 L鎖 V領域のァミノ酸配列を一部改変した L鎖 V領域も本発明における L鎖 V領域に包含されるが、ヒトモノクロ^"ナ /レ抗体 L鎖 V領域の F Rとマウスモノクローナル抗体の L鎖 V領域の C D Rを含むヒト型化し鎖 V領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を有する L鎖 V領域も好ましい。また、本発明の L鎖 V領域には、前記 L鎖 V領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。

相補性决定領域（C D R )

L鎖及び H鎖の各 V領域は抗原結合部位を形成し、 L鎖及び H鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された 4個のフレームワークと 3個の超可変又は相補性决定領域（C D R ) により連結されている（Kabat, E. A.ら、「Sequences of Proteins of Immunological InteirestJ US Dept. Health and human services, 1983) ₀

前記 4個のフレームヮク領域（F R ) の多くの部分は β—シート構造をとり、その結果 3個の C D Rはループを形成し、 C D Rは場合により β—シート構造の —部分を形成することもある。 3個の C D Rは F Rによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の 3個の C D Rと共に抗原結合部位の形成に寄与する。

これらの C D R領域は、得られた抗体の V領域のァミノ酸配列と既知抗体の V 領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、 Kaba1;， E. A. ら、「Sequences of Proteins of Immunological InterestJ の経験貝l力ら見出すことができる。

一本鎖 F V

一本鎖 F vは、モノクローナル抗体に由来する、連結した H鎖 V領域及び L鎮

V領域を含むポリペプチドのモノマーであり、得られる一本鎖 F Vはもとのモノクローナル抗体の可変領域を含有し、相補性決定領域を保存するため、もとのモノクロナル抗体と同一の特異性をもって抗原に結合する（特願平 1 1— 6 3 5

5 7号)。さらに、本発明の一本鎖 F Vにおいて、前記可変領域および Zまたは C D Rの一部またはそのアミノ酸配列の一部を改変（例えば、欠失、置換又は付カロ）することができる。本発明の一本鎖 F Vを構成する H鎖 V領域及び L鎖 V領域は上述したものであり、 H鎖 V領域と L鎖 V領域を直接又はリンカ一、好ましくはペプチドリンカ一を介して連結することができ、その構成としては、 [H鎖 V 領域] 一 [： L鎖 V領域]、 [ L鎖 V領域] ― [ H鎖 V領域] のいずれでもよい。本発明においては、これら一本鎖 F Vはダイマー、トリマ一又はテトラマーを形成させ、本発明の改変抗体とすることができる。

一本鎖改変抗体

本発明の 2つ以上の H鎖 V領域及び 2つ以上の L鎖 V領域、好ましくは各々 2 〜4、特に好ましくは各々 2つ含む一本鎖改変抗体は、上述のような 2つ以上の H鎖 V領域と L鎖 V領域をそれぞれ含有する。このポリペプチドにおいて各領域は、該一本鎖改変抗体が特定の立体構造、具体的には一本鎖 F Vのダイマが構成する立体構造を模倣し得るよう配置させる必要があり、例えば

[H鎖 V領域] 一 [L鎖 V領域] 一 [H鎖 V領域] ― [L鎖 V領域] 又は

[L鎖 V領域] 一 [H鎖 V領域] 一 [L鎖 V領域] 一 [H鎖 V領域] の順序で各領域が配置され、これらの領域はリンカを介して連結される。

リンカー

本発明において、 H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意のぺプチドリンカー、又は合成化合物リンカ、例えば、 Protein Engineering, 9(3)， 299-305, 1996 に開示されるリンカ^を用いることができる。これらのリンカ一は同一分子内で同じ又は異なっていてもよレ、。ペプチドリンカを所望する場合、各々のリンカ一の例としては：

S e r

G 1 y · a e r

G 1 y · G 1 y · S e r

S e r ' G l y ' G l y

G 1 y · G 1 y · G 1 y · S e r

S e r · G 1 y ■ G 1 y · G 1 y

G 1 y · G 1 y ■ G 1 y ' G】 y ' S e r

S e r - G l y - G l y - G l y - G l y

G l y ' G l y ' G l y ' G】 y ' G l y ' S e r

S e r ' G l y ' G】 y ' G l y ' G l y ' G l y

G l y ' G l y ' G l y ' G l y ' G l y ' G l y ' S e r S e r . G l y . G l y . G l y . G l y . G l y . G l y

(G l y - G l y - G l y - G l y - S e r) n

(S e r · G 1 y ■ G 1 y - G 1 y · G 1 y ) n

[nは 1以上の整数である] を挙げることができる。好ましいリンカ一ペプチドの長さは抗原となる受容体によって異なるが、一本鎖 F Vにおいては通常 1〜2 0アミノ酸であるのが好ましい。 2つ以上の H鎮 V領域及び 2つ以上の L鎖 V領域を含む一本鎖改変抗体においては、 [H鎖 V領域] 一 [L鎖 V領域] (又は [L 鎖 V領域] ― [H鎖 V領域]) からなる同一の抗原結合部位を形成するもの同士を連結するためのぺプチドリンカーの長さは 1〜 30アミノ酸、好ましくは 1〜2 0アミノ酸、さらに好ましくは 3〜18アミノ酸である。また、 [H鎖 V領域] ― [L鎖 V領域] (又は [ 鎖領域] ― [H鎖 V領域]) からなる同一の抗原結合部位を形成しないもの同士を連結するためのペプチドリンカ^"の長さは 1〜40 アミノ酸、好ましくは 3〜 30アミノ酸、さらに好ましくは 5〜 20アミノ酸である。これらのリンカを導入する方法は本発明の改変抗体をコードする DNA の構築方法の説明において述べる。

本発明における化学合成物リンカ一（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS)

ジスクシンイミジノレスべレート（DS S)、ビス（スノレホスクシンィミジル）スべレト（B S³)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネト）（DS P)、ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTS S P)、エチレングリコ^ルビス（スクシンイミジノレスクシネート）（EGS)、エチレングリコノレビス（スルホスクシンィミジルスクシネート）（スノレホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST：)、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩（スルホ一 DS T)、ビス [2— (スクシンイミドォキシカルボニルォキシ）ェチル] スルホン (B SOCOES)、ビス [2— （スノレホスクシンイミドォキシカノレボニルォキシ）ェチル] スルホン（スルホー B S OCOE S) などであり、これらの架橋剤は市販されている。また、化学合成物リンカ一の長さは、上述のペプチドリンカ一の長さに相当する長さであるのが好ましい。特に、一本鎖 F vのダイマーを形成させる場合、宿主細胞で産生された一本鎖モノマを培地等の溶液中で、 20%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、最も好ましくは 90%以上ダイマー化するのに適したリンカ一を選択することが好ましく、具体的には 2〜 1 2アミノ酸、より好ましくは 3 〜 10アミノ酸、またはこれに相当する他のリンカが好ましい。

改変抗体の製造

改変抗体は、細胞表面分子に特異的に結合する既知または新規なモノクローナノレ抗体由来の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを前述のリンカ一を介して連結することにより得られる。一本鎖 F vの例として、 MABL— 1抗体、 MABL— 2抗体に由来する H鎖 V領域と L鎖 V領域を有するものを MAB L 1— s c F v、 MA BL 2— s c F vとする。 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む一本鎮ポリペプチドの例としては、前記モノクロ^"ナ /レ抗体由来の H鎖 V領域と L鎖 V 領域を有するものを MAB L 1— s c (F v)₂、 MAB L 2— s c (F v)₂ とする _c これらポリぺプチドを製造するにあたり、該ポリぺプチドが分泌性であることを所望する場合は、その N—末端にシグナルペプチドを付加することができる。また、該ポリペプチドの効率的精製等のために、ポリペプチド精製において有用である公知の配列、例えば FLAG配列などを揷入することができる。この場合、杭 F LAG抗体を用いてダイマ形成させることもできる。

本発明の改変を作製するためには、これをコードする DNA、即ち一本鎖 F v を 3 ドする DN A又は再構成一本鎖ポリぺプチドをコードする DNAを得る必要がある。これらの DNAは、例えば MAB L 1 - s c F v、 MAB L 2— s c F v、 MAB L 1— s c (F v)₂及び Z又は MAB L 2- s c (F v)₂の場合には前記 F v由来の H鎖 V領域及び L鎖 V領域をコードする DNAを用いて、又はこれらの DN Aを铸型とし、その配列内の所望のアミノ酸配列をコ一ドする DNA 部分を、その両端を規定するプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PC R) 法により増幅することにより得ることができる。

各 V領域について、ァミノ酸配列の一部改変を所望する場合には、 P C R法を用いる公知の方法によって 1又は数個のアミノ酸が改変された、即ち 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列を有する V領域を得ることができる。特定の抗原に対して十分に活性がある改変抗体を作製するために、 PCR法を用いる公知の方法によつて前記 V領域のァミノ酸配列の一部を改変することが望ましい。

PCRに用いるプライマを决定するにあたり、所望のモノクローナル抗体由来の H鎖及び： L鎖のタイビングをして両鎖の型を決める必要がある。 MABL— 1抗体、 MAB L— 2抗体の場合、 1^ 81^— 1抗体は1^型1^鎖及び丫1型の1^ 鎖を有し、 MABL— 2抗体は κ型 L鎖及び γ 2 a型の H鎖を有することが明らかになつている（特願平； L 1— 63557号)。前記 MAB L— 1抗体及び/又は MAB L— 2抗体の H鎖 V領域及び L鎖 V領域をコ一ドする DNAを PCR法を用いて増幅するには、 Jones, S. T.ら、 Bio/Technology， 9, 88 - 89, 1991に記載されているプライマを用いることができる。

次に、 PCR法を用いて MAB L— 1抗体及び MAB L— 2抗体のレ鎖 V領域を増幅するため、 5 '—末端ォリゴヌクレオチドプライマ及び 3 '—未端ォリゴヌクレオチドプライマを上述のように決定する。同様にして、 MABL— 1抗体の H鎖 V領域及び MAB L— 2抗体の H鎖 V領域の増幅のため、それぞれ 5'— 末端プライマー及び 3'—末端プライマーを決定する。

その例として本発明においては、 5'—末端プライマ^"はその 5'—末端近傍に制限酵素 H i n f I切断部位を提供する配列 G ANT Cを含有し、そして 3'—末端プライマーはその 5 '—末端近傍に制限酵素 Xm a I切断部位を提供するヌクレォチド配列 C C C G G Gを含有するものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコ一ドする目的の DNA断片をクロユングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でもよい。

特に設計された PCRプライマ一を用いて、 MABL— 1、 MABL— 2抗体の各 V領域をコードする c DNAをそれらの 5'—及び 3'—未端において適当な塩基配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明では Ko z a k配列の導入により翻訳効率を上げるように工夫されている）。次に、これらのプライマーを用いて P CRにより増幅して得た MAB L— 1、 MAB L— 2抗体の各 V領域を、所望のヒト C領域をすでに含有する HE F発現ベクター（WO 92- 19759参照）に揷入した。クロン化された DNAの配列決定は任意の常法、例えば、自動 DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社製）を用いて行うことができる。

本発明の改変抗体において、リンカー、例えばべプチドリンカ一は次のように導入することができる。即ち、上述の H鎖 V領域及び L鎖 V領域のためのプライマと一部相補的な配列を有し、且つ該リンカ一の N—末端または C—末端をコドするようにプライマーを設計し、これを用いて PC Rを行うことによって所望のアミノ酸配列および長さを有するペプチドリンカ一をコドする DNAを作成することができる。そして、該 DNAを介して H鎖 V領域及び L鎖 V領域をコ一ドする DN Aを連結すれば、所望のぺプチドリンカを有する本発明の改変抗体をコードする DN Aを得ることができる。さらに、 1つの改変抗体をコードする DNAを得ることができれば、前記 DNAを錄型にして、そして種々のリンカ一用のプライマを設計し、これを用いて PC Rを実施すれば、所望のペプチドリン力を有する改変抗体又はリン力を有さない改変抗体をコ^"ドする DNA は容易に得ることができる。

また、本発明における改変抗体の各鎮 V領域は、従来の技術（例えば、 Sato, K. ら、 Cancer Res.， 53, 1-6 (1993)を参照のこと）を用いることによって、ヒト型化することが可能であり、また一旦ヒト型化された各鎖 V領域をコードする DN Aが作製されれば、ヒト型化一本鎖 F v、ヒト型化一本鎖 F v断片、ヒト型化モノクローナル抗体あるいはヒト型化モノクローナル抗体断片は、常法に従って容易に作出する事が可能である。さらに、必要な場合、これらの V領域のアミノ酸配列の一部を改変することも可能である。

さらに、遺伝子工学における' I賞用技術を用いて上述のマウス由来の H鎖 V領域及び L鎖 V領域をコドする DNAと同様に、これらに相当する他の哺乳動物由来の DNA、例えばヒト抗体由来の各鎖 V領域をコードする DNAを得ることができる。得られた DN Aを用いて、他の哺乳動物、特にヒト抗体由来の H鎖 V領域及び L鎖 V領域、ヒト由来の一本鎖 F V及びその断片、並びにヒト由来のモノクローナル抗体及びその断片を得ることができる。

本発明の改変抗体が、二重特異性（bi - specific) 改変抗体である場合、公知の方法（例えば、 W09413804号公報に記載の方法）により作製することができる。以上のように、目的とする改変抗体の各鎖 V領域、ヒト型化改変抗体の各鎖 V 領域をコドする D N Aが作製されれば、それらを含有する発現べクタ、及び該発現べクタ^により形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。また、常法に従って宿主を培養し、産生した再構成一本鎖 F v、再構成ヒト型化一本鎖 F v、ヒト型化モノクローナル抗体及びヒト型化モノクローナル抗体断片は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。この場合、通常の蛋白質で用いられる分離 ·精製方法、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せて、本発明の改変抗体を分離 ·精製することができるが、これらに限定されるものではない。

再構成一本鎖 F Vを動物細胞、例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞などの動物培養細胞、好ましくは C H〇細胞で産生する場合、無血清培地で該再構成一本鎖 F Vを産生させると、培地中で形成した該一本鎖 F Vのダイマーを安定的に高収率で回収'精製することができる。さらに、このようにして精製された該ダイマは、長期間、安定してダイマの状態で保存することができる。この場合に用いることができる無血清培地は、通常組み換えタンパク質の産生に用いられている培地であればいかなるものでもよく、特に限定されるものではない。

本発明の改変抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明の改変抗体は哺乳類細胞、例えば C O S 7細胞又は C HO細胞中で発現される。

これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト 'サイトメガロウィルス（Human cytomegalovirus： H CMV) 前期（immediate early) プロモーターを使用するのが好ましレ、。 HCMVプロモーターを含有する発現ベクターの例には、 HCMV— VH— HC_Y1、 HCMV— VL—HCK等であって、 P S V 2 n e oに由来するプラスミドベクター（国際公開公報 WO 92/19759参照）が包含される。

また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモ^ "ターとしてはレトロウイルス、ポリオマウィルス、アデノウィルス、シミアンゥイノレス 40 (SV40) などのウイノレスプロモターやヒト -ポリペプチドチェ ^"ン ·エロンゲ^"シヨン · ファクター la (HEF- 1α) などの哺乳動物細胞由来のプロモ^"タ^"を用いればよい。例えば S V40のプロモータを使用する場合は、 Mulligan, R. C.らの方法（Nature, 277, 108-114, (1979))、また、 HEF_ 1αプロモ^タ^を使用する場合は、 Mizushima, S.らの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, (1990)) に従えば容易に実施することができる。

複製起原（o r i) としては、 SV40、ポリオマウィルス、アデノウィルス、牛パピローマウィルス（BPV) 等の由来の o r iを用いることができ、さらに発現べクタは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼ APH (3 ') IIあるいは I (n e o) 遺伝子、チミジンキナーゼ（TK) 遺伝子、大腸菌キサンチンーグァニンホスホリボシルトランスフェラゼ（E c o g p t) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR) 遺伝子等を含むことができる。

上述のように作成した改変抗体の抗原結合活性は、ラジオィムノアッセィ（R I A)、酵素標識固相免疫測定法（EL I SA) または表面プラズモン共鳴等の既知の方法で測定することができる。また、元のモノクローナノレ抗体の結合阻害能を指標にして、具体的には該モノクローナル抗体のその抗原への濃度依存的阻害作用の有無を指標にして評価することができる。

詳細には、本発明の改変抗体をコ一ドする DNAを包含する発現ベクターで形質転換した動物細胞、例えば COS 7細胞又は CHO細胞を培養し、前記培養した細胞及び Z又はその培養上清、又はこれらから精製した改変抗体を用いて抗原への結合を測定する。対照として発現ベクターのみで形質転換した細胞の培養上清などを用いる。抗原、例えば MAB L— 1抗体、 MAB L— 2抗体の場合にはヒト I A Pを発現するマウス白血病細胞株 L 1 2 1 0細胞に、本発明の改変抗体などの試験試料又は対照の培養上清を加え、例えばフローサイトメトリーを実施して抗原結合活性を評価する。

in vitro でのシグナル伝達誘起効果（MA B L— 1抗体、 MA B L— 2抗体の場合はアポトーシス誘導効果）は、抗原を発現する細胞又は該抗原遺伝子を導入した細胞に、前述の改変抗体の試験試料を添加し、当該細胞においてシグナル伝達による変化（例えば、ヒト I A P抗原特異的に細胞死を誘導するか否か）を既知の測定方法で評価することができる。

in vivo での評価試験は、例えば改変抗体がヒト I A Pを認識する場合（例えば MA B L— 1抗体、 MA B L— 2抗体由来の改変抗体）、アポト^"シス誘起効果として、次の通りに行う。先ずヒト骨髄腫のモデルマウスを作成し、当該マウスに I A Pを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体、本発明の改変抗体を静脈投与する。対照群には P B Sのみを投与する。そして、アポトーシス誘起を、抗腫瘍効果としてマウス血清中のヒト I g Gの量の変化及び生存期間によって評価する。

上述のように、標的である細胞表面分子又は細胞内分子に特異的に結合する. H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体を作製し、例えば上記の In vitroまたは In vivoでの評価試験により本発明の改変抗体をスクリユングすることによって、本発明の改変抗体を取得することができる。

本発明の改変抗体は、 2つ以上の H鎖 V領域及び 2つ以上のし鎖 V領域、好ましくは各々 2〜4、特に好ましくは各々 2つ含むものであり、 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F Vのダイマ、又は 2つ以上の H鎮 V領域及び 2つ以上の L鎖 V領域を連結した一本鎖ポリペプチドである。このような構成をとることで、もとのモノクロ "ナノレ抗体の抗原結合部位の立体構造を模倣して、優れた抗原結合性を保持するものと考えられる。

本発明の改変抗体は、抗体分子（w h o 1 e I g G) と比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらにもとのァゴニスト抗体分子よりも高い活性を有する。このため、本発明の改変抗体の親抗体を適宜選択することによって、種々のシグナルを細胞内に伝達して、当該細胞において種々の作用、例えばアポシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用を誘導することがでる。故に、これを含有する医薬製剤は、シグナル伝達の誘起が疾病の治療に有効である、例えば癌、炎症、ホルモン異常、自己免疫疾患並びに白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および真性多血症などの血液疾患の治療薬としての利用が期待される。また、 R I標識による造影剤としての利用も期待され、 R I化合物ゃトキシン等の他の化合物と結合させることにより、効力を増強させることも可能である。発明を実施するための最良の形態

次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。

本発明の改変抗体の製造方法を、下記の一本鎖 F Vの作製を例にして説明する。本発明の改変抗体の製造方法において用いる、ヒト I APに対するマウス MAB L— 1、 MAB L— 2抗体を産生するハイブリド^"マ、 MABL— 1及び MAB L一 2は、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に、 1997年 9月 1 1曰に、受託番号それぞれ FERM B P— 6 100、 FERM B P— 6 10 1として国際寄託されている。

