DE69719939T2

DE69719939T2 - Verfahren und Vorrichtung für Immunotest unter Verwendung von fluoreszensinduzierter Oberflächen-plasmonresonanz

Info

Publication number: DE69719939T2
Application number: DE69719939T
Authority: DE
Inventors: Jinn-Nan Lin; Christopher J. Wilson
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Current assignee: Siemens Medical Solutions Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1996-12-30
Filing date: 1997-12-23
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: DE69719939D1; EP0851230B1; JP3100360B2; AU4923297A; AU698376B2; EP0851230A1; US5776785A; JPH10311831A; ATE235055T1

Description

Diese Erfindung betrifft Techniken zum Sammeln von Strahlung aus Abtastvorrichtungen, die auf dem Phänomen der Oberflächen-Plasmonresonanz basieren, und Mittel zur Verbesserung derartiger Techniken. Sie betrifft ferner die Anwendung solcher Techniken auf den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von chemischen oder biochemischen Analytika in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung Techniken zur Verbesserung der Empfindlichkeit der Analyse auf chemische oder biochemische Analytika und eine Vorrichtung, die zur Durchführung dieser Techniken benötigt wird.
Die erfindungsgemäß verwendete Analysetechnik nutzt die Affinität zwischen dem in dem Analyse zu bewertenden Analyten (nachfolgend als "Ligand" bezeichnet) und einer Substanz, die sich spezifisch an den Liganden bindet (nachfolgend als "spezifischer Bindungspartner bezeichnet"). Immunanalysen auf Basis der Antigen/Antikörper-Affinitätswechselwirkungen sind ein übliches Beispiel. Solche Techniken sind im Stand der Technik wohl bekannt und können in zwei Kategorien eingeordnet werden: (1) heterogene Analysen, bei denen eine physikalische Trennung des freien von dem gebundenen Analyten erforderlich ist, typischerweise zum Abtrennen von freiem Liganden und/oder spezifischem Bindungspartner von demjenigen, der an die Oberfläche einer Festphase gebunden ist, und (2) homogene Analysen, bei denen keine physikalische Wäsche erforderlich ist. In den meisten Fällen liefern homogene Analysen niedrigere Empfindlichkeit, benötigen in der Durchführung im Vergleich mit heterogenen Analysen jedoch weniger Zeit. Beide Klassifizierungen erfordern ein Nachweisverfahren, durch das Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner angezeigt werden können.
Es gibt viele unterschiedliche Abtasttechniken, von besonderer Relevanz für die vorliegende Erfindung sind jedoch jene, die Dämpfungswellen zum Nachweis immunochemischer Wechselwirkungen zwischen einem Liganden und seinem spezifischen Bindungspartner verwenden. Bei solchen Techniken findet die Wechselwirkung typischerweise an der Oberfläche einer Festphase statt, die Ligand und/oder spezifischen Bindungspartner enthält. Da Dämpfungswellen nur Wechselwirkungen nahe der Oberfläche nachweisen, wird die Trennung zwischen freiem Liganden und/oder spezifischem Bindungspartner von demjenigen, der an die Oberfläche gebunden ist, auf optischem Wege erreicht. Dies steht im Gegensatz zu der physikalischen Trennung von freiem von gebundenem Analyten, die in heterogenen Analysen erforderlich ist. Dies wirft auch ein Schlaglicht auf ein Motivationsziel hinter vielen zuvor beschriebenen Dämpfungswellentechniken: Das Erreichen der Empfindlichkeit einer heterogenen Analyse mit einer zeitsparenden homogenen Analyse. Eine Anzahl derartiger Techniken ist offenbart worden.
Zu den frühen Beispielen gehören Techniken, die innere Totalreflektion (TIR) verwenden, um Veränderungen der wechselwirkungsabhängigen Fluoreszenzintensität an der Oberfläche eines faseroptischen Wellenleiters (US-A- 4,582,809; US-A-5,061,857, US-A-4,880,752 und US-A-5,340,715) oder eines planaren Wellenleiters (US-A-4,775,637 und US-A-4,810,658, EP-A-0 170 376, erneut erteilte US-A-33064, US-A-5,344,784 und US-A-4,649,280) nachzuweisen. Bei diesen Techniken wird entweder der Ligand oder der spezifische Bindungspartner mit Fluoreszenzmaterial markiert. Der Wellenleiter dient als Festphase. Erregungslicht, das sich in den Wellenleitern ausbreitet, erfährt mehrere innere Totalreflektionen, wodurch Dämpfungswellen erzeugt werden, die sich von der Festphasenoberfläche eine kleine Distanz in die Flüssigphase hinein erstrecken. Der Fluoreszenzindikator jedes Liganden oder spezifischen Bindungspartners, der an die Oberfläche gebunden ist, wird durch die Dämpfungswellen angeregt und emittiert Licht mit einer Frequenz, die sich von derjenigen des Erregungslichts unterscheidet. Die Menge oder Rate der Änderung der Fluoreszenzemission infolge der Wechselwirkung zwischen Ligand/spezifischem Bindungspartner an der Oberfläche wird analysiert, um die Ligandkonzentration zu bestimmen. Obwohl diese frühen Techniken verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich mit konventionellen homogenen Analysen liefern können, liegt die Empfindlichkeit noch unter derjenigen von heterogenen Analysen und reicht nicht aus, um besonders niedrige Analytikumkonzentrationen zu messen.
In den vergangenen Jahren sind verbesserte Analysetechniken offenbart worden, die Oberflächen-Plasmonresonanz zur Erzeugung von Dämpfungswellen nahe der Oberfläche von Beugungsgittern verwenden (WO-A-88/07202, US-A-4,882,288, EP-A-0 346 016, EP-A-0 257 955, EP-BI-0 276 142 und US-A- 5,449,918). Ein dünner Metallfilm wird auf einer Seite des Gitters als Beschichtung aufgebracht, um als Festphase zu dienen. Erregungslicht in einem festgelegten Auftreffwinkel wird von der Gitterseite des Metallfilms reflektiert, wodurch eine Dämpfungswelle erzeugt wird, die sich von der entgegengesetzten Seite des Metallfilms eine geringe Distanz in die Flüssigphase hinein erstreckt. Die Wechselwirkung zwischen Ligand/spezifischem Bindungspartner wird durch eines von zwei Verfahren nachgewiesen, was von der verwendeten Technik und Ausführungsform abhängt. Ein Verfahren beinhaltet das Analysieren von Veränderungen der Eigenschaften des reflektierten Erregungslichts, die aus einer Änderung der Dämpfungswelle aufgrund von Komplexbildung auf der Festphasenoberfläche resultiert. Das andere Verfahren beinhaltet die Analyse der Eigenschaften einer Emission, die durch ein Fluoreszenzsubstrat induziert ist, das zum Markieren des Liganden verwendet wird, das zum Markieren des spezifischen Bindungspartners verwendet wird oder das auf der Festphasenoberfläche immobilisiert ist. Dieses letztere Verfahren liefert ein Beispiel für eine Klasse von Dämpfungswellentechniken, deren hier beschriebener Nachweismechanismus als Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz (SPRF) bezeichnet wird. Diese Techniken schließen ein Mittel zur Sammlung der fluoreszenzinduzierten Emission ein, das das Positionieren einer Lichtnachweisvorrichtung im Weg des Emissionslichtes innerhalb der Auftreffebene des Erregungslichts beinhaltet. Die geringe Winkeltrennung zwischen dem Weg des reflektierten Erregungslichts und dem des Emissionslichts innerhalb der Auftreffebene führt zu einem starken Hintergrundsignal der Lichtnachweisvorrichtung und einem niedrigen Verhältnis von Signal zu Rauschen. Daher ist die Empfindlichkeit der Analyse für diese Techniken noch schlechter als bei den meisten konventionellen heterogenen Analysen.
Mehrere Typen von Analysetechniken auf Basis von Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz sind in EP-BI-0 382 832, US-A-5,478,755 und WO- 90/01166 offenbart. Das Sammeln der fluoreszenzinduzierten Emission wird erreicht, indem eine Lichtnachweisvorrichtung in den Weg des Emissionslichts innerhalb einer Ebene positioniert wird, die sich im Wesentlichen in rechten Winkeln zu der Auftreffebene des Erregungslichts befindet. In einer solchen Anordnung ist das Hintergrundsignal infolge des Erregungslichts reduziert. Weiterhin werden eine Technik und Mittel offenbart, womit ein spezifischer Typ von Oberflächen-Plasmonresonanz, der als Weitbereichs-Oberflächen- Plasmonresonanz (LRSPR) bezeichnet wird, verwendet werden kann, um einen Anstieg des Verhältnisses der Feldintensität der Dämpfungswelle an der Grenzfläche von Festphase/Flüssigphase gegenüber derjenigen des Erregungslichts an der Auftrefffläche zu erreichen (dieses Verhältnis wird nachfolgend als "Grenzflächensteigerung" bezeichnet). Der Anstieg der Grenzflächensteigerung führt laut Beschreibung zu einem entsprechenden Anstieg der Intensität der fluoreszenzinduzierten Emission relativ zu derjenigen des Erregungslichts an der Auftreffoberfläche um einen Faktor von 10, verglichen mit konventioneller Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz. Dieses Verfahren hat zwei Nachteile hinsichtlich des Aufbaus einer praktischen Vorrichtung zur Durchführung von Analysen. Erstens ist der Bereich, in den der Auftreffwinkel des Erregungslichts fallen muss, grob gesagt eine Größenordnung kleiner als der Bereich von 0,5 Grad bei konventioneller Oberflächen- Plasmonresonanz. Ein solches Präzisionsniveau ist bei einem Instrument, das im Produktionsmaßstab hergestellt werden soll, schwierig zu erreichen. Zweitens sind typische erforderliche Metallfilmdicken sehr dünn, für Silber wird beispielsweise 15,5 nm offenbart, verglichen mit 54 nm für konventionelle Oberflächen-Plasmonresonanz (R. D. Olney und R. J. Romagnoli, Applied Optics 26: 2279 (1087). Selbst unter Verwendung von Dünnfilmbeschichtungstechniken des Standes der Technik ist die Herstellung eines derartigen Films, der im Produktionsmaßstab reproduzierbar sein soll, eine Herausforderung.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Verbesserung der Sammlung von fluoreszenzinduzierten Emissionen aus Abtastvorrichtungen, die das Phänomen der Oberflächen-Plasmonresonanz nutzen. Dadurch ist die Möglichkeit zur Durchführung einer Analyse mit der Bequemlichkeit einer konventionellen homogenen Analyse und einer Empfindlichkeit gegenüber Ligandenkonzentrationen gegeben, die vergleichbar mit oder besser als konventionelle heterogene Analysen ist.
