DE68914134T2

DE68914134T2 - Testverfahren fuer einen in einer probe enthaltenden ligand.

Info

Publication number: DE68914134T2
Application number: DE68914134T
Authority: DE
Inventors: John Attridge; Ian Shanks
Original assignee: ARS HOLDING 89 NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1989-07-25
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-07-26
Also published as: CA1339005C; ZA895648B; IL91105A0; NO177407C; AU638938B2; AU4043389A; WO1990001166A1; JPH03502604A; NO177407B; JP2969177B2; GB8817710D0; EP0382832A1; DE68914134D1; EP0353937A1; EP0382832B1; ES2050277T3; NO901349D0; NO901349L

Description

Die Erfindung betrifft Assaytechniken und Mittel zur Durchführung dieser Techniken. Inbesondere betrifft sie eine verbesserte Assaytechnik, die ein erhöhtes Signal-Rausch- Verhältnis und erhöhte Empfindlichkeit bietet.
Die Assaytechniken der vorliegenden Anmeldung beruhen auf der Affinität zwischen dem zu untersuchenden Teilchen (nachstehend als "Ligand" bezeichnet) und einem spezifischen Bindungsmaterial für den Liganden (nachstehend als "spezifischer Bindungspartner" bezeichnet), der auf einen speziellen Oberflächentyp beschichtet ist. Solche Techniken sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, insbesondere hinsichtlich beschichteter optischer Strukturen, wobei die Bindung des Liganden an den spezifischen Bindungspartner zu einer nachweisbaren Veränderung in den optischen Eigenschaften der optischen Struktur führt, und sie wurden beispielsweise in der EP-0 112 721 und der EP-0 178 083 beschrieben. Erfindungsgemäß wird ein alternatives Assayverfahren mit beträchtlichen Vorteilen gegenüber herkömmlichen Assays bereitgestellt.
Die WO-A-88/07202, die Teil des Stands der Technik nach Art. 54(3) EPÜ bildet, offenbart ein Assayverfahren auf einen Liganden, bei dem ein Beugungsgitter mit der Fähigkeit, eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz zu zeigen, verwendet wird, wobei an die Oberfläche ein spezifischer Bindungspartner für den Liganden, der nachgewiesen werden soll, gebunden ist. Die Verwendung des mit einem Fluorphor markierten Materials in einer Ausführungsform eines solchen Assays wird auch beschrieben.
Die EP-A-0 346 016, die auch Teil des Stands der Technik nach Art. 54(3) EPÜ ist, offenbart einen Sensor zur Verwendung in biologischen, biochemischen oder allgemeinen chemischen Tests, wobei das Phänomen der Oberflächen- Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich verwendet wird. Die in dem Sensor verwendete optische Struktur besitzt einen für die Strahlungsquelle transparenten Materialblock, eine Membran aus einem dielektrischen Material, das auf einer Oberfläche des Blocks angebracht ist, eine Metallschicht, die auf der Oberfläche der Membran gegenüber dem Block aufgebracht ist und eine geeignete Schicht aus einem empfindlichen Material, das auf die Metallschicht aufgebracht ist. Es ist beschrieben, daß das transparente Material und die Membran aus dem dielektrischen Material in der gleichen integralen Struktur nur in einem Beispiel vorkommen, in dem die optische Struktur die Form eines kontinuierlichen Films annimmt, der von einer Zufuhrtrommel auf eine Aufnahmetrommel bewegt werden kann. Diese Druckschrift beschreibt nicht die Verwendung fluoreszierender oder phosphoreszierender Bindungsverbindungen im Zusammenhang mit den beschriebenen Sensoren.
Gemäß dem breitesten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung Verbesserungen eines Assayverfahrens auf einen Liganden in einer Probe, bei dem man
a) die Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, der auf einer Oberfläche einer optischen Struktur angebracht ist, inkubiert;
b) eine andere Oberfläche der optischen Struktur in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen so bestrahlt, daß die Resonanz und/oder die gesamte innere Reflexion der Strahlung innerhalb der optischen Struktur und/oder der Schicht des spezifischen Bindungspartners stattfindet; und
c) die reflektierte und/oder erzeugte Strahlung analysiert, um zu bestimmen, ob und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit die erzeugte Strahlung und/oder die optischen Eigenschaften der optischen Struktur durch Komplexbildung verändert werden.
Es ist zu verstehen, daß der hier verwendete Ausdruck "erzeugte Strahlung" Fluoreszenz und Phosphoreszenz umfaßt. Obwohl die Erfindung nachstehend unter besonderem Bezug auf Fluoreszenz beschrieben wird, ist sie auch auf Phosphoreszenz anwendbar.
Die optische Struktur umfaßt ein Substrat und gegebenenfalls eine oder mehrere Materialschichten, die zwischen dem Substrat und der Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner, die auf der Oberfläche der optischen Struktur angebracht ist, angeordnet sind. Im allgemeinen kann die Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Jedoch kann bei einigen Ausführungsformen der Erfindung, wie nachstehend beschrieben und insbesondere, wenn der spezifische Bindungspartner direkt auf der Substratoberfläche der optischen Struktur ohne irgendwelche dazwischen vorhandene Materialzwischenschichten angebracht ist, eine kontinuierliche Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner bevorzugt sein.
Überraschenderweise erwies sich das erfindungsgemäße Verfahren als allgemein anwendbar, um die Empfindlichkeit sowohl direkter als auch indirekter Meßmethoden von Assays auf der Basis der optischen Eigenschaften bestimmter Oberflächen zu erhöhen. Die direkte Messung im Zusammenhang mit der Erfindung ist mit der Überwachung der Modulation eines Signals aus einer biochemischen Reaktion (z.B. Antigen/Antikörper-Bindung) verbunden. Die indirekte Messung ist mit der Überwachung eines Markers (zB. eines Fluorophors) durch einen Übeträger zur quantitativen Bestimmung einer biochemischen Reaktion verbunden.
Die Technik ermöglicht eine wesentliche Erhöhung der Intensität des elektrischen Feldes an der Oberfläche der optischen Struktur, wodurch die Wechselwirkung zwischen der anregenden Strahlung und dem Ligand/spezifischer Bindungspartner-Komplex erhöht wird, wodurch das Ansprechen auf die Komplexbildung an der Oberfläche der optischen Struktur maximiert wird, und bei den Ausführungsformen, bei denen indirekte Meßtechniken verwendet werden, signifikant die Größen des Hintergrundsignals verringert werden.
So kann, wenn ein direktes Meßverfahren auf der Basis der Veränderung des Brechungsindex der Oberflächenschicht, die auf einer optischen Struktur angebracht ist, nach Bindung des nachzuweisenden Liganden verwendet wird, das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Oberflächenfeldintensität, die durch die einfallende Strahlungsquelle erzeugt wird, und zur Erhöhung der Resonanz bzw. Resonanzen, die im Zusammenhang mit der Kopplung an Schwingungsarten steht bzw. stehen, die sich in die Oberflächenschicht fortpflanzen, verwendet werden.