実施例

実施例 1 (ヒト I APに対するマウスモノクローナル抗体の V領域をコードする DNAのクローン化）

ヒト I APに対するマウスモノクロ一ナル抗体 MAB L— 1及び MAB L— 2 の可変領域をコドする DNAを次のようにしてクローン化した。

1. 1 メッセンジャー RNA (mRNA) の調製

ハイブリドーマ MAB L— 1及び MAB L— 2からの; mRNAを、 raRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech社製）を用いて調製した。 1. 2 二本鎖 cDNAの合成

約 lpgの mRNAより Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH社製）を用いて二本鎖 cDNAを合成し、アダプターを連結した。

1. 3 抗体可変領域をコドする遺伝子の PC R法による増幅

Thermal Cycler (PERKIN ELMER社製）を用いて P C R法を行った。

(1) MAB L— 1 L鎖 V領域をコドする遺伝子の増幅

P C R法に使用するブラィマ^"は、アダプタの部分配列とハイプリダイズする配列番号： 1に示すアダプタープライマー 1 (CLONTECH社製）、及びマウス力ッパ型 L鎖 C領域配列とハイブリダイズする配列番号： 2に示す MK C (Mouse Kappa Constant) プライマ^ (Bio/Technology, 9, 88 - 89， 1991) を用いた。

卩〇溶液50 1は、 5μ 1の 1 OxP CR Buffer II、 2 mM Mg C l₂、 0. 16 mM dNTP s (dATP、 dGTP、 dCTP、 d TTP)ヽ 2. 5ュニットの DNAポリメラーゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKIN ELMER社製）、 0. 2μ Μの配列番号： 1に示すアダプタプライマーと 0. 2μΜの配列番号： 2に示す MKCプライマ及び MAB L— 1由来の二本鎖 c DNA O. lpgを含有し、 9 4 °Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間及び 72 °Cにて 1分 20秒間、この順序で加熱した。この温度サイクノレを 35回反復した後、反応混合物を更に 72°Cで 10分間加熱した。

(2) MAB L— 1 H鎖 V領域をコードする c DNAの増幅

P CRのためのプライマ^"として配列番号： 1に示すアダプタープライマ 1. 及び配列番号： 3に示す MHC— γΐ (Mouse Heavy Constant) プライマー

(Bio/Technology, 9， 88-89, 1991) を用いた。

c DNAの増幅は、 0. 2μΜの MKCプライマーの代わりに◦. 2μΜの MHC —γΐプライマーを用いて増幅した点を除いて、前記 1. 3 (1) においてし鎖 V 領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。

(3) MAB L— 2 L鎖 V領域をコードする c DNAの増幅

P C Rのためのプライマとして配列番号： 1に示すアダプタープライマ一 1. 及び配列番号： 2に示す MKCプライマーを用いた。 cDNAの増幅は、 MAB L— 1由来の二本鎖 c DNA 0. 1μ_§の代わりに M AB L— 2由来の二本鎖 cDNA 0. 1 μ gを用いて増幅した点を除いて、前記 3 (1) において MAB L— 1し鎖 V領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。

(4) MAB L— 2 H鎖 V領域をコドする c DNAの増幅

P CRのためのプライマーとして配列番号： 1に示すアダプタープライマー 1、及び配列番号： 4に示す MHC— γ 2 aプライマー（Bio/Technology, 9， 88-89， 1991) を用いた。

cDNAの増幅は、 0. 2μΜの MKCプライマの代わりに 0. 2μΜの MHC 一 _Y2 aプライマを用いて増幅した点を除いて、前記 1. 3 (3) において L鎖 V領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。

1. 4 PCR生成物の精製

前記のようにして PCR法により增幅した DNA断片を QIAquick PGR

Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 1 mM ED T Aを含有する 1 OmM T r i s— HC 1 (pH8.0) に溶解した。

1. 5 連結及び形質転換

上記のようにして調製した MABL— 1由来マウスカッパ型 L鎖 V領域をコードする遺伝子を含んで成る DN A断片約 140 n gを p GEM— T E a s yベクタ (Promega 社製） 50 n gと、 30 mM T r i s— HC 1 (pH7. 8)、 1 OmM Mg C l₂、 10 mM ジチオスレイトノレ、 1 mM ATP及び 3ュニット T4 DNAリガーゼ（Promega社製）を含有する反応混合液中で、 1 5 °Cにて 3時間反応させ連結した。

次に、 1 μ 1の上記連結混合液を大腸菌 D Η5αのコンビテント細胞（東洋紡社製） 50μ 1に加え、そしてこの細胞を氷上で 30分間、 42°Cにて 1分間そして再び氷上で 2分間静置した。次いで 10 Ομΐの SOC培地（GIBCO BRL社製）を加え、 100pg/m 1のアンピシリン（SIGMA社製）を含有する L B

(Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Sambrookら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 寒天培地上にこの大腸菌を塗布し、 37 °Cにて終夜培養して大腸菌形質転換体を得た。

この形質転換体を、 5 OpgZm 1のアンピシリンを含有する LB培地 3 m 1中で 37 °Cにて終夜培養し、そしてこの培養物から QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド DN Aを調製した。

こうして得られた、ハイブリドーマ MAB L— 1に由来するマウスカッパ型 L 鎖 V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを p GEM— Ml Lと命名した。

上記の同じ方法に従って、ハイブリド^"マ MAB L— 1に由来するマウス H鎖 V領域をコ"ドする遺伝子を含有するプラスミドを精製 DNA断片から作製し、 p GEM— Ml Hと命名した。

また、ハイブリドーマ MAB L— 2に由来するマウスカッパ型 L鎖 V領域をコ ^"ドする遺伝子を含有するプラスミドを精製 DN A断片から作製し、 pGEM— M2 Lと命名した。

また、ハイプリドーマ MAB L— 2に由来するマウス H鎖 V領域をコドする遺伝子を含有するプラスミドを精製 DNA断片から作製し、 pGEM— M2Hと命名した。

実施例 2 (DNAの塩基配列の決定）

前記のプラスミド中の cDNAコード領域の塩基配列の決定は、自動 DNAシ ^ケンサ" (Applied Biosystem社製）及び ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem社製) を用レヽて、メーカー指定のプロトコールに従って行った。

プラスミド p GEM— Ml Lに含まれるマウス MAB L— 1抗体の L鎖 V領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 5に示す。

また、プラスミド p GEM— Ml Hに含まれるマウス MAB L— 1抗体の H鎖 V領域をコ一ドする遺伝子の塩基配列を配列番号： 6に示す。

また、プラスミド p GEM— M 2しに含まれるマウス MAB L— 2抗体の: L鎖 V領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 7に示す。

また、プラスミド p GEM— M2 Hに含まれるマウス MAB L— 2抗体の H鎖 V領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 8に示す。

実施例 3 (CDRの决定）

L鎖及び H鎖の V領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ 4つのフレームワーク部分が 3つの超可変領域、即ち相補性決定領域（CDR) により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、 CD R領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat, E. A. ら、「Sequences of Proteins of Immunological ェ nterest」 US Dept. Health and Human Services, 1983)。

このような事実に基づき、ヒト I APに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のァミノ酸配列を K a b a tらにより作製された抗体のァミノ酸配列のデータベスにあてはめ、相同性を調べることにより〇01 領域を表1に示す如く決定した。表 1

プラスミド配列番号 CDR(l) CDR (2) CDR(3) p GEM-MI L 5 43-58 74-80 113-1 21 p GEM-MI H 6 50-54 69— 85 118-125 p GEM-M2 L 7 43-58 74-80 1 1 3-121 p GEM-M2 H 8 50-54 69-85 118- 125 実施例 4 (クローン化 c DN Aの発現の確認（キメラ MAB L— 1抗体及びキメラ MAB L— 2抗体の作製））

4. 1 キメラ MAB L— 1抗体発現ベクターの作製

キメラ MAB L— 1抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウス MAB L— 1 L鎖及び H鎖 V領域をコードする c D N Aクローン p G EM— M 1 L及び p GEM— Ml Hを P CR法により修飾した。そして HE F発現ベクター (国際公開公報 WO 92/1 9759参照）に導入した。

し鎖 V領域のための前方プライマ一 Mし S (配列番号： 9) 及び H鎖 V領域のための前方プライマー MHS (配列番号： 10) は、各々の V領域のリーダ配列の最初をコ^ "ドする DNAにハイブリダィズし且つ K o z a kコンセンサス配列 (J. mol. Biol.， 196, 947-950, 1987) 及び H i n d III制限酵素部位を有するように設計した。 L鎖 V領域のための後方プライマー MLAS (配列番号： 11) 及び H鎖 V領域のための後方プライマ MHAS (配列番号： 12) は、 J領域の末端をコードする DN A配列にハイブリダィズし且つスプライスドナ配列及び B a mH I制限酵素部位を有するように設計した。

卩〇1 溶液100 1は、 1 Ομ 1の 1 OxP C R Buffer II、 2 mM Mg C 1₂、 0. 16 mM dNTP s (dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)、 5 ユニットの DNAポリメラ」ゼ AmpliTaq Gold、 0 · 4μΜずつの各プライマー、及び 8 n gの铸型 DNA (p GEM— Ml L及び p GEM— Ml H) を含有し、 94 °Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間及び 72°Cにて 1分 20秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 35回反復した後、反応混合物を更に 72°Cで 10分間加熱した。

P CR生成物を QIAquick PCR Pur ication Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 H i n d III及び B amti Iで消化し、そして L鎖 V領域については、 HE F発現べクタ HEF— κに、 H鎖 V領域については HE F発現ベクター HE F 一 γにそれぞれクロニングした。 DNA配列決定の後、正しい DNA配列を有する DNA断片を含むプラスミドをそれぞれ HE F— Ml L、 HE F— Ml Hと命名した。

4. 2 キメラ MA B L— 2抗体発現べクタの作製

c DN Aの修飾及びクロ一ニングは、 p GEM— Ml L及び p GEM— Ml H の代わりに p GEM— M 2 L及び p G EM— M 2 Hを铸型 D N Aに増幅した点を除いて、前記 4. 1において記載したのと同じ方法により増幅及びクローユングを行い、 DNA配列決定の後、正しい DN A配列を有する DNA断片を含むブラスミドをそれぞれ HE F— M2 L、 HEF— M2Hと命名した。

4. 3 CO S 7細胞への遺伝子導入

キメラ MABL— 1抗体及びキメラ MABし一 2抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターを COS 7細胞において試験した。

(1) キメラ MAB L— 1抗体の遺伝子導入

HE F— Ml Lと HE F— Ml Hベクタを、 Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーシヨンにより COS 7細胞に同時形質転換した。各 DNA ( 1 O g) と、 PB S中 ixl 0⁷細胞 Zm 1の 0. 8m 1をキュべットに加え、 1. 5 kV、 25pFの容量にてパルスを与えた。

室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロポレーシヨン処理された細胞を、 10 %の γ—グロブリンフリゥシ胎児血清を含有する DMEM培養液（GIBC0 BRL社製）に加えた。 72時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。

(2) キメラ MAB L— 2抗体の遺伝子導入

キメラ MABし一 2抗体遺伝子の導入は、 HE F— Ml Lと HEF— M1Hベクタ^ ·の代わりに HE F— M 2 Lと HE F—M 2 Hベクターを用いた点を除いて、前記 4. 3 (1) に記載したのと同じ方法により CO S 7細胞に同時形質転換し、回収培養上清を得た。

4. フロサイトメトリー

抗原への結合を測定するため、前記 COS 7細胞培養上清を用いてフロ"サイトメトリーを行った。ヒト I A Pを発現するマウス白血病細胞株 L 1210細胞 4x 10⁵個に、キメラ MAB L— 1抗体を発現させた CO S 7細胞の培養上清あるいはキメラ MAB L— 2抗体を発現させた CO S 7細胞の培養上清あるいはコントロールとしてヒト I gG l抗体（SIGMA社製）を加え、氷上にてインキュべ —シヨン及び洗浄の後、 F I TC標識した抗ヒト I gG抗体（Cappel社製）を加えた。インキュべション及び洗浄の後、 FACS c a n装置（BEGT0N

DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。

その結果、キメラ MABし一 1抗体及びキメラ MAB L— 2抗体は、ヒト IA

Pを発現する L 1210細胞に特異的に結合したことにより、これらのキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体 MABし一 1及び MAB L— 2のそれぞれの V領域の正しレ、構造を有することが明らかとなった（図 1〜 3 )。実施例 5 (再構成 MA B L- 1抗体及び再構成 MA B L— 2抗体一本鎖 F v (s c F v) 領域の作製）

5. 1 再構成 MAB L— 1抗体一本鎖 F vの作製

再構成 MAB L— 1抗体一本鎖 F Vを次の様にして作製した。再構成 MAB L 一 1抗体 H鎖 V領域、リンカ一領域、及び再構成 MABL— 1抗体 L鎖 V領域をそれぞれ PC R法を用いて増幅し、連結することにより、再構成 MABL— 1抗体一本鎖 F vを作製した。この方法を図 4に模式的に示す。再構成 MABL— 1 抗体一本鎖 F Vの作製のために 6個の PCRプライマ（A〜F) を使用した。プライマ^ A、 C及び Eはセンス配列を有し、プライマー B、 D及び Fはアンチセンス配列を有する。

H鎖 V領域のための前方プライマー VHS (プライマー A、配列番号： 13) は、 H鎖 V領域の N末端をコードする DN Aにハイブリダィズし且つ N c o I制 P艮酵素認識部位を有するように設計した。 H鎖 V領域のための後方プライマ V HAS (プライマー B、配列番号： 14) は、 H鎖 V領域の C未端をコードする DN Aにハイブリダィズし且つリンカーとオーバーラップするように設計した。リンカ一のための前方プライマ L S (プライマー C、配列番号： 1 5) は、リンカーの N末端をコ^"ドする DNAにハイブリダイズし且つ H鎖 V領域の C末端をコ^ _ドする DNAとオ^ "バ^ "ラップするように設計した。リンカ^ "のための後方プライマー LAS (プライマー D、配列番号： 16) は、リンカ^"の C末端をコ^"ドする DNAにハイブリダイズし且つ L鎖 V領域の N未端をコドする D NAとォバーラップするように設計した。

L鎖 V領域のための前方プライマ VL S (プライマー E、配列番号： 17) は、リン力の C末端をコードする DN Aにハイブリダィズし且つ L鎖 V領域の N末端をコードする D N Aにオーバ一ラップするように設計した。 L鎖 V領域のための後方プライマ V LAS— F LAG (プライマ^ ~F、配列番号： 18) は、 L鎖 V領域の C末端をコードする DN Aにハイブリダイズし且つ F LAGぺプチドをコードする配列（Hopp, T. P.ら、 Bio/Technology， 6， 1204 - 1210, 1988)、 2個の転写停止コドン及び E c o R 【制限酵素認識部位を有するように設計した _c 第一 P CR段階において 3つの反応 A— B、 C一 D及び E— Fを行い、そして各 P C R生成物を精製した。第一 P C Rから得られた 3つの P C R生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次に、プライマー A及び Fを加えて、再構成 MAB L— 1抗体一本鎖 F Vをコードする全長 DN Aを増幅した（第二 P CR)。なお、第一 PCRにおいては、再構成 MAB L— 1抗体 H鎖 V領域をコ^" ドするプラスミド p GEM— Ml H (実施例 2を参照）、 G 1 y G 1 y G 1 y G l y S e r G l y G 1 y l y 1 y S e r 1 y 1 y G 1 y G l y S e r (配列番号： 19) からなるリン力領域をコ^"ドする DNA配列（Huston, J. S.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883， 1988) を含んで成るプラスミド p SC—DP 1、及び再構成 MABL— 1抗体 L 鎖 V領域をコ^ "ドするプラスミド pGEM— Ml L (実施例 2を参照）をそれぞれ铸型として用いた。

第一 P CR段階の溶液 5 Ομ 1は、 5μ 1の 1 OxP CR Buffer II、 2 mM Mg C l₂、 0. 16mM dNTP s、 2. 5ユニットの D N Aポリメラーゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKIN ELMER社製）、 0.4μΜずつの各プライマ^及び 5 n gの各鎵型 DNAを含有し、 94°Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 1分間、 65 °Cにて 1分間及び 72°Cにて 1分 20秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 35回反復した後、反応混合物を更に 72°Cで 7分間加熱した。

〇1^生成物 —：6 (371 b p)、 C-D (63 b p)、及び E— F (384 b p) を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、第二 PCRでアッセンブノレした。第二 PC Rにおいて、鍀型として 120 n gの第一 ?〇1 生成物ー8、 20 n gの P CR生成物 C一 D及び 120 n gの PCR生成物 E— F、 1 Ομ 1の 1 OxP C R Buffer II、 2 mM MgC l₂、 0. 16m M dNTP s、 5ユニットの DNAポリメラーゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKIN ELMER 社製）を含有する 98μ 1の P C R混合液を、 94°Cの初期温度にて 8分間そして次に 94°Cにて 2分間、 65 °Cにて 2分間及び 72 °Cにて 2分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 2回反復した後、それぞれ 0.4uMのプライマ^ · A及び Fを加えた。そして 94 °Cの初期温度にて 1分間そして次に 94°Cにて 1分間、 6 5。こて 1分間及び 7 2 °Cにて 1分 20秒間、この順序で加熱し、この温度サイクルを 3 5回反復した後、反応混合物を 7 2 °Cにて 7分間加熱した。第二 PC Rにより生じた 843 b pの DNA断片を精製し、 N c o I及び E c o R Iで消化し、得られた DNA断片を p SCFVT 7ベクタにクローニングした。なお、本発現ベクター p S CFVT 7は、大腸菌ペリブラズム分泌発現系に適する p e I Bシグナル配列（Lei， S. P.ら、 J. Bacteriology, 169， 4379- 4383, 1987) を含んでいる。 DNA配列決定の後、再構成 MA B L— 1抗体一本鎖 F Vの正しいアミノ酸配列をコードする DNA断片を含むプラスミドを p s c Mlと命名した（図 5を参照）。本プラスミド p s cMlに含まれる再構成 MAB L一 1抗体一本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 20に示す。

次に、哺乳動物細胞にて再構成 MAB L— 1抗体一本鎖 F Vを発現するべクタ ^"を作製するため、 p s cMlベクタ^"を PC R法により修飾した。そして得られた DNA断片を p CttO 1発現ベクターに導入した。なお、本発現べクタ p CH〇 1は、 DHFR— 0E— r vH— PM1— f (W09 2 1 97 5 9参照）から、 E c o R I及び Sma I消化により抗体遺伝子を削除し、 E c o R I -No t I -B amH I Ad a p t o r (宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。

PCRに使用するプライマーは、前方プライマ一として H鎖 V領域の N末端をコドする DN Aにハイブリダィズし且つ S a 1 I制限酵素認識部位を有する配列番号： 2 1に示す3 & 1— VHSプライマー及び後方プライマーとして第一フレームヮク配列の最後をコドする DNAにハイブリダィズする配列番号： 2 2に示す FRH 1 n t iプライマーを用いた。

。1溶液1 00 1は、 1 Ομ 1の 1 OxP C R Buffer II、 2mM Mg C 1₂、 0. 1 6 m dNT P s、 5ユニットの D N Aポリメラ一ゼ AmpliTaq Gold、 0. 4μΜずつの各プライマ^"、及び 8 n gの铸型 DNA (p s cMl) を含有し、 9 5 °Cの初期温度にて 9分間そして次に 9 5 °Cにて 1分間、 60 °Cにて 1分間及び 7 2 °Cにて 1分 20秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 3 5回反復した後、反応混合物を更に 72 °Cで 7分間加熱した。

