WO2002016454A1

WO2002016454A1 - Polymeres

Info

Publication number: WO2002016454A1
Application number: PCT/JP2001/007121
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Ohnishi; Hirotaka Furukawa; Kazunori Kataoka; Katsuhiko Ueno
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Chisso Corporation
Priority date: 2000-08-21
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2002-02-28
Also published as: EP1312627A4; JP4969760B2; US7195925B2; DE60140133D1; US20030186293A1; EP1312627A1; EP1312627B1; JPWO2002016454A1

Description

明細書ポリマー

<技術分野 >

本発明は刺激応答性のポリマー、微生物の分離方法または濃縮方法、核酸の精製方法、検出方法、または濃縮方法、分離剤、生体物質の分離方法、および物質の変換方法に関する。ぐ背景技術 >

近年、刺激応答性ポリマ一はドッラグデリバリ一システム（DDS)、各種分離剤、カテーテル、人工筋肉、ケモバルブなどに広く応用され、その重要性は急激に増大している。例えば特開平 8- 103653号公報には、熱、 pH、電位、または光などの刺激により高次構造が変化して水溶液中で膨潤したり収縮する刺激応答性高分子として、ポリ- N-イソプロピルアクリルアミド、および Ν,Ν—ジェチルアクリルァミドなどのアクリルアミド誘導体類、ポリメチルビ二ルェ一テルなどのビニルェ一テル類が記載されている。

しかしながら、温度変化に応答して膨潤-収縮するとして公知のポリマーは、上限臨界溶液温度（以下「UCST」と記述する。）又は下限臨界溶液温度（以下「LCST」と記述する。）を有すると記載されるものの、実際は全て LCSTを有する高分子である。すなわち、或る温度以上において可逆的に高分子間同士での凝集を起こすことにより水に不溶化し、それ未満では水に溶解するという性質を有する物であつた o

LCSTを有するポリマ一は、ある一定温度以上においてポリマーが収縮し水に対して不溶化する物であるから、分離剤等の用途に使用する際、収縮を低温下、降温操作で行いたいという要請に対して、その調整が難しいという課題があった。例えば、熱に不安定なタンパク質等の分離剤として用いる場合、 LCSTを有するポリマ一は昇温操作により凝集するため、その操作により夕ンパク質の変性を伴う危険性を考慮しなければならなかった。

一方、水溶液中で UCSTを示す高分子であるポリアクリル酸を用いたポリマー間イオンコンプレックスやポリソープなどは、緩衝液中において例えば分離剤などの用途に使用すると、ポリマーのィォン解離が起こり U C S Tを示さない場合がめった。ぐ発明の開示 >

本発明者らは前述の従来技術の課題に鑑み鋭意努力した、その結果、少なくとも下記一般式（1)で表されるモノマーと一般式（2 )で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーは、緩衝液中においても U C S Tを有すること、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行えることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。

本発明は以下の構成を有する。

( 1 ) 少なくとも一般式（1)で表されるモノマーと一般式（2 )で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマ一。

一般式 (1)

(式中、 R¹¹は水素原子又はメチル基を示し、 R¹²は単結合または炭素数 1〜5の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）

(式中、 R¹³は水素原子又はメチル基を示し、 R¹⁴は水素原子、炭素数 1〜10 の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルァミノ基、ァリール基、又は複素環基を示す。）

(2)上記一般式（1)で表されるモノマーと、ピオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。

(3) さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマ一から選ばれた 1種以上を用いた前記第 1項または第 2項記載のポリマー。

(4) 相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された前記第 1項〜第 3項の何れか 1項記載のポリマ一。

(5) 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ピオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 cDNAと mRNA、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテア一ゼとプロテア一ゼインヒビ夕一、 Fc部位とプロテイン A、 Fc 部位とプロテイン G、レクチンと糖、ホルモンレセプ夕一とホルモン、 DNAと DNA 結合タンパク質、へパリンとフイブロネクチン、およびへパリンとラミニンとの組合せから選ばれた 1種以上である前記第 4項記載のポリマー。

(6) 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ピオチンとアビジンである前記第 4項記載のポリマ一。

(7) 高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ビォチンである前記第 4項記載のポリマー。

(8) ピオチンがアビジンと結合したピオチン（以下「アビジン結合ビォチン」と記載する。）である前記第 7項記載のポリマー。

(9) アビジン化酵素をビォチンに結合させた前記第 7項記載のポリマー。

( 10) ビォチン化酵素をアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 8項記載のポリマ一。

( 1 1) 前記第 9項または第 10項記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。 (12) アビジン化抗体をピオチンに結合させた前記第 7項記載のポリマ一。

(13) ピオチン化抗体をアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 8項記載のポリマー。

(14) 前記第 12項または第 13項記載のポリマ一を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。

(15) アビジン化分子シャペロンをピオチンに結合させた前記第 7項記載のポリマ一。

(16) ピオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 8項記載のポリマ一。

(17)前記第 15項または第 16項記載のポリマ一を用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。

