JPH07236475A - Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 - Google Patents
Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株Info
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- JPH07236475A JPH07236475A JP6058082A JP5808294A JPH07236475A JP H07236475 A JPH07236475 A JP H07236475A JP 6058082 A JP6058082 A JP 6058082A JP 5808294 A JP5808294 A JP 5808294A JP H07236475 A JPH07236475 A JP H07236475A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 骨髄腫のＩＬ−６依存性増殖機構のモデルと
なりえる骨髄腫細胞株を樹立することを目的とする。さ
らに、該細胞株を移植した実験動物、該細胞株または該
実験動物を用いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法を提
供することも目的とする。 【構成】 オートクライン機構によりＩＬ−６依存性で
増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植した実験動
物、骨髄腫治療剤を該細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖
抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロ
スクリーニング法、ならびに骨髄腫治療剤を該実験動物
に投与して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる
骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。
なりえる骨髄腫細胞株を樹立することを目的とする。さ
らに、該細胞株を移植した実験動物、該細胞株または該
実験動物を用いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法を提
供することも目的とする。 【構成】 オートクライン機構によりＩＬ−６依存性で
増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植した実験動
物、骨髄腫治療剤を該細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖
抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロ
スクリーニング法、ならびに骨髄腫治療剤を該実験動物
に投与して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる
骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト骨髄腫細胞株に関
し、さらに詳しくはオートクライン機構によってＩＬ−
６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植
した実験動物、ならびに該細胞株または該実験動物を用
いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法に関する。
し、さらに詳しくはオートクライン機構によってＩＬ−
６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植
した実験動物、ならびに該細胞株または該実験動物を用
いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）および
マウスハイブリドーマ／形質細胞腫増殖因子と同一因子
であるインターロイキン６（ＩＬ−６）は多発性骨髄腫
（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：以下ＭＭと記載
する場合がある）細胞の主要な増殖因子であると考えら
れている（Kawano et al., Nature 332:83,1988; Klein
et al., Blood 73:517, 1989）。多発性骨髄腫は、形質
細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場とし、複数の
部位に同時に発生する。ＩＬ−６はこのような細胞上で
２種の膜タンパク質を介してその活性を伝達する。その
１つは、ＩＬ−６が結合する分子量８０ｋＤのリガンド
結合性膜タンパク質（ＩＬ−６受容体）であり、他の１
つは非リガンド結合性のシグナル伝達にかかわる膜タン
パク質ｇｐ１３０である（Taga et al., J. Exp. Med.
196:967, 1987）。
マウスハイブリドーマ／形質細胞腫増殖因子と同一因子
であるインターロイキン６（ＩＬ−６）は多発性骨髄腫
（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：以下ＭＭと記載
する場合がある）細胞の主要な増殖因子であると考えら
れている（Kawano et al., Nature 332:83,1988; Klein
et al., Blood 73:517, 1989）。多発性骨髄腫は、形質
細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場とし、複数の
部位に同時に発生する。ＩＬ−６はこのような細胞上で
２種の膜タンパク質を介してその活性を伝達する。その
１つは、ＩＬ−６が結合する分子量８０ｋＤのリガンド
結合性膜タンパク質（ＩＬ−６受容体）であり、他の１
つは非リガンド結合性のシグナル伝達にかかわる膜タン
パク質ｇｐ１３０である（Taga et al., J. Exp. Med.
196:967, 1987）。
【０００３】１９８８年Ｋａｗａｎｏらは新鮮ヒト骨髄
腫細胞が構成的にＩＬ−６を産生し、かつＩＬ−６受容
体を発現していること、ならびに抗ＩＬ−６受容体
（Ｒ）抗体によりインビトロで増殖が抑制されることか
ら、骨髄腫細胞は成長因子を自ら産生し、自身で受容す
るというオートクライン機構により増殖する可能性があ
ることを報告し（Kawano et al., Nature 332:83, 198
8）、一方Ｋｌｅｉｎらは、自ら成長因子を産生しない
が、周囲からの成長因子を受容するというパラクライン
機構により増殖することを提唱した（Klein et al., Bl
ood 73:517, 1989）。また、血清中のＩＬ−６濃度は骨
髄腫の病勢と相関していることが知られており（Batail
le et al., J. Clin. Invest. 84:2008, 1989）、ＩＬ
−６が骨髄腫の主要な増殖因子の１つであると考えられ
ている。
腫細胞が構成的にＩＬ−６を産生し、かつＩＬ−６受容
体を発現していること、ならびに抗ＩＬ−６受容体
（Ｒ）抗体によりインビトロで増殖が抑制されることか
ら、骨髄腫細胞は成長因子を自ら産生し、自身で受容す
るというオートクライン機構により増殖する可能性があ
ることを報告し（Kawano et al., Nature 332:83, 198
8）、一方Ｋｌｅｉｎらは、自ら成長因子を産生しない
が、周囲からの成長因子を受容するというパラクライン
機構により増殖することを提唱した（Klein et al., Bl
ood 73:517, 1989）。また、血清中のＩＬ−６濃度は骨
髄腫の病勢と相関していることが知られており（Batail
le et al., J. Clin. Invest. 84:2008, 1989）、ＩＬ
−６が骨髄腫の主要な増殖因子の１つであると考えられ
ている。
【０００４】また、新鮮分離した骨髄腫細胞の場合、骨
髄腫細胞以外の細胞の混入が避けられず、正確なアッセ
イが困難であることから、現在にいたるまで、骨髄腫細
胞がオートクライン機構またはパラクライン機構のいず
れによって増殖するのかは定かではない。
髄腫細胞以外の細胞の混入が避けられず、正確なアッセ
イが困難であることから、現在にいたるまで、骨髄腫細
胞がオートクライン機構またはパラクライン機構のいず
れによって増殖するのかは定かではない。
【０００５】ＩＬ−６依存性増殖をするヒト骨髄腫細胞
株中にトランスフェクションによってヒトＩＬ−６ ｃ
ＤＮＡを導入すると、自律的に増殖して腫瘍化すること
が観察され、これはパラクラインＩＬ−６増殖機構を示
唆するものである（Okuno etal., Exp. Hematol. 20:39
5, 1992）。また、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６はＩＬ−
６オートクライン機構によって増殖することが報告され
ている（Jernberg etal., Leukemia 5:255, 1991; Levy
et al., J. Clin. Invest. 88:696, 1991）。しかしな
がら、Ｕ２６６の増殖は外因性ＩＬ−６によっても（Je
rnberg et al., Leukemia 5:255, 1991）、また抗ＩＬ
−６モノクローナル抗体によっても（Levy et al., J.
Clin. Invest. 88:696, 1991）影響を受けなかった、と
いう報告もあり、Ｕ２６６の増殖機構に対するＩＬ−６
の関与は不明である。
株中にトランスフェクションによってヒトＩＬ−６ ｃ
ＤＮＡを導入すると、自律的に増殖して腫瘍化すること
が観察され、これはパラクラインＩＬ−６増殖機構を示
唆するものである（Okuno etal., Exp. Hematol. 20:39
5, 1992）。また、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６はＩＬ−
６オートクライン機構によって増殖することが報告され
ている（Jernberg etal., Leukemia 5:255, 1991; Levy
et al., J. Clin. Invest. 88:696, 1991）。しかしな
がら、Ｕ２６６の増殖は外因性ＩＬ−６によっても（Je
rnberg et al., Leukemia 5:255, 1991）、また抗ＩＬ
−６モノクローナル抗体によっても（Levy et al., J.
Clin. Invest. 88:696, 1991）影響を受けなかった、と
いう報告もあり、Ｕ２６６の増殖機構に対するＩＬ−６
の関与は不明である。
【０００６】本発明者らは、多発性骨髄腫患者の腹水か
ら得た１例の新鮮骨髄腫細胞において、腫瘍細胞は明ら
かなＩＬ−６依存性増殖を示し、かつ、自律的増殖とと
もに抗ＩＬ−６受容体抗体で強く抑制されることを報告
した（Goto et al., Biotherapy 7:655, 1993）。
ら得た１例の新鮮骨髄腫細胞において、腫瘍細胞は明ら
かなＩＬ−６依存性増殖を示し、かつ、自律的増殖とと
もに抗ＩＬ−６受容体抗体で強く抑制されることを報告
した（Goto et al., Biotherapy 7:655, 1993）。
【０００７】本発明者らはさらに、新鮮ヒト骨髄腫細胞
をヒトＩＬ−６遺伝子導入重症複合免疫不全マウス（Ｉ
Ｌ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウス）に移植した
腫瘍細胞の性質について検討した（Goto et al., 第５
２回日本癌学会総会講演要旨集、４９８頁、１９９３年
１０月）。その結果、皮下に移植した３匹にはその移植
部位に形質細胞腫を認め、腋窩リンパ節転移も認めた。
腹腔内移植では腫瘤形成は認めなかった。移植後の腫瘍
細胞は表面抗原やインビトロでのＩＬ−６依存性増殖お
よび抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による増殖抑制効果など
に移植前と比べて変化を認めなかった。
をヒトＩＬ−６遺伝子導入重症複合免疫不全マウス（Ｉ
Ｌ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウス）に移植した
腫瘍細胞の性質について検討した（Goto et al., 第５
２回日本癌学会総会講演要旨集、４９８頁、１９９３年
１０月）。その結果、皮下に移植した３匹にはその移植
部位に形質細胞腫を認め、腋窩リンパ節転移も認めた。
腹腔内移植では腫瘤形成は認めなかった。移植後の腫瘍
細胞は表面抗原やインビトロでのＩＬ−６依存性増殖お
よび抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による増殖抑制効果など
に移植前と比べて変化を認めなかった。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】上記したように、骨髄腫細胞
の増殖機構には未だ不明な点が多く、これを解明するこ
とが求められている。
の増殖機構には未だ不明な点が多く、これを解明するこ
とが求められている。
【０００９】本発明の目的は骨髄腫のＩＬ−６依存性増
殖機構のモデルとなりえる骨髄腫細胞株を樹立すること
にある。該細胞株は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体
抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治
療剤による骨髄腫の治療のインビトロモデルとして有用
である。
殖機構のモデルとなりえる骨髄腫細胞株を樹立すること
にある。該細胞株は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体
抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治
療剤による骨髄腫の治療のインビトロモデルとして有用
である。
【００１０】本発明は該細胞株を移植した実験動物を提
供することも目的とする。上記実験動物は抗ＩＬ−６抗
体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤を
はじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビ
ボモデルとして有用である。
供することも目的とする。上記実験動物は抗ＩＬ−６抗
体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤を
はじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビ
ボモデルとして有用である。
【００１１】本発明は骨髄腫治療剤のスクリーニング法
を提供することも目的とする。上記インビトロモデルに
おいては、細胞増殖抑制あるいはＭタンパク（ミエロー
マタンパク）分泌抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスク
リーニング法を使用することができる。また、上記イン
ビボモデルにおいては、細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌
抑制あるいは骨病変の抑制を指標とする骨髄腫治療剤の
スクリーニング法を使用することができる。なお、Ｍタ
ンパクとは、骨髄腫が特異的に産生する免疫グロブリン
タンパク質であり、それを産生する骨髄腫によりＩｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎ
ｅｓタンパクの５種類がある。
を提供することも目的とする。上記インビトロモデルに
おいては、細胞増殖抑制あるいはＭタンパク（ミエロー
マタンパク）分泌抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスク
リーニング法を使用することができる。また、上記イン