Die Erfindung liefert somit ein Immunanalyse-Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytikums in einer Körperflüssigkeit, umfassend
(a) das Bereitstellen einer optischen Struktur, die in Folge (i) ein transparentes Festphasen-Substrat, das mit (ii) einem Metallfilm beschichtet ist, der die Oberflächen-Plasmonresonanz unterstützt, wobei (iii) ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum direkt oder indirekt auf dem Metallfilm immobilisiert wird;
(b) das In-Kontakt-Bringen des ersten spezifischen Bindungspartners mit der Körperflüssigkeit und einem Indikator, der einen Fluoreszenzindikator umfasst, welcher entweder mit dem (i) Analytikum oder einem immunologischen Analogon desselben oder (ii) mit einem zweiten spezifischen Bindungspartner für das Analytikum konjugiert;
(c) das Bestrahlen des Substrates mit Erregerstrahlung von solcher Wellenlänge, Polarität und einem Auftreffwinkel, die ausreichen, um die Oberflächen-Plasmonresonanz zu erzeugen und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von jeglichem spezifisch gebundenen Indikator zu induzieren;
(d) das Messen jeder Veränderung in der Rate oder der Menge der Fluoreszenzemission über eine vorgegebene Zeitspanne mit Hilfe eines Fluoreszenz- Sammlungsmittels, das im wesentlichen die gesamte Fluoreszenz in dem Emissionskegel aufnimmt, wobei das Mittel das Substrat umfasst, dessen Geometrie so beschaffen ist, dass es die Fluoreszenzemission entlang zweier Winkeldimensionen eines sphärischen Koordinatenraumes sammelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine Drehfläche von 360º mit einer Symmetrieachse umfasst, die senkrecht zur Substrat-/Film-Grenzfläche steht, wobei die Drehfläche sich auf jede Fläche bezieht, deren Verbindung mit einer senkrecht auf ihrer Symmetrieachse stehenden Ebene einen Kreis bildet, und
(e) das Bestimmen des Vorhandenseins beziehungsweise der Menge des Analytikums in der Körperflüssigkeit aus der gemessenen Veränderung der Rate oder Menge der fluoreszierenden Strahlung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren zur verbesserten Sammlung von Fluoreszenzemissionen in einer auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierenden Fluoreszenz-Immunanalyse, bei dem eine auf Analytikum zu testende Körperflüssigkeit mit einem ein geschichteten optischen System kontaktiert wird, wobei das System in Folge ein transparentes Substrat mit einer Grenzfläche zu einem Metallfilm zur Unterstützung einer Oberflächen-Plasmonresonanz, auf dem ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum immobilisiert ist, und einen Indikator umfasst, der einen Fluoreszenz-Indikator umfasst, der entweder mit dem Analytikum, einem immunologischen Analogon desselben oder einem zweiten spezifischen Bindungspartner für das Analytikum konjugiert; wobei das geschichtete optische System von der Substratseite mit Erregerstrahlung von einer Wellenlänge, einer Polarität und einem Auftreifwinkel bestrahlt wird, welche die Oberflächen-Plasmonresonanz erzeugt und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von spezifisch gebundenem Indikator induziert, auf diese Weise jede Veränderung in der Rate oder der Menge der Fluoreszenzemission über einen vorherbestimmten Zeitraum misst und die gemessene Veränderung in der Rate oder Menge der Fluoreszenzemission mit dem Vorhandensein beziehungsweise der Menge des Analytikums korreliert, wobei der Messschritt das Messen der Veränderung in der Rate oder der Menge der Fluoreszenzemission mit Hilfe eines Fluoreszenz-Sammlungsmittels umfasst, das im Wesentlichen die gesamte Fluoreszenz in dem Emissionskegel aufnimmt, wobei das Mittel das Substrat umfasst, welches eine Geometrie hat, dass es die Fluoreszenzemission entlang zweier Winkeldimensionen in einem sphärischen Koordinatenraum sammelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine 360º-Drehfläche mit einer Symmetrieachse umfasst, die senkrecht zur Substrat/Film-Grenzfläche steht, wobei die Drehfläche sich auf jegliche Fläche bezieht, deren Verbindung mit einer Ebene senkrecht zu ihrer Symmetrieachse einen Kreis bildet.
Die Erfindung liefert auch eine Oberflächen-Plasmonresonanzvorrichtung für die Fluoreszenz-Immunanalyse eines Analytikums in einer Probe, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst:
(a) eine optische Struktur, umfassend in Folge (i) ein transparentes Festphasensubstrat, beschichtet mit (ii) einem Metallfilm, der Oberflächen-Plasmonresonanz unterstützt, wobei (iii) ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum direkt oder indirekt auf dem Metallfilm immobilisiert ist, so dass ein Indikator, der einen Fluoreszenz-Indikator umfasst, der entweder mit (i) dem Analytikum oder einem immunologischen Analogon desselben oder (ii) mit einem zweiten spezifischen Bindungspartner für das Analytikum konjugiert ist, in einer Menge proportional zur Menge des Analytikums in der Probe nach Kontakt mit der optischer Struktur, der Probe und dem Indikator an die optische Struktur gebunden wird;
(b) eine Lichtquelle, die so angeordnet ist, dass sie die optische Struktur von der Substratseite mit Erregungsstrahlung einer Wellenlänge, Polarität und einem Auftreffwinkel bestrahlt, die ausreichen, um die Oberflächen-Plasmonresonanz zu erzeugen und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von jeglichem an die optische Struktur gebundenen Indikator zu induzieren;
(c) ein Fluoreszenz-Sammlungsmittel, das im Wesentlichen die gesamte Fluoreszenz im Emissionskegel auffängt, wobei das Mittel das Substrat umfasst, das eine Geometrie aufweist, die die Fluoreszenzemission entlang zweier. Winkeldimensionen in einem sphärischen Koordinatenraum sammelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine 360º-Drehfläche mit einer Symmetrieachse senkrecht zur Substrat/Film-Grenzfläche einschließt, wobei die Drehfläche sich auf jede Fläche bezieht, deren Verbindung mit einer Ebene rechtwinklig zur Symmetrieachse einen Kreis bildet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Substrat mit einem dünnen Film beschichtet, auf dem der spezifische Bindungspartner direkt oder indirekt immobilisiert ist. Der Film kann aus einer oder mehreren Schichten zusammengesetzt sein, von denen mindestens eine aus leitfähigem Material sein muss. Ein Lichtstrahl, der in das Substrat eintritt, trifft in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich auf die Substrat/Film- Grenzfläche auf, um Oberflächenplasmawellen (SPWs) über innere Totalreflektion anzuregen. Oberflächenplasmawellen weisen zugehörige Dämpfungswellen auf, die sich entlang der Film/Proben-Grenzfläche ausbreiten und deren Amplitude exponentiell in Richtung senkrecht zu der Grenzfläche abklingt. Da die Amplitude des Dämpfungsfelds diejenige des Auftrefffelds in Abhängigkeit von den für das optische Element verwendeten Materialien um einen Faktor von 10 bis 100 übertrifft, verstärkt das Dämpfungsfeld die Emission aus fluoreszierend markiertem Liganden, der an die Filmoberfläche gebunden ist. Der Fluoreszenzindikator emittiert Dämpfungswellen, die Oberflächenplasmawellen mit der Fluoreszenzemissionsfrequenz erzeugen. Diese strahlen wiederum Ausbreitungswellen (nachfolgend als "induzierte Emission" bezeichnet) durch den Film und in das Substrat hinein ab, die auf einen engen Winkelbereich in Bezug zu der Oberfläche begrenzt sind, der normalerweise durch die Oberflächenplasmawellendispersionsrelation für die beschriebene optische Struktur bestimmt wird. Da die durch den Fluoreszenzindikator induzierten Oberflächenplasmawellen keine bevorzugte Ausbreitungsrichtung entlang der Oberfläche haben, tritt die induzierte Emission als Strahlungskegel in dem Substrat aus. Ein weiterer Anstieg der Intensität der nachgewiesenen induzierten Emission wird erreicht, indem 360º-Azimutsammlung verwendet wird, um den gesamten Kegel aufzunehmen. Das nachgewiesene Signal wird dann analysiert, um die Ligandenkonzentration zu bestimmen. Das Verhältnis von Signal zu Rauschen wird weiter verbessert, indem das Sammeln des Lichts in der Auftreffebene ausgeschlossen wird, wodurch das Hintergrundsignal durch das auftreffende und reflektierte Lichts minimiert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt schematisch die Anordnung eines optischen Systems zur Erzeugung von Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz.