(18) アビジン化ヒートショックプロテインをビォチンに結合させた前記第 7 項記載のポリマ一。

(19) ピオチン化ヒートショックプロティンをアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 8項記載のポリマ一。

(20)前記第 19項または第 20項記載のポリマ一を用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。

(21) アビジン化核酸をピオチンに結合させた前記第 7項記載のポリマー。 (22) ピオチン化核酸をアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 8項記載のポリマー。

(23) 前記第 21項または第 22項記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。

(24)前記第 23項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。

(25)増幅方法が PCR法または RT-PCR法である前記第 24項記載の核酸の検出方法。

(26) 前記第 1項〜第 8項の何れか 1項記載のポリマーを含有する分離剤。 (27)前記第 26項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法 c

<発明を実施するための最良の形態 >

以下、本発明について更に詳しく説明する。

上限臨界温度（以下「UCST」と記述する。）を有するポリマ一（以下「uc

STポリマー」と記述する。）とは、ポリマ一含有溶媒において、該ポリマ一含有溶媒の温度が特定温度を越えた場合には、該ポリマーが溶媒に溶解した状態となり、該特定温度以下となった場合には、該ポリマーが溶媒中に析出、凝集する性質を有するポリマーのことである。 UCS Tとは該特定温度のことである。また、 UC S Tを境にポリマーの溶解、析出が起こる現象を UC S T特性と言う。

前述の溶媒は特に限定されるものではないが、具体的には水、および水を 50 重量％以上含有する液体を挙げることができる。さらに水を 50重量％以上含有する液として具体的には、生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。また、ポリマーを含有した状態で UCST特性を示すのであれば、該溶媒は、アセトンなどの有機溶媒と水との混合液であっても良い。

本発明の第一のポリマーは、少なくとも一般式（1) で表されるモノマー（以下「モノマー ( 1) j と記述する。 ) と一般式 (2)で表されるモノマー (以下「モノマ一（2)」と記述する。）とを重合させて得られた UCSTポリマーである。

-般式 (1) 一般式（1) 中、 R¹¹は水素原子又はメチル基を示し、本発明において R¹¹は水素原子であることが好ましい。 R ¹²は単結合または炭素数 1〜5の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、本発明において: ¹²はメチレン基がであることが好ましい。

-般式 (2) 一般式（2 ) 中、 R ¹³は水素原子又はメチル基を示し、本発明において R¹³は水素原子であることが好ましい。 R¹⁴は水素原子、炭素数 1〜1 0の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、ァリール基、又は複素璟基を示す。アルキル基としては炭素数 1〜5の直鎖のアルキル基が好ましく、アルコキシル基およびアルキルアミノ基のアルキル基部分としては、炭素数 1〜 5の直鎖のアルキル基が好ましい。ァリール基としては、フエニル基、およびナフチル基等が挙げられ、複素環基となるものとしてはピリミジン等が挙げられる。

本発明 U C S Tポリマーの重合において、モノマー（ 1 ) とモノマー（2 ) の他に、その他の成分として、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた 1種以上を用いた場合には、その種類および使用割合を変えることによって U C S Tを制御することが可能である。

その他の成分として使用するモノマーが親水性であるのか、もしくは疎水性であるのかの分類は、モノマー（ 1 ) の親水性を基準として行う。つまり、重合に用いるモノマ一（ 1 ) よりも親水性であるものは親水性モノマ一であり、疎水性であるものは疎水性モノマーである。また、重合に用いるモノマー（ 1 ) が複数である場合には、その中で最も親水性であるモノマ一を基準に分類を行えばよい。重合に用いるモノマー（ 1 ) の種類により異なり、一概に特定することはできないが、具体的にその例を挙げれば、本発明において使用する親水性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、ァリルアルコール、およびァリルァミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル（メ夕）ァクリレート、スチレン、エチレン、プロピレン、アセチレン等の不飽和炭化水素、アルキルビニルェ一テル、およびアルキル（メタ）アクリルアミドなどを挙げることができる。本発明の U C S Tポリマーの重合に親水性モノマーを用いた場合、 U C S Tは低下する傾向にあり、反対に疎水性モノマ一を用いた場合、 UC STは上昇する傾向にある。

本発明の U C S Tポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（ 1 ) ：モノマー（ 2 )：その他のモノマ — =95〜20 : 1〜60 : 0〜40の割合であり、好ましくは 95〜 50 ： 1 〜50 ： 0〜20の割合である。

本発明の U C S Tポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマ一や塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度を UCST以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。

本発明の第二のポリマーは、前述のモノマ一（ 1) とビォチン部位を有するモノマーとを重合させて得られた UC S Tポリマーである。本発明第二の UC S T ポリマーは、該 UC S Tポリマー内に導入されたピオチン部位により、アビジンを特異的に吸着することが可能となることから、該 UCSTポリマ一を用いれば、各種目的物質をアビジン化することによって、該目的物質の分離、精製、濃縮を効率よく行うことが可能となる。

