WO2001014859A1 - Verfahren zur bestimmung von substanzen mittels der evaneszenzfeldmethode - Google Patents

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WO2001014859A1
WO2001014859A1 PCT/EP2000/008116 EP0008116W WO0114859A1 WO 2001014859 A1 WO2001014859 A1 WO 2001014859A1 EP 0008116 W EP0008116 W EP 0008116W WO 0114859 A1 WO0114859 A1 WO 0114859A1
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fluorophore
substance
cuvette
determined
reactant
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PCT/EP2000/008116
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Manfred Schawaller
Gerald Quapil
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Stiftung Für Diagnostische Forschung
Leuze Electronic Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
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    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
    • Y10S436/817—Steroids or hormones

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining substances based on the evanescent field method and a cuvette, a microtiter plate, a solution and a kit for use in the method according to the invention.
  • the present invention can be used in particular in diagnostics and analysis.
  • ELISA enzyme-linked immunoabsorbent assay
  • a second reaction partner for example another antibody for the substance to be investigated is then brought into contact with the carrier, this reaction partner being marked with an enzyme which permits colorimetric detection.
  • the reaction of this second reaction partner with the substance to be examined which is coupled to the surface of the carrier produces a colored product which can be optically evaluated.
  • Standardized plastic plates often made of polystyrene, with 96 wells are usually used as the solid phase. The surface of the plastic wells binds proteins in the nanogram range through adsorption, which is a sufficient amount for immunological detection.
  • ELISAs show very good results in terms of sensitivity and specificity, the detection limits that can be achieved are in the nanogram range or below. There are various embodiments of assays based on this principle. Depending on the question, antigens or antibodies are detected.
  • a major disadvantage of the ELISA is the handling of the test, since different reagents have to be added to the wells in succession and then removed again. A total of ten or more pipetting, washing and incubation steps may be required. That is why ELISAs are time-consuming and labor-intensive and must be carried out with great care by specially trained personnel.
  • Another disadvantage of the ELISA is the time required for the sum of the incubation and washing steps for an assay or test, which normally takes one to several hours.
  • the interaction of, for example, biomolecules on a surface can be observed directly using the evanescence field method.
  • the interaction of the reactant in solution with a solid matrix surface is measured.
  • the binding of the ligand can be measured physically as a surface plasmon resonance ("surface plasmon resonance") without a time delay (in "real time”).
  • surface plasmon resonance a surface plasmon resonance
  • the advantages compared to an ELISA are the omission of further pipetting steps after the addition of the reagents and the elimination of the waiting steps. So far, however, complex devices and multilayer sensor chips with special surface chemistry have been required for such measurements. These disadvantages have prevented the method from being used in routine diagnostics.
  • the present invention is therefore based on the object of a method for
  • a method for determining substances comprising the steps - providing a surface which comprises at least one reaction partner R 1 for a reaction partner R 2 bound to the surface, contacting the surface with a solution which contains at least the substance to be determined, at least a fluorophore-containing compound and at least one dye which absorbs in the absorption and / or emission region of the fluorophore, in which a complex is formed on the surface of the reaction partner R 1 by means of the reaction partner R 2 and in which this complex in addition to the reaction partner R 1 comprises at least the substance to be determined and the at least one fluorophore-containing compound, and - excitation of the fluorophore bound on the surface by the evanescent field of a light source and measurement of the fluorescence generated.
  • Figure 1 is a schematic representation of an embodiment of the cuvette according to the invention and the inventive method according to one embodiment.
  • Figure 2 shows a schematic representation of a further embodiment of the method according to the invention.
  • FIG. 3 shows the intensity curve of electromagnetic radiation within a dye solution in accordance with Lambert-Beer law.
  • FIG. 4 shows a double logarithmic representation of the intensity curve as a function of the penetration depth of an evanescent wave and a wave weakened by absorption in accordance with Lambert-Beer law.
  • Figure 5 shows the absorption spectra of a number of dyes.
  • FIG. 6 shows the determination of the optimal concentration of a dye for use according to the method according to the invention.
  • FIG. 7 shows a reaction kinetics of the attachment of a protein to reaction partners R 1 bound on the surface, measured by means of the method according to the invention.
  • FIG. 8 shows a comparison measurement for the reaction kinetics according to FIG. 7, which was measured as in FIG. 7. However, in this comparative example, the surface was not coated with a reactant R 1 for the protein.
  • a surface which comprises at least one reaction partner R 1 bound or immobilized.
  • Bound means preferably that the reactant R 1 adheres to the surface by adsorption (direct adsorption).
  • the reaction partner R 1 can, however, also be bound to the surface via a bridge member, for example a protein, such as an antibody or an antigen.
  • the reactant R 1 can also be bound to the surface by a covalent bond. In the case of an acrylate surface, for example, this can be brought about by reaction with a carbodiimide.
  • bound means the adherence of a reaction partner or a compound to a surface or to a further reaction partner and / or compound and includes both covalent and non-covalent interactions, such as interactions due to ionic, polar or non-polar interactions ,
  • the reactant R 1 can be applied to the surface by conventional methods.
  • a protein serving as reaction partner R 1 can be coated on the surface (coating).
  • the reaction partner R 1 can preferably be bound to the surface by adsorption or by covalent binding.
  • the surface is preferably treated with a further solution, by means of which parts of the surface not afflicted with the reactant R are blocked or blocked, for example by a further protein which essentially does not contain the solution to be contacted Components responded.
  • the protruding surface is, for example, an inside of a concave container, such as a cuvette or a well (well) of a microtiter plate.
  • the reaction partner R 1 bound to the surface can form a complex on the surface by means of a reaction partner R 2 , this complex comprising at least the substance to be determined and the at least one fluorophore-containing compound in addition to the reaction partner R 1 .
  • the complex with the substance to be determined is "anchored", ie fixed, by the reaction partner R 1 bound to the surface, and can at the same time be detected by labeling with the fluorophore-containing compound.
  • a “complex” or “conjugate” is understood to mean a molecular linkage or binding together of two or more preferably chemical or biochemical substances. Training the
  • Reactions particularly preferably by antigen-antibody reactions.
  • the term “implementation” encompasses both covalent and non-covalent interactions of two or more reaction partners, it being possible for both types of interaction to coexist within a complex or conjugate.
  • non-covalent interaction encompasses both covalent and non-covalent interactions of two or more reaction partners, it being possible for both types of interaction to coexist within a complex or conjugate.
  • Van-der-Waals interaction Van-der-Waals interaction, polar and / or ionic interaction of the
  • Reaction partners mean.
  • reaction partner means a connection with an affinity for another substance.
  • the complex in addition to the reaction partner R 1, the complex comprises at least the substance to be determined and the at least one fluorophore-containing compound.
  • Reaction partner R 2 has the following options, among others:
  • the substance to be determined is the reaction partner R 2 .
  • the substance to be determined comprises the reaction partner R 2 , ie the reaction partner R 2 is a partial structure of the substance to be determined.
  • the substance to be determined has an affinity or binding site for the reaction partner R 2 .
  • Case (2) can thus arise after the binding of the reaction partner R 2 to the substance to be determined.
  • a further compound comprises the reaction partner R 2 or has an affinity for the reaction partner R 2 , this further compound further comprising at least one binding site for the substance to be determined.
  • the further compound, the substance to be determined and the reaction partner R 2 can be added to the solution as a conjugate or complex (all or only some) or the conjugate forms in the solution.
  • the substance to be determined can itself have an affinity for the reaction partner R 1 on the surface and can therefore form a bond directly with this reaction partner R 1 .
  • the substance to be determined can bind as reaction partner R 2 to the reaction partner R 1 on the surface. If, for example, the substance to be determined is an antibody, an antigen specific for this antibody can be applied to the surface, or vice versa.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of an embodiment of the cuvette according to the invention, and the inventive method according to the above embodiment.
  • the cuvette 1 has a recess 2, the surface of which comprises 3 reactants R 1 4 bound for the protein to be determined.
  • the depression 2 also increases with the surface 3 contacting solution 5, which according to this embodiment comprises a dye 6 and the substance 7 to be determined, which is already present as a conjugate with the fluorophore-containing compound.
  • the substance to be determined reacts with the reactant R 1 4 bound on the surface to form a complex 9 on the surface 3.
  • a light beam 10 is projected onto the underside of the surface 3, which is totally reflected at the phase interface 11.
  • an evanescence field 13 is formed above the surface 3, in which there is essentially only fluorophore bound to the surface in the complex 9.
  • the evanescence field does not usually extend over the entire width of the cuvette bottom.
  • the evanescence field can have an extent of approximately 1 mm 2 . Due to the excitation of the fluorophores by the evanescence field 13, the fluorophores bound on the surface emit photons 14, which can be amplified and measured, for example, by means of a photomultiplier 15. The fluorescence of the volume 16 is essentially suppressed by the presence of the dye 6.