ビボモデルにおいては、細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌
抑制あるいは骨病変の抑制を指標とする骨髄腫治療剤の
スクリーニング法を使用することができる。なお、Ｍタ
ンパクとは、骨髄腫が特異的に産生する免疫グロブリン
タンパク質であり、それを産生する骨髄腫によりＩｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎ
ｅｓタンパクの５種類がある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６依存性増殖機
構を有する骨髄腫のモデルとなりうる細胞株を樹立する
ことに成功し、本発明を完成した。
を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６依存性増殖機
構を有する骨髄腫のモデルとなりうる細胞株を樹立する
ことに成功し、本発明を完成した。
【００１３】すなわち、本発明はオートクライン機構に
よりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を提供
する。
よりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を提供
する。
【００１４】また、本発明は該細胞株を移植した実験動
物を提供する。
物を提供する。
【００１５】さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記細胞
株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制あるいはＭタンパク分
泌抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビト
ロスクリーニング法を提供する。
株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制あるいはＭタンパク分
泌抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビト
ロスクリーニング法を提供する。
【００１６】さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記実験
動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑
制あるいは骨病変の抑制を試験することからなる骨髄腫
治療剤のインビボスクリーニング法を提供する。
動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑
制あるいは骨病変の抑制を試験することからなる骨髄腫
治療剤のインビボスクリーニング法を提供する。
【００１７】本発明の細胞株は、例えば多発性骨髄腫患
者の腹水などから採取した骨髄腫細胞を用いて樹立する
ことができる。本発明では特に、ＩｇＧ、λ型多発性骨
髄腫患者の腹水から骨髄腫細胞を採取した。培養開始後
１カ月で細胞は安定して増殖し始め、１年以上維持され
た。このようにして樹立された細胞株はＫＰＭＭ２と命
名され、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１７０で寄託されてい
る（１９９４年２月２２日寄託）。細胞株ＫＰＭＭ２は
インビトロでの継代、ならびに実験動物、例えば重症複
合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ＩＬ−６トランスジェ
ニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不
全状態にあるマウス中での安定した継代が可能である。
者の腹水などから採取した骨髄腫細胞を用いて樹立する
ことができる。本発明では特に、ＩｇＧ、λ型多発性骨
髄腫患者の腹水から骨髄腫細胞を採取した。培養開始後
１カ月で細胞は安定して増殖し始め、１年以上維持され
た。このようにして樹立された細胞株はＫＰＭＭ２と命
名され、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１７０で寄託されてい
る（１９９４年２月２２日寄託）。細胞株ＫＰＭＭ２は
インビトロでの継代、ならびに実験動物、例えば重症複
合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ＩＬ−６トランスジェ
ニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不
全状態にあるマウス中での安定した継代が可能である。
【００１８】細胞株ＫＰＭＭ２はインビトロでＩＬ−６
を産生し、またＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現し
ていることが確認された。また、ＫＰＭＭ２の各種サイ
トカインに対する反応性を3Ｈ−チミジンの取り込み実
験、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphe
nyltetrazolium bromide）法（J. Immun. Methods 65:5
5-63, 1983 参照）および生細胞の測定で試験した結
果、ＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみ顕著
に刺激され、これはＫＰＭＭ２がＩＬ−６に特異的に反
応して増殖することを示している。さらに、ＫＰＭＭ２
の増殖は、抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）
および抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによって用量依存的に顕著
に抑制された。また、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレー
スチェインリアクション）により、ＫＰＭＭ２がＩＬ−
６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡを発現していることが確
認された。なお、ＫＰＭＭ２は各種の接着分子、すなわ
ちＣＤ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、Ｌ
ＦＡ−３およびＶＬＡ−４を発現しており、またインビ
トロで自律的細胞凝集を示す。
を産生し、またＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現し
ていることが確認された。また、ＫＰＭＭ２の各種サイ
トカインに対する反応性を3Ｈ−チミジンの取り込み実
験、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphe
nyltetrazolium bromide）法（J. Immun. Methods 65:5
5-63, 1983 参照）および生細胞の測定で試験した結
果、ＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみ顕著
に刺激され、これはＫＰＭＭ２がＩＬ−６に特異的に反
応して増殖することを示している。さらに、ＫＰＭＭ２
の増殖は、抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）
および抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによって用量依存的に顕著
に抑制された。また、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレー
スチェインリアクション）により、ＫＰＭＭ２がＩＬ−
６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡを発現していることが確
認された。なお、ＫＰＭＭ２は各種の接着分子、すなわ
ちＣＤ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、Ｌ
ＦＡ−３およびＶＬＡ−４を発現しており、またインビ
トロで自律的細胞凝集を示す。
【００１９】このようなＫＰＭＭ２の各種特徴から、Ｋ
ＰＭＭ２がＩＬ−６オートクライン機構により増殖する
骨髄腫細胞株であることが示された。本発明の細胞株は
その増殖機構がＩＬ−６依存性のオートクライン機構で
あることが証明された最初の細胞株である。
ＰＭＭ２がＩＬ−６オートクライン機構により増殖する
骨髄腫細胞株であることが示された。本発明の細胞株は
その増殖機構がＩＬ−６依存性のオートクライン機構で
あることが証明された最初の細胞株である。
【００２０】したがって、本発明の細胞株は抗ＩＬ−６
ｍＡｂあるいは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂなどのＩＬ−６
活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤のスクリーニン
グに有用である。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ
−６受容体抗体を本発明の細胞株に添加して骨髄腫細胞
増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のイ
ンビトロスクリーニング法が可能である。また、本発明
の骨髄腫細胞株は、細胞数の増加に比例してＭタンパク
の分泌量が増大することにより、Ｍタンパク分泌抑制を
指標として骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニングを
行うことができる。さらに、本発明の細胞株は、細胞間
相互作用やＩＬ−６シグナル伝達を介する骨髄腫細胞の
増殖において接着分子の果たす役割を研究するモデルと
しても有用である。
ｍＡｂあるいは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂなどのＩＬ−６
活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤のスクリーニン
グに有用である。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ
−６受容体抗体を本発明の細胞株に添加して骨髄腫細胞
増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のイ
ンビトロスクリーニング法が可能である。また、本発明
の骨髄腫細胞株は、細胞数の増加に比例してＭタンパク
の分泌量が増大することにより、Ｍタンパク分泌抑制を
指標として骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニングを
行うことができる。さらに、本発明の細胞株は、細胞間
相互作用やＩＬ−６シグナル伝達を介する骨髄腫細胞の
増殖において接着分子の果たす役割を研究するモデルと
しても有用である。
【００２１】本発明は、本発明の細胞株を移植した実験
動物も提供する。本発明の細胞株を移植する実験動物と
しては、マウスの他、ラット、ウサギ、モルモット、ハ
ムスター、サルなどが挙げられ、さらには、Ｔ細胞ある
いはＢ細胞といった免疫担当細胞の機能に障害が生じ、
免疫不全状態にある実験動物に本発明の細胞株を移植す
るのがよい。既に述べたように、本発明の細胞株はＳＣ
ＩＤマウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウ
スおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス
中で安定した継代が可能である。
動物も提供する。本発明の細胞株を移植する実験動物と
しては、マウスの他、ラット、ウサギ、モルモット、ハ
ムスター、サルなどが挙げられ、さらには、Ｔ細胞ある
いはＢ細胞といった免疫担当細胞の機能に障害が生じ、
免疫不全状態にある実験動物に本発明の細胞株を移植す
るのがよい。既に述べたように、本発明の細胞株はＳＣ
ＩＤマウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウ
スおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス
中で安定した継代が可能である。
【００２２】興味深いことに、本発明の上記細胞株をマ
ウスに移植するには、皮下移植、腹腔内移植の外に、静
脈内移植によっても行うことができる。皮下移植および
腹腔内移植した場合には、それぞれ移植部位皮下および
腹腔内に固形腫瘍が観察されるが、静脈内移植した場合
には、骨髄への腫瘍細胞の生着が見られ、これを実際の
骨髄腫の病態に近いモデルとして使用することができ
る。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗
体といったＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治
療剤を本発明の実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制
効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボス
クリーニング法が可能である。また、本発明の細胞株が
生着した実験動物では、腫瘍の増殖に伴って血清中のＭ
タンパク濃度の上昇が観察されるため、Ｍタンパク濃度
の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニ
ング法も可能である。さらに、本発明の細胞株が実験動
物の骨髄へ生着すると骨髄腫細胞の増殖に伴い、血中イ
オン化カルシウム濃度の上昇、骨破壊、骨融解および骨
吸収といった骨病変が観察されることから、これら骨病
変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリー
ニング法が可能である。
ウスに移植するには、皮下移植、腹腔内移植の外に、静
脈内移植によっても行うことができる。皮下移植および
腹腔内移植した場合には、それぞれ移植部位皮下および
腹腔内に固形腫瘍が観察されるが、静脈内移植した場合
には、骨髄への腫瘍細胞の生着が見られ、これを実際の
骨髄腫の病態に近いモデルとして使用することができ
る。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗
体といったＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治
療剤を本発明の実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制
効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボス
クリーニング法が可能である。また、本発明の細胞株が
生着した実験動物では、腫瘍の増殖に伴って血清中のＭ
タンパク濃度の上昇が観察されるため、Ｍタンパク濃度
の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニ
ング法も可能である。さらに、本発明の細胞株が実験動
物の骨髄へ生着すると骨髄腫細胞の増殖に伴い、血中イ
オン化カルシウム濃度の上昇、骨破壊、骨融解および骨
吸収といった骨病変が観察されることから、これら骨病
変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリー
ニング法が可能である。
【００２３】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく
説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものでは
ない。
【００２４】
実施例１：骨髄腫細胞株の樹立および維持 ＩｇＧ、λ型多発性骨髄腫患者（７６才、女性、ステー
ジIIＡ）の腹水から骨髄腫細胞を採取した。腹水は多数
