JP4143408B2 - 化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合活性を測定する方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質とリガンドとの結合活性を測定する方法に関する。
背景技術
様々な生体反応は、生体を構成する分子同士の特異的相互作用によって引き起こされ制御されている。例えば、酵素と基質との反応、抗原抗体反応、レセプターとそのリガンドとの結合、あるいは転写因子とＤＮＡの複合体の形成など、生体反応は生体分子の特異的結合、解離反応によって制御されている。このような生体反応を分子レベルで理解するには、分子同士の相互作用の解析を必要とする。
例えば、抗体と抗原の相互作用の測定には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素標識固相免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、レセプターとそのリガンドの結合にはフィルターバインディングアッセイ、転写因子とＤＮＡの結合にはゲルシフトアッセイなどが従来用いられてきた。これらの方法はいずれも、一方の分子を放射性同位元素、あるいは蛍光色素などで標識し、結合反応が平衡に達した状態で複合体の量を測定するという手法である。
最近、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，以下「ＳＰＲ」と記す。）という光学現象を利用して、分子間の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるようになった。その一例として、ＢＩＡＣＯＲＥと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより分子間の相互作用を解析する装置が市販されている（ファルマシアバイオテク社：現在はＢＩＡＣＯＲＥ社）。また、共鳴ミラーという光学現象を利用しても分子間の相互作用を標識なしでモニターすることが可能であり、ＩＡｓｙｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｎｓｏｒｓ社）と呼ばれる装置が市販されている。
ＢＩＡＣＯＲＥの基本構造は、光源とプリズム、ディテクターとマイクロ流路から成っている。実際には、カセット式のセンサーチップ上に相互作用する分子の一方を固定化し、これに作用する分子を含む試料をカセット式のマイクロ流路系を介して注入して、２分子間の結合、解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化を光学的に検出する。
その検出原理は表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。すなわち、ガラスと金属薄膜との界面に全反射するように入射した光のうち、ある角度の入射光は表面プラズモンの励起に使われ減衰してしまう。その角度が金属薄膜（センサー）に接している溶媒の濃度変化に依存して変動する。ＳＰＲはこの変動を検出するというものである。
ＢＩＡＣＯＲＥではこの変化を共鳴シグナル（ＳＰＲ ｓｉｇｎａｌ）と呼び、０．１度の変化を１０００ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔｓ）としている。１０００ＲＵは表面積１ｍｍ２の薄金センサー上に約１ｎｇのタンパク質が結合した場合の変化量であり、タンパク質であれば５０ＲＵ（５０ｐｇ）程度の変化を十分検出することができる。
検出されたシグナルは、ＳＰＲ測定装置に付属しているコンピューターがセンサーグラムと呼ばれる結合曲線に変換し、リアルタイムにコンピューターディスプレイ上に描き出される（夏目徹 他、（１９９５）実験医学、１３，ｐ５６３−５６９．）（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５，ｐ２２９−２４０．）。
ＳＰＲを利用して抗体と抗原の相互作用を測定する場合、例えば、抗原を固定化したセンサーチップに、この抗原を認識する抗体を含む試料を注入すると、特異的抗原抗体反応によりセンサーチップ表面の質量が増加するとともにセンサーチップ表面の屈折率が増加する。屈折率の変化に伴う反射光の消失角度（ＳＰＲ角度）を測定することにより、抗原と抗体の結合と解離を検出することができる。このような測定では、通常、測定後に結合した抗体を洗浄してセンサーチップに固定化した抗原を繰り返し使用する。
しかし、センサーチップに固定する抗原が化学的安定性に乏しいタンパク質である場合には、洗浄により失活して再利用ができなくなる。
抗ＩＬ−６レセプター抗体の認識する抗原であるＩＬ−６レセプターもこのような化学的安定性に乏しいタンパク質である。抗ＩＬ−６レセプター抗体は未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害することによりＩＬ−６が関与するさまざまな免疫異常症、炎症性疾患、リンパ球腫瘍などに治療効果を示すことが見いだされている（Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：２４３７，１９９７；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２５３７，１９９６）。
抗ＩＬ−６レセプター抗体の生物活性試験を行うには、従来は、抗ＩＬ−６レセプター抗体とその抗原であるＩＬ−６レセプターとの結合を利用したＥＬＩＳＡ法を適用しているが、その精度はＣＶ値（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ：変動係数）１０−２０％である。一方、抗ＩＬ−６レセプター抗体の電荷的ヘテロ分子や会合体などについて、その品質を詳細に評価するためには、より精度の高い生物活性測定法の確立が望まれる。そこで、ＳＰＲ法を用いる、再現性が高く、かつ高精度な生物活性測定法の開発を検討した。その際、前述したように、ＩＬ−６レセプターが化学的安定性に乏しいタンパク質であり、センサーチップ表面で繰り返し使用できないという問題があった。
そこで、ＳＰＲの有する特異性を保持しつつも、化学的安定性に乏しい抗原を用いる場合であっても、簡便且つ精度の高い抗体の生物活性の測定が可能な方法が必要である。
本発明は、簡便且つ精度の高いリガンド（特に、抗体）の生物活性測定法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、化学的安定性に乏しい抗原タンパク質の場合であっても、センサーチップを繰り返し用い、ＳＰＲで抗体の生物活性評価を行う方法を開発することを目的として検討を行ったところ、第二抗体をセンサーチップに固定させ、第二抗体に抗原を結合させ、次いで該抗原と生物活性を測定しようとする抗体との結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、精度が高く且つ簡便な抗体の活性評価試験法を確立することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、第一リガンドの生物活性を測定することを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を表面プラズモン共鳴により測定するためのキットであって、（１）該リガンド結合タンパク質及び（２）該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを含むキットを提供する。
発明を実施するための最良の形態
化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は、そのリガンドと特異的に結合を形成するタンパク質のうち化学的安定性に乏しいものいう。具体的には、固定化されたセンサーチップ上で、１回の洗浄操作（例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２），１０〜１００ｍＭ ＨＣｌなどの酸性溶液、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１），１０〜１００ｍＭ ＮａＯＨなどのアルカリ溶液、１〜５Ｍ ＮａＣｌなどの高塩溶液、あるいは０．５％ＳＤＳ，８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌなどのタンパク質変性剤を用いる洗浄）によりリガンドとの結合活性が８０％以下に低下するタンパク質、好ましくは５０％以下に低下するタンパク質をいう。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は、例えば、化学的安定性に乏しい抗原タンパク質、レセプタータンパク質、酵素、転写因子などであってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は抗原タンパク質であることが好ましい。特に、可溶性レセプターのように、通常、細胞膜等に結合している、比較的分子量の大きく且つ複雑な構造を有しているタンパク質分子を可溶化させたタンパク質では、抗体等のリガンドとの結合部位の安定性が乏しいことから、本発明の測定方法でリガンドとの結合活性を測定することが好ましい。可溶性レセプターはペプチドホルモン、サイトカインなどのレセプターであってよく、サイトカインレセプターであることが特に好ましい。