WO2001006243A1 - Procede de mesure d'une substance et reactif a cet usage - Google Patents

Procede de mesure d'une substance et reactif a cet usage Download PDF

Info

Publication number
WO2001006243A1
WO2001006243A1 PCT/JP2000/004792 JP0004792W WO0106243A1 WO 2001006243 A1 WO2001006243 A1 WO 2001006243A1 JP 0004792 W JP0004792 W JP 0004792W WO 0106243 A1 WO0106243 A1 WO 0106243A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measurement
sample
measuring
substance
reagent
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/004792
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuya Kitaguchi
Akitaka Kanagawa
Naoko Katakura
Original Assignee
Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Kabushiki Kaisha filed Critical Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Priority to AU60188/00A priority Critical patent/AU6018800A/en
Priority to EP00946365A priority patent/EP1211505A4/en
Priority to KR1020027000593A priority patent/KR20020035101A/ko
Publication of WO2001006243A1 publication Critical patent/WO2001006243A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • G01N25/16—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating thermal coefficient of expansion
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/171—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated with calorimetric detection, e.g. with thermal lens detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin

Definitions

  • the present invention relates to a method for simply measuring a substance in a minute amount of a sample.
  • the present invention also relates to a measurement reagent used in the measurement method.
  • an absorbance method is usually adopted in many cases.
  • the standard optical path length for absorbance measurement is 1 cm from the viewpoint of measurement sensitivity, but measurement can be performed even if the sensitivity is slightly reduced to a few millimeters.
  • Examples of the absorbance measurement with such a short optical path length include, for example, Japanese Patent Publication No. 2001-51040 and Japanese Patent Publication No. No. 504732 (the above two applications were filed by Abacsis), and Japanese Patent Publication No. 1997-196920 (immunity items): Japanese Patent Publication No. 1996-114439 ( Biochemical items), Japanese Patent Publication No. 1997-196739 (dissolution liquid tip detection), Japanese Patent Publication No. 1997 138195 (analysis by transmitted light measurement of porous material) (The above four applications were filed by Nippon Mediphysics Co., Ltd.).
  • the volume of a detection cuvette (cell) having an optical path length in millimeters is too large, and if the sample volume is adjusted to match the cell volume, the amount of the sample in the sample will increase. Concentrations may be too low for analysis.
  • ⁇ TAS micro total analysis system
  • Lab-on-Ch i Lab-on-Ch i
  • TAS has been studied as a measurement method capable of analyzing even a small amount of sample (see Japanese Patent Publication No. 245655/1990).
  • This TAS has grooves (capillaries) with a depth and width of several meters to several hundreds // m on the surface of chips made of glass, silicon, organic polymer, etc., of 10 cm to several cm square or less.
  • the sample is separated, reacted, and measured.
  • the amount of sample, the amount of reagent required for the analysis, the amount of waste such as consumables used for the analysis, and the amount of waste liquid are all small, and the time required for the analysis is reduced. It is said that it can be done in a short time There are advantages.
  • the optical path length can only be about several / m to several hundred / z m, so that satisfactory measurement cannot be often performed by the absorbance method. Because, in principle, the absorbance method detects the ratio between incident light and transmitted light, it is necessary to increase the optical path length to obtain accurate results.
  • Fluorescence and luminescence methods are also known as methods for detecting trace components. However, since it is necessary to directly or indirectly bind an enzyme or an antibody labeled with a fluorescent dye to the substance to be measured (such as hemoglobin) in the measurement sample, the detection reaction becomes extremely complicated.
  • thermothermal conversion detection method that excites a sample with excitation light to form a so-called thermal lens and measures the change in the thermal lens with probe light.
  • Detection method has been known for some time.
  • Japanese Patent Publication No. 2004, No. 1421,177 (Molecular Biophotonics)
  • Japanese Patent Disclosure No. 4,694,674 Japanese Patent Disclosure No. 4,694,674
  • the measurement sample is irradiated with light (excitation light) at a wavelength that is absorbed by the substance to be measured dissolved in the solution. Then, the substance to be measured is excited by the excitation light to generate heat (photothermal conversion effect).
  • excitation light light
  • the generated heat is transferred to the solvent near the part irradiated with the excitation light, causing a local change in density and a change in refractive index. Therefore, in the presence of a substance that absorbs the excitation light, the part irradiated with the excitation light is as if a concave lens was formed.
  • the portion where the concave lens is formed is irradiated with probe light different from the wavelength of the excitation light. Since the probe light is bent by the thermal lens, the amount of the probe light captured by the light receiving element that captures the probe light decreases due to the formation of the thermal lens.
  • the quantity of the substance to be measured can be determined by measuring the degree of decrease in the light quantity.
  • the thermal lens detection method usually requires two types of light sources (excitation light and probe light), such as a laser.
  • a photothermal conversion detection method thermal lens detection method
  • a capillary analysis in which liquid is sent by a pump from the outside of a chip with grooves is used.
  • Some examples have been applied to the instrument (Bunseki No. 4, 280-284, 1997; M. Harada, et. Al., Anal. Chem. Vol. 65, 2938-2940, 1993, Kawanishi, et al. Abstracts of the 44th Annual Meeting of the Chemical Society of Japan, pll9, 1995).
  • the use of such a thermal lens detection method to measure the amount of a substance to be measured in a sample is being studied.
  • K. Sato, T. Kitamori et al. Reported that an Ar laser beam (wavelength: 488 nm) was used as excitation light, and a He—Ne laser beam (wavelength: 632.8 nm) was used as probe light. It is used to measure the dye, the dye of the sunset (Analytical Sciences Vol. 15, 525-529, 1999).
  • the kitamori et al.'S improved thermal lens detection method uses a microscope to convert excitation light and trap light into cavities to measure trace substances in cavities of several tens of meters deep and wide in microchips. It is designed to condense light and can be said to be a microthermal lens.
  • a laser having a uniform wavelength without chromatic aberration is preferable as a light source.
  • clenbuterol was measured (for example, Y. Martin Biosca, et. Al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41 (1996), 1037-104, etc.).
  • gas lasers such as an Ar laser and a He-Ne laser are expensive, and it is desirable to use an inexpensive semiconductor laser as a light source for simple POC analysis and the like.
  • inexpensively available semiconductor lasers have wavelengths of roughly 580 nm, more cheaply more than 600 nm, and even cheaper more than 630 nm.
  • a substance having absorption of 580 nm or more (hereinafter referred to as a long-wavelength substance) is generated from the substance to be measured by some method, and It is necessary to use a method to measure the amount of the target substance indirectly by measuring the long wavelength substance.
  • a method for measuring total cholesterol in blood and glucose oxaloacetic transaminase is described.
  • the key point in these measurement methods is to use the substance to be measured as a starting material to generate hydrogen peroxide by a reaction using an enzyme.
  • the method of indirectly measuring the amount of a substance to be measured by generating a long-wavelength substance by generating hydrogen peroxide is also known as an absorbance method. ing.
  • cholesterol ester is hydrolyzed by cholesterol esterase to obtain cholesterol, and oxidized by cholesterol oxidase together with cholesterol originally released to generate hydrogen peroxide.
  • this hydrogen peroxide causes 3,5-dimethoxy-N-ethyl-N- (2,1-hydroxy-3, -sulfopropyl) aniline sodium (hereinafter referred to as DAOS) and 4-amino.
  • Oxidative condensation of antipyrine hereinafter referred to as 4-AA
  • 4-AA antioxidant-dimethoxy-N-ethyl-N- (2,1-hydroxy-3, -sulfopropyl) aniline sodium
  • 4-AA Oxidative condensation of antipyrine
  • the total blood cholesterol level is determined. This measurement method is described in the instructions attached to HA Test Co., Ltd. for total cholesterol measurement and Cholesterol E—HA Test Co., Ltd. of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • EMSE 1-succinylethylenediamine
  • oxaloacetate is generated by GOT in a sample using sodium L-aspartate and monoketoglutaric acid as substrates, and then oxalate acetate is purified by oxalate acetate oxidase. The pyrite is then oxidized with oxygen and pyruvate to produce hydrogen peroxide.
  • TOOS toluidine sodium
  • hemoglobin, alkaline phosphatase, and the like are substances to be measured.
  • the reaction to generate hydrogen peroxide from hemoglobin, alkaline phosphatase, etc. is not common. Therefore, as for these substances to be measured, the above-described measurement method utilizing the reaction involving the generation of hydrogen peroxide has not been performed.
  • hemoglobin Will be described.
  • Measuring hemoglobin in a blood sample is important in clinical diagnosis of anemia and polycythemia.
  • the cuvette (cell) for measurement is large, about several hundred to two to one meter, and the optical path length required for measurement can be set to about 2 to 10 mm. It was possible.
  • Conventional methods for measuring hemoglobin include the cyanmethemoglobin method,
  • the cyanmethemoglobin method As a method of hemolyzing whole blood and measuring hemoglobin by absorbance, the cyanmethemoglobin method is widely used, and is also defined as an international standard law. Here, a method for measuring hemoglobin by the cyanmethemoglobin method will be briefly described.
  • a red blood cell lysing agent containing a nonionic surfactant or the like is added to a blood sample to elute hemoglobin contained in red blood cells.
  • the eluted hemoglobin is oxidized with an oxidizing agent such as a ferricyanation rim to convert it into methemoglobin.
  • an oxidizing agent such as a ferricyanation rim to convert it into methemoglobin.
  • cyanide ions methemoglobin is changed to cyanmethemoglobin, and a stable hemoglobin measurement sample is prepared.
  • this cyanomethemoglobin has an absorption at 540 nm
  • the hemoglobin can be quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • cyanmethemoglobin has an absorption at 540 nm
  • the semiconductor laser has a wavelength of 600 nm or more, the cyanometer-to-mog-mouth bin method cannot be applied to a method for measuring hemoglobin using an inexpensive semiconductor laser as an excitation light or an absorption light source.
  • handling of the measurement reagent involves danger because the measurement reagent contains the toxic potassium cyanide. Further, the waste liquid after the measurement needs to be disposed after decomposing the cyanide using sodium hypochlorite or the like, and the disposal treatment is complicated.
  • SLS sodium dodecyl sulfate or sodium lauryl sulfate
  • Triton X-100 in neutral buffer are used.
  • Hemoglobin measuring reagent containing (trade name) is clinical biochemistry
  • erythrocytes are lysed by the action of SLS and Triton X-100, and the eluted hemoglobin is converted into methemoglobin by the action of SLS and oxygen, and simultaneously converted to SLS hemoglobin. Since the SLS hemoglobin has an absorption at 540 nm, the hemoglobin can be quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • Japanese Patent Laid-Open Publication No. 12222267 (Midori-Jujisha) states that tetramethylbenzidine in citric acid solution can be converted to strontium peroxide using the peroxidase activity of hemoglobin itself. It describes a method for measuring hemoglobin by measuring the absorbance (wavelength: 65 O nm) of the product after oxidation.
  • these methods do not include the erythrocyte lysis step, they are compared with the solubilized trace amounts of hemoglobin (the amount of hemoglobin in whole blood (tens of g / d)) contained in plasma, serum, and urine. The concentration was measured as low as 1/100) and not the total hemoglobin.
  • these methods use a calibration method based on hemoglobin peroxidase activity inhibitor present in plasma, etc. Creating lines is not easy. Also, since it is an absorbance measurement, it is not suitable for measuring a small amount of a sample using a microchip or the like.
  • Japanese Patent Publication No. 1997-278786 discloses a method for improving pectin and oligogalacturonic acid by improving the cyanmethemoglobin method, which normally measures absorbance at a wavelength of 540 nm. It describes a measurement method in which the absorbance is increased by adding, to improve the sensitivity. In this method, the absorbance is increased and the absorption wavelength is shifted to the longer wavelength side, so that measurement at 680 to 685 nm is possible.
  • this method has limitations in the sensitivity of the absorbance measurement (limit of the amount of the sample) and also has a problem in that cyanide is used.
  • hemoglobin separated by gel electrophoresis was measured by the thermal lens detection method of the single beam method (MA Thompson, et. A 1., Applied Spectroscopy, Vol. 46, 945-947, 1992). ).
  • an expensive Ar laser (wavelength: 514.5 nm) is used as the excitation light source.
  • the measurement uses a large slab gel, 18 cm x 16 cm x 750 m, or solid phase, rather than measuring a liquid sample in a microchip.
  • a method for measuring phosphatase in a blood sample will be described.
  • a method using p-nitrophenyl phosphate ester as a substrate is widely used as a standard method (clinical test). Proposal, Izumi Kanai, Kanehara Publishing, 1998, pp. 613-615).
  • p-nitroph n-nylphosphoric acid is hydrolyzed by phosphatase, and the generated P-trotropenol is measured by absorbance at a wavelength of 405 nm.
  • azo is used as a substrate for alkaline phosphatase (hereinafter referred to as ALP) having absorption at longer wavelengths.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Methods using dyes have also been studied. However, this method is for measurement by the absorbance method, not for measurement by photothermal conversion detection.
  • chyle is a common problem when measuring a blood-derived sample by absorbance. Chy e is a cloudy white or pale yellow liquid that is taken up from the chyle of the intestine during the digestive process and is transported by lymphatics through the thoracic duct into the circulatory organs.