モノマー（ 1) のうち、下記一般式（3) で表されるァクリロイルグリシンァミドは、本発明の第二の UCSTポリマーに好ましく使用することができる。

—般式（ 3 )

本発明において、本発明に使用するピオチン部位を有するモノマーは特に限定されるものではないが、ピオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、ビォチンの末端カルボキシル基を用いた（メタ）ァクリルアミド、（メタ）ァクリレ ―ト誘導体などを挙げることが出来るが、本発明においてこれらに限定されるものではない。その中でも好ましい該モノマーとして、下記一般式（4) で表される重合性ピオチン誘導体を挙げることができる。

一般式（4) 中、 R ²は水素原子又はアルキル基を示す。 R ³及び R ⁴はそれそれ独立に水素原子、アルキル基又はァリール基を示す。 Tは酸素原子又は =NH 基を示す。 Wは単結合又はカルボニル基、チォカルボニル基もしくは炭素数 1〜 5のアルキレン基を示す。 Uは単結合又は— NH—基を示す。 Xは単結合又は炭素数 1〜 8の炭化水素結合、酸素原子もしくは一 NH—基を示す。 Yは単結合又はカルボニル基、チォカルボニル基、 — NH基—、 1, 2—ジォキシエチレン基もしくは 1， 2—ジァミノエチレン基を示す。 Zは単結合又はカルボニル基、チォカルボニル基、炭素数 1〜 5のアルキレン基、酸素原子もしくは— NH—基を示す。 Vは単結合又は炭素数 1〜5のアルキレン基を示す。

一般式（4) で表される重合性ピオチン誘導体の中でも、下記一般式（5) 〜 (7) で表される重合性ビォチン誘導体は、本発明の UCSTポリマーに好ましく使用することができる。一般式 (5)

一般式 (6)

—般式（5) 〜（7) 中、 R¹は単結合又は炭素数 1〜4のアルキレン基を示し、 R⁵は炭素数 2又は 3のアルキレン基を示す。 X¹は酸素原子又は硫黄原子を示し、 X²〜X⁵はそれそれ独立に、酸素原子又は一 NH—基を示す。 T、 R R ³及び R ⁴はそれぞれ上記一般式（4) における定義と同じである。

上記一般式（5) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（8) で示されるビォチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式（ 9 ) で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得るとができる。

上記一般式（6 ) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（ 1 0 ) で示されるビォチン誘導体を、適当なアクリル化剤（メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、ァクリロキシスクシンイミド等のァクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸ク口リド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンィミド等のメ夕クリル化剤などが挙げられる。）と反応させることにより得ることができる。

ここで、一般式（10) で表されるピオチン誘導体は、一般式（8) で表されるピオチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体（X⁴ =酸素原子）の水酸基を、脱離基機能を有する官能基に変換し、変換後の該アルコール体とアミン誘導体（X⁴ =— NH— ) とを置換反応させることにより得ることができる。

上記一般式（7) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（1 1)で示されるビォチン誘導体を、テトラヒドロフラン（THF)、ジメチルスルホキシド（DMS〇）、エーテル、ジメチルホルムアミド（DMF)、ジクロロメタン、クロ口ホルム、酢酸ェチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルェン等の非プロトン性溶媒中で、一般式（12)で示されるイソシァネート物質と反応させることにより得ることができる。

(7) さらに、下記一般式（ 1 3) で表される重合性ピオチン誘導体は、本発明の U C S Tポリマーに特に好ましく使用することができる。

さらに、本発明の UCS Tポリマーに好ましく使用することができるモノマ一として、一般式（ 1 4) で表されるピオチンメタクリアミド誘導体、および一般式（ 1 5) で表されるピオチン誘導体が挙げられる。

式 (15)

さらに、本発明の第二の UC S Tポリマ一には、本発明第一の UC S Τポリマ —と同様に、 UC STを制御する目的で、その他のモノマーとして前述の親水性モノマ一および疎水性モノマ一から選ばれた 1種以上を用いることができる。本発明第二の UC S Τポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（ 1 )：ビォチン部位あるいはィミノビォチン部位を有するモノマー：その他のモノマ一 = 500〜1 ： 500〜0. 1 ： 0-50の割合であり、好ましくは 100〜5 ： 10〜0. 5 ： 0〜5の割合である。

本発明 U C S Τポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行つてもよく、または溶液の温度を UCST以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。

本発明の第一、第二の何れの UC S Τポリマーにおいても、その分子量は特定されるものではないが、質量平均分子量が 500〜1000000の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは 1000〜； 100000の範囲である。また、その UCSTは該分子量に依存しないことが好ましい。本発明における UC STとは、具体的には、本発明の UC S Tポリマ一を水に対して 1重量％の割合で水に添加した U C S Tポリマ一含有水を加熱して清澄状態とし、次いで UCSTポリマー含有水の温度を 1分あたり 1°Cの割合で降下させて行き、該 UC S Tポリマ一含有水の可視光透過率が、清澄状態時の 1/2の値になつた時点の温度である。