P CR生成物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 S a i l及び M b o llで消化し、 N末端側再構成 MA B L- 1抗体一本鎖 F Vをコドする DNA断片を得た。また、 p s cMlベクターを Mb o II及び E c o R Iで消化し、 C末端側再構成 M A B L— 1抗体一本鎖 F vをコードする DNA断片を得た。そして、 S a 1 I一 Mb o II DNA断片及び Mb o II— E c oR I DNA断片を pGHO I g sベクタ一にクローユングした。 D N A配列決定の後、正しい DN A配列を有する DN A断片を含むプラスミドを p CHOM1と命名した（図 6を参照）。なお、本発現ベクター p CHO 1 _ I g s は、哺乳動物細胞分泌発現系に適するマウス I g G 1シグナル配列（Nature, 332, 323-327, 1988) を含んでいる。本プラスミド p C HOM 1に含まれる再構成 MA B L- 1抗体一本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 23に示す。 5. 2 再構成 MA BL- 2抗体一本鎖 F vの作製

再構成 MABL— 2抗体一本鎖 F Vを前記 5. 1に従って作製した。第一 PC Rにおいては、 p GEM— Ml Hの代わりに再構成 MAB L— 2抗体 H鎖 V領域をコードするプラスミド pGEM— M2H (実施例 2を参照）、及び pGEM— M 1 Lの代わりに再構成 MAB L— 2抗体 L鎖 V領域をコードするプラスミド p G EM-M2 L (実施例 2を参照）を使用し、再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F v の正しいアミノ酸配列をコドする DNA断片を含むプラスミド p s cM2を得た。本プラスミド p s cM2に含まれる再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 24に示す。

また、 p s cM2ベクターの修飾により再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F vの正しいアミノ酸配列をコードする DN A断片を含む哺乳動物細胞発現用 p CHO _M2ベクターを得た。本プラスミド p CHOM2に含まれる再構成 MAB L— 2 抗体一本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 25に示す。

5. 3 COS 7細胞への遺伝子導入

再構成 MABL— 2抗体一本鎖 F Vの一過性発現を観察するため、 p CHOM ₂ベクタ^ _を C〇 s 7細胞において試験した。 p CH〇M2ベクターを、 Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクト口ポレーシヨンにより CO S 7細胞に形質転換した。 DNA (10μ_§) と、 ΡΒ S中: Lxl 0⁷細胞 Zm 1の 0.8m 1をキュベットに加え、 1. 5 kV、 25pF の容量にてパルスを与えた。

室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、 10%のゥシ胎児血清を含有する IMDM培養液（GIBC0 BRL社製）に加えた。

72時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。

5. 4 COS 7細胞培養上清中の再構成 M A BL— 2抗体一本鎖 F vの検出

p CHOM2ベクターを遺伝子導入した COS 7細胞培養上清中における再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F Vをウェスタンブロッティング法により確認した。

p CHOM 2ベクタを遺伝子導入した COS 7細胞培養上清及びコントローノレとして p CH〇 1ベクタを遺伝子導入した COS 7細胞培養上清について S DS電気泳動を行い、 RE INFORCED NC膜（Schleicher & Schuell 社製）に転写した。 5⁰/₀スキムミルク（森永乳業社製）にてブロッキングを行い, 0.05%Tw e e n 20— PB Sにて洗浄後、抗 FLAG抗体（SIGMA社製）を加えた。室温にてインキュベ^ション及び洗浄の後、アルカリフォスファターゼ結合抗マウス I gG抗体（Zymed社製）を加え、室温にてインキュベーション及び洗浄後、基質溶液（Kirkegaard Perry Laboratories社製）を添加し、発色させた（図 7)。

その結果、 p CHOM2ベクター導入 CO S 7細胞培養上清中にのみ F LAG ぺプチド特異的なタンパク質が検出され、この培養上清中に再構成 MAB L— 2 抗体一本鎖 F Vが分泌されていることが明らかとなつた。

5. 5 フローサイトメトリ一

抗原への結合を測定するため、前記 COS 7細胞培養上清を用いてフローサイ卜メ卜リーを行った。ヒ卜ェ ntegrin Associated Protein ( I A P ) を発現するマウス白血病細胞株 L 1210細胞、あるいはコントロノレとして p COS 1ベクタ一を形質転換した： L 1 2 1 0細胞 2X1 0⁵個に、再構成 MABL— 2抗体一本鎖 F vを発現させた CO S 7細胞の培養上清あるいはコントロールとして p C H〇 1ベクターを形質転換した COS 7細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベーシヨン及び洗浄の後、マウス抗 FLAG抗体（SIGMA社製）を加えた。ィンキュベ ^シヨン及び洗浄の後、 F _l TC標識した抗マウス I gG抗体（BEGT0N DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、 FACS c a n装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。

その結果、再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F Vは、ヒト IAPを発現する L 1 210細胞に特異的に結合したことにより、この再構成 MABL— 2抗体一本鎖 Fvがヒト Integrin Associated Proteinに対するァフィ二ティ^を有することが明らかとなった（図 8〜11)。

0. り Comp e t i t i v e EL I SA.

マウスモノクローナル抗体の抗原結合に対する阻害活性を指標に、再構成 MA B L— 2抗体一本鎖 F Vの抗原結合活性を測定した。

IpgZm 1に調整した抗 F LAG抗体を 9 6ゥエルプレートの各ゥエルに加え、 37°Cにて 2時間インキュベートした。洗浄後、 1%B SA— PB Sにてブロッキングを行った。室温にてインキュベート及び洗浄後、分泌型ヒト IAP抗原遺伝子（配列番号： 26) を導入した C 0 S 7細胞培養上清を P B Sにて 2倍希釈したものを各ゥエルに加えた。室温にてインキュべ^"ト及び洗浄後、 l O O n g m 1に調整したピオチン化 M A B L-2抗体 50μ 1及び順次希釈した再構成 Μ ABL— 2抗体一本鎖 F V発現 COS 7細胞培養上清 50μ 1を混和したものを各ゥエルに加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、アルカリフォスファタ一ゼ結合ストレプトアビジン（Zymed社製）を加えた。室温にてインキュベート及び冼浄後、基質溶液（SIGMA社製）を加え、次に 405 nmでの吸光度を測定した。

その結果、再構成 MA B L— 2抗体一本鎖 F V (MABL 2— s c Fv) は、コントロールの p CHO 1導入 CO S 7細胞培養上清に比較して明らかに濃度依存的にマウス MAB L— 2抗体のヒト I A P抗原への結合を阻害した（図 12)。このことから、再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F Vは、マウスモノクローナル抗体 MAB L— 2のそれぞれの V領域の正しい構造を有することが示唆された。

5. 7 in vitro でのアポトーシス誘起効果

ヒト I APを遺伝子導入した L 1210細胞、及びコントロールとして p CO S 1ベクタ一を遺伝子導入した L 1210細胞、及び CCRF— CEM細胞を用い、再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F Vのアポトーシス誘起作用を An n e X i n— V (BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。

各細胞 ixl 0⁵個に、再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F v発現 COS 7細胞培養上清あるいはコントルとして: p CH〇 1ベクタ^"導入 COS 7細胞培養上清を終濃度 50%で添加し、 24時間培養した。その後、 An n e x i n— V染色を行い、 FACS c a n装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。

An n e x i n— V染色による解析の結果を図 13 18にそれぞれ示した。ここで、図の左下の領域にあるドットは生細胞を、右下の領域はアポシス初期の細胞を、右上の領域はアポトーシス後期の細胞を示す。その結果、再構成 M ABL— 2抗体一本鎖 F v (MA BL 2- s c F v) は L I 2 10細胞においてヒト I AP抗原特異的に著しい細胞死を誘導した（図 1 3 16)。また、 CGR F-C EM細胞においてもコント口ールに比較して著しい細胞死を誘導した（図 17~ 18)₀

5 - 8 CHO細胞における MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vポリペプチドの邏

MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F V (ポリペプチド）の恒常的発現 CHO細胞株を樹立するため、 p CHOM 2ベクタを CHO細胞に遺伝子導入した。

p CH〇M2ベクターを、 Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクト口ポレーシヨンにより CHO細胞に形質転換した。 DNA ( 10μ_§) と PB Sに懸濁した CHO細胞（lxl 0⁷細胞ズ m l ) の 0. 7 m 1を混合したものをキュべットに加え、 1. 5 kV 25pFの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 10%のゥシ胎児血清を含有する核酸不含 α— MEM培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。得られたクローンについて、 SDS— PAGEにて目的とするタンパク質の発現を確認し、発現量の高いクロを MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vの産生細胞株として選択した。 10 nM methotrexate (SIGMA社製）を含む無血清培地 CH O-S-S FM II (GIBCO BRL社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。

5. 9 CHO細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vの精製

5. 8で得た一本鎖 F V発現 CHO産生株の培養上清を人工透析用カートリツジ（PAN130 SF、旭メディカル）を用いて約 20倍まで濃縮した。濃縮液は一 20°Cで保存し、精製時解凍して用いた。

CHO細胞培養上清から一本鎖 F Vの精製は、 Blue- sepharose、ハイドロキシァパタイト及びゲル濾過の三種のクロマトグラフィ一により行った。

( 1 ) Blue - sepharoseカラムクロマ卜グラフ

培養上清の濃縮液を 20 mM酢酸緩衝液（ρΗ6.0) にて 10信希釈し、遠心分離（10000 r pmx30分）により不溶物を除去した。上清を同緩衝液で平衡化した Blue- sepharoseカラム（20m l ) に添加し、同緩衝液で力ラムを洗浄後、同緩衝液中 Na C 1濃度を 0. 1 0. 2 0. 3 0. 5及び 1.0 Mまで段階的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。 SD S— PAGEで素通り及び各溶出画分を分析し、一本鎖 F Vが她認された画分（0. 1 0. 3M N a C い溶出画分）をプ^"ルし、 Centriprep- 10 (アミコン）を用いて約 20倍濃縮した _c (2) ハイドロキシァパタイト

(1) の濃縮液を 10 mM リン酸緩衝液 ( p H 7.0 ) にて 10倍希釈し、ハイドロキシアパタイトカラム（20ml BioRad) に添加した。 60 m 1の 10 mM リン酸緩衝液（pH7.0) でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を 200 mMまで直線的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した（図 19)。 SDS— P A G Eにより各画分を分析した結果、画分 A及び画分 Bに一本鎖 F vが確認された。

(3) ゲル濾過

(2) の画分 A及び Bをそれぞれ Centriprep- 10を用いて濃縮し、 0. 1 5 Μ· N a C 1を含む 20 mM 酢酸緩衝液（ p H 6.0 ) で平衡化した TSKg e l G 3000 SWGカラム（21. 5x600mm) に添加した。クロマトグラムを図 20に示す。得られた画分を SDS— PAGEで分析した結果、いずれも主要ピク（A I B I ) が目的の一本鎮 F Vであり、ゲノレ濾過で分析した結果、画分 Aでは見かけ上の分子量約 36 kD、画分 Bでは同 76 kDに溶出された。精製した一本鎖 F v (A I B I ) を 15%—SD S—ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、 L a emml iの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシプリリアントブ染色した ₍ 図 21に示すように、 A I B Iいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約 35 kDに単一バンドを与えた。以上の結果から、 AIは一本鎖 F vのモノマで、 B Iは一本鎖 F Vの非共有結合性ダイマと考えられる。画分 A I及び B Iを T S K g e 1 G 3000 SWカラム（7. 5x60mm) を用いたゲル濾過により分析した結果、画分 A Iはモノマーのピクのみ、画分 B Iはダイマのピークのみ検出された（図 22を参照）。また、ダイマー画分（画分 B I) は、全一本鎖 F Vの約 4%であった。該ダイマ^"画分中のダイマ^"は、その 90°/₀以上が 4°Cで 1ヶ月以上安定的に維持された。

5. 10 大腸菌細胞での MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F vポリぺプチド発現ベクターの構築

MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vを大腸菌菌体内にて効率的に発現するべクターを作製するため、 p s cM2ベクタを PCR法により修飾した。得られた DNA断片を p S CF VT 7発現べクタ"に導入した。

PCRに使用するプライマーは、前方プライマーとして H鎖 V領域の N未端をコ^ "ドする DNAにハイブリダィズし且つ開始コドン及び N d e I制限酵素認識部位を有する配列番号： 27に示す N d e -VHSmO 2プライマ"及び後方プライマーとして L鎖 V領域の C未端をコードする DNAにハイブリダィズし且つ 2個の停止コドン及び E c o R I制限酵素認識部位を有する配列番号： 28に示す VLASプライマーを用いた。なお、前方プライマーの N d e— VHSmO 2 は大腸菌菌体内にて効率的に発現するため、 H鎖 V領域の N末端をコ一ドする D N Aにハイブリダイズする部分に 5力所の点変異を含んでいる。

じ！¾溶液100 1は、 1 Ομ 1の 1 OxP CR Buffer # 1、 1 mM Mg C l₂、 0. 2mM dNTP s、 5ユニットの KOD DNAポリメラ一ゼ（以上東洋紡社製）、 ΙμΜずつの各プライマー、及び 100 n gの铸型 DNA (p s cM2) を含有し、 98°Cにて 1 5秒間、 65。Cにて 2秒間及び 74°Cにて 30 秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 25回反復した。

PCR生成物を QIAquick PGR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 N d e I及び E c o R Iで消ィ匕し、得られた DNA断片を p S CF VT 7ベクタ一にクローニングした。なお、本発現べクタ一 p SCFVT 7は Nd e I及び E c o R Iで消化したことにより p e 1 Bシグナル配列が削除されている。 D NA配列決定の後、正しい DNA配列を有する DNA断片を含むプラスミドを p s cM2DEmO 2と命名した（図 23を参照のこと）。本プラスミド p s cM2 DEmO 2に含まれる MABL— 2抗体由来の一本鎖 F vの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号： 29に示す。

5. 11 大腸菌細胞における MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vポリペプチドの発現

MABL-2抗体由来の一本鎖 F Vポリぺプチドを発現する大腸菌株を得るため、 p s cM2DEmO 2ベクタを大腸菌 B L 21 (DE 3) p Ly s S

(STRATAGENE社製）に形質転換した。得られたクロ ^"ンについて、 SDS— PA GEにて目的とするタンパク質の発現を検討し、発現量の高いクローンを MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vポリぺプチドの産生株として選択した。

5. 12 大腸菌細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vポリペプチドの形質転換して得られた大腸菌のシングルコロニーを LB培地 3 m】にて 28°C で 7時間培養し、これを 7 Om〗の L B培地に植え継ぎ、 28°Cにて一夜培養を亍つた。この p r e— c u l t u r eを 7 Lの LB培地に植え,維ぎ、ジャーファ一メンタ一を用いて 28°C、櫈拌速度 300 r pmにて培養した。 O.D. = l. 5 のときに ImM I PTGで誘導をかけ、その後 3時間培養を行った。培養液を遠心分離（10000xg、 10分）し、沈殿として回収した菌体に 5 mM EDTA、 0. 1M Na C l、 l⁰/₀T r i t o n X— 100を含む 50 mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0) を加え、超音波（out put： 4、 duty cycle： 70%, 1分 x 10回）により菌体を破砕した。この懸濁液を遠心分離（1 2000xg、 10分）にかけ、沈殿として回収した封入体に 5 mM EDTA、 0. 1M Na C l、 %T r i o n X— 100を含む 50 mM トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) を加え、再度超音波処理（out put： 4、 duty cycle： 50%、 30秒 x2) を行い、遠心分離（12000xg、 10分）により目的蛋白質を沈殿として回収し、上清にくる夾雑蛋白質を除去した。

目的蛋白質を含んだ封入体を 6M Ur e a, 5 mM EDTA、 0. 1M N &〇 1を含む501111^ トリス塩酸緩衝液（pH8.0) に溶解し、 4M Ur e a、 5mM EDTA、 0. 1M Na C l、 10 mM メルカプトエタノノレを含む 50 mM トリス塩酸緩衝液（ p H 8.0 ) で平衡化した S e p h a c r y l S— 300 (5x90 cm, A ERSHA PHARMACIA社製）ゲノレ濾過力ラムに、流速 5 m l/分で添加し、会合している高分子量の一本鎖 F Vを除去した。各画分を SD S— PAGEで分析し、純度の高い画分について、 O. D₂₈。= 0. 25になるようにゲル濾過で用いた溶媒で希釈後、 5mM EDTA、 0. 1M Na C l、 0. 5M Ar g、 2 mM還元型グルタチオン、 0. 2 mM 酸化型グルタチオンを含む 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0) に対して透析を 3回行うことにより、巻き戻し操作を行った。さらに 0. 1 5M N a C 1を含む 2 OmM酢酸緩衝液 (pH6.0) に対して 3回透析し、溶媒交換を行った。

わずかに含まれる分子間で S—S結合で架橋された高分子を分離除去するため, 0. 15M N a C 1を含む 20 mM酢酸緩衝液（ p H 6.0 ) で平衡化した S u p e r d e x 200 p g (2.6x60 c m, AMERSHAM PHARMACIA社製）ゲル濾過カラムに添加した。図 24に示すように、高分子量の会合体と考えられるブロドなピークのあと、主要ピクとサブピークの 2つのピークが検出された。 S DS— PAGEによる分析（図 21参照）及びゲル濾過の溶出位置から、主要ピークは一本鎖 F Vポリべプチドのモノマ"であり、サブピークは非共有結合性のダイマーと考えられる。なお、形成された非共有結合性のダイマーは、全一本鎖 F Vポリぺプチドの約 4%であった。

5. 13 MAB L— 2抗体由来の精製一本鎖 F Vポリペプチドの； in vitro でのアポシス誘起効果

ヒト I APを遺伝子導入した L 1210細胞（h I A P/L 1 210) を用い C HO細胞及び大腸菌細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vポリぺプチド（MABL 2— s c F v) のアポシス誘起作用を、次の 2つのプロトコ一ルにて An n e X i n-V (BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。第一のプロトコ一ノレは、 h I AP/L 1210細胞 5x10⁴個に、抗体試料を終濃度 3 μ g /m 1で添加し、 24時間培養した。抗体試料として、実施例 5. 9 で得た CHO細胞由来 MAB L 2—本鎖 F vのモノマ及びダイさらに実施例 5, 12で得た大腸菌細胞由来の同モノ及びダイそしてコント口ールとしてマウス I g G抗体について検討した。培養後、 An n e X i n— V染色を行い、 FACS c a n装置（BEGT0N DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。

また、第二のプロトコ一ノレは、 h I AP/L 1210細胞 5x10⁴個に、抗体試料を終濃度 3 μ g /m 1で添加し、 2時間培養後に抗 F L A G抗体（SIGMA社製）を終濃度 15pgZm 1で添加し、更に 22時間培養した。抗体試料として、 5. 9で得た CHO細胞由来 MAB L 2 本鎖 F vのモノマ^及びコントロールとしてマウス I g G抗体について検討した。培養後、 An n e x i n— V染色を行い、 FAC S c a n装置にて蛍光強度を測定した。

An n e x i n一 V染色による解析の結果を図 25 31にそれぞれ示した。その結果、 CHO細胞及び大腸菌細胞産生の MAB L— 2杭体由来一本鎖 F Vポリペプチドのダイマーはコント口ル（図 25) と比較して著しい細胞死を誘導した（図 26 27) 力 S CHO細胞及び大腸菌細胞産生の一本鎖 Fvポリぺプチドのモノマのアポトーシス誘導作用は認められなかった（図 28 29)。また、抗 FLAG抗体の添加により、 CHO細胞産生の MAB L— 2抗体由来一本鎖 F Vポリペプチドのモノマーはコントロール（図 30) と比較して著しい細胞死を誘導した（図 31)。

5. 14 s c F vZC HOポリペプチドのモノマー及びダイマ^ ·のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果