  • Chilly has a milk-like appearance due to chiral micron in lymph fluid (Steedman, Medical Dictionary, Meguri Rubiyu Co., Ltd.). That is, in blood, cholesterol and neutral fats form micellar ribosomes and the like, and exhibit a cloudy state. Since turbidity occurs in a blood sample with chyle, the measurement result will be adversely affected when measuring absorbance. That is, in the absorbance measurement, it is difficult to distinguish between absorption due to turbidity and absorption of a substance to be measured or a reaction product.
  • control absorbance is usually measured at a long wavelength of 700 to 800 nm where there is no absorption of the substance to be measured or the reaction product, and then the absorbance at the absorption wavelength of the substance or the reaction product is measured. And the difference between the two absorbances is used as the measured value (described in the Proposal of Clinical Examination Method described above and in the package insert for in vitro diagnostics, 1998 edition of Kainos Co., Ltd.).
  • the influence of contamination of the cell (cubet) of the absorbance meter can be corrected, but it is necessary to perform measurement at two different wavelengths in one sample.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a measurement method suitable for application to P 0 C analysis and the like, and to provide an inexpensive long wavelength It is an object of the present invention to provide a method capable of inexpensively, simply, and quickly measuring a substance in a small amount of a biological component-derived sample in a capillary by a thermal lens detection method using the laser beam as a light source of excitation light.
  • Another object of the present invention is to provide a measurement method capable of quantifying a substance in a blood sample with a single measurement even for a blood sample presenting chyle.
  • an object of the present invention is to provide a measurement reagent that is suitably used in the above-described measurement method and can stably measure a substance in a minute amount of a sample derived from a biological component. Disclosure of the invention
  • the method for measuring a substance of the present invention is a method for detecting or measuring the concentration of a substance in a sample derived from a biological component, comprising a sample preparation step and a photothermal conversion detection step. Mixes and reacts the biological component-derived sample with the measurement reagent to generate reaction products having different absorption wavelengths from the substance in an amount corresponding to the amount of the substance without inducing hydrogen peroxide.
  • the photothermal conversion detection step is a step of irradiating the measurement sample with excitation light and measuring a resulting change in physical quantity associated with a partial temperature change.
  • the reaction product has water solubility, and the absorbance of the reaction product in the wavelength region of the excitation light is sufficient to cause the temperature change.
  • the photothermal conversion detecting step includes causing a probe light for detection to be incident on a thermal lens formed by the refractive index change, and changing the probe light caused by the thermal lens Can be measured.
  • the wavelength of the excitation light is preferably at least 600 nm.
  • the biological component-derived sample and the measurement reagent can be loaded on a microchip having a capillary, and the sample preparation step and the photothermal conversion detecting step can be performed in the capillary of the microchip.
  • the cavities may be formed by laminating a pair of flat members having a groove on the plate surface with the plate surface having the groove inside.
  • the groove may be provided on at least one of the pair of flat members.
  • the wavelength of the excitation light may be in a range from 600 nm to 640 nm, and the wavelength of the probe light may be longer than the wavelength of the excitation light.
  • the measuring reagent includes a neutral surfactant that lyses erythrocytes, an oxidizing agent that oxidizes hemoglobin to methemoglobin, and a buffer that has a concentration that maintains pH in the range of 5 to 7. , And can be included.
  • the measurement reagent does not contain cyanide.
  • the mixing ratio of the blood sample and the measurement reagent is preferably in the range of 1: 1 to 1: 250.
  • the substance is phosphatase
  • the measurement reagent contains a substrate for the phosphatase
  • the sample preparation step is performed by mixing the biological component-derived sample and the measurement reagent. If phosphatase in a component-derived sample is reacted with the substrate in the measurement reagent to prepare a measurement sample, phosphase in a biological component-derived sample can be measured.
  • the substrate may have a phosphate bond.
  • the substrate is preferably one of 5-bromo-4 monochloro-3-indoxylphosphate and a salt thereof.
  • the phosphatase may be an alkaline phosphatase.
  • the concentration of the substrate in the measurement sample is preferably in the range of 1 to 15 mM.
  • the time required to measure the change in the physical quantity is preferably 3 to 15 minutes.
  • the method for measuring a substance of the present invention is a method for detecting a substance in a blood sample presenting chyle or measuring the concentration thereof, wherein the blood sample and the measurement reagent are mixed to prepare a measurement sample. And a photothermal conversion detection step of irradiating the measurement sample with excitation light and measuring a resulting physical quantity change accompanying a partial temperature change.
  • the photothermal conversion detecting step includes causing a probe light for detection to be incident on a thermal lens formed by the refractive index change, and changing the probe light caused by the thermal lens. Can be measured.
  • the blood sample and the measurement reagent can be loaded on a microchip having a capillary, and the sample preparation step and the photothermal conversion detection step can be performed in the capillary of the microphone port.
  • the cavities may be formed by laminating a pair of flat members having a groove on the plate surface with the plate surface having the groove inside.
  • the groove may be provided on at least one of the pair of flat members.
  • the measurement reagent of the present invention is a measurement reagent used in a measurement method when the substance is hemoglobin, and has a concentration of a neutral surfactant that lyses erythrocytes and a concentration that oxidizes hemoglobin to methemoglobin. It is characterized by comprising an oxidizing agent and a buffer at a concentration that maintains the pH in the range of 5 to 7.
  • the measurement reagent of the present invention is a measurement reagent used in a measurement method when the substance is phosphatase, and includes a substrate having a phosphate bond.
  • the substrate is preferably one of 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate and a salt thereof.
  • a microchip having a capillary and a thermal lens detection method are used. It is useful to combine them.
  • the excitation light and the probe light are combined with the capillary. It is preferable that the light is condensed.
  • a laser beam or a light emitting diode having a uniform wavelength is preferable, not a white light light source having a problem such as chromatic aberration.
  • short-wavelength lasers and light-emitting diodes are very expensive, and in order to form a thermal lens, the light source of the excitation light must have some output. Therefore, a long-wavelength semiconductor laser which is relatively inexpensive at present and has a certain output is preferable.
  • a light emitting diode can be used as an inexpensive light source in the present invention as long as it has an output of about several mW or more.
  • the wavelengths of the excitation light and the probe light are longer than 580 nm.
  • a semiconductor laser or a light emitting diode having a wavelength of 600 nm or more, and more preferably, a wavelength of 600 nm or more is inexpensive and preferable.
  • reaction product The substance to be measured or a substance enzymatically or chemically derived from it (hereinafter referred to as a reaction product) has sufficient absorbance to form a thermal lens in the wavelength region of the excitation light. .
  • the wavelength of the probe light be longer than the wavelength of the excitation light.
  • Pyrirubin and the like have a very weak absorption at wavelengths longer than 630 nm, making quantitative measurement difficult.
  • the substance when quantifying a substance in the blood other than an enzyme, such as cholesterol, the substance is absorbed into a longer wavelength region by the action of an enzyme that selectively uses the substance as a substrate (a substance that reacts with the enzyme) or a chemical reaction. It is necessary to induce the blood substance into a reaction product having the following.
  • the absorption wavelength of the above reaction product should be 580 nm or more, more cheaply 600 nm or more, and more cheaply 63 3 nm.
  • Target substance so that it is 0 nm or more It is necessary to find out a reaction or a measuring reagent which leads to the reaction product from the above. If the reaction product absorbs a sufficient amount of excitation light and the light source is inexpensive, the upper limit of the absorption wavelength is not particularly limited, but usually 80 O nm or less is often used.
  • the quantification of ALP is generally performed by measuring the activity of ALP.
  • the phosphate moiety in the substrate is hydrolyzed by ALP, and a dye derived from the substrate develops a color. The dye is measured.
  • p-ditrophenol phosphate is used as a substrate, and the absorption around 450 nm of P-ditrophenol produced by hydrolysis is measured with an absorptiometer.
  • an inexpensive excitation light source it is necessary to generate a reaction product having absorption at a longer wavelength as described above.
  • Research reagents that are commercially available as substrates for ALP that produce a reaction product having an absorption around 630 nm include 5-promote 4-monocloth-3-indoxyl phosphate.
  • 5-Bromo-4-chloro-3-hydroxyindole obtained by hydrolyzing this substrate becomes a blue dye having an absorption of 600 nm or more by being oxidized and dimerized with oxygen. Since this dimer does not have high solubility in water, the conditions such as the ALP concentration, the substrate concentration, and the reaction time, that is, the concentration of the reaction product of the long-wavelength reaction resulting from the combination of these dimers, may be affected by heat. There will be a range suitable for lens detection. When the concentration of the reaction product is higher than the range, microcrystals are generated as in Comparative Example 1 described later, and the measurement by the thermal lens detection method becomes difficult.
  • microcrystals are suspended and dispersed in a solution during normal handling, and do not precipitate even if left overnight. These microcrystals have almost no adverse effect on absorbance measurement, but may have such an adverse effect that they cannot be measured by the thermal lens detection method. Therefore, strong centrifugation It is necessary to precipitate microcrystals by performing the method.
  • the theoretical reason why the output (thermal lens signal) by the thermal lens detection method becomes unstable when the microcrystals (microprecipitates) that absorb the excitation light are suspended or dispersed is not clear. Even with the same fine particles, the output by the thermal lens detection method can be measured even if latex beads (diameter of about 500 nm) such as polystyrene that do not absorb the excitation light exist.
  • the ability to measure by the thermal lens detection method even when turbidity or fine particles that do not absorb excitation light is present is particularly advantageous when measuring substances in blood samples that exhibit chyle. .
  • the excitation light is chopped (onZ off) at a frequency of about 100 to 300 Hz, and only the change in the light amount of the probe light synchronized with it is extracted, and the output by the thermal lens detection method is detected. It is because.
  • the turbidity that does not absorb the excitation light causes the absolute value of the absorbance to appear large without a change over time, but does not cause a thermal change in the measurement sample that is synchronized with the excised excitation light.
  • methemoglobin Since methemoglobin is highly water-soluble, there is no problem such as the formation of a precipitate during measurement. However, since methemoglobin is unstable, stable quantitative measurement has been made possible by adding a device as described below. Hereinafter, a method for measuring hemoglobin and ALP will be described in further detail.
  • hemoglobin in the blood exists in the form of oxyhemoglobin, in which oxygen is bonded to divalent iron, and deoxyhemoglobin, in which oxygen is separated from oxygen. It is turned into methemoglobin, which is oxidized to monovalent iron.
  • the absorption of oxyhemoglobin is at 540 nm and 577 nm, and that of xyhemoglobin is at 555 nm.
  • the absorption of methemoglobin changes depending on the pH.
  • the absorption is 630 nm in the case of acid and the shorter wavelength region in the case of strong basic.
  • the wavelength of inexpensive semiconductor lasers and light-emitting diodes is 600 nm or more, so it is necessary to guide all hemoglobins in the blood to absorb more.
  • the measurement sample (the solution after the reaction) is placed in a cuvette with a long optical path length of 1 cm at the same wavelength as the excitation light applied to the cavities of the microchip, and the absorbance is measured. was done.
  • the output of the thermal lens detection method will also be unstable in principle. Therefore, stable and high-accuracy measurement of the absorbance is a necessary condition for the thermal lens detection method.
  • hemoglobin was oxidized to methemoglobin having an absorption of 630 ⁇ m without adding potassium cyanide. Then, this was irradiated with 633 nm laser light, and it was examined whether the change in absorbance had a capacity dependence. As a result, it was possible to quantify hemoglobin even at a wavelength of 63 nm. (About mixing ratio of blood sample and measurement reagent)
  • the output by the thermal lens detection method is determined at a normal mixing ratio (1: 250 or more). Was slightly unstable with time, and gradually decreased over time. For example, at 1: 250, the absorbance at 630 nm is reduced by 8.5% in 20 minutes, but by 1: 4 15 is decreased by 16%, and at 1: 250, it is 3%. This is a decrease of as much as 1%, which is difficult to apply to clinical diagnosis.
  • hemoglobin is measured with relatively low accuracy, it can be measured with this method, but improvements must be made to perform high-precision measurement.
  • the present inventors have found that if the mixing ratio of a blood sample to a measurement reagent having a composition described below is reduced from 1: 1 to 1: 250 or less, the output of the thermal lens detection method can be reduced. It has been found that changes over time (decrease) can be avoided.
  • the mixing ratio between the blood sample and the measurement reagent in the present invention is preferably from 1: 1 to 1: 250, more preferably from 1: 1 to 1:50, and even more preferably from 1: 1 to 1:10. is there. If the mixing ratio is less than 1: 1, for example, 1: 0.1, it may not be possible to provide sufficient measurement reagent and osmotic pressure for hemolysis. In addition, the effect of the viscosity of blood cannot be ignored when sending liquid in the microchip.
  • the neutral surfactant contained in the measurement reagent used in the method for measuring hemoglobin of the present invention is not particularly limited as long as it has a sufficient surfactant ability to dissolve all red blood cells.
  • Examples of the type of neutral surfactant include polyoxyethylene ethers such as 6-octylphenoxypolyethoxyethanol (for example, Triton X-100 from Sigma), and polyoxyethylene.