Fig. 2 zeigt schematisch die Anordnung eines optischen Systems zur Erzeugung von Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz zum Nachweis von Fluoreszenzmolekülen, die sich an eine Flüssig/Festphasen-Grenzfläche binden, indem eine Substratgeometrie verwendet wird, die eine Drehfläche (Halbkugel) einschließt.
Fig. 3 zeigt die Verwendung von flachen Fenstern auf einer Oberfläche des Drehsubstrats zum Eintritt/Austritt des Erregungsstrahls in das Substratmedium hinein und aus diesem heraus.
Fig. 4 illustriert die Anordnung eines Kegelschnittreflektors mit Schlitzen zum Eintritt/Austritt des Erregungsstrahls in eine Oberfläche eines Drehsensors und aus dieser heraus, um nahezu 360º der induzierten Emission zu sammeln.
Fig. 5 zeigt die Verwendung eines Sensors mit einer Oberfläche des Drehsubstrats (Kegelstumpf-Paraboloid), das innere Totalreflektion zur 360º- Sammlung der induzierten Emission verwendet.
Fig. 6 ist eine Auftragung der induzierten Emissionsintensität als Funktion des Polarwinkels, bezeichnet von der Substratseite der Symmetrieachse eines halbkugelförmigen Sensors.
Fig. 7 ist eine Auftragung, die die induzierte Emissionsintensität als Funktion der Wellenlänge bei 90º Azimutwinkel mit derjenigen bei 45º Azimutwinkel vergleicht, wobei der Azimutwinkel gegen den Uhrzeigersinn von der Projektion des Wegs des eintreffenden Erregerstrahls auf die Substrat/Film-Grenzflächenebene bezeichnet wird, gesehen von der Substratseite.
Fig. 8 zeigt schematisch (Draufsicht) eine Vorrichtung von einer Ausführungsform der Erfindung zum Messen der optischen Veränderungen der fluoreszenzinduzierten Emission, die an Beispiel 2 beteiligt ist.
Fig. 9 ist eine Auftragung des Detektorsignals infolge von induzierter Emission von einem Sensor, der in Folge sieben Kalibratoren mit unterschiedlichen Konzentrationen des Analytikums (CK-NM) ausgesetzt war.
Fig. 10 ist eine Standardkurve, die aus den Steigungen der induzierten Emissionsbindung in Fig. 9 erzeugt wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Eine Oberflächenplasmawelle, üblicherweise als Oberflächen-Plasmon bezeichnet, ist eine longitudinale Oszillation (Kompressionswelle) in den Leitungsbandelektronen nahe der Oberfläche eines Metalls, Halbleiters oder anderen leitfähigen Mediums. Oberflächenplasmawellen reagieren empfindlich auf Veränderungen der optischen Eigenschaften der Medien nahe der Oberfläche, entlang der sie sich ausbreiten. Sie sind als solche brauchbare Sonden zum Nachweis von nahe der Oberfläche stattfindenden Phänomenen, ein Beispiel ist molekulare Bindung an oberflächenadsorbierte Moleküle. Damit Oberflächenplasmawellen einem solchen Zweck dienen, muss (1) eine Technik zum Erregen der Oberflächenplasmawellen und (2) ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen, die durch das interessierende Oberflächenphänomen bei den Eigenschaften der Oberflächenplasmawellen induziert werden, verwendet werden.
Eine übliche Technik zur Anregung von Oberflächen-Plasmonwellen ist abgeschwächte Totalreflektions-(ATR)-Kopplung. Bei dieser Technik wird ein Teil der Energie eines Lichtstrahls über ein geschichtetes optisches System in Oberflächenplasmawellen umgewandelt, welches in seiner einfachsten Form aus drei Komponenten besteht:
(a) Substrat: Diese Schicht wirkt als inneres Reflektionselement (IRE) für das Erregerlicht. Als solches muss es für das Erregungslicht transparent sein.
(b) Film: Dies ist die Schicht, in der die Ausbreitung der Oberflächen- Plasmonwellen unterstützt werden soll. Er ist verglichen mit den anderen Schichten dünn (etwa 100 bis 1000 Angström) und ist nicht notwendigerweise homogen.
(c) Probe: Das nachgewiesene Oberflächenphänomen findet innerhalb dieses Mediums nahe seiner Grenze zu der Film statt. Damit das Substrat als inneres Reflektionselement wirken kann, muss das Substrat einen höheren Brechungsindex als die Probe haben.
In einigen Anwendungen kann die Reihenfolge des Films und der Probe vertauscht sein.
Ebenso wichtig wie die Materialstruktur des Systems ist die Art des Erregerstrahls. Zur Erregung von Oberflächenplasmawellen muss der Strahl einen Minimalsatz von Kriterien erfüllen:
(a) Polarisierung: Der Strahl muss eine Komponente haben, die in Bezug auf die Substrat/Film-Grenzfläche p-polarisiert ist.
(b) Wellenlänge: Die Wellenlänge muss größer als ein bestimmter Mindestwert sein, der durch die Plasmafrequenz des Films bestimmt wird.
(c) Auftreffwinkel: Der Strahl muss in einem Winkel auf die Substrat/Film- Grenzfläche auftreffen, dessen Wert in einen Bereich von Winkeln fällt, die durch die Dicke und den dielektrischen Koeffizienten der Schichtmedien sowie die Wellenlänge des Strahls bestimmt werden.
In Hinsicht auf das letzte Kriterien sind alle Erregungswinkel, bezogen auf die Senkrechte der Oberfläche, die durch die Substrat/Film-Grenzfläche definiert sind, größer als der kritische Winkel für die innere Totalreflektion zwischen dem Substrat und Probenmedien. Unter diesen Winkeln sind zwei zu beachten. Das abgeschwächte Totalreflektionsminimum ist der Winkel, bei dem der intern reflektierte Strahl aufgrund von Energieabsorption und Streuung (in Form von Joule'scher Wärme) durch die induzierten Oberflächen-Plasmonwellen eine dramatische Reduktion der Intensität erfährt, und auslöschende Interferenz wird an der Substrat/Film-Grenzfläche bewirkt. Das Grenzflächensteigerungsmaximum ist der Winkel, bei der das zu der Oberflächen-Plasmonwelle gehörende elektromagnetische Feld in der Probenschicht eine maximale Intensität erhält. Bei einigen Filmen sind diese beiden Winkel so nahe aneinander, dass sie kaum unterscheidbar sind, z. B. Silber. Bei anderen ist der Unterschied recht deutlich, z. B. Eisen (R. D. Olney und R. J. Romagnoli, Applied Optics, 26: 2279 (1987)).
Ein gemäß der obigen Beschreibung angeordnetes System kann Oberflächen- Plasmawellen entlang der Film/Proben-Grenzfläche erzeugen. Dieses Phänomen wird als Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) bezeichnet. Da eine Oberflächen-Plasmawelle aus sich bewegenden Ladungen gebildet ist, gehört dazu eine elektromagnetische Welle, die sich in der gleichen Richtung ausbreitet. Die Feldintensität der elektromagnetischen Welle nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Film/Proben-Grenzfläche ab. Eine solche Welle wird als Dämpfungswelle bezeichnet, und das dazugehörige elektromagnetische Feld wird als Dämpfungsfeld bezeichnet. Das Ausmaß des Dämpfungsfelds kann durch die Eindringtiefe charakterisiert werden, die als die Distanz definiert ist, bei dem die Feldstärke auf l/e oder 37% ihres Wertes an der Film/Proben- Grenzfläche abklingt. Ihr Wert ist typischerweise nur eine Fraktion der Erregungswellenlänge. Als Beispiel werden für λ = 600 nm für Silber und Gold Eindringtiefen von 390 beziehungsweise 280 nm erhalten (H. Raether, Surface Plasmons on Smooth and Rough Surfaces and on Gratings, Springer Tracts in Modern Physics, Band III, Seite 6 (Springer Verlag, New York 1988)). Dieses Dämpfungsfeld ist für die Empfindlichkeit der Oberflächenplasmawellen auf Änderungen der optischen Eigenschaften nahe der Film/Proben-Grenzfläche verantwortlich. Die Frequenz der Dämpfungswelle entspricht derjenigen der Oberflächenplasmawelle, die wiederum diejenige des Erregungsstrahls ist. Es ist daher möglich, Fluoreszenzmoleküle innerhalb des Dämpfungsfelds nahe der Film/Probe-Grenzfläche anzuregen, falls die Frequenz des Erregungsstrahls eine Absorptionsfrequenz des Fluorophors ist. Fluoreszenzmoleküle in dem Bereich jenseits des Dämpfungsfelds werden nicht erregt.
Alle der bislang erörterten Wechselwirkungen sind von ihrer Art her reziprok. Als Ergebnis emittieren die angeregten Fluoreszenzmoleküle eine Dämpfungswelle, die einen neuen Satz von Oberflächenplasmawellen erzeugt, die mit der Fluorophoremissionsfrequenz oszillieren. Diese Oberflächenplasmawellen strahlen dann Ausbreitungswellen mit derselben Frequenz durch den Film hindurch und in das Substratmaterial hinein ab, wo sie in einem Winkel austreten, der durch die Oberflächenplasmawellendispersionsrelation des Systems bestimmt wird (R. E. Benner et al., Optics Communications, 30: 145 (1979). Der Nachweis der Intensität der induzierten Emission ergibt eine relative Messung der Oberflächendichte der Fluoreszenzmoleküle. Da die Größe des Dämpfungsfelds diejenige des auftreffenden Felds in Abhängigkeit von den Materialien, die für das geschichtete optische System verwendet werden, um einen Faktor von 10 bis 100 übertrifft, erhöht das Dämpfungsfeld die Emission aus fluoreszenzmarkiertem Liganden, der an die Filmoberfläche gebunden ist.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der induzierten Emission. Da die Oberflächenplasmawellen 10 (dargestellt durch Pfeile), die durch den Fluoreszenzindikator 12 neben der Film/Proben-Grenzflächenoberfläche 22 des Films 20 induziert worden sind, keine bevorzugte Ausbreitungsrichtung entlang der Film/Probe-Grenzflächenoberfläche haben, tritt die induzierte Emission aus der Substrat/Film-Grenzflächenoberfläche 24 des Films als konischer Strahlungsmantel 14 aus, dessen Symmetrieachse mit der Senkrechten 16 zur Substrat/Film-Grenzflächenoberfläche an dem Punkt 26 zusammenfällt, an dem der Erregungsstrahl 18 auf den Film auftrifft (W. H. Weber und C. F. Eagen, Optics Letters, 4: 236 (1979)).