サイトカインレセプターとしては増殖因子、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、造血因子、神経栄養因子、分化抑制因子などのレセプターが挙げられる。より具体的には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）レセプター、トロンボポエチン（ＴＰＯ）レセプター、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）レセプター、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）レセプター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター、インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプター、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプター、インターロイキン−３（ＩＬ−３）レセプター、インターロイキン−４（ＩＬ−４）レセプター、インターロイキン−５（ＩＬ−５）レセプター、インターロイキン−６（ＩＬ−６）レセプター、インターロイキン−７（ＩＬ−７）レセプター、インターロイキン−９（ＩＬ−９）レセプター、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）レセプター、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）レセプター、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）レセプター、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）レセプター、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）レセプター、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）レセプター、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）レセプター、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レセプター、成長ホルモン（ＧＨ）レセプター、インスリンレセプター、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）レセプター、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、トランスフォーミング増殖−β（ＴＧＦ−β）レセプター、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）レセプター、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）レセプター、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）レセプター、Ｎｏｔｃｈファミリーレセプターなどを挙げることができる。ＩＬ−６レセプターが特に好ましい。従って、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は可溶性ＩＬ−６レセプター（Ｔａｇａ，Ｃｅｌｌ，５８：５７３−５８１，１９８９；Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８：６７３−６７９，１９９０）であることが特に好ましい。
第一リガンドは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と特異的結合を形成するリガンドである。例えば、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であるときには、これを認識する抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等の抗体断片、一本鎖抗体Ｆｖ等であってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が可溶性ＩＬ−６レセプターであるときには、第一リガンドは抗ＩＬ−６レセプター抗体であることが好ましい。特に好ましいのはヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である。
あるいは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がレセプタータンパク質であるときには、第一リガンドは該レセプタータンパク質のリガンドであってよい。例えば、リガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）であるときには、第一リガンドはＩＬ−６であり、本発明の方法を用いることにより、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒ結合活性を測定することによるＩＬ−６の品質評価や、血中ＩＬ−６濃度の測定に利用することができる。また、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が酵素であるときは、第一リガンドは該酵素の基質であってよく、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が転写因子であるときには、第一リガンドは該転写因子と相互作用するＤＮＡであってよい。
あるいは、第一リガンドはリガンド結合タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト作用を有する合成化合物あるいはペプチドであってもよい。
第二リガンドは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合するリガンドである。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であるときには、第二リガンドは、第一リガンドの抗体と異なるエピトープでリガンド結合タンパク質を認識する抗体であってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプターであるときは、マウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体などを使用できる。マウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体としては、例えばＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２９００−２９０６，１９８９）を用いることができる。
第一リガンド又は第二リガンドに用いられる抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体のクラスは、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥのいずれであってもよい。さらに、抗体にはＦａｂ，（Ｆａｂ’）２などの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）などの再構成したものも含む。抗体は、ダイマーなどのオリゴマーを形成しないか、あるいはオリゴマーの形成量が少ない（好ましくは５％以下の）ものであることが望ましい。
これらの抗体の作製方法としては、例えば、これらのタンパク質を発現細胞または組換え体の培養液などから精製し、これを適当なアジュバントとともにウサギ等に免疫し、その血清より定法に従って抗体画分を得ることができる。あるいは、マウス、ラット等を用いたモノクローナル抗体の作製、遺伝子組換技術、遺伝子組換動物等を用いたヒト型抗体や１本鎖抗体の作製なども用いることができるが、これらの記載の方法に限られるものではない。
本発明の好ましい態様では、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であり、第一リガンドが該抗原タンパク質を認識する第一抗体であり、第二リガンドが第一抗体とは異なるエピトープで該抗原タンパク質を認識する第二抗体である。
本発明の特に好ましい態様の一例では、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプターであり、第一リガンドがヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体であり、第二リガンドがマウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体である。