(1) マウス血清ヒト I gG定量法

マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するヒト I gG (Mタンパク質）の定量は、以下の E L I S Aで行った。 0. 1 %重炭酸緩衝液（ p H 9. 6 ) で lpgZm 1に希釈したャギ抗ヒト I g G抗体（BIOSOURCE社製、 L o t # 79 02) 100μ 1を 96ゥエルプレート（Nunc社製）に加え、 4 °Cで一晚インキュベーシヨンし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希釈したマウス血清あるいは標品としてヒト I g G (Gappel社製、 L o t #009 15) 10 Ομ 1を添カ卩し、室温にて 2時間インキュベーションした。洗浄後、 5000倍希釈したアルカリフォスファタゼ標識抗ヒト I gG抗体（BIOSOURCE社製、 L o t # 6202) Ι Ο ΟμΙを加え、室温にて 1時間インキュべ^"シヨンした。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベションの後、 MICR0PLATE READER Model 3550

(BioRad社製）を用いて 405 nmの吸光度を測定し、標品のヒト I g Gの吸光度より得られた検量線から、マウス血清中のヒト I gG (Mタンパク質）濃度をした。

(2) 投与抗体の調製

s c F vZCHOポリペプチドのモノマ及びダイマ^"は、投与当日、濾過滅菌した PB S (—）を用いて、それぞれ 0.4m g/m 1.、 0. 25mgZm lになるように調製し、投与試料とした。

(3) ヒト骨髄腫マウスモデルの作製

ヒト骨髄腫マウスモデルは以下のように作製した。 SC IDマウス（日本タレァ）を用いて in vivo継代した KP MM 2細胞（特開平 7— 236475号公報）を 10 °/。ゥシ胎児血清（GIBC0 BRL社製）を含む R PMI 1640培地

(GIBC0 BRL社製）で 3x10⁷個 Zm 1になるように調製した。あらかじめ前曰抗ァシァ口 GM 1抗体（和光純薬社製、 1バイアルを 5 m 1で溶解） 100μ 1を皮下投与した S C I Dマウス（ォス、 6週齢）（日本クレア）に上記 ΚΡΜΜ2細胞懸濁液 200μ1 (6x10⁶個/マウス）を尾静脈より注入した。

(4) 抗体投与

(3) で作製したヒト骨髄腫マウスモデルに対し、 ΚΡΜΜ2細胞移植後 3 S 目より、 1日 2回、 3日間、上記（2) で調製した投与試料、モノマーは 25 Ομ 1、ダイマーは 400μ1を、尾静脈より投与した。対照として、濾過滅菌した Ρ BS (—）を同様に 1日 2回、 3日間、 20 Ομ 1、尾静脈より投与した。両群とも、 1群 7匹で行った。

(5) s c F vZCHOポリペプチドのモノマ及びダイマ^ "のヒト骨髄腫移植マゥスモデルに対する抗腫瘍効果の評価

s c F vZCHOポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫マウスモデルの抗腫瘍効果については、当該骨髄腫細胞が産生するヒト I gG (Mタンパク質）のマウス血清中の量の変化、及び生存期間で評価した。マウス血清中のヒト I gG量の変化については、 KPMM2細胞移植後 24日目に血清を採取し、上記 (1) で述べた EL I S Aを用いてヒト I gG量を測定した。その結果、 P B S (—）投与群では、血清ヒト I gG (Mタンパク質）量が約8500 §/1!1 1まで上昇しているのに対し、 s c F v/CHOダイマー投与群では対照群の 1 /10以下と顕著に低値であり、 s c F v/CHOダイマ^が KPMM 2細胞の増殖を非常に強く抑制していることが示された（図 32)。一方、生存期間についても図 33に示すとおり、 s c F vZCHOダイマー投与群では PB S (—）投与群と比較して顕著な生存期間の延長が認められた。

以上より、 s c F vZCHOダイマーがヒト骨髄腫マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。本発明の改変抗体である s c FvZCHOダイマの抗腫瘍効果は、当該改変抗体が有するアポトーシス誘起作用に基づくと考えられる。

5. 15 赤血球凝集試験

赤血球凝集試験及び赤血球凝集の判定法は、続生化学実験講座の免疫生化学研究法（日本生化学会編、東京化学同人）に準じて実施した。

健常人の血液をへパリン処理した注射筒により採血し、 PB S (―) により 3 回洗浄した後、 PB S (—）にて最終濃度が 2%の赤血球浮遊液を作製した。検查サンプルは、対照としてマウス I gG. (Zymed 社製）を用い、 MABL— 2杭体、 CHO細胞産生の一本鎖 F Vポリペプチドモノマー、ダイマー、大腸菌産生の一本鎖 F Vポリペプチドのモノマとダイマーを使用した。赤血球の凝集作用を検討するために、ファルコン社製の U底の 96ゥエルプレトを使用し、上記の抗体サンプルを 5 Ομ 1ノウエル添加した中に、 2%赤血球浮遊液をさらに 50 μ 1添加、混和し、 37 °Cで 2時間ィンキュベーション後、 4 °Cで一昼夜保存し、凝集を判定した。また、対照として、 PBS (—）を 5 Ομ 1 Zゥエル添加し、抗体サンプルと同様にして凝集試験を行った。抗体の最終濃度は、マウス I gG、 MABL— 2抗体は、 0.01、 0.1、 1、 10、 100μ g /m 1、一本鎖 F v は、 0.004、 0.04、 0.4、 4、 40、 80μ g /m 1で大腸菌産生の一本鎖 F Vポリぺプチドのダイマ一のみさらに 16 OpgZm 1の用量を設定した。その結果は、下記の表 2に示す通り、 MABL— 2抗体では、 ◦. IpgZml以上で赤血球凝集が見られたのに対し、一本鎖 F Vポリペプチドではモノマー、ダイマ共に赤血球凝集は認められなかった。

表 2

赤血球凝集試験

対照 0.01 0.1 1 10 100 ((ig/mL)

tnlgG

MABL- 2 (intact) + +++ +++ ++

対照 0.004 0.04 0.4 4 40 80 ^g/mL) scFv/CHO モノマー

scFv/CHO 'イマ一

対照 0.004 0.04 0.4 4 40 80 160 ^g/mL) scFv/E. coli モノマ- scFv/E. coli Γイマ一実施例 6 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む改変抗体 s c (F v)₂及び種々の長さのぺプチドリンカーを有する MAB L— 2抗体 s c F V

6. 1 MAB L— 2抗体 s c (F V )。発現プラスミドの構築

MAB L— 2抗体由来の 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む改変抗体 [ s c (F v)₂] を発現するプラスミドを作製するため、前述 p CHOM2 (M AB L— 2抗体由来の s c F Vをコードする DNAを含む）を以下に示す通り P CR法により修飾し、得られた DNA断片を p CHOM2に導入した。

P CRに使用するプライマーは、センスプライマ^"として EF 1αをコドする DNAにハイブリダィズする EF 1プライマ（配列番号： 30) を使用し、アンチセンスプライマーとして L鎖 V領域の C末端をコ^"ドする DNAにハイブリダィズし且つリンカ領域をコ^ "ドする DN Α配列（配列番号： 1 9) 及び S a 1 I制限酵素認識部位を有する VL LASプライマー（配列番号： 3 1) を使用した。

〇1溶液1 00 1は、 10μ 1の 1 OxP CR Buffer # 1、 1 mM Mg C l₂、 0. 2mM d NT P s (dATP、 dGTP、 dC丁 P、 d TTP)、 5 ユニットの KOD DNAポリメラーゼ（以上東洋紡社製）、 ΙμΜの各プライマ一、及び 1 00 n gの铸型 DNA (p CHOM2) を含有する。 PCR溶液を 9 4 °Cにて 3 0秒間、 50 °Cにて 30秒間及び Ί 4°Cにて 1分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを 30回反復した。

P CR生成物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 S a 1 Iで消化し、得られた DNA断片を p B 1 u e s c r i p t KS⁺ベクタ一（東洋紡社製）にクロ ^"ユングした。 DNA配列決定の後、正しい DNA 配列を有する DNA断片を含むプラスミドを S a 1 Iで消化し、得られた DNA 断片を S a 1 Iで消化した p CHOM2に Rapid DNA Ligation Kit (BOEHRINGER MANNHEIM社製）を用いて連結した。 DNA配列決定の後、正しい DN A配列を有する DNA断片を含むプラスミドを p CHOM2 (F v)₂と命名した（図 34を参照）。本プラスミド p CHOM2 (F v)₂に含まれる MAB L— 2抗体 s c (F v)₂ 領域の塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 32に示す。 6. 2 種々の長さのペプチドリンカ一を有する MAB L— 2抗体 s c F v発現プラスミドの作製

種々の長さのペプチドリンカを有し、そして [H鎖] 一 [L鎖] (以下 HL)、 [L鎖] 一 [H鎖] (以下 LH) となるように V領域を連結した s c F Vを、 MA BL—2由来のH鎖及びL鎖cDNAを鎵型として以下の通りに作製した。

HLタイプの s c F Vを作製するために、まず p GHOM2 (F v)₂を鏡型として CFHL— F 1 (配列番号： 33) 及び CFHL— R2 (配列番号： 34) プライマー、 CFHL— F 2 (配列番号： 35) 及び C F HL— R 1プライマ^

(配列番号： 036) により KODポリメラーゼにて 94°C30秒、 60°C30 秒、 72 °C 1分間の反応を 30回操り返す P C R反応を行い、 5 '側にリダー配列を含む H鎖、及び 3 '側に F L A G配列を含む L鎖の c D N A遺伝子を作製した _c 得られた H鎖及び L鎖 c DNAを錶型として混合し、 KODポリメラゼにて 9 4°C30秒、 60°C30秒、 72 °C1分間の反応を 5回繰り返す PC R反応を行レヽ、 CFHL— F 1及び CFHL— R 1プライマーを加えてさらに 30サイクル反応することによりリンカ"を含まない HL— 0タイプの cDNAを作製した。

LHタイプの s c F Vを作製するために、まず MAB L— 2の L鎖及び H鎖 V 領域の c DNAを含むプラスミド pGEM— M2 L及び pGEM— M2H (特願平 1 1一 63557参照）を铸型として、それぞれ T 7 (配列番号： 37 ) 及び CFLH—R 2 (配列番号： 38) プライマ^、 CFLH—F 2 (配列番号： 3 9) 及び CFLH— R 1 (配列番号： 40 ) プライマを用いて KODポリメラゼ（東洋紡）にて 94 °C 30秒、 60 °C 30秒、 72 °C 1分間の反応を 30回繰り返す PC R反応を行い、 5'側にリーダ一配列を含む L鎖、及び 3'側に FL AG配列を含む H鎖の c DN A遺伝子を作製した。得られた L鎖及び H鎖 c DN Aを铸型として混合し、 KODポリメラーゼにて 94°C30秒、 60°C30秒、 72 °C1分間の反応を 5回繰り返す PC R反応を行い、丁 7及び0?1^^1— 1 プライマーを加えてさらに 30サイクル反応した。この反応産物を鎊型とし、 C F LH-F 4 (配列番号： 41) 及び CF LH— R 1プライマーを用いて 94°C 30秒、 60°C30秒、 72 °C1分間の反応を 30回操り返す PC R反応を行うことによりリンカーを含まない LH— 0タイプの c DNAを作製した。

こうして作製した LH— 0、 HL— 0タイプの c DNAを制限酵素 E c o R I、 B amHI (宝酒造）処理し、 X h o I制限酵素切断部位を含まない哺乳動物発現プラスミド I NPEP4に LigaWon High (東洋紡）を用いて導入し、

Competent E. coli JM109 (二ツボンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌より QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) にてプラスミドを精製した。こうしてプラスミド pGF 21^^[—0及び〇 2HL— 0を作製した。

次に、リンカ一サイズの異なる発現プラスミドを作製するために HLタイプでは p CF 2HL— 0を鎵型として CFHL— X3 (配列番号： 42)、 CFHL- X4 (配列番号： 43)、 C FHL-X 5 (配列番号： 44)、 CFHL— X6

(配列番号： 45)、又は CFHL— X 7 (配列番号： 46) のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてベクター配列に相補的な BGH— 1 (配列番号： 47) プライマーを用いて KODポリメラーゼにて 94°C30秒、 60°C3 0秒、 72°C1分間の反応を 30回繰り返す PC R反応を行い、得られた反応産物を制限酵素 Xh o I、 B amHI (宝酒造）にて処理した。得られた断片を p CF 2HL— 0の Xh o I、 B a mH Iサイトに Ligation High (東洋紡）を用いて導入し、 Competent E. coli J M 109を形質転換した。形質転換した大腸菌ょり QIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミド p CF 2HL— 3、 pCF 2HL— 4、 p CF 2HL— 5、 p C F 2H L— 6及び p CF 2HL— 7を作製した。更に C O S 7細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、 pCF 2HL— 0、 p CF 2HL— 3、 P CF 2HL— 4、 p CF 2HL— 5、 p C F 2 H L— 6及び p C F 2 Hし— 7 を制限酵素 E c o R I及び B a mH I (宝酒造）にて処理し、約 800 b pの断片をァガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミド p COS lの: E c o R I及び B a πιΗ Iサイトに Ligation Highを用いて導入し、 Competent E. coli DH 5α (東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌より QIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミド CF 2Hし一 0/p COS l、 CF 2Hし一 3/p COS l、 C F 2 HL— 4/p CO S 1、 CF 2HL-5/p COS l , CF 2HL— 6/p COS l及び C F 2HL— 7/p COS lを作製した。代表的な例として、プラスミド CF 2HL— OZp COS 1の構造を図 35に示し、これに含まれる MABL 2 - s c F Vく H L _ 0 >の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号： 48に示す。また各プラスミドのリンカ部分の塩基配列及びァミノ酸配列を図 36に示す。

また、リンカ一サイズの異なる LHタイプの発現プラスミドを作製するため、 p C F 2 LH—0を铸型として CFLH— X 3 (配列番号： 49)、 CFLH— X 4 (配列番号： 50)、 CF LH-X 5 (配列番号： 51)、 CFLH— X6 (配列番号： 52) 又は CFLH— X 7 (配列番号： 53) のセンスプライマ及びアンチセンスプライマとしてべクタ配列に相補的な BGH— 1プライマーを用いて KODポリメラ ^"ゼにて 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C1分間の反応を 30回操り返す PC R反応を行い、得られた反応産物を制限酵素 Xh o I、 B amHIにて処理した。得られた断片を p C F 2 L H— 0の X h o I、 B am H Iサイトに Ligation Highを用いて導入し、 Competent E. coli DH 5α (東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌より QIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミド p CF 2LH— 3、 p CF 2 L H_4、 p CF 2 LH— 5、 p C F 2 L H— 6及び p C F 2 L H— 7を作製した _c 更に COS 7細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、 p CF 2 LH— 0、 p CF 2 LH— 3、 p CF 2 LH— 4、 p CF 2 LH— 5、 p C F 2 LH— 6及び p CF 2 LH— 7を制限酵素 E c o R I及び B amH I (宝酒造）にて処理し、約 800 b pの断片をァガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミド p COS 1の E c o R I及び B amH Iサイ卜に Ligation Highを用いて導入し、

Competent E. coli DH5a (東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌より QIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミド CF 2 LH— OZp COS 1、 CF 2 LH-3/p COS l, CF 2 LH— 4 Zp COS l、 CF 2 LH— 5/p COS l、 C F 2 L H— 6 Z p C O S 1及び CF 2 LH— 7ZpCOS 1を作製した。代表的な例として、プラスミド CF 2 LH-O/p COS 1の構造を図 37に示し、これに含まれる MABL 2- s c F v <LH-0 >の塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 54に示す。また各プラスミドのリンカ一部分の塩基配列及びァミノ酸配列を図 38に示す。

6. 3 COS 7細胞における s c F V及び s c (F V ) の発現

(1) 有血清培地での培養上清の調製

HLタイプ、 LHタイプ s c F V及び s c (F v)₂の発現のために、 COS 7細胞（J CRB 9 1 27、ヒュマンサイエンス振興財団）での一過的発現を行つた。 COS 7細胞は 10%牛胎児血清（HyGlone) を含む DMEM培地（GIBG0 BRL社製）にて、 37 °Cの炭酸ガス恒温槽中で経代培養した。

6. 2で構築した C F 2 HL— 0, 3〜7/p COS l、もしくは CF 2 LH— 0， 3〜7/p COS 1又は p CHOM2 (F v)₂ベクターを、 Gene Pulser装置 (BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションにより COS 7細胞にトランスフエクションした。

DNA (10μ_§) と DMEM (10^o/oFB S, 5 mM BE S (S I GMA 社））培地中 2x 10⁷細胞 Zm 1の 0. 25m 1をキュベットに加え、 10分間静置の後に 0. 1 7 kV、 95 OpFの容量にてパルスを与えた。 10分間静置の後、エレクト口ポレーシヨンされた細胞を DMEM ( 10 % F B S ) 培地に混合し、 75 cm³フラスコに加えた。 72時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に 0. 22μιηボトルトップフィルタ^ (FALCON) にて濾過し、これを培養上清（CM) とした。

(2) 無血清培地での培養上清の調製

上記（1) と同様の方法でトランスフエクシヨンした細胞を DMEM (10% FB S) 培地に加え 75 cm³フラスコにて一夜培養した後、培養上清を捨て、 P B Sにて洗浄後、 CHO— S— S FM II培地（GIBC0 BRし社製）を添加した。 7 2時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に 0. 22 pmボトルトップフィルタ一にて濾過し、 CMを得た。

6. 4 CO S 7 CM中の s c F V及び s c (F V) の検出前記 6. 3 (2) で調製した CO S 7の CM中における種々の MAB L 2— s c F v及び s c (F v)₂のポリぺプチドを下記の通りにウェスタンブロッティング法により検出した。

各 CO S 7 CMについてについて SD S— PAGEを行い、 RE I FOR C ED NC膜（Schleicher & Schuell社製）に転写した。 5 %スキムミルク (森永乳業社製）にてブロッキングを行い、 TB Sにて冼浄後、抗 F LAG抗体 (SIGMA社製）を加えた。室温にてインキュべシヨン及び洗浄の後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体（Jackson Immuno Research社製）を加え、室温にてインキュべ^"シヨン及び洗浄後、基質溶液を添加し、発色させた（図 3 9)_c 6. 5 フローサイトメトリー

MA B L 2— s c F V及び s c ( F v ) ₂のヒ卜 Integrin Assosiated Protein ( I AP) 抗原への結合を測定するため、前記 6. 3 ( 1) にて調製した CO S 7細胞培養上清を用いてフ口サイトメトリを行った。ヒト I APを発現するマウス白血病細胞株 L 1 2 1 0細胞 2x 1 0⁵個に、実施例 6. 3 ( 1) で得られた培養上清あるいは対照として CO S 7細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベシヨン及び洗浄の後、 1 OpgZm 1のマウス抗 F LAG抗体（SIGMA社製）を加えた。インキュベション及び洗浄の後、 F I TC標識抗マウス I g G 抗体（BECTON DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後- FAC S c a n装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、各 CO S 7培養上清中の種々の長さのペプチドリンカを有する MAB L 2 一 s c F V及び s c (F v)₂は、ヒト I APに対して高い親和性を有することが示された（図 40 a及び b)。

6. 6 in vitroでのアポトーシス誘起効果

前記 1. 3 ( 1 ) にて調製した CO S 7細胞培養上清について、ヒト I APを遺伝子導入した L 1 2 1 0細胞（h I APZL 1 2 1 0) に対するアポトーシス誘導作用を An a e X i n— V (BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。

h I AP L 1 2 1 0細胞 5X10⁴個に、各べクタ一を形質転換した C O S 7 細胞培養上清あるいはコントロールとして COS 7細胞培養上清を終濃度 10% で添加し、 24時間培養した。その後、 An n e x i n-V/P I染色を行い、 FACS c a n装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、 COS 7 CM中の s c F Vく HL 3， 4, 6， 7、 LH3, 4， 6, 7 > 及び s c (F v)₂は h I APZL 1210細胞に対して顕著な細胞死を誘導した。得られた結果を図 41にそれぞれ示す。