該 U C S Tポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の 1 /2の値になつて、さらに昇温乃至降温してもある温度範囲で 1/2の値が保持される場合がある。この温度範囲の上限を昇温時の UCSTと言い、同下限を降温時の UCST と言う。この両者の差（温度範囲）をスイッチング範囲と言う。このスイッチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては 10°C以下であることが好ましく、より好ましくは o°cである。

本発明 UC S Tポリマーの UC S Tは特に限定されるものではないが、本発明の UC S Tポリマ一を分離剤とする場合には、 0〜50°Cの範囲であることが好ましく、特に好ましくは 0〜40°Cの範囲である。

相互に特異的作用を有する一対の物質とは、イオン間の相互作用、水素結合、疎水的相互作用、および金属原子に対する配位などの相互作用によって特異的に相互に吸着する物質であり、具体的には、ビォチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 cDNAと m A、酵素 (活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビ夕一、 Fc部位とプロテイン A、 Fc部位とプロティン G、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、 DNAと DNA結合タンパク質、へパリンとフイブロネクチン、へパリンとラミニン、ポリチミンと mRNA、大腸菌抗体と大腸菌、および抗体（I gG) と抗 I gGとの組合せを挙げることができる。

その中でも、ビォチンとアビジンとの組合せは本発明に最も好ましく使用することができる。本発明第一の UC S Tポリマ一にピオチンを固定化した場合には、アビジンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となり、本発明第一または第二の U C S Tポリマーにアビジンを固定化した場合には、ビォチンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となる。なお、本発明においてピオチンは、イミノビォチンであってもよく、アビジンはストレブトアビジンであっても良い。何れの場合も本発明の効果を得ることができる。

その際の目的物質は特に限定されるものではないが、例えば酵素、抗体、核酸、分子シャペロン、およびヒ一トショックプロティンなどを挙げることができる。本発明の U C S Tポリマーにアビジンが固定化された場合には、アビジンのビォチン結合 4サイトのうち最大 3サイトを閧いた状態に保つことが可能であることから、ビォチン化された目的物質をさらに効率よく分離、回収することが可能となる。

しかしながら、現実的にはアビジンを直接 U C S Tポリマーに固定化することは困難であることから、本発明第二の U C S Tポリマーに固定されているビォチンにアビジンを結合させることによって、アビジンを本発明の U C S Tポリマーに固定化することが好ましい。

相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された、本発明の U C S Tポリマーを用いれば、そのもう一方の物質、該物質が固定化された物質を容易に分離、回収することが可能となる。

例えば、酵素が固定化された本発明の U C S Tポリマーを酵素反応に用いれば、従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、より速い速度で基質を変換することが可能である。その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、異性化酵素、および合成酵素などを挙げることができる。

基質の変換により生成した物質は、本発明の U C S Tポリマーと該生成物質とを含有する溶液の温度を下げることにより、該 U C S Tポリマ一のみを析出させ、析出した該 U C S Tポリマ一のみを取り除くことにより、酵素と該生成物質とを容易に分離することができる。

抗体を固定化した本発明の U C S Tポリマーを用いれば、溶液中の微生物の分離、濃縮を効率よく行うことができる。その際に使用する抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリク口一ナル抗体であっても良い。

溶液中の微生物の分離方法、濃縮方法は特に限定されるものではないが、具体的には、微生物を含有する溶液に該 U C S Tポリマ一を添加し、微生物と該 U C S Tポリマーとを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、微生物を吸着した U C S Tポリマ一のみを析出させ、析出した U C S Tポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の微生物を容易に分離、濃縮することが可能である。

例えば、使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、食品懸濁液中のサルモネラ菌だけを容易に分離、濃縮することが可能であることから、任意の抗体が固定化された本発明の U C S Tポリマ一と適当な検出試薬とを組み合わせることによつて、感度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。

分子シャペロンゃヒ一トショックプロテインを U C S Tポリマーに固定化した磁性微粒子は、溶液中における、酵素や抗体の安定性を高めることから、その繰り返し離床が可能となり、工業レベルでの蛋白質生産、物質生産を補助することが出来る。通常、分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、工業レベルでの使用は困難である。

核酸を固定化した本発明の U C S Tポリマーを、核酸を含有する溶液に添加し、該 U C S Tポリマ一と核酸とを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、核酸を吸着した U C S Tポリマーのみを析出させ、析出した U C S Tポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の核酸を容易に分離、濃縮することが可能である。また、該核酸の分離、濃縮方法は、特定遺伝子の精製、濃縮、検出等に応用することも可能である。