So betrifft gemäß einem Gesichtspunkt die Erfindung ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen
(a) Inkunieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, wobei die optische Struktur ein transparentes Substrat, das mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist, die ihrerseits mit einer Schicht aus einem dielektrischen Material einer Dicke, die geeignet ist, eine oder mehrere geführte Schwingungsarten zu unterstützen, beschichtet ist, umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche der Schicht aus dem dielektrischen Material der optischen Struktur aufgebracht ist;
(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird und an eine geführte Schwingungsart, die von der Schicht aus dem dielektrischen Material unterstützt wird, gekoppelt wird; und
(c) Analyse der reflektierten Strahlung, um zu bestimmen, ob und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit die optischen Eigenschaften des durch die optische Struktur und den spezifischen Bindungspartner, der darauf angebracht ist, gebildeten Sensors durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner verändert werden.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann die einfallende Strahlung an eine geführte Schwingungsart gekoppelt werden, die durch eine optische Struktur spezieller Geometrie unterstützt werden kann. Optische Strukturen mit geeigneter Geometrie wurden zuvor in der US 4649280 im Zusammenhang mit einem Fluoreszenzimmunoassay beschrieben. Es wurde jedoch bisher nicht erkannt, daß ähnliche Techniken auf ein direktes Meßverfahren eines Assays angewandt werden können. Die optische Struktur umfaßt ein transparentes (mindestens für die Wellenlänge der verwendeten Strahlung) Substrat, das mit einer dünnen Metallschicht, wie Silber oder Gold, beschichtet ist, wobei die Metallschicht selbst mit einer Schicht aus einem dielektrischen Material wie Kieselsäure beschichtet ist. Die Schicht aus dem dielektrischen Material besitzt eine Dicke beispielsweise in der Größenordnung einer Wellenlänge der verwendeten einfallenden Strahlung, die ausreicht, eine oder mehrere geführte Schwingungsarten zu unterstützen, aber es ist besonders bevorzugt, eine Dicke des dielektrischen Materials zu verwenden, die nur eine einzelne geführte TE- oder TM-Schwingungsart unterstützt. Beispielsweise beträgt für ein Substrat mit einem Brechungsindex von 1,52 mit einer 50 nm Silberschicht und einer einfallenden Strahlungswellenlänge von 543 nm die Dicke der dielektrischen Kieselsäureschicht für eine einzelne transversale, magnetische (TM), geführte Schwingungsart 350 nm bis 750 nm. Eine ähnliche Dicke wird benötigt, um eine einzelne geführte Schwingungsart einer transversalen elektrischen (TE) Strahlung fortzupflanzen.
Der Bereich der Erfindung erstreckt sich auch auf einen Sensor zum Nachweis eines Liganden in einer Probe nach dem vorstehenden Verfahren, wobei der Sensor eine optische Struktur mit einem Substrat, das mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist, umfaßt, wobei die Metallschicht selbst mit einer Schicht aus einem dielektrischen Material einer Dicke, die geeignet ist, eine oder mehrere geführte Schwingungsarten der Strahlung der verwendeten Wellenlänge bei Verwendung des Sensors zu unterstützen, und wobei die dielektrische Schicht einen spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden trägt.
Die Erfindung umfaßt auch ein Kit zur Verwendung bei dem vorstehend erwähnten Assayverfahren, das
(a) einen wie vorstehend definierten Sensor;
(b) eine Strahlungsquelle, die geeignet ist, eine resonanzaktive geführte Schwingungskopplung innerhalb der in dem Sensor enthaltenen optischen Struktur zu erzeugen;
(c) Mittel zur Analyse der Strahlung, die bei Verwendung von dem Sensor reflektiert wird, umfaßt.
In einer alternativen, erfindungsgemäßen Ausführungsform zur direkten Messung wird die einfallende Strahlung an eine Oberflächen-Plasmon-Schwingungsart über einen weiten Bereich gekoppelt, die aus der Wechselwirkung der Oberflächenplasmone auf jeder Seite der Metallschicht entsteht.
So wird ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Stufen
(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner auf den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, wobei die optische Struktur anders als in Form eines kontinuierlichen Films vorliegt, und die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und, dazwischen angebracht, eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner direkt oder indirekt an die Metallschicht adsorbiert oder gebunden ist;
(b) Bestrahlen einer weiteren Oberfläche der optischen Struktur, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird und eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich in der optischen Struktur eintritt; und
(c) Analyse der reflektierten Strahlung, um zu bestimmen, ob gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit die optischen Eigenschaften des Sensors, der von der optischen Struktur und dem darauf angebrachten, spezifischen Bindungspartner gebildet wird, durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner verändert werden.
Bei dieser Ausführungsform kann die optische Struktur beispielsweise ein Glassubstrat umfassen, und die Metallschicht, wie Silber oder Gold, ist von dem Substrat durch eine Schicht auf einem Dielektrikum mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat, beispielsweise MgF&sub2;, getrennt. Die Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich (LRSPR) ist üblicherweise mit einer Geometrie assoziiert, bei der die Brechungsindizes der dielektrischen Schichten auf jeder Seite der Metallschicht identisch sind. Jedoch wurde gefunden, daß LRSPR immer noch erreicht werden kann, wenn ein geringer Reflexionsverlustindex vorhanden ist, und daß ein Empfindlichkeitsbereich unter Verwendung von Schichten unterschiedlicher Dicke und/oder durch Auswahl von Materialien mit geeigneten Reflexionsverlustindizes möglich ist. Wenn so die Dicke der dielektrischen Schicht erhöht wird, muß die Dicke der Metallschicht erhöht werden, um die Resonanzkopplung zwischen der einfallenden Strahlung und der Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich zu optimieren.
Erfindungsgemäß wird somit weiterhin ein Sensor zum Nachweis eines Liganden in einer Probe bereitgestellt, der eine optische Struktur in einer anderen Form als einem kontinuierlichen Film umfaßt, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und dazwischen angebracht eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als der des Substrats und einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden in Adsorption oder Bindung (direkt oder indirekt) auf die Metallschicht, umfaßt, wobei die Schichten so sind, daß bei Verwendung die langwellige Oberflächen-Plasmon-Resonanz darin fortgepflanzt werden kann.