6. 7 MAB L 2— s c F V及び s c (F の CHO細胞用発現ベクターの構前記 MABL 2— s c F V及び s c (F v )₂を培養上清から精製することを目的として、これらを CHO細胞にて発現させるための発現べクタを以下のように構築した。

前記 1. 2にて調製した p CF 2HL— 0， 3〜 7及び p C F 2 L H— 0 , 3 〜7の E c oR I— B amH I断片を、 C HO細胞用発現べクタ一 p C HO 1の E c o R I及び B a mH I部位に Ligation Highを用いて導入し、 Competent E. coli DH 5αを形質転換した。形質転換した大腸菌より QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) にてプラスミドを精製した。このようにして発現プラスミド p CH OM2HL— 0， 3〜7及び〇 0^12し£<ー0, 3〜7を作製した。

6. 8 MAB L 2— s c F Vく HL— 0， 3〜 7 >、 MA B L 2— s c F vく LH-0, 3〜7〉及び s G (F v),発現 CHO細胞の作製並びにその培養上清の前記 1. 7にて構築した発現プラスミド p CHOM2HL— 0, 3〜7及び p CHOM2 LH-0, 3〜7並びにp CHOM2 ( F v ) ₂ベクターを以下の通りに C H O細胞に形質転換し、各改変抗体を恒常的に発現する C HO細胞を作製した _c その代表的な例として MAB L 2- s c F Vく HL— 5〉、 s c (F v)₂を恒常的に発現する C HO細胞の作製を下記に示す。

発現プラスミド p CHOM2 HL— 5及び p CHOM2 (F v)₂を制限酵素 P v u 1にて消化して直鎖状にし、これらを Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションにより CHO細胞にトランスフエクションした。 DN A (10pg) と、 PB S中 lxl 0⁷細胞/ m】の 0. 75m 1をキュベットにカロえ、 1. 5 kV、 25 Fの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロボレシヨン処理された細胞を、 10。/₀のゥシ胎児血清を含有する核酸含有 α— MEM培地（GIBC0 BRL社製）に加え培養した。一夜培養後、培養上清を除去し、 PB Sにてリンスした後、 10%のゥシ胎児血清を含有する核酸不含 α— MEM培地（GIBCO BRL社製）を加え培養した。約 2週間培養後、 methotrexate (SIGMA社製）を終濃度 10 nMで含有する培地で更に培養し、その後 50 nM、そして 100 nMと濃度を順次上げて培養を続けた。こうして得られた細胞を口 ^"ラ一ボトル中で無血清培地 CHO— S— SFM II (GIBCO BRL 社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に 0. 2 Ομιηフィルタ一にて濾過し、それぞれの CMを得た。

同様にして、 MABL 2— s c F Vく HL— 0, 3， 4, 6， 7〉及びく LH 一 0， 3, 4, 5， 6， 7 >を恒常的に発現する CHO細胞及びそれらの CMを得た。

6. 9 MAB L 2— s c F Vく HL— 5〉のダイマ一及び s c (F の精製下記の 2種類の精製法により前記 6. 8で得られた GMから MA B L 2- s c F v <HL- 5 >及び s c (F v )₂の精製を行った。

く精製法 1 > HL— 5及び s c (F v)₂を、そのポリペプチドの C末端の F 1 a g配列を利用した抗 F 1 a g抗体ァフィ二ティカラムクロマトグラフィ及びゲノレ濾過を用いて精製した。 150mM Na C lを含む 50mM T r i s塩酸緩衝液、 pH7. 5 (TB S) で平衡化した抗 Flag M2 Affinity gel (SIGMA) で作成したカラム（7. 9m l ) に前記 6. 8で得られた CM (l L) を添加し、 T BSでカラムを洗浄後、 0. 1Mグリシン塩酸緩衝液、 pH3. 5で s c F vを力ラムから溶出させた。得られた画分を SD SZPAGEで分析し、 s c F vの溶出を確認した。 s c F V画分を終濃度が 0.01%となるように Twe e n 20を加え、 Centricon_10 (MILLIP0RE) で濃縮した。濃縮液を 150 mM Na C l及び 0. 01°/oTwe e n 20を含む 20 mM 酢酸緩衝液、 p H 6.0で平衡化した TSKg e 1 G 3000 SWカラム（7. 5x600 mm) にかけた。流速 0.4 m 1 /ra i nで s c F vは 2 8 0 nmの吸収で検出した。 HL— 5は主要ピークとしてダイマーの位置に、 s c (F v)₂はモノマの位置にそれぞれ溶出された。く精製法 2 > HL— 5及び s c (F v)₂をイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシァパタイト及びゲル濾過の三工程で精製した。イオン交換クロマトダラフィでは、 HL— 5では Q Sepharose fast flowカラム（フアルマシア）を s c (F V )₂では SP- sepharose fast flowカラムを用い、第二工程以降は HL— 5 と s c (F V )₂で同じ条件を用いた。

(第一工程） HL— 5

HL— 5の CMは、 0. 0 2%Tw e e n 20を含む 2 OmM T r i s塩酸緩衝液、 p H 9. 0で 2倍希釈した後に、 1M T r i sで p Hを 9. 0に調整した, この後、 0. 02 %Tw e e n 20を含む 2 OmM T r i s塩酸緩衝液、 pH8. 5で平衡化した Q Sepharose fast flowカラムにかけ、同緩衝液中 0. 1 Mから 0. 5 5Mまでの Na C 1の直線濃度勾配でカラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SD SZPAGEで分析し、 HL— 5を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシァパタイトにかけた。

(第一工程） s c (F v)₂

s c ( F V )₂の CMは、 0. 0 2%Tw e e n 20を含む 20 mM 酢酸緩衝液、 p H5. 5で 2倍希釈した後に、 1 M酢酸で p Hを 5. 5に調整した。 0. 0 2 %丁 w e e n 20を含む 20 mM 酢酸緩衝液、 p H 5. 5で平衡化した SP- Sepahrose fast flowカラムにかけ、同緩衝液中、 N a C 1濃度を 0から 0. 5 Mまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SD SZP AGEで分析し、 s c (F v)₂を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシァパタィトにかけた。

(第二工程） HL— 5及び s c (F v)₂のハイドロキシァパタイトクロマトグラフィ"

第一工程で得られた HL— 5画分及び s c (F v)₂画分をそれぞれ 0. 0 2% Tw e e n 20を含む 10 mM リン酸緩衝液、 p H 7. 0で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（BioRad、タイプ I ) に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を 0. 5 Mまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリべプチドを溶出した。各画分を SDS/ PAGEで分析し、所望のポリペプチドが含まれる画分を集めた。

(第三工程） HL— 5及び s c (F v)₂のゲル濾過

第二工程で得られた各画分をそれぞれ Centriprep - 10 (MILLIPORE) で濃縮し、

0.02%Tw e e n 20及び 0. 1 5M N a C 1を含む 20 mM酢酸緩衝液、 p H6.0で平衡化した S u p e r d e x 200カラム（2. 6x60 cm、フアルマシア）にかけた。 HL— 5はダイマーに位置に、 s c (F v)HL— 5及び s c (F V )₂はモノマーの位置にそれぞれ主要ピクとして溶出された。

いずれの精製法においても、 HL— 5モノは殆ど検出されなかったことカら、一本鎖 F Vのリンカ一のアミノ酸残基数が 5個程度であれば、効率的に一本鎖 F Vのダイマーが形成できることが判明した。 HL— 5ダイマーおよび s c (F v)₂はいずれも精製された後も 4°Cで 1ヶ月間安定的に維持された。

6. 10 精製 s c F v<HL— 5 >のダイ及び s c (F V),の抗原結合活性贿

精製された MAB L 2— s G F V <HL 5〉のダイマー及び s c (F v)₂のヒト Integrin Assosiated Protein ( Γ AP) 抗原への結合を測定するため、フローサィトメトリ^"を行った。ヒト I APを発現するマウス白血病細胞株 L 1210細胞（h IAP/L 1210) 又は対照として p COS 1ベクターをトランスフエクシヨンした L 1 210細胞（p CO S 1/L 1210) 2x10⁵個に、 10μ g/m 1の精製 MAB L 2— s c F v <HL 5 >のダイ MAB L 2— s c (F v)₂、陽性対照としてモノクロナル抗体 MAB L— 2、陰性対照としてマウス I gG (Zymed社製）を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、 1 OpgZm 1のマウス抗 F LAG抗体（SIGMA社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、 F I TC標識抗マウス I gG抗体（BECT0N DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベシヨン及び洗浄の後、 FACS c a n装置（BEGT0N DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。

その結果、精製 MAB L 2— s c F vく HL 5〉のダイマー及び MA B L 2— s c (F v)₂は h I AP/L 1210細胞に特異的に結合したことにより、 s c F v <HL 5 >のダイマー及び s c (F v)₂がヒト I APに対して高い親和性を有することが示された（図 42)。

6. 1 1 精製 s c F Vく HL— 5〉のダイマー及び s c (F の in vitroァポトーシス誘起効果

精製した MAB L 2 - s G F V <HL 5 >のダイマー及び s c (F v)₂について、ヒト I A Pを遺伝子導入した L 1210細胞（h I AP/L 1210) 及びヒト白血病細胞株 CCRF— CEMに対するアポトーシス誘導作用を An n e X i n -V (BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。

h I AP/L 1210細胞 5x10⁴個あるいは C C R F— C EM細胞 1 x 1 O⁵ 個に、精製 MAB L 2— s c F v <HL 5 >のダイマー、 MAB L 2— s c (F v ) ₂、陽性対照としてモノクローナル抗体 MA B L— 2、陰性対照としてマウス I g Gを様々な濃度で添加し、 24時間培養した。その後、 An n e X i n— V 染色を行い、 FACS c a n装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、 MABL 2— s c F v<HL 5 >のダイマー及び MABL 2_ s c (F v)₂は h I AP/L 1210 C C R F— C EMの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導した（図 43)。この結果、 MAB L 2- s c F v <HL 5 > のダイマー及び MAB L 2 - s c (F v)₂は、もとのモノクロ^ "ナル抗体 MA B L —2と比較して改善されたアポシス誘導作用を有することが示された。

6. 12 精製 s c F Vく HL— 5〉のダイマー及び s c (F v)₉の赤血球凝集試 m

実施例 5. 15に従って、種々の濃度の精製した s c F Vく HL— 5>のダイマー及び s c (F V )₂の血液凝集試験を実施した。

モノクローナル抗体 MA B L— 2 (陽性対照）では血液凝集が起こるのに対して、一本鎖抗体の MAB L 2- s c (F v)₂及び MAB L 2- s c (F v)<HL 5 〉は凝集しなかった。また、 MAB L— 2抗体を用いた緩衝液の差もほとんどみられなかった。その結果を下記の表 3に示す。ヒト赤血球凝集試験

職夜: PBS ― ug/ )

cont 28.9 1445 7.225 3.6125 1.8063 0.903L 0.4516 0.2258 0.1129 0.0564 0.0282 0.0ί4ί 0.0071 0.0035 0.0018 «-¾c(Fv)2 一 — — — — — — — — — 一 — — 一 — 一 cont 28.0 140 7.0 3.5 1.75 0.875 0.4375 0.2188 0.109 0.0547 0.0273 0.0137 0.0068 0.0034 0.0017 «-¾c(Fv)<HL5> - - - - - - - - - - - - - - - - cont 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.1563 0.078L 0.0391 0.0195 0.0098 0.0049 e 画 (intact) 一 + + + + + + + + + 土一一一一一 nu

^夜: Acetate Buffer (^g/ral) _

cont 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.1563 0.0781 0.0391 0.0195 0.0098 0.0049 圆 (intact) 一 + + + + + + + + + + + — 一一一

6. 13 精製 s c F vく HL— 5〉のダイマー及び s c (F v)ゥのヒト骨髄腫マ：対する抗腫瘍効果実施例 6. 8及び 6. 9にて作製、精製した s c F Vく HL— 5〉のダイマー及び s c (F v)₂について、その抗腫瘍効果を試験した。具体的には実施例 5. 1 4 (3) で作製したヒト骨髄腫マウスモデルを用いて、マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生する Mタンパク質を EL I SAにより定量し、併せてマウスの生存日数を記録した。そして、血清中の Mタンパク質量の変化および生存日数により、 s c F Vく HL— 5〉のダイマー及び s G (F V )₂の抗腫瘍効果を評価した。

なお、本試験において HL— 5及び s c (F v)₂は、 v e h i c l e (150m M N a C 1 , 0.02%Tw e e n及び 2 OmM 酢酸緩衝液， pH6.0) 中の 0. 01、 0. 1又は Img/m 1の溶液として、投与量が 0. 1、 1または 10m g/k gになるようにマウスに投与した。また、対照は V e h i G 1 eのみを投与した。

ヒト骨髄腫細胞移植後 26日目に血清を採取し、血清中の Mタンパク質量を E L I SAにより実施例 5. 14に従って測定した。その結果、 HL— 5投与群及びダイマー及び s c (F V ) ₂投与群共に、血清中の Mタンパク質量が投与量依存的に減少していた（図 44を参照）。また、その生存期間については、 HL— 5投与群（図 45) 及び s c (F v)₂投与群（図 46) 共に対照（ v e h i c 1 e投与群）と比較して有意な生存期間の延長が観察された。これらの結果は、本発明の HL— 5及び s c (F v)₂がインビボにおいても優れた抗腫瘍作用を有することを示している。

実施例 7 ヒト MP Lに対するヒト抗体 12B 5の H鎖 V領域及び L鎖 V領域を含む一本鎖 F v

ヒト MP Lに対するヒトモノクローナル抗体 12 B 5の V領域をコドする D NAを次のようにして構築した。

7. 1 12 B 5 H鎖 V領域をコードする遺伝子の構築ヒト MP Lに結合するヒト抗体 1 2 B 5 H鎖 V領域をコードする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号 55) を用いて、その 5'末端にヒト抗体遺伝子由来のリ^ダー配列（配列番号 56) (Eur. J. Immunol. 1996； 26: 63-69) を連結させることで設計した。設計した塩基配列はそれぞれ 15 b pのォバ ^"ラップ配列を持つように 4本のオリゴヌクレオチド（12B 5VH— 1、 12B 5VH— 2、 12B 5VH— 3、 12B 5VH— 4) に分割し、 12B 5VH— 1 (配列番号 57) 及び 12B 5 VH— 3 (配列番号： 59 ) はセンス方向で、 12B 5 VH- 2 (配列番号： 58) 及び 12B 5VH— 4 (配列番号： 60) はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマ^" (12B 5 VH— S及び 12B 5 VH-A) を加え、全長の遺伝子を增幅した。なお、 12B 5VH— S (配列番号： 61) は前方プライマーでリダ配列の 5'末端にハイブリダィズし、且つ H i n d III制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また 12 B 5 VH-A (配列番号： 62) は後方プライマ^"で H鎖 V領域の C末端をコドする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナ配列ならびに B amH I制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

?〇溶液100 1は、 10μ 1の 1 OxP CR Gold Buffer II、 1. 5 mM Mg C l ₂、 0.08 mM d NT P s (dATP、 dGTP、 dCTP、 d TT P)、 5ユニットの DNAポリメラーゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKDJ ELMER社製）、 2. 5ピコモノレ [p mole] ずつの合成オリゴヌクレオチド 12 B 5 VH— 1〜4を含有し、 94°Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 2分間、 55°Cにて 2分間及び 72 °Cにて 2分間のサイクルを 2回反復した後、 l O O pmo l eずつの外側プライマー 12B 5 VH—S及び 12B 5 VH— Aを加え、さらに 9 4°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間及び 72 °Cにて 1分間のサイクルを 35 回反復した後、反応混合物を更に 72 °Cで 5分間加熱した。

PCR生成物は 1. 5 %低融点ァガロースゲル（Sigma 社製）を用い精製した後、制限酵素 B amH I及び H i n d IIIで消化し、ヒト H鎖発現べクタ一 HE F— g_Ylにクローユングした。 DN A配列決定の後、正しい DNA配列を有する DN A断片を含むプラスミドを HE F— 12 B 5 H- gylと命名した。

さらに、 HEF— 12B 5H— g_Ylを制限酵素 E c o R Iならびに B a mH I で消化し、 12 B 5 VHをコードする遺伝子を調製した後、ヒト F a b H鎖発現ベクター pCOS— F dに揷入し pF d— 12B 5Hを得た。なお、ヒト F a b H鎖発現ベクターはヒト抗体 H鎖 V領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイントロン領域ならびにヒト H鎖定常領域の一部をコードする遺伝子を含む DNA (配列番号 63) を PCR法を用い増幅した後、動物細胞発現べクタ一; p COS 1に挿入することで構築したベクターである。ヒト H鎖定常領域は HE F 一 gylを铸型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマ一としてイントロン 1の 5'端の配列とハイブリダィズし、且つ E c oR I及び B a m H I制限酵素認識配列を有するように設計した G 1 C H 1— S (配列番号 6 4)を、後方プライマとしてヒト H鎖定常領域 C HI ドメインの 3'端の DNA にハイブリダィズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよび B g 1 II制限酵素認識部位を有するように設計した G 1 C H 1— A (配列番号 65)を用いた。

プラスミド HEF— 12 B 5H- gyl及び p F d— 1 2 B 5 Hに含まれる再構成 12 B 5 H鎖可変領域の塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 66に示す。

7. 2 12 B 5 L鎖 V領域をコ^"ドする遺伝子の構築 '

ヒト MP Lに結合するヒト抗体 12 B 5 L鎖 V領域をコドする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号 67) を用い、その 5'末端にヒト抗体遺伝子 3D 6 (Nuc. Acid Res. 1990: 18； 4927) 由来のリーダ^配列（配列番号 68 ) を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ 15 b pのォ一バーラップ配列を持つように 4本のオリゴヌクレオチド（12B 5VL—: 12B 5VL-2, 12B 5VL— 3、 12B 5 VL-4) に分割し、それぞれ合成した。 12B 5VL— 1 (配列番号： 69 ) 及び 12 B 5 V L— 3 (配列番号： 71) はセンス配列、 12 B 5VL— 2 (配列番号： 70) 及び 12 B 5 V L一 4 (配列番号： 72) はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンプリさせた後、外側プライマ一（12.B 5 VL— S及び 12B 5 VL— A) を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、 12 B 5 VL-S (配列番号： 73) は前方プライマーでリダー配列の 5 '末端にハイブリダイズし、且つ H i n d III制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また 12B 5VL— A (配列番号： 74) は後方プライマ^"で L鎖 V 領域の C末端をコードする塩基配列にハイブリダィズし、且つスプライスドナ^" 配列ならびに B a mH I制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

PCR反応は上記と同様に行い、？〇生成物は1. 5。/₀低融点ァガ口一スゲノレ (Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素 B a mH I及び Bi i n d IIIで消化し、ヒト L鎖発現べクタ^ "HEF— gKにクロユングした。 DNA配列決定の後、正しい DNA配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF— 12B 5 L- g_Kと命名した。本プラスミド HE F— 1 2 B 5 L一 gKに含まれる再構成 12 B 5 L鎖 V領域の塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 75に示す。

7. 3 再構成 12B 5—本鎖 F V ( s c F V)の作製

再構成 12 B 5抗体一本鎖 F Vは 12 B 5 VH—リンカ¹ ~— 12 B 5 VLの順とし、その C末端には検出及び精製を容易にするために FLAG配列（配列番号： 76) を付加することで設計した。さらに、リンカ一配列は（G】 y₄S e r )₃ の 15アミノ酸からなるリンカ配列を用い、再構成 1 2B 5—本鎖 F V ( s c 12 B 5) を構築した。