  • the substance to be determined itself has (essentially) no or only slight affinity for the reaction partner R 1 on the surface.
  • the solution to be brought into contact with the surface contains a further compound which comprises a reaction partner R 2 and a binding site to the substance to be determined.
  • the reaction partner R 2 can bind to the reaction partner R 1 on the surface and thus fixes the substance to be determined indirectly on the surface.
  • This further connection thus serves as a bridge between the substance to be determined and the reaction partner R 1 on the surface.
  • avidin may be present as the reaction partner R 1 on the surface.
  • the further compound then comprises, in addition to a binding site for the substance to be determined, for example biotin, which can bind to the avidin bound on the surface.
  • This embodiment has the advantage, for example, that, in contrast to some antibodies and antigens, a surface coated with avidin can be lyophilized and dried or lyophilized is very stable. It also points out System Avidin / Biotin a very high dissociation constant KD. Furthermore, it is possible in this way to always provide an avidin-coated surface for a number of different determinations and to match only the further compound which is brought into contact with the solution with the surface to the substance to be determined.
  • Figure 2 shows schematically this embodiment of the method according to the invention.
  • the substance 20 to be determined, a dye 22, a fluorophore-containing compound 24 and a further compound 26 are present side by side in the solution brought into contact with the surface.
  • the reactant R 1 28 is bound on the surface.
  • the further compound and the fluorophore-containing compound attach to the substance to be determined (conjugate 30), and conjugate 30 binds via the reaction partner R 2 present in the further compound 26 to the reaction partner R 1 present on the surface 28 to the complex 32.
  • the complex 32 which contains the fluorophore-containing compound 24, is bound to the surface and can be determined by measuring the fluorescence in the evanescent field 34.
  • avidin or streptavidin
  • biotin all ligands or ligand-binding systems in which, for example, proteins are selective and / or specific binding sites for one or more ligands, such as histidine, histidine tags, are suitable for this embodiment of the method according to the invention.
  • the solution to be contacted with the surface further contains at least one fluorophore-containing compound.
  • a fluorophore is understood to mean a fluorescent compound, such as a fluorescent dye. Fluorescent proteins and / or low-molecular fluorescent chemical compounds are preferred.
  • phycobiliproteins such as allophycocyanin (APC), Cryptofluor Crimson or Cryptofluor Red can be used as fluorescent proteins.
  • APC allophycocyanin
  • Cryptofluor Crimson Cryptofluor Red
  • Cryptofluor Red can be used as fluorescent proteins.
  • low-molecular fluorescent compounds for example
  • Cy5 or BODIPY (4,4-Diluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indazene fluorophores) can be called.
  • Fluorescent dyes with an absorption in the range from 600 to 700 nm are preferred.
  • a fluorophore precursor compound can be used, from which the fluorophore is released before the measurement process, for example by changing the pH or by splitting off a protective group.
  • the term fluorophore also includes phosphorescent compounds. If such a phosphorescent compound is used as the fluorophore, the emitted phosphorescence is determined, which takes place at different times from the excitation. It is thus possible to separate the period of irradiation from the period of measurement.
  • this fluorophore-containing compound has a binding site for the substance to be determined.
  • the fluorophore can be bound to an antibody.
  • This fluorophore-containing antibody can preferably react in an antigen-antibody reaction with the substance to be determined, for example a protein, as the antigen.
  • the substance to be determined is itself present as a fluorophore-containing compound.
  • competition assays can be carried out, which are characterized in particular by a low detection limit.
  • the method is suitable for determining biologically active substances, such as hormones, proteins such as antigens, antibodies or haptens, pharmaceuticals, viruses, bacteria, etc.
  • biologically active substances such as hormones, proteins such as antigens, antibodies or haptens, pharmaceuticals, viruses, bacteria, etc.
  • the method can also be used to detect environmental toxins, toxins, etc.
  • the substances to be determined are particularly preferably detected by immunological reactions.
  • a complex of at least the first reaction partner R 1 , the substance to be determined and the fluorophore-containing compound forms on the surface. It is then possible to excite the fluorophore bound to the surface by the evanescent field of a light source and to measure the fluorescence of the fluorophore.
  • a light beam is directed onto the underside of the surface at such an angle that total reflection occurs at the phase interface of the cuvette / solution.
  • an angle of incidence of at least 60 ° to 90 ° is preferred, so that an evanescent field is formed above the surface at a height of up to 400 nm, preferably 200 nm, particularly preferably 50 to 150 nm.
  • the incident light is able to excite suitable fluorophores.
  • the emitted fluorescent light is amplified and evaluated, for example, with a photomultiplier.
  • Monochromatic light can be used as the light source. It should
  • Light of a wavelength can be used, which is preferably not with the
  • a laser is particularly preferred as the light source, in particular laser which emits light of a wavelength of
  • the 40 emit at least 635 nm.
  • the solution to be examined is serum, wavelengths of 600 to 700 nm are preferred, since the inherent fluorescence of serum is around 580 nm.
  • the increase in the fluorophore bound to the surface can be measured directly in real time as the reaction progresses. Since the amount of fluorophore bound to the surface is directly proportional to the amount of fluorophore-containing compound originally present, the method according to the invention permits the quantitative determination of reactants in solution in real time without additional washing and / or pipetting steps.
  • volume is understood to mean the liquid which is outside the evanescence field and which contains unbound fluorophore-containing compounds.
  • polarization of the light beam can be rotated in both plastic and glass cuvettes. This leads in particular to reflections of the excitation light when coupling out. So-called vagabond light is created, which together with volume and surface scattering effects can lead to volume stimulation.
  • excitation of the fluorophore located in the volume can be prevented if at least one dye is added to the solution to be contacted with the surface, which dye has an absorption in the absorption and / or emission range of the fluorophore.
  • a comparison of the penetration depths of evanescent wave and of stray light shows that the volume excitation can be suppressed by adding a dye.
  • the absorption of light is physically described by Lambert-Beer law, the intensity of the light decreasing logarithmically with the distance by absorption:
  • FIG. 4 shows a comparison of the penetration depths of the evanescent wave with the penetration depth of the light when absorbed by a dye.
  • the double logarithmic representation shows the intensity curve as a function of the penetration depth of an evanescent wave (left) and a wave attenuated by absorption (right).
  • the ordinate is in the range from -2 to 0, i.e. from 1/100 to 1 Iog10 intensity.
  • the parameters used here correspond to technically realizable values.
  • the decisive factor for the effectiveness of suppression is the geometric one Distance between the surface part of the cuvette from which light can reach the detector and the penetration points of the stray light into the volume.
  • a distance in the range of one millimeter is sufficient for a weakening of scattered light of two orders of magnitude. This distance can be easily maintained by appropriate cell dimensioning.
  • the absorption of the dye added to the volume is matched to the absorption and / or emission range of the fluorophore.
  • a single dye or a mixture of dyes can be used.
  • the absorption range of the fluorophore will usually correlate with the wavelength of the light source used. It is not necessary for the dye to have an absorption maximum in this spectral range; a shoulder in the absorption spectrum may already be sufficient. If, for example, fluorophores such as APC or Cy5 are used, the dye used can have an absorption between 600 nm and 700 nm, such as, for example, brilliant blue (brilliant blue FCF).
  • the concentration of the added dye depends on the absorption coefficient of the respective dye in solution and also depends on the frequency of the incident light.
  • the concentration of the dye can be adjusted depending on the dye so that the penetrating light can be essentially absorbed within 1 mm above the surface.
  • the volume fluorescence and the fluorescence in the evanescent field i.e. the surface fluorescence, measured in each case at different dye concentrations (cf. FIG. 6a).
  • the ratio of surface fluorescence to volume fluorescence is then plotted against the concentration of the dye (cf. FIG. 6b).
  • the maximum of curve 6b represents the optimal concentration of the dye.
  • the “signal / noise ratio” is understood to mean the ratio of surface fluorescence (“signal”) to volume fluorescence (“noise”).
  • “Essentially absorbed” can be one Intensity deletion of 70%, preferably 80%, particularly preferably at least 90%.
  • the concentration of brilliant blue FCF is preferably at least 0.001 mM.
  • the present invention further relates to a cuvette or a microtiter plate for carrying out the method according to the invention.
  • the cuvette preferably comprises glass or a plastic, particularly preferably a plastic such as polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyethylene terephthalate, polycycloolefin, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate and / or mixtures or blends of these plastics.
  • a plastic such as polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyethylene terephthalate, polycycloolefin, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate and / or mixtures or blends of these plastics.
  • any plastic is suitable which essentially does not absorb any light in the visible range.
  • the plastic can also be colored, for example, slightly bluish in order to filter out an emission caused by scattered light.
  • Plastic cuvettes can be obtained inexpensively by injection molding and preferably have a reaction volume of 1 to 400 ⁇ l, particularly preferably 5 to 200 ⁇ l.