Bevorzugt besteht die Metallschicht aus Silber, ist 10 bis 50 nm dick, insbesondere 15,5 nm dick, und die dielektrische Schicht besteht bevorzugt aus MgF&sub2; mit einer Dicke von 10 bis 2000 nm, insbesondere 1500 nm.
Der Umfang der Erfindung erstreckt sich auf ein Kit zur Verwendung bei dem vorstehenden Assayverfahren, das
(a) einen wie vorstehend definierten Sensor zur Verwendung bei dem Verfahren;
(b) eine Strahlungsquelle mit der Eignung, eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich innerhalb der in dem Sensor enthaltenen optischen Struktur zu erzeugen
(c) Mittel zur Analyse der Strahlung, die bei Verwendung von dem Sensor reflektiert wird oder dadurch erzeugt wird, umfaßt.
Die Empfindlichkeit von Assays mit direkter Messung kann geeigneterweise aus der Auflösung des Sensors abgelesen werden. Die Auflösung kann als das Verhältnis der Winkelverschiebung in dem Resonanzpeak für eine spezielle Veränderung des Brechungsindex des der Metalloberfläche benachbarten Mediums zu der halben Winkelbreite des reflektierten Resonanzminimums definiert werden. Der hier verwendete Ausdruck "halbe Winkelbreite" bedeutet den Winkelbereich zwischen den Einfall- oder Reflektionswinkeln auf jeder Seite des einfallenden oder austretenden Winkels, der im Zusammenhang mit dem Resonanzreflektionsminimum auftritt, bei dem die Reflexion die Hälfte ihres Minimalwerts hat. Je größer die Auflösung, desto größer ist die Empfindlichkeit des Meßsystems hinsichtlich der Auflösung der Resonanzveränderungen infolge der Ligandenbindung, wodurch die Empfindlichkeit des Assays erhöht wird. In vergleichbaren Anordnungen und für die gleiche Veränderung des Brechungsindex ergeben die bevorzugten Materialien und Dimensionen, die für die erste Ausführungsform vorstehend beschrieben wurden, einen r-Wert größer als 5, und bei denen der zweiten vorstehend beschriebenen Ausführungsform einen r-Wert von größer 12 (mit einer halben Winkelbreite von etwa 1/6 Grad) im Vergleich zu einem r-Wert von 0,47 bis 0,76 und einer halben Winkelbreite von etwa 1,5 Grad unter Verwendung eines feinen Silberfilms.
Jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren bei Anwendung auf einen Assay mit einem indirekten Meßverfahren, wie die Techniken, die auf oberflächengebundenen Fluorophoren beruhen, besonders vorteilhaft. Wie bereits für die direkten Meßtechniken beschrieben, kann das Verfahren verwendet werden, um die Oberflächenfeldintensität, die durch die einfallende Strahlung erzeugt wird, zu erhöhen, und um die erzeugten Resonanzpeaks zu verschärfen. Dies selbst erzeugt große Verbesserungen in der Spezifität und der Empfindlichkeit der Fluoreszenzassays, weil die gebundenen Fluorophore durch das abklingende Feld, das an der Außenoberfläche der optischen Struktur erzeugt wird, angeregt werden. Dies minimiert die Anregung der nichtgebundenen Fluorophore und verringert somit das Hintergrundsignal. Zusätzlich wird die Oberflächenfeldintensität im Vergleich sowohl zur direkten Einstrahlung als auch zur abklingenden Einstrahlung über die totale interne Reflexion stark verstärkt, und so ist die verfügbare Energie größer und das von dem gebundenen Fluorophoren erhaltene Signal sehr signifikant verstärkt.
Jedoch können noch weitere Vorteile dadurch erhalten werden, daß man die emittierte Fluoreszenz an den Detektor über die optische Struktur koppelt, und der Winkelbereich des Detektors kann begrenzt werden, um zu gewährleisten, daß im wesentlichen nur die Strahlung, die von dem gebundenen Fluorophor emittiert wird, nachgewiesen wird. Ferner kann durch Anbringen des Detektors außerhalb der Ebene der Einstrahlung/Reflexion eine weitere Abnahme des Hintergrundsignals erzielt werden. Filtern des nachgewiesenen Lichts wird dann nur benötigt, um die gestreute Anregungsstrahlung im Gegensatz zur reflektierten zu beseitigen. Geeignete Anordnungen für die optischen Detektoren zur Messung der Fluoreszenzemission gebundener Fluorophore, die über die gesamte interne Reflexion der Oberflächen-Plasmon-Resonanz in die optische Struktur gekoppelt sind, wurden beispielsweise in der EP-0 170 376 beschrieben, und die Verwendung von abklingender Feldanregung unter Verwendung der gesamten internen Reflexion wurde auch in der US 4608344, US 4447546 und US 4558014 beschrieben. Jedoch wurde zuvor nicht erkannt, daß die Verfahren in modifizierter Form allein oder in Kombination allgemein anwendbar sein könnten, um wesentliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik zu ergeben.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Stufen
(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur angebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes X, das entweder ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markiertes Ligandenanalogon, das für den gleichen spezifischen Bindungspartner spezifisch ist, oder ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markierter weiterer spezifischer Bindungs-partner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat und ggfs. eine oder mehrere Materialschichten, die zwischen dem Substrat und dem spezifischen Bindungspartner angebracht sind, umfaßt;
(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einer Ebene senkrecht zu der Ebene der Materialschichten und in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird, und Fluoreszenz oder Phosphoreszenz erzeugt wird; und
(c) Überwachen der erzeugten Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, die aus einer Kante der optischen Struktur austritt, und Analyse der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, um zu bestimmen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit diese durch die Komplexbildung verändert wird, wobei die Achse der Detektionsoptik im wesentlichen rechtwinklig zu der Ebene, in der die optische Struktur bestrahlt wird und aus der die Reflexion austritt, steht.
Beispielsweise kann bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform das abklingende Feld, das mit der totalen internen Reflexion assoziiert ist, verwendet werden, um Fluorophore innerhalb etwa 1 um der Grenzfläche optische Struktur- Probe anzuregen. Die optische Struktur wird mit einer einzelnen Reflexion in eine Ebene, die im wesentlichen rechtwinklig zu der Achse der Detektionsoptik ist, bestrahlt. Dies ergibt einen Vorteil gegenüber den in den vorstehend erwähnten US-Patenten beschriebenen Anordnungen, weil die nachgewiesene Strahlung und die Strahlungsquelle in verschiedenen Ebenen sind, und so die Auflösung von einfallender und austretender Strahlung vereinfacht wird. Das Filtern des nachgewiesenen Lichts wird nur benötigt, um gestreute Strahlung zu entfernen, obwohl solche Streustrahlung, die als Folge des Hintergrunds der Lösungsfluoreszenz emittiert wird, im wesentlichen unter Verwendung einer abklingenden Anregung eliminiert wird.