Konventionelle Ansätze, die im Stand der Technik zum Aufnehmen der induzierten Emission beschrieben sind, beschränken die Sammlung auf einen Azimutwinkel in einem festgelegten Abstand von dem Ursprungspunkt der induzierten Emission. Somit erfolgt die Sammlung entlang nur einer Dimension einem sphärischen Koordinatensystem.
Erfindungsgemäß wird das induzierte Emissionssignal erhöht und die Analyseleistung verbessert, indem das Mittel zum Aufnehmen des gesamten induzierten Emissionskegels bereitgestellt wird, indem Substratgeometrien gewählt werden, die die Sammlung entlang zweier Winkeldimensionen in einem sphärischen Koordinaten ermöglichen.
Gemäß ihrer umfassendsten Ausführungsform befasst sich die vorliegende Erfindung mit Verbesserungen des Verfahrens der Lichtsammlung der induzierten Emission von Abtastvorrichtungen auf Basis von Oberflächen-Plasmonresonanz, die beinhalten:
(a) Bestrahlen des Films des geschichteten optischen Systems von der Substratseite mit Licht, das die Wellenlänge, Polarisation und den Auftreifwinkel aufweist, die zum Anregen der Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz geeignet sind;
(b) Inkubieren der Probe, die fluoreszent oder fluoreszierend markierte Moleküle in Kontakt mit dem Film enthält, wobei der Film chemisch modifiziert sein kann oder nicht; und
(c) Verwendung von 360º Azimutsammlung des fluoreszenzinduzierten Emissionskegels und Analysieren der Rate oder Menge, mit der sich das nachgewiesene induzierte Emissionssignal ändert, wenn die Bindung zwischen den fluoreszent oder fluoreszierend markierten Molekülen und dem Film voranschreitet.
Das geschichtete optische Substrat umfasst ein Substrat, eine Probe und eine oder mehrere Schichten aus Material, die kollektiv als dazwischen befindlicher "Film" bezeichnet werden. Es ist erforderlich, dass eine der Schichten, aus denen der Film zusammengesetzt ist, ein Leiter ist, wie Silber oder Gold, wobei die Dicke im Bereich von ungefähr 10 nm bis 100 nm liegt. Diese Schicht unterstützt die Ausbreitung der verschiedenen Modi von Oberflächenplasmawellen. Zusätzliche Schichten sind optional. Die Schichten, die sich zwischen dem Substrat und der Leiterschicht befinden, werden hier als "Unterschichten" bezeichnet. Jene Schichten, die sich zwischen dem Leitersubstrat und der Probe befinden, werden nachfolgend als "Oberschichten" bezeichnet. Sowohl Unterschichten als auch Oberschichten sind üblicherweise dielektrische Materialien, wie LiF, MgF&sub2; und SiO&sub2;, wobei die Dicke in Abhängigkeit von der Anwendung im Bereich von 2 nm bis 1500 nm liegt. Eine dünne Schicht aus Chromoxid (3 bis 5 nm dick) kann beispielsweise als Unterschicht verwendet werden, um die Adhäsion zwischen einer Leitschicht aus Gold (50 nm dick) und einem BK-7-Glassubstrat zu erhöhen. Das Absetzen jeder Schicht auf dem Substrat kann mittels Dünnfilmbeschichtungstechniken erfolgen, zu denen PVD und Aufdampfen gehören. Solche Techniken sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Das Substrat wirkt als internes Reflektionselement (IRE) für das Erregungslicht. Es muss als solches für das Erregungslicht transparent sein. Glas, Kieselerde und optische Kunststoffe, wie Polystyrol, Polycarbonat, Acryl, Polymethylpenten und ihre Copolymere sind Beispiele für üblicherweise verwendete Substratmaterialien, die für sichtbares Licht transparent sind. Die grundlegende Geometrie des Substrat wird durch die Anforderung bestimmt, dass es zur maximalen Sammlung des induzierten Emissionskegels leitfähig sein soll. Erfindungsgemäß ist das bevorzugte Substratmaterial irgendein Typ eines optischen Kunststoffs, und das bevorzugte Verfahren zum Herstellen des Substrats in einer speziellen Geometrie ist Spritzgießen. Die Vorteile der Verwendung von geformten Kunststoffen sind geringe Kosten und die Möglichkeit, weitere Strukturen in das Substrat zu formen, um das Substrat mit einem Instrument zu transportieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung schließt die Geometrie der Substratoberfläche eine 360º Drehfläche mit Symmetrieachse senkrecht zu der Substrat/Film-Grenzfläche ein.
Nachfolgend bezieht sich der Begriff "Drehfläche" auf jede Fläche, deren Verbindung mit einer Ebene senkrecht zu ihrer Symmetrieachse einen Kreis bildet. Es gibt viele Beispiele für geometrische Körper mit solchen Oberflächen, einschließlich Halbkugel, Ellipsoid, Kegel und Paraboloid. In Fig. 2 befindet sich ein halbkugelförmiges Substrat 28, das mit einem dünnen leitfähigen Film 30 beschichtet ist, der Oberflächen-Plasmonwellen unterstützt, in Kontakt mit der Probe 32. Das Erregungslicht 34 bestrahlt die kugelförmige Oberfläche in einem Winkel oder Winkelbereich, die für die Anregung von Oberflächen- Plasmonresonanz geeignet sind. Diese Winkel beziehen sich auf die Symmetrieachse 36 des Substrats, die auch eine Normallinie der Ebene ist, die durch die Substrat/Film-Grenzfläche 38 definiert ist. Das Licht breitet sich weiter durch das Substratmedium aus und erfährt eine abgeschwächte Totalreflektion in der Mitte 40 der Substrat/Film-Grenzfläche. Das sich im Inneren des Substrats ausbreitende Erregungslicht ist entweder parallel gerichtet, durch einen festgelegten Betrag konvergiert oder divergiert, um sich der Winkelvariation der Orientierung des Substrats innerhalb seiner Ausrichttoleranz anzupassen. Das reflektierte Licht 42 tritt von der anderen Seite des Substrats aus. Die Fluoreszenzmoleküle 44 innerhalb der Eindringtiefe des Dämpfungsfelds der induzierten Oberflächen-Plasmawellen werden angeregt, während die Fluoreszenzmoleküle 46 jenseits der Eindringtiefe, d. h. jene in Massenlösung, dies nicht werden. Der Halbwinkel des indizierten Emissionskegels 48 hat eine längere Wellenlänge als das Erregungslicht und ist daher infolge von Dispersionseffekten in dem Substratmaterial immer kleiner als der Erregungsauftreffwinkel. Der Hauptvorteil der Verwendung eines halbkugelförmigen Substrats liegt darin, dass der allgemeine Charakter des induzierten Emissionskegels intakt bleibt, wenn er aus dem Substrat austritt. Dies erleichtert die Sammlung der induzierten Emission in erheblich verbessertem Maße im Vergleich mit Prismen, wie geraden dreieckigen und halbzylindrischen Prismen, die Geometrien aufweisen, die mit dem induzierten Emissionskegel unverträglich sind, sowie scharfe Ecken haben, die Licht streuen.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Mittel zum Reduzieren des Hintergrunds, was wiederum das Verhältnis von Signal zu Rauschen verbessert. Dies wird bewirkt, indem die Divergenz der Fresnel- Reflektion des Erregungslichts minimiert wird, das auf die Oberfläche des Substrats auftrifft. Wie in Fig. 3 und wiederum unter Verwendung des Beispiels des halbkugelförmigen Substrats gezeigt ist, werden an den Eintritts- und Austrittspunkten des Erregungslichts 54 zwei flache optische Fenster 50 in das Substrat 52 eingebaut. Die Fenster werden in Bezug auf die Substrat/Film- Grenzfläche in einem festgesetzten Winkel orientiert. Im Unterschied zu einer gekrümmten Oberfläche ändert das flache Fenster die Wellenfrontkrümmung dieses Teils des Erregungsstrahls nicht, der Fresnel-Reflektion erfährt, wodurch derartiges Licht leichter aus dem System entfernt werden kann. Die Größe des Fensters wird durch die Größe des Erregungsstrahls bestimmt. Als Daumenregel sollte die Größe des Fensters klein sein, und die Position des Fensters sollte so sein, dass minimale Interferenz mit dem Strahlungskegel hervorgerufen wird.
Als weiterer Vorteil erhöht die Anwesenheit von flachen Fenstern die Empfindlichkeit des Systems für induzierte Emission, indem bessere Kollimation des Erregungslichts in dem Substratmedium ermöglicht wird. Da Oberflächenplasmawellen nur durch Licht angeregt werden, das in einem vergleichsweise kleinen Bereich von Auftreffwinkeln auf die Substrat/Film-Grenzfläche auftrifft, überträgt ein Erregungsstrahl, der in dem Substratmedium nicht ausreichend parallel gerichtet ist, nicht die gesamte Energie, die er potentiell zur Erzeugung des Erregungsplasmons beitragen könnte. Zudem wird Energie, die nicht zur Erzeugung des Plasmons verwendet wird, von der Substrat/Film-Grenzfläche reflektiert und trägt zum Hintergrund bei. Das kombinierte Ergebnis aus niedrigerer induzierter Emission und höherem Hintergrund führt zu einem Gesamtverlust an Empfindlichkeit. Da alle Drehflächen gekrümmt sind, hat ein Substrat, das eine derartige Fläche einschließt, eine optische Leistung, die bei der externen Optik berücksichtigt werden muss, um interne Kollimation des Erregungsstrahls zu gewährleisten. Es ist in der Praxis infolge von Aberrationseffekten, die an der Substratoberfläche erzeugt werden, sehr schwierig, dies für kleine Substratgrößen innerhalb der Kollimationsanforderungen für Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz zu erreichen. Extern parallel gerichtetes Licht, das durch ein flaches Fenster an der Substratoberfläche einfällt, macht diese Korrektur entbehrlich.