本発明の特に好ましい態様の方法で第一リガンドとして使用する抗ＩＬ−６レセプター抗体は、感作抗原として、例えば欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いることによって得られる。すなわち、ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒタンパク質を感作抗原として用いて公知の方法で得ることができる。本発明では、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト型化抗体を用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。なお、必要に応じ、再構成ヒト型化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１−６，１９９３）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
本発明により、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定するには、まず第二リガンドを適当な緩衝液（例えば、Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ緩衝液など）中に調製してセンサーチップに注入して固定させる。リガンドをセンサーチップに効率的に固定化するには、リガンドがセンサーチップ上で濃縮される緩衝液の種類とｐＨ、流速を選択する。ＳＰＲで濃度測定を行う場合、より正確な濃度算出をするには、リガンドを大量に（数千〜一万ＲＵ程度）固定化することが好ましい（生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、永田和宏、シェーリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８、ｐ．４２）。
次に、適当な緩衝液中に調製したリガンド結合タンパク質を注入して、第二リガンドにリガンド結合タンパク質を結合させる。次いで、同様に適当な緩衝液中に調製した第一リガンドを注入し、リガンド結合タンパク質と第一リガンドの結合活性を測定する。
結合活性の測定、評価は、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）などのＳＰＲ測定装置を用いてセンサーグラムを描き、市販のソフトウエアー（例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒ．３．０：ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いることにより計算できる。
測定後は再生溶液を注入してリガンドとタンパク質とを解離させ、センサーチップを洗浄する。一般には再生溶液として塩濃度やｐＨを変化させた溶液（例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２），１０〜１００ｍＭ ＨＣｌなどの酸性溶液、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１），１０〜１００ｍＭ ＮａＯＨなどのアルカリ溶液、１〜５Ｍ ＮａＣｌなどの高塩溶液、あるいは０．５％ＳＤＳ，８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌなどのタンパク質変性剤）が使用される。再生が不十分であると、リガンドからタンパク質が完全に解離しないために、センサーチップの性能が低下する。従って、再生溶液、流速、注入量などの再生条件を検討してセンサーチップを十分に洗浄する。
本発明はまた、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、第一リガンドの生物活性を測定することを特徴とする方法を提供する。これにより第一リガンドの生物活性を効率よく、高精度に得ることができる。
本発明はまた、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を表面プラズモン共鳴により測定するためのキットであって、（１）該リガンド結合タンパク質及び（２）該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを含むキットを提供する。
本発明の表面プラズモン共鳴による測定は、生体分子間の相互作用、例えば抗体と抗原の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるので、便利である。さらに、いったん第二リガンドをセンサーチップに固定すると、これを繰り返し使用して多数の試料を測定することが可能である。また、後述の実施例で示すように、本発明の表面プラズモン共鳴による測定はＥＬＩＳＡ法によるよりも高い精度を示した。
本発明の結合活性を測定する方法、第一リガンド（例えば、抗体）の生物活性の測定方法およびキットは、仮に試料溶液中に異種タンパク質が不純物或いは培地や安定化剤として存在していても、精製操作を加えることなしにリガンド（例えば、抗体）分子としての結合活性比を評価する事が可能である。したがって製造過程にある或いは精製された原薬としての抗体の品質管理やインプロセスコントロール、処方設計の検討に利用することができる。
また、レセプター等のリガンド結合タンパク質に対して高い結合活性を有する、抗体、天然リガンドの変異体等のリガンドのスクリーニング方法としても利用できる。例えば、抗原タンパク質に対して高い結合活性を有するモノクローナル抗体、抗体断片、一本鎖抗体等の選抜にも有用である。
その他、レセプター等のリガンド結合タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト作用を有する、合成化合物又はペプチドのスクリーニング方法としても有用である。
以下、本発明の方法の一例として、ＳＰＲを用いて、センサーチップにリガンドとして固相化したＭＴ−１８（マウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体）に、ｓＩＬ−６Ｒ（可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ）を捕捉させ、これにｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６Ｒ抗体）を結合させることによって、ｈＰＭ−１抗体のＩＬ−６Ｒ結合活性を評価する系を説明する。なお、この系の概略図を図１に示す。
産業上の利用可能性
本発明により、化学的安定性に乏しいタンパク質であっても、これとリガンドとの結合活性測定法、及びリガンドの生物活性測定法が提供された。本発明の方法は簡便且つ精度が高い。
実施例
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
なお、以下の実施例で使用した試料、試薬および装置は以下の通りである：
試料
試薬
機器及び装置
データ解析法およびソフトウエアー
実施例１：ＭＴ−１８のｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
リガンドをセンサーチップに効率的に固定化するにはリガンドがセンサーチップに濃縮される条件を見出すことが有効な手段である。ＳＰＲではセンサーチップ上のカルボキシメチルデキストランのｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅと固定化するリガンドのｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅの電荷的相互作用を用い、リガンドをセンサーチップ上に濃縮する。本方法を”リガンドのｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ”という。ＭＴ−１８のセンサーチップへのｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎを調べるため、ＭＴ−１８を種々のｐＨの緩衝液（ＰＢＳ，１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．０，５．０又は４．０）で調製し、リガンドを固定化していないセンサーチップに注入した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ＭＴ−１８のｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
その結果を図２に示す。ＭＴ−１８はｐＨ６．０ではわずかにｍａｔｒｉｘ内に濃縮され、ｐＨ５．０、及び４．０では効率的に濃縮された。タンパク質の構造安定性を鑑み、ＭＴ−１８の固定化溶液は１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０を選択した。
実施例２：ＭＴ−１８の固定化
ＭＴ−１８を１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０で１００μｇ／ｍＬに調製し、以下の条件でセンサーチップに固定化した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ＭＴ−１８固定化チップの作製）
ＭＴ−１８は１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０で１００μｇ／ｍＬに調製し、センサーチップをＮＨＳ＋ＥＤＣで活性化した後、５０μＬを注入してセンサーチップに固定化した。ＭＴ−１８を固定化した際のセンサーグラムの一例を図３に示した。図３から、ＭＴ−１８はセンサーチップに約１８０００ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ（ＲＵ）固定化できることがわかった。本固定化条件において正確な濃度測定を実施するのに十分量のＭＴ−１８を固定化できると判断した。