Beispiele für fluoreszierende Moleküle, die zur Verwendung eines Markers geeignet sind, sind Rhodaminisothiocyanat, Dansylchlorid, FITC und XRITC.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt wird erfindungsgemäß ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Stufen
(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur angebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes, das entweder ein fluoreszierend oder phosporeszierend markiertes Ligandenanalogon, das für den gleichen spezifischen Bindungspartner spezifisch ist, oder ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markierter weiterer spezifischer Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und gegebenenfalls eine Schicht aus einem dielektrischen Material, das zwischen der Metallschicht und der Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner, die auf der Oberfläche der optischen Struktur angebracht ist, umfaßt, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und gegebenenfalls eine Schicht aus einem dielektrischen Material, das zwischen der Metallschicht und der Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner, die auf der Oberfläche der optischen Struktur angebracht ist, umfaßt, wobei die optische Struktur ein planarer Hohlleiter, ein Prisma, eine optische Faser oder ein Objektträger, ausgenommen ein Beugungsgitter, ist;
(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß die Oberflächen-Plasmon-Resonanz innerhalb oder an der Oberfläche der optischen Struktur eintritt, so daß Fluoreszenz oder Phosporeszenz erzeugt wird; und
(c) Analyse der erzeugten Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, um zu bestimmen, ob und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit diese durch Komplexbildung verändert wird.
In einer Ausführungsform dieses Gesichtspunkts der Erfindung wird die einfallende Strahlung in eine Oberflächen- Plasmon-Resonanz (SPR)-Schwingungsart, die zwischen einer dünnen Metallschicht, beispielsweise aus Silber oder Gold, und einer dielektrischen Schicht, die beispielsweise aus Kieselsäure, Phosphatglas oder einem Silan (z.B. Glycidoxypropyltrimethoxysilan) sein kann, erzeugt wird, gekoppelt. Kieselsäure kann als Passivierungsschicht zum Schutz der Metallschicht vor Korrosion und zur Erzeugung einer Oberfläche, auf der der spezifische Bindungspartner bequem, beispielsweise kovalent, immobilisiert werden kann, wirken. Es ist jedoch zu verstehen, daß der spezifische Bindungspartner direkt auf die Metallschicht adsorbiert werden kann, um selbst die Schicht aus dem dielektrischen Material zu bilden, und in dieser speziellen Ausführungsform ist es bevorzugt, daß der spezifische Bindungspartner eine kontinuierliche Schicht mindestens über einen abgetrennten Bereich der optischen Struktur bildet. Es wurde gezeigt, daß die Intensität des abklingenden Feldes eines Oberflächen-Plasmons im Vergleich zu der, die mit der totalen internen Reflexion im Zusammenhang steht, als Folge der Fokussierwirkung der Kopplung der einfallenden Strahlung an eine zweidimensionale Oberflächenwelle stark erhöht wird. Die unter Verwendung einer Oberflächen-Plasmon-Resonanz erhältliche Oberflächenfeldintensität ist wellenlängenabhängig, wobei sie bei größeren Wellenlängen innerhalb der optimierten optischen Struktur größer ist.
Fluorophore innerhalb des abklingenden Feldes werden durch ein Oberflächen-Plasmon mit geeigneter Wellenlänge angeregt, und eine verstärkte Emission tritt auf. So werden erfindungsgemäß die allgemeinen Vorteile einer erhöhten Oberflächenfeldintensität und Anregungsspezifität erhalten. Jedoch können diese Vorteile noch stark unter Verwendung einer umgekehrten optischen Anordnung vergrößert werden, wobei der angeregte Fluorophor in den Grundzustand durch Kopplung seiner Emission an ein Oberflächen-Plasmon der verschobenen Stoke-Wellenlänge erhöht werden. Bei dieser Ausführungsform tritt erhöhte Fluoreszenzemission über einen engen Winkelbereich auf, der von der Oberflächen-Plasmon- Dispersion und dem Emissionsspektrum des Fluorophors bestimmt wird (vgl. beispielsweise Benner et al., Optics Communications, 30, 145-149 (1979)). Die anschließende Strahlung der Oberflächen-Plasmon-Energie kann dann durch eine optische Anordnung, die der, die in der vorstehenden EP-0 170 376 beschrieben ist, ähnlich ist, bestimmt werden. Wie bei abklingender Einstrahlung allein können nichtgebundene Lösungsfluorophore (d.h. ein Fluorophor, der sich in einer Entfernung von der Oberfläche, die im wesentlichen größer als die Wellenlänge der verwendeten, einfallenden Strahlung ist, befindet) nur durch Streuen der einfallenden Strahlung angeregt werden, aber angesichts des engen Winkels der Fluorszenzemission der Fluorophore innerhalb des abklingenden Felds und der Eigenschaften der Oberflächen-Plasmon-Resonanz des Metallfilms wird jedes derartige Lösungssignal noch weiter durch den Metallfilm geschwächt und dadurch das Hintergrundsignal weiter verringert. Die Kopplungswahrscheinlichkeit des angeregten Fluorophors an die Oberflächen-Plasmone des Metalls kann durch einen geeigneten Abstand der Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner von der Metallschicht kontrolliert werden (vgl. beispielsweise Weber und Eagan, Optics Letters 4, 236 (1979)).
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das abklingende Feld, das im Zusammenhang mit der langwelligen Oberflächen-Plasmon-Resonanz steht, verwendet, um die oberflächengebundenen Fluorophore anzuregen.
So wird gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Stufen
(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes, das entweder ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markiertes Ligandenanalogon, das für den gleichen spezifischen Bindungspartner spezifisch ist, oder ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markierter weiterer spezifischer Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und, dazwischen angebracht, eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner direkt oder indirekt an die Metallschicht adsorbiert oder gebunden ist;
(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich eintritt, und Fluoreszenz oder Phosphoreszenz erzeugt wird; und
(c) Analyse der erzeugten Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, um zu bestimmen, ob und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit diese durch die Komplexbildung verändert wird.