  • Polyoxyethylene such as ethylene sorbitan monolaurate (for example, Tween 20 from ICI and Sigma) and polyoxyethylene sorbitan monooleate (for example, Tween 80 for ICI and Sigma) Sorbi evenings (tweens) are used.
  • anionic surfactants such as SLS and cationic surfactants such as cetyltriptylammonium amide (CTAB) can be used in some cases. As long as the pH does not change during hemolysis, these ionic surfactants can be used.
  • CTL cetyltriptylammonium amide
  • a detailed list of surfactants can be found in the compendium. For example, Gower's Handbook, Surfactant, 2nd edition, Volumes 1 and 2 (1997).
  • the measuring reagent in the present invention may be added in such an amount that all the red blood cells in the blood sample are hemolyzed.
  • the measuring reagent in the present invention is added to a blood sample at a ratio of 1: 1 to 1: 250.
  • the concentration of surfactant in the resulting mixture is preferably from 0.5 to 1.1% by weight, more preferably from 0.7 to 0.9% by weight, even more preferably from 0.8 to 0.1% by weight. % By weight.
  • the oxidizing agent that can be used in the measurement reagent is not particularly limited as long as it can oxidize hemoglobin to methoglobulin. It is power cyanide. This reagent is added to a blood sample in an amount sufficient to oxidize all hemoglobin.
  • the oxidation of methemoglobin which is a necessary condition for the thermal lens detection method, requires 50 to: L 0000 It is preferably nmo (absolute amount), and more preferably, the oxidizing agent is 100 to 400 nmo (absolute amount) per 1 blood sample.
  • the pH value of the measurement reagent is preferably in the range of weakly acidic to weakly alkaline in order to maintain the absorption of methemoglobin at 630 nm.
  • the pH is preferably from 4 to 8, more preferably from pH 5.0 to 7.0, and even more preferably from pH 5.7 to 6.3.
  • ordinary buffers such as a phosphate buffer such as PBS and various good buffers are used.
  • the necessary conditions for the properties of the reaction system and the reaction product in the measurement method of the present invention are as follows: c) The reaction system does not pass through hydrogen peroxide.
  • the reaction product is a dye-based substance that absorbs at the wavelength of an inexpensive semiconductor laser.
  • the properties of the reaction product must be in the form of a solution with sufficient uniformity to the laser beam diameter.
  • Inexpensive semiconductor lasers currently on the market are those having wavelengths of about 635 to 645 nm or more. Therefore, as a reaction system in the measurement method of the present invention, a dye-based substance having an absorption at the above wavelength is generated. Is preferred.
  • the absorption spectrum of a red quinone dye obtained by oxidatively condensing phenol, which is a decomposition product of phenylphosphoric acid, with 4-AA (maximum: 500 nm) is measured in the wavelength region of 600 nm or more.
  • 4-AA maximum: 500 nm
  • glycerophosphate is used directly as a substrate, and glycerol to be produced is used as glycerol dehydrogenase and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NAD +).
  • NAD + oxidized nicotinamide adenine dinucleotide
  • dihydroxycetone A. Bianchi, et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 28, 35, 1994.
  • NADH and tetrazolium salt specifically, WST series of Dojindo Research Laboratories, Inc. are used as substrates, and phenazine mesylate (hereinafter referred to as PMS) or diaphora A method of measuring at a wavelength of 600 nm or more by adding a reaction system that reduces color by the activity of the enzyme and develops the color.
  • PMS phenazine mesylate
  • diaphora A method of measuring at a wavelength of 600 nm or more by adding a reaction system that reduces color by the activity of the enzyme and develops the color.
  • the method of measuring a red quinone dye with a human max of 500 nm at a wavelength of 600 nm or more reduces the resolution in measuring phosphatase activity.
  • a reaction system using glycerophosphate as a substrate is considered to be effective, it is necessary to optimize the combination of the substrate reaction systems and the like because of the multi-step reaction. Therefore, an additional study period is required to use the reaction system in the measurement method of the present invention.
  • BCI 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl
  • the measurement method of the present invention is effective for measuring ALP activity used in clinical chemistry by optimizing the concentration of BCIP in a measurement sample. did.
  • the concentration and reaction time of BCIP were defined so as to suppress the formation of BCI2 pigment particles having a diameter in the range of about 0.1 to 1 ⁇ m or less.
  • a buffer was prepared according to the JSCC standard method.
  • BCI ⁇ Waako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the ALP measurement reagent Measurement reagent
  • the final concentration is the concentration when a blood sample and a measurement reagent are mixed to obtain a measurement sample.
  • the solubility of the substrate BCIP in pure water is 20 mg / £, that is, 54 mM for sodium salt (Sigma General Catalog, SIGMA).
  • the solubility of BCIP in buffer 1 was about 7 OmM.
  • ALP measurement reagents of 70 mM, 35 mM, 15 mM: 10 mM, 6.25 mM, 5 mM, 2.5 mM, 1.25 mM were prepared respectively.
  • the absorbance meter can measure all B CIP concentrations, but there are some B C I P concentrations that are difficult to measure with the thermal lens detection method. Assuming that this is due to the presence of colored fine particles (dye particles), the particle size distribution of the reaction product was measured for the ALP measurement reagent at each BCIP concentration.
  • the particle size distribution was measured according to the manual of the device. Specifically, 10:11 samples 1 to 4 were added to an ultrasonic dispersion bath provided with the measuring device containing about 50 mL of purified water, and the measurement was performed.
  • the relative refractive index which is the measurement condition of the particle size distribution, was 1.26-0.00 ⁇ (As a result of the measurement, one obtained by mixing and reacting the ALP measurement reagent and the standard serum includes the above reaction. It was found that BCI 2 formed as a result of the above existed, and that the particles (fine crystals) of the BCI 2 were found to have a particle size of approximately several hundred nm (see FIG. 16).
  • the measurement results of the particle size distribution revealed that particles having a size of several / zm also existed.
  • particles with a particle size of several hundred nanometers are mainly present.
  • the particles are considered to be BCIP.
  • the thermal lens detection method it is necessary not to generate dye particles as a reaction product between the measurement reagent and a sample derived from a biological component.
  • the BLP concentration and reaction time of the ALP measurement reagent need to be appropriate.
  • lactate dehydrogenase hereinafter referred to as LDH
  • lactate and NAD + are changed to pyruvate and NADH by LDH activity
  • NADH and NTB are converted to NAD + by diaphorase activity. Convert quantitatively to insoluble diformazan. Then, the insoluble diformazan is solubilized with 0.1 N-H C and measured at a wavelength of 570 nm.
  • phenazine salt hereinafter referred to as PMS
  • PMS phenazine salt
  • the maximum absorption wavelengths of WST-1, WST-3, and WST-8 are 438 nm, 433 nm, and 46 O nm, respectively, and no absorption wavelength spectrum is observed above 60 O nm. .
  • the absorption can be obtained at 600 nm or more (spectral shift), so that the method can be applied to the measurement method of the present invention.
  • the pH must be adjusted in a microchip with a strong acid or strong alkali, or the solubilization of the insoluble dye with a solvent or the like must be performed in the microchip. Is my There is a risk of causing damage, such as dissolution, to the polymer and the like that make up the black chip. Then, the cross-sectional area of the capillaries changes, and the flow rate of the liquid flowing in the capillaries may change with time, which is not preferable.
  • WST-4 and WST-5 were applied as water-soluble substrates.
  • the present inventor was able to demonstrate the effectiveness of the measurement method of the present invention in the range of LDH activity measured in clinical tests.
  • TP blood total protein
  • TP blood total protein
  • a method of quantification at 600 nm using a pyrogallol red dye is also common (In Vitro Diagnostic Drug Collection, Yakuji Nipposha 1997).
  • the measurement method using pyrogallol red dye has a low concentration of total blood protein that can be measured quantitatively, and it is necessary to dilute the blood 1000 times or more in order to measure TP in blood.
  • Quantitative dilution in a microchip is possible. However, it is not practically possible to perform dilution 1000 times or more, because the dilution reservoir provided in the microchip becomes too large.
  • the present inventor has confirmed the absorbance spectrum of a commercial product (Kainos Auto Series TP reagent, manufactured by Kainos Co., Ltd.) as a buret colorimetric measuring reagent, and found that quantitative measurement of TP at 635 nm was possible.
  • a commercial product Kainos Auto Series TP reagent, manufactured by Kainos Co., Ltd.
  • ⁇ lease-indophenol method is a method that does not use a reaction that induces hydrogen peroxide from the substance to be measured, and performs quantitative measurement at an absorption wavelength of 570 nm.
  • the present inventor has developed a commercially available reagent for measuring the enzyme / indophenol method.
  • the p-nitro-2-lide method or the carboxy-p-nitroanilide method cannot be applied to the measurement method of the present invention in terms of the absorption wavelength of the reaction product (the 3-carboxy-14-hydroxyanilide method).
  • the dimethylaminoanilide method, the getylaminoanilide method, and the y-Gu-DBHA method are methods that do not use a reaction to derive hydrogen peroxide from a substance to be measured. Applicable to
  • albumin is colored by binding a dye to albumin, and quantification is performed. These methods do not use a reaction that induces hydrogen peroxide from the substance to be measured, and can be measured in a wavelength region of 600 nm or more.
  • the measurement method of the present invention is useful for a reaction for quantitatively measuring a substance to be measured via generation of hydrogen peroxide.
  • hydrogen peroxide is generated by a reaction with an enzyme specific to the substance to be measured.
  • the hydrogen peroxide causes oxidative condensation between 4-AA and the chromogen via peroxidase activity.
  • the wavelength for color development can be selected by selecting an appropriate chromogen. That is, measurement can be performed in a wavelength region of 600 nm or more.
  • Known methods for quantifying uric acid in blood include the ⁇ Licase POD method and the ⁇ Likaze-Kitatarase method, etc. (In Vitro Diagnostic Drug Collection, Pharmaceutical Daily, 1997) o
  • the present inventor has confirmed that a commercially available reagent (peripheral QUA, Jatron Co., Ltd.) of a pericase-POD method measuring reagent can be applied to the measuring method of the present invention to determine the amount of uric acid.
  • a commercially available reagent peripheral QUA, Jatron Co., Ltd.
  • a pericase-POD method measuring reagent can be applied to the measuring method of the present invention to determine the amount of uric acid.
  • Known methods for quantifying total cholesterol in blood include the cholesterol oxidase method (In Vitro Diagnostic Drug Collection, Yakuji Nippo, 199
  • the present inventor applied a commercially available reagent for measuring cholesterol oxidase method (HA test cholesterol E—HA test coco, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the measurement method of the present invention, It was confirmed that quantification was possible.
  • HA test cholesterol E HA test coco, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the present inventor has confirmed that it is possible to quantify HDL-cholesterol by adapting a commercially available direct measurement reagent (Cholester Test HDL, Daiichi Kagaku) to the measurement method of the present invention. .
  • a direct method is known as a method for quantifying LDL-cholesterol in blood (In Vitro Diagnostic Drug Collection '99 Supplement, Pharmaceutical Daily, 1999).
  • LDL-cholesterol can be quantified by adapting a commercially available direct measurement reagent (LDL-EX, Denka Seiken Co., Ltd.) to the measurement method of the present invention.
  • LDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.
  • the present inventor applied a commercially available enzyme colorimetric assay reagent (reagent for automatic analyzer: HR triglyceride-HR, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the assay method of the present invention, It was confirmed that quantification was possible.
  • enzyme colorimetric assay reagent reagent for automatic analyzer: HR triglyceride-HR, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Known methods for quantifying creatinine in blood include the Jaffé method and the enzymatic colorimetric method: Enzyme UV method (In Vitro Diagnostic Drug Collection, Yakuji Nippo, 1997) o
  • the present inventor has determined that it is possible to quantify creatinine by adapting a commercially available reagent (enzyme colorimetric method, L-type Co-creatinine F, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the measurement method of the present invention. confirmed.
  • thermal lens detection method has resistance to fine particles having a diameter of about several tens of nm that does not exhibit specific absorption at the wavelength of the excitation light, such as chyle, will be described.
  • Interference check ⁇ A Plus International Reagents Co., Ltd. was used to quantify the degree of chyle.
  • This combination of excitation light and probe light can be used to detect and quantify the output of the thermal lens detection method without any problem when biochemical parameters such as cholesterol are induced by dyes such as DA ⁇ S. It is a combination.
  • This can be seen, for example, in International Publication WO 99-64846 (International application PCT / JP 99/03 158, “Analyzer”), Japanese Patent Publication No. 2000-2675 ( Japanese Patent Application Publication No. Hei 18-1987, Japanese Patent Application Publication No. 1998 No. 1677, Japanese Patent Application Publication No. 1998 No.
  • the excitation light source used in the present invention for the measurement of hemoglobin must have a wavelength that can excite the absorption band of 630 nm of hemoglobin to the metha, and have sufficient output to form a thermal lens. It is.
  • the wavelength of the excitation light is 610 ⁇ ! ⁇ 650 nm is preferred, More preferably, it is 630 nm ⁇ 10 nm.
  • the light source of the excitation light is not particularly limited as long as it has a light intensity required for excitation around 630 nm.