の骨髄腫細胞を含んでおり、腹水中のＩＬ−６レベルは
９１．０ｐｇ／ｍｌに達していた。採取した腹水をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）を用い
た密度勾配遠心法にかけて単核球を分離、プラスチック
シャーレにて付着細胞を除去し、さらにヒツジ赤血球に
てＴ細胞を除去し、腫瘍細胞を９５％以上に純化した。
細胞を２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｘａｖｉｅｒ Ｉ
ｎｖｅｓｔｍｅｎｔｓ製、オーストラリア）、組換えヒ
トＩＬ−６（中外製薬製）４ｎｇ／ｍｌおよびカナマイ
シン（明治製菓社製）１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ
１６４０（ギブコ社製）培養液中に１×１０6細胞／ｍ
ｌの濃度で浮遊させた。次いで２５ｍｌフラスコ中で１
０ｍｌの培養液中で培養し、湿潤５％ＣＯ2中、３７℃
でインキュベートした。安定した細胞増殖が観察される
まで３日ごとに培地を部分的に新しいものに取り替え
た。
ジIIＡ）の腹水から骨髄腫細胞を採取した。腹水は多数
の骨髄腫細胞を含んでおり、腹水中のＩＬ−６レベルは
９１．０ｐｇ／ｍｌに達していた。採取した腹水をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）を用い
た密度勾配遠心法にかけて単核球を分離、プラスチック
シャーレにて付着細胞を除去し、さらにヒツジ赤血球に
てＴ細胞を除去し、腫瘍細胞を９５％以上に純化した。
細胞を２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｘａｖｉｅｒ Ｉ
ｎｖｅｓｔｍｅｎｔｓ製、オーストラリア）、組換えヒ
トＩＬ−６（中外製薬製）４ｎｇ／ｍｌおよびカナマイ
シン（明治製菓社製）１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ
１６４０（ギブコ社製）培養液中に１×１０6細胞／ｍ
ｌの濃度で浮遊させた。次いで２５ｍｌフラスコ中で１
０ｍｌの培養液中で培養し、湿潤５％ＣＯ2中、３７℃
でインキュベートした。安定した細胞増殖が観察される
まで３日ごとに培地を部分的に新しいものに取り替え
た。
【００２５】培養開始１カ月後で細胞は安定して増殖し
始め１年以上維持され、細胞株として樹立された。この
細胞株をＫＰＭＭ２と命名した。ＩＬ−６の存在下また
は非存在下における倍加時間はそれぞれ４８時間および
７２時間であった。
始め１年以上維持され、細胞株として樹立された。この
細胞株をＫＰＭＭ２と命名した。ＩＬ−６の存在下また
は非存在下における倍加時間はそれぞれ４８時間および
７２時間であった。
【００２６】ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌は以下の
通りである。ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌 ＫＰＭＭ２細胞は光学顕微鏡下で自律的な細胞凝集を示
して増殖することが観察され（図１）、ライト−ギムザ
染色では形質細胞様の形態を示した（図２）。ＫＰＭＭ
２は酸ホスファターゼが陽性であり、α−ナフチルブチ
レートエステラーゼがやや陽性であるが、ペルオキシダ
ーゼ、ＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ、パス
（過ヨウ素酸シッフ試薬）およびアルカリホスファター
ゼは陰性であった。細胞質ＩｇＧおよびλＬ鎖が検出さ
れたが、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびκＬ鎖は直接免疫蛍光
法で陰性であった。また、細胞（１０6個／ｍｌ）を３
日間培養すると、培養上清にはＩｇＧおよびλＬ鎖の分
泌が見られた。
通りである。ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌 ＫＰＭＭ２細胞は光学顕微鏡下で自律的な細胞凝集を示
して増殖することが観察され（図１）、ライト−ギムザ
染色では形質細胞様の形態を示した（図２）。ＫＰＭＭ
２は酸ホスファターゼが陽性であり、α−ナフチルブチ
レートエステラーゼがやや陽性であるが、ペルオキシダ
ーゼ、ＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ、パス
（過ヨウ素酸シッフ試薬）およびアルカリホスファター
ゼは陰性であった。細胞質ＩｇＧおよびλＬ鎖が検出さ
れたが、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびκＬ鎖は直接免疫蛍光
法で陰性であった。また、細胞（１０6個／ｍｌ）を３
日間培養すると、培養上清にはＩｇＧおよびλＬ鎖の分
泌が見られた。
【００２７】実施例２：表面抗原の解析 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の表面抗原の
発現を各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネ
ルを用いて、直接および間接蛍光抗体法（Fried et a
l., Flow Cytometry, Boca Raton, CRC Press:59-78, 1
989）により検討した。
発現を各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネ
ルを用いて、直接および間接蛍光抗体法（Fried et a
l., Flow Cytometry, Boca Raton, CRC Press:59-78, 1
989）により検討した。
【００２８】実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ
２を、１０6個／チューブとなるように、１００μｌの
蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％
ＦＣＳおよび０．１％ ＮａＮ3を含むリン酸緩衝化生
理食塩溶液（ＰＢＳ）、以下ＦＡＣＳ緩衝液という）に
浮遊させた。次いで、直接蛍光抗体法においては、飽和
量の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対するフルオレシ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）あるいはフィコエリ
スリン（ＰＥ）標識抗体を添加し、４℃にて３０分間イ
ンキュベートした。細胞を上記ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗
浄した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯ
ＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
２を、１０6個／チューブとなるように、１００μｌの
蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％
ＦＣＳおよび０．１％ ＮａＮ3を含むリン酸緩衝化生
理食塩溶液（ＰＢＳ）、以下ＦＡＣＳ緩衝液という）に
浮遊させた。次いで、直接蛍光抗体法においては、飽和
量の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対するフルオレシ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）あるいはフィコエリ
スリン（ＰＥ）標識抗体を添加し、４℃にて３０分間イ
ンキュベートした。細胞を上記ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗
浄した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯ
ＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００２９】一方、間接蛍光抗体法においては、非標識
の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対する抗体を添加
し、４℃にて３０分間インキュベートして、細胞をＦＡ
ＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ
あるいはＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）
２断片（ＴＡＧＯ社製）を加え、４℃にて３０分間反応
させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩
衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ
ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対する抗体を添加
し、４℃にて３０分間インキュベートして、細胞をＦＡ
ＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ
あるいはＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）
２断片（ＴＡＧＯ社製）を加え、４℃にて３０分間反応
させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩
衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ
ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００３０】ＫＰＭＭ２の表面抗原を以下の表１にまと
めて示す。
めて示す。
【００３１】
【表１】 表から明らかなように、ＫＰＭＭ２は形質細胞関連抗原
（ＣＤ３８、ＰＣＡ−１およびＢＬ３）、接着分子（Ｃ
Ｄ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＬＦＡ
−３およびＶＬＡ−４）ならびにＣＤ４５、ＣＤ６３、
ＣＤ７１、ＩｇＧおよびλなどの抗原が陽性であった。
（ＣＤ３８、ＰＣＡ−１およびＢＬ３）、接着分子（Ｃ
Ｄ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＬＦＡ
−３およびＶＬＡ−４）ならびにＣＤ４５、ＣＤ６３、
ＣＤ７１、ＩｇＧおよびλなどの抗原が陽性であった。
【００３２】実施例３：免疫グロブリン遺伝子再構成 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の免疫グロブ
リン（Ｉｇ）遺伝子再構成をサザンブロット法により分
析した。
リン（Ｉｇ）遺伝子再構成をサザンブロット法により分
析した。
【００３３】実施例１に記載の方法により得られたＫＰ
ＭＭ２細胞（１０7個）から、Manual of Clinical Immu
nology, 3rd edition, American Society for Microbio
logy, 1986の方法に準じてＤＮＡを調製し、３種類の制
限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄIII
（ベーリンガー・マンハイム社製）で別々に処理し、エ
タノール沈殿としてＤＮＡを回収して、０．８％アガロ
ースゲル（ＳＥＡＫＥＭＧＴＧ，ＦＭＣ社製）により２
４時間電気泳動を行った。電気泳動したＤＮＡをナイロ
ン膜（ハイボンドＮ+，アマシャム社製）に移し、これ
を乾燥させた。次に、タカラランダムプライマーＤＮＡ
ラベリングキット（宝酒造社製）を用いて、32Ｐ標識し
たヒトＩｇ ＪH、ＣκおよびＣλプローブ（オンコア
社製）を用い、添付の処方に従ってサザンブロット分析
を行った。なお、対照として健常人の末梢血単核球から
得た再構成を生じていない染色体ＤＮＡを用いた。その
結果、ＩｇＨおよびκ鎖遺伝子が再構成していたが、λ
鎖遺伝子は再構成していなかった（図３）。以上のこと
より、ＫＰＭＭ２がモノクローナルな抗体を産生するこ
と、および細胞の単一性が確認された。
ＭＭ２細胞（１０7個）から、Manual of Clinical Immu
nology, 3rd edition, American Society for Microbio
logy, 1986の方法に準じてＤＮＡを調製し、３種類の制
限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄIII
（ベーリンガー・マンハイム社製）で別々に処理し、エ
タノール沈殿としてＤＮＡを回収して、０．８％アガロ
ースゲル（ＳＥＡＫＥＭＧＴＧ，ＦＭＣ社製）により２
４時間電気泳動を行った。電気泳動したＤＮＡをナイロ
ン膜（ハイボンドＮ+，アマシャム社製）に移し、これ
を乾燥させた。次に、タカラランダムプライマーＤＮＡ
ラベリングキット（宝酒造社製）を用いて、32Ｐ標識し
たヒトＩｇ ＪH、ＣκおよびＣλプローブ（オンコア
社製）を用い、添付の処方に従ってサザンブロット分析
を行った。なお、対照として健常人の末梢血単核球から
得た再構成を生じていない染色体ＤＮＡを用いた。その
結果、ＩｇＨおよびκ鎖遺伝子が再構成していたが、λ
鎖遺伝子は再構成していなかった（図３）。以上のこと
より、ＫＰＭＭ２がモノクローナルな抗体を産生するこ
と、および細胞の単一性が確認された。
【００３４】実施例４：細胞遺伝学的分析 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の染色体の構
造異常を分析した。
造異常を分析した。
【００３５】実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ
２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて５×１０5個／ｍｌ
となるように培養した。培養４８時間後に、ＫＰＭＭ２
に０．０５μｇのコルセミド（ギブコ社製）を１５分間
処理し、分裂中期で細胞周期が停止したＫＰＭＭ２細胞
を回収した。回収したＫＰＭＭ２細胞を０．０７５Ｍの
ＫＣｌで２０分間処理し、メタノール−酢酸で固定し
た。次いで、ＫＰＭＭ２細胞の染色体をトリプシン−ギ
ムザバンド染色法によって分析した。
２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて５×１０5個／ｍｌ
となるように培養した。培養４８時間後に、ＫＰＭＭ２
に０．０５μｇのコルセミド（ギブコ社製）を１５分間
処理し、分裂中期で細胞周期が停止したＫＰＭＭ２細胞
を回収した。回収したＫＰＭＭ２細胞を０．０７５Ｍの
ＫＣｌで２０分間処理し、メタノール−酢酸で固定し
た。次いで、ＫＰＭＭ２細胞の染色体をトリプシン−ギ
ムザバンド染色法によって分析した。
【００３６】その結果、ＫＰＭＭ２は多くの構造異常を
もつ二倍体細胞であることが判明した（図４）。分析し
た１５細胞すべてが４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）
（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３
２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅ
ｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１
０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
もつ二倍体細胞であることが判明した（図４）。分析し
た１５細胞すべてが４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）
（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３
２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅ
ｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１
０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
【００３７】 実施例５：ＥＢＶおよびマイコプラズマの検出 実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２のエプスタイン・
バールウイルス（ＥＢＶ）およびマイコプラズマ汚染を
試験した。
バールウイルス（ＥＢＶ）およびマイコプラズマ汚染を
試験した。
【００３８】実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ
２細胞の染色体からエプスタイン・バールウイルス（Ｅ
ＢＶ）を検出するために、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＥＢＶ Ｂ
ａｍＷ領域増幅プライマーを用いて、添付の処方に従い
ＰＣＲ（ポリメレース チェイン リアクション）を行
った。マイコプラズマ感染の検出はマイコプラズマＤＮ
Ａ検出用Ｍ．Ｔ．Ｃ．キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉ
ｎｃ．社製）により、添付の処方に従って実施した。
２細胞の染色体からエプスタイン・バールウイルス（Ｅ
ＢＶ）を検出するために、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＥＢＶ Ｂ
ａｍＷ領域増幅プライマーを用いて、添付の処方に従い
ＰＣＲ（ポリメレース チェイン リアクション）を行
った。マイコプラズマ感染の検出はマイコプラズマＤＮ
Ａ検出用Ｍ．Ｔ．Ｃ．キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉ
ｎｃ．社製）により、添付の処方に従って実施した。
【００３９】その結果、ＫＰＭＭ２はＥＢＶゲノムおよ
びマイコプラズマゲノムに対して陰性であった。
びマイコプラズマゲノムに対して陰性であった。
【００４０】実施例６：サイトカインに対する反応性 実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の各種サイトカイ
ンへの反応性を試験した。
ンへの反応性を試験した。
【００４１】実施例１に記載する方法で得られたＫＰＭ
Ｍ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシ
ンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２
００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１
０4個／穴となるように分注した。
Ｍ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシ
ンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２
００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１
０4個／穴となるように分注した。
【００４２】９６穴プレートの各穴には、下記の濃度と
なるように各種サイトカインを別々に加えた。
なるように各種サイトカインを別々に加えた。
【００４３】組換えＩＬ−２、同ＩＬ−３、同腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）−α、同顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、同幹細胞成長因子（ＳＣ
Ｆ）（以上、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、同ＩＬ−４、同Ｉ
Ｌ−７、同ＩＬ−１０、同ＩＬ−１１、同白血病阻害因
子（ＬＩＦ）、同オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（以上、
Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−９、同
トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β（以上、
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−１α
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、同Ｉ
Ｌ−５（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）、同エリスロポエチン（ＥＰＯ）および同顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（以上、中外製薬株式会
社より提供）は１００ｎｇ／ｍｌ。
因子（ＴＮＦ）−α、同顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、同幹細胞成長因子（ＳＣ
Ｆ）（以上、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、同ＩＬ−４、同Ｉ
Ｌ−７、同ＩＬ−１０、同ＩＬ−１１、同白血病阻害因
子（ＬＩＦ）、同オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（以上、
Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−９、同
トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β（以上、
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−１α
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、同Ｉ
Ｌ−５（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）、同エリスロポエチン（ＥＰＯ）および同顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（以上、中外製薬株式会
社より提供）は１００ｎｇ／ｍｌ。
【００４４】組換えインターフェロン（ＩＦＮ）−γ
（塩野義製薬株式会社より提供）および天然型ヒトＩＦ
Ｎ−α（住友製薬株式会社より提供）は１０００Ｕ／ｍ
ｌ。
（塩野義製薬株式会社より提供）および天然型ヒトＩＦ
Ｎ−α（住友製薬株式会社より提供）は１０００Ｕ／ｍ
ｌ。
【００４５】組換えＩＬ−６（中外製薬株式会社より提
供）は１ｎｇ／ｍｌ。
供）は１ｎｇ／ｍｌ。
【００４６】なお、対照群は、サイトカインを加えない
２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添
加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。
２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添
加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。
【００４７】９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ
２を、上記サイトカイン存在下あるいは非存在下で湿潤
５％ＣＯ2中、３７℃で９６時間培養した。その培養終
了４時間前に、各穴に3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭ
Ｍ２が取り込んだ3Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シ
ンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレー
ト、ファルマシア社製）を用いた。
２を、上記サイトカイン存在下あるいは非存在下で湿潤
５％ＣＯ2中、３７℃で９６時間培養した。その培養終
了４時間前に、各穴に3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭ
Ｍ２が取り込んだ3Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シ
ンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレー
ト、ファルマシア社製）を用いた。
【００４８】ＫＰＭＭ２の増殖に対する各種サイトカイ
ンの効果を図５に示す。図５から明らかなように、ＫＰ
ＭＭ２細胞はＩＬ−６とともにインキュベートしたとき
のみに3Ｈ−チミジンの取り込みが顕著に刺激された。
濃度１ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ−６により、3Ｈ−チミ
ジンの取り込みが２．２倍に上昇した。一方、ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−γはＫＰＭＭ２細胞の増殖を顕著に阻
害した。
ンの効果を図５に示す。図５から明らかなように、ＫＰ
ＭＭ２細胞はＩＬ−６とともにインキュベートしたとき
のみに3Ｈ−チミジンの取り込みが顕著に刺激された。
濃度１ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ−６により、3Ｈ−チミ
ジンの取り込みが２．２倍に上昇した。一方、ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−γはＫＰＭＭ２細胞の増殖を顕著に阻
害した。
【００４９】また、ＫＰＭＭ２のサイトカインに対する
反応性を調べるために、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiaz
ol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法（J. I
mmun. Methods 65:55, 1983 を参照）および生細胞を直
接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
反応性を調べるために、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiaz
ol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法（J. I
mmun. Methods 65:55, 1983 を参照）および生細胞を直
接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５０】実施例７：抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗Ｉ
Ｌ−６Ｒ ｍＡｂによる増殖阻害 実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２に対するマウス抗
ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（Ｉｇ
Ｇ1クラス：ＰＭ１）およびマウス抗ＩＬ−６ｍＡｂ
（ＩｇＧ1クラス：ＳＫ２）の効果を調べた。ＳＫ２は
文献（Y. Ohe etal., Br. J. Cancer 67:939, 1993）に
記載されており、またＰＭ１は文献（Hirata et al.,
J. Immunol. 143:2900, 1989）に記載されている。
Ｌ−６Ｒ ｍＡｂによる増殖阻害 実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２に対するマウス抗
ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（Ｉｇ
Ｇ1クラス：ＰＭ１）およびマウス抗ＩＬ−６ｍＡｂ
（ＩｇＧ1クラス：ＳＫ２）の効果を調べた。ＳＫ２は
文献（Y. Ohe etal., Br. J. Cancer 67:939, 1993）に
記載されており、またＰＭ１は文献（Hirata et al.,
J. Immunol. 143:2900, 1989）に記載されている。
【００５１】実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２
を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを
含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００
μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０4
個／穴となるように分注した。
を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを
含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００
μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０4
個／穴となるように分注した。
【００５２】９６穴プレートの各穴には、各種濃度のＩ
Ｌ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＳＫ２）およ
び抗ＩＬ−６Ｒ（受容体）ｍＡｂ（ＰＭ１）を別々に加
えた。なお、対照群は、抗体を加えない２０％ＦＣＳお
よび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６
４０培養液とした。
Ｌ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＳＫ２）およ
び抗ＩＬ−６Ｒ（受容体）ｍＡｂ（ＰＭ１）を別々に加
えた。なお、対照群は、抗体を加えない２０％ＦＣＳお
よび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６
４０培養液とした。
【００５３】９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ
２を、抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ
存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ2中、３７℃で
９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に3
Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴
となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ3Ｈ−
チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンタ
ー（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を
用いた。
２を、抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ
存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ2中、３７℃で
９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に3
Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴
となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ3Ｈ−
チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンタ
ー（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を
用いた。
【００５４】ＫＰＭＭ２の増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍ
Ａｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を図６に示す。
ＳＫ２およびＰＭ１の添加はいずれも用量依存的に細胞
増殖を有意に阻害した。特に、ＰＭ１は１μｇ／ｍｌの
濃度でＫＰＭＭ２の増殖を完全に阻害した。
Ａｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を図６に示す。
ＳＫ２およびＰＭ１の添加はいずれも用量依存的に細胞
増殖を有意に阻害した。特に、ＰＭ１は１μｇ／ｍｌの
濃度でＫＰＭＭ２の増殖を完全に阻害した。
【００５５】また、ＫＰＭＭ２増殖の抗ＩＬ−６ ｍＡ
ｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂに対する効果を調べるた
めに、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dip
henyltetrazolium bromide）法（J. Immun. Methods 6
5:55, 1983 を参照）および生細胞を直接測定する方法
を用いたが、同様の結果が得られた。
ｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂに対する効果を調べるた
めに、ＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dip
henyltetrazolium bromide）法（J. Immun. Methods 6
5:55, 1983 を参照）および生細胞を直接測定する方法
を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５６】実施例８：ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６産生
の測定 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２によるＩＬ−
６産生能を試験した。
の測定 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２によるＩＬ−
６産生能を試験した。
【００５７】実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２
を、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０6個／ｍｌとなる
ように浮遊させ、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ
2中、３７℃で培養した。
を、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０6個／ｍｌとなる
ように浮遊させ、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ
2中、３７℃で培養した。
【００５８】培養７２時間後、培養上清中に含まれるＫ
ＰＭＭ２が産生したＩＬ−６の濃度を、ヒトＩＬ−６用
ＥＬＩＳＡキット（帝人バイオラボラトリー社製）を用
いて添付の処方に従い測定した。なお、陰性対照とし
て、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を用いた。培養上清
には７９．７±１９．６（平均値±Ｓ．Ｄ．）ｐｇ／ｍ
ｌのＩＬ−６の産生が検出され、対照培養液において検
出限界（４．０ｐｇ／ｍｌ）以下であったのに比較する
と、培養上清中のＩＬ−６濃度が顕著に増加しているこ
とが確認された。
ＰＭＭ２が産生したＩＬ−６の濃度を、ヒトＩＬ−６用
ＥＬＩＳＡキット（帝人バイオラボラトリー社製）を用
いて添付の処方に従い測定した。なお、陰性対照とし
て、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシン
を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を用いた。培養上清
には７９．７±１９．６（平均値±Ｓ．Ｄ．）ｐｇ／ｍ
ｌのＩＬ−６の産生が検出され、対照培養液において検
出限界（４．０ｐｇ／ｍｌ）以下であったのに比較する
と、培養上清中のＩＬ−６濃度が顕著に増加しているこ
とが確認された。
【００５９】実施例９：フローサイトメトリーによるＩ
Ｌ−６Ｒの発現の確認 ＫＰＭＭ２細胞上でのＩＬ−６Ｒ発現を確認するため
に、ＩＬ−６Ｒに結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結
合を阻害しないマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂである
ＭＴ１８抗体（Hirata et al., J. Immunol. 143:2900,
1989）を用いて、間接蛍光抗体法を実施した。
Ｌ−６Ｒの発現の確認 ＫＰＭＭ２細胞上でのＩＬ−６Ｒ発現を確認するため
に、ＩＬ−６Ｒに結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結
合を阻害しないマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂである
ＭＴ１８抗体（Hirata et al., J. Immunol. 143:2900,
1989）を用いて、間接蛍光抗体法を実施した。
【００６０】実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ
２細胞を１０6個／チューブとなるように、１００μｌ
の実施例２記載のＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、１０μｇ
／ｍｌのＭＴ１８抗体を加え、４℃にて３時間反応させ
た後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＦＡ
ＣＳ緩衝液に浮遊させ、さらに、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を５μｇ／ｍｌ添加
し、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２
回洗浄した後、同ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサ
イトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ、コールタ
ー社製）で蛍光を測定した。
２細胞を１０6個／チューブとなるように、１００μｌ
の実施例２記載のＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、１０μｇ
／ｍｌのＭＴ１８抗体を加え、４℃にて３時間反応させ
た後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＦＡ
ＣＳ緩衝液に浮遊させ、さらに、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を５μｇ／ｍｌ添加
し、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２
回洗浄した後、同ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサ
イトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ、コールタ
ー社製）で蛍光を測定した。
【００６１】その結果、図７に示すように、ＫＰＭＭ２
細胞上にＩＬ−６Ｒの発現が示された。
細胞上にＩＬ−６Ｒの発現が示された。
【００６２】実施例１０：ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ
（Ｍタンパク）産生の測定 ＫＰＭＭ２のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生能を試験し
た。
（Ｍタンパク）産生の測定 ＫＰＭＭ２のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生能を試験し
た。
【００６３】実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ
２を１０6個／ｍｌとなるように、２０％ＦＣＳおよび
１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０
培養液に浮遊させ、容量２ｍｌで１２穴プレート（ファ
ルコン社製）の各穴に分注し、ヒトＩＬ−６非存在下で
湿潤５％ＣＯ2中、３７℃で７２時間培養した。なお、
実験は３回行った。その後、培養上清中のヒトＩｇＧ濃
度を、ＴＡＧＯ社製ヤギ抗ＩｇＧ抗体（ＮＯ．４１０
０）およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ＩｇＧ
ガンマ鎖特異的抗体（ＮＯ．２４９０）を用いるＥＬＩ
ＳＡにて測定した。なお、スタンダードとしてカッペル
社製ヒトＩｇＧ（ＮＯ．０００１−８６０）を用いた。
その結果、培養上清中には１０．１μｇ／ｍｌのヒトＩ
ｇＧが検出され、対照培養液では検出限界以下（５ｎｇ
／ｍｌ）であったのに比較して、培養上清中のヒトＩｇ
Ｇ濃度が顕著に増加していることが確認された。
２を１０6個／ｍｌとなるように、２０％ＦＣＳおよび
１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０
培養液に浮遊させ、容量２ｍｌで１２穴プレート（ファ
ルコン社製）の各穴に分注し、ヒトＩＬ−６非存在下で
湿潤５％ＣＯ2中、３７℃で７２時間培養した。なお、
実験は３回行った。その後、培養上清中のヒトＩｇＧ濃
度を、ＴＡＧＯ社製ヤギ抗ＩｇＧ抗体（ＮＯ．４１０
０）およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ＩｇＧ
ガンマ鎖特異的抗体（ＮＯ．２４９０）を用いるＥＬＩ
ＳＡにて測定した。なお、スタンダードとしてカッペル
社製ヒトＩｇＧ（ＮＯ．０００１−８６０）を用いた。
その結果、培養上清中には１０．１μｇ／ｍｌのヒトＩ
ｇＧが検出され、対照培養液では検出限界以下（５ｎｇ
／ｍｌ）であったのに比較して、培養上清中のヒトＩｇ
Ｇ濃度が顕著に増加していることが確認された。
【００６４】実施例１１：ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメ
レースチェインリアクション）によるＩＬ−６およびＩ
Ｌ−６Ｒ ｍＲＮＡの検出 実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２におけるヒ
トＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの発現を確認するため
に、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアク
ション）法によりヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出した。
レースチェインリアクション）によるＩＬ−６およびＩ
Ｌ−６Ｒ ｍＲＮＡの検出 実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２におけるヒ
トＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの発現を確認するため
に、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアク
ション）法によりヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出した。
【００６５】グアニジウムセシウムクロライド法（Mole
cular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）によってＫＰＭＭ２細胞（１０8個）から全ＲＮＡを
調製した。陰性対照としてヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｓ
ＫＷ６．４からも同様に全ＲＮＡを調製した。１本鎖ｃ
ＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社製）を用いて、添付の処方に従い全ＲＮＡ５μｇか
ら直接実施した。
cular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）によってＫＰＭＭ２細胞（１０8個）から全ＲＮＡを
調製した。陰性対照としてヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｓ
ＫＷ６．４からも同様に全ＲＮＡを調製した。１本鎖ｃ
ＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社製）を用いて、添付の処方に従い全ＲＮＡ５μｇか
ら直接実施した。
【００６６】陽性対照としてヒトＩＬ−６およびヒトＩ
Ｌ−６Ｒ検出用ＰＣＲプライマーを用いた（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ Ｉｎｃ．社製）。ＰＣＲ溶液各１００μｌは、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
塩化カリウム、Ａｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）２．５ユニット、１本鎖ｃ
ＤＮＡ合成反応物１μｌ、各プライマー１００ｐｍｏｌ
を含む。各ＰＣＲ用チューブに鉱物オイル５０μｌを上
層してＰＣＲに付した。最初に９４℃で１分メルトし、
６０℃で１分と７２℃で１０分のサイクルを３０サイク
ル繰り返した。最終サイクルの後、最終的に７２℃で１
０分伸長を行った。ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ
検出用プライマーを用いた陽性対照群も同様に増幅し、
約５０ｐｇの陽性対照ＰＣＲ産物を得た。
Ｌ−６Ｒ検出用ＰＣＲプライマーを用いた（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ Ｉｎｃ．社製）。ＰＣＲ溶液各１００μｌは、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
塩化カリウム、Ａｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）２．５ユニット、１本鎖ｃ
ＤＮＡ合成反応物１μｌ、各プライマー１００ｐｍｏｌ
を含む。各ＰＣＲ用チューブに鉱物オイル５０μｌを上
層してＰＣＲに付した。最初に９４℃で１分メルトし、
６０℃で１分と７２℃で１０分のサイクルを３０サイク
ル繰り返した。最終サイクルの後、最終的に７２℃で１
０分伸長を行った。ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ
検出用プライマーを用いた陽性対照群も同様に増幅し、
約５０ｐｇの陽性対照ＰＣＲ産物を得た。
【００６７】各反応チューブから１０μｌを取って１．
５％アガロースゲル上で電気泳動を行った。図８に示す
ように、ＩＬ−６（６２８ｂｐ）およびＩＬ−６Ｒ（２
５１ｂｐ）のＰＣＲ産物はいずれもＫＰＭＭ２のＲＮＡ
から増幅された。これらの結果は、ＫＰＭＭ２がＩＬ−
６のオートクライン機構によって増殖することを遺伝子
発現の面から支持する。一方、ＳＫＷ６．４細胞はＩＬ
−６に応答してＩｇＭを分泌する。ＩＬ−６ＲのＰＣＲ
産物はＳＫＷ６．４ ｍＲＮＡから増幅された。しか