また、複数種類の核酸と該 U C S Tポリマーとを含有する混合液中で、ハイブリダイゼ一シヨンを充分に行った後、該混合液の温度を下げることにより核酸ごと凝集、回収を行った後、再度温度を上げることで容易に任意の核酸の精製、検出、濃縮を行うことが出来る。

例えば目的とする D N Aと相補的な配列を有するピオチン化 D N Aゃビォチン化ポリチミンを用いることで、目的 DNAや mRNAを濃縮、精製することが出来る。得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、感度良く核酸を検出することが出来る。核酸の増幅方法は特に限定されないが、 PCR法や R T-P C R法が本発明に好ましく用いることができる。

相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、本発明第一の UCSTポリマ —に固定化する方法は特に限定されるものではなく、既に合成された該 UCS T ポリマーに該一対の物質の一方を固定化する方法（以下「固定化法」と記載する。）や、アビジンが固定化された該一対の物質の一方を、アビジンとビォチンとの特異的作用を利用して、本発明第二の UCSTポリマーに結合させる方法（以下「結合法」と記載する。）などを挙げることができる。

前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレヅクスゃ電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。

抗体や酵素などの蛋白質を、本発明の U C S Tポリマーに結合させる場合であれば、該蛋白質が有するアミノ基ゃカルボキシル基等の官能基の反応性を利用して、該 UCSTポリマ一と該蛋白質とを結合させればよい。

例えば、蛋白質のアミノ基を利用する場合は、該 UC S Tポリマーにカルボキシル基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。

縮合剤

R-NH₂ 4- HOOC-R' > R-NH-CO-R' + H₂0

R :蛋白質、 R ' ： UCSTポリマ一また、下記に示すようなアルデヒド基を利用する方法、エポキシ基を利用して、本発明の UCS Tポリマ一と蛋白質とを結合させても良い。 R-NHz 4- OHC-R' R~NH=CH- (シッフ塩基）

還元剤

-NH-CH₉-R '

R-NH_Z + CH_Z— CH— R' + R-NH-CH₂-CH-R'

\ / I

O OH また、該蛋白質のカルボキシル基を利用する場合であれば、本発明の UCST ポリマーにアミノ基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。

縮合剤

R-COOH + HiN-R' R-CO-NH-R' +H₂0 また、例えば、メ夕クリル酸のカルボキシル基などを、上記モノマ一や他のモノマーに共重合させて、カルボキシル基など適当な官能基を持つように本発明の UCSTポリマーを設計することにより、カルボジィミド等を用いる既知の蛋白質固定化方法により酵素や抗体などの蛋白質を、該 UCSTポリマーに固定化することも出来る。

本発明の UCS Tポリマーに抗体を導入して蛋白質と結合させる場合、該結合は、 pHが中性付近の燐酸、トリスバッファーの中で行われることが好ましい。また、塩濃度は目的に応じて適宜設定できる。

相互に特異的作用を有する一対の物質の一方の、本発明 UC S Tポリマーへの固定化は、前述のように相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、該 UC STポリマーに直接固定化しても良いが、固定化の作業が簡便であることから、ビォチンとァビジンとの結合を介して該 U C S Tポリマーに固定化されていることが好ましい。例えば、アビジンが固定化された酵素を、アビジンとピオチンとの間の特異的作用を利用して、ピオチンが固定化された本発明第二の UC S Tポリマーに固定化すればよい。さらに好ましくは、例えば、ピオチンが固定化された酵素を、アビジン結合ビォチンが固定化された U C S Tポリマーに固定化することである。前述のように該ァビジン結合ピオチンは、最大 3つのピオチン化酵素を固定化することが可能であることから、より高い効率で基質の変換、分離、回収が可能となる。

当然のことながら、これは酵素に限定されるものではなく、前述の相互に特異的作用を有する一対の物質であれば、同様の効果が得られる。

本発明の分離剤は、本発明の U C S Tポリマーを含有するものであれば特に限定されるものではないが、該 U C S Tポリマーの分離剤に対する含有割合が 1〜 1 0 0重量％の範囲であることが好ましく、特に好ましくは 2〜 3 0重量％の範囲である。

その他の成分としてはフヱライト粒子、マグネタイト粒子、およびへマタイト粒子などを挙げることができる。

本発明の分離剤を用いれば、微生物、核酸、タンパク、ペプチド、抗原、璟境ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。

本発明の U C S Tポリマ一は、相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された場合であっても、その U C S Tは不変であることが好ましく、さらに、溶解、不溶化の操作を繰り返し行った場合であっても、その U C S Tは不変であることが好ましい。

また、本発明の U C S Tポリマ一は、細菌、残留農薬の検出等の如き検査薬、診断薬への応用、微生物や細胞培養の生体物等のバイオプロダクトの分離、酵素や分子シャぺ口ン等の固定化による生体反応機能の活性化 ·維持などに特に有効に利用できる。