実施例３：可溶性ヒトＩＬ−６レセプター及びｈＰＭ−１抗体の結合の確認
ＭＴ−１８固定化チップに対して可溶性ヒトＩＬ−６レセプター（以下においてｓＩＬ−６Ｒという）、ｈＰＭ−１抗体を注入（緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ）し、それぞれの相互作用を検出した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ｓＩＬ−６Ｒ，ｈＰＭ−１の結合の確認）
また、これとは別にｓＩＬ−６ＲとｈＰＭ−１のセンサーチップへの非特異的吸着がないことを示すため、ＥＤＣ＋ＮＨＳによる活性化、Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅによるｂｌｏｃｋｉｎｇは行っているが、リガンドを固定化していないセンサーチップ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップと以下称する）を以下の方法により調製した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップの作製）
センサーチップに固定化されたＭＴ−１８とｓＩＬ−６Ｒ、及びｈＰＭ−１とｓＩＬ−６Ｒが結合することを確認するための検討を行った。その結果を図４に示した。ＭＴ−１８固定化チップにｓＩＬ−６Ｒを注入すると、センサーグラムの上昇が認められた。引き続いて、ｈＰＭ−１を注入すると、ｈＰＭ−１がセンサーチップ上に結合することが確認された。以上の結果から、ｓＩＬ−６Ｒは固定化されたＭＴ−１８に結合しうること、固定化したＭＴ−１８に捕捉されたｓＩＬ−６Ｒに対してｈＰＭ−１が結合できることが確認された。
同様にｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップへｓＩＬ−６Ｒ、ｈＰＭ−１を注入し、これらとセンサーチップとの相互作用を調べたところ、ｓＩＬ−６Ｒ培養液のｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップとの結合量は４０ＲＵ、ｈＰＭ−１の結合量は３０ＲＵ程度であった。ｓＩＬ−６Ｒ、ｈＰＭ−１のＭＴ−１８との結合量（数百ＲＵ、図４参照）に比べると、ｄｅｘｔｒａｎ ｍａｔｒｉｘとの非特異的結合は無視できる程度であると考えられた。同様に、ｓＩＬ−６Ｒ培養液中の共存タンパク質の影響はほとんどないものと考えられた。なお、ここで使用したｓＩＬ−６Ｒはｈｕｍａｎ ＩＬ−６Ｒを含む細胞培養液であり、特に精製操作は行っていない。したがって、ｓＩＬ−６Ｒの試料中にはＩＬ−６Ｒ以外に、培養に使用した様々なタンパク質（ウシ血清アルブミンなど）が含まれている。本結果から、これらの共存物を含んだ状態でもｓＩＬ−６ＲがＭＴ−１８と結合できることが確認された。
実施例４：再生条件検討
ＭＴ−１８固定化チップに結合したｓＩＬ−６Ｒ、及びｈＰＭ−１を解離させる再生溶液として以下の各ｐＨを有する酸溶液を検討した。
Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．０及び４．０はＭＴ−１８からｓＩＬ−６Ｒを解離させる能力が低かった。Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．０及びＧｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．５はＭＴ−１８に結合したｓＩＬ−６Ｒを解離することができた。Ｇｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．０ではベースライン上昇幅は小さかったが、ｓＩＬ−６Ｒの結合量の低下が著しく、再生溶液としては不適当であると判断した。残ったＧｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．５とＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．０について比較すると、ベースラインの変動が小さいのはＧｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．５であるが、ｓＩＬ−６Ｒ結合量の変動が小さいのはＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．０であった。再生が不十分であると、リガンドからａｎａｌｙｔｅが完全に解離しないためにセンサーチップの性能が低下すると考えられ、ベースラインの変動が小さいＧｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．５を再生溶液として採用した。上記検討により再生溶液として１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ ｐＨ２．５を選択した。次に、流速、注入量などの再生条件について検討した。これまでの実験の経験上、センサーチップの使用回数が増えると、再生溶液によってセンサーチップから解離しない成分が増加することがわかっている。また、再生溶液を流速５μＬ／ｍｉｎ、５μＬ注入した場合、２回再生溶液を注入しなければ、十分にセンサーチップを洗浄できないことも明らかになっている。
そこで、再生時の条件を５μＬ／ｍｉｎ、５μＬｘ２回と１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬｘ１回とした。その結果、流速１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬ注入の場合の方がｈＰＭ−１のｓＩＬ−６Ｒ結合活性の変動量が小さくなることがわかった。したがって、再生条件として１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬｘ１回を採用した。
また、再生回数が増すにつれて、ｈＰＭ−１の結合量が低下することが経験的に知られている。この傾向は他のタンパク質（ＩＬ−５）をセンサーチップに固相化した場合にも認められている（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）１−１５）。その試験法では、「ａｎａｌｙｔｅの結合量の変動が２０％以内」という基準を設定し、この基準を満たすように試料の測定回数に制限を設けている。本測定系においても、ｈＰＭ−１の結合量低下を完全に回避することは困難であり、目的に適した基準を満たすように測定回数に制限を設ける必要がある。そこで、上記の再生条件でＮ＝３０の繰り返し測定を行い、繰り返し測定の限界回数について検討した。なお、基準はｈＰＭ−１結合量のばらつきがＣＶ値５％以下になることとした。その結果、目的の基準を満たす測定回数は２０回程度であることがわかった。そこで、「１つのＭＴ−１８固定化センサーチップを用いた試料測定回数は２０回程度」と規定することとした。
実施例５：ＳＰＲ法とＥＬＩＳＡ法の比較
ｈＰＭ−１の生物活性を評価する試験法として、本検討で設定したＳＰＲを用いる方法と現行の品質試験法であるＥＬＩＳＡ法を比較した。測定に使用したｈＰＭ−１標準品、被験試料（無処理及び６０℃、２週間で加速試験を行ったもの）を以下に示す。
（１）ＳＰＲ法
実施例２に記載した方法に従い、ＭＴ−１８をセンサーチップに固定化した。標準品、被験試料の調製方法、およびＳＰＲによる測定条件を以下に示す。
試料調製方法
１．ｈＰＭ−１標準品、被験試料はＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒで５０μｇ／ｍＬに調製した。（ただし、被験試料はそれぞれ試料調製をＮ＝３で行った。）
２．ＢＩＡＣＯＲＥ２０００によって５０μｇ／ｍＬのｈＰＭ−１原体を、標準品は１，２，５，１０，２０μｇ／ｍＬに、被験試料は５μｇ／ｍＬにそれぞれＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈した。
３．希釈した溶液についてＩＬ−６Ｒ結合活性を測定した。測定はＮ＝２で実施した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件
データ解析
ＢＩＡＣＯＲＥ用解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒ，３．０を用い、標準品のｈＰＭ−１結合量から検量線を作成した。なお、検量線のｆｉｔｔｉｎｇには解析ソフトの４Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｆｉｔを用いた。被験試料のｈＰＭ−１結合量を作成した検量線を用いてｈＰＭ−１濃度に換算した。被験試料のＮ＝２のｈＰＭ−１換算濃度の平均値を測定値とした。
（２）ＥＬＩＳＡ法
ＭＴ−１８を固相化したプレートにｓＩＬ−６Ｒを結合させた。そこへｈＰＭ−１抗体を添加し、プレート上のｓＩＬ−６Ｒに結合させた。未反応のｈＰＭ−１抗体を洗浄した後、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を添加した。プレートを洗浄後、酵素活性を測定することにより、ＩＬ−６Ｒに結合したｈＰＭ−１抗体量を標準溶液の酵素活性から算出した。
（３）ＳＰＲ法とＥＬＩＳＡ法の比較
ｈＰＭ−１原体加速品の抗原結合活性のＳＰＲ、及びＥＬＩＳＡによる評価結果を表１，表２に示した。
【表１】
【表２】