  • prisms may be used to extract light of a required wavelength from a xenon lamp or the like, but if the light is split, the output will be reduced.
  • a laser having a wavelength capable of exciting the substance to be measured or a light emitting diode having a sufficient output may be used.
  • a 633 nm He-Ne laser can be used as the laser, but the use of a semiconductor laser makes the detector smaller, making it suitable for applications such as POC analysis.
  • a semiconductor laser a laser having a wavelength of 650 nm such as TOLD 945 OMC manufactured by Toshiba Corporation is also used. More preferred excitation light sources are LT050MS manufactured by Sharp Corporation and DL-3088-0 manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd. 1 1, DL4038-Semiconductor lasers with a wavelength of 635 nm, such as 025.
  • the wavelength of the probe light in the hemoglobin measurement is preferably longer than 600 nm, more preferably longer than 630 ⁇ m ⁇ 20 nm, which is the wavelength of the excitation light.
  • a 1064 nm YAG laser — or a carbon dioxide laser with approximately 1-0 oscillation line between 900 and 1200 nm — can also be used, such as Nippon Kagaku Engineering's LDT 783 0 and Sanyo Electric's DL-4034.
  • a semiconductor laser having a wavelength of 780 nm such as 151 is more preferable.
  • Semiconductor lasers having a wavelength of 830 nm such as DL-7032-0101 manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd., LT015PD manufactured by Sharp Corporation, and HL8325G manufactured by Hitachi, Ltd. can also be preferably used.
  • a focusing lens is required to focus both excitation and probe light near the cavity.
  • excitation light source and probe light source described above can also be used when measuring other than hemoglobin.
  • the change of the probe light due to the thermal lens La, photomultiplier tube, etc. are suitable for downsizing the detection device.
  • Excitation light is converted into pulse light (frequency: 50 Hz to 100 Hz) of about 0.1 to 20 ms by a chopper or the like, and changes in probe light are generated by a low-power amplifier or the like synchronized with the chopper. It is designed to take out only. A more preferable frequency of the chopper is 100 Hz to 400 Hz.
  • the structure of the c- rockin amplifier can be simplified with a single-function semiconductor element or the like.
  • the excitation light may be pulsed by electrically modulating the semiconductor laser.
  • a lock-in amplifier is generally used to detect the probe light, but the method of the dark-field photothermal conversion spectrometer disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 2009-229883 is used. You may. That is, it is a means for shielding the light flux near the optical axis of the pump light and the probe light with the shielding plate and detecting only the probe light diverged by the thermal lens.
  • the configuration and the like of the microchip used in the method for measuring hemoglobin of the present invention are not particularly limited as long as the microchip has a capillary through which a blood sample, a measurement reagent, and the like flow.
  • the following microchip is one of preferred embodiments of the present invention. That is, the microchip is composed of a pair of flat members. Is what is being done. At least one of the pair of flat members has a groove on the surface where the liquid flows. Then, by bonding the two flat members with the groove of the flat member facing the inside, a cavity is formed inside.
  • Such a microchip can be made of an inorganic material such as silicon or glass or an organic polymer.
  • the detection part of the thermal lens detection method must be transparent to excitation light and probe light.
  • an etching protection film such as Cr
  • a coating resist is applied thereon using a spinner or the like. After that, the resist is exposed to ultraviolet light using a photolithographic mask, and then developed (the uncured portion is removed with a solvent) to be patterned into a desired shape.
  • the etching protective film is dissolved and removed with an aqueous solution of potassium furocyanide and patterned.
  • the substrate is etched with, for example, a hydrofluoric acid aqueous solution to form grooves. After that, the resist and the protective film are removed by etching.
  • a substrate such as a glass having a through hole formed by a method such as laser or ultrasonic processing is prepared.
  • the substrate with the groove and the substrate with the through-hole are bonded together with the groove inside, and heated, for example, in a vacuum furnace (for glass substrates, about 600 ° C for several hours). After heating, it is naturally cooled and fused to form a chip with a microphone opening.
  • a vacuum furnace for glass substrates, about 600 ° C for several hours. After heating, it is naturally cooled and fused to form a chip with a microphone opening.
  • the light transmittance of the resin measured by ASTM D103 is 600 ⁇ ! In the wavelength range of 8800 ⁇ m, those having a wavelength of 80% or more, preferably 90% or more can be suitably used.
  • the above light transmittance is a value obtained by subtracting the sum of the reflectance on the surface of the microchip and the absorptance by the organic polymer substrate itself from 100%.
  • the light scattered on the surface of the microchip has no effect on the organic polymer, whereas the light absorbed by the organic polymer substrate generates heat on the organic polymer. Has the effect of causing. Therefore, when light passes through the organic polymer, an effect similar to that of a thermal lens occurs, and this becomes the background of the output by the thermal lens detection method, which causes measurement errors. Therefore, it is necessary to evaluate the organic polymer material prior to microchip fabrication and investigate the range of transmittance that does not affect the thermal lens detection method.
  • the absorption of light by the organic polymer forming the microchip is 1% or less. This means that the content is preferably 0.2% or less.
  • this value can change due to differences in the concentration of the substance to be measured and the fineness of the capillaries. For example, if the absorbance of a 1 cm cuvette is increased to about 0.5 by increasing the concentration of the substance to be measured, the absorption rate of a 50-millimeter cantilever will be 0.342%. Equivalent to. Therefore, if absorption by organic polymer microchips (formation of thermal lens) is allowed up to 10 times, the absorption rate by organic polymer microchips is about 3.5%, and absorption up to 2 times. The rate is less than 1%.
  • thermoplastic resins and resins obtained by UV curing are general melt-processable thermoplastic resins and resins obtained by UV curing. It can be used particularly well because it is a thermoplastic resin that can be melt-processed because it can be molded in large quantities and at low cost with a flat plate member with grooves on its surface.c Among them, amorphous thermoplastic resin and amorphous A thermoplastic polymer alloy containing a resin as a main component or a part of a crystalline thermoplastic resin having low crystallinity is preferable.
  • 1,3-Cyclohexadiene polymers are also preferably used. It can be used as a homopolymer, but when it is used as a copolymer, it can be used as a chain conjugated diene monomer such as 1,3-butadiene, isoprene, 1,3-pentene, 1,3-hexadiene.
  • Styrene polymethylstyrene, p-methylstyrene, 1,3-dimethylstyrene, vinylnaphthylene, vinylaromatic monomers such as vinylstyrene, methyl methacrylate, methyl acrylate, acrylonitrile, methyl vinyl ketone, Examples thereof include a polar vinyl monomer such as methyl cyanoacrylate or a polar monomer such as ethylene oxide, propylene oxide, cyclic lactone, cyclic lactam, or cyclic siloxane, or a copolymer with ethylene or a monoolefin monomer.
  • an injection molding method in which the solidification temperature of the resin surface in contact with the mold is lowered and injection molding is performed
  • Japanese Patent Publication No. No. 3, Japanese Patent Application No. 2006-66565 discloses a method of forming a flat member having fine grooves with high molding accuracy with high productivity. it can.
  • the injection molding method there is a method in which carbon dioxide is filled in a cavity and injection molding is performed.
  • the pressure of the carbon dioxide gas is lOMPa or less, more preferably 0.3 to 2MPa.
  • the mold temperature is set low, and only the mold surface is selectively heated immediately before molding by a high-frequency induction heating or a heat source such as a halogen lamp to achieve both mold surface transferability and the molding cycle. This is because it is a molding method that can be used.
  • Such a die for microchip molding is made of iron or iron as a main component.
  • Molds made of metals generally used for molding synthetic resins, such as steel, aluminum, alloys containing aluminum as a main component, zinc alloys, and beryllium-copper alloys, can be used favorably.
  • a microchip When a microchip is manufactured using a glass substrate, there is a method of forming a resist pattern on the glass substrate and processing the glass substrate by a sand blast method. According to this method, the direction of the incoming particles is aligned in the vertical direction by the thick resist, so that sharp processing can be performed as compared to the ordinary thin resist, and grooves with a high aspect ratio are formed. be able to. Furthermore, a method of applying a photosensitive resist on a glass or resin substrate, exposing portions other than the grooves, removing the uncured portions, and forming a groove-shaped resist pattern on the substrate can also be adopted. . Furthermore, the microchip used in the present invention can be manufactured by sandwiching a glass flat plate provided with a groove penetrating both surfaces with a laser or the like between two other glass flat plates. .
  • a method of forming a groove on a glass substrate by wet etching with hydrogen fluoride or the like after forming a resist pattern on the glass substrate can also be used.
  • a microchip composed of two flat members is preferable. At least one of them has a groove as described above, and is bonded to the other flat member with the surface having the groove inside. Then, they are integrated by ultrasonic fusion, heat fusion, adhesion with adhesives such as hot melt adhesives and UV adhesives, adhesion with adhesives, and press contact directly or through a thin elastic sheet.
  • adhesives such as hot melt adhesives and UV adhesives
  • adhesion with adhesives and press contact directly or through a thin elastic sheet.
  • the material of the flat plate member having no groove can be selected from the materials used for the flat plate member having the groove. Also, a thin glass plate or the like may be used. it can.
  • the materials of the two flat members may be the same material or different materials.
  • the thickness is not particularly limited as long as it does not hinder measurement, but is preferably about 0.05 to several mm. Regardless of the material used, the absorptance of the excitation light and probe light should be 5% or less, more preferably 1% or less, as described above, in the detection unit using the thermal lens detection method. is important.
  • the configuration of the microchip in the present invention is Is preferably composed of two flat members as described above. Preferably, at least one of them has a groove, and a structure in which the surface having the groove is on the inner side and bonded to the other flat member is adopted. However, it is also possible to adopt a three-plate configuration in which a flat member having a through groove is sandwiched by two other flat members to form a groove.
  • the flow rate means the volume of the liquid that moves in the groove (capillary) within a certain period of time.
  • a quantitative reaction in a microchip can be performed by weighing and mixing a fixed amount of a blood sample and a measurement reagent in a measuring tank inside or outside the microchip.
  • the measurement reagent and the blood sample can be mixed at a fixed ratio, and the reaction can be performed continuously for at least a certain period of time (see above).
  • a pump outside the chip or a method using centrifugal force or gravity as a liquid sending means can be used.
  • Electroosmotic flow is caused by the movement of ions on the inner surface of the capillaries.
  • the liquid in the rally moves together.
  • the cavities are made of glass-silicon, the mobility of the protons is from the acid on the glass surface.
  • the electrolyte in the liquid may be transferred to the inside of the capillary.
  • the electroosmotic flow can be generated by the movement of the electrolyte.
  • an organic polymer having a sulfonic acid group or a carboxylic acid group may be added to the surface of the inner surface of the capillary by graft polymerization or the like. It is also effective to hydrolyze the surface of PMMA or the like with an aqueous sodium hydroxide solution to form carboxylic acid groups on the inner surface of the capillaries.
  • the flow rate can be controlled precisely and precisely according to the set program by controlling the voltage. Therefore, it is preferable because the reaction and separation in the microchip can be accurately controlled.
  • a high-voltage power supply (eg, Mode del HCZE-30PNO, 25, Matsusada Precision, capable of applying up to 30 kV) is used as the power supply to generate the electroosmotic flow.
  • the output of the high-voltage power supply can be controlled from an external computer via an internal or external face board (eg, DAQCard-1200, CB-50 connector block, National Instruments).
  • a program such as timing of voltage application can be created by using, for example, NI-D AQ drive software (Lab V I EW).
  • the shape of the flow path adopts a shape where one flow path is joined with another flow path, or a shape where one flow path is joined with multiple flow paths at one place. can do.
  • Mixing operation and dilution operation can be performed by combining one flow path with another flow path or a plurality of flow paths to form one flow path. At this time, mixing and dilution at different ratios are possible by changing the flow rate of each.
  • a measuring tank (measurement cylinder) is provided in the microchip, and a blood sample and a measuring reagent are measured in this measuring tank, and they are mixed to measure a thermal lens. It can also be provided to an output device.
  • the reaction between the blood sample and the measurement reagent preferably takes 2 to 10 minutes for mixing and for completing the reaction.
  • heparin blood collected from a healthy person was used as a blood sample.
  • the mixing ratio between the blood sample and the above-mentioned measurement reagent is 1: 250
  • the above-mentioned measurement reagent is diluted to 996% with respect to 4% of the blood sample, and diluted to 60% with PBS (phosphate buffer) at the mixing ratio of 1: 415
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 1 Changes in absorbance over time immediately after the addition are shown in FIG. 1 (mixing ratio 1: 250), FIG. 2 (mixing ratio 1: 415), and FIG. 3 (mixing ratio 1: 1245).
  • the decrease in absorbance after 1200 seconds (20 minutes) compared to immediately after the addition was 8.5% at a mixing ratio of 1: 250, 16.3% at a mixing ratio of 1: 415, and 31% at a mixing ratio of 1: 124. Met.
  • Fig. 6 shows the absorption spectra after 10 minutes and 20 minutes. In this case, the decrease in absorbance after 1,200 seconds (20 minutes) as compared to immediately after mixing was stable at 2.9%.