<実施例 >

以下の実施例において、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。実施例 1 [ N—ァクリロイルグリシンアミドの合成] アクリル酸クロリド 9質量部とグリシンアミド塩酸塩 11質量部とをエーテル 200ml中に懸濁させ、 10°Cで 3時間撹拌した。その後飽和重曹水を 100 ml加え、更に 1時間室温で撹拌を行った。次いで、酢酸ェチル 200mlを加え有機相の抽出を行った。減圧下、該有機相を濃縮して得られた在留物を、酢酸ェチルを移動相に用いて、シリカゲルでカラムクロマトを行い白色結晶の化合物 10質量部を得た。得られた化合物について NMR及び質量分析を行い、該化合物が N—ァクリロイルグリシンアミドであることを確認した。実施例 2 [UC S Tポリマ一の合成：（N—ァクリロイルグリシンアミドと N— ァセチルアクリルアミドとの共重合体（モル比 10 : 1) )

N—ァクリロイルグリシンアミド 13質量部と、 N—ァセチルァクリルアミド 1. 1質量部とを、 100mlのジメチルスルフォキシドに溶解し、 0. 1質量部のァゾビスイソプチロニトリル（AIBN)を開始剤に用いて、窒素雰囲気下、 3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物について NMR分析を行い、該重合物が N—ァクリロイルグリシンアミドと N—ァセチルァクリルアミドとの共重合体であることを確認した。また GPCを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約 6000であった。

得られたポリマーを pH = 7. 6、 PB Sサリンバッファ一中に溶解し（2質量％) 、石英セル中で 50 Onmの可視光を用いて UCSTを測定したところ、昇温時約 13°C；、降温時約 5°Cであった。実施例 3 [UC S Tポリマーの合成： N—ァクリロイルグリシンアミドとモノマ — (3 a) との共重合体（モル比 10 : 1) ]

N—ァクリロイルグリシンアミド 13質量部と、モノマー（3 a) 3. 7質量部とを 1◦ Omlのジメチルスルフォキシドに溶解し、 0. 1質量部の AIBN を開始剤に用いて、窒素雰囲気下、 3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物について NMR分析を行い、該重合物が N—ァクリロイルグリシンアミドとモノマー（3 a) との共重合体であることを確認した。また GPCを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約 8000であった。

得られたポリマーを pH = 7.6、PB Sサリンバッファ一中に溶解し（ 2質量％)、石英セル中で 50 Onmの可視光を用いて UCSTを測定したところ、昇温時約 33 °C、降温時約 21 °Cであった。実施例 4 [卵白中からのアビジンの特異的分離]

実施例 3で得られた UCSTポリマー 5mg、 1. 0%アビジン溶液 50 zl、 1. 0Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0)100〃1、蒸留水 450 /1、および 2. 5%の卵白溶液 400 zlを試験管中で良く混合した锋、該試験管を氷水中に置き、溶液の温度を UCST以下にし高分子を凝集させた。上清部分 1 00〃1を取り出し、 SDSによる変性処理後、 SDS— PAGE (SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなつていることを確認した。実施例 5 [U C S Tポリマーの合成： N—ァクリロイルグリシンアミドとモノマ — (3 a) との共重合体（モル比 200 : 1 ) ]

N—ァクリロイルグリシンアミド 13質量部とモノマ一（ 3 a) 0. 19質量部とを、 10 Omlのジメチルスルフォキシドに溶解し、 0. 1質量部の AIB Nを開始剤に用いて、窒素雰囲気下、 3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物について NMR分析を行い、該重合物が N—ァクリロイルグリシンアミドとモノマー（3 a) との共重合体であることを確認した。また GP Cを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約 8000であった。

得られた共重合体を ρΗ=7· 6、 PB Sサリンバッファ一中に溶解し（2質量％)、石英セル中で 500 nmの可視光を用いて UC S Τを測定したところ、昇温時約 18°C、降温時約 7°Cであった。実施例 6 [UCS Tポリマ一へのアビジン固定化酵素の固定化]

実施例 5で得られた U C S Τポリマ一 3 m g、市販のァビジン固定化ペルォキシダ一ゼ溶液（ 1 mg/m 1) 1000〃1、および 1. 0Mリン酸ナトリゥム緩衝液（pH=7. 0)100〃1を、蒸留水 700 /1に添加し良く混合した。得られた溶液を、その温度が UC S T以下になるまで冷却し、生成した凝集物を回収し、上清 1900〃1を取り除いた後、新たに 0. 1Mリン酸緩衝液（pH = 7. 0) 1900 z 1を添加することによって、アビジン固定化ペルォキシダーゼを固定化した UCS Tポリマーを含有する溶液を調製した。

該 U C S Tポリマーは該溶液中において、該溶液の温度が U C S Tを越えた場合には溶解し、 UCST以下である場合には凝集した。該溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集および遠心分離後の操作を行い、それそれ段階における上清のペルォキシダ一ゼ活性を、下記に示すペルォキシダーゼの活性測定法により測定した。なお、遠心分離後、凝集物を回収した後は、毎回上清 1900 z 1を取り除き、新たに 0. 1Mリン酸緩衝液（pH= 7. 0) 1900 lを添加した。