ｈＰＭ−１ ９９Ｌ０１ Ｉｎｉｔｉａｌと６０℃−２ＷのＩＬ−６Ｒ結合活性をｈＰＭ−１濃度に換算すると、ＳＰＲでは４９．７ｍｇ／ｍＬ、４０．７ｍｇ／ｍＬ、ＥＬＩＳＡでは７０．５ｍｇ／ｍＬ、４８．５ｍｇ／ｍＬと算出された。また、６０℃−２Ｗの結合活性のＩｎｉｔｉａｌに対する残存率は、８１．９％（ＳＰＲ）、６８．７％（ＥＬＩＳＡ）であった。
これらの結果から、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡともにｈＰＭ−１原体の加速による活性低下を検出可能であることが確認できた。
抗原結合活性試験法の精度はＳＰＲでＣＶ値５．５％、ＥＬＩＳＡで２４．３％であった。この結果から、ｈＰＭ−１のＩＬ−６Ｒ結合活性評価法の中でＳＰＲ法は高い精度を持つ評価法であることが示された。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６Ｒ抗体）のＩＬ−６Ｒ結合活性を評価する系の概略図を示す。
図２は、ＭＴ−１８（マウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体）のｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ測定時のセンサーグラムを示す。
図３は、ＭＴ−１８を固定化した際のセンサーグラムの一例を示す。
図４は、センサーチップに固定化されたＭＴ−１８とｓＩＬ−６Ｒ、及びｈＰＭ−１とｓＩＬ−６Ｒが結合することを示すセンサーグラムである。
本発明は、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質とリガンドとの結合活性を測定する方法に関する。
背景技術
様々な生体反応は、生体を構成する分子同士の特異的相互作用によって引き起こされ制御されている。例えば、酵素と基質との反応、抗原抗体反応、レセプターとそのリガンドとの結合、あるいは転写因子とＤＮＡの複合体の形成など、生体反応は生体分子の特異的結合、解離反応によって制御されている。このような生体反応を分子レベルで理解するには、分子同士の相互作用の解析を必要とする。
例えば、抗体と抗原の相互作用の測定には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素標識固相免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、レセプターとそのリガンドの結合にはフィルターバインディングアッセイ、転写因子とＤＮＡの結合にはゲルシフトアッセイなどが従来用いられてきた。これらの方法はいずれも、一方の分子を放射性同位元素、あるいは蛍光色素などで標識し、結合反応が平衡に達した状態で複合体の量を測定するという手法である。
最近、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，以下「ＳＰＲ」と記す。）という光学現象を利用して、分子間の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるようになった。その一例として、ＢＩＡＣＯＲＥと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより分子間の相互作用を解析する装置が市販されている（ファルマシアバイオテク社：現在はＢＩＡＣＯＲＥ社）。また、共鳴ミラーという光学現象を利用しても分子間の相互作用を標識なしでモニターすることが可能であり、ＩＡｓｙｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｎｓｏｒｓ社）と呼ばれる装置が市販されている。
ＢＩＡＣＯＲＥの基本構造は、光源とプリズム、ディテクターとマイクロ流路から成っている。実際には、カセット式のセンサーチップ上に相互作用する分子の一方を固定化し、これに作用する分子を含む試料をカセット式のマイクロ流路系を介して注入して、２分子間の結合、解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化を光学的に検出する。
その検出原理は表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。すなわち、ガラスと金属薄膜との界面に全反射するように入射した光のうち、ある角度の入射光は表面プラズモンの励起に使われ減衰してしまう。その角度が金属薄膜（センサー）に接している溶媒の濃度変化に依存して変動する。ＳＰＲはこの変動を検出するというものである。
ＢＩＡＣＯＲＥではこの変化を共鳴シグナル（ＳＰＲ ｓｉｇｎａｌ）と呼び、０．１度の変化を１０００ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔｓ）としている。１０００ＲＵは表面積１ｍｍ２の薄金センサー上に約１ｎｇのタンパク質が結合した場合の変化量であり、タンパク質であれば５０ＲＵ（５０ｐｇ）程度の変化を十分検出することができる。
検出されたシグナルは、ＳＰＲ測定装置に付属しているコンピューターがセンサーグラムと呼ばれる結合曲線に変換し、リアルタイムにコンピューターディスプレイ上に描き出される（夏目徹 他、（１９９５）実験医学、１３，ｐ５６３−５６９．）（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５，ｐ２２９−２４０．）。
ＳＰＲを利用して抗体と抗原の相互作用を測定する場合、例えば、抗原を固定化したセンサーチップに、この抗原を認識する抗体を含む試料を注入すると、特異的抗原抗体反応によりセンサーチップ表面の質量が増加するとともにセンサーチップ表面の屈折率が増加する。屈折率の変化に伴う反射光の消失角度（ＳＰＲ角度）を測定することにより、抗原と抗体の結合と解離を検出することができる。このような測定では、通常、測定後に結合した抗体を洗浄してセンサーチップに固定化した抗原を繰り返し使用する。
しかし、センサーチップに固定する抗原が化学的安定性に乏しいタンパク質である場合には、洗浄により失活して再利用ができなくなる。
抗ＩＬ−６レセプター抗体の認識する抗原であるＩＬ−６レセプターもこのような化学的安定性に乏しいタンパク質である。抗ＩＬ−６レセプター抗体は未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害することによりＩＬ−６が関与するさまざまな免疫異常症、炎症性疾患、リンパ球腫瘍などに治療効果を示すことが見いだされている（Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：２４３７，１９９７；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２５３７，１９９６）。
抗ＩＬ−６レセプター抗体の生物活性試験を行うには、従来は、抗ＩＬ−６レセプター抗体とその抗原であるＩＬ−６レセプターとの結合を利用したＥＬＩＳＡ法を適用しているが、その精度はＣＶ値（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ：変動係数）１０−２０％である。一方、抗ＩＬ−６レセプター抗体の電荷的ヘテロ分子や会合体などについて、その品質を詳細に評価するためには、より精度の高い生物活性測定法の確立が望まれる。そこで、ＳＰＲ法を用いる、再現性が高く、かつ高精度な生物活性測定法の開発を検討した。その際、前述したように、ＩＬ−６レセプターが化学的安定性に乏しいタンパク質であり、センサーチップ表面で繰り返し使用できないという問題があった。
そこで、ＳＰＲの有する特異性を保持しつつも、化学的安定性に乏しい抗原を用いる場合であっても、簡便且つ精度の高い抗体の生物活性の測定が可能な方法が必要である。
本発明は、簡便且つ精度の高いリガンド（特に、抗体）の生物活性測定法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、化学的安定性に乏しい抗原タンパク質の場合であっても、センサーチップを繰り返し用い、ＳＰＲで抗体の生物活性評価を行う方法を開発することを目的として検討を行ったところ、第二抗体をセンサーチップに固定させ、第二抗体に抗原を結合させ、次いで該抗原と生物活性を測定しようとする抗体との結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、精度が高く且つ簡便な抗体の活性評価試験法を確立することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、第一リガンドの生物活性を測定することを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を表面プラズモン共鳴により測定するためのキットであって、（１）該リガンド結合タンパク質及び（２）該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを含むキットを提供する。
発明を実施するための最良の形態