Ein, wie vorstehend beschriebener, Sensor, in dem die LRSPR sich fortpflanzen kann, eignet sich zur Verwendung in solchen Assays. In jeder Hinsicht sind die Vorteile der Verwendung von LRSPR die gleichen wie vorstehend für die Oberflächen-Plasmon-Resonanz diskutiert, ausgenommen, daß die Oberflächenfeldverstärkung größer (10-fach) als die Oberflächen-Plasmon-Resonanz ist, und die Emissionswinkel kleiner sind, was von besonderem Vorteil ist, wenn das emittierte Licht selbst über LRSPR in die optische Struktur gekoppelt wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren wurden realistisch infolge einer Anzahl von Modifikationen der benötigten Instrumente, sowohl zur Bestrahlung der optischen Struktur als auch zur Analyse der reflektierten, transmittierten und/oder fortgepflanzten Strahlung, durchführbar. So wird erfindungsgemäß weiterhin eine Apparatur, die zur Verwendung in einem vorstehend beschriebenen Assayverfahren geeignet ist, bereitgestellt, die (a) einen Sensor, wobei der Sensor einen spezifischen Bindungspartner für einen nachzuweisenden Liganden, der auf der Oberfläche einer optischen Struktur, umfassend ein Substrat und eine oder mehrere Materialschichten, die zwischen dem Substrat und dem spezifischen Bindungspartner angebracht sind, aufgebracht ist, enthält; (b) eine Collimatorstrahlungsquelle, die so angebracht werden kann, daß bei Verwendung die Strahlung in die optische Struktur in einem geeigneten Winkel zur Erzeugung einer totalen internen Reflexion und gegebenenfalls Resonanz (wobei die Resonanz eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz, eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich oder eine resonanzaktive, geführte Schwingungskopplung ist) innerhalb der optischen Struktur; und (c) Mittel zur Analyse der bei Verwendung reflektierten oder erzeugten Strahlung umfaßt.
Die Strahlung kann beispielsweise auf ein oder zwei Grad collimiert werden und kann bei Verwendung in eine optische Struktur innerhalb der Apparatur, beispielsweise durch eine Kante des Substrats der optischen Struktur oder über ein Prisma oder eine Gitterkopplung, eingeführt werden. Idealerweise ist die Strahlungsquelle polarisiert, bevorzugt transversal magnetisch polarisiert, aber eine unpolarisierte Strahlungsquelle kann auch verwendet werden.
Wenn bei dem Assayverfahren eine Kopplung der Fluorszenz der oberflächengebundenen Fluorophore in die optische Struktur beteiligt ist, beispielsweise durch totale interne Reflexion, SPR oder LRSPR, kann die Empfindlichkeit des Verfahrens durch Verwendung einer Apparatur, worin der Winkelbereich, bezogen auf die Detektionsrichtung, begrenzt ist, beispielsweise auf 3º, zur Entsprechung mit den Emissionswinkeln der gekoppelten Fluoreszenz weiter erhöht werden. Eine theoretische Analyse dieses Effekts ist in der EP-0 170 376 angegeben.
Es ist besonders bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Immunoassay anzuwenden und insbesondere eine spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung ähnlich der in der EP-0 171 148 beschriebenen, zusammen mit dem in der EP-0 170 376 beschriebenen Verfahren zur optischen Analyse zu verwenden. So wird erfindungsgemäß eine spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung mit einer Kavität oder Kavitäten, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit in die Kavität durch die Kapillarwirkung gezogen werden kann, und wobei mindestens ein Teil der Wand der Kavität einen Sensor zur Nachweis eines Liganden in einer Probe umfaßt, wobei der Sensor ein erfindungsgemäßer Sensor, wie vorstehend beschrieben, ist, bereitgestellt. Bei dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung umfaßt die optische Struktur einen planaren Hohlleiter.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer solchen Vorrichtung trägt die Wand der Kapillarkavität, die von der Wand, die einen Sensor umfaßt, entfernt ist, in trockener, freisetzbarer Form ein fluoreszierend oder phosphoreszierend markiertes Ligandenanalogon oder einer weiteren spezifischen Bindungspartner.
Es ist jedoch klar, daß die bei dem erfindungsgemäßen Assayverfahren verwendete optische Struktur nicht auf planare Hohlleiter beschränkt ist und andere optische Strukturen, wie Gitter (abgesehen von den vorstehend angegebenen spezifischen Ausnahmen), Prismen, optische Fasern und Objektträger, wie Gitter, Prismen, optische Fasern und Objektträger, umfaßt, mit der Maßgabe, daß eine geeignete Geometrie zur Einführung der einfallenden Strahlung, außer über den Weg durch die Probe und in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich, so daß Resonanz und/oder totale interne Reflexion eintreten kann, gewählt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand ein Antigen, und der spezifische Bindungspartner umfaßt einen Antikörper gegen das Antigen. Jedoch soll die Erfindung nicht auf Assays von Antikörpern oder Antigegen beschränkt werden. Beispiele von Liganden, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammen mit einer Angabe eines geeigneten spezifischen Bindungspartners in jedem Fall angegeben. Tabelle 1 Ligand Spezifischer Bindungspartner Antigen Antikörper Hormon Hormonrezeptor Polynucleotidstrang Avidin Biotin Protein A Immunglobulin Spezifischer Antikörper Antigen Hormonrezeptor Hormon Komplementärer Polynucleotidstrang Biotin Avidin Immunglobulin Protein A Enzym Enzym-Cofaktor (Substrat) oder -Inhibitor Lectine Spezifisches Kohlenhydrat der Lectine Enzym
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine sehr breite Anwendbarkeit, aber kann insbesondere für Assays verwendet werden: Hormone, einschließlich Peptidhorme (z.B. schilddrüsenstimulierendes Hormon (z.B. TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (hCG), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder nichtpeptidartige Hormone (z.B. Steroidhormone, wie Cortisol, Östradiol, Progesteron und Testosteron oder Schilddrüsenhormone, wie Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z.B. karzinoembryonales Antigen (CEA) und α-Fötoprotein (AFP), Arzneimittel (z.B. Digoxin), Zucker, Toxine, Vitamine, Proteine, Viren, wie Influenza-, Parainfluenza-, Adeno-, Hepatitis-, respiratorische und AIDS-Viren, oder Mikroorganismen.
Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Antikörper", der hier verwendet wird, die folgenden Bedeutungen umfaßt:
(a) eine der verschiedenen Immunglobulinklassen oder -unterklassen, z.B. IgG, IgA, IgM oder IgE, abgeleitet von einem der üblicherweise verwendeten Tiere, z.B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse,
(b) monoclonale Antikörper,
(c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, wobei die Fragmente solche sind, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, d.h. Fragmente ohne den Fc-Teil (z.B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sog. "Halbmolekül"-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schwerkettigen Komponenten des intakten Antikörpers verknüpfen, erhalten wurden.
Das Verfahren zur Herstellung der Antikörperfragmente ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Antigen" werden sowohl permanente antigene Teilchen (z.B. Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, verstanden.
Die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele erläutern spezielle Aspekte der Erfindung.