  • the cuvettes or microtiter plates according to the invention are preferably formed in one piece. It can also prove to be advantageous if the inside and / or the emission surface, i.e. the surface from which the emitted beam emerges from the cuvette is / are polished to a surface roughness of preferably at most 10 nm.
  • the small size and the low price make it possible to use the method according to the invention in routine diagnostics and analysis.
  • a cuvette or microtiter plate can already be prepared and closed in the special label Trade.
  • the prepreparation includes the coating of the surface of the cuvette or microtiter plate with the first reaction partner and, if necessary, the subsequent blocking of the non-coated areas.
  • the coated cuvette or microtiter plate is particularly preferably lyophilized or dried.
  • the at least one dye and / or the at least one fluorophore-containing compound and / or the further compound may also be lyophilized and / or dried in the closed cuvette or microtiter plate, so that only the substance to be examined is present in the measurement Solution must be added.
  • the present invention comprises a solution which comprises at least one fluorophore-containing compound and / or at least one dye which absorbs in the absorption and / or emission range of the fluorophore.
  • the solution according to the invention can optionally contain a further compound which has at least one binding site to the substance to be determined and which comprises the reactant R 2 .
  • the present invention comprises a kit which comprises a prepared cuvette or microtiter plate and / or solutions of the at least one dye and the at least one fluorophore-containing compound and, if appropriate, the further compound which has at least one binding site to the substance to be determined and which comprises the reactant R 2 .
  • the at least one dye and the at least one fluorophore-containing compound can be present together in one solution and in two separate solutions.
  • the present invention further relates to the use of the method according to the invention for determining reaction kinetics, preferably immunological reactions, and the use of the method in medical or veterinary diagnostics, food analysis, environmental analysis or analysis of fermentation processes.
  • the detection of crop protection agents, such as atrazine, in drinking water, the detection of hormones in veal, the detection of hormones, such as HCG, and the direct or indirect detection of viruses, such as hepatitis S and HIV, can be mentioned as examples of specific applications.
  • the influence of the concentration of the added fluorophore bound to a protein is determined.
  • only fluorophore bound to the surface is present; unbound fluorophore was washed away. A dye was not added to the solution.
  • GAMAPC conjugate of allophycocyanin (APC) and Crosslinked, Goat Anti-Mouse IgG (H + L); Molecular Probes, Leiden, Netherlands
  • PBS + T 100 mM PO 4 , pH 7.5; 100 mM NaCI, 0.025v / v Tween20
  • PBS + T 100 mM PO 4 , pH 7.5; 100 mM NaCI, 0.025v / v Tween20
  • Endpoint reaction with washing the chip and measuring the fluorescence. Only bound fluorophore is present in the measurement.
  • the surface of cuvettes was coated by leaving 200 ⁇ l human serum 1: 1000 in PBS + at room temperature (RT) on the surface overnight. Then the surface was washed four times with PBS and treated with 1% BSA (Bovine Serum Albumine) Miles enhanced, PBS +, 300 ⁇ l, for one hour at RT.
  • BSA Bovine Serum Albumine
  • the cuvette is blocked with 1% BSA Miles enhanced, in PBS + 300 ⁇ l, for one hour at RT.
  • the reduction in volume excitation depends on the concentration of the brilliant blue dye in the volume. With brilliant blue FCF, at a concentration of 0.04 mm and above, far more than 95% of the volume fluorescence is extinguished.
  • a cuvette prepared as in Example 1a) is contacted with GAMAPC in PBS + T overnight at RT and then washed five times with PBS.
  • the negative control M1 has 5,000 counts / s.
  • Brilliant blue FCF reduces the volume emission from APC from 230,000 counts / s M1 to 5,000 counts / s.
  • the specific surface-bound fluorescence is reduced by about 50%.
  • the signal-to-noise ratio is significantly improved when adding brilliant blue FCF.
  • reaction kinetics of the attachment of a fluorophore-labeled protein to a reaction partner bound to the surface of the cuvette were measured.
  • Fig. 7 shows the change in emission against time.
  • An increase in the emission (fluorescence counts) with the reaction time is observed, which corresponds to the attachment of the fluorophore-labeled protein to the reaction partner bound on the surface.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen auf Basis der Evaneszenzfeldmethode und eine Küvette, eine Mikrotiterplatte, eine Lösung und ein Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere in der Diagnostik und Analytik eingesetzt werden.

Description

"Verfahren zur Bestimmung von Substanzen mittels der Evaneszenzfeldmethode"
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen auf Basis der Evaneszenzfeldmethode und eine Küvette, eine Mikrotiterplatte, eine Lösung und ein Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere in der Diagnostik und Analytik eingesetzt werden.
Die medizinische Diagnostik, im speziellen die immunologische Diagnostik, basiert zu einem großen Teil auf dem ELISA (Enzyme-Linked-Immunoabsorbent-Assay). Eine neuere Übersicht über Immuno-Assays findet sich bei Hage, Anal. Chem. 71 (1999), 294R-304R. Ein ELISA-Test dient zur Bestimmung der Konzentration von Antigenen oder Antikörpern. Die zu untersuchende Substanz (z.B. ein Antigen) wird zunächst mit einem festen Träger in Kontakt gebracht, an den vorher ein spezifischer Reaktionspartner für die zu untersuchende Substanz (z.B. ein Antikörper) gekoppelt wurde. Durch die Bindung der zu untersuchenden Substanz an den auf dem Träger gekoppelten Reaktionspartner wird die zu untersuchende Substanz an dem festen Träger konzentriert. Anschließend wird ein zweiter Reaktionspartner (z.B. ein weiterer Antikörper) für die zu untersuchende Substanz mit dem Träger in Kontakt gebracht, wobei dieser Reaktionspartner mit einem Enzym markiert ist, welches einen colorimetrischen Nachweis erlaubt. Durch die Reaktion dieses zweiten Reaktionspartners mit der an die Oberfläche des Trägers gekoppelten, zu untersuchenden Substanz entsteht ein farbiges Produkt, welches optisch ausgewertet werden kann. Als Festphase kommen dabei meistens standardisierte Kunststoffplatten, häufig aus Polystyrol, mit 96 Vertiefungen ("Wells") zur Anwendung. Die Oberfläche der Kunststoff-Wells bindet Proteine im Nanogramm-Bereich durch Adsorption, was eine für immunologische Nachweise ausreichende Menge ist. Für die Markierung des zweiten Reaktionspartners, welcher meist ein Immunoglobulin ist, mit Enzym gibt es eine Reihe von Möglichkeiten. Gängige Markierungen sind Peroxidase oder alkalische Phosphatase.
ELISA's zeigen sehr gute Ergebnisse hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität, die erreichbaren Nachweisgrenzen liegen im Nanogrammbereich oder darunter. Es gibt die verschiedensten Ausführungsformen von Assays, die auf diesem Prinzip beruhen. Dabei werden je nach Fragestellung Antigene oder Antikörper nachgewiesen.
Ein wesentlicher Nachteil des ELISA ist jedoch die Handhabung des Tests, da nacheinander verschiedene Reagenzien zu den Wells zugegeben und wieder entfernt werden müssen. Insgesamt können zehn oder mehr Pipettier-, Wasch- und Inkubationsschritte erforderlich sein. Deshalb sind ELISA's zeit- und arbeitsaufwendig und müssen von einem speziell ausgebildeten Personal mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Ein weiterer Nachteil des ELISA's ist die durch die Summe der Inkubations- und Waschschritte benötigte Zeitdauer für einen Assay bzw. Test, der normalerweise eine bis mehrere Stunden dauert.
Mittels der Evaneszenzfeldmethode kann die Interaktion von beispielsweise Biomolekülen an einer Oberfläche direkt beobachtet werden. Dabei wird die Interaktion des Reaktanten in Lösung mit einer festen Matrixoberfläche gemessen. Man kann ohne Zeitverzögerung (in "real-time") die Bindung des Liganden physikalisch als Oberflächen-Plasmonen-Resonanz ("Surface Plasmon Resonance") messen. Die Vorteile gegenüber einem ELISA sind das Wegfallen weiterer Pipettierschritte nach der Zugabe der Reagenzien und das Wegfallen der Warteschritte. Bisher werden jedoch für dartige Messungen aufwendige Apparaturen und mehrlagige Sensorchips mit spezieller Oberflächenchemie benötigt. Diese Nachteile verhindern bisher einen Einsatz der Methode in der Routinediagnostik.