(1) 15アミノ酸からなるリンカ^"配列を用いた再構成 12B 5—本鎖 F Vの作製

15アミノ酸からなるリンカ一を用いた再構成 12B 5抗体一本鎖 F vをコードする遺伝子は 12 B 5 H鎖 V領域、リンカ一領域、及び 12 B 5 L鎖 V領域をそれぞれ PC R法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この方法を図 47に模式的に示す。再構成 12 B 5—本鎖 F Vの作製のために 6個の PCRプライマー（A〜F) を使用した。プライマー A、 C及び Eはセンス配列を有し、プライマー B、 D及び Fはアンチセンス配列を有する。

H鎖 V領域のための前方プライマー 12 B 5— S (プライマ A、配列番号： 77) は、 H鎖リーダー配列の 5 '末端にハイブリダイズし且つ E c o R I制限酵素認識部位を有するように設計した。 H鎖 V領域のための後方プライマー H u V HJ 3 (プライマー B、配列番号： 78) は、 H鎖 V領域の C末端をコードする D N Aにハイブリダイズするように設計した。

リンカ一のための前方プライマー RHu J H3 (プライマー C、配列番号： 7 9) は、リンカの N末端をコードする DNAにハイブリダィズし且つ H鎖 V領域の C未端をコドする DNAとオーバーラップするように設計した。リンカのための後方プライマ RHu VK1 (プライマー D、配列番号： 80) は、リンカ ^"の C末端をコドする DNAにハイブリダィズし且つ L鎖 V領域の N末端をコードする DNAとオーバーラップするように設計した。

L鎖 V領域のための前方プライマ Hu VK1. 2 (プライマ一 E、配列番号：

81) は L鎖 V領域の N末端をコードする DNAにハイブリダィズするように設計した。 L鎖 V領域のための後方プライマ^ · 12 B 5 F— A (プライマー F、配列番号： 82) は、 L鎖 V領域の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし且つ F LAGペプチドをコードする配列（Hopp, T. P.ら、 Bio/Technology， 6, 1204-1210, 1988)、 2個の転写停止コドン及び N o t I制限酵素認識部位を有するように設計した。

第一； PC R段階において 3つの反応 A— B、 C一 D及び E— Fを行い、そして第一 PCRから得られた 3つの PCR生成物をそれら自体の相補性によりアツセンブリさせた。次に、プライマー A及び Fを加えて、 15アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成 12 B 5—本鎖 F Vをコ^ "ドする全長 DNAを増幅した（第二 PCR)。なお、第一 PCRにおいては、再構成 1 2B 5H鎖 V領域をコードするプラスミド HEF— 1 2 B 5H— gYl (実施例 7. 1を参照）、 G 1 y G 1 y G l y G 1 y S e r G 1 y G 1 y G l y G l y S e r G 1 y G l y G l y G l y S e rからなるリンカ一領域をコードする D N A 配列（配列番号： 83) (Huston, J. S.ら、 Pro atl. Acad. Sci. USA, 85，

5879-5883, 1988) を含んで成るプラスミド p S C F V T 7— h M 21 (ヒト型化 ONS— M21抗体）（Ohtomo, T. ら、 Anticancer Res. 8 (1998), 4311-4316), 及び再構成 12 B 5 L鎖 V領域をコードするプラスミド HEF— 12B 5 L— gK (実施例 7. 2を参照）をそれぞれ铸型として用いた。

第一 PCR段階の溶液 5 Ομ 1は、 5μ1の 1 Ox PC R Gold Buffer II、 1. 5mM Mg C l₂、 0. 08 mM dNTP s、 5ユニットの D N Aポリメラーゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKIN ELMER社製）、 100 p m o 1 eずつの各プライマー及び 100 n gの各铸型 DNAを含有し、 94°Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間及び 72 °Cにて 1分間のサイクルを 35回反復した後、反応混合物を更に 72 °Cで 5分間加熱した。

PCR生成物 A— B、 C— D、及び E— Fは第二 PCRでアッセンプリした。第二 PCRにおいて、铸型として Ιμΐの第一 P CR反応物 A— Β、 0. 5μ1の PCR反応物 C一 D及び 1μ 1の PCR反応物 E— F、 Ι ΟμΙの l OxPCR

Gold Buffer II 1. 5 mM M g C 1₂、 0.08 mM dNTP s、 5ユニットの DNAポリメラ^ "ゼ AmpliTaq Gold (以上 PERKIN ELMER 社製）を含有する 98 μΐの PCR混合液を、 94°Cの初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 2分間、 65 °Cにて 2分間及び 72 °Cにて 2分間のサイクルを 2回反復した後、それぞれ 100 pmo 1 eずつのプライマー A及び Fを加えた。そして 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間及び 72 °Cにて 1分間のサイクルを 35回反復した後、反応混合物を 72 °Cにて 5分間加熱した。

第二 PGRにより生じた DNA断片を 1. 5。/。低融点ァガ口ースゲルを用いて精製し、 E c o R I及び N o t Iで消化し、得られた DNA断片を p CHO 1べクタおよび p CO S 1ベクタ（特願平 8— 255 196) にクロ一ユングした _c なお、本発現べクタ" p CHO 1は、 DHFR—ΔΕ— r vH-PMl - f (WO 92/19759参照）から、 E c o R I及び Sma I消化により抗体遺伝子を削除し、 E c oR I— No t l— B a mH I Ad a p t o r (宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。 DNA配列決定の後、再構成 1 2 B 5—本鎖 F Vの正しいアミノ酸配列をコ"ドする DN A断片を含むプラスミドを p CHO— s c l 2B 5及び p COS— s c l 2B 5と命名した。本プラスミド p CHO— s c 1 2 B 5及び p COS— s c l 2B 5に含まれる再構成 12 B 5—本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 84に示す。 7. 4 動物細胞を用いた各 1 2 B 5抗体（I g G、 F a b ) 及び一本鎖 F vポリぺプチドの発現

1 2 B 5抗体（I g G、 F a b ) 及び 1 2 B 5抗体由来の一本鎖 F v (ポリべプチド）は C O S— 7細胞又は C H O細胞を用レ、発現させた。

C O S— 7細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、

Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いたエレクト口ポレ^"シヨン法により遺伝子導入した。 1 2 B 5抗体（I g G) の発現には前述の発現べクタ^ HE F— 1 2 B 5 H- _§丫1及び £ ー 1 2 B 5 L— gK各 1 Opgずつを、 1 2 B 5 F a b断片の発現には p F d— 1 2 B 5 Hと HE F— 1 2 B 5 L— gK各 1 Opgずつを、一本鎖 F Vの発現には p C O S— s c 1 2 B 5 ( 1 0μ _§ ) を P B Sに懸濁したじ03— 7細胞（1 1 0⁷細胞71111 ) 0. 8 m lに混合し、キュベットに加え、 1. 5 k V, 2 5pFDの容量にてパルスを与えた。室温にて 1 0分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、 1 0 °/₀のゥシ胎児血清を含有する DMEM培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞を P B Sで一回洗浄し、さらに無血清培地 C HO- S- S FM II培地を加え、さらに 2 日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、 0. 2 2μπιのフィルターを通すことで調製した。

また、 1 2 Β 5抗体由来の一本鎖 F V (ポリペプチド）の恒常的発現 CHO細胞株を樹立するため、 p CHO— s c l 2 B 5発現ベクターを下記のように CH O細胞に遺伝子導入した。

すなわち、 Gene Pulser装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーシヨン法により発現ベクターを C HO細胞に導入した。制限酵素 P V u Iで消化し直鎖状にした DNA ( 1 0 0μ_§ ) と P B Sに懸濁した C HO細胞（l x l O⁷細胞/ m l ) (D O. 8 m 1を混合したものをキュべットに加え氷中で 1 0分間静置した後、 1. 5 k V、 2 5 FDの容量にてパノレスを与えた。室温にて 1 0分間の回復期間の後、エレクトロボレ一シヨン処理された細胞を、 1 0 %のゥシ胎児血清を含有する CHO— S— S FM II (GIBCO BRL社製）に加え培養した。培養 2日後に 5 n M メトトレキサ一ト（SIGMA社製）ならびに 1 0⁰ ゥシ胎児血清を含む C H O- S-S FM II (GIBCO BRL社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを 1 2B 5—本鎖 F Vの産生細胞株として選択した。 5 n Mメトトレキサ^ ~ト（SIGMA社製）を含む無血清培地 CHO—S— S FM II (GIBCO BRL 社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して培養上清を得た。

7. 5 CHO細胞産生の 12 B 5由来の一本鎖 F Vの精製

7. 4で得られた 12 B 5—本鎖 F V発現 CHO産生株の培養上清からの精製は、抗 F LAG抗体カラム及びゲル濾過カラムにより行った。

(1) 抗 FLAG抗体カラム

培養上清は、 PB Sで平衡化した抗 F LAG M 2ァフィ二ティーゲル（SIGMA 社製）に添加した。同緩衝液で力ラムを洗浄後、緩衝液を 0. 1 Mグリシン塩酸緩衝液（pH3. 5) でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は、溶出後直ちに 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0) を加えて中和した。 SDS— PAGEで溶出画分を分析し、一本鎖 F Vが碓認された画分を Gentricon-10 (MILLIP0RE社製）を用いて濃縮した。

(2) ゲル濾過

(1) の濃縮液は、 0.0 l%Tw e e n 20を含む PB Sで平衡化した S u p e r d e x 200カラム（10x300 mm、 AMERSHAM PHARMACIA社製）に添カロした。

s c 12 B 5は 2つのピーク（A、 B) に分かれて溶出した（図 48を参照）。画分 A、 Bを 14%— SDS—ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、し a emm 1 iの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシ一ブリリアントブルー染色した。図 49に示すように、画分 A、 Bいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約 3 1 kDに単一バンドを与えた。画分 A及び Bを S u p e r d e X 200 PC 3. 2/30 (3. 2x30 Omm, AMERSHAM PHARMACIA社製）を用いたゲル濾過により分析した結果、画分 Aでは見かけ上の分子量約 44 kD、画分 Bでは同 22 k Dに溶出された（図 50 a及び bを参照）。以上の結果から、画分 Aは s c l 2B 5—本鎖 F vの非共有結合性ダイマで、 Bはモノマ^である。

7. 6 各種一本鎖 F Vの T P O様ァゴニスト活性の測定

ヒト TPO受容体（MPL) を発現する B a/F 3細胞（BaF/mpl) に対する增殖活性を測定することによって、抗 MP L—本鎖抗体の T PO様活性を評価した。

B a F/Mp 1細胞を、 1 %ゥシ胎児血清（GIBC0社製）を含む RPM 1 164 0培地（GIBC0社製）で 2回洗浄したのち、 5x10⁵細胞 /m 1の細胞密度になるように培地に懸濁した。抗 MP L—本鎖抗体またはヒト TPO (R&D Systems 社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液 5 Ομ 1に抗体またはヒト T PO希釈液 5 Ομ 1を加えて 96穴マイクロウェル平底プレート（Falcon社製）に分注し、 C0₂インキュベター（C〇₂濃度： 5%) で 24時間培養した。培養後、 WS T—8試薬（生細胞数測定試薬 SF ：ナカライテスタ社製）を Ι ΟμΙ加え、直後に蛍光吸光光度計 SPECTRA Fluor (TECAN社製）を用いて測定波長 450 n m、対照波長 620 nmの吸光度を測定した。 C〇₂インキュベータ (C〇₂濃度： 5 %) で 2時間ィンキュベー卜した後、 SPECTRA Fluorを用いて再度測定波長 4 50 nm, 対照波長 620 n mの吸光度を測定した。 WS T— 8試薬は生細胞数に応じて波長 450 nmの発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に B a F/Mp 1増殖活性を次のように算出した ED 50値により評価した。先ず、縦軸を吸光度、横軸を抗体濃度とし、その増殖反応曲線がプラトに達した吸光度を反応率 10◦ °/₀とした。反応率 50 %付近の数に基づく直線近似により近似式を得て、これから反応率 50%となる抗体濃度を算出し、これを ED 50ィ直とした。

各種 12 B 5抗体分子を発現させた COS— 7細胞の培養上清を用い、 MP L に対するァゴニスト活性を測定した結果、図 51に示すように抗原結合部位が二価である 12 B 5 I g Gでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められ T PO様のァゴニスト活性を示したのに対し（ED 50 ； 29 nM)、抗原結合部位が一価である 1 2 B 5 F a bのァゴニスト活性は非常に弱いものであった（ED 50 ； 34, 724 nM)₀ それに対し、 F a bと同様に抗原結合部位が一価である一本鎖 F v ( s c 12 B 5) においては ED 50値が 75 nMと強いァゴニスト活性が認められた。しかしながら、一本鎖 F vでは H鎖、 L鎖各可変領域は非共有結合で介合しているために、溶液中で各可変領域が解離し他の分子の可変領域と介合し二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、ゲル濾過を用い精製 s c 12 B 5の分子量を測定した結果、確かに単量体（モノマー）と二量体（ダイマ ) と考えられる分子が認められた（図 48を参照）。続いて、モノマとダイマの s c 12 B 5をそれぞれ単離し（図 50を参照）、それらの MP Lに対するァゴニスト活性を測定した結果、図 5 1及び 52に示すように s c l 2 B 5モノマーでは ED 50値が 4438. 7 nMと C O S— 7細胞の培養上清を用いた結果に比べ、ァゴニスト活性の減弱が確認された。それに対し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖 F v ( s c 12 B 5ダイマ^") では一価の s c 1 2 B 5に対し約 4 00倍強いァゴニスト活性を示した（ED 50 ； 10. 1 nM)₀ さらに、二価の —本鎖 F Vではヒト TPOならびに 1 2 B 5 I gGのァゴニスト活性と同等もしくはそれ以上のァゴニスト活性を示した。

実施例 8 (ヒト MP Lに対するヒト抗体 12E 10可変領域をコドする遺伝子の構築）

ヒト MP Lに対するヒトモノクローナル抗体 12 E 10の可変領域をコ^"ドする DNAを次のようにして構築した。

8. 1 12 E 10 H鎖可変領域をコ一ドする遺伝子の構築

ヒト MP Lに結合するヒト抗体 12 E 10 H鎖可変領域をコードする遺伝子は WO 99/10494に記載のァミノ酸配列（配列番号 85 ) を基に配列番号 8 6に示す塩基配列を設計した。さらに、その 5'端にヒト抗体遺伝子由来のリーダ一配列（配列番号 87) (G e nB a n k a c c e s s i o n No. AF 06 2252) を連結させることで全長の塩基配列を設計した。設計した塩基配列はそれぞれ 1 5 b pのォ"バラップ配列を持つように 4本のオリゴヌクレオチド (1 2 E 10VH1、 12 E 10 VH2, 12 E 10VH3、 12 E 10 VH

4) に分割し、 12E 10VH1 (配列番号： 88) 及び 12 E 10 VH3 (配列番号： 90) はセンス方向で、 1 2E 10VH2 (配列番号： 89) 及び 1 2 E 10VH4 (配列番号： 9 1) はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成ォリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンプリさせた後、外側プライマー（12 E 10 VHS及び 1 2E 10 VHA) を加え、全長の遺伝子を增幅した。なお、 12E 10VHS (配列番号： 92) は前方プライマ"でリーダ一配列の 5'端にハイブリダィズし、且つ H i n d I I I制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また 12E 10VHA (配列番号： 93) は後方プライマ"で H鎖可変領域の C末端をコ一ドする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびに B a mH I制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

?〇溶液100 1は、 Ι ΟμΙの l OxPCR Go l d B u f f e r I I、 1. 5mM Mg C l₂、 0.08 mM d NT P s (d ATP, d GT P, dCTP， dTTP)ゝ 5ユニットの DNAポリメラゼ Amp 1 i T a q

Go l d (以上 PERKIN ELMER社製）、 2. 5ピコモルずつの合成オリゴヌクレォチド 12B 5 VH—1〜4を含有し、 94°Cの初期温度にて 9分間そして次に 94 °Cにて 2分間、 55 °Cにて 2分間及び 72 °Cにて 2分間のサイクルを 2回反復した後、 100 pmo 1 eずつの外側プライマ 12E 10VHS及び 12E 10VHAを加え、さらに 94°Cにて 30秒間、 55 °Cにて 30秒間及び 72 °C にて 1分間のサイクルを 35回反復した後、反応混合物を更に 72 °Cで 5分間加熱した。

1 生成物は1. 5°/。低融点ァガロースゲル（Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素 B a mH I及び H i n d I I Iで消化し、ヒト H鎖発現ベクター H EF— gylにクロニングした。 DN A配列決定の後、正しい DN A配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF— 12 E 1 OH-gylと命名した。さらに、 HE F— 12 E 10 H— gylを制限酵素 E c o R 1ならびに B a mH Iで消化し、 1 2 E 10 VHをコ^ "ドする遺伝子を調製した後、ヒト F a b H鎖発現ベクター p COS— F dに挿入し p F d— 1 2 E 10Hを得た。なお、ヒト F a bH鎖発現べクタ^-はヒト抗体 H鎖 V領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイント口ン領域ならびにヒト H鎖定常領域の一部をコ一ドする遺伝子を含む DNA (配列番号 63) について PC R法を用いて増幅した後、動物細胞発現用ベクター p COS 1に挿入することで構築したベクターである。ヒト H鎖定常領域は HEF— g_Ylを铸型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマ一としてイントロン 1の 5'端の配列とハイブリダィズし、且つ E c o R I及び B a mH I制限酵素認識配列を有するように設計した G 1 C H 1 一 S (配列番号 64) を、後方プライマーとしてヒト H鎖定常領域 CH1 ドメインの 3'端の DN Aにハイブリダィズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよび B g 1 II制限酵素認識部位を有するように設計した G 1 CH1— A (配列番号 65) を用いた。

プラスミド HE F_ 12 E 10 H— g_Yl及び p F d— 1 2 E 1 OHに含まれる再構成 12 E 10 H鎖可変領域の塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 94に示す。

8. 2 12E 10 L鎖可変領域をコ一ドする遺伝子の構築

ヒト MP Lに結合するヒト抗体 12 E 10 L鎖可変領 ¾ίをコードする遺伝子は WO 99/10494に記载のァミノ酸配列（配列番号 95 ) を基に配列番号 9 6に示す塩基配列を設計した。さらに、その 5'端にヒト抗体遺伝子由来のリーダ "配列（配列番号 97) (Mo 1. I mm un o l . 1992 ; 29 : 1515— 1 518) を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ 15 b pのォバーラップ配列を持つように 4本のオリゴヌクレオチド（1 2E 10VL 1、 12E 10VL 2、 12 E 10 VL 3, 12E 10VL4) に分割し、それぞれ合成した。 12E 10VL 1 (配列番号： 98) 及び 12 E 1 0 VL 3 (配列番号： 100) はセンス配列、 12E 10VL 2 (配列番号： 9 9) 及び 12E 10VL4 (配列番号： 101) はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンプリさせた後、外側プライマー（12 E 10 VL S及び 12 E 10 VLA) を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、 12 E 10VLS (配列番号： 102) は前方プライマーでリーダー配列の 5 '端にハイプリダイズし、且つ E c o R I制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また 1 2 E 10VLA (配列番号： 103) は後方プライマーで L鎖可変領域の C末端をコ一ドする塩基配列にハイプリダイズし - 且つ B 1 n I制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。

PCR反応は上記と同様に行い、？0 生成物は1. 5°/。低融点ァガロースゲル (Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素 E c o R I及び B 1 n Iで消化し、ヒトラムダ鎖定常領域遺伝子を含有する pUC 19ベクタにクローユングした。

DNA配列決定の後、正しい DN A配列を有する DNA断片を含むプラスミドを制限酵素 E c o R Iで消化し、 12 E 10 L鎖可変領域及びヒトラムダ鎖定常領域をコードする遺伝子を調製し、さらに発現べクタ p COS 1に揷入し、 12 E 10 L鎖遺伝子（配列番号： 104) を持つプラスミドを p COS— 12 E 1 0 Lと命名した。