化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は、そのリガンドと特異的に結合を形成するタンパク質のうち化学的安定性に乏しいものいう。具体的には、固定化されたセンサーチップ上で、１回の洗浄操作（例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２），１０〜１００ｍＭ ＨＣｌなどの酸性溶液、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１），１０〜１００ｍＭ ＮａＯＨなどのアルカリ溶液、１〜５Ｍ ＮａＣｌなどの高塩溶液、あるいは０．５％ＳＤＳ，８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌなどのタンパク質変性剤を用いる洗浄）によりリガンドとの結合活性が８０％以下に低下するタンパク質、好ましくは５０％以下に低下するタンパク質をいう。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は、例えば、化学的安定性に乏しい抗原タンパク質、レセプタータンパク質、酵素、転写因子などであってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は抗原タンパク質であることが好ましい。特に、可溶性レセプターのように、通常、細胞膜等に結合している、比較的分子量の大きく且つ複雑な構造を有しているタンパク質分子を可溶化させたタンパク質では、抗体等のリガンドとの結合部位の安定性が乏しいことから、本発明の測定方法でリガンドとの結合活性を測定することが好ましい。可溶性レセプターはペプチドホルモン、サイトカインなどのレセプターであってよく、サイトカインレセプターであることが特に好ましい。サイトカインレセプターとしては増殖因子、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、造血因子、神経栄養因子、分化抑制因子などのレセプターが挙げられる。より具体的には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）レセプター、トロンボポエチン（ＴＰＯ）レセプター、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）レセプター、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）レセプター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター、インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプター、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプター、インターロイキン−３（ＩＬ−３）レセプター、インターロイキン−４（ＩＬ−４）レセプター、インターロイキン−５（ＩＬ−５）レセプター、インターロイキン−６（ＩＬ−６）レセプター、インターロイキン−７（ＩＬ−７）レセプター、インターロイキン−９（ＩＬ−９）レセプター、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）レセプター、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）レセプター、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）レセプター、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）レセプター、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）レセプター、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）レセプター、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）レセプター、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レセプター、成長ホルモン（ＧＨ）レセプター、インスリンレセプター、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）レセプター、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、トランスフォーミング増殖−β（ＴＧＦ−β）レセプター、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）レセプター、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）レセプター、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）レセプター、Ｎｏｔｃｈファミリーレセプターなどを挙げることができる。ＩＬ−６レセプターが特に好ましい。従って、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質は可溶性ＩＬ−６レセプター（Ｔａｇａ，Ｃｅｌｌ，５８：５７３−５８１，１９８９；Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８：６７３−６７９，１９９０）であることが特に好ましい。
第一リガンドは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と特異的結合を形成するリガンドである。例えば、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であるときには、これを認識する抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等の抗体断片、一本鎖抗体Ｆｖ等であってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が可溶性ＩＬ−６レセプターであるときには、第一リガンドは抗ＩＬ−６レセプター抗体であることが好ましい。特に好ましいのはヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である。
あるいは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がレセプタータンパク質であるときには、第一リガンドは該レセプタータンパク質のリガンドであってよい。例えば、リガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）であるときには、第一リガンドはＩＬ−６であり、本発明の方法を用いることにより、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒ結合活性を測定することによるＩＬ−６の品質評価や、血中ＩＬ−６濃度の測定に利用することができる。また、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が酵素であるときは、第一リガンドは該酵素の基質であってよく、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が転写因子であるときには、第一リガンドは該転写因子と相互作用するＤＮＡであってよい。
あるいは、第一リガンドはリガンド結合タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト作用を有する合成化合物あるいはペプチドであってもよい。
第二リガンドは、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合するリガンドである。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であるときには、第二リガンドは、第一リガンドの抗体と異なるエピトープでリガンド結合タンパク質を認識する抗体であってよい。化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプターであるときは、マウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体などを使用できる。マウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体としては、例えばＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２９００−２９０６，１９８９）を用いることができる。
第一リガンド又は第二リガンドに用いられる抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体のクラスは、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥのいずれであってもよい。さらに、抗体にはＦａｂ，（Ｆａｂ’）２などの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）などの再構成したものも含む。抗体は、ダイマーなどのオリゴマーを形成しないか、あるいはオリゴマーの形成量が少ない（好ましくは５％以下の）ものであることが望ましい。
これらの抗体の作製方法としては、例えば、これらのタンパク質を発現細胞または組換え体の培養液などから精製し、これを適当なアジュバントとともにウサギ等に免疫し、その血清より定法に従って抗体画分を得ることができる。あるいは、マウス、ラット等を用いたモノクローナル抗体の作製、遺伝子組換技術、遺伝子組換動物等を用いたヒト型抗体や１本鎖抗体の作製なども用いることができるが、これらの記載の方法に限られるものではない。