Für üblicherweise verwendete Substratmaterialien (Brechungsindex von ungefähr 1,5 bis 1,6) ist der Halbwinkel des induzierten Emissionskegels oft relativ groß (größer als 65º), wodurch die Sammlung durch Brechungstechniken (z. B. Linsensysteme) schwierig wird. Die Verwendung von Reflektionstechniken (z. B. Verwendung von Spiegeln oder inneren Reflektionselementen) liefert eine praktischere Lösung, insbesondere wenn die reflektierende Oberfläche die Rotationssymmetrie des Strahlungskegels teilt. Das bedeutendste Beispiel ist die Verwendung von Kegelschnittoberflächenreflektoren (z. B. Paraboloid- und Ellipsoidoberflächenreflektoren), um weit divergierendes Licht umzulenken, das von einer Punktquelle entlang einer klar definierten optischen Achse abgestrahlt wird. Da man sich den Strahlungskegel so vorstellen kann, dass er einer ungefähren Punktquelle entstammt, die sich an seinem Scheitel befindet, ergibt sich eine solche Sammlungstechnik von selbst. Als Beispiel zeigt Fig. 4 einen Ellipsoidoberflächenreflektor 56. Das halbkugelförmige Substrat 58 wird in einer solchen Weise positioniert, dass (1) seine Symmetrieachse mit der Symmetrieachse des Reflektors 60 zusammenfällt, (2) seine Krümmungsmittel (wo das auftreffende Licht den Film bestrahlt, um Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz anzuregen) mit dem inneren Brennpunkt 62 des Reflektors zusammenfällt, und (3) seine halbkugelförmige Seite auf den äußeren Brennpunkt 64 des Reflektors gerichtet ist. Der Ellipsoidreflektor reflektiert den Strahlungskegel, der von der Krümmungsmitte zu dem äußeren Brennpunkt ausstrahlt, wo eine Lichtnachweisvorrichtung positioniert ist. Techniken zum Entwerfen eines solchen optischen Systems unter Verwendung von Reflektoren zur maximalen Lichtsammlung und Techniken zur Fertigung der erforderlichen optischen Komponenten sind im Bereich der Optik wohl bekannt (W. T. Wilford und R. Winston, High Collection Noniniaging Optics, (Academic Press Inc., NY, NY, USA, Seiten 53 bis 97, 1989)).
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Oberfläche des Substrats eine 360º Drehfläche, deren Symmetrieachse senkrecht zu der Substrat/Film-Grenzfläche an dem Punkt ist, an dem das Erregungslicht auftrifft, die als innerer Oberflächenreflektor für den Strahlungskegel wirkt. Ein Beispiel ist das Kegelstumpf-Paraboloidsubstrat 66, das in Fig. 5 gezeigt ist. Die Substratform wird erhalten, indem ein Paraboloid entlang zwei Ebenen geschnitten wird, zu denen die Symmetrieachse 68 des Paraboloids senkrecht ist. Die Austrittsebene 70 enthält den Brennpunkt des Paraboloids, und die Ausgangsebene 72 ist jede Ebene, die weiter von dem Brennpunkt entfernt ist als die Ebene, in der der Kegel 73 die Paraboloidoberfläche 74 schneidet, wenn (1) sie die gleiche Symmetrieachse 68 haben, (2) der Scheitel des Kegels und der Brennpunkt 76 des Paraboloids zusammenfallen und (3) sowohl der Kegel als auch das Paraboloid in der gleichen Richtung geöffnet sind. Der Abschnitt des Paraboloids zwischen diesen beiden Ebenen definiert die Form des Substrats. Die Vorrichtung wird vollendet, indem der Film 78 auf der planaren Oberfläche mit kleinerem Durchmesser, d. h. der Austrittsebene, als Beschichtung aufgebracht wird. Das geschichtete optische System wird eingesetzt, indem ein Fluoreszenzmaterial in Kontakt mit der Film gebracht wird und der Erregungsstrahl (beispielsweise unter Verwendung von Fenstern) in einer solchen Weise in das Substrat geführt wird, dass er an dem Brennpunkt des Paraboloids auf die Substrat/Film-Grenzfläche mit einem Winkel, einer Wellenlänge und einer Polarisation auftrifft, die geeignet sind, um Oberflächen-Plasmonresonanzfluoreszenz anzuregen. Der resultierende Strahlungskegel wird intern von der Paraboloidoberfläche reflektiert und durch die größere planare Oberfläche geführt, wo er als annähernd zylindrischer Mantel 80 austritt. Ein solches Strahlungsmuster kann leicht mit einer einzigen Linse auf einem Detektor fokussiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung verbesserte Analysetechniken für den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von chemischen oder biochemischen Analytika in einer Probe und ein Mittel zur Anwendung solcher Techniken. Die Typen von analytischen Messungen, die sich erfindungsgemäß durchführen lassen, sind zahlreich und ergeben sich Fachleuten von selbst. Einige Beispiele werden jedoch zur Veranschaulichung gegeben. In einem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Messen eines Liganden in einer Probe, bei dem im Allgemeinen
(a) der Film des geschichteten optischen Elements von der Substratseite mit Licht bestrahlt wird, das eine Wellenlänge, Polarisation und einen Auftreffwinkel hat, die geeignet sind, um Oberflächen-Plasmonresonanz anzuregen;
(b) die Probe, die Ligand und geeignete mit Fluorophor markierte Moleküle als Indikator enthält (nachfolgend als "fluoreszent markiertes Konjugat" bezeichnet), in Kontakt mit dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der sich als Beschichtung auf der Oberfläche des Films befindet, der sich als Beschichtung auf dem Substrat befindet, inkubiert wird; und
(c) 360º Azimutsammlung des fluoreszenzinduzierten Emissionskegels verwendet wird und die Rate oder Menge überwacht und analysiert wird, mit der sich die nachgewiesene induzierte Emissionsintensität ändert, wenn Bindung zwischen den fluoreszent markierten Molekülen und dem immobilisierten spezifischen Bindungspartner über direkte oder Brückenbindungswechselwirkungen abläuft.
Ein Beispiel für diese Technik ist die "sandwich"-immunometrische Analysentechnik, auch als "markiertes Reagenz"-Technik bezeichnet, wobei die analysierten Liganden mehr als eine Bindungsstelle oder ein Epitop für Antikörper haben. Der spezifische Bindungspartner wird dann durch physikalische Adsorption oder chemische Kopplung auf der Oberfläche des Films immobilisiert, um entweder eine kontinuierliche Schicht (d. h. Monoschicht) oder eine diskontinuierliche Schicht (d. h. Insel oder spezielle Strukturmuster) zu erzeugen. Die Festphasenimmobilisierungstechniken sind im Stand der Technik wohl bekannt. Als Daumenregel dient die Strategie der Immobilisierung zum Aufrechterhalten der Maximalaktivität und Zugänglichkeit des immobilisierten spezifischen Bindungspartners. In einer typischen einstufigen Sandwichanalyse (oder Simultananalyse) wird Ligand mit dem fluoreszent markierten Konjugat (das in Bezug auf den Liganden im Überschuss vorhanden ist) für eine festgesetzte Zeitspanne in einem geeigneten Verdünnungsmittel co-inkubiert, um über Affinitätswechselwirkungen Ligand/Konjugat-Komplexe zu bilden, bevor sie in Kontakt mit dem immobilisierten spezifischen Bindungspartner gebracht werden. Die Ligand/Konjugat-Komplexe werden dann in die Festphase immunoextrahiert, indem der Ligandenteil sich an den spezifischen Bindungspartner mit seinen verbleibenden Epitopen binden gelassen wird. Die induzierte Emission, die durch das mit Fluorophor markierte Konjugat in dem Dämpfungsfeld der Oberflächenplasmawelle erzeugt wird, tritt aus der Substrat/Film-Grenzfläche in das Substratmedium hinein als Strahlungskegelmantel aus, welcher durch das zuvor beschriebene optische System gesammelt wird. Da nur die fluoreszierend markierten Konjugate in dem Dämpfungsfeld der Oberflächenplasmawellen angeregt werden, nimmt die induzierte Emission zu, wenn mehr Ligand/Konjugat-Komplexe in das Dämpfungsfeld diffundieren und dort durch den spezifischen Bindungspartner gebunden werden. Auf diese Weise werden freier und gebundener Ligand und Konjugat optisch getrennt, daher entfällt die Notwendigkeit einer Waschstufe, um freies von gebundenem Analytikum zu trennen. Die Konzentration des Liganden wird unter Verwendung von entweder einem Gleichgewichtsmodus, bei dem die Änderung der absoluten Intensität gemessen wird, oder einem kinetischen Modus bestimmt, bei dem die Rate der Intensitätsänderung gemessen wird. Die Ratenmessung misst die Diffusion der Komplexe nahe der Film/Probe-Grenzfläche und bietet eine Umlaufzeit, die erheblich rascher als diejenige der Gleichgewichtsmessung ist.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf zweistufige Sandwichanalysen (oder sequentielle Analysen) anwendbar, in der der Ligand zuerst mit dem spezifischen Bindungspartner inkubiert ist, gefolgt von einer weiteren Inkubation mit dem fluoreszierend markierten Konjugat. In diesem Fall wird zwischen den beiden Inkubationen eine Waschstufe verwendet. Allergieanalysen (d. h. spezifisches IgE für Allergene) sind für diese Kategorie repräsentativ.
Ein weiterer Analysentyp ist die "kompetive" (vergleichende) Analyse, auch als "markiertes Analytikum"-Technik bezeichnet, in der es eine Konkurrenz des unmarkierten Liganden (oder Probeliganden) und des fluoreszenzmarkierten Liganden um eine begrenzte Menge an Bindungsstelle an dem spezifischen Bindungspartner gibt. Wie bei den Sandwichanalysen kann die kompetitive Analyse simultan oder sequentiell durchgeführt werden. Datenerfassung und Analyse können entweder im Gleichgewichts- oder im kinetischen Modus erfolgen.
Es gibt viele Beispiele für Fluorophore, die zur Verwendung als Indikatoren geeignet sind, und sie sind im Stand der Technik wohl bekannt. Üblicherweise verwendete Fluoreszenzfarbstoffe schließen Rhodaminisothiozyanat, Cy5TM, Fluoreszeinisothiozyanat, Allophycozyanin, R-Phycoerythrin, B-Phycoerythrin und Farbstoffe im nahen Infrarot ein. Andere Fluorophore sind Fachleuten bekannt.