Somit liegt der vorliegeden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur
Bestimmung von Substanzen, insbesondere biologisch aktiven Substanzen, bereitzustellen, bei dem die bei einem ELISA üblichen Wasch- und
Pipettierschritte möglichst ganz vermieden werden können und die
Z Inkubationszeiten reduziert werden können. Ferner sollen leicht herstellbare und billige Sensorchips bzw. Küvetten mit denen ein derartiges Verfahren durchführbar ist, erhältlich sein.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände gelöst.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen bereitgestellt, umfassend die Schritte - Bereitstellen einer Oberfläche, welche mindestens einen Reaktionspartner R1 für einen Reaktionspartner R2 an der Oberfläche gebunden umfaßt, Kontaktieren der Oberfläche mit einer Lösung, welche mindestens die zu bestimmende Substanz, mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung und mindestens einen Farbstoff, welcher im Absorptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors absorbiert, umfaßt, worin sich an dem Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche mittels des Reaktionspartners R2 ein Komplex ausbildet und worin dieser Komplex neben dem Reaktionspartner R1 mindestens die zu bestimmenden Substanz und die mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung umfaßt, und - Anregen des auf der Oberfläche gebundenen Fluorophors durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle und Messen der erzeugten Fluoreszenz.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Küvette sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer Ausführungsform.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 3 zeigt den Intensitätsverlauf von elektromagnetischer Strahlung innerhalb einer Farbstofflösung gemäß dem Lambert-Beer'schen Gesetz. Figur 4 zeigt in doppelt logarithmischer Darstellung den Intensitätsverlauf in Abhängigkeit von der Eindringtiefe einer evaneszenten Welle und einer durch Absorption gemäß des Lambert-Beer'schen Gesetzes abgeschwächten Welle.
Figur 5 zeigt die Absorptionsspektren einer Reihe von Farbstoffen.
Figur 6 zeigt die Bestimmung der optimalen Konzentration eines Farbstoffes zur Verwendung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Figur 7 zeigt eine mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessene Reaktionskinetik der Anlagerung eines Proteins an auf der Oberfläche gebundene Reaktionspartner R1.
Figur 8 zeigt eine Vergleichsmessung zur Reaktionskinetik gemäß Figur 7, welche wie bei Figur 7 gemessen wurde. Jedoch wurde bei diesem Vergleichsbeispiel die Oberfläche nicht mit einem Reaktionspartner R1 für das Protein beschichtet.
Erfindungsgemäß wird zunächst eine Oberfläche bereitgestellt, welche mindestens einen Reaktionspartner R1 gebunden bzw. immobilisiert umfaßt. Gebunden bedeutet dabei vorzugsweise, daß der Reaktionspartner R1 durch Adsorption an der Oberfläche anhaftet (direkte Adsorption). Der Reaktionspartner R1 kann aber auch über ein Brückenglied, beispielsweise ein Protein, wie einen Antikörper oder ein Antigen, an die Oberfläche gebunden sein. Ferner kann der Reaktionspartner R1 auch durch eine kovalente Bindung an die Oberfläche gebunden sein. Dies kann beispielsweise bei einer Acrylat-Oberfläche durch Umsetzung mit einem Carbodiimid bewirkt werden. „Gebunden" bedeutet im Sinne der Erfindung das Anhaften eines Reaktionspartners bzw. einer Verbindung an einer Oberfläche bzw. an einem weiteren Reaktionspartner und/oder Verbindung und umfaßt sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie beispielsweise Wechselwirkungen aufgrund ionischer, polarer oder unpolarer Wechselwirkungen.
Der Reaktionspartner R1 kann durch übliche Verfahren auf die Oberfläche aufgebracht werden. Beispielsweise kann ein als Reaktionspartner R1 dienendes Protein auf die Oberfläche beschichtet werden (Coaten). Der Reaktionspartner R1 kann vorzugsweise adsorptiv oder durch kovalente Bindung an die Oberfläche gebunden sein. Im Anschluß an diesen Arbeitsgang wird die Oberfläche vorzugsweise mit einer weiteren Lösung behandelt, durch welche nicht mit dem Reaktionspartner R behaftete Stellen der Oberfläche blockiert bzw. geblockt werden, beispielsweise durch ein weiteres Protein, welches im wesentlichen nicht mit den in der zu kontaktierenden Lösung enthaltenen Komponenten reagiert. Die vorstehende Oberfläche ist beispielsweise eine Innenseite eines konkaven Behälters, wie eine Küvette oder eine Vertiefung (Well) einer Mikrotiterplatte.
Erfindungsgemäß kann der an der Oberfläche gebundene Reaktionspartner R1 mittels eines Reaktionspartners R2 auf der Oberfläche einen Komplex ausbilden, wobei dieser Komplex neben dem Reaktionspartner R1 mindestens die zu bestimmende Substanz und die mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung umfaßt. Durch den an der Oberfläche gebundenen Reaktionspartner R1 wird der Komplex mit der zu bestimmende Substanz an der Oberfläche „verankert", d.h. fixiert und kann gleichzeitig durch die Markierung mit der Fluorophor-haltigen Verbindung detektiert werden.
Erfindungsgemäß wird unter einem „Komplex" oder „Konjugat" eine molekulare Verknüpfung bzw. Aneinanderbindung zweier oder mehrerer vorzugsweise chemischer oder biochemischer Substanzen verstanden. Die Ausbildung des
Komplexes erfolgt vorzugsweise mittels selektiven und/oder spezifischen
Umsetzungen, besonders bevorzugt durch Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Erfindungsgemäß umfaßt der Begriff „Umsetzung" sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Interaktionen zweier oder mehrerer Reaktionspartner, wobei innerhalb eines Komplexes oder Konjugats auch beide Arten der Wechselwirkung nebeneinander vorliegen können. Nicht-kovalente Interaktion kann bespielsweise
Van-der-Waals-Wechselwirkung, polare und/oder ionische Wechselwirkung der
Reaktionspartner bedeuten. Der Begriff „Reaktionspartner" bedeutet in der vorlie- genden Erfindung eine Verbindung mit einer Affinität zu einer anderen Substanz.
Erfindungsgemäß umfaßt der Komplex neben dem Reaktionspartner R1 mindestens die zu bestimmende Substanz und die mindestens eine Fluorophor- haltige Verbindung.
6 Zur Bindung dieses Komplexes an den Reaktionspartner R1 mittels des
Reaktionspartners R2 gibt es u.a. folgende Möglichkeiten:
(1 ) Die zu bestimmende Substanz selbst ist der Reaktionspartner R2. (2) Die zu bestimmende Substanz umfaßt den Reaktionspartner R2, d.h. der Reaktionspartner R2 ist eine Teilstruktur der zu bestimmenden Substanz.
(3) Die zu bestimmende Substanz weist eine Affinität bzw. Bindungsstelle für den Reaktionspartner R2 auf. Nach der Bindung des Reaktionspartners R2 an die zu bestimmende Substanz kann sich somit Fall (2) ergeben. (4) Eine weitere Verbindung umfaßt den Reaktionspartner R2 oder weist eine Affinität zu dem Reaktionspartner R2 auf, wobei diese weitere Verbindung ferner mindestens eine Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz umfaßt. In diesem Fall können die weitere Verbindung, die zu bestimmende Substanz und der Reaktionspartner R2 als Konjugat bzw. Komplex (aller oder nur einzelner) in die Lösung gegeben werden oder das Konjugat bildet sich in der Lösung.