上記方法により繰り返し凝集、溶解を行った場合の上清のペルォキシダ一ゼ活性を測定した結果を表 1に示す。なお、ペルォキシダ一ゼ活性は最初の溶解時の活性を 100とした場合の比活性で示した。

(ペルォキシダーゼ活性測定法）

10 OmM過酸化水素 100 1、 50 mMフエノール 100 1、 50 mM 4—ァミノアンチピリン 100〃 1、 1. 0Mリン酸ナトリゥム緩衝液（ pH= 7. 0)100〃1、および蒸留水 580〃1を、吸光度計のセル内で予め混合し、次いで、該セルにサンプルを 2 Ο l添加し、再び良く混合した後、生成物を 50 0 nmの可視光吸収を測定することにより、該サンプルのペルォキシダ一ゼ活性を求めた。なお、以上の操作は 30°Cで行った。表 1

この結果よりアビジン固定化ペルォキシダ一ゼの活性は、該 UC S Τポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行った場合であつても、低下しにくいことが明らかである。実施例 Ί [アビジン固定化 U C S Τポリマーへのビォチン固定化酵素の固定] まず、アビジンのビォチン結合サイト 3力所が空いている状態のアビジン固定化 U C S Τポリマーを得るため、実施例 5で得られた UC STポリマー 5mgに

1. 0 % ァビジン溶液 500〃1、 1. 0Mリン酸ナトリゥム緩衝液（ pH= 7.

0) 100 _d l、および蒸留水 350〃1を試験管中で良く混合した後、氷水中に置き該混合液の温度を UCS Τ以下にし、該 UC S Τポリマーを凝集させた。該凝集物を遠心分離後、吸引濾過し、 UCS Tポリマーとの結合部位以外のピオチン結合サイトが空いているアビジン固定化 UC S Τポリマ一含有液を得た。このアビジン固定化 UC S Τポリマー含有液に、市販のビォチン固定化ペルォキシダ一ゼ溶液（ 1 mg/m l) 1 000 z l、 1. 0Mリン酸ナトリゥム緩衝液

(pH=7. 0 ) 1 00 l、および蒸留水 700〃 1を添加し、良く混合した。得られた混合液を冷却し、生成した凝集物を回収し、回収後の該混合液から上清

1 900〃1を取り除いた後、該混合液に新たに 0. 1Mリン酸緩衝液（pH =

7. 0) 1 900〃 1を添加し、ピオチン固定化ペルォキシダ一ゼを固定化したアビジン固定化 UC S Tポリマ一を調製した。この UCS Tポリマーを使って、実施例 6と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清のペルォキシダ一ゼ活性を測定した結果を表 2に示す。なお、ペルォキシダ一ゼ活性についても同様に最初の溶解時の活性を 1 00とした場合の比活性で示した

表 2

アビジン固定化 UC S Tポリマーに固定化されたピオチン固定化ペルォキシダ —ゼの活性は、該 U C S Tポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行つた場合であつても、低下しにくいことが明らかである。実施例 8 [UC S Tポリマーへのヒ一トショヅクプロティンの固定化]

市販のピオチンが固定化されたヒートショヅクプロティン H S P 70、 0.5mg を 10 OmMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH = 7. 0 ) lmlによく混合した後、この混合液から 5 u 1取り出して変性処理した後 SD S— PAGEにより H S P 70のバンドを確認した。

続いて上記ピオチン化 HS P 70のリン酸ナトリゥム緩衝溶液 500〃 1を、実施例 7で調製したアビジン固定化 UC S Tポリマー 5 mgに加え、良く混合したのち、その混合液を冷却し、冷却によって生成した凝集物を回収し、上清の HS P 70を SD S— P AGEにより確認したところ上清には HS P 70は無く、 H SP 70は UC S Tポリマーに固定化されたアビジンと結合していることが確認された。実施例 9 [微生物の分離濃縮方法]

市販のビォチン固定化サルモネラ抗体を、実施例 7に記載の方法に準じて U C

STポリマーに固定化した。固定化したことは SD S— PAGEを用い確認を行つた。続いて該ビォチン固定化サルモネラ菌の濃度が 1個/ mlになるように調整した菌けん濁液 20 m 1に該 U C S Tポリマ一 5 m gを添加してよく撹拌後、得られた混合液を冷却して該 U C S Tポリマーを凝集させ、該凝集物を遠心分離により沈殿させ、上清を取り除き、次いで、残さである凝集物に水を加えて容積を lmlとした。この凝集体含有液を予め滅菌し、 50°Cにインキュベートしていたブレインハ一トインフユ一ジョン寒天培地 2 Omlに添カ卩し、すばやく混合後シャーレに広げ、寒天が固まるまで放冷し、 37°Cで 48時間インキュベートした。 48時間後のコロニー数を計測した結果を表 3に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。また、対照として、該 UCSTポリマーを添加せず、最初に調整した菌けん濁液 1 m 1中の菌数を同様に測定した。