し、ＩＬ−６のＰＣＲ産物はこの実験で検出されず、こ
のことはＳＫＷ６．４細胞がＩＬ−６を産生していない
ことを示唆する。
５％アガロースゲル上で電気泳動を行った。図８に示す
ように、ＩＬ−６（６２８ｂｐ）およびＩＬ−６Ｒ（２
５１ｂｐ）のＰＣＲ産物はいずれもＫＰＭＭ２のＲＮＡ
から増幅された。これらの結果は、ＫＰＭＭ２がＩＬ−
６のオートクライン機構によって増殖することを遺伝子
発現の面から支持する。一方、ＳＫＷ６．４細胞はＩＬ
−６に応答してＩｇＭを分泌する。ＩＬ−６ＲのＰＣＲ
産物はＳＫＷ６．４ ｍＲＮＡから増幅された。しか
し、ＩＬ−６のＰＣＲ産物はこの実験で検出されず、こ
のことはＳＫＷ６．４細胞がＩＬ−６を産生していない
ことを示唆する。
【００６８】実施例１２：細胞株ＫＰＭＭ２のＳＣＩＤ
マウスおよびヌードマウスへの移植 （１）ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の可移植性お
よびインビボでの継代を以下のように検討した。
マウスおよびヌードマウスへの移植 （１）ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代 上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の可移植性お
よびインビボでの継代を以下のように検討した。
【００６９】ＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μ
ｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に
１０8個／ｍｌで懸濁し、０．２ｍｇのウサギ抗アシア
ロＧＭ１抗体（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．０１４−０９８０１、
和光純薬工業社製）で処理したＩＬ−６トランスジェニ
ック重症免疫不全マウス（以下ＩＬ−６−ＳＣＩＤＴｍ
という）（中外製薬製）の腹部皮下に注射針で０．１ｍ
ｌ移植した。その結果、１カ月後には３例全例で移植部
位に結節型の腫瘍を形成した。
ｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に
１０8個／ｍｌで懸濁し、０．２ｍｇのウサギ抗アシア
ロＧＭ１抗体（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．０１４−０９８０１、
和光純薬工業社製）で処理したＩＬ−６トランスジェニ
ック重症免疫不全マウス（以下ＩＬ−６−ＳＣＩＤＴｍ
という）（中外製薬製）の腹部皮下に注射針で０．１ｍ
ｌ移植した。その結果、１カ月後には３例全例で移植部
位に結節型の腫瘍を形成した。
【００７０】この腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍
塊を使い捨て注射器のピストンなどでつぶし、ナイロン
メッシュ（７０μｍ、ファルコン社製）を通して細胞を
回収した。この細胞を上記と同様にＲＰＭＩ１６４０培
養液に懸濁し、ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、重症免疫不
全マウス（ＳＣＩＤマウスという）（日本クレア社
製）、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（以下ヌードマ
ウスという）（日本クレア社製）に皮下移植したとこ
ろ、同じように移植部位に結節型の腫瘍を形成し、イン
ビボでの継代が可能であった。また腫瘍塊を３ｍｍ角の
ブロックにし、移植針を用いてＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔ
ｍ、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスの皮下に移植しても
継代可能であった。 （２）ＫＰＭＭ２の異なる移植経路での可移植性 ＫＰＭＭ２の移植経路を皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内
（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）とした場合の可移植
性を以下のように検討した。
塊を使い捨て注射器のピストンなどでつぶし、ナイロン
メッシュ（７０μｍ、ファルコン社製）を通して細胞を
回収した。この細胞を上記と同様にＲＰＭＩ１６４０培
養液に懸濁し、ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、重症免疫不
全マウス（ＳＣＩＤマウスという）（日本クレア社
製）、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（以下ヌードマ
ウスという）（日本クレア社製）に皮下移植したとこ
ろ、同じように移植部位に結節型の腫瘍を形成し、イン
ビボでの継代が可能であった。また腫瘍塊を３ｍｍ角の
ブロックにし、移植針を用いてＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔ
ｍ、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスの皮下に移植しても
継代可能であった。 （２）ＫＰＭＭ２の異なる移植経路での可移植性 ＫＰＭＭ２の移植経路を皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内
（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）とした場合の可移植
性を以下のように検討した。
【００７１】（１）においてＳＣＩＤマウスにて継代し
たＫＰＭＭ２腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を
使い捨て注射器のピストンでつぶし、ナイロンメッシュ
を通して細胞を回収し、１０8個／ｍｌの細胞懸濁液を
作成した。この懸濁液をＳＣＩＤマウス、あるいは０．
２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体および５００Ｒの
Ｘ線で処理したヌードマウスに０．１ｍｌずつ皮下
（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．
ｐ．）の３経路で移植し、４０日後に生着の判定を行っ
た（表２）。その結果、約４０日後には全例で生着が確
認され、ｓ．ｃ．移植では移植部位に、ｉ．ｐ．移植で
は腹腔内に固形腫瘍を形成した。また、ｉ．ｖ．移植で
はＫＰＭＭ２は骨髄での生着が認められた。
たＫＰＭＭ２腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を
使い捨て注射器のピストンでつぶし、ナイロンメッシュ
を通して細胞を回収し、１０8個／ｍｌの細胞懸濁液を
作成した。この懸濁液をＳＣＩＤマウス、あるいは０．
２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体および５００Ｒの
Ｘ線で処理したヌードマウスに０．１ｍｌずつ皮下
（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．
ｐ．）の３経路で移植し、４０日後に生着の判定を行っ
た（表２）。その結果、約４０日後には全例で生着が確
認され、ｓ．ｃ．移植では移植部位に、ｉ．ｐ．移植で
は腹腔内に固形腫瘍を形成した。また、ｉ．ｖ．移植で
はＫＰＭＭ２は骨髄での生着が認められた。
【００７２】
【表２】 （３）ＫＰＭＭ２移植動物の血清ヒトＩｇＧ（Ｍタンパ
ク：ミエローマタンパク）の濃度 細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、形成
された腫瘍の体積と血清中ヒトＩｇＧ濃度の相関を調べ
た。上記（２）に記載の方法で細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣ
ＩＤマウスへ皮下移植し、ＫＰＭＭ２移植前、移植後２
１日目、４２日目の３回、血清サンプルを採取してＥＬ
ＩＳＡ法にてヒトＩｇＧ濃度を測定した。
ク：ミエローマタンパク）の濃度 細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、形成
された腫瘍の体積と血清中ヒトＩｇＧ濃度の相関を調べ
た。上記（２）に記載の方法で細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣ
ＩＤマウスへ皮下移植し、ＫＰＭＭ２移植前、移植後２
１日目、４２日目の３回、血清サンプルを採取してＥＬ
ＩＳＡ法にてヒトＩｇＧ濃度を測定した。
【００７３】その結果、マウス血清中のヒトＩｇＧ濃度
はＫＰＭＭ２を移植した動物ではいずれも経時的に上昇
した。また図９に示すように、皮下移植した動物では皮
下に形成された腫瘍の体積と血清ヒトＩｇＧ濃度に相関
が見られ、腫瘍の大きな動物ほど血清ヒトＩｇＧ濃度は
高値を示した。このことから、血清ヒトＩｇＧ濃度を指
標としても抗腫瘍効果の判定ができると考えられた。 （４）ＫＰＭＭ２の可移植性および移植細胞数の検討 ＳＣＩＤマウスとヌードマウスで移植細胞数を変えたと
きのＫＰＭＭ２の可移植性を検討した。
はＫＰＭＭ２を移植した動物ではいずれも経時的に上昇
した。また図９に示すように、皮下移植した動物では皮
下に形成された腫瘍の体積と血清ヒトＩｇＧ濃度に相関
が見られ、腫瘍の大きな動物ほど血清ヒトＩｇＧ濃度は
高値を示した。このことから、血清ヒトＩｇＧ濃度を指
標としても抗腫瘍効果の判定ができると考えられた。 （４）ＫＰＭＭ２の可移植性および移植細胞数の検討 ＳＣＩＤマウスとヌードマウスで移植細胞数を変えたと
きのＫＰＭＭ２の可移植性を検討した。
【００７４】特別な前処理を行わない雄のＳＣＩＤマウ
スおよびヌードマウスに、上記（２）記載の方法で各々
ＫＰＭＭ２細胞を１０7、３×１０6、１０6個腹部皮下
（ｓ．ｃ．）に移植し、またＳＣＩＤマウスには上記
（２）の方法で得たＫＰＭＭ２細胞を３×１０6、１０6
個静脈内（ｉ．ｖ．）でも移植した。
スおよびヌードマウスに、上記（２）記載の方法で各々
ＫＰＭＭ２細胞を１０7、３×１０6、１０6個腹部皮下
（ｓ．ｃ．）に移植し、またＳＣＩＤマウスには上記
（２）の方法で得たＫＰＭＭ２細胞を３×１０6、１０6
個静脈内（ｉ．ｖ．）でも移植した。
【００７５】その結果、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した
場合、３×１０6個以上移植すると、２１日までに全例
で腫瘍結節を形成し、１０6個移植した場合でも２１日
までに２／３、３２日までに全例で腫瘍結節を形成し
た。ヌードマウスに皮下移植すると、１０7個移植した
場合では２１日までに２／３、３２日までには全例で、
また３×１０6個移植した場合では４２日までには全例
で腫瘍結節が形成された。しかし、１０6個の移植では
４２日までに腫瘍の生着は見られなかった。また、ＳＣ
ＩＤマウスに静脈内移植した場合、４２日までに３×１
０6個移植で全例、１０6個移植で１／３にＫＰＭＭ２が
生着した。これらの結果を以下の表３にまとめて示す。
場合、３×１０6個以上移植すると、２１日までに全例
で腫瘍結節を形成し、１０6個移植した場合でも２１日
までに２／３、３２日までに全例で腫瘍結節を形成し
た。ヌードマウスに皮下移植すると、１０7個移植した
場合では２１日までに２／３、３２日までには全例で、
また３×１０6個移植した場合では４２日までには全例
で腫瘍結節が形成された。しかし、１０6個の移植では
４２日までに腫瘍の生着は見られなかった。また、ＳＣ
ＩＤマウスに静脈内移植した場合、４２日までに３×１
０6個移植で全例、１０6個移植で１／３にＫＰＭＭ２が
生着した。これらの結果を以下の表３にまとめて示す。
【００７６】
【表３】 （５）ＫＰＭＭ２移植ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣＤ
３８抗原の発現の解析 ＫＰＭＭ２を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、その生
着を確認するために、ＫＰＭＭ２の細胞表面上で特徴的
に発現している表面抗原であるヒトＣＤ３８抗原の発現
を試験した。
３８抗原の発現の解析 ＫＰＭＭ２を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、その生
着を確認するために、ＫＰＭＭ２の細胞表面上で特徴的
に発現している表面抗原であるヒトＣＤ３８抗原の発現
を試験した。
【００７７】ＫＰＭＭ２を上記（１）に記載する方法で
ＳＣＩＤマウスへ静脈内移植し、移植後３７日目にマウ
スを屠殺した。屠殺したマウスの大腿骨より骨髄を回収
して懸濁し、ステンレスメッシュ（１００μｍ）を通
し、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２
％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（−）溶
液）にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。なお、陰性対照
としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨
髄からも同様の方法にて骨髄細胞浮遊液を調製した。
ＳＣＩＤマウスへ静脈内移植し、移植後３７日目にマウ
スを屠殺した。屠殺したマウスの大腿骨より骨髄を回収
して懸濁し、ステンレスメッシュ（１００μｍ）を通
し、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２
％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（−）溶
液）にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。なお、陰性対照
としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨
髄からも同様の方法にて骨髄細胞浮遊液を調製した。
【００７８】また、本実施例に記載する方法によりＫＰ
ＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスからは、移植後３
７日目に皮下腫瘍塊を外科的に摘出し、摘出した腫瘍塊
を２枚のスライドグラスの間にはさんですりつぶし、こ
れをステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、ＦＡＣ
Ｓ緩衝液にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。
ＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスからは、移植後３
７日目に皮下腫瘍塊を外科的に摘出し、摘出した腫瘍塊
を２枚のスライドグラスの間にはさんですりつぶし、こ
れをステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、ＦＡＣ
Ｓ緩衝液にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。
【００７９】陽性対照として、実施例１に記載した方法
でインビトロにて培養したＫＰＭＭ２を用いた。インビ
トロで４日間培養したＫＰＭＭ２をＦＡＣＳ緩衝液で洗
浄した後、同緩衝液中に浮遊させた。
でインビトロにて培養したＫＰＭＭ２を用いた。インビ
トロで４日間培養したＫＰＭＭ２をＦＡＣＳ緩衝液で洗
浄した後、同緩衝液中に浮遊させた。
【００８０】次に、このように調製した細胞浮遊液を用
いて、ＦＡＣＳ解析によるヒトＣＤ３８抗原の発現を調
べた。
いて、ＦＡＣＳ解析によるヒトＣＤ３８抗原の発現を調
べた。
【００８１】すなわち、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中