Im folgenden wird auf bevorzugte Ausführungsformen dieser Fälle (1 ) bis (4) im einzelnen eingegangen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zu bestimmende Substanz selbst eine Affinität zu dem Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche aufweisen und kann daher direkt mit diesem Reaktionspartner R1 eine Bindung eingehen. Gemäß dieser Ausführungsform kann die zu bestimmende Substanz als Reaktionspartner R2 an den Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche binden. Wenn es sich beispielsweise bei der zu bestimmenden Substanz um einen Antikörper handelt, kann auf der Oberfläche ein für diesen Antikörper spezifisches Antigen aufgebracht sein, oder umgekehrt.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Küvette, sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der vorstehenden Ausführungsform. Die Küvette 1 weist eine Vertiefung 2 auf, deren Oberfläche 3 Reaktionspartner R1 4 für das zu bestimmende Protein gebunden umfaßt. Die Vertiefung 2 nimmt ferner die mit der Oberfläche 3 zu kontaktierende Lösung 5 auf, welche gemäß dieser Ausführungsform einen Farbstoff 6 und die bereits als Konjugat mit der Fluorophor-haltigen Verbindung vorliegende, zu bestimmende Substanz 7 umfaßt. Die zu bestimmende Substanz reagiert mit dem auf der Oberfläche gebundenen Reaktionspartner R1 4 zu einem Komplex 9 auf der Oberfläche 3. Beispielsweise mit einer Laserdiode 12 wird ein Lichtstrahl 10 auf die Unterseite der Oberfläche 3 projeziert, welcher an der Phasengrenzfläche 11 total reflektiert wird. Dadurch bildet sich über der Oberfläche 3 ein Evaneszenzfeld 13 aus, in dem sich im wesentlichen nur an die Oberfläche im Komplex 9 gebundenes Fluorophor befindet. Im Gegensatz zur schematischen Darstellung in Figur 1 erstreckt sich das Evaneszenzfeld üblicherweise nicht über die gesamte Breite des Küvettenbodens. Beispielsweise kann das Evaneszenzfeld eine Ausdehnung von etwa 1 mm2 aufweisen. Durch die Anregung der Fluorophore durch das Evaneszenzfeld 13 emittieren die auf der Oberfläche gebundenen Fluorophore Photonen 14, welche beispielsweise mittels eines Photomultipliers 15 verstärkt und gemessen werden können. Die Fluoreszenz des Volumens 16 wird im wesentlichen durch die Anwesenheit des Farbstoffs 6 unterdrückt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die zu bestimmende Substanz selbst (im wesentlichen) keine oder nur geπnge Affinität zu dem Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche auf. In diesem Fall enthält beispielsweise die mit der Oberfläche in Kontakt zu bringende Lösung eine weitere Verbindung, welche einen Reaktionspartner R2 und eine Bindungsstelle zu der zu bestimmenden Substanz umfaßt. Der Reaktionspartner R2 kann an den Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche binden und fixiert die zu bestimmende Substanz so indirekt an der Oberfläche. Diese weitere Verbindung dient somit als Brückenglied zwischen der zu bestimmenden Substanz und dem Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche. Beispielsweise kann als Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche Avidin vorliegen. Die weitere Verbindung umfaßt dann neben einer Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz beispielsweise Biotin, welches an das auf der Oberfläche gebundene Avidin binden kann. Diese Ausführungform hat beispielsweise den Vorteil, daß eine mit Avidin beschichtete Oberfläche im Gegensatz zu manchen Antikörpern und Antigenen lyophilisiert werden kann und getrocknet oder lyophilisiert sehr stabil ist. Außerdem weist das System Avidin/Biotin eine sehr hohe Dissoziationskonstante KD auf. Weiterhin ist es so möglich, für eine Reihe von verschiedenen Bestimmungen immer eine Avidin-beschichtete Oberfläche vorzulegen und nur die weitere Verbindung, welche mit der Lösung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird, auf die zu bestimmende Substanz abzustimmen.
Figur 2 zeigt schematisch diese Ausführunsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. In der mit der Oberfläche in Kontakt gebrachten Lösung liegen nebeneinander die zu bestimmende Substanz 20, ein Farbstoff 22, eine Fluorophor-haltige Verbindung 24 und eine weitere Verbindung 26 vor. Auf der Oberfläche ist der Reaktionspartner R1 28 gebunden. Die weitere Verbindung und die Fluorophor-haltige Verbindung lagern sich an die zu bestimmende Substanz an (Konjugat 30), und es erfolgt eine Bindung des Konjugats 30 über den in der weiteren Verbindung 26 vorliegenden Reaktionspartner R2 an den auf der Oberfläche vorliegenden Reaktionspartner R1 28 zu dem Komplex 32. So wird der Komplex 32, welcher die Fluorophor-haltige Verbindung 24 enthält, an die Oberfläche gebunden und kann durch Messung der Fluoreszenz im Evaneszenzfeld 34 bestimmt werden.
Für diese Ausführungform des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich beispielsweise neben dem System Avidin(oder Streptavidin)/Biotin alle Liganden bzw. Liganden-bindende Systeme, in welchen beispielsweise Proteine selektive und/oder spezifische Bindungsstellen für einen oder mehrere Liganden, wie beispielsweise Histidin, Histidintags, Lectine, und/oder Digoxigenin, aufweisen, und natürlich Antigen/Antikörper-Systeme.
Die mit der Oberfläche zu kontaktierende Lösung enthält erfindungsgemäß weiterhin mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung. Erfindungsgemäß wird unter einem Fluorophor eine fluoreszierende Verbindung, wie ein Fluoreszenzfarbstoff, verstanden. Bevorzugt sind fluoreszierende Proteine und/oder niedermolekulare fluoreszierende chemische Verbindungen. Als fluoreszierende Proteine können erfindungsgemäß Phycobiliproteine, wie Allophycocyanin (APC), Cryptofluor Crimson oder Cryptofluor Red, verwendet werden. Als niedermolekulare fluoreszierende Verbindungen können beispiels-
9 weise Cy5 oder BODIPY (4,4-Diluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indazen-Fluorophore) genannt werden. Bevorzugt sind Fluoreszenzfarbstoffe mit einer Absorption im Bereich von 600 bis 700 nm.
Weiterhin kann anstelle eines Fluorophors eine Fluorophorvorläuferverbindung verwendet werden, aus welcher vor dem Meßvorgang, beispielsweise durch Änderung des pH-Werts oder durch Abspalten einer Schutzgruppe, das Fluorophor freigesetzt wird.
Erfindungsgemäß umfaßt der Begriff Fluorophor auch phosphoreszierende Verbindungen. Wird eine solche phosphoreszierende Verbindung als Fluorophor verwendet, so wird die ausgestrahlte Phosphoreszenz bestimmt, welche zeitlich verschoben zur Anregung stattfindet. Somit ist es möglich, den Zeitraum des Einstrahlens von dem Zeitraum des Messens zeitlich zu trennen.
Weiterhin weist diese Fluorophor-haltige Verbindung eine Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz auf. Beispielsweise kann das Fluorophor an einen Antikörper gebunden vorliegen. Dieser Fluorophor-haltige Antikörper kann vorzugsweise in einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit der zu bestimmenden Substanz, beispielsweise einem Protein, als Antigen reagieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt die zu bestimmende Substanz selbst als Fluorophor-haltige Verbindung vor. Gemäß dieser Ausführungsform können Kompetitions-Assays durchgeführt werden, welche sich insbesondere durch eine geringe Nachweisgrenze auszeichnen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die verschiedensten Substanzen nachgewiesen werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren zur Bestimmung biologisch aktiver Substanzen, wie Hormonen, Proteinen wie Antigenen, Antikörpern oder Haptenen, Pharmazeutika, Viren, Bakterien usw.. Das Verfahren kann aber auch zum Nachweis von Umweltgiften, Toxinen, usw., dienen.
Besonders bevorzugt werden die zu bestimmenden Substanzen durch immunologische Reaktionen nachgewiesen.
3 Erfindungsgemäß bildet sich ein Komplex aus mindestens dem ersten Reaktionspartner R1, der zu bestimmenden Substanz und der Fluorophor-haltigen Verbindung auf der Oberfläche aus. Es ist dann möglich, das an die Oberfläche gebundene Fluorophor durch durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle anzuregen und die Fluoreszenz des Fluorophors zu messen.
Bei der Anregung des auf der Oberfläche gebundenen Fluorophors durch ein Evaneszenzfeld wird ein Lichtstrahl in einem derartigen Winkel auf die Unterseite der Oberfläche gerichtet, daß an der Phasengrenzfläche Küvette/Lösung Totalreflektion auftritt. Dadurch bildet sich ein Evaneszenzfeld oberhalb der Oberfläche in der Lösung aus, welches bis zu mehrere hundert Nanometer in die Flüssigkeit eindringen kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Einfallswinkel von mindestens 60° bis 90° bevorzugt, so daß sich ein Evaneszenzfeld in einer Höhe bis zu 400 nm, vorzugsweise 200 nm, besonders bevorzugt 50 bis 150 nm, über der Oberfläche ausbildet. Innerhalb dieses Evaneszenzfelds vermag das eingestrahlte Licht geeignete Fluorophore anzuregen. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird beispielsweise mit einem Photomultiplier verstärkt und ausgewertet.
Da nur das an die Oberfläche gebundene Fluorophor im Evaneszenzfeld liegt, wird nur dieses gebundene Fluorophor optimal angeregt und emittiert Photonen. Nicht gebundene Fluorophor-haltige Verbindung in der Lösung befindet sich nicht im Bereich des Evaneszenzfelds, wird deshalb im wesentlichen nicht angeregt und emittiert im wesentlichen auch keine Photonen. Diese Anordnung erlaubt somit die quantitative Bestimmung von an die Oberfläche gebundenem Fluorophor in Anwesenheit von Fluorophor in der überstehenden Lösung ohne einen vorhergehenden Separations- und/oder Waschschritt.
Als Lichtquelle kann monochromatisches Licht verwendet werden. Dabei sollte
Licht einer Wellenlänge verwendet werden, welche vorzugsweise nicht mit der
Emission des Fluorophors interferiert und welche sich vorzugsweise mit der
Absorptionsbande des Farbstoffs überschneidet. Als Lichtquelle ist ein Laser besonders bevorzugt, insbesondere Laser, welche Licht einer Wellenlänge von
40 mindestens 635 nm emittieren. Insbesondere, wenn es sich bei der zu untersuchenden Lösung um Serum handelt, sind Wellenlängen von 600 bis 700 nm bevorzugt, da die Eigenfluoreszenz von Serum bei etwa 580 nm liegt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zunahme des an die Oberfläche gebundenen Fluorophors mit zeitlich fortschreitender Reaktion direkt gemessen werden (in real-time). Da die Menge des an die Oberfläche gebundenen Fluorophors direkt proportional zur ursprünglich vorhandenen Menge Fluorophor-haltiger Verbindung ist, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die quantitative Bestimmung von in der Lösung befindlichen Reaktanden in Echtzeit ohne zusätzliche weitere Wasch- und/oder Pipettierschritte.