表 3

この結果より、サルモネラ菌は該 U C S Tポリマーにより濃縮されていることが明らかである。実施例 10 [UCSTポリマーへの核酸の固定化]

市販のピオチン固定化 DNA断片 500 /1 (50〜： L O O Obp) に、蒸留水 450 l、および実施例 7で調製したアビジン固定化 UCS Tポリマー 5 m gを加え良く混合したのち、該混合液を冷却して該 UC S Tポリマーを凝集させ、該凝集を遠心分離により回収し、上清の DN A断片をァガロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれの DN A断片も該 UC S Tポリマーに結合していることが示唆された。 RN Aについても同様の実験を行い、該 UCSTポリマーへの結合を確認した。本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとつて明らかである。本出願は、 2000年 8月 21日出願の日本特許出願 No.2000— 249818に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

<産業上の利用可能性 >

本発明の UCSTポリマ一は、緩衝液中においても UCSTを有し、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行える。特に温度設定が難しい物質、高温環境が好ましくない物質（例えばバイオプロダクト、酵素、抗体などの蛋白質）の分離、精製、固定化酵素、検量、制御、或いはケモバルブ、ドラッグデリバリ一システム（DDS) 等に有効に利用出来る。

Claims

請求の範囲

1 . 少なくとも一般式（1) で表されるモノマーと一般式（2 )で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマー。

一般式（1)

R¹³

0 .V 0 ¹⁴ 一般式（₂₎

(式中、 R¹³は水素原子又はメチル基を示し、 R¹⁴は水素原子、炭素数 1 ~ 1 0 の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルァミノ基、ァリ一ル基、又は複素環基を示す。）

2 . 上記一般式（1)で表されるモノマーと、ピオチン部位或いはイミノビォチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。

3 . さらに親水性モノマ一および疎水性モノマーから選ばれた 1種以上を用いた請求の範囲第 1項または第 2項記載のポリマー。

4 . 相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された請求の範囲第 1項〜第 3項の何れか 1項記載のポリマー。

5 . 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ピオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 c DNA と mRNA、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリァジン色素、プロテアーゼとプロテア一ゼィンヒビ夕一、 Fc部位とプロティン A、 Fc部位とプロテイン G、レクチンと糖、ホルモンレセプ夕一とホルモン、 DNA と MA結合タンパク質、へパリンとフイブロネクチン、およびへパリンとラミニンとの組合せから選ばれた 1種以上である請求の範囲第 4項記載のポリマー。

6 . 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビォチンとアビジンである請求の範囲第 4項記載のポリマー。

7 . 高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ピオチンである請求の範囲第 4項記載のポリマー。

8 . ピオチンがアビジンと結合したビォチン（以下「アビジン結合ビォチン」と記載する。）である請求の範囲第 7項記載のポリマー。

9 . アビジン化酵素をビォチンに結合させた請求の範囲第 7項記載のポリマ一 o

1 0 . ビォチン化酵素をアビジン結合ピオチンに結合させた請求の範囲第 8項記載のポリマー。

1 1 . 請求の範囲第 9項または第 1 0項記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。

1 2 . アビジン化抗体をピオチンに結合させた請求の範囲第 7項記載のポリマ一。

1 3 . ピオチン化抗体をアビジン結合ピオチンに結合させた請求の範囲第 8項記載のポリマー。

1 4 . 請求の範囲第 1 2項または第 1 3項記載のポリマ一を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。

1 5 . アビジン化分子シャペロンをピオチンに結合させた請求の範囲第 7 項記載のポリマー。

1 6 . ビォチン化分子シャペロンをアビジン結合ビォチンに結合させた請求の範囲第 8項記載のポリマー。

1 7 . 請求の範囲第 1 5項または第 1 6項記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。

1 8 . アビジン化ヒートショックプロティンをビォチンに結合させた請求の範囲第 7項記載のポリマー。

1 9 . ピオチン化ヒートショックプロティンをアビジン結合ビォチンに結合させた請求の範囲第 8項記載のポリマー。

2 0 . 請求の範囲第 1 9項または第 2 0項記載のポリマ一を用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。

2 1 . アビジン化核酸をピオチンに結合させた請求の範囲第 7項記載のポリマー。

2 2 . ピオチン化核酸をアビジン結合ビォチンに結合させた請求の範囲第 8項記載のポリマー。

2 3 . 請求の範囲第 2 1項または第 2 2項記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。

2 4 . 請求の範囲第 2 3項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。

2 5 . 増幅方法が PCR法または RT-PCR法である請求の範囲第 2 4項記載の核酸の検出方法。

2 6 . 請求の範囲第 1項〜第 8項の何れか 1項記載のポリマーを含有する分離剤。

2 7 . 請求の範囲第 2 6項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。