JP2004159662A - Il−6オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 オートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植した実験動物、骨髄腫治療剤を該細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法、ならびに骨髄腫治療剤を該実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。
【選択図】 なし
Description
IgG、λ型多発性骨髄腫患者(76才、女性、ステージIIA)の腹水から骨髄腫細胞を採取した。腹水は多数の骨髄腫細胞を含んでおり、腹水中のIL−6レベルは91.0pg/mlに達していた。採取した腹水をFicoll−Hypaque(ファルマシア社製)を用いた密度勾配遠心法にかけて単核球を分離、プラスチックシャーレにて付着細胞を除去し、さらにヒツジ赤血球にてT細胞を除去し、腫瘍細胞を95%以上に純化した。細胞を20%ウシ胎児血清(FCS:Xavier Investments製、オーストラリア)、組換えヒトIL−6(中外製薬製)4ng/mlおよびカナマイシン(明治製菓社製)100μg/mlを含むRPMI1640(ギブコ社製)培養液中に1×106細胞/mlの濃度で浮遊させた。次いで25mlフラスコ中で10mlの培養液中で培養し、湿潤5%CO2中、37℃でインキュベートした。安定した細胞増殖が観察されるまで3日ごとに培地を部分的に新しいものに取り替えた。
KPMM2の形態およびIg分泌
KPMM2細胞は光学顕微鏡下で自律的な細胞凝集を示して増殖することが観察され(図1)、ライト−ギムザ染色では形質細胞様の形態を示した(図2)。KPMM2は酸ホスファターゼが陽性であり、α−ナフチルブチレートエステラーゼがやや陽性であるが、ペルオキシダーゼ、AS−Dクロロアセテートエステラーゼ、パス(過ヨウ素酸シッフ試薬)およびアルカリホスファターゼは陰性であった。細胞質IgGおよびλL鎖が検出されたが、IgA、IgM、およびκL鎖は直接免疫蛍光法で陰性であった。また、細胞(106個/ml)を3日間培養すると、培養上清にはIgGおよびλL鎖の分泌が見られた。
上記実施例1で樹立した細胞株KPMM2の表面抗原の発現を各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、直接および間接蛍光抗体法(Fried et al., Flow Cytometry, Boca Raton, CRC Press:59-78, 1989)により検討した。
上記実施例1で樹立した細胞株KPMM2の免疫グロブリン(Ig)遺伝子再構成をサザンブロット法により分析した。
上記実施例1で樹立した細胞株KPMM2の染色体の構造異常を分析した。
実施例1で樹立した細胞株KPMM2のエプスタイン・バールウイルス(EBV)およびマイコプラズマ汚染を試験した。
実施例1で樹立した細胞株KPMM2の各種サイトカインへの反応性を試験した。
実施例1で樹立した細胞株KPMM2に対するマウス抗ヒトIL−6R mAb(モノクローナル抗体)(IgG1クラス:PM1)およびマウス抗IL−6 mAb(IgG1クラス:SK2)の効果を調べた。SK2は文献(Y. Ohe et al., Br. J. Cancer 67:939, 1993)に記載されており、またPM1は文献(Hirata et al., J. Immunol. 143:2900, 1989)に記載されている。
上記実施例1で樹立した細胞株KPMM2によるIL−6産生能を試験した。
KPMM2細胞上でのIL−6R発現を確認するために、IL−6Rに結合し、IL−6のIL−6Rへの結合を阻害しないマウス抗ヒトIL−6R mAbであるMT18抗体(Hirata et al., J. Immunol. 143:2900, 1989)を用いて、間接蛍光抗体法を実施した。
KPMM2のヒトIgG(Mタンパク)産生能を試験した。
実施例1に記載の方法で得られたKPMM2におけるヒトIL−6およびヒトIL−6Rの発現を確認するために、RT−PCR(逆転写ポリメレースチェインリアクション)法によりヒトIL−6およびヒトIL−6RのメッセンジャーRNA(mRNA)を検出した。
(1)KPMM2の可移植性およびインビボでの継代
上記実施例1で樹立した細胞株KPMM2の可移植性およびインビボでの継代を以下のように検討した。
(2)KPMM2の異なる移植経路での可移植性
KPMM2の移植経路を皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)とした場合の可移植性を以下のように検討した。
細胞株KPMM2をSCIDマウスへ皮下移植し、形成された腫瘍の体積と血清中ヒトIgG濃度の相関を調べた。上記(2)に記載の方法で細胞株KPMM2をSCIDマウスへ皮下移植し、KPMM2移植前、移植後21日目、42日目の3回、血清サンプルを採取してELISA法にてヒトIgG濃度を測定した。
(4)KPMM2の可移植性および移植細胞数の検討
SCIDマウスとヌードマウスで移植細胞数を変えたときのKPMM2の可移植性を検討した。
KPMM2を移植したSCIDマウスにおいて、その生着を確認するために、KPMM2の細胞表面上で特徴的に発現している表面抗原であるヒトCD38抗原の発現を試験した。
KPMM2移植動物における抗ヒトIL−6抗体SK2および抗ヒトIL−6R再構成ヒト型化抗体PM1のインビボ抗腫瘍効果を以下のようにして検討した。
KPMM2(107個)を上記実施例12(2)に記載する方法でSCIDマウス(日本クレア社製)へ静脈内移植し、移植後経時的に血中イオン化カルシウム濃度および骨吸収の有無を試験した。
Claims (16)
- オートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株。
- ヒト骨髄腫がヒト多発性骨髄腫である請求項1に記載の細胞株。
- オートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株であって、重症複合免疫不全マウス及び/又はヌードマウスに静脈内移植した場合に骨髄へ生着する能力を有するヒト骨髄腫細胞株。
- 請求項1または3に記載の細胞株を移植したヒト以外の実験動物。
- 実験動物が免疫不全状態である請求項4に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物がマウスである請求項4に記載の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を静脈内移植して得られる請求項4に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を皮下移植して得られる請求項4に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりIL−6依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を腹腔内移植して得られる請求項4に記載のヒト以外の実験動物。
- 骨髄腫治療剤を請求項1または3に記載の細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験をMタンパク分泌抑制を指標として行うことからなる請求項10に記載のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤がIL−6活性阻害剤である請求項10に記載のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤を請求項4に記載のヒト以外の実験動物に移植して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験をMタンパク分泌抑制を指標として行うことからなる請求項13に記載のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験を骨病変の抑制を指標として行うことからなる請求項13に記載のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤がIL−6活性阻害剤である請求項13に記載のインビボスクリーニング法。
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WO2023000687A1 (zh) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | 浙江大学 | 一种人原发性骨髓纤维化细胞株及其应用 |
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2004
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JP4882076B2 (ja) * | 2005-11-22 | 2012-02-22 | 国立大学法人 東京大学 | インターロイキン−6(il−6)シグナル伝達阻害剤スクリーニング方法 |
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