  • the pH value was examined using a solution in which potassium ferricyanide and Triton X-100 were dissolved at a concentration of 0.61 mM and 0.8% by weight, respectively, as a measurement reagent.
  • the pH value was adjusted using the following reagents for adjusting the pH value.
  • pH 2 and pH 4 are 1 OmM citrate buffer adjusted with Na ⁇ H
  • pH 6 is 1 OmM MES buffer
  • pH 8 is 1 OmM TRIZMA (Sigma) buffer
  • p H 10 was adjusted using an approximately 1 mM NaOH solution
  • pH 12 was adjusted using an approximately 10 mM Na ⁇ H solution.
  • the method for measuring a substance of the present invention it is possible to measure the concentration of a substance such as hemoglobin from a minute amount of a specimen, particularly a specimen derived from a living body such as blood or urine.
  • a long-wavelength laser can be used as the excitation light. Therefore, the thermal lens detector can be manufactured at low cost and is economical. Therefore, the method of measuring the substance of the present invention and the measuring reagent used in the measuring method are a measuring method and a measuring reagent suitable for P0C analysis and the like.
  • Fig. 1 shows the results at 635 nm (upper curve) and 780 nm (lower curve) when the mixing ratio of the blood sample to the measurement reagent was 1: 250 in Experimental Example 1.
  • 4 is a graph showing a change over time in absorbance of a measurement sample.
  • Fig. 2 shows the results at 635 nm (upper curve) and 780 nm (lower curve) when the mixing ratio of the blood sample to the measurement reagent is 1: 4 15 in Experimental Example 1.
  • 4 is a graph showing a change over time in absorbance of a measurement sample.
  • Fig. 3 shows the results of 635 nm (upper curve) and 780 nm (lower curve) when the mixing ratio of the blood sample and the measurement reagent was 1: 1 245 in Experimental Example 1.
  • 5 is a graph showing the change over time in the absorbance of the measurement sample in FIG.
  • Fig. 4 shows the absorption spectrum of the measurement sample after the blood sample and the measurement reagent were mixed at 1: 4 and reacted for 5 minutes in Experimental Example 1. (The oxidizing agent concentration in the measurement reagent was 1 to 3).
  • Fig. 5 shows the absorption spectrum of the measurement sample after mixing the blood sample and the measurement reagent at 1: 4 and reacting for 5 minutes in Experimental Example 1. (When raised from the case in Fig. 4).
  • Fig. 6 shows the time-dependent changes in the absorption spectrum of the measurement sample after mixing the blood sample and the measurement reagent at 1: 4 in Experimental Example 1.
  • the oxidizing agent concentration in the measurement reagent is shown in Fig. 5. The same as if)).
  • (A) is 30 seconds after mixing, (b) after 10 minutes and (c) after 20 minutes.
  • FIG. 7 shows the absorption spectrum of the measurement sample under the conditions of pH 2, 4, 6, 8, 10, and 12 in Experimental Example 2.
  • FIG. 8 (a) is a graph showing the relationship between the hemoglobin concentration and the output by the thermal lens detection method in Experimental Example 3.
  • (B) is an enlarged graph of the low hemoglobin concentration portion on the horizontal axis of (a).
  • the numbers in the unit of g / d 1 at the top of the horizontal axis indicate the hemoglobin concentration in the blood sample, and the numbers in units of g / ml at the bottom of the horizontal axis indicate the hemoglobin concentration in the measurement sample.
  • FIG. 9 is a diagram showing a flow channel shape of a microchip made of an organic polymer.
  • FIG. 10 is a graph showing the measurement results of ALP activity by a photothermal conversion detection method in a glass cuvette.
  • FIG. 11 is a measurement chart showing the measurement results of ALP activity by the photothermal conversion detection method in Comparative Example 1.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring ALP activity by the absorbance method.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing a configuration of a liquid sending system according to a fifth embodiment.
  • FIG. 14 is a schematic diagram for explaining the configuration of the belly pump shown in FIG.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of measuring ALP activity by a photothermal conversion detection method in a resin microchip.
  • FIG. 16 is a diagram showing the measurement results of the particle size distribution of BCI2.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of measuring LDH activity by the photothermal conversion detection method.
  • Fig. 18 is a graph showing the measurement results of total protein concentration by the photothermal conversion detection method. It is.
  • Fig. 19 is a graph showing the measurement results of urea nitrogen concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 20 is a graph showing the measurement results of the total pyrilvin concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 21 is a graph showing the measurement results of the GTP activity by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 22 is a graph showing the measurement results of albumin concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 23 is a graph showing the measurement results of the AST activity by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 24 is a graph showing measurement results of uric acid concentration by a photothermal conversion detection method.
  • FIG. 25 is a graph showing a measurement result of a glucose concentration by a photothermal conversion detection method.
  • FIG. 26 is a graph showing the results of measuring the total cholesterol concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 27 is a graph showing the measurement results of the HDL-cholesterol concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 28 is a graph showing the measurement results of LDL-cholesterol concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 29 is a graph showing the measurement results of the neutral fat concentration by the photothermal conversion detection method.
  • FIG. 30 is a graph showing the results of measuring the creatinine concentration by the photothermal conversion detection method.
  • Figure 31 shows the photothermal conversion of total cholesterol concentration in a sample with chyle.
  • 5 is a graph showing measurement results by a detection method.
  • FIG. 32 is a graph showing the results of measurement of the total cholesterol concentration in a sample exhibiting chyle by the absorbance method.
  • the linearity between the dilution degree of the blood sample and the output by the thermal lens detection method was examined.
  • the configuration of the photothermal conversion detection device whose contents will be described below is as follows.
  • An inverted microscope (1X70, Olympus) was used for the microscope in consideration of the ease of handling the sample on the stage. This may be an epi-illumination type microscope. This microscope has been modified to introduce a laser beam coaxial with the optical system outside the microscope.
  • the laser uses a He—Ne laser (633 nm, 10 mW, manufactured by Edmont Scientific) for excitation, and a semiconductor laser (780 nm) for detection (probe light). Nippon Kagaku Engineering LDT 7830) was used. Optical systems such as mirrors and beam expanders were unified with Mesglio products.
  • the laser beam for excitation is modulated by a light chopper, made coaxial with the laser for detection by a dichroic mirror, guided to a microscope, and irradiated to a measurement sample. After irradiating the measurement sample, only the excitation light of the coaxial laser light is selectively removed by the filter and guided to the photosensor.
  • a photosensor amplifier with a fiber (C6386, Hamamatsu Photonics) was used for the element of the laser light receiving part for easy handling. This photo sensor light receiving section has a cover with a pinhole. Covered with one.
  • the output from the photosensor and sensor amplifier is amplified by a low-noise preamplifier (LI-75A, manufactured by NF Corporation), and then guided to a lock-in amplifier for signal processing.
  • LI-75A low-noise preamplifier
  • the blood of a healthy person to which heparin was added (haemoglobin concentration was 16 g / d ⁇ ) was used as a blood sample.
  • a solution (pH 6.0) in which potassium furocyanide, ⁇ ES, and Triton X-100 were dissolved at concentrations of 8 mM, 10 mM, and 0.8% by weight, respectively was used.
  • the hemoglobin (Hb) concentration in the measurement sample is 640 OgZmjg
  • If the Hb concentration in the measurement sample is 640 g / mjg, add 996 ⁇ of the measurement reagent to blood sample 4 and mix. If the Hb concentration in the measurement sample is 384 ⁇ g / m, add 6 g of PBS.
  • Each of the measurement samples thus obtained was placed in a flat glass cuvette with a depth of 50 zm and a width of several mm (Quartz Ce QGT e AB20-SQ-0.05 from GLS sciences). ), And placed this cube on the stage of an inverted microscope.
  • This cuvette was a model version of a microchip with a complex groove pattern, but it was wide but had the same groove depth as the microchip. In the thermal lens detection method, if the width of the groove is more than several tens / zm, there is no problem even if it is wider than it (however, diffusion mixing in the groove is affected).
  • An excitation laser was used to focus the objective lens. In other words, focusing was performed on the edge of the groove of the glass cubette while referring to the monitor screen. Then, a thermal lens was detected almost at the center of the groove.
  • the laser for excitation was modulated to 3289 Hz by a light chopper to excite methemoglobin and generate heat.
  • Frequency modulation by this Rye DOO chopper also likely c focal position of the detection laser one by the thermal lens generated by this heat generation can be changed by influence of the S / N ratio is not, through thereby pinholes
  • the amount of light received by the photo sensor changes according to the amount of heat generated.
  • the signal from the photosensor is processed by the mouth-in amplifier.
  • a time constant of 1 second was used, and only the signal with the same frequency of 329 Hz as the light chopper was selectively used as the output.
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis is the output intensity (mV) by the thermal lens detection method
  • the upper part of the horizontal axis is the hemoglobin concentration in the blood sample
  • the lower part of the horizontal axis is the hemoglobin concentration in the measurement sample after mixing the measurement reagent.
  • Hemoglobin in blood samples was measured using a microchip made of an organic polymer and a semiconductor laser of 635 nm as excitation light. The details will be described below.
  • the plate-like member having a groove on the surface, which constitutes the microchip, was formed by injection molding.
  • the resin used for the injection molding was Mesacrylic resin (Delut 80 NH manufactured by Asahi Kasei Corporation). Purity of more than 99% as gas
  • the pressure was set to IMP a.
  • the molding machine used was SG 50 manufactured by Sumitomo Heavy Industries, Ltd.
  • the molded product is a flat member having a thickness of 2 mm and lengths and widths of 120 mm and 60 mm.
  • a linear groove having a width of 100 ⁇ m, a depth of 50 ju, and a length of 3 cm is provided on the surface of the flat member.
  • Circular grooves (diameter: 3 mm, depth: 50 mm) are formed at both ends of the grooves to provide through holes for the sample to be drawn in and out.
  • a through-hole with a diameter of 2 mm was made in the circular groove with a drill or the like to serve as a lead-in / out part for the measurement sample.
  • the mold for the mold may be one obtained by etching silicon by the RIE method or one obtained by light curing with DFR (dry film resist).
  • DFR dry film resist
  • a 200-inch thick methacrylic resin sheet coated with a photocurable adhesive was bonded to the grooved surface of the thus obtained flat member. Then, UV light was applied to form a capillary with only both ends open, and this was used as a microchip for measurement.
  • the device described in Example 1 was basically used as the photothermal conversion detection device. However, the laser for excitation light was changed from a He—Ne gas laser of 633 nm to a semiconductor laser (DL-43038-025) manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd. The optical system was adjusted accordingly.
  • a measurement sample healthy human blood (haemoglobin concentration: 16 g / d) to which heparin was added was used as a measurement reagent (potassium ferricyanide, MES, Liton X-100 was mixed and reacted with a solution (pH 6.0) of 8 mM, 10 mM, and 0.8% by weight, respectively.
  • a measurement reagent potassium ferricyanide, MES, Liton X-100
  • the hemoglobin concentration in the measurement sample is 6400 ⁇ g / mjg
  • the above-mentioned measurement reagent is added to the blood sample 40 and mixed with 960
  • the hemoglobin concentration in the measurement sample is 640 / g / m
  • blood Sample 4 / was added to, and the measuring reagent solution 996 was added and mixed, and each was allowed to stand at room temperature for at least 5 minutes.
  • a microchip was prepared in the same manner as in Example 2.
  • a PMMA flat member 31 having a groove on the surface as shown in FIG. 9 was formed by injection molding.
  • the outer dimensions of the flat member 31 are the same as those of the second embodiment.
  • a through-hole having a diameter of 1 mm was made with a drill in the circular grooves 1 and 2 of the plate-shaped member 31 to provide a blood sample and a measuring reagent introduction portion.
  • a through-hole was made in the circular groove 3 to serve as a waste liquid outlet.
  • FIG. 9 shows the flow path shape of the formed capillaries. At the end of the flow path, a reservoir 1 for blood sample, a reservoir 2 for the measurement reagent, and a waste liquid reservoir 3 are provided, excluding the through holes of both reservoirs 1, 2 and the waste liquid reservoir 3.
  • the size is 3mm in diameter and 50m in depth.
  • All capillaries are 50 mm deep and 150 mm wide, and their lengths are 9 mm for channel 11, 9 mm for channel 12, and 65 mm for channel 13.
  • the flow path 13 is provided with a detection unit 21 using a photothermal conversion detection method (thermal lens detection method), and the distance from the junction 22 between the flow paths 11 and 12 to the detection unit 21 is 6 Omm. .
  • a solution pH 6.0 in which potassium ferricyanide, MES, and Triton X-100 were dissolved at a concentration of 8 mM, 10 mM, and 0.8% by weight, respectively, was used.
  • a blood sample blood from a healthy person to which heparin was added (haemoglobin concentration was 16 g / d d) and a hemoglobin concentration adjusted to 10 g / d £ by diluting it with PBS were used.
  • microsyringes manufactured by Hamilton
  • the microsyringes were connected to the through-hole of the blood sample reservoir 1 with a Teflon tube.
  • 20 measurement reagents were placed in another microsyringe, and the microsyringe was connected to the through-hole of the measurement reagent reservoir 2 by another Teflon tube.