Beispiel 1

Vergleich der Resonanz-Anregungs-Geometrien

Die nachstehende Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der theoretisch erhältlichen Ergebnisse unter Verwendung einer optischen Struktur, wie sie schematisch in Figur 1 dargestellt ist. Die Anregungswellenlänge für alle Mechanismen war 543 nm, und der Fluorophor war Rhodamin B mit einer Spitzenemission bei 570 nm und einer halben Breite von 35 nm (von 555 nm bis 590 nm).

Beispiel 2

Totale interne Reflexion

(a) Die Figur 2 zeigt die Oberflächenfeldintensität, aufgetragen als Funktion der Winkel für eine Anzahl von Glasindizes in Wasser, mit einer Wellenlänge von 543 nm (grüner HeNe-Laser). Für einen Glasobjektträger mit einem Brechungsindex von 1,52 ist die Feldintensität 2,5mal so hoch wie für die einfallende Strahlung bei 70º.
(b) Die Figur 3 zeigt die Feldintensitätsdurchdringung, aufgetragen als Funktion des Winkels. Entfernt von dem kritischen Winkel ist dies eine langsam variierende Funktion des Einfallswinkels. Für das unter (a) oben angegebene Beispiel beträgt die Felddurchdringung etwa 90 nm bei 70º. Es ist nicht wünschenswert, zu nahe am kritischen Winkel zu arbeiten, weil die Durchdringung zu groß ist und eine schlechte Oberflächendiskriminierung folgen würde. So muß ein Ausgleich zwischen der Feldintensität und der Durchdringungstiefe getroffen werden.

Beispiel 3

Oberflächen-Plasmon-Resonanz

Die Figur 4 zeigt die Reflexion und die Oberflächenfeldintensität eines 50 nm Silberfilms in Wasser, welcher mit 543 nm bestrahlt wurde. Eine 25-fache Verstärkung der Feldintensität ergibt sich bei Vergleich mit der Intensität der einfallenden Strahlung. Tabelle 20α) Mechanismus Schicht Anregungswinkel Emissionsspitzenwinkel Emissionshalbbreite

Beispiel 4

Vergleich von SPR und totaler interner Reflexion

Die Figur 5 zeigt einen Vergleich der Anregung einer Rhodamin B-Lösung durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz und einer totalen internen Reflexion. Die Verstärkung der Emissionsintensität und der enge Emissionsbereich für die SPR-Geometrie können klar erkannt werden. Die Einzelheiten des Versuchs folgen.

(i) Herstellung einer optischen Struktur

Glasobjektträger mit den Maßen 25 mm x 75 mm wurden mittels Ultraschall in einer Detergenslösung gereinigt. Mittels Vakuumabscheidung wurde Chrom auf einer Hälfte einer Oberfläche auf jedem Objektträger durch eine Maske mit einer Dicke von 1 nm aufgebracht. Auf gleiche Weise wurde Silber auf die Chromschicht bis zu einer Dicke von 54 nm aufgebracht. Die Maske wurde entfernt, und eine 10 nm Beschichtung aus Kieselsäure wurde auf der gesamten Oberfläche auf ähnliche Weise aufgebracht, um sicherzustellen, daß beide Hälften der Oberfläche jedes Objektträgers die gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften hatten. Die Objektträger wurden mit ultrareinem Wasser gewaschen. Jeder Objektträger wurde angerissen und in drei Stücke geschnitten (so, daß jedes Stück zur Hälfte versilbert war). Jedes Stück wurde verwendet, um eine Kapillarzelle unter Verwendung eines anderen Glasstückes mit ähnlicher Größe und doppelseitigem Klebeband herzustellen.

(ii) Experimentelles Vorgehen

Eine Probenlösung wurde unter Verwendung einer geeigneten Konzentration eines geeigneten mit Rhodamin B markierten Proteins hergestellt. Das experimentelle Vorgehen war wie in Absatz (iii) des nachstehenden Beispiels 5 beschrieben.

Beispiel 5

Assay auf menschliches Choriongonadotropin (hCG) unter Verwendung einer indirekten Oberflächen-Plasmon-Resonanz- Technik

(i) Herstellung einer optischen Struktur

Glasobjektträger mit den Maßen 25 mm x 75 mm wurden mit Ultraschall in einer Detergenslösung gereinigt. Mittels Vakuumabscheidung wurde Aluminium auf einer Hälfte einer Oberfläche jedes Objektträgers durch eine Maske bis zu einer Dicke von 1 nm abgeschieden. Auf gleiche Weise wurde Silber auf der Aluminiumschicht bis zu einer Dicke von 54 nm abgeschieden. Die Maske wurde entfernt, und eine 10 nm Beschichtung aus Kieselsäure wurde auf der gesamten Oberfläche auf ähnliche Weise abgeschieden, um zu gewährleisten, daß beide Hälften der Oberfläche jedes Objektträgers die gleiche Oberflächenchemie hatten. Die Objektträger wurden 5 mm über einem Bad aus GOPS (Glycidoxypropyltrimethoxysilan) 2 h bei 20ºC eingespannt, um die Kieselsäureoberfläche zu silanisieren, und danach wurden die Objektträger 1 h lang bei 60ºC gebacken. Ein 75 ul Tropfen einer 20 ug/ml Lösung aus α12/17 Anti-hCG-Antikörper in HEPES-Puffer wurde auf jede Hälfte jedes Objektträgers aufgebracht, und die Objektträger wurden 2 h lang trocknen gelassen. Die Objektträger wurden dann mit ultrareinem Wasser gewaschen, und dann wurde eine Saccharoselösung mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Natriumazid auf der Oberfläche des Objektträgers durch Zentrifugieren abgeschieden. Jeder Objektträger wurde angeritzt und in drei Stücke geschnitten (so, daß jedes Stück zur Hälfte versilbert war). Jedes Stück wurde verwendet, um eine Kapillarzelle unter Verwendung eines anderen Glasstückes mit ähnlicher Größe und doppelseitigem Klebeband herzustellen.