本発明の好ましい態様では、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質が抗原タンパク質であり、第一リガンドが該抗原タンパク質を認識する第一抗体であり、第二リガンドが第一抗体とは異なるエピトープで該抗原タンパク質を認識する第二抗体である。
本発明の特に好ましい態様の一例では、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質がＩＬ−６レセプターであり、第一リガンドがヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体であり、第二リガンドがマウス抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体である。
本発明の特に好ましい態様の方法で第一リガンドとして使用する抗ＩＬ−６レセプター抗体は、感作抗原として、例えば欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いることによって得られる。すなわち、ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒタンパク質を感作抗原として用いて公知の方法で得ることができる。本発明では、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト型化抗体を用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。なお、必要に応じ、再構成ヒト型化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１−６，１９９３）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
本発明により、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定するには、まず第二リガンドを適当な緩衝液（例えば、Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ緩衝液など）中に調製してセンサーチップに注入して固定させる。リガンドをセンサーチップに効率的に固定化するには、リガンドがセンサーチップ上で濃縮される緩衝液の種類とｐＨ、流速を選択する。ＳＰＲで濃度測定を行う場合、より正確な濃度算出をするには、リガンドを大量に（数千〜一万ＲＵ程度）固定化することが好ましい（生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、永田和宏、シェーリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８、ｐ．４２）。
次に、適当な緩衝液中に調製したリガンド結合タンパク質を注入して、第二リガンドにリガンド結合タンパク質を結合させる。次いで、同様に適当な緩衝液中に調製した第一リガンドを注入し、リガンド結合タンパク質と第一リガンドの結合活性を測定する。
結合活性の測定、評価は、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）などのＳＰＲ測定装置を用いてセンサーグラムを描き、市販のソフトウエアー（例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒ．３．０：ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いることにより計算できる。
測定後は再生溶液を注入してリガンドとタンパク質とを解離させ、センサーチップを洗浄する。一般には再生溶液として塩濃度やｐＨを変化させた溶液（例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２），１０〜１００ｍＭ ＨＣｌなどの酸性溶液、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１），１０〜１００ｍＭ ＮａＯＨなどのアルカリ溶液、１〜５Ｍ ＮａＣｌなどの高塩溶液、あるいは０．５％ＳＤＳ，８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌなどのタンパク質変性剤）が使用される。再生が不十分であると、リガンドからタンパク質が完全に解離しないために、センサーチップの性能が低下する。従って、再生溶液、流速、注入量などの再生条件を検討してセンサーチップを十分に洗浄する。
本発明はまた、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を測定する方法であって、該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを固定させ、第二リガンドに該タンパク質を結合させ、次いで該タンパク質と第一リガンドとの結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより、第一リガンドの生物活性を測定することを特徴とする方法を提供する。これにより第一リガンドの生物活性を効率よく、高精度に得ることができる。
本発明はまた、化学的安定性に乏しいリガンド結合タンパク質と結合する第一リガンドの生物活性を表面プラズモン共鳴により測定するためのキットであって、（１）該リガンド結合タンパク質及び（２）該リガンド結合タンパク質と該第一リガンドとの結合部位以外の結合部位において該リガンド結合タンパク質と結合する第二リガンドを含むキットを提供する。
本発明の表面プラズモン共鳴による測定は、生体分子間の相互作用、例えば抗体と抗原の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるので、便利である。さらに、いったん第二リガンドをセンサーチップに固定すると、これを繰り返し使用して多数の試料を測定することが可能である。また、後述の実施例で示すように、本発明の表面プラズモン共鳴による測定はＥＬＩＳＡ法によるよりも高い精度を示した。
本発明の結合活性を測定する方法、第一リガンド（例えば、抗体）の生物活性の測定方法およびキットは、仮に試料溶液中に異種タンパク質が不純物或いは培地や安定化剤として存在していても、精製操作を加えることなしにリガンド（例えば、抗体）分子としての結合活性比を評価する事が可能である。したがって製造過程にある或いは精製された原薬としての抗体の品質管理やインプロセスコントロール、処方設計の検討に利用することができる。
また、レセプター等のリガンド結合タンパク質に対して高い結合活性を有する、抗体、天然リガンドの変異体等のリガンドのスクリーニング方法としても利用できる。例えば、抗原タンパク質に対して高い結合活性を有するモノクローナル抗体、抗体断片、一本鎖抗体等の選抜にも有用である。
その他、レセプター等のリガンド結合タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト作用を有する、合成化合物又はペプチドのスクリーニング方法としても有用である。
以下、本発明の方法の一例として、ＳＰＲを用いて、センサーチップにリガンドとして固相化したＭＴ−１８（マウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体）に、ｓＩＬ−６Ｒ（可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ）を捕捉させ、これにｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６Ｒ抗体）を結合させることによって、ｈＰＭ−１抗体のＩＬ−６Ｒ結合活性を評価する系を説明する。なお、この系の概略図を図１に示す。
産業上の利用可能性
本発明により、化学的安定性に乏しいタンパク質であっても、これとリガンドとの結合活性測定法、及びリガンドの生物活性測定法が提供された。本発明の方法は簡便且つ精度が高い。
実施例
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
なお、以下の実施例で使用した試料、試薬および装置は以下の通りである：
試料
リガンドをセンサーチップに効率的に固定化するにはリガンドがセンサーチップに濃縮される条件を見出すことが有効な手段である。ＳＰＲではセンサーチップ上のカルボキシメチルデキストランのｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅと固定化するリガンドのｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅの電荷的相互作用を用い、リガンドをセンサーチップ上に濃縮する。本方法を”リガンドのｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ”という。ＭＴ−１８のセンサーチップへのｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎを調べるため、ＭＴ−１８を種々のｐＨの緩衝液（ＰＢＳ，１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．０，５．０又は４．０）で調製し、リガンドを固定化していないセンサーチップに注入した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ＭＴ−１８のｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