  • Both microsyringes were mounted separately on two microsyringe pumps (manufactured by Harvard) so that the blood sample flow rate was 0.2 l / hr and the measurement reagent flow rate was 4.8 l / hr. Then, each micro syringe pump was set. Thus, the mixing ratio of the blood sample to the measurement reagent is 1:24. The reaction time after mixing is the time required to flow through flow path 13 in Fig. 9, so 5.4 Minutes.
  • Hemoglobin was measured in the same manner as in Example 1 except that an Ar laser emitting at 488 nm was used as a probe light source.
  • Blood samples (hemoglobin concentration: 16 g / d) from two healthy subjects to which heparin was added were used as blood samples 1 and 2. These blood samples were diluted to 60% and 20% with PBS to obtain 0.6 x and 0.2 x samples.
  • the solution (pH 6.0) dissolved at a concentration of 996 ⁇ was added, mixed, and allowed to stand at room temperature for at least 5 minutes before measurement by the thermal lens detection method.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • the numerical values in Table 1 are the outputs obtained by the thermal lens detection method after subtracting the background.
  • the light-to-heat conversion detection system (light-to-heat conversion detection device) used had the same basic configuration as in Example 1.
  • the general procedure of measurement by the photothermal conversion detection system in the measurement of a substance other than hemoglobin is as follows.
  • a flat microchip having a groove pattern (or a glass cell containing a sample to be measured; the depth of the glass cell is 50, 100, 200, or 500 mm) is placed on the stage of an inverted microscope.
  • An excitation laser is used to focus the objective lens. Focusing is performed at the upper and lower positions of the groove pattern while referring to one screen of the monitor, and the intermediate point is set. It was located at the center of the groove.
  • the excitation laser is modulated to 117 Hz by a light chopper to excite the reaction product in the groove and generate heat.
  • the frequency of modulation by this light chopper may change due to the influence of the S / N ratio and the like.
  • the thermal lens generated by this heat shifts the focus position of the detection laser, and the amount of light received by the photo sensor through the pinhole changes according to the amount of heat generated.
  • the measurement sample may be in a state where the flow is stopped or in a state where it is flowing. However, in this embodiment, the measurement is performed in a state where the flow is stopped.
  • the signal from the photosensor 1 is processed by a lock-in amplifier.
  • a time constant of 1 second was used, and only a signal having the same frequency of 117 Hz as that of the light chopper was selectively used as an output. Since the output voltage of the mouth-in amplifier is proportional to the concentration of the reaction product excited by the excitation light, the reaction product can be quantified.
  • buffer 1 was prepared in the same manner as described above.c. Immediately before the reaction with the blood sample, BCIP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate at a final concentration of 30, 15, The solution was dissolved in buffer solution 1 to a concentration of 7 mM, and an ALP measurement reagent (measurement reagent) was prepared.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of lyophilized product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.) 250 and adjusted so that the ALP activity was calculated to be 302 IU, and used as a stock solution. . Next, dilute the stock solution with purified water and calculate the ALP of 101 IU / and 51 IU / A solution containing the activity was prepared. These solutions and purified water itself were used as samples.
  • the configuration is the same as that of the fourth embodiment.
  • the disposable injection needle was cut at a position about 3 mm from its root, and the tip was removed to create a conical external reservoir.
  • the size of the external liquid reservoir was 4 mm in inner diameter and 10 mm in height.
  • the three external liquid reservoirs were bonded to the plate-shaped member 31 so as to communicate with the liquid reservoirs 1 to 3, respectively, to complete a microchip.
  • FIG. 13 shows a liquid delivery system composed of a micro syringe 41, a syringe pump 40, and a Berisu pump 50 with an improved syringe pump.
  • FIG. 14 is a schematic diagram illustrating the configuration of the Berisu evening pump 50.
  • Micro syringe 41, 41 manufactured by Hamilton Co., Ltd., with a capacity of 500
  • syringe pump 40 manufactured by Harvard
  • One end of 5 1, 5 1 is connected to an ethylene vinyl acetate tube 4 2, 4 2 (internal diameter 350 5m).
  • the other ends of the peristaltic tubes 51 and 51 and two external reservoirs 61 and 61 communicating with the reservoirs 1 and 2 of the microchip 60 are connected to SUS tubes 52 and 52, respectively. It is linked by
  • the Belis tube 51 fixed to the Beris pump 50 by the tube stopper 55 is sandwiched between the mouthpiece 53 and the aluminum plate 54.
  • the roller 53 in the longitudinal direction of the tube 5 By moving the roller 53 in the longitudinal direction of the tube 5, the liquid in the tube 51 is pushed out toward the polymer chip 60.
  • the flow rate of the ALP measurement reagent and the specimen is controlled, and the liquid is sent from the micro syringe 41 to the microchip 60.
  • the light-to-heat conversion detection system (light-to-heat conversion detection device) used had the same basic configuration as in Example 1.
  • the laser for the excitation light is a semiconductor laser having a light emission of 635 nm from a He—Ne gas laser having a wavelength of 633 nm (DL—43038-0 manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.). 2 5) The optical system was adjusted accordingly.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product is dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.) 2500 ⁇ , and the ALP activity is adjusted to a calculated value of 3500 IU /. And Next, the stock solution was diluted with purified water and the calculated ALP activity was 175 IU / and 100 IU / A solution that was U / was prepared. Furthermore, 480 Buffer 1 was mixed with each of the two solutions and 20 ml of purified water, and these were used as specimens. Each liquid contains a small amount (0.1 V o £) of a suspension of 0.5 ⁇ m latex beads (made by Otsuka Electronics Co., Ltd., cell monitor particles for plate samples) to check the flow. %) Was added.
  • the measuring reagent was injected into the liquid reservoir 1 and the sample was injected into the liquid reservoir 2 manually using a syringe or the like.
  • the microchip 60 into which both solutions were injected was placed on the stage of an inverted microscope equipped with a 37 ° C. air thermostat.
  • liquid reservoirs 1 and 2 of the microchip 60 and the belly tube 51 attached to the perimeter pump 50 are connected by a SUS tube, and the liquid supply having a configuration as shown in FIG. Completed the system.
  • the measurement reagent and the sample were allowed to flow at a flow rate of 600 / £ / h for about 3 minutes, and the two liquids were fed into the cavities of the microchip 60. Thereafter, the syringe pump 41 was stopped, and the ALP activity was measured in the same manner as in Example 4. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 15 was obtained.
  • sample 2 was prepared by mixing 625 ⁇ of standard serum with an ALP measurement reagent having a BCIP concentration of 7 OmM and reacting at 37 ° C for 3 days.
  • Sample 3 was obtained by mixing standard serum 625 ⁇ with an ALP measurement reagent having a BCIP concentration of 6.25 mM and reacting at 37 ° C for 3 hours. Further, Sample 4 is the ALP measurement reagent having a BCIP concentration of 6.25 mM (standard serum is not mixed).
  • Figure 16 shows the measurement results.
  • BCI2 produced as a result of the reaction is present in the measurement reagent obtained by mixing and reacting the ALP measurement reagent and the standard serum. Then, it was found that the BC12 particles (fine crystals) had a particle size of about several hundred nm.
  • the measurement results of the particle size distribution revealed that particles having a size of several / m were present.
  • particles with a particle size of several hundred nm are mainly present.
  • the particles are considered to be BCIP.
  • the thermal lens detection method it is necessary not to generate dye particles as a reaction product between the measurement reagent and a sample derived from a biological component.
  • the BCIP concentration and reaction time of the ALP measurement reagent must be appropriate. Needless to say, it is not preferable that fine crystals such as BCI 2 particles exist before the reaction between the measurement reagent and the biological component-derived sample.
  • the LDH activity was measured in the same manner as in Example 5. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 17 was obtained.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the calculated TP concentration was 9.75 gd £, 7.5 g / d and 5.0 g / d. Adjusted to be d. Then, these solutions and purified water itself were used as samples.
  • the photothermal conversion detection device As the photothermal conversion detection device, a device having the same configuration as in Example 4 was used. Then, mixing and reaction of the sample and the measurement reagent were performed according to the specification of the measurement reagent. Thereafter, the measurement sample was transferred to a flat glass cuvette having a depth of 50 / m (Quartz Ce £ 2 Type AB 20—SQ—O.05) manufactured by GL Sciences, and this cuvette was used. Was mounted on the stage of an inverted microscope. Focusing of the objective lens is performed using the position showing the highest value as an index while observing the output value of the lock amplifier. The highest value was processed by the above-mentioned software LabVIEW to measure the TP concentration. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 18 was obtained.
  • the sample used was Sutrol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the urea nitrogen concentration was calculated to be 99.4 mg / d, 24.9 mg / d, and 6.2 mg / d Adjusted to be d. Then, these solutions and purified water itself were used as samples.
  • the light-to-heat conversion detection device used was the same as in Example 4. Then, the urea nitrogen concentration was measured in the same manner as in Example 8. As a result, a calibration curve as shown in Fig. 19 was obtained. .
  • the measurement reagent the total Pirirubin measurement for HA Tesutowako one total Pirirubin II- HA Tesutowako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used according to specifications (the specimen, sweep rate Troll A (day water that has partially modified the method of preparation Specifically, 1 vial of lyophilized product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the total pyrilrubin concentration was calculated to be 1.68 mg / d 0.4 mg / d. d, and 0.1 mg / d, and these solutions and purified water itself were used as samples.
  • the light-to-heat conversion detection device used was the same as in Example 4. Then, the GTP activity was measured in the same manner as in Example 8. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 21 was obtained.
  • albumin reagent A International Reagents Co., Ltd. was used according to the specifications.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product is dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the calculated albumin concentration is 7.0 g / d 4.71 g / d, and 2.35 g Adjusted to be / dd. These solutions and purified water itself were used as samples.
  • Example 4 As the photothermal conversion detection device, a device having the same configuration as in Example 4 was used. Then, the albumin concentration was measured in the same manner as in Example 8. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 22 was obtained.
  • Reference Examples 2 to 9 below show measurement examples of various substances for reference.
  • TA-LN Kainos (Kainos Co., Ltd.) was used as the measurement reagent according to the specifications. However, this measurement reagent contains D AOS (Dojindo Laboratories, Inc.) in place of the TOOS normally contained in TA-LN Kainos. ing. Its concentration is usually the same as that containing T ⁇ 0 S.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, one vial of freeze-dried product is dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the calculated AST activity is 23.8 KU, 33.6 KU, and 1.7 KU. Was adjusted as follows. Then, these solutions and purified water itself were used as samples.
  • the photothermal conversion detection device As the photothermal conversion detection device, a device having the same configuration as in Example 4 was used. Then, the AST activity was measured in the same manner as in Example 4. As a result, a calibration curve as shown in Fig. 23 was obtained.
  • Iatro LQUA Jatron Co., Ltd.
  • the sample used was Sample A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product is dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the calculated uric acid concentration is 9.7 Q mg / d Q ⁇ 6.5 3 mg / d, and 3. It was adjusted to 25 mg / dd. Then, these solutions and purified water itself were used as samples.
  • DEMINA GL ⁇ (Kyowa Medex Co., Ltd.) was used according to the specification.
  • Samples include Sytrol ⁇ ⁇ (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) Was used. Specifically, 1 vial of lyophilized product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the glucose concentration was calculated to be 305 mg / d, 101.7 mg / d, and 50.9 mg / d. so as to adjust the c then, the purified water itself and these solutions and specimen.
  • Example 4 As the photothermal conversion detection device, a device having the same configuration as in Example 4 was used. Then, the glucose concentration was measured in the same manner as in Example 8. As a result, a calibration curve as shown in FIG. 25 was obtained.
  • Cholestest HDL (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) was used as a measurement reagent according to the specifications.
  • the photothermal conversion detection device As the photothermal conversion detection device, a device having the same configuration as in Example 4 was used. Then, the HDL-cholesterol concentration was measured in the same manner as in Example 8. As a result, a calibration curve as shown in Fig. 27 was obtained.
  • Choletest LDL (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) was used as a measurement reagent according to the specifications.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of lyophilized product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the calculated neutral fat concentration was 2 ° 8 mg / d, 10 mg / d, and 34, 7 mg / d. Adjusted to be d. Soshi Then, these solutions and purified water itself were used as samples.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of lyophilized product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the creatinine concentration was calculated to be 1.5 mg / d12, 0.79 mg / d, and 0.3. Adjusted to 9 mg / d. These solutions and purified water itself were used as samples.
  • the sample used was Strol A (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) whose preparation method was partially modified. Specifically, 1 vial of freeze-dried product was dissolved in purified water (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), and the total cholesterol was calculated to be 80 Omg / d, 40 Omg / d, 200 mg / d £, and 0 mg / d. d (purified water itself). Then, use these solutions as interference check • A plus (International Reagent Co., Ltd.) chyle and chyle blank. The diluted sample was used as a sample. The sample diluted with interference check A-brass chyle is a sample showing chyle, and the sample diluted with interference check A-plus chyle is a sample that does not show chyle.
  • the sample preparation step and the photothermal conversion detection step are performed in a microchip, the amount of the biological component-derived sample and the measurement reagent required for the measurement are small. Furthermore, the operation of preparing a measurement sample by mixing a biological component-derived sample and a measurement reagent is simple, and the amount of waste is reduced.