にて、各群の浮遊細胞１０6個に対し、２．５μｇ／ｍ
ｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３８抗体
（Ｌｅｕ−１７、ベクトン・ディッキンソン社製）を添
加し、氷上で３０分間反応させた。次いで、１ｍｌのＦ
ＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝
液で懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソ
ン社製）によりＦＡＣＳ解析を行った。
にて、各群の浮遊細胞１０6個に対し、２．５μｇ／ｍ
ｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３８抗体
（Ｌｅｕ−１７、ベクトン・ディッキンソン社製）を添
加し、氷上で３０分間反応させた。次いで、１ｍｌのＦ
ＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝
液で懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソ
ン社製）によりＦＡＣＳ解析を行った。
【００８２】陽性対照群であるインビトロ培養ＫＰＭＭ
２のＦＡＣＳ解析の結果から、蛍光強度４０から２００
０までの範囲にある細胞をヒトＣＤ３８抗原発現細胞と
した（図１０（ａ）参照）。ＫＰＭＭ２を静脈内移植し
たＳＣＩＤマウスでは、その骨髄細胞のおよそ７１％が
ヒトＣＤ３８陽性細胞で占められていた（図１０（ｂ）
参照）。このことは、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した
ＫＰＭＭ２がＳＣＩＤマウスの骨髄に生着したことを示
している。また、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスに皮下移
植して生じた腫瘍塊から得られた細胞は全てヒトＣＤ３
８が陽性であり（図１０（ｃ）参照）、ＫＰＭＭ２を皮
下移植して生ずる腫瘍塊は、全てＫＰＭＭ２から構成さ
れていることが示された。なお、ＫＰＭＭ２を移植して
いない陰性対照群のＳＣＩＤマウスの骨髄細胞にはヒト
ＣＤ３８陽性細胞は全く検出されなかった（図１０
（ｄ）参照）。
２のＦＡＣＳ解析の結果から、蛍光強度４０から２００
０までの範囲にある細胞をヒトＣＤ３８抗原発現細胞と
した（図１０（ａ）参照）。ＫＰＭＭ２を静脈内移植し
たＳＣＩＤマウスでは、その骨髄細胞のおよそ７１％が
ヒトＣＤ３８陽性細胞で占められていた（図１０（ｂ）
参照）。このことは、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した
ＫＰＭＭ２がＳＣＩＤマウスの骨髄に生着したことを示
している。また、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスに皮下移
植して生じた腫瘍塊から得られた細胞は全てヒトＣＤ３
８が陽性であり（図１０（ｃ）参照）、ＫＰＭＭ２を皮
下移植して生ずる腫瘍塊は、全てＫＰＭＭ２から構成さ
れていることが示された。なお、ＫＰＭＭ２を移植して
いない陰性対照群のＳＣＩＤマウスの骨髄細胞にはヒト
ＣＤ３８陽性細胞は全く検出されなかった（図１０
（ｄ）参照）。
【００８３】実施例１３：抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２お
よび抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１の抗腫
瘍効果 ＫＰＭＭ２移植動物における抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２
および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１のイ
ンビボ抗腫瘍効果を以下のようにして検討した。
よび抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１の抗腫
瘍効果 ＫＰＭＭ２移植動物における抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２
および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１のイ
ンビボ抗腫瘍効果を以下のようにして検討した。
【００８４】上記実施例１２（１）に記載の方法でＳＣ
ＩＤマウスで継代して得たＫＰＭＭ２骨髄腫腫瘍塊をウ
サギ抗アシアロＧＭ１抗体／Ｘ線処理ヌードマウス（５
週齢、雄）に４ｍｍ角ブロックで皮下移植し、翌日に１
回だけＳＫ２抗体を１ｍｇ／マウスの１用量、再構成ヒ
ト型化ＰＭ１抗体（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９
参照）を０．１２５、０．５および１ｍｇ／マウスの３
用量で静脈内投与した。各抗体は０．２ｍｌ／マウスと
なるようにＰＢＳ（−）（ニッスイ製）で調製し、陰性
対照群には、ＰＢＳ（−）を０．２ｍｌ／マウス投与し
た。その後腫瘍の大きさを経時的に観察し、対照群の腫
瘍が十分大きくなった３５日目に全採血を行ってから腫
瘍を摘出して重量を測定した。
ＩＤマウスで継代して得たＫＰＭＭ２骨髄腫腫瘍塊をウ
サギ抗アシアロＧＭ１抗体／Ｘ線処理ヌードマウス（５
週齢、雄）に４ｍｍ角ブロックで皮下移植し、翌日に１
回だけＳＫ２抗体を１ｍｇ／マウスの１用量、再構成ヒ
ト型化ＰＭ１抗体（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９
参照）を０．１２５、０．５および１ｍｇ／マウスの３
用量で静脈内投与した。各抗体は０．２ｍｌ／マウスと
なるようにＰＢＳ（−）（ニッスイ製）で調製し、陰性
対照群には、ＰＢＳ（−）を０．２ｍｌ／マウス投与し
た。その後腫瘍の大きさを経時的に観察し、対照群の腫
瘍が十分大きくなった３５日目に全採血を行ってから腫
瘍を摘出して重量を測定した。
【００８５】その結果を図１１に示す。陰性対照群の平
均腫瘍重量が約１ｇであったのに対し、再構成ヒト型化
ＰＭ１抗体投与群においては、１ｍｇ／マウス投与した
場合で腫瘍増殖抑制率（Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｙ Ｒａｔｉｏ：ＧＩＲ）は７８％、０．５ｍｇ／
マウス投与した場合でのＧＩＲは５３％、０．１２５ｍ
ｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは６６％を示し、強
い腫瘍増殖抑制効果が見られた。またＳＫ２において
も、１ｍｇ／マウス投与群でＧＩＲ６１％と腫瘍増殖を
抑制した。
均腫瘍重量が約１ｇであったのに対し、再構成ヒト型化
ＰＭ１抗体投与群においては、１ｍｇ／マウス投与した
場合で腫瘍増殖抑制率（Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｙ Ｒａｔｉｏ：ＧＩＲ）は７８％、０．５ｍｇ／
マウス投与した場合でのＧＩＲは５３％、０．１２５ｍ
ｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは６６％を示し、強
い腫瘍増殖抑制効果が見られた。またＳＫ２において
も、１ｍｇ／マウス投与群でＧＩＲ６１％と腫瘍増殖を
抑制した。
【００８６】さらに、腫瘍摘出時に採取した血清サンプ
ルのヒトＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その
結果を図１２に示す。抗体非投与陰性対照群では血清ヒ
トＩｇＧ濃度が平均２７．６ｍｇ／ｍｌであったもの
が、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体を１、０．５、０．１２
５ｍｇ／マウス投与することでそれぞれ７１％、５５
％、７５％抑制された、ＳＫ２ １ｍｇ／マウス投与で
も４３％抑制された。腫瘍重量と血清ヒトＩｇＧ濃度は
各処理群間でも、個体レベルでもよく相関していた。
ルのヒトＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その
結果を図１２に示す。抗体非投与陰性対照群では血清ヒ
トＩｇＧ濃度が平均２７．６ｍｇ／ｍｌであったもの
が、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体を１、０．５、０．１２
５ｍｇ／マウス投与することでそれぞれ７１％、５５
％、７５％抑制された、ＳＫ２ １ｍｇ／マウス投与で
も４３％抑制された。腫瘍重量と血清ヒトＩｇＧ濃度は
各処理群間でも、個体レベルでもよく相関していた。
【００８７】実施例１４：ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩ
Ｄマウスにおけるイオン化カルシウム濃度の上昇および
骨吸収の亢進 ＫＰＭＭ２（１０7個）を上記実施例１２（２）に記載
する方法でＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）へ静脈内
移植し、移植後経時的に血中イオン化カルシウム濃度お
よび骨吸収の有無を試験した。
Ｄマウスにおけるイオン化カルシウム濃度の上昇および
骨吸収の亢進 ＫＰＭＭ２（１０7個）を上記実施例１２（２）に記載
する方法でＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）へ静脈内
移植し、移植後経時的に血中イオン化カルシウム濃度お
よび骨吸収の有無を試験した。
【００８８】ＫＰＭＭ２移植後９日目、２０日目、３０
日目および３７日目にＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマ
ウスをエーテル麻酔し、マウス眼窩より６０μｌ容量の
キャピラリーカラム（チバ・コーニング社製）で採血
し、直ちに血中イオン化カルシウム濃度を６３４自動Ｃ
ａ++／ｐＨアナライザー（チバ・コーニング社製）にて
測定した。なお、対照としてＫＰＭＭ２を移植していな
いＳＣＩＤマウスからも同様の方法で採血し、血中イオ
ン化カルシウム濃度を測定した。
日目および３７日目にＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマ
ウスをエーテル麻酔し、マウス眼窩より６０μｌ容量の
キャピラリーカラム（チバ・コーニング社製）で採血
し、直ちに血中イオン化カルシウム濃度を６３４自動Ｃ
ａ++／ｐＨアナライザー（チバ・コーニング社製）にて
測定した。なお、対照としてＫＰＭＭ２を移植していな
いＳＣＩＤマウスからも同様の方法で採血し、血中イオ
ン化カルシウム濃度を測定した。
【００８９】その結果、ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤ
マウスの血中イオン化カルシウム濃度は、移植後３０日
目より上昇がみられ、３７日目には対照群のマウスに比
べ、約２０％の血中イオン化カルシウム濃度上昇が観察
された（図１３）。なお、血中イオン化カルシウム濃度
上昇は、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ静脈内移植した
ときの、マウス骨髄におけるＫＰＭＭ２（ヒトＣＤ３８
抗原陽性細胞）が占める増加の割合の経時的増加とよく
相関していた（図１４参照）。
マウスの血中イオン化カルシウム濃度は、移植後３０日
目より上昇がみられ、３７日目には対照群のマウスに比
べ、約２０％の血中イオン化カルシウム濃度上昇が観察
された（図１３）。なお、血中イオン化カルシウム濃度
上昇は、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ静脈内移植した
ときの、マウス骨髄におけるＫＰＭＭ２（ヒトＣＤ３８
抗原陽性細胞）が占める増加の割合の経時的増加とよく
相関していた（図１４参照）。
【００９０】また、ＫＰＭＭ２静脈内移植３７日目のＳ
ＣＩＤマウス下肢の骨をＸ線撮影して形態的に観察した
ところ、対照群のマウスと比較し、顕著な骨吸収像が確
認された（図１５参照）。以上の結果は、ＫＰＭＭ２静
脈内移植ＳＣＩＤマウスの骨病変が、実際の骨髄腫の病
変とよく一致していることを示している。
ＣＩＤマウス下肢の骨をＸ線撮影して形態的に観察した
ところ、対照群のマウスと比較し、顕著な骨吸収像が確
認された（図１５参照）。以上の結果は、ＫＰＭＭ２静
脈内移植ＳＣＩＤマウスの骨病変が、実際の骨髄腫の病
変とよく一致していることを示している。
【００９１】
【発明の効果】本発明によってＩＬ−６オートクライン
依存性で増殖する骨髄腫が存在することが明らかとなっ
た。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性
で増殖するヒト骨髄腫細胞株は、骨髄腫のＩＬ−６依存
性増殖機構モデルとして有用である。また抗ＩＬ−６抗
体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤を
はじめとする骨髄腫治療剤の治療モデルとしても使用し
得るものである。本発明のオートクライン機構によりＩ
Ｌ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株はインビトロ
およびインビボで細胞増殖抑制を指標とした骨髄腫治療
剤の評価系を作成するのに有用であるのはもちろん、Ｍ
タンパクを産生し、この産生量が骨髄腫の増殖に極めて
よく相関することから、Ｍタンパク産生量の抑制を指標
とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用であ
る。
依存性で増殖する骨髄腫が存在することが明らかとなっ
た。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性
で増殖するヒト骨髄腫細胞株は、骨髄腫のＩＬ−６依存
性増殖機構モデルとして有用である。また抗ＩＬ−６抗
体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤を
はじめとする骨髄腫治療剤の治療モデルとしても使用し
得るものである。本発明のオートクライン機構によりＩ
Ｌ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株はインビトロ
およびインビボで細胞増殖抑制を指標とした骨髄腫治療
剤の評価系を作成するのに有用であるのはもちろん、Ｍ
タンパクを産生し、この産生量が骨髄腫の増殖に極めて
よく相関することから、Ｍタンパク産生量の抑制を指標
とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用であ
る。
【００９２】さらに、本発明のヒト骨髄腫細胞株を実験
動物に静脈内移植して得られる骨髄腫の骨髄生着モデル
では、多発性骨髄腫の増殖に伴い骨髄腫に特徴的な骨病
変が観察され、したがってこの骨病変の抑制を指標とし
た骨髄腫治療剤の評価系を作成することができる。
動物に静脈内移植して得られる骨髄腫の骨髄生着モデル
では、多発性骨髄腫の増殖に伴い骨髄腫に特徴的な骨病
変が観察され、したがってこの骨病変の抑制を指標とし
た骨髄腫治療剤の評価系を作成することができる。
【００９３】これらの点から本発明のヒト骨髄腫細胞株
の利用価値は極めて大きい。
の利用価値は極めて大きい。
【図１】液体培養におけるＫＰＭＭ２の自律的凝集を示
す図（生物の形態を表す写真）である。
す図（生物の形態を表す写真）である。
【図２】ＫＰＭＭ２の形態を示す図（生物の形態を表す
写真）である。ライト−ギムザ染色では形質細胞の特徴
を有する。
写真）である。ライト−ギムザ染色では形質細胞の特徴
を有する。
【図３】サザンブロット分析によるＫＰＭＭ２のＪHお
よびＣλ遺伝子の再構成を示す図（電気泳動の写真）で
ある。ＫＰＭＭ２から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＪHおよびＣλ遺伝子
プローブを用いてサザンブロット分析を行った。再構成
したバンドを（▲）で示す。