(ii) Assavverfahren

Ein Assay vom Sandwich-Typ wurde unter Verwendung vorgemischter Lösungen in Pferdeserum aus hCG und XRITC-markiertem Antikörper, der in der Kapillarzelle immobilisiert war, durchgeführt. Die Konzentration an dem verwendeten XRITC-markierten Antikörper betrug 2,5 ug/ml. Die Probenlösungen wurden von den in Absatz (i) hergestellten Kapillarzellen aufgenommen und 15 min lang inkubieren gelassen, bevor eine Ablesung vorgenommen wurde.

(iii) Experimentelle Durchführung

Die untersuchte, gefüllte Kapillarzelle wurde an eine hemizylindrische Linse unter Verwendung einer Flüssigkeit mit einem geeigneten Brechungsindex gekoppelt. Licht aus einem grünen Helium-Neon-Laser wurde dann auf den Objektträger (d.h. die Platte der Zelle, die den immobilisierten Antikörper trug) durch eine planare Wand der Linse in einem Winkel, der für das Eintreten der Oberflächen-Plasmon- Resonanz geeignet ist, gerichtet. Die Fluoreszenzemission wurde durch Rotieren einer Fotomultiplierröhre in eine Ebene, die senkrecht zu der Ebene des einfallenden/reflektierten Lichtes ist, aufgezeichnet. Das Licht, das den PMT-Detektor erreichte, trat durch einen 610 nm Breitbandfilter, um jedes anregende Streulicht zu entfernen. Ein Spalt wurde hinter dem Filter angebracht, so daß eine Winkelauflösung von 10 entstand. Zwei Linsen fokussierten das Licht, das durch den Spalt auf den Detektor trat. Ein Vergleich der Fluoreszenz aus der Oberflächen- Plasmon-Resonanz mit der aus einer totalen internen Reflexion wurde durch Spalten der Zelle auf dem Prisma, so daß die versilberten und nicht versilberten Hälften der Zelle ihrerseits getrennt waren, durchgeführt.

Ergebnisse

Die Figur 6 zeigt einen Vergleich der Signale, die über den Emissionswinkelbereich 60 bis 800 aus einer Kapillarzelle, die 8105 mIE/ml hCG in Serum, erhalten durch SPR- und TIR-Anregung, erhalten wurden. Besonders zu beachten ist ein starker Peak bei dem Signal um 74º für die SPR-Anregung. Das integrierte Signal zwischen 70º und 78º ist 5,2-mal größer bei Verwendung der SPR-Anregung als bei Verwendung der TIR-Anregung. Die Optimierung der Metallschicht und die verbesserten Techniken zur Proteinimmobilisierung sollten das Erreichen größerer Verstärkungen ermöglichen.
Die Figur 7 zeigt die Signale über den gleichen Winkelbereich, aber diesmal von einer Zelle, die mit Serum ohne hCG gefüllt ist.
Die Emission aus der SPR-Anregung zeigt einen leichten Peak bei 76º als Folge der nichtspezifischen Bindung des XRITC-markierten Antikörpers.

Beispiel 6

Nachweis der Empfindlichkeit eines direkten geführten Schwingungssensors auf Veränderungen des Brechungsindex

(i) Herstellung der ontischen Struktur

Mikroskopische Objektträger aus Glas wurden mit Ultraschall in einer Detergenslösung gereinigt und ausgiebig mit ultrareinem Wasser gespült. Mit den Vakuumabscheidungstechniken wurde eine 1 nm dicke Aluminiumschicht auf der Oberfläche des Glases aufgebacht, und anschließend wurde ein 54 nm dicker Silberfilm aufgebracht. Die Silberoberfläche wurde dann mit einem Glasfilm durch Spinnbeschichtung eines Kieselsäure-Solgels (HT Products Inc., USA) auf der Vorrichtung bei 300 UpM beschichtet. Die optischen Strukturen wurden über Nacht bei 60ºC gebacken. Eine Kapillarzelle wurde aus der optischen Struktur und einem anderen Glasstück mit den gleichen Dimensionen unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebands hergestellt.

(ii) Versuchsdurchführung

Die untersuchte Kapillarzelle wurde optisch an ein rechtwinkliges Kronenglasprisma unter Verwendung einer geeigneten Flüssigkeit gekoppelt. Die Zelle wurde durch das Glassubstrat und auf den Silberfilm mit einem polarisierten TM-HeNe-Laser bestrahlt, wobei die Intensität des reflektierten Lichts mittels einer Fotodiode gemessen wurde. Das Prisma wurde durch einen Winkelbereich während der Messung rotiert. Die Zelle wurde mit ultrareinem Wasser (Brechungsindex 1,3316) gefüllt, und die Position des Reflektionsminiminums wurde notiert. Dann wurde das ultrareine Wasser durch eine 5%ige Saccharoselösung (Brechungsindex 1,3382) und dann durch eine 10%ige Saccharose1ösung (Brechungsindex 1,3450) ersetzt, und die Position des Minimums der reflektierten Lichtintensität wurde in Gegenwart der Saccharoselösungen gemessen.

(iii) Ergebnisse

Die Figur 8 zeigt die Positionen der Minima der reflektierten Lichtintensität eines geführten Schwingungslichts in der optischen Struktur. Wenn der Brechungsindex des Mediums in Kontakt mit der optischen Struktur erhöht wird, verschiebt sich der Winkel, bei dem das Minimum eintritt, was zeigt, daß die Vorrichtung empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindex ist.
Die Bindung eines Liganden (z.B. eines Antigens) an ein geeignetes biologisches Molekül (z.B. einen Antikörper), das auf der Oberfläche der Vorrichtung immobilisiert ist, führt zu einer Veränderung des Brechungsindex. Dies erlaubt die Verwendung des Sensors mit geführter Schwingungsart als direkten optischen Immunsensor.

Claims

1) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes, das entweder ein fluoreszent oder phosphoreszent markiertes Ligandenanalogon mit Spezifität für den gleichen spezifischen Bindungspartner oder ein fluoreszent oder phosphoreszent markierter weiterer spezifischer Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und, dazwischen angebracht, eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner direkt oder indirekt an die Metallschicht adsorbiert oder gebunden ist;

(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich eintritt, und Fluoreszenz oder Phosphoreszenz erzeugt wird; und

(c) Analyse der erzeugten Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, um zu bestimmen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit diese durch die Komplexbildung verändert wird.

2) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, wobei die optische Struktur anders als in Form eines kontinuierlichen Films ist, und die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und, dazwischen angebracht, eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner direkt oder indirekt an die Metallschicht adsorbiert oder gebunden ist;

(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird und eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich in der optischen Struktur eintritt; und

(c) Analyse der reflektierten Strahlung, um zu bestimmen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit die optischen Eigenschaften des durch die optische Struktur und den darauf angebrachten spezifischen Bindungspartner gebildeten Sensors durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner verändert werden.

3) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, wobei die optische Struktur ein transparentes Substrat, das mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist, die selbst mit einer Schicht aus einem dielektrischen Material mit einer Dicke, die geeignet ist, eine oder mehrere geführte Schwingungsarten zu unterstützen, beschichtet ist, umfaßt, wobei der spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche der Schicht aus dielektrischem Material der optischen Struktur aufgebracht ist,

(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird und an eine geführte Schwingungsart, die von der Schicht aus einem dielektrischen Material unterstützt wird, gekoppelt wird; und

4) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes, das entweder ein fluoreszent oder phosphoreszent markiertes Ligandenanalogon mit Spezifität für den gleichen spezifischen Bindungspartner oder ein fluoreszent oder phosphoreszent markierter weiterer spezifischer Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat und gegebenenfalls eine oder mehrere Materialschichten, die zwischen dem Substrat und dem spezifischen Bindungspartner angebracht sind, umfaßt;

(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einer Ebene senkrecht zu der Ebene der Materialschichten und in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß die Strahlung total intern reflektiert wird, und Fluoreszenz oder Phosphoreszenz erzeugt wird; und

(c) Überwachen der erzeugten Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, die aus einer Kante der optischen Struktur austritt, und Analyse der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, um zu bestimmen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit diese durch die Komplexbildung verändert wird, wobei die Achse der Detektionsoptik im wesentlichen rechtwinklig zu der Ebene, in der die optische Struktur bestrahlt wird und aus der die Reflexion austritt, steht.

5) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden, wobei der spezifische Bindungspartner auf einer Oberfläche einer optischen Struktur aufgebracht ist, und in Gegenwart eines weiteren Reagenzes, das entweder ein fluoreszent oder phosphoreszent markiertes Ligandenanalogon mit Spezifität für den gleichen spezifischen Bindungspartner oder ein fluoreszent oder phosphoreszent markierter weiterer spezifischer Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden ist, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und gegebenenfalls eine Schicht aus einem dielektrischen Material, die zwischen der Metallschicht und der auf der Oberfläche der optischen Struktur aufgebrachten Schicht mit dem spezifischen Bindungspartner, angebracht ist, umfaßt, wobei die optische Struktur ein planarer Hohlleiter, ein Prisma, eine optische Faser oder ein Objektträger, ausgenommen ein Gitter, ist;

(b) Bestrahlen einer anderen Oberfläche der optischen Struktur in einem geeigneten Winkel oder Winkelbereich zu der Normalen, so daß Oberflächen-Plasmon-Resonanz innerhalb oder an der Oberfläche der optischen Struktur eintritt, so daß Fluoreszenz oder Phosphoreszenz erzeugt wird; und

6) Sensor zum Nachweis eines Liganden in einer Probe mit dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine optische Struktur, die anders als in Form eines kontinuierlichen Films ist, wobei die optische Struktur ein Substrat, eine Metallschicht und, dazwischen angebracht, eine Schicht aus einem dielektrischen Material mit einem niedrigeren Brechungsindex als das Substrat, und einen (direkt oder indirekt) an die Metallschicht adsorbierten oder gebundenen spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden umfaßt, wobei die Schichten so sind, daß bei Verwendung die Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich darin fortgepflanzt werden kann.

7) Sensor nach Anspruch 6, worin die Metallschicht aus Silber ist und eine Dicke zwischen 10 und 50 nm besitzt, und die Schicht aus dem dielektrischen Material aus Magnesiumfluorid ist und eine Dicke zwischen 10 und 2000 nm besitzt.

8) Sensor nach Anspruch 7, worin die Silberschicht 15,5 nm dick ist, und die Magnesiumfluoridschicht 1500 nm dick ist.

9) Sensor zum Nachweis eines Liganden in einer Probe mit dem Verfahren nach Anspruch 3, umfassend eine optische Struktur mit einem Substrat, das mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist, wobei die Metallschicht selbst mit einer Schicht aus einem dielektrischen Material, das eine Dicke besitzt, die geeignet ist, eine oder mehrere geführte Schwingungsarten der Strahlung der verwendeten Wellenlängen bei Verwendung des Sensors zu unterstützen, beschichtet ist, und wobei die dielektrische Schicht einen spezifischen Bindungspartner für den nachzuweisenden Liganden trägt.

10) Sensor nach Anspruch 9, worin die Metallschicht aus Silber oder Gold ist und etwa 50 nm dick ist, und die Schicht aus dem dielektrischen Material aus Kieselsäure ist.

11) Spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung mit einer Kavität oder Kavitäten, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit durch die Kapillarwirkung in die Kavität gezogen werden kann, und worin mindestens ein Teil einer Wand der Kavität einen Sensor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 umfaßt.

12) Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Wand der Kapillarkavität, die von der den Sensor umfassenden Wand entfernt ist, in trockener, freisetzbarer Form ein fluoreszent oder phosphoreszent markiertes Ligandenanalogon oder einen weiteren spezifischen Bindungspartner trägt.

13) Kit zur Verwendung bei einem Assayverfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend

(a) einen Sensor nach einem der Ansprüche 6 bis 8;

(b) eine Strahlungsquelle, die geeignet ist, eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz über einen weiten Bereich in der in dem Sensor enthaltenen optischen Struktur zu erzeugen;

(c) Mittel zur Analyse der Strahlung, die bei Verwendung von dem Sensor reflektiert oder erzeugt wird.

14) Kit zur Verwendung bei einem Assayverfahren nach Anspruch 3, umfassend

(a) einen Sensor nach Anspruch 9 oder 10;

(b) eine Strahlungsquelle, die geeignet ist, eine resonanzaktive geführte Schwingungskopplung innerhalb der in dem Sensor enthaltenen optischen Struktur zu erzeugen;

(c) Mittel zur Analyse der Strahlung, die bei Verwendung von dem Sensor reflektiert wird.