  • the method for measuring hemoglobin of the present invention stable measurement of hemoglobin is possible. Since the measuring reagent does not contain the toxic cyanide, there is no danger in handling the measuring reagent, and complicated waste liquid treatment is unnecessary.
  • the method for measuring the substance of the present invention it is not necessary to perform measurement at two different wavelengths, even for a blood sample presenting chyle, which is a problem in clinical examination, and quantitative measurement can be performed in one measurement. Measurement is possible.
  • the measurement reagent of the present invention it is possible to stably measure the amounts of substances such as hemoglobin and ALP in a trace amount of a biological component-derived sample by a photothermal conversion detection method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

明 細 書 物質の測定方法及び該測定方法に用いる測定試薬 技術分野
本発明は、 微量検体中の物質を簡便に測定する方法に関する。 また、 該測定方法において用いる測定試薬に関する。 背景技術
医療診断に必要な測定を患者近傍で行うべッ ドサイ ド診断用の分析 ( P O C (point of care ) 分析） や、 河川や廃棄物中の有害物質の分 析を河川や廃棄物処理場等の現場で行うことや、 食品の調理， 収穫， 輸 入の各現場における汚染検査等のような、 分析 ·測定が必要とされる現 場もしくは現場の近傍で分析 ·測定を行うこと （以下、 「P O C分析 等」 と総称する） の重要性が注目されている。 そして、 近年、 このよう な P O C分析等に適した測定法や装置の開発が重要視されつつある。 このような P 0 C分析等においては、 安価で簡便且つ短時間で測定で きることが要求されている。 また、 医療診断のための分析に対しては、 分析時間の短縮や、 分析に必要な検体 （血液等） の量及び測定後の廃棄 物の量の微量化が求められている。
上記のような P 0 C分析等における測定法には、 通常、 吸光度法が採 用されることが多い。 吸光度測定の際の光路長は、 測定感度の点から 1 c mが標準であるが、 数ミリメートル程度まで短く しても、 感度が若干 低下するものの測定は可能である。
このような短い光路長での吸光度測定としては、 例えば、 日本国特許 公表公報 平成 1 0年第 5 0 1 3 4 0号や日本国特許公表公報 平成 9 年第 504732号に記載のもの （以上 2件はアバクシス社による出 願） や、 日本国特許公開公報 平成 9年第 196920号 （免疫項目） ： 曰本国特許公開公報 平成 8年第 1 14539号 （生化学項目） ， 日本 国特許公開公報 平成 9年第 196739号 （溶解液先端検知） ， 日本 国特許公開公報 平成 9年第 138 195号 （多孔性材料の透過光測定 による分析） に記載のもの （以上 4件は日本メディフィジックス社によ る出願） がある。
しかしながら、 検体量がさらに微量になると、 ミ リメートル単位の光 路長を有する検出キュベッ ト （セル） では容積が大きすぎて、 セルの容 積に試料量を合わせようとすると、 試料中の検体の濃度が薄くなりすぎ て分析できない場合がある。
このような問題を解決するために、 〃TAS (micro total analysis system ) あるいは L ab-on-Ch i と総称される分析法の概念 が提唱されている (Sensors and Actuators, Bl(1990)， 244-248, A. M anz 他） 。 これらのものは、 従来利用されてきた分析装置を小型化し、 且つ、 数/ mから数百// mの幅及び深さのキヤビラリを有する数 cm角 程度の大きさのチップを用いて試料の分離や反応を行って、 微量分析を 簡便に行うことを目指している。
T A Sは、 微量な試料でも分析可能な測定方法として研究が進めら れている （日本国特許公開公報 平成 2年第 245655号参照） 。 こ の〃 TASは、 10 cmから数 cm角程度以下のガラス、 シリコン、 有 機ポリマー等のチップの表面に、 深さ及び幅が数 mから数百// m程度 の溝 （キヤビラリ） を設け、 その中で試料の分離， 反応さらには測定を 行うものである。 このようなマイクロチップを用いた場合には、 検体量， 分析に必要な試薬量， 分析に用いた消耗品等の廃棄物， 廃液の量がいず れも少なくて済む上、 分析に必要な時間もおおむね短時間で済むという 利点がある。
しかしながら、 上記のような溝を有するマイクロチップを使用した場 合は、 光路長を数// mから数百/ z m程度しか取れないので、 吸光度法で は満足な測定ができない場合が多い。 なぜなら、 吸光度法は原理的に、 入射光と透過光との比を検出するものであるため、 精度のよい結果を得 るためには光路長を長くとる必要があるからである。
そのため、 マイクロチップ中の溝に、 液の流れ方向 （溝の長手方向） に対し垂直に光をあてるのではなく、 液の流れ方向に沿って光を当てる という工夫もされているが （一般的な溝中の吸光度測定の例としては、 例えば、 日本国特許公開公報 平成 8年第 3 0 4 3 3 9号がある） 、 平 面チップに形成された溝 （キヤビラリ） の場合、 液の流れ方向での検出 は容易ではなく、 また、 長光路を得るためマイクロチップ及び検出部の 構造が複雑となる欠点を有する。
また、 微量成分の検出法としては、 蛍光法や発光法も知られている。 しかし、 測定試料中の測定対象物質 （ヘモグロビン等） に直接又は間接 に酵素や蛍光色素で標識した抗体などを結合させる必要があるので、 検 出のための反応がきわめて複雑になる。
一方、 微量検体中の物質の別の検出法としては、 励起光により試料を 励起して、 いわゆる熱レンズを形成させ、 プローブ光によりその熱レン ズの変化を測定する光熱変換検出法 （熱レンズ検出法） が以前から知ら れている。 例えば、 日本国特許公開公報 昭和 6 0年第 1 7 4 9 3 3号、 A. C. Boccara et. al . ' Appl . Phys. Lett . 36, 130, 1980 、 J. Liquid Chromatography 12, 2575-2585( 1989 ), 日本国特許公開公報 平成 1 0 年第 1 4 2 1 7 7号 （分子バイオホトニクス） 、 曰本国特許公開公報 平成 4年第 3 6 9 4 6 7号 （横河電機株式会社） などに記載のものがあ る。 まず、 光熱変換現象により形成される熱レンズを用いた検出法、 すな わち光熱変換検出法 （熱レンズ検出法） の原理を説明する。
溶液に溶解している測定対象物質が吸収する波長の光 （励起光） を測 定試料に照射する。 すると、 測定対象物質は励起光により励起され、 熱 を発生する （光熱変換効果） 。 ここでは、 溶液中に存在する測定対象物 質以外の夾雑物が、 この励起光を吸収しないように、 励起光の波長を選 択することが重要である。
発生した熱は、 励起光が照射された部分の近傍の溶媒に伝わり、 局所 的な密度変化、 ひいては屈折率変化を引き起こす。 このため、 励起光を 吸収する物質の存在下では、 励起光を照射した部分はあたかも凹レンズ が形成されたようになる。 この凹レンズが形成された部分に、 励起光の 波長とは異なるプローブ光を照射する。 プロ一ブ光は熱レンズにより屈 折するため、 プローブ光を捕捉する受光素子が捉えるプローブ光の光量 は、 熱レンズが形成されることにより低下する。
光熱変換効果の度合いは測定対象物質の濃度に応じて変化するので、 前記光量の低下度合いを測定することにより測定対象物質の定量を行う ことができる。 実際には、 S /N比の改善のため、 励起光をチヨツビン グし、 その周波数に同期しているプローブ光の光量変化のみをロックィ ンアンプで検出することが一般的に行われている。
上記のように熱レンズ検出法では、 励起光とプローブ光との通常 2種 の光源 （レーザ一等） が必要である。 A rレーザーと H e _ N eレ一ザ 一とを用いて光熱変換検出法 （熱レンズ検出法） で検出を行う例として、 溝が刻まれたチップの外部からポンプにより送液するキヤビラリ分析装 置に適用した例もある （ぶんせき N o . 4 , 280-284, 1997、 M. Harada, et. al . ,Anal . Chem. Vol . 65, 2938-2940, 1993, 川西， 他 日本分析化 学会第 4 4年会講演要旨集， pll9, 1995) 。 このような熱レンズ検出法を用いて、 検体中の測定対象物質の量を測 定することが検討されている。
例えば、 K. Sato、 T. Kitamori らは、 Arレ一ザ一光 （波長： 48 8 nm) を励起光、 H e— N eレーザ一光 （波長： 632. 8 nm) を プロ一ブ光として用いて、 色素であるサンセッ トイエロ一の測定を行つ ている (Analytical Sciences Vol.15， 525-529,1999) 。
Kitamoriらが改良した熱レンズ検出法は、 マイクロチヅプが有する数 十 m程度の深さ及び幅のキヤビラリ中の微量物質を測定するために、 顕微鏡を利用して励起光及びプロ一プ光をキヤビラリに集光するように したものであり、 顕微熱レンズとも言えるものである。
このような顕微熱レンズにおいては、 キヤビラリ中の微小空間に励起 光及びプローブ光の焦点を結ばせるので、 光源としては色収差のない波 長のそろったレーザーが好ましい。
また、 Nd ： YAGレーザ一光 （波長： 355 nm) 等を励起光、 H e— N eレーザ一光 （波長： 632. 8 nm) をプローブ光として用い て、 5カロチンの量を測定した例もある （例えば、 S. Luterotti, et. al. , J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21(1999), 901-909 や J. Amador - Hernandez, et. al. , Applied Spectroscopy Vol.52, 146 5-1471,1998 など） 。
さらに、 Arレ一ザ一光 （波長： 5 14. 5 nm) を励起光、 He— N eレ一ザ一光 （波長： 632. 8 nm) をプローブ光として用いて、 医薬などとして有用なクレンブテロールを測定した例もある （例えば、 Y. Martin Biosca, et. al. , J. Pharmaceutical and Biomedical Anal ysis, 41(1996)， 1037-104など） 。
これらの方法においては、 検体中の測定対象物質そのものの吸収を利 用し、 その物質の吸収に適した波長を持つ励起光源を使用して、 熱レン ズ検出法により測定を行っている。 しかしながら、 測定対象物質が常に 都合のよい吸収波長を有するとは限らない。
一般に、 A rレーザ一や H e - N eレーザーなどのガスレーザーは高 価であるので、 簡便な P O C分析等には、 安価に入手可能な半導体レー ザ一を光源として使用することが望ましい。 現在、 安価に入手可能な半 導体レーザーは波長が概ね 5 8 0 n m以上であり、 より安価には 6 0 0 n m以上、 さらに安価には 6 3 0 n m以上である。
したがって、 吸収波長が上記の波長以下である測定対象物質について は、 何らかの方法で測定対象物質から 5 8 0 n m以上の吸収を有する物 質 （以降は、 長波長物質と称する） を生成させ、 その長波長物質を測定 することで、 測定対象物質の量を間接的に測定するという方法を用いる 必要がある。
熱レンズ検出法による測定法については、 本出願人も、 日本国特許願 平成 1 0年第 1 8 1 5 8 6号明細書 （ 「混合分析装置及び混合分析方 法」 ） 、 日本国特許願 平成 1 0年第 1 8 1 5 8 7号明細書 （ 「キヤピ ラリ光熱変換分析装置」 ） 、 日本国特許願 平成 1 0年第 1 6 7 6 0 3 号明細書 （ 「分析装置」 ） 、 国際出願 P C T / J P 9 9 / 0 3 1 5 8号 明細書 （ 「光熱変換分光分析装置」 ） 、 日本国特許願 2 0 0 0年第 2 0 5 7号明細書等を出願している。
これらの明細書においては、 微量の血液試料の成分を分析する方法の 例として、 血中総コレステロール及びグル夕ミヅクオキザロアセティ ッ ク トランスアミナーゼ （G O T ) を測定する方法が記載されている。 こ れらの測定方法においては、 測定対象物質を出発物質として、 酵素を用 いた反応により過酸化水素を発生させることが要点である。
このように、 過酸化水素を発生させることにより長波長物質を生成さ せて測定対象物質の量を間接的に測定する方法は、 吸光度法でも知られ ている。