よびＣλ遺伝子の再構成を示す図（電気泳動の写真）で
ある。ＫＰＭＭ２から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＪHおよびＣλ遺伝子
プローブを用いてサザンブロット分析を行った。再構成
したバンドを（▲）で示す。
【図４】ＫＰＭＭ２の核型を示す図（生物の形質を表す
写真）である。検索した１５細胞はすべて４６、ＸＸ、
ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１
４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１
２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１
３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を
示した。
写真）である。検索した１５細胞はすべて４６、ＸＸ、
ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１
４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１
２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１
３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を
示した。
【図５】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する各種サイトカイ
ンの効果を示す図である。使用したサイトカインの濃度
は以下の通りである：ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮ
−αおよびＩＦＮ−γ、１０００Ｕ／ｍｌ；その他のサ
イトカイン、１００ｎｇ／ｍｌ。各数値は３回の試験の
平均＋標準偏差（ＳＤ）を表す。
ンの効果を示す図である。使用したサイトカインの濃度
は以下の通りである：ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮ
−αおよびＩＦＮ−γ、１０００Ｕ／ｍｌ；その他のサ
イトカイン、１００ｎｇ／ｍｌ。各数値は３回の試験の
平均＋標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍ
Ａｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図であ
る。ＳＫ２はマウス抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（▲）；ＰＭ１
はマウス抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（●）。破線は対照を示
す。各数値は３回の試験の平均を表す。
Ａｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図であ
る。ＳＫ２はマウス抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（▲）；ＰＭ１
はマウス抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（●）。破線は対照を示
す。各数値は３回の試験の平均を表す。
【図７】ＫＰＭＭ２細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現を示
す図である。細胞は抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（ＭＴ１８）
で染色した。マウスＩｇＧ２ｂ抗体を対照として用い
た。破線はｍＩｇＧ２ｂを、実線はＭＴ１８を表す。
す図である。細胞は抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（ＭＴ１８）
で染色した。マウスＩｇＧ２ｂ抗体を対照として用い
た。破線はｍＩｇＧ２ｂを、実線はＭＴ１８を表す。
【図８】１．５％アガロースゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ
（逆転写ＰＣＲ）分析により、ＫＰＭＭ２のＩＬ−６お
よびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの発現を示す図（電気泳動の
写真）である。レーン１および４、ＳＫＷ６．４；レー
ン２および５、ＫＰＭＭ２；レーン３および６、陽性対
照。
（逆転写ＰＣＲ）分析により、ＫＰＭＭ２のＩＬ−６お
よびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの発現を示す図（電気泳動の
写真）である。レーン１および４、ＳＫＷ６．４；レー
ン２および５、ＫＰＭＭ２；レーン３および６、陽性対
照。
【図９】ＫＰＭＭ２を皮下移植したマウスにおける腫瘍
体積と血清ヒトＩｇＧ濃度の相関を示す図である。
体積と血清ヒトＩｇＧ濃度の相関を示す図である。
【図１０】（ａ）はインビトロ培養したＫＰＭＭ２にお
けるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。
ＫＰＭＭ２は４０から２０００までの範囲の蛍光強度を
有する。（ｂ）はＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤ
マウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ
解析を示す図である。７１％の細胞が４０から２０００
の範囲の蛍光強度を有する。（ｃ）はＫＰＭＭ２を皮下
移植したＳＣＩＤマウスの腫瘍塊から得た細胞における
ヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。全て
の細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｄ）はＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの
骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示
す図である。４０から２０００の範囲の蛍光強度を有す
る細胞は全くみられない。
けるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。
ＫＰＭＭ２は４０から２０００までの範囲の蛍光強度を
有する。（ｂ）はＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤ
マウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ
解析を示す図である。７１％の細胞が４０から２０００
の範囲の蛍光強度を有する。（ｃ）はＫＰＭＭ２を皮下
移植したＳＣＩＤマウスの腫瘍塊から得た細胞における
ヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。全て
の細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｄ）はＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの
骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示
す図である。４０から２０００の範囲の蛍光強度を有す
る細胞は全くみられない。
【図１１】ＫＰＭＭ２に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよ
び抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂのインビボにおける腫瘍増殖抑
制効果を示す図である。ＳＫ２は抗ヒトＩＬ−６ ｍＡ
ｂ；再構成ヒト型化ＰＭ１は抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡ
ｂ。
び抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂのインビボにおける腫瘍増殖抑
制効果を示す図である。ＳＫ２は抗ヒトＩＬ−６ ｍＡ
ｂ；再構成ヒト型化ＰＭ１は抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡ
ｂ。
【図１２】ＫＰＭＭ２移植ヌードマウス中の血清ヒトＩ
ｇＧ濃度に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−６
Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。
ｇＧ濃度に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−６
Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。
【図１３】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウス
の血中イオン化カルシウム濃度（□）の経時的変化を示
す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマ
ウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示
す。
の血中イオン化カルシウム濃度（□）の経時的変化を示
す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマ
ウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示
す。
【図１４】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウス
の骨髄中のヒトＣＤ３８抗原陽性細胞の割合（□）の経
時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値
はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±
Ｓ．Ｄ．を示す。
の骨髄中のヒトＣＤ３８抗原陽性細胞の割合（□）の経
時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値
はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±
Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１５】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウス
の骨のＸ線撮影像を示す図（生物の形態を示す写真）で
ある。（ａ）はＫＰＭＭ２を移植していない対照群のＳ
ＣＩＤマウス （ｂ）はＫＰＭＭ２移植後３７日目のＳＣＩＤマウス
の骨のＸ線撮影像を示す図（生物の形態を示す写真）で
ある。（ａ）はＫＰＭＭ２を移植していない対照群のＳ
ＣＩＤマウス （ｂ）はＫＰＭＭ２移植後３７日目のＳＣＩＤマウス
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 (72)発明者 恒成 利明 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社富士御殿場研究所
Claims (16)
- 【請求項１】 オートクライン機構によりＩＬ−６依存
性で増殖するヒト骨髄腫細胞株。 - 【請求項２】 ヒト骨髄腫がヒト多発性骨髄腫である請
求項１に記載の細胞株。 - 【請求項３】 ＫＰＭＭ２（生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センター、受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１
７０）である請求項１に記載の細胞株。 - 【請求項４】 請求項１に記載の細胞株を移植した実験
動物。 - 【請求項５】 実験動物が免疫不全状態である請求項４
に記載の実験動物。 - 【請求項６】 実験動物がマウスである請求項４に記載
の実験動物。 - 【請求項７】 実験動物にオートクライン機構によりＩ
Ｌ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を静脈内移植
して得られる請求項４に記載の実験動物。 - 【請求項８】 実験動物にオートクライン機構によりＩ
Ｌ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を皮下移植し
て得られる請求項４に記載の実験動物。 - 【請求項９】 実験動物にオートクライン機構によりＩ
Ｌ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を腹腔内移植
して得られる請求項４に記載の実験動物。 - 【請求項１０】 骨髄腫治療剤を請求項１に記載の細胞
株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからな
る骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法。 - 【請求項１１】 骨髄腫細胞増殖抑制試験をＭタンパク
分泌抑制を指標として行うことからなる請求項１０に記
載のインビトロスクリーニング法。 - 【請求項１２】 骨髄腫治療剤がＩＬ−６活性阻害剤で
ある請求項１０に記載のインビトロスクリーニング法。 - 【請求項１３】 骨髄腫治療剤を請求項４に記載の実験
動物に移植して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することから
なる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。 - 【請求項１４】 骨髄腫細胞増殖抑制試験をＭタンパク
分泌抑制を指標として行うことからなる請求項１３に記
載のインビボスクリーニング法。 - 【請求項１５】 骨髄腫細胞増殖抑制試験を骨病変の抑
制を指標として行うことからなる請求項１３に記載のイ
ンビボスクリーニング法。 - 【請求項１６】 骨髄腫治療剤がＩＬ−６活性阻害剤で
ある請求項１３に記載のインビボスクリーニング法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05808294A JP3554355B2 (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05808294A JP3554355B2 (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004001967A Division JP2004159662A (ja) | 2004-01-07 | 2004-01-07 | Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236475A true JPH07236475A (ja) | 1995-09-12 |
| JP3554355B2 JP3554355B2 (ja) | 2004-08-18 |
Family
ID=13074005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05808294A Expired - Fee Related JP3554355B2 (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3554355B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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