Da die Absorptionskoeffizienten und die Emissionseigenschaften für Fluorophore sehr günstig sind, ergeben sich geringe Nachweisgrenzen. Bereits nach einigen Minuten kann man Reaktionen qualitativ und/oder quantitativ auswerten.
Probleme bereitet jedoch die nicht ideale Streuung des Lichtstrahls in der Küvette, selbst wenn physikalische Maßnahmen zur Reduktion des Streulichts vor- genommen werden. Durch Streuung gelangt Licht auch in das Volumen der Küvette und verursacht dort eine Hintergrundfluoreszenz. Unter "Volumen" wird erfindungsgemäß die sich außerhalb des Evaneszenzfelds befindende Flüssigkeit verstanden, welche nicht-gebundene Fluorophor-haltige Verbindungen enthält. Ferner kann sowohl in Kunststoff- wie auch von Glasküvetten die Polarisation des Lichtstrahls gedreht werden. Dies führt insbesondere zu Reflektionen des Anregungslichts bei der Auskopplung. Es entsteht sog. vagabundierendes Licht, das gemeinsam mit Volumen- und Oberflächenstreueffekten zu einer Volumenanregung führen kann.
Erfindungsgemäß kann eine Anregung des sich im Volumen befindenden Fluorophors unterbunden werden, wenn der mit der Oberfläche zu kontaktierenden Lösung mindestens ein Farbstoff zugegeben wird, welcher eine Absorption im Absorptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors aufweist. Ein Vergleich der Eindringtiefen von evaneszenter Welle und von vagabundierendem Licht zeigt, daß die Unterdrückung der Volumenanregung durch Zugeben eines Farbstoffs gelingt. Physikalisch wird die Lichtabsorption durch das Lambert- Beer'sche Gesetz beschrieben, wobei die Intensität des Lichts logarithmisch mit der Entfernung durch Absorption abnimmt:
l[x] = loExp(-αcx)
wobei l0 die Intensität des in das absorbierende Medium einfallenden Lichts, I die Intensität des aus dem absorbierenden Medium austretenden Lichts, x die Dicke des absorbierenden Mediums (Schichtdicke), α der Absorptionskoeffizient und c die Konzentration eines sich Lösung befindenden Farbstoffes sind. Figur 3 zeigt den Intensitätsverlauf einer Lösung eines Absorberfarbstoffs mit zunehmender
Schichtdicke, wobei der Verlauf der Intensität für = 100.000 Mol/(l x cm) und c = 20 mMol bis zu einer Tiefe von 1 mm dargestellt ist. Es ist zu erkennen, daß auf dieser Strecke das Streulicht auf 1/100 seiner Anfangsintensität abgeschwächt wird. Da das Streulicht überwiegend seitlich eingekoppelt wird, genügt diese
Abschwächung, um das Volumensignal und damit auch die Meßunsicherheit für das zeitabhängige Signal der Reaktionskinetik, dem dieses Signal überlagert ist, in praktisch nutzbaren Grenzen zu halten.
Figur 4 zeigt einen Vergleich der Eindringtiefen der evaneszenten Welle mit der Eindringtiefe des Lichts bei Absorption durch einen Farbstoff. Die doppelt logarithmische Darstellung zeigt den Intensitätsverlauf in Abhängigkeit von der Eindringtiefe einer evaneszenten Welle (links) und einer durch Absorption abgeschwächten Welle (rechts). Die Ordinate liegt im Bereich von -2 bis 0, d.h. von 1/100 bis 1 Iog10 Intensität. Die dabei zugrunde gelegten Parameter entsprechen technisch realisierbaren Werten. Obwohl die Dämpfung des vagabundierenden Lichts wesentlich größere Eindringtiefen als das Licht der evaneszenten Welle zuläßt, kann eine Volumenanregung und/oder -emission trotzdem effizient und im wesentlichen quantitativ unterdrückt werden, wie in den Beispielen gezeigt werden wird.
Ausschlaggebend für die Wirksamkeit der Unterdrückung ist der geometrische Abstand zwischen demjenigen Oberflächenteil der Küvette, von dem Licht auf den Detektor gelangen kann, und den Eindringorten des vagabundierenden Lichts in das Volumen.
Wie aus Figur 4 deutlich wird, genügt für eine Streulichtabschwächung von zwei Größenordnungen ein Abstand im Bereich von einem Millimeter. Dieser Abstand kann durch eine entsprechende Küvettendimensionierung einfach eingehalten werden.
Die Absorption des dem Volumen zugegebenen Farbstoffs ist erfindungsgemäß auf den Absorptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors absgestimmt. Es kann ein einzelner Farbstoff oder auch eine Mischung von Farbstoffen verwendet werden. Der Absorptionsbereich des Fluorophors wird in der Regel mit der Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle korrelieren. Dabei ist es nicht notwendig, daß der Farbstoff ein Absorptionsmaximum in diesem Spektralbereich aufweist, es kann bereits eine Schulter im Absorptionsspektrum ausreichen. Werden beispielsweise Fluorophore wie APC oder Cy5 verwendet, kann der verwendete Farbstoff eine Absorption zwischen 600 nm und 700 nm aufweisen, wie beispielsweise Brilliantblau (Brillant-Blue FCF). Die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs ist abhängig vom Absorptionskoeffizienten des jeweiligen Farbstoffs in Lösung und hängt zusätzlich von der Frequenz des eingestrahlten Lichts ab. Die Konzentration des Farbstoffs kann je nach Farbstoff so eingestellt werden, daß das eindringende Licht innerhalb von 1 mm oberhalb der Oberfläche im wesentlichen absorbiert werden kann. Zur Bestimmung der jeweils optimalen Konzentration des Farbstoffs werden zunächst die Volumenfluoreszenz und die Fluoreszens im Evaneszenzfeld, d.h. die Oberflächenfluoreszenz, jeweils bei verschiedenen Farbstoffkonzentrationen gemessen (vgl. Figur 6a). Anschließend wird das Verhältnis von Oberflächenfluoreszenz zur Volumenfluoreszenz gegen die Konzentration des Farbstoffs aufgetragen (vgl. Figur 6b). Das Maximum der Kurve 6b stellt die optimale Konzentration des Farbstoffes dar. Erfindungsgemäß wird unter dem „Signal/Rausch-Verhältnis" das Verhältnins der Oberflächenfluoreszenz („Signal") zur Volumenfluoreszenz („Rauschen") verstanden. „Im wesentlichen absorbiert" kann dabei eine Intensitätslöschung von 70 %, vorzugsweise 80 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 %, bedeuten.
^3 Beispielsweise kann bei Verwendung von Brilliantblau FCF als Farbstoff eine Konzentration von 0,04 mM ausreichen, um weit mehr als 95% der Volumenfluoreszenz zu löschen (vgl. Tabelle 4, Beispiel 4). Da die erforderliche Konzentration des Farbstoffs u.a. auch von der verwendeten Küvette, der Meßanordung usw. abhängt, können auch noch geringere Farbstoffkonzentrationen für ein ausreichendes Signal/Rausch-Verhältnis genügen. Demgemäß beträgt beispielsweise die Konzentration von Brilliantblau FCF vorzugsweise mindestens 0,001 mM.
Vergleichsversuche, wie in Figur 6a und 6b dargestellt, haben gezeigt, daß das Signal/Rausch-Verhältnis von 1 ,3 : 1 auf bis zu 18,5 : 1 bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verbessert werden konnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Küvette bzw. eine Mikrotiterplatte zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Küvette umfaßt vorzugsweise Glas oder einen Kunststoff, besonders bevorzugt einen Kunststoff, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polycycloolefin, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat und/oder Mischungen oder Blends dieser Kunststoffe. Es ist prinzipiell jeder Kunststoff geeignet, welcher im wesentlichen kein Licht im sichtbaren Bereich absorbiert. Gemäß einer Ausführungsfom kann der Kunststoff auch beispielsweise leicht bläulich eingefärbt sein, um eine durch Streulicht verursachte Emission herauszufiltem. Kunststoff küvetten können kostengünstig durch Spritzgießen erhalten werden und weisen vorzugsweise ein Reaktionsvolumen von 1 bis 400 μl, besonders bevorzugt 5 bis 200 μl, auf. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Küvetten oder Mikrotiterplatten einstückig ausgebildet. Es kann sich weiterhin als vorteilhaft ausweisen, wenn die Innenseite und/oder die Emissionsfläche, d.h. die Fläche aus der der emittierte Strahl aus der Küvette austritt, auf eine Oberflächenrauhigkeit von vorzugsweise höchstens 10 nm poliert ist/sind.