BEISPIEL 1 - BEOBACHTUNG VON FLUORESZENZINDUZIERTEM PLASMON-EMISSIONSKEGEL UNTER VERWENDUNG EINES HALBKUGELFÖRMIGEN SUBSTRATS

(i) Fertigung des filmbeschichteten Substrats

Eine 1/16 Zoll dicke, 1 Zoll im Quadrat Glasplatte wurde mit Königswasser gereinigt und zuerst mit entionisiertem Wasser und dann mit Ethanol gespült. Eine Seite der Platte wurde mittels Aufdampfen mit einer 500 Angström dicken Goldschicht beschichtet. Eine Glashalbkugel mit 1 Zoll Durchmesser wurde durch optisches Schleifen und Polieren ihrer planaren Oberfläche modifiziert, um 1/16 Zoll Material gleichförmig zu entfernen. Die unbeschichtete Seite der Glasplatte wurde dann unter Verwendung von Indexangleichungsflüssigkeit, die einen Brechungsindex hat, der ungefähr gleich demjenigen des Glases ist, optisch an die planare Oberfläche der Halbkugel gekoppelt. Diese Anordnung führte dazu, dass sich die Krümmungsmitte der Halbkugel ungefähr in der Ebene befand, die durch die Grenzfläche zwischen der Glasplatte und der Goldschicht definiert war (die Dicke der Indexanpassungsflüssigkeitsschicht wurde als vernachlässigbar angesehen).

(ii) Herstellung der Durchflusszelle

Eine Dichtung wurde hergestellt, indem ein elliptisches Loch in die Mitte einer 1 Zoll im Quadrat Lage Silikonkautschuk geschnitten wurde. Zwei Löcher wurden in eine Metallplatte gebohrt, und Metallrohr wurde in die Löcher gepresst, so dass ein Ende von beiden Rohren mit einer Seite der Metallplatte auf gleicher Höhe war. Der Abstand zwischen den Löchern wurde so gewählt, dass er ungefähr der Distanz zwischen den beiden Brennpunkten der Ellipse entsprach, die das Loch in der Dichtung beschrieb. Der Durchmesser des Metallrohrs entsprach ungefähr demjenigen, der für die Befestigung von Polyethylenschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,040 Zoll vorgesehen ist. Ein mechanisches Gerät wurde verwendet, das zum Komprimieren der Dichtung zwischen der goldbeschichteten Oberfläche der Glasplatte und der Seite der Metallplatte geeignet war, mit der beide Metallrohre auf einer Höhe waren. Es wurde darauf geachtet, dass gewährleistet war, dass die beiden Löcher in der Metallplatte innerhalb des elliptischen Perimeters des Loches in der Dichtung waren, wenn sie komprimiert wurde.

(iii) Nachweissystemaufbau

Eine Vorrichtung wurde gebaut, die das Positionieren der Eintrittsöffnung eines faseroptischen Bündels irgendwo entlang einer halbkugelförmigen Oberfläche in einer solchen Weise ermöglichte, dass die Eintrittsöffnung immer senkrecht zu der Mitte der Halbkugelfläche orientiert war (nachfolgend als "Bewegungsmitte" der Eintrittsöffnung bezeichnet). Die Austrittsöffnung des faseroptischen Bündels wurde an einem Sekundärelektronenvervielfacherrohr- (PMT)-Nachweissystem befestigt, das mit einem Monochromator ausgestattet war.

(iv) Experimentelle Anordnung

Der Film/Substrat- und Durchflusszellenaufbau wurde in einer solchen Weise angeordnet, dass die Position der Krümmungsmitte der Glashalbkugel und die Position der Bewegungsmitte der Eintrittsöffnung zusammenfielen. Die Distanz zwischen der Eintrittsöffnung und seiner Bewegungsmitte wurde in einer Distanz von ungefähr 3 Zoll festgelegt. Der Durchmesser der Eintrittsöffnung wurde auf 2 mm verringert, um die Winkelauflösung zu verbessern.
Ein roter Helium-Neon-Laser (Wellenlänge = 632,8 nm), der mit einem 3 nm Spektralbandpass-Laserlinienfilter ausgestattet war, wurde entlang einer Linie, die in Bezug zu der Krümmungsmitte der Glashalbkugel radial war, und in einem Winkel, der zur Anregung von SPRF in der verwendeten Probe geeignet war, auf die Glas/Gold-Grenzfläche gerichtet. Zwischen den Laser und den Sensor wurde geeignete Optik eingefügt, um nahezu Kollimation des Laserlichts in dem Glasmaterial der optischen Struktur zu gewährleisten.

(v) Experimentelles Verfahren

Eine Probenlösung wurde hergestellt, indem eine geeignete Konzentration eines geeigneten Proteins verwendet wurde, das mit der Trimerform von Allophycozyanin (nachfolgend als "APO" bezeichnet) markiert war. Die Probe wurde in einer Spritze aufgenommen. Die Spritze wurde in das freie Ende von einer der Längen des Polyethylenschlauchmaterials an der Durchflusszellenvorrichtung eingesetzt. Das freie Ende der anderen Länge des Polyethylenschlauchmaterials wurde in einen Abfallbehälter gesteckt. Die Probe wurde in die Durchflusszelle injiziert, bis eine geringe Menge davon in den Abfallbehälter entleert wurde. Die resultierende fluoreszenzinduzierte Emission wurde visuell (durch eine Laserschutzbrille, die rotes Helium-Neon-Laserlicht blockierte, jedoch alle anderen Wellenlängen des sichtbaren Bereichs durchließ) beobachtet, indem abwärts entlang einer Sichtlinie radial zu der Krümmungsmitte der Glashalbkugel in einem geeigneten Winkel geblickt wurde, in dem die Strahlungskegelemission erwartet wurde. Es wurde eine ausreichende Zeit verstreichen gelassen, um die Adsorption der markierten Proteine abzuschließen. Dann wurden quantitative Daten genommen, indem die Eintrittsöffnung in eine spezielle Winkelposition bewegt wurde und das Nachweissystem verwendet wurde, um ein Wellenlängenprofil des gesammelten Lichts zu erhalten (nachfolgend als "Emissionsabtastung" bezeichnet). Die Winkelposition wurde in konventionellen sphärischen Koordinaten angegeben, der Polarwinkel (theta) bezog sich auf die Normallinie zu der Glas/Gold-Grenzfläche, und der Azimutwinkel (phi) bezug sich auf die Linie, die durch den Schnittpunkt der Auftreffebene und der Ebene der Glas/Gold-Grenzfläche auf der Laserseite der Bewegungsmitte definiert wurde. Emissionsabtastungen wurden an einer Reihe von Winkelpositionen vorgenommen. Das Laserlicht wurde am Auftreffen auf das Substrat zwischen Emissionsabtastungen gehindert, um das Photobleichen der Fluoreszenzmoleküle zu verringern, die die adsorbierten Proteine markierten.