8. 3 再構成 12 E 10—本鎖 F vの作製

再構成 12E 10抗体一本鎖 F Vは 12E 10VH—リンカ^ 12 E 10 V Lの順とし、その C末端には検出及び精製を容易にするために F LAG配列（配列番号： 105) を付加することで設計した。リンカ一配列は（G l y₄S e r) ₃ の 1 5アミノ酸からなるリンカー配列、またはを（G 1 y₄S e r ) ^の 5アミノ酸からなるリンカ配列用い、再構成 12 E 10鎖 F V (s c l 2E 10および d b 1 2 E 10) を構築した。

(1) 5アミノ酸からなるリンカ配列を用いた再構成 12E 10—本鎖 F V の作製

5アミノ酸からなるリンカ配列を用いた再構成 12E 10—本鎖 F vをコドする遺伝子は 12 E 10 H鎖 V領域をコドする遺伝子の 3 '端、及び 12 E 1 0 L鎖 V領域をコードする遺伝子の 5，端に（G l y₄S e r) _tからなるリンカ一をコードする塩基配列を付カ卩させた遺伝子についてそれぞれ P C R法を用いて增幅し、連結することにより構築した。再構成 12E 10—本鎖 F Vの作製のために 4個の PC Rプライマー（A〜D) を使用した。プライマ^" A及び Cはセンス配列を有し、プライマ一 Bおよび； Dはアンチセンス配列を有する。

H鎖 V領域のための前方プライマーは 12 E 10 S (プライマー A、配列番号： 106) を用い、 H鎖 V領域のための後方プライマ一 DB 2 (プライマー B, 配列番号： 107) は、 H鎖 V領域の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、且つ（G l y₄S e r) からなるリンカ一をコードする塩基配列ならびに L鎖 V領域の N末端をコードする塩基配列を有するように設計した。

L鎖 V領域のための前方プライ DB 1 (プライ C、配列番号： 10 8) は L鎖 V領域の N末端をコードする DNAにハイブリダィズし、且つ（G y₄S e r) iからなるリンカ一をコードする塩基配列ならびに H鎖 V領域の C末端をコードする塩基配列を有するように設計した。 L鎖 V領域のための後方ブライマは 12E 10 FA (プライマ D、配列番号： 109) は L鎖可変領域 C 末端をコードする DNAにハイブリダィズし、且つ F LAGをコードする塩基配列を有し、さらに N o t I制限酵素認識部位を有するように設計した。

第一 PC R段階において 2つの反応 A— B及び C一 Dを行い、そして第一 PC Rから得られた 2つの PC R生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライ A及び Dを加えて、 5アミノ酸からなるリンを用いた再構成 12 E 10—本鎖 F Vをコドする全長 DNAを增幅した（第二 PCR)。なお、第一 PCRにおいては、再構成 12 E 10H鎖 V領域をコードするプラスミド HEF— 12 E 10H— g_Yl (実施例 8. 1を参照）及び再構成 12 E 10 L鎖 V領域をするプラスミド p COS— 12E 10 L (実施例 8. 1を参照）をそれぞれ铸型として用いた。

第一 P CR段階の溶液 50μ 1は、 5μ1の 10XPCR Go l d B u f f e r I I 1. 5mM Mg C l₂ 0.08 mM dNTP s 5ユニットの D NAポリメラーゼ Amp 1 i T a q Go l d (以上 PERKIN ELMER社製）、 10 0ピコモルずつの各プライマ^"及び 100 n gの各铸型 DNAを含有し、 94°C の初期温度にて 9分間そして次に 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間及び 72 °Cにて 1分間のサイクルを 35回反復した後、反応混合物を更に 72°Cで 5 分間加熱した。

PCR生成物 A— B (429 b p) 及び C一 D (395 b p) は第二 PCRでアッセンプリした。第二 PC Rにおいて、鎵型として Ιμίずつの第一 P CR反応物 Α— Β及び P CR反応物 C一 D 100ピコモルずつの各プライ 10μ 1 の l OxPCR Go l d B u f f e r I I 1. 5 mM M g Cし、 0.08 mM dNTP s、 5ユニットの DNAポリメラーゼ Am p 1 i T a q

Go l d (以上 PERKIN ELMER 社製）を含有する 98μ 1の PCR混合液を、上記と同様の条件下で反応させた。

第二 PC Rにより生じた 795 b pの DNA断片について 1. 5%低融点ァガロースゲルを用いて精製した後、 E c o R I及び N o t Iで消化し、得られた D NA断片を p CHO 1ベクターまたは p COS 1ベクターにクローエングした。なお、本発現べクタ"： CH〇 1は、 DHFR— ΔΕ— RVH— PM1— f (WO 92ノ19759参照）から、 E c o R I及ぴ Sma I消化により抗体遺伝子を削除し、 E c oR I— No t l— B amHI Ad a p t o r (宝酒造社製）を連結することにより構築したベクタである。 DN A配列決定の後、再構成 12 B 5—本鎖 F Vの正しいァミノ酸配列をコードする DN A断片を含むプラスミドを pCHO— d b 12E 10、及び pCOS— d b 12 E 10と命名した。本プラスミド p CHO- d b 12 E 10及び p COS— d b l 2E l 0に含まれる再構成 12 E 10—本鎖 F Vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 1 10に示す。

(2) 15アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成 1 2 E 10—本鎖 F v の作製

15アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成 12E 10—本鎖 F Vをコドする遺伝子は 12 E 10 H鎖 V領域をコドする遺伝子の 3'端、及び 1² E 10 L鎖 V領域をコ^ "ドする遺伝子の 5'端にそれぞれ（G 1 y₄S e r) ₃からなるリンカーをコ^"ドする塩基配列を付カ卩させた遺伝子について、それぞれ PC R 法を用いて増幅し、連結することにより構築した。再構成 12E 10—本鎖 F V の作製のために 4個の: P CRプライマー（A〜D) を使用した。プライマー A及び Cはセンス配列を有し、プライマー Bおよび Dはアンチセンス配列を有する。

H鎖 V領域のための前方プライマーは 12 E 10 S (プライマー A、配列番号： 106) を用い、 H鎖 V領域のための後方プライマ s c 4. 3 (プライマー JB、配列番号： 11 1) は、 H鎖 V領域の C未端をコードする DNAにハイプリダイズし、且つ（G l y₄S e r) ₃からなるリンカ一をコードする塩基配列ならびに L鎖 V領域の N末端をコ一ドする塩基配列を有するように設計した。

L鎖 V領域のための前方プライマー s c 1. 3 (プライマー C、配列番号： 11 2) は L鎖 V領域の N末端をコ^"ドする DNAにハイブリダィズし、且つ（G 1 y₄S e r ) ₃からなるリンカをコドする塩基配列ならびに H鎖 V領域の C末端をコードする塩基配列を有するように設計した。 L鎖 V領域のための後方ブライマは 12E 10 FA (プライマー D、配列番号： 109) は L鎖可変領域 C 末端をコードする DN Aにハイブリダィズし、且つ FLAGをコ^"ドする塩基配列を有し、さらに N o t I制限酵素認識部位を有するように設計した。

第一 P CR段階において 2つの反応 A— B及び C— Dを行い、そして第一 P C Rから得られた 2つの P C R生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマー A及び Dを加えて、 15アミノ酸からなるリンカ一を用いた再構成 12E 10—本鎖 F Vをコードする全長 DNAを増幅した（第二 PC R)₀ なお、第一 PC Rにおいては、再構成 12 E 10—本鎖 F Vをコードするプラスミド p COS— d b l 2E 10 (実施例 8. 1 (1)を参照）を鎵型として用いた。

第一 PCR段階の溶液 50μ 1は、 5 1の10 £ 丁 & Bu f f e r, 0.4mM dNTP s、 2. 5ユニットの DNAポリメラーゼ T a K a R a

E xT a q (以上宝酒造社製）、 100ピコモルずつの各プライマ^及び 10 n gの各铸型 DNAを含有し、 94°Cの初期温度にて 30秒間そして次に 94°Gにて 15秒間及び 72°Cにて 2分間のサイクルを 5回、 94°Cにて 15秒間及び 7 0°Cにて 2分間のサイクルを 5回、 94°Cにて 15秒間及び 68 °Cにて 2分間のサイクルを 28回反復した後、反応混合物を更に 72 °Cで 5分間加熱した。

PCR生成物 A— B (477 b p) 及び C— D (447 b p) は第二： PCRでアッセンプリした。第二 PCRにおいて、铸型として Ιμίずつの第一 PC R反物 A— B及び PGR反応物 C一 D、 100ピコモルずつのプライマ^ A及び D、 5μ1の l OxExTa q B u f f e r, 0. m dNTP s、 2. 5ュニッ卜の DNAポリメラ一ゼ T a Ka R a E x T a q (以上宝酒造社製）を混合し、上記と同様の条件下で反応させた。第二 PC Rにより生じた 825 b pの DNA断片について 1. 0°/。低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 E c o R I及び No t Iで消化し、得られた DNA 断片を p CHO 1ベクターまたは p COS 1ベクターにクローニングした。 DN A配列決定の後、再構成 12 E 10—本鎖 F Vの正しいアミノ酸配列をコドする DN A断片を含むプラスミドを p CHO— s c 12 E 1◦及び p C〇 S— s c 12 E 10と命名した。本プラスミド p CHO— s c 12 E 10及び p COS— s c 12 E 10に含まれる再構成 1 2 E 10—本鎖 F vの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号： 1 13に示す。

8. 動物細胞を用いた各 1 2 E 10抗体（I gG、 F a b) 及び一本鎖 F v ポリぺプチドの発現

12 E 10抗体（ I g G、 F a b) ならびに 12 E 10抗体由来の一本鎖 F v (リンカ一配列 5アミノ酸、 15アミノ酸）は COS— 7細胞もしくは CHO細胞を用い発現させた。

COS- 7細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、 Ge n e P u 1 s e r I I装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーシヨン法により遺伝子導入した。 1 2E 10抗体（I gG) の発現には前述の発現べクタ — HEF— 1 2 E 1 OH— gyl及び！ COS— 1 2E 10 L各 1 Opgずつを、 12E 10F a b断片の発現には pF d— 12E 10Hと p COS— 12E 10 L各 1 Opgずつを、一本鎖 F Vの発現には p COS— s c 12 E 10 (10μ g) または p COS— d b 12 E 10 (10μ_§) を P B Sに懸濁した C O S— 7 細胞（lxl 0⁷細胞 Zm 1 ) 0. 8ni 1に混合したものをキュベットに加え、 1. 5 kV、 25 FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロポレーシヨン処理された細胞を、 10%のゥシ胎児血清を含有する D MEM培地（GIBC0 BRL 社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞を PB Sで一回洗浄し、さらに無血清培地 CHO- S- S FM I I培地（GIBC0 BRL 社製）を加え、さらに 3日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、 0. 22 μιηのフィルタ ^"を通すことで調製した。

また、 12 Ε !_ 0抗体由来の一本鎖 F V (ポリペプチド）の恒常的発現 CHO 細胞株を樹立するため、 p CHO— s c 1 2 E 10または p CHO- d b 12 E 10発現べクタ一をそれぞれ C H O細胞に遺伝子導入した。

各発現べクタを、 Ge n e P u l s e r l I装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーシヨン法により CHO細胞に遺伝子導入した。 P v u I消化により直鎖状にした DNA (l O Opg) と PB Sに懸濁した CHO細胞（1x10⁷ 細胞 Zm I ) の 0. 8m 1を混合したものをキュベットに加え、氷中で 10分間静置した後、 1. 5 kV、 25 FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロボレシヨン処理された細胞を、 10%の透析ゥシ胎児血清ならびに核酸を含有する CH〇 - S- S FMI I培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。培養 2日後に 10°/。の透析ゥシ胎児血清を含有する核酸不含 C HO-S-S FMI I培地（GIBCO BRL 社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを 12 E 10—本鎖 F Vの産生細胞株として選択した。この細胞株を無血清培地 CHO— S— SFMI I培地（GIBCO BRL社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去後に、 0. 22μπιのフィルターを通すことで培養上清を調製した。

8. 5 CHO細胞産生の 12 Ε 10由来の一本鎖 F Vの精製

実施例 8. 4で得た一本鎖 F V発現 C ΗΟ産生株（s c l 2E 10， d b 12 E 10) それぞれの培養上清から抗 FLAG抗体カラム、及びゲルろ過カラムを用いて一本鎖 F vを精製した

(1) 抗 F LAG抗体カラムを用いた精製

培養上清（s c l 2E 10， d b 12 E 10) を、それぞれ 150 mM N a C 1を含む 50 mMトリス-塩酸緩衝液（ p H 7.4 ) にて平衡化した抗 FLAG M2 ァフィ二ティゲル（S I GMA社製）カラムに添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、 100 mM グリシン緩衝液（pH3. 5) でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は直ちに 1M トリス塩酸緩衝液（pH8.0) を加えて中和した。 SDS— PAGEで各溶出画分を分析し、一本鎖 F Vが確認された画分を- それぞれプールし、 C e n t r i c o n— 10 (アミコン社製）を用いて約 20 倍濃縮した。 (2) ゲル濾過

(1) の画分を、 0.01^ο/ο T w e e η 20含む Ρ Β Sで平衡化した S u p e r d e x 200HRカラム（10 x 300mm、 Am e r s h a m P h a r m a c i a社製）に添加した。クロマトグラムを図 53および 54に示す。その結果、 s c 12 E 10においては 2つのピク（A， B) が検出された（図 53)。また、 d b l 2E 10では、 2つのピク（C, D) が検出された（図 54)。それぞれのピ^"ク画分を分取し、還元剤添加、非添加で処理し、 L a emm l iの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシ一プリリアントブ染色した。図 55に示すように、画分 Α、画分 Β、画分 C、画分 Dいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約 31 kDに単一バンドを与えた。これらの画分を、前述の S u p e r d e x 200 H Rカラムを用いたゲルろ過で分析した結果、画分 Aは見かけ上の分子量約 20 kD、画分 Bは同 42 kDに溶出された (図 56を参照）。一方、画分 Cは見かけ上の分子量約 69 kD、画分 Dは同 41 kDに溶出された（図 57を参照）以上の結果から、 s c 12E 10由来の画分 Aは一本鎖 F Vの非共有結合性ダイマーで、画分 Bは一本鎖 F Vのモノマーであり、また、 d b 12E 10由来の画分 Cは一本鎖 F Vの非共有結合性トリマー、画分 Dは一本鎖 F Vの非共有結合性ダイマーであることが示唆された。

8. 6 各種一本鎖 F Vの TP O様ァゴニスト活性の測定

ヒト TPO受容体（MPL) を発現する B a/F 3細胞（BaF/mpl) に対する增殖活性を測定することによって、抗 ra p 1—本鎖抗体の T P O様活性の評価を行つた。

B a F/m 1細胞を、 1 %ゥシ胎児血清（GIBC0社製）を含む R PM I 164 0培地（GIBC0社製）で 2回洗浄したのち、 5x10⁵細胞/ mLの細胞密度になるように培地に懸濁した。抗 MP L—本鎖抗体またはヒト TP〇 (R&D Systems 社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液 5 OpLに抗体またはヒト TPO希釈液 5 OpLを加えて 96穴マイクロウェル平底プレト（Corning社製）に分注し、 C0₂インキュベータ (C0₂濃度： 5%) で 24時間培養した。培養後、 WS 丁一 8試薬（生細胞数測定試薬 S F ：ナカライテスク社製）を l OuL加え、直後に吸光光度計 Benchmark Plus (BioRad社製）を用いて測定波長 450 n m、対照波長 655 nmの吸光度を測定した。 C〇₂インキュベータ一（C〇₂濃度： 5%) で 2時間インキュベートした後、 Benchmark Plusを用いて再度測定波長 4 50 nm、対照波長 655 nmの吸光度を測定した。 WST— 8試薬は生細胞数に応じて波長 450 nmの発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に B a F/mp 1細胞増殖活性を評価した。

各種 12 E 10抗体分子を発現させた COS— 7細胞の培養上清を用い、 MP Lに対するァゴニスト活性を測定した結果を図 58に示す。リン力配列 5アミノ酸（d b l 2E 10) および 1 5アミノ酸（s c l 2E 10) の一本鎖 F vでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められ、 T PO様のァゴニスト活性を示したのに対し（ED 50 ；それぞれ 9 pMおよび 51 ρΜ)、 1 2 E 10 I g Gおよび 1 2 E 10 F a bでは全く活性が認められなかった。

—本鎖 F Vはリンカ一配列の長さによっては、 H鎖と L鎖が分子内だけでなく、分子間でも介合することによって二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、 1 2 E 1 0—本鎖 F Vを発現させた CHO細胞の培養上清をゲルろ過分画して、 MP Lに対するァゴニスト活性を測定した。その結果を図 59に示す。 s c 12 E 10中にわずかに含まれる二量体（ s c 1 2 E 1 0ダイ E D 50 ； 1. 9 pM) は単量体（ s c 1 2 E 10モノマー、 ED 50 ; 〉 10 n M) に比べて、 5000倍以上強い TPO様ァゴニスト活性を示し、その活性は TP〇（ED 50 ; 2 7 pM) よりも強かった。また、 d b 1 2 E 10の二量体 (d b l 2E 10ダイマー、 ED 50 ; 2. 0 pM) は s c l 2E 10ダイマーとほぼ同等の強い活性を示した。ゲルろ過分子量から三量体と推定された d b 1 2 E 10 トリマー (ED 50 ； 7.4 p M) も d b l 2E 10ダイマーには劣るが高い活性を示した。以上の結果から、ァゴニスト抗体 12 E 10の活性には、抗原結合部位が二価（ダイであることが重要と考えられるが、 12E 10 I g Gには活性が見られなかったことから、単に二価であるだけでなく、抗原結合部位間の距離や角度といった要素も重要と推測される。図面の簡単な説明

図 1. ヒト I g G 1抗体が、ヒト I A Pを発現する L 1210細胞（ h I A P /L 1 210) に結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。

図 2. キメラ MAB L— 1抗体が、ヒト I APを発現する L 1 210細胞（h I AP/L 1 210) に特異的に結合することを示すフローサイトメトリ^"の結果を示す図である。

図 3. キメラ MAB L— 2抗体が、ヒト I APを発現する L 1 210細胞（h I AP/L 1210) に特異的に結合することを示すフロ^"サイトメトリーの結果を示す図である。

図 4. 本発明にかかる一本鎖 F Vの作成方法を模式的に示す図である。

図 5. 本発明の一本鎖 F Vをコ^ "ドする DNAを、大腸菌にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。

図 6. 本発明の一本鎖 F Vをコードする DNAを、哺乳動物細胞にて発現させるために使用する発現プラスミドの一例の構造を示す。

図 7. 実施例 5. 4で得られたウェスタンプロットの結果を示す図である。左側より、分子量マーカ（上から 97.4、 66、 45、 31、 2 1.5、 14. 5 kD aを示す）、 p CHO 1導入 COS 7細胞培養上清、 p CHOM2導入細胞培養上清。 p CHOM2導入細胞培養上清に再構成 MAB L— 2抗体一本鎖 F v (矢印）が明らかに含まれていることを示す。

図 8. コント口ルとしての p CHO l/C OS 7細胞培養上清の抗体は、コントローノレとしての p COS 1/L 1210細胞には結合しないことを示すフロ —サイトメトリーの結果を示す図である。

図 9. MA B L 2— s c F v/CO S 7細胞培養上清の抗体は、コント口ールとしての p COS 1/L 12 10細胞には結合しないことを示すフローサイトメトリ一の結果を示す図である。

図 10. コントロールとしての p COS 1ZCOS 7細胞培養上清の抗体は、 h I AP/L 1 210細胞に結合しないことを示すフローサイトメトリ^の結果を示す図である。

図 1 1. MA B L 2 - s c F v/CO S 7細胞培養上清の抗体は、 h I AP/L 1210細胞に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。