Die kleine Dimension und der niedrige Preis machen einen Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Routinediagnostik und -analytik realisierbar. In der praktischen Anwendung kann eine derartige Küvette oder Mikrotiterplatte bereits vorpräpariert und durch ein Spezialettiket verschlossen im Handel vertrieben werden. Die Vorpräparation umfaßt dabei das Beschichten der Oberfläche der Küvette oder Mikrotiterplatte mit dem ersten Reaktionspartner und gegebenenfalls das anschließende Blocken der nichtbeschichteten Stellen. Besonders bevorzugt liegt die beschichtete Küvette oder Mikrotiterplatte lyophilisiert oder getrocknet vor. Es können/kann auch bereits der mindestens eine Farbstoff und/oder die mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung und/oder die weitere Verbindung in der abgeschlossenen Küvette oder Mikrotiterplatte lyophilisiert und/oder getrocknet vorliegen, so daß zur Messung nur noch die zu untersuchende Substanz in Lösung zugegeben werden muß. Durch Versehen der Küvette oder Mikrotiterplatte mit einer Seriennummer kann jederzeit eine eindeutige Zuordnung der Erstellungscharge, der Nachweisreaktion und der Probe möglich sein.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung eine Lösung, welche mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung und/oder mindestens einen Farbstoff, welcher im Absortptions- und/oder Emissionsbereich des Fluorophors absorbiert, umfaßt. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Lösung gegebenenfalls eine weitere Verbindung enthalten, welche mindestens eine Bindungsstelle zu der zu bestimmenden Substanz aufweist und welche den Reaktionspartner R2 umfaßt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Kit, welches eine wie vorstehend beschriebene vorpräparierte Küvette oder Mikrotiterplatte und/oder Lösungen des mindestens einen Farbstoffs und der mindestens einen Fluorophor-haltigen Verbindung und gegebenfalls der weiteren Verbindung, welche mindestens eine Bindungsstelle zu der zu bestimmenden Substanz aufweist und welche den Reaktionspartner R2 umfaßt, enthalten kann. Der mindestens eine Farbstoff und die mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung können zusammmen in einer Lösung, sowie in zwei getrennten Lösungen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Reaktionskinetiken vorzugsweise immunologischer Reaktionen, sowie die Verwendung des Verfahrens in der medizinischen oder veterinärmedizinischen Diagnostik, der Lebensmittelanalytik, der Umweltanalytik oder der Analytik von Fermentationsprozessen. Als Beispiele für konkrete Anwendungen können der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln, wie Atrazin, in Trinkwasser, der Nachweis von Hormonen in Kalbfleisch, der Nachweis von Hormonen, wie HCG, sowie der direkte oder indirekte Nachweis von Viren, wie Hepatitis S und HIV, genannt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden durch Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird der Einfluß der Konzentration des zugegebenen, an ein Protein gebundenen Fluorophors bestimmt. Bei dieser Messung ist nur an der Oberfläche gebundenes Fluorophor vorhanden, nichtgebundenes Fluorophor wurde weggewaschen. Ein Farbstoff wurde der Lösung nicht zugesetzt.
a) Beschichten einer Oberfläche einer Küvette mit CACMAK
Die Oberfläche einer Küvette wurde beschichtet, indem 200 μl Mouse IgGI, monoklonaler Antikörper Ad -20.4-2. (CACMAK; Fa. Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany) 5 μg/ml in PBS+ (PBS+ = 100 mM PO4, pH 7,5; 100 mM NaCI) bei Raumtemperatur (RT) über Nacht (ON) auf der Oberfläche belassen wurde. Dann wurde die Oberfläche viermal mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und mit 1 % BSA (Bovine Serum Albumine) Miles Enhanced, PBS+, 300 μl, für eine Stunde bei RT behandelt.
b) Kontaktieren der Oberfläche mit dem zu bestimmenden Protein
GAMAPC (Konjugat aus Allophycocyanin (APC) und Crosslinked, Goat Anti- Mouse IgG (H+L); Molecular Probes, Leiden, Netherlands) in PBS+T (PBS+T = 100 mM PO4, pH 7,5; 100 mM NaCI, 0,025v/v Tween20) wurde über Nacht bei RT auf der Oberfläche belassen. Anschließend wurde fünfmal mit PBS gewaschen, und es wurden 200μl PBS+T zugegeben und die Fluoreszenz mittels der Evaneszenzfeldmethode gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. /6 Tabelle 1
Figure imgf000019_0001
Es wurde demnach eine von der Konzentration des auf der Oberfläche gebundenen Fluorophors APC abhängige Emission von Photonen festgestellt.
Beispiel 2
Endpunktreaktion mit Waschen des Chips und Messen der Fluoreszenz. Es ist nur gebundenes Fluorophor bei der Messung vorhanden.
a) Beschichten einer Oberfläche einer Küvette
Die Oberfläche von Küvenetten wurde beschichtet, indem 200 μl Humanserum 1 :1000 in PBS+ bei Raumtemperatut (RT) über Nacht auf der Oberfläche belas- sen wurden. Dann wurde die Oberfläche viermal mit PBS gwaschen und mit 1 % BSA (Bovine Serum Albumine) Miles enhanced, PBS+, 300 μl, für eine Stunde bei RT behandelt.
b) Kontaktieren der Oberfläche mit dem zu bestimmenden Protein
Anti-Human-lgG-Cy5-Konjugat (amersham pharmacia biotech, Dübendorf, Schweiz) in PBS+T wurde über Nacht bei RT auf der Oberfläche belassen. Anschließend wurde fünfmal mit PBS gewaschen, und es wurden 200 μl PBS+T zugegeben und die Fluoreszenz gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Figure imgf000020_0001
Wiederum konnte eine von der Konzentration des gebundenen Fluorophors Cy5 abhängige Emission von Photonen gemessen werden.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde die Wirksamkeit verschiedener Farbstoffe zur Vermin- derung der Volumenabsorption untersucht. Die Oberfläche der Küvette war in diesem Beispiel nicht beschichtet, es wurde nur die Reduzierung der Fluoreszenz des in Lösung befindlichen Konjugats aus Protein und Fluorophor bestimmt. Die Fluorophore im Volumen der Reaktionslösung werden durch die geringen Mengen Streulicht angeregt und fluoreszieren. Die Absorptionsspektren der verwendeten Farbstoffe sind in Fig. 5 gezeigt.
GAMAPC 10 μg/ml in PBS+T wird mit verschiedenen Farbstoffen gemischt und die Fluoreszenz durch die Volumenanregung gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.
AS Tabelle 3
Figure imgf000021_0001
Anmerkungen:
1) Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH
2) Amaranth, Fluka, Buchs, CH
3) Supercook Food Colourings, Supercook, Leeds, GB
Es wurde somit festegestellt, daß bei der Verwendung von APC als Fluorophor Farbstoffe oder Mischungen davon, die zwischen 600 und 700 nm absorbieren, die Volumenfluoreszenz durch Absorption des einfallenden und/oder emittierten Lichts reduzieren.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Abhängikeit der Reduzierung der Volumenfluoreszenz von der Konzentration des Farbstoffs Brillantblau FCF (Brilliant-Blue FCF) bei Verwendung von APC als Fluorophor untersucht.
^3 a) Vorbereitung der Küvette
Die Küvette wird mit 1 % BSA Miles enhanced, in PBS+ 300 μl, eine Stunde bei RT blockiert.
b) Kontaktieren mit der das Fluorophor und den Farbstoff enthaltenden Lösung
GAMAPC (10 μg/ml) in PBS+T wird mit Brilliantblau FCF in verschiedenen Konzentrationen gemischt und die Fluoreszenz der Volumenanregung gemessen. Tabelle 4
Figure imgf000022_0001
Anmerkung: 4) Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH
Die Reduktion der Volumenanregung ist abhängig von der Konzentration des Farbstoffs Brilliantblau im Volumen. Bei Brilliantblau FCF sind bereits bei einer Konzentrationen von 0,04 mm und darüber weit mehr als 95% der Volumenfluoreszenz gelöscht.
*o Beispiel 5
In diesem Beispiel wird der Einfluß des Farbstoffs auf die Fluoreszenz der an der Oberfläche gebundenen Fluorophore untersucht. Endpunktreaktion mit Waschen der Oberfläche und Messen der Fluoreszenz. Es ist nur gebundenes Fluorophor bei der Messung vorhanden.
Eine wie in Beispiel 1a) preparierte Küvette wird mit GAMAPC in PBS+T über Nacht bei RT kontaktiert und anschließend fünfmal mit PBS gewaschen.