(vi) Ergebnisse: Qualitative Beobachtung

Die fluoreszenzinduzierte Plasmon-Emission wurde sofort nach Injektion der Probe sichtbar. Das Variieren des Polarwinkels der Sichtlinie mit fixiertem Azimutwinkel führte zu einem beobachteten Aufblitzen von Emissionslicht, wenn der Polarwinkel, der dem Emissionswinkel entsprach, überquert wurde.
Das Fixieren des Polarwinkels der Sichtlinie am Emissionswinkel und Variieren des Azimutwinkels ergab die Beobachtung, dass das Emissionslicht sichtbar war und in der Intensität gleichförmig an allen Position in den 360º erschien, die den Sensor umgaben. Die offenbare Diskretheit entlang der Polarrichtung und Gleichförmigkeit entlang der Azimutrichtung wurden als qualitative Bestätigung des kegelmantelförmigen Strahlungsmusters genommen.

(vii) Ergebnisse: Quantitative Beobachtung

Fig. 6 zeigt die Gesamtzahl der Photonen, die in einem Azimutwinkel von 90º zu dem Auftreffstrahl im 640 bis 700 nm Band als Funktion des Polarwinkels für einen Winkelbereich von 60º bis 80º aufgefangen wurden. Zu Beachten ist der Emissionswinkelpeak bei 72º.
Fig. 7 zeigt nur jene Emissionsabtastungen, die bei einem Polarwinkel von 72º für zwei Azimutwinkel genommen wurden: 45º und 90º. Die vergleichbaren Profile dieser Kurven beweisen die Gleichförmigkeit der Emissionsintensität in der Azimutrichtung.
Theoretische Berechungen unter Verwendung der Fresnel'schen Gleichungen für geschichtete Medien sagen einen Emissionswinkel von 72,22º für dies System voraus. Dieser Wert passt zu den beobachteten 72º und weist auf die Nützlichkeit einer halbkugelförmigen Substratgeometrie hin, um den allgemeinen Charakter der fluoreszenzinduzierten Plasmonstrahlung aufrechtzuerhalten.

BEISPIEL 2 - OBERFLÄCHEN-PLASMONRESONANZ- FLUORESZENZANALYSE FÜR CREATINKINASE-MB UNTER VERWENDUNG VON 360º AZIMUTSAMMLUNG VON FLUORESZENZINDUZIERTER PLASMONEMISSION

(i) Fertigung der Film/Substrat-Struktur

Ein halbkugelförmiges Substrat wurde aus NAS-Kunststoff von optischer Qualität geformt. Die planare Oberfläche der Halbkugel wurde mit einer 470 Angström dicken Goldschicht beschichtet.

(ii) Analysenmethode

Eine Sandwichanalyse wurde mit Lösungen mit einem geringen Zusatz von CK- MB in Rinderserum durchgeführt. Einfang-Antikörper wurden auf der Goldoberfläche des Sensors unter Verwendung von Biotin-Streptavidin-Chemie immobilisiert. Jede der vorgemischten Lösungen wurde mit einer Konjugatlösung, die APO-markierte Antikörper in einer Konzentration von 150 nM enthielt, 2 Minuten inkubieren gelassen, bevor sie in Kontakt mit der Goldoberfläche gebracht wurde.

(iii) Experimentelle Anordnung

In Fig. 8 wurde ein Ellipsoid-Oberflächenreflektor 81 mit einer Länge von Brennpunkt zu Brennpunkt, die dem 20-fachen des Durchmessers des halbkugelförmigen Substrats 82 entsprach, entlang einer Sagittalebene geschnitten, die seine Hauptachse 87 enthielt, um zwei Schlitze zu erzeugen (wie in Fig. 4 deutlicher zu sehen ist). Die Breite der Schlitze war so, dass jeder einen Winkel von 9º am inneren Brennpunkt 84 des Reflektors in einer Ebene senkrecht zu der Hauptachse überstrich. Ein roter Diodenlaser 83 (Wellenlänge = 635 nm), der als Erregungsquelle wirken sollte, wurde an einem Beschlag befestigt, der den Laser durch einen der Schlitze scheinen ließ und ermöglichte, dass er in einer solchen Weise um den inneren Brennpunkt des Reflektors gedreht werden konnte, dass der Strahl 85 immer auf den inneren Brennpunkt gerichtet war. Ein Photonendetektor 86 wurde vor dem Reflektor entlang seiner Symmetrieachse 87 positioniert. Das antikörperbeschichtete halbkugelförmige Substrat wurde in einer Durchflusszellenvorrichtung 88 angebracht, die aus einem Einlass 89, einem Auslass 90 und einem O-Ring 91 ähnlich wie in Beispiel 1 bestand. Das halbkugelförmige Substrat wurde dann in einer solchen Weise positioniert, dass (1) seine Symmetrieachse mit der Symmetrieachse des Reflektors zusammenfiel, (2) seine Krümmungsmitte mit dem inneren Brennpunkt des Reflektors zusammenfiel, und (3) seine halbkugelförmige Seite in Richtung des äußeren Brennpunkts des Reflektors gerichtet war. Das Positionieren des Substrats auf diese Weise ermöglichte, dass der Laserstrahl von der Mitte der Substrat/Gold-Grenzfläche 92 reflektiert wurde und aus dem verbleibenden Schlitz austreten konnte. Geeignete Optik, die aus Polarisierungs-Strahlteiler 98 und einer Kollimatorlinse 99 bestand, wurde zwischen den Laser und die äußere Oberfläche des Reflektors gesetzt, um nahezu Kollimation innerhalb des Substrats zu gewährleisten. Geeignete Optik, die aus einer einstellbaren Achse 93, einer Kollimatorlinse 94, einem Emissionsfilter 95, einer Fokussierlinse 96 und Kondensor 97 bestand, wurde zwischen den Ellipsoidreflektor und den Detektor eingesetzt, um den fluoreszenzinduzierten Emissionskegel 100 auf den Detektor zu leiten. Erregungs- und Emissionsfilter, die für die verwendete Erregungsspektrum/Fluorophor-Kombination geeignet waren, wurden vor dem Laser beziehungsweise Detektor eingesetzt. Laser und Detektor wurden für Strom, Steuerung und Datenerfassung mit einem Computer 101 verbunden.

(iv) Experimentelles Verfahren

Phosphatgepufferte Salzlösung (nachfolgend als "PBS" bezeichnet) wurde in die Durchflusszelle injiziert, und die Position des Lasers wurde auf die Winkelposition des abgeschwächten Totalreflektionsminimum eingestellt, wie durch eine scharfe Abnahme der Intensität des reflektierten Strahls gezeigt wird. Die Integrationszeit wurde auf I s eingestellt. Die folgenden Schritte wurden für Lösungen mit Konzentrationen von 0,00, 1,95, 3,90, 15,6, 62,5, 250 und 500 ng/ml CK-MB in Rinderserum wiederholt. Die CK-MB-Lösung wurde als Schuss mit 1 : 5 Verdünnung in die APC-Antikörper-Konjugatlösung gegeben und vor der Injektion 2 Minuten inkubieren gelassen. Datenerfassung wurde 30 Sekunden vor der Injektion eingeleitet, um eine Hintergrundablesung zu erhalten. Die Probe wurde in der Durchflusszelle 60 Sekunden inkubieren gelassen und dann mit PBS gewaschen.

(v) Ergebnisse

Fig. 9 zeigt das Detektorsignal als Funktion der Zeit. Der Bereich jedes Peaks ist die Zeit zwischen Injektion und Waschen einer Probe mit spezieller Konzentration. In jedem der Zeitintervalle nahm das Detektorsignal in linearer Weise zu. Dies geschieht infolge des Anstiegs der fluoreszenzinduzierten Oberflächen-Plasmonstrahlung, wenn sich das mit Fluorophor markierte Analytikum nahe der Goldoberfläche akkumuliert, indem es sich an den Einfang-Antikörper bindet. Es sei darauf hingewiesen, dass die Neigung des linearen Anstiegs mit der Probenkonzentration an Analytikum steigt und somit als Reaktion auf die Probenkonzentration interpretiert wird. Die Neigung von jedem Konzentrationspunkt wird in Fig. 10 aufgetragen und zeigt eine lineare Reaktion von 1,95 ng/ml bis 500 ng/ml CK-MB.
Die obigen Beispiele und Zeichnungen dienen zu veranschaulichenden Zwecken der Erfindung und sollen den Umfang nicht einschränken.