実施例２：ＭＴ−１８の固定化
ＭＴ−１８を１０ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０で１００μｇ／ｍＬに調製し、以下の条件でセンサーチップに固定化した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ＭＴ−１８固定化チップの作製）
実施例３：可溶性ヒトＩＬ−６レセプター及びｈＰＭ−１抗体の結合の確認
ＭＴ−１８固定化チップに対して可溶性ヒトＩＬ−６レセプター（以下においてｓＩＬ−６Ｒという）、ｈＰＭ−１抗体を注入（緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ）し、それぞれの相互作用を検出した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ｓＩＬ−６Ｒ，ｈＰＭ−１の結合の確認）
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップの作製）
同様にｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップへｓＩＬ−６Ｒ、ｈＰＭ−１を注入し、これらとセンサーチップとの相互作用を調べたところ、ｓＩＬ−６Ｒ培養液のｒｅｆｅｒｅｎｃｅ用チップとの結合量は４０ＲＵ、ｈＰＭ−１の結合量は３０ＲＵ程度であった。ｓＩＬ−６Ｒ、ｈＰＭ−１のＭＴ−１８との結合量（数百ＲＵ、図４参照）に比べると、ｄｅｘｔｒａｎ ｍａｔｒｉｘとの非特異的結合は無視できる程度であると考えられた。同様に、ｓＩＬ−６Ｒ培養液中の共存タンパク質の影響はほとんどないものと考えられた。なお、ここで使用したｓＩＬ−６Ｒはｈｕｍａｎ ＩＬ−６Ｒを含む細胞培養液であり、特に精製操作は行っていない。したがって、ｓＩＬ−６Ｒの試料中にはＩＬ−６Ｒ以外に、培養に使用した様々なタンパク質（ウシ血清アルブミンなど）が含まれている。本結果から、これらの共存物を含んだ状態でもｓＩＬ−６ＲがＭＴ−１８と結合できることが確認された。
実施例４：再生条件検討
ＭＴ−１８固定化チップに結合したｓＩＬ−６Ｒ、及びｈＰＭ−１を解離させる再生溶液として以下の各ｐＨを有する酸溶液を検討した。
そこで、再生時の条件を５μＬ／ｍｉｎ、５μＬｘ２回と１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬｘ１回とした。その結果、流速１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬ注入の場合の方がｈＰＭ−１のｓＩＬ−６Ｒ結合活性の変動量が小さくなることがわかった。したがって、再生条件として１０μＬ／ｍｉｎ、１０μＬｘ１回を採用した。
また、再生回数が増すにつれて、ｈＰＭ−１の結合量が低下することが経験的に知られている。この傾向は他のタンパク質（ＩＬ−５）をセンサーチップに固相化した場合にも認められている（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）１−１５）。その試験法では、「ａｎａｌｙｔｅの結合量の変動が２０％以内」という基準を設定し、この基準を満たすように試料の測定回数に制限を設けている。本測定系においても、ｈＰＭ−１の結合量低下を完全に回避することは困難であり、目的に適した基準を満たすように測定回数に制限を設ける必要がある。そこで、上記の再生条件でＮ＝３０の繰り返し測定を行い、繰り返し測定の限界回数について検討した。なお、基準はｈＰＭ−１結合量のばらつきがＣＶ値５％以下になることとした。その結果、目的の基準を満たす測定回数は２０回程度であることがわかった。そこで、「１つのＭＴ−１８固定化センサーチップを用いた試料測定回数は２０回程度」と規定することとした。
実施例５：ＳＰＲ法とＥＬＩＳＡ法の比較
ｈＰＭ−１の生物活性を評価する試験法として、本検討で設定したＳＰＲを用いる方法と現行の品質試験法であるＥＬＩＳＡ法を比較した。測定に使用したｈＰＭ−１標準品、被験試料（無処理及び６０℃、２週間で加速試験を行ったもの）を以下に示す。
実施例２に記載した方法に従い、ＭＴ−１８をセンサーチップに固定化した。標準品、被験試料の調製方法、およびＳＰＲによる測定条件を以下に示す。
試料調製方法
１．ｈＰＭ−１標準品、被験試料はＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒで５０μｇ／ｍＬに調製した。（ただし、被験試料はそれぞれ試料調製をＮ＝３で行った。）
２．ＢＩＡＣＯＲＥ２０００によって５０μｇ／ｍＬのｈＰＭ−１原体を、標準品は１，２，５，１０，２０μｇ／ｍＬに、被験試料は５μｇ／ｍＬにそれぞれＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈した。
３．希釈した溶液についてＩＬ−６Ｒ結合活性を測定した。測定はＮ＝２で実施した。
ＢＩＡＣＯＲＥ測定条件
ＢＩＡＣＯＲＥ用解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒ，３．０を用い、標準品のｈＰＭ−１結合量から検量線を作成した。なお、検量線のｆｉｔｔｉｎｇには解析ソフトの４Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｆｉｔを用いた。被験試料のｈＰＭ−１結合量を作成した検量線を用いてｈＰＭ−１濃度に換算した。被験試料のＮ＝２のｈＰＭ−１換算濃度の平均値を測定値とした。
（２）ＥＬＩＳＡ法
ＭＴ−１８を固相化したプレートにｓＩＬ−６Ｒを結合させた。そこへｈＰＭ−１抗体を添加し、プレート上のｓＩＬ−６Ｒに結合させた。未反応のｈＰＭ−１抗体を洗浄した後、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を添加した。プレートを洗浄後、酵素活性を測定することにより、ＩＬ−６Ｒに結合したｈＰＭ−１抗体量を標準溶液の酵素活性から算出した。
（３）ＳＰＲ法とＥＬＩＳＡ法の比較
ｈＰＭ−１原体加速品の抗原結合活性のＳＰＲ、及びＥＬＩＳＡによる評価結果を表１，表２に示した。
【表１】
これらの結果から、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡともにｈＰＭ−１原体の加速による活性低下を検出可能であることが確認できた。
抗原結合活性試験法の精度はＳＰＲでＣＶ値５．５％、ＥＬＩＳＡで２４．３％であった。この結果から、ｈＰＭ−１のＩＬ−６Ｒ結合活性評価法の中でＳＰＲ法は高い精度を持つ評価法であることが示された。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６Ｒ抗体）のＩＬ−６Ｒ結合活性を評価する系の概略図を示す。
図２は、ＭＴ−１８（マウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体）のｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ測定時のセンサーグラムを示す。
図３は、ＭＴ−１８を固定化した際のセンサーグラムの一例を示す。
図４は、センサーチップに固定化されたＭＴ−１８とｓＩＬ−６Ｒ、及びｈＰＭ−１とｓＩＬ−６Ｒが結合することを示すセンサーグラムである。
Claims (8)
- 第二リガンドが固定されたセンサーチップを繰り返し用いて、可溶性レセプターと抗体との結合活性を測定する方法であって、
該可溶性レセプターと該抗体との結合部位以外の結合部位において該可溶性レセプターと結合する第二リガンドをセンサーチップに固定すること、
該第二リガンドに該可溶性レセプターを結合すること、
該可溶性レセプターと抗体との結合活性を表面プラズモン共鳴により測定すること、及び、
該可溶性レセプターと該抗体とを再生溶液により解離して、該第二リガンドが固定されたセンサーチップを再生すること、
を含む方法。 - 可溶性レセプターが抗原タンパク質である請求項１記載の方法。
- 可溶性レセプターがサイトカインレセプターである請求項１記載の方法。
- サイトカインレセプターがＩＬ−６レセプターである請求項３記載の方法。
- 抗体が抗ＩＬ−６レセプター抗体である請求項１記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗体である請求項１記載の方法。
- 第二リガンドが抗体である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 第二リガンドが固定されたセンサーチップを繰り返し用いて、可溶性レセプターと結合する抗体の生物活性を測定する方法であって、
該可溶性レセプターと該抗体との結合部位以外の結合部位において該可溶性レセプターと結合する第二リガンドをセンサーチップに固定すること、
該第二リガンドに該可溶性レセプターを結合すること、
該可溶性レセプターと抗体との結合活性を表面プラズモン共鳴により測定することにより抗体の生物活性を測定すること、及び
該可溶性レセプターと該抗体とを再生溶液により解離して、該第二リガンドが固定されたセンサーチップを再生すること、
を含む方法。
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