Nach Zugabe von 200 μl PBS+T, gemischt mit Brilliantblau FCF in verschiedenen Konzentrationen, wurde die an die Oberfläche der Küvette gebundene Fluoreszenz von GAMAPC 10 μg/ml in PBS+T und die Fluoreszenz durch Volumenanregung gemessen.
Tabelle 5
Figure imgf000023_0001
Anmerkung: 5) Brilliant-Blue FCF (Erioglaucine A), Fluka, Buchs, CH
SA Es wurde eine von der Konzentration des Farbstoffs im Volumen abhängige Reduktion der Evaneszenzfeldanregung des gebundenen APC festgestellt. Bei Brilliantblau-Konzentrationen von 0,04 mM sind etwa 35% der gebundenen Fluoreszenz gelöscht, d.h. die Reduktion der gebundenen Fluoreszenz ist wesentlich geringer als die Reduktion der Fluoreszenz durch Volumenanregung, wo mehr als 95% der Fluoreszenz durch die Farbstoffzugabe in der gleichen Konzentration gelöscht wurden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt, daß die Emission der Fluorophore, welche an der Oberfläche gebunden sind, durch die zugegebene Menge Farbstoff nicht wesentlich inhibiert wird, während die Volmenanregung stark reduziert ist. Daraus folgt ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis und deshalb niedrigere Nachweisgrenzen. Eine wie bei Beispiel 1a) preparierte Küvette wird mit GAMAPC in PBS+T über Nacht bei RT kontaktiert und anschließend fünfmal mit PBS gewaschen. Dann wurde wie in Beispiel 1 b) GAMAPC in PBS+T über Nacht bei RT auf der Ober- fläche belassen. Anschließend wurde fünfmal mit PBS gewaschen.
Die so präparierten Küvetten wurden den folgenden, verschiedenen Fluoreszenzmessungen unterworfen:
(1 ) Nach Zugabe von PBS+T (nur gebundenes Fluorophor)
(2) Nach Zugabe von APC (10 μg/ml in PBS+T) (gebundenes Fluorophor + Fluorophor im Volumen, aber ohne Farbstoff)
(3) Nach Zugabe von APC 10 μg/ml und Brilliantblau FCF (BB FCF) (0,25 mM in PBS+T) (gebundenes Fluorophor + Fluorophor im Volumen + Farbstoff)
21 Tabelle 6
Figure imgf000025_0001
Tabelle 7
Figure imgf000025_0002
Anmerkungen:
6) Signal/Rausch-Verhältnis = Verhältnis der Oberflächenemission („Signal") zur Volumenemission („Rauschen")
7) Rauschen = Chip M1 - negative Reaktion (negative Kontrolle)
Ergebnisse:
1. Abnehmende Konzentrationsreihe GAMAPC von M2 nach M6. Die negative Kontrolle M1 weist eine Emission in Höhe von 3.000 counts/s auf. 2. Ohne die Zugabe eines Farbstoffs, d.h. mit nicht gelöschter APC-
Anregung im Volumen, ist keine eindeutige abnehmende Konzentrationsreihe von M2 nach M6 erkennbar. Vor allem geringe Werte verschwinden im Hintergrund der Volumenanregung. 3. Mit Brilliantblau FCF im Volumen ist die abnehmende Konzentrationsreihe
M2 nach M6 deutlich erkennbar. Die negative Kontrolle M1 weist 5.000 counts/s auf. Durch Brilliantblau FCF reduziert sich die Emission des Volumens durch APC von 230.000 counts/s M1 auf 5.000 counts/s.
Die spezifische oberfächengebundene Fluoreszenz ist um etwa 50% reduziert. Das Signal/Rausch-Verhältnis ist bei Zugabe von Brilliantblau FCF wesentlich verbessert.
Beispiel 7
In diesem Beispiel wurden Reaktionskinetiken der Anlagerung eines fluorophor- markierten Proteins an einen auf der Oberfläche der Küvette gebundenen Reaktionspartner gemessen.
In eine wie in Beispiel 1a) preparierte Küvette wurden GAMAPC in PBS+T zugegeben, und die Fluoreszenz wurde in Abhängigkeit von der Zeit gemessen.
Fig. 7 zeigt die Änderung der Emission gegen die Zeit. Die Zugabe von GAMAPC erfolgte bei T = 100 s. Es wird eine Zunahme der Emission (Fluoreszenzcounts) mit der Reaktionszeit beobachtet, welche der Anlagerung des Fluorophor- markierten Proteins an den auf der Oberfläche gebundenen Reaktionspartner entspricht.
Zum Vergleich wurde die Änderung der Emission mit der Zeit bei einer Probe gemessen, bei der die Oberfläche der Küvette nicht mit gemäß Beispiel 1 a) mit Mouse-1gG beschichtet war (vgl. Fig. 8). Die Emission nahm mit der Zeit nicht zu, sondern blieb stabil.
2H

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von Substanzen, umfassend die Schritte
Bereitstellen einer Oberfläche, welche mindestens einen Reaktionspartner R1 für einen Reaktionspartner R2 an der Oberfläche gebunden umfaßt, - Kontaktieren der Oberfläche mit einer Lösung, welche mindestens die zu bestimmende Substanz, mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung und mindestens einen Farbstoff, welcher im Absorptionsund/oder Emissionsbereich des Fluorophors absorbiert, umfaßt, worin sich an dem Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche mittels des Reaktionspartners R2 ein Komplex ausbildet und worin dieser Komplex neben dem Reaktionspartner R1 mindestens die zu bestimmenden Substanz und die mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung umfaßt, und Anregen des auf der Oberfläche gebundenen Fluorophors durch das Evaneszenzfeld einer Lichtquelle und Messen der erzeugten
Fluoreszenz.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , worin die zu bestimmende Substanz als Reaktionspartner R2 an den Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der an der Oberfläche gebundene Reaktionspartner R1 ein Antigen oder ein Antikörper ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , worin eine weitere Verbindung, welche eine Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz aufweist und einen
Reaktionspartner R2 enthält, an den Reaktionspartner R1 auf der Oberfläche bindet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Reaktionspartner R1 Avidin oder Streptavidin umfaßt und der Reaktionspartner R2 Biotin und eine Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz umfaßt.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die zu bestimmende Substanz eine biologisch aktive Substanz umfaßt, welche aus der Gruppe Hormone, Proteine, Viren, Bakterien, Pharmazeutika und Toxine ausgewählt ist.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die zu bestimmende Substanz ein Protein, vorzugsweise ein Antigen oder einen Antikörper, umfaßt.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Fluorophor-haltige Verbindung eine fluoreszierende Verbindung und eine Bindungsstelle für die zu bestimmende Substanz aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin als Fluorophor fluoreszierende Proteine und/oder niedermolekulare fluoreszierende chemische Verbindungen verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin als fluoreszierende Proteine Phycobiliproteine, wie Allophycocyanin (APC), Cryptofluor Crimson oder Cryptofluor Red, verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspuch 9, worin als niedermolekulare fluoreszierende Verbindungen Cy5 oder BODIPY verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin mindestens ein Fluorophor verwendet wird, welcher in einem Wellenlängenbereich von 600 bis 700 nm absorbiert.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin mindestens eine phosphoreszierende Verbindung als Fluorophor verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin eine Mischung von Farbstoffen verwendet wird, welche im Absorptions- und/oder Emmisionsbereich des Fluorophors absorbieren.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprpüche, worin mindestens ein Farbstoff verwendet wird, welcher in einem Wellenlängenbereich von 600 bis 700 nm absorbiert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin als der mindestens eine Farbstoff Brilliantblau FCF in einer Konzentration von mindestens 0,001 mM verwendet wird.
17. Küvette oder Mikrotiterplatte zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, welche mindestens einen Reaktionspartner für die zu bestimmende Substanz an einer Oberfläche gebunden umfaßt.
18. Küvette oder Mikrotiterplatte nach Anspruch 17, wobei der mindestens eine Reaktionspartner R1 in lyophilisierter Form vorliegt.
19. Küvette oder Mikrotiterplatte nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Küvette einen Kunststoff, vorzugsweise Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Polyacrylnitril, Polymethylmehtacrylat, Polycycloolefin, Polyethylentereph- thalat und/oder Mischungen derselben umfaßt.
20. Küvette oder Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Küvette oder Mikrotiterplatte einteilig ist.
21. Küvette nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Küvette ein Reaktionsvolumen von 1 bis 400 μl aufweist.
22. Lösung, enthaltend mindestens eine Fluorophor-haltige Verbindung, mindestens einen Farbstoff und gegebenenfalls einen Reaktionspartner R2 zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
23. Kit zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend mindestens eine Küvette oder Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , und/oder mindestens eine Lösung nach Anspruch
22.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, zur Bestimmung von Reaktionskinetiken immunologischer Reaktionen.
25. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in der medizinischen oder veterinärmedizinischen Diagnostik, der Lebensmittelanalytik, der Umweltanalytik oder der Analytik von Fermentationsprozessen.
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