Claims

1. Immunanalyse-Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analytikums in einer Körperflüssigkeit, umfassend

(a) das Bereitstellen einer optischen Struktur, die in Folge (i) ein transparentes Festphasen-Substrat mit (ii) einem Metallfilm umfasst, der die Oberflächen-Plasmonresonanz unterstützt, wobei (iii) ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum direkt oder indirekt auf dem Metallfilm immobilisiert wird;

(b) das In-Kontakt-Bringen des ersten spezifischen Bindungspartners mit der Körperflüssigkeit über einen Indikator, der einen fluoreszierenden Indikator enthält, welcher entweder mit dem (i) Analytikum oder einem immunologischen Analogon desselben beziehungsweise (ii) mit einem zweiten spezifischen Bindungspartner für das Analytikum konjugiert;

(c) das Bestrahlen des Substrates mit Erregerstrahlung von solcher Wellenlänge, Polarität und einem Auftreffwinkel, die ausreichen, um die Oberflächen-Plasmonresonanz zu erzeugen und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von einem spezifisch gebundenen Indikator zu induzieren;

(d) das Messen jeder Veränderung in der Frequenz oder der Menge der Fluoreszenzemission über eine vorgegebene Zeitspanne mit Hilfe eines Fluoreszenz bündelnden Mittels, das im wesentlichen die gesamte Fluoreszenz in dem Emissionskegel aufnimmt, wobei das Mittel das Substrat enthält, dessen Geometrie so beschaffen ist, dass es die Fluoreszenzemission entlang zweier Winkelebenen eines sphärischen Koordinatenraumes sammelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine Drehfläche von 360º zur Symmetrieachse umfasst, die senkrecht zur Substrat- /Film-Zwischenschicht steht, wobei die Drehfläche sich auf jede Oberfläche bezieht, deren Verbindung mit einer senkrecht auf ihrer Symmetrieachse stehenden Verbindung einen Kreis bildet, und

(e) das Ermitteln des Vorhandenseins beziehungsweise der Menge des Analytikums in der Körperflüssigkeit aus der gemessenen Veränderung der Frequenz oder Menge der fluoreszierenden Strahlung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Metallfilm eine Dicke von etwa 10 nm bis etwa 100 nm hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die optische Struktur außerdem noch eine darunter liegende dielektrische Zwischenschicht zwischen dem Substrat und dem Metallfilm beziehungsweise eine darüber liegende dielektrische Zwischenschicht zwischen dem Metallfilm und dem ersten spezifischen Bindungspartner umfasst, wobei jede dielektrische Schicht eine Dicken von etwa 2 nm bis 1500 nm hat.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat aus der Gruppe, die Glas, Kieselerde und optische Kunstfaser umfasst, ausgewählt ist.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat für eine Strahlung zwischen 400 nm und 1500 nm transparent ist.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Analytikum aus der Gruppe, die ein Antigen, einen Antikörper, ein Hapten oder ein immunreaktives Fragment desselben umfasst, ausgewählt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Antigen ein Protein, ein Enzym oder ein Oligonukleotid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Hapten ein Hormon, ein Medikament oder ein Allergen ist.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren eine einstufige Sandwich-Immunanalyse und der Indikator der Fluoreszenz anzeigende zweite spezifische Bindungspartner ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren eine zweistufige Sandwich-Immunanalyse und der Indikator der die Fluoreszenz anzeigende zweite spezifische Bindungspartner ist.

11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren eine vergleichende Immunanalyse und der Indikator ein Fluoreszenz anzeigendes Analytikum oder ein immunologisches Analogon desselben ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Fluoreszenz-Indikator indirekt mit dem Analytikum oder einem immunologischen Analogon desselben über eine Liganden-Antiliganden-Bindung zusammenhängt, so dass der Fluoreszenz-Indikator an den Liganden und das Analytikum oder das immunologische Analogon desselben an den Antiliganden gebunden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der erste spezifische Bindungspartner vor dem Kontakt mit der Körperflüssigkeit mit dem Indikator gesättigt ist.

14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Fluoreszenz-Indikator ein fluoreszierender Farbstoff, aus der Gruppe umfassend 3,3-Trimethylindolenium-5-sulfonat-pentamethin-zyanin-1-(6-pentyl-N- hydroxysuccinimid)-ester, Rhodamin-isozyanat, Fluorescein-isozyanat, Allophycozyanin, R-Phycoerythrin, B-Phycoerythrin oder ein nahezu infraroter Farbstoff ist.

15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Fluoreszenz-Indikator ein gefärbtes fluoreszierendes Partikel ist.

16. Verfahren zur verbesserten Sammlung fluoreszierender Emissionen in einer aus Oberflächen-Plasmonresonanz basierenden Fluoreszenz- Immunanalyse, die die Berührung mit einer durch ein geschichtetes optisches System auf Analytikum zu testende Körperflüssigkeit umfasst, wobei das System in Folge aus einem transparenten Substrat, einer Zwischenschicht aus Metallfilm zur Unterstützung einer Oberflächen- Plasmonresonanz besteht, auf der unbeweglich ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum, und ein Fluoreszenz-Indikator, der entweder mit dem Analytikum, einem immunologischen Analogon desselben oder einem zweiten spezifischen Bindungsparameter für das Analytikum konjugiert; wobei das geschichtete optische System von der Substratseite mit Erregerstrahlung von einer Wellenlänge, einer Polarität und einem Auftreffwinkel abstrahlt, welche die Oberflächen- Plasmonresonanz erzeugt und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von einem spezifisch gebundenen Indikator induziert, auf diese Weise jede Veränderung in der Frequenz oder der Menge der Fluoreszenzemission über einen vorherbestimmten Zeitraum misst und die gemessene Veränderung in der Frequenz oder Menge der Fluoreszenzemission auf das Vorhandensein beziehungsweise die Menge des Analytikums korreliert, wobei der Messschritt die Veränderung in der Frequenz oder der Menge der Fluoreszenzemission mit Hilfe eines fluoreszierenden Bündelungsmittels umfasst, das im wesentlichen die gesamte Fluoreszenz in dem Emissionskegel aufnimmt, wobei das Mittel das Substrat erfasst, welches eine Geometrie hat, dass es die Fluoreszenzemission entlang zweier winkliger Ebenen in einem sphärischen Koordinatenraum bündelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine 360º-Drehfläche mit einer symmetrischen Achse umfasst, die senkrecht zur Grenzfläche zwischen Substrat und Film steht, wobei die Drehfläche sich auf die Oberfläche bezieht, deren Verbindung mit einer Ebene senkrecht zu ihrer Symmetrieachse einen Kreis bildet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Drehfläche eine Halbkugel, ein Ellipsoid, einen Kegel, ein Paraboloid oder einen Kegelstumpf- Paraboloid bildet.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Substrat wie eine Halbkugel, ein Ellipsoid, ein Kegel, ein Paraboloid oder ein Kegelstumpf-Paraboloid geformt ist und die Abstrahlung durch ein flaches optisches Fenster in das Substrat eintritt oder aus dem Substrat austritt, um die Divergenz der Fresnel-Reflektion der Eintrittserregerstrahlung so gering wie möglich zu halten.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Bündelungsmittel paraboloide oder ellipsoide Oberflächenreflektoren umfassen, die relativ zum Substrat angeordnet sind, um divergente Erregerstrahlung so entlang einer definierten optischen Achse umzuleiten, dass die fluoreszierende Emission weitestgehend gebündelt wird.

20. Oberflächen-Plasmonresonanzvorrichtung für die Fluoreszenz- Immunanalyse eines Analytikums in einer einfachen Vorrichtung, die folgendes umfasst:

(a) eine optische Struktur, umfassend in Folge (i) ein transparentes Festphasensubstrat, beschichtet mit (ii) einem Metallfilm, der Oberflächen-Plasmonresonanz unterstützt, wobei (iii) ein erster spezifischer Bindungspartner für das Analytikum direkt oder indirekt auf dem Metallfilm immobilisiert wird, so dass ein Indikator, der aus einem Fluoreszenz-Indikator besteht, welcher entweder mit (i) dem Analytikum oder einem immunologischen Analogon desselben oder (ii) mit einem zweiten spezifischen Bindungspartner für das Analytikum an die optische Struktur in einer Menge proportional zur Menge des Analytikums in der Probe nach Kontakt mit der optischer Struktur, der Probe und dem Indikator gekoppelt ist;

(b) eine Lichtquelle, die so angeordnet ist, dass sie die optische Struktur von der Substratseite mit Erregungsstrahlung einer Wellenlänge, Polarität und eines Auftreffwinkels bestrahlt, die ausreichen, um die Oberflächen-Plasmonresonanz zu erzeugen und einen Fluoreszenz-Emissionskegel von einem Tracer jeder beliebigen optischen Struktur zu induzieren;

(c) ein Fluoreszenz-Bündelungsmittel, das im wesentlichen die gesamte Fluoreszenz im Emissionskegel auffängt, wobei das Mittel aus dem Substrat besteht, das eine Geometrie aufweist, die die fluoreszierende Strahlung entlang zweier winkliger Ebenen in einem sphärischen Koordinatenraum bündelt, wobei die Geometrie der Substratoberfläche eine 360º-Drehfläche mit einer Achse senkrecht zur Substrat/Film-Grenzfläche umschreibt, wobei die Drehfläche sich auf jede Fläche bezieht, deren Verbindung mit einer Ebene rechtwinklig zur Symmetrieachse einen Kreis bildet.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei der Metallfilm eine Dicke von etwa 10 nm bis 100 nm hat.

22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, wobei die optische Struktur ferner eine darunter liegende dielektrische Zwischenschicht zwischen dem Metallfilm und dem ersten spezifischen Bindungspartner beziehungsweise eine darüber liegende dielektrische Zwischenschicht zwischen dem Metallfilm und dem ersten spezifischen Bindungspartner enthält, wobei jede dielektrische Schicht eine Dicke von etwa 2 nm bis 1500 nm hat.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei jedes Substrat aus der Gruppe, die aus Glas, Kieselerde und optischem Faserstoff besteht, gewählt ist.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das Substrat transparent für Strahlung zwischen 400 nm und 1500 nm ist.