図 12. 実施例 5. 6で示す C omp e t i t i V e EL I SAの結果を示す図であり、本発明の一本鎖 F v (MABL 2— s c F v) の抗原結合活性を、コントロノレとしての！） CHO 1/CO S 7細胞培養上清と比較して、マウスモノクローナル抗体 MAB L— 2の抗原結合に対する阻害を指標として示す図である。図 1 3. 実施例 5. 7のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、コント口ルとしての p CO S l/L 1210細胞には、コントルとしての p CHO 1/COS 7細胞培養上清抗体はアポトシスを誘起しないことを示す。

図 14. 実施例 5. 7のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、コント口しての p COS l/L 1210細胞には、 MAB L 2 - s c F v/COS 7細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。

図 15. 実施例 5. 7のアポト^"シス誘導効果の結果を示す図であり、 h l AP ZL 1 210細胞には、コントロ^"ノレとしての p CHO 1/CO S 7細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。

図 16. 実施例 5. 7のアポト"シス誘導効果の結果を示す図であり、 h l AP /L 121 0細胞に対し、 MAB L 2- s c F vZCOS 7細胞培養上清抗体が特異的にアポシスを誘起することを示す。

図 1 7. 実施例 5. 7のアポトシス誘導効果の結果を示す図であり、 CCRF — CEM細胞には、コントロールとしての1> CHO 1/CO S 7細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度 50

図 18. 実施例 5. 7のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、 CCRF —CEM細胞に対し、 MAB L 2— s c F v/CO S 7細胞培養上清抗体が特異的にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度 50

図 1 9. 実施例 5. 9の CHO細胞産生の MABし一 2抗体由来の一本鎖 F Vの精製過程において、 Blue- sepharose カラムで得られた画分をハイドロキシァパタィトカラムを用いて精製した際のクロマトグラムを示す図であり、主要なピークとして画分 A、画分 Bが得られたことを示す。

図 20. 実施例 5. 9の（2) で得られた画分 A、画分 Bについてゲル濾過により精製した結果を示す図であり、画分 Aでは見かけ上の分子量約 36 kD、画分 Bでは同 76 kDの位置に主要ピクが（それぞれ A I及び B I) が溶出したことを示す。

図 21. 実施例 5. 9の CH〇細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vの精製過程において得られた画分を SD S— PAGEで分析した図であり、何れも分子量約 35 kDに単一のバンドのみであることを示す。

図 22. CHO細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F Vの精製において得られた画分 A I及び B Iをゲル滤過により分析した結果を示す図であり、画分 A Iはモノマーからなり、画分 B Iはダイマーからなることを示す。

図 23. 本発明の一本鎖 F Vをコドする DNAを、大腸菌の菌体内にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。

図 24. 実施例 5. 1 2の大腸菌細胞産生の MAB L— 2抗体由来の一本鎖 F V ポリべプチドの精製において、得られた粗製物をゲル滤過カラムを用いて精製した結果を示す図であり、各ピクはそれぞれ大腸菌細胞産生の一本鎖 F Vのモノマー、ダイマ "~を示す。

図 25. 実施例 5. 1 3のアポト^"シス誘起効果の結果を示す図であり、 h IA P/L 1210細胞には、コントロールとしてのマウス I g G抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度 3 μ gZm 1 )。 " 図 26. 実施例 5. 13のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、 h I A P/L 1210細胞に対し、 CHO細胞産生の MAB L 2— s c F vダイマ^"が顕著にアポトーシスを誘起することを示す (最終濃度 3 g/m l)。

図 27. 実施例 5. 1 3のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、 h I A P/L 1210細胞に対し、大腸菌細胞産生の MAB L 2— s c F vダイマ一が顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度 3 g/m 1 )₀

図 28. 実施例 5. 1 3のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、 h I A P/L 1 2 10細胞には、 CH〇細胞産生の MAB L 2— s c F vモノマーのァポト一シス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度 3 g /m 1 )。

図 29. 実施例 5. 1 3のアポト一シス誘起効果の結果を示す図であり、 h I A P/L 1210細胞には、大腸菌細胞産生の MAB L 2— s c F vモノマーのァポトーシス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度 3 μ g / 1 )o

図 30. 実施例 5. 1 3のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、 h I A P/L 1210細胞には、コントロールとしてのマウス I g G抗体は抗 F LAG 抗体の添加によってもアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度 3 /i gノ m 1 )。

図 3 1. 実施例 5. 13のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、 h i A P/L 12 10細胞に対し、 CHO細胞産生の MAB L 2— s c F vモノマーが抗 F LAG抗体の添加によって顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度 3 // gZm l )。

図 3 2. ヒト骨髄腫細胞株 KP MM 2を移植したマウスの血清中のヒト I gG量を定量したものであり、マウスにおけるヒト骨髄腫により産生されるヒト I gG の量を測定した結果を示す図であり、 s c F v/CHOダイマーが KPMM2細胞の増殖を非常に強く抑制していることを示す。

図 3 3. 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、 s c F v/CHOダイマ —投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。

図 34. MAB L— 2抗体由来の 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む改変抗体 [_S c (F v)₂] を発現するプラスミドの一例の構造を示す。

図 35. [H鎖] ― [L鎖] となるように V領域を連結し、且つペプチドリンカ一を含まない s c F v (HLタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。図 36. HLタイプのポリぺプチドの構造およびべプチドリンカーのアミノ酸配歹¹ Jを示す。

図 37. [L鎖] 一「H鎖] となるように V領域を連結し、且つペプチドリンカ一を含まない s c F v (LHタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。図 38. LHタイプのポリべプチドの構造およびぺプチドリンカーのアミノ酸酉己列を示す。

図 39. 実施例 6. 4におけるウェスタンブロッテイングの結果を示す図であり、 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む改変抗体 s c (F v)₂及び種々の長さのぺプチドリンカを有する MAB L— 2抗体 s c F Vが発現していることを示す。

図 40 a及び b. 実施例 6. 3 (1) にて調製した COS 7細胞培養上清を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図であり、種々の長さのペプチドリンカ一を有する MABL 2— s c F V及び s c (F v ) ₂は、ヒト I A Pに対して高い親和性を有することを示す。

図 41. 実施例 6. 6のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、 s c F v <HL 3, 4, 6， 7、 LH3, 4， 6， 7〉及び s c (F v) ₂は h I A P/L 1 210細胞に対して顕著な細胞死を誘導することを示す。

図 42. 実施例 6. ： L 0の抗原結合評価の結果を示す図であり、 s c F v<HL 5 >のダイマ及び s c (F v)₂がヒト IAPに対して高い親和性を有すること示す。

図 43. 実施例 6. 1 1の in vitroアポト一シス誘起効果の結果を示す図であり、 MAB L 2 - s c F V <HL 5 >のダイマー及び MAB L 2— s c (F v) ₂は h I AP/L 1 2 10, C CR F— C EMの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導することを示す。

図 44. ヒト骨髄腫細胞株 KP MM 2を移植したマウスにおけるヒト骨髄腫により産生される血清中の Mタンパク質の量を測定した結果を示す図であり、 s c F V <HL- 5 >及び s c (F v)₂が KPMM2細胞の增殖を非常に強く抑制していることを示す。

図 45. 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、 s c F v <HL— 5〉投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。

図 46. 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、 s c (F v)₂投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。

図 47. 1 5アミノ酸からなるリンカ配列を含む再構成 1 2 B 5—本鎖 F Vをコードする D N A断片の構築方法とその構造を概略的に示す。

図 48. 実施例 7. 5 (1) で得られた各 1 2 B 5—本鎖 F Vを、ゲル濾過により精製した結果を示す図であり、 s c 12 B 5では 2つのピーク（画分 A， B) に分かれた結果を示す。

図 49. 実施例 7. 5 (2) において、各画分 Aおよび Bを SD S— PAGEにより分析した結果を示す。

図 50. 実施例 7. 5 (2) において、各画分 Aおよび Bを S u p e r d e X 2 00カラムにより分析した結果を示し、（a) 画分 Aでは見かけ上の分子量約 44 kDに、（b) 画分 Bでは同 22 kDの位置に主要ピークが溶出されたことを示す。図 51. s c 1 2 B 5及び 1 2B 5抗体（I gG, F a b) の TP O様ァゴニスト活性の測定結果を示し、 12 B 5 I g G及び一価一本鎖 F V ( s c 12 B 5 )は、濃度依存的に T P O様のァゴニス卜活性を有することを示す。

図 52. s c 1 2 B 5モノマー及びダイマーの TPO様ァゴニスト活性の測定結果を示し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖 F V ( s c 1 2 B 5ダイマ ) は一価の s c l 2 B 5より約 400倍以上強いァゴニスト活性を示し、その強さはヒト TPOと同等もしくはそれ以上であることを示す。

図 53. 得られた s c 12E 10—本鎖抗体を S u p e r d e x 200HRカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した結果を示す図であり、 12 E 10 s c 3では、 2つのピク（画分 A， B) に分かれた結果を示す。

図 54. 得られた d b 12 E 10—本鎖抗体を S u p e r d e x 200HRカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィ一で精製した結果を示す図であり、 12 E 10 s c 3では、 2つのピク（画分 C， D) に分かれた結果を示す。

図 55. 画分 A， B ( s c 1 2 E 10) および画分 C、 D (d b 12 E 10) を還元、非還元条件下における SD S— PAGE分析した結果を示す。

図 56. 画分 A， Bを、 S u p e r d e x 200 H Rカラムを用いたゲルろ過ク口マトグラフィ一で分析した結果を示す。（1) 画分 Aでは、見かけ上の分子量 4 2 kDに（2) 画分 Bでは、同 20 kDの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。

図 57. 画分 C, Dを、 S u p e r d e X 200 HRカラムを用いたゲルろ過ク口マトグラフ分析した結果を示す。（1) 画分 Cでは、見かけ上の分子量 6 9 kDに（2) 画分 Bでは、同 41 k Dの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。

図 58. 各種 1 2 E 10抗体分子の MP Lに対するァゴニスト活性を示すグラフであり、一本鎖 F V (s c l 2 E 10, d b 1 2 E 10) では TP O様のァゴニスト活性を示したのに対し、 1 2E 10 1 _§0ぉょび1 2£ 10 F a bでは全く活性が認められなかったことを示す。

図 59. s c 12 E 10モノマーおよびダイ並びに d b 1 2 E 10ダイマ一およびトリマーの MP Lに対するァゴニスト活性を示すグラフであり、 s c 1

2 E 10ダイ d b 1 2 E 10ダイマおよびトリマーの TP O様ァゴニスト活性が TP〇よりも強力であることを示す。産業上の利用可能性

本発明の改変抗体は、細胞表面上の分子を架橋することにより該細胞内にシグナルを伝達しうるァゴニスト作用を有しており、また親抗体（w h o l e 1 g G) と比較して低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れているという特徴を有している。さらに本発明によれは、 TPO等の天然のリガンドゃ親抗体（wh o 1 e I g G) より顕著に高いァゴニスト活性を有する改変抗体が提供される。特に、親抗体分子でァゴニスト活性が認められない場合においても天然のリガンドより高いァゴニスト活性を有する改変抗体が提供できる。これは本発明の改変抗体が抗体分子に比べてよりリガンドに近い形態であるためと考えられる。従って、当該改変抗体は、シグナル伝達ァゴ-ストとして使用して、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用を奏することができる。また、本発明によれば、抗体分子を本発明の改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品が提供される。本発明の改変抗体を有効成分とする医薬製剤は、癌、炎症、ホルモン異常、自己免疫疾患並びに白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および真性多血症などの血液疾患の予防及び Z又は治療薬として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 細胞表面分子または細胞内の分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、同一又は異なるモノクローナル抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体。

2 . 細胞表面分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、モノクロナル抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体。

3 . H鎖 V領域及び L鎖 V領域がリンカ一を介して連結されている、請求項 1 または 2記載の改変抗体。

4 . リンカが、少なくとも 1個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカ^"である、請求項 3に記載の改変抗体。

5 . 改変抗体が、 1つの H鎖 V領域及び 1つの L鎖 V領域を含む一本鎖 F Vのマルチマから構成される請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の改変抗体。

6 . 改変抗体が、一本鎖 F Vのテトラマ"、トリマーまたはダイマから構成される請求項 5に記載の改変抗体。

7 . 改変抗体が、一本鎖 F Vのダイマから構成される請求項 6に記載の改変抗体。

8 . 同じ鎖上の H鎖 V領域及び L鎖 V領域は互いに連合して 1つの抗原結合部位を形成していない、請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の改変抗体。

9 . 改変抗体が、 2つ以上の H鎖 V領域及び 2つ以上の L鎖 V領域を含む一本鎖ポリぺプチドである請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の改変抗体。

1 0 . 改変抗体が、 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む一本鎖ポリぺプチドである請求項 9に記載の改変抗体。

1 1 . 改変抗体が、さらにポリぺプチド精製のためのァミノ酸配列を含む請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の改変抗体。

1 2 . 改変抗体が精製されたものである、請求項 1〜1 1のいずれか 1項に記載の改変抗体。

1 3 . H鎖 V領域及び/又はし鎖 V領域が、ヒト抗体の H鎖 V領域及び/又は L 鎖 V領域である請求項 1〜 12のいずれか 1項に記載の改変抗体。

14. H鎖 V領域及び/又は L鎖 V領域が、ヒト型化された H鎖 V領域及び/又は L鎖 V領域である請求項 1 ~ 13のいずれか 1項に記載の改変抗体。

15. 前記細胞表面分子又は細胞内分子が、ホルモン受容体、サイト力イン受容体、チロシンキナーゼ受容体又は核内受容体である、請求項 1〜14のいずれか

1項に記載の改変抗体。

16. 細胞表面分子又は細胞内分子が、エリスロポエチン（EPO) 受容体、トロンボポェチン（TPO) 受容体、顆粒球コロニー刺激因子（G— CSF) 受容体、マクロファージコロニー刺激因子（M— CSF) 受容体、顆粒球マクロファ —ジコロニー刺激因子（GM— CSF) 受容体、腫瘍壊死因子（TNF) 受容体、インタロイキン一 1 ( I L一 1) 受容体、インタロイキン一 2 (I L- 2) 受容体、インターロイキン一 3 ( I L- 3) 受容体、インタ^ロイキン一 4 (I L-4) 受容体、インターロイキン— 5 ( I L- 5) 受容体、インタ^"ロイキン一 6 ( I L- 6) 受容体、インターロイキン一 7 (I L— 7) 受容体、インターロイキン一 9 (I L一 9) 受容体、インターロイキン一： L O (I L—10) 受容体、インターロイキン一 1 1 (I L— 11) 受容体、インターロイキン _ 12

(I L- 12) 受容体、インターロイキン一 1 3 (I L— 13) 受容体、インタロイキン一 1 5 ( I L- 15) 受容体、インターフェロン一 α ( I FN— α) 受容体、インターフェロン一 β ( I FN-β) 受容体、インタフエロン一 γ ( I FN 一 γ) 受容体、成長ホルモン（GH) 受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（SCF) 受容体、血管内皮増殖因子（VEGF) 受容体、上皮細胞増殖因子（EGF) 受容体、神経成長因子（NGF) 受容体、線維芽細胞増殖因子（F GF) 受容体、血小板由来増殖因子（PDGF) 受容体、トランスフォミング増殖因子一 β (TGF— β) 受容体、白血球遊走阻止因子（L I F) 受容体、毛様体神経栄養因子（CNTF) 受容体、オンコスタチン M (OSM) 受容体、 No t c hファミリ"受容体、 E 2 F、 E 2F/DP 1又は TAK1/TAB 1である請求項 1〜 15のいずれか 1項に記載の改変抗体。

17. ァゴニスト作用が、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用である、請求項 1〜1 6のいずれか 1項に記載の改変抗体。

1 8 . 改変抗体が、単一特異性（mono- specific) の改変抗体である請求項 1〜 1 7のいずれか 1項に記載の改変抗体。

1 9 . 改変抗体が、多価特異性（multi- specific) の改変抗体である請求項 1 ~ 1 7のいずれか 1項に記載の改変抗体。

2 0 . 改変抗体が、二重特異性（bi- specific) の改変抗体である請求項 1 9に記載の改変抗体。

2 1 . L鎖 V領域及び H鎖 V領域が、同一のモノクロナノレ抗体由来である、請求項 2 0に記載の改変抗体。

2 2 . 親抗体と比較して同等以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、請求項 1 〜 2 1のいずれか 1項に記載の改変抗体。

2 3 . 親抗体と比較して 2倍以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、請求項 2 2に記載の改変抗体。

2 4 . 親抗体と比較して 10倍以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、請求項 2 3に記載の改変抗体。

2 5 . 親抗体がァゴニスト作用を実質的に有さない、請求項 1〜2 1のいずれか 1項に記載の改変抗体。

2 6 . 細胞表面分子または細胞内分子に結合する天然のリガンドと比較して同等以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、モノクローナル抗体の H鎖 V領域を 2 つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む化合物。

2 7 . 細胞表面分子または細胞内分子に結合する天然のリガンドと比較して 2倍以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、請求項 2 6に記載の化合物。

2 8 . 細胞表面分子または細胞内分子に結合する天然のリガンドと比較して 1 0 倍以上のァゴニスト作用（ED50値）を示す、請求項 2 7に記載の化合物。

2 9 . 細胞間接着作用を実質的に有さない請求項 1〜 2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物。

3 0 . 親抗体と比較して、 1/ 1 0以下の細胞間接着作用（ED50値）を示す請求項 1〜 2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物。

3 1 . 請求項 1〜 2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物をコドする D NA。

3 2 . 請求項 1〜2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物を産生する動物細胞。

3 3 . 請求項 1〜2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物を産生する微生物。

3 4 . 請求項 1〜2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物のァゴニストとしての使用。

3 5 . 細胞表面分子または細胞内分子に結合する第 1のリガンドと第 2のリガンドを投与し、さらに第 1及び第 2のリガンドに結合して、前記第 1及び第 2のリガンドを架橋する物質を投与することからなる、細胞にァゴニスト作用を誘導する方法。

3 6 . 第 1及び第 2のリガンドが、同一又は異なる一本鎖 F Vモノマーである請求項 3 5記載の方法。

3 7 . リガンドを架橋する物質が、抗体、抗体断片または 2価の改変抗体である. 請求項 3 5又は 3 6記載の方法。

3 8 . 請求項 1〜 2 8のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物を用いて細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより細胞内にァゴニスト作用を生じさせる方法。

_{3 9} . ァゴニスト作用が、アポト^シス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用である、請求項 3 8記載の方法。

4 0 . 請求項 1〜 2 9のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物を有効成分として含む医薬。

4 1 . 請求項 1〜2 9のいずれか 1項に記載の改変抗体または化合物の医薬としての使用。

4 2 . 細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体のスクリーユング方法であって、

( 1 ) 該細胞表面分子または細胞内分子に特異的に結合する、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体を作製し、

( 2 ) 該細胞表面分子または細胞内分子を発現している細胞に該改変抗体を作用させ、

( 3 ) 該細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより該細胞に生ずるァゴニス卜作用を測定する、

工程を含むスクリ一エング方法。

4 3 . 細胞表面分子または細胞內分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体のァゴニスト活性の測定方法であって、

( 1 ) 細胞表面分子または細胞内分子に特異的に結合する、抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体を作製し、

( 2 ) 該細胞表面分子または細胞内分子を発現している細胞に前記改変抗体を作用させ、

( 3 ) 該細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより該細胞に生ずるァゴニスト作用を測定する、

工程を含むァゴニスト活性の測定方法

4 4 . 細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりァゴニスト作用を示す、モノクローナル抗体の H鎖 V領域を 2つ以上及び L鎖 V領域を 2つ以上含む改変抗体の製造方法であって、

( 1 ) 請求項 3 2記載の動物細胞または請求項 3 3記載の微生物を培養して前記改変抗体を産生し、

( 2 ) 前記改変抗体を精製する、

工程を含む製造方法。