例えば、 血中総コレステロールの測定の場合は、 コレステロールエス テルをコレステロールエステラーゼにより加水分解してコレステロール を得、 もともと遊離していたコレステロールとともにコレステロールォ キシダ一ゼにより酸化して、 過酸化水素を発生させる。
そして、 この過酸化水素によって、 3, 5—ジメ トキシ— N—ェチル -N- ( 2， 一ハイ ドロキシ— 3， —スルホプロピル） ァニリンナトリ ゥム （以降は、 DAOSと記す） と 4—ァミノアンチピリン （以降は、 4— AAと記す） とを酸化縮合させて、 反応生成物として青色色素を生 成させる。 そして、 この青色色素の吸光度 （波長： 600 nm) を測定 することにより、 血中総コレステロール量を求める。 この測定方法につ いては、 和光純薬工業株式会社の総コレステロール測定用 H Aテストヮ コー、 コレステロール E—H Aテストヮコ一に添付の説明書に記載され ている。
また、 D AO Sの代わりに N—ェチルー N— （3—メチルフエニル） — N， 一サクシニルエチレンジァミン （以降は、 EMS Eと記す） を用 いて、 吸光度法 （波長： 555 nm) により測定した例が、 臨床検査法 提要 （金井泉著， 金原出版， 1998年， p 555〜556) に記載さ れている。
さらに、 GOT測定の場合は、 L—ァスパラギン酸ナトリウムとひ一 ケトグルタル酸とを基質として、 検体中の GO Tによりォキザロアセテ ートを生成させ、 次いで、 ォキザ口アセテートをォキザ口アセテートォ キシダ一ゼによりピルべ一トに導き、 さらにピルべ一トを酸素とピルべ 一トォキシダ一ゼとにより酸化して過酸化水素を生成させる。
そして、 生成した過酸化水素とパーォキシダーゼとにより、 4—AA と N—ェチル— N— ( 2—ハイ ドロキシ一 3—スルホプロピル） — m— トルイジンナトリウム （以降は、 T O O Sと記す） とを酸化縮合させ色 素を生成させる。 そして、 この色素の吸光度 （波長： 5 5 5 n m) を測 定することにより G O Tの量を求めるのである。 この測定については、 株式会社カイノスの体外診断用医薬品添付文書集 1 9 9 8年版の 2 7 9 〜 2 8 0頁に記載されている。
このように、 測定対象物質にその種類に応じたォキシダ一ゼを作用さ せて過酸化水素を生成させることができれば、 D A O S (あるいは、 E M S E , T 0 0 S等の類似色素） と 4 _ A Aとの酸化縮合物を比較的容 易に生成させることができる。 そして、 長波長のレーザー光を励起光と して用いて熱レンズ検出法によりこの酸化縮合物 （青色色素等） を測定 することにより、 測定対象物質の測定を間接的に行うことができる。 しかしながら、 すべての物質から過酸化水素が誘導できるわけではな いことは、 言うまでもない。
例えば、 臨床診断に有用な血液分析においては、 ヘモグロビン， アル カリフォスファタ一ゼ等が測定対象物質である。 しかし、 ヘモグロビン， アル力リフォスファターゼ等から過酸化水素を発生させる反応は、 一般 的ではない。 したがって、 これらの測定対象物質に関しては、 上記のよ うな過酸化水素の生成を伴う反応を利用した測定方法は、 行われていな かった。
したがって、 ヘモグロビン等のような過酸化水素に誘導し難い物質に ついては、 へモグロビン等から長波長物質を生成するような試薬や反応 を見出すことが必要である。
特に、 キヤビラリ中で測定を行う場合は、 沈殿の生成が測定に多大な 悪影響を及ぼすので、 沈殿ゃ微結晶を生じることがない試薬や反応を見 出す必要がある。
次に、 これらの物質の従来の測定法を詳述する。 まず、 ヘモグロビン について説明する。
血液試料中のへモグロビンを測定することは、 貧血症や多血症等の臨 床診断において重要である。
従来の吸光度法を用いたヘモグロビン測定方法はいずれも、 デスク ト ップからベンチトップ程度の比較的大型の自動検査機に適合するよう改 良されてきたものである。 そのため、 測定用のキュベッ ト （セル） は数 百 2 から 1 m 程度の大きなものであり、 測定に必要な光路長を 2〜 1 0 mm程度に取ることが可能なため、 吸光度法で検出することが可能 であった。
従来のヘモグロビンの測定方法としては、 シアンメ トヘモグロビン法，
S L S法， ァザィ ドメ トヘモグロビン法， アルカリへマチン法等がある が、 いずれも吸光度法により測定する方法である。
全血を溶血させヘモグロビンを吸光度で測定する方法としては、 シァ ンメ トヘモグロビン法が多く用いられており、 国際基準法としても定め られている。 ここで、 シアンメ トヘモグロビン法によるヘモグロビンの 測定方法を簡単に説明する。
まず、 血液試料にノニオン性界面活性剤等を含む赤血球溶解剤を添加 し、 赤血球中に含まれるヘモグロビンを溶出する。 次に、 溶出したへモ グロビンをフェリシアン化力リゥム等の酸化剤により酸ィ匕し、 メ トへモ グロビンに転化させる。 そして、 シアンイオンを添加することによって、 メ トヘモグロビンをシアンメ トヘモグロビンとし、 安定なヘモグロビン 測定試料を調製する。
このシアンメ トへモグロビンは 5 4 0 n mに吸収を持っため、 5 4 0 n mの吸光度を測定することでヘモグロビンを定量することができる。 しかし、 シアンメ トヘモグロビンは 5 4 0 n mに吸収を持つものの、 6
0 0 n m以上には吸収を持たない。 したがって、 現在安価に入手可能な 半導体レーザーが 6 0 0 n m以上であるから、 安価な半導体レーザーを 励起光又は吸収光源としたへモグロビンの測定方法にシアンメ 卜へモグ 口ビン法は適用することはできない。
その上、 この方法では、 測定試薬が毒物であるシアン化カリウムを含 有しているので、 測定試薬の取り扱いに危険が伴う。 さらに、 測定後の 廃液は次亜塩素酸ナトリゥム等を用いてシァニドを分解した後に廃棄す る必要があり、 廃棄処理が煩雑である。
このような毒物の問題を解決する方法として、 中性緩衝液中にァニォ ン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリゥム又はラウリル硫酸ナトリ ゥム （以降は S L Sと記す） 及びトリ トン X— 1 0 0 (商品名） を含有 するヘモグロビン測定試薬が、 クリニカル ·バイオケミストリー 1 5卷
8 3 ( 1 9 8 2 ) に開示されている。
この方法では、 赤血球を S L S及びトリ トン X— 1 0 0の働きで溶解 し、 溶出したヘモグロビンを、 S L Sと酸素との働きでメ トへモグロビ ンとすると同時に S L Sヘモグロビンに転化する。 この S L Sへモグロ ビンは 5 4 0 n mに吸収を持っため、 5 4 0 n mにおける吸光度を測定 することで、 ヘモグロビンを定量することができる。
この方法では、 測定試薬がシアニドを含有しないので、 煩雑な廃液処 理は不要である。 しかし、 S L Sヘモグロビンは、 シアンメ トへモグロ ビンと同様に 5 4 0 n mの吸収は持つものの、 6 0 0 n m以上の吸収は 持たない。 そのため、 6 0 0 n m以上の波長を持つ安価な半導体レーザ 一を光源とする光学的測定方法には適用できない。
また、 へモグロビン自体のパーォキシダ一ゼ活性を利用した定量法も 知られている。 日本国特許公開公報 昭和 5 9年第 2 2 2 7 6 6号 （テ ルモ株式会社） には、 ヘモグロビン自体のパーォキシダーゼ活性を利用 して、 試薬として加えた過酸化水素によりテトラメチルベンジジンを酸 化して、 その生成物の吸光度 （波長： 66 O nm) を酢酸中で測定する ことにより、 ヘモグロビンを測定する方法が記載されている。
さらに、 曰本国特許公開公報 平成 2年第 1 22267号 （ミ ドリ十 字社） には、 ヘモグロビン自体のパーォキシダーゼ活性を利用して、 ク ェン酸溶液中のテトラメチルベンジジンを過酸化ストロンチウムにより 酸化して、 その生成物の吸光度 （波長： 65 O nm) を測定することに より、 へモグロビンを測定する方法が記載されている。
これらの方法はいずれも、 赤血球の溶血工程は含まれていないから、 血漿， 血清， 尿などに含まれる可溶化された微量のヘモグロビン （全血 中のヘモグロビン量 （十数 g/d ) に比べて 100分の 1程度の低濃 度） を測定したものであって、 全ヘモグロビンを測定したものではない さらに、 これらの方法は、 血漿などに存在するヘモグロビンパーォキシ ダーゼ活性阻害因子により、 検量線の作成が容易ではない。 また、 吸光 度測定であるので、 マイクロチップ等を用いた微量の検体の測定には適 さない。
一方、 日本国特許公開公報 平成 9年第 278786号 （ポーラ化成 社） には、 通常では波長 540 nmにおける吸光度を測定するシアンメ トへモグロビン法に改良を加えて、 ぺクチンやオリゴガラクチュロン酸 を添加することにより、 吸光度を増強させ感度を向上させた測定法が記 載されている。 この方法においては、 吸光度が増強するとともに、 吸収 波長が長波長側にシフ 卜し、 680〜 685 nmでの測定が可能となる。 しかし、 吸光度が増強されたとは言え、 この方法には吸光度測定の感度 の限界 （検体量の限界） があり、 また、 シアンを用いるという問題点が ある。
さらに、 熱レンズ検出法を用いて、 白血病白血球中の異常へモグロビ ン産生を検出した例が知られている （Wu, K i t amo r i, S aw a d a, Ana. C h e m. 63， 2 17 - 2 19 , 1 99 1、 北森， 澤田， ぶんせき 3， 1 78 - 187 , 1 994) 。 この方法は、 顕微 鏡検鏡下でスライ ドガラス上で白血球細胞を一つ分離し、 細胞を壊すこ となく、 そのままへモグロビンの 420 nmの吸収を X eランプで励起 する。 そして、 H e—N eレーザ一をプローブ光として、 白血球外の上 部空間に形成される熱レンズを検出することにより、 白血病で異常にな つた白血球が産生するへモグロビンを測定している。
しかし、 血液中のヘモグロビン濃度を求めるためには、 所定体積の血 液を溶血させ、 その中に存在する全赤血球由来のヘモグロビンを測定す ることが必要であるので、 この方法では、 貧血などの診断に必要な血液 中の赤血球ヘモグロビン量を測定することはできない。 その上、 励起光 の波長が 420 nmであるので、 安価な半導体レーザ一を用いることは 難しい。
また、 ゲル電気泳動で分離したヘモグロビンを、 シングルビーム法の 熱レンズ検出法により測定した例も知られている （MA Thompson, et. a 1.， Applied Spectroscopy, Vol.46, 945-947, 1992 ) 。 しかし、 この 例でも、 励起光の光源には高価な A rレ一ザ一 （波長： 5 14. 5 n m) が使用されている。 さらに、 測定には、 18 cmx l 6 cmx 75 0 mという大きなスラブゲル、 つまり固体相を用いていて、 マイクロ チップ中で液体試料を測定するというものではない。
このように、 全血中のヘモグロビン濃度を、 極微量の血液試料から、 600 nm以上の波長を持つレーザーを用いて測定する方法は知られて いない。
次に、 血液試料中のフォスファタ一ゼの測定方法について説明する。 フォスファタ一ゼの測定方法としては、 p—ニトロフエニル燐酸エステ ルを基質として用いる方法が基準法として広く行われている （臨床検査 法提要， 金井泉著， 金原出版， 1 998年， p 613〜6 1 5) 。 この 方法は、 フォスファタ一ゼにより p—二トロフ： nニル燐酸を加水分解し、 生成した P—二トロフエノールを波長 405 nmにおける吸光度により 測定するものである。
p—二トロフエノールは波長 550 nm以上では実質的に吸収がない ので、 安価なレーザーを用いた熱レンズ検出法にこの反応系を採用する ことはできない。 このことは、 デンカ生研株式会社の ALP— S試薬の 添付書などにも記載されている。
また、 生成した p—二トロフエノールと 4一 AAとを、 メタ過ヨウ素 酸ナトリウムで酸化縮合して赤色キノン色素を生成させ、 波長 50 O n mにおける吸光度で比色定量する方法も知られている （株式会社カイノ スの 「体外診断用医薬品添付文書集 1 998年版」 の 277〜 278頁 に記載） 。
さらに、 日本国特許公開公報 平成 7年第 33789号 （富士フィル ム株式会社） に記載のように、 より長波長側に吸収を有するアルカリフ ォスファタ一ゼ （以降は ALPと記す） の基質としてァゾ色素を使用す る方法も検討されてきた。 しかし、 この方法は吸光度法による測定のた めのものであって、 光熱変換検出法による測定のためのものではない。 一方、 血液由来の検体を吸光度で測定する場合の一般的な問題として、 乳びがあげられる。 乳び （c hy e) とは、 消化過程で腸の乳び管か ら取り込まれる混濁した白色又は薄黄色の液体で、 リンパ線によって胸 管を経て循環器中へ運ばれる。
乳びは、 リンパ液中のカイ口ミクロンにより牛乳状の外観を呈してい る （ステツ ドマン、 医学大辞典、 メジ力ルビユ一社） 。 すなわち、 血液 中において、 コレステロールや中性脂肪がミセルゃリボゾームなどを形 成し、 白濁状態を呈している。 乳びが生じている血液検体では 「濁り」 が発生しているため、 吸光度 測定の場合は測定結果に悪影響が生じる。 すなわち、 吸光度測定では、 濁りによる吸収と測定対象物質や反応生成物の吸収との区別がつきにく い。 そのため、 通常は、 測定対象物質や反応生成物の吸収がない 7 0 0 〜8 0 0 n mという長波長において対照吸光度を測定し、 次に、 測定対 象物質や反応生成物の吸収波長における吸光度を測定して、 両吸光度の 差を測定値としている （前述の臨床検査法提要や株式会社カイノスの 「体外診断用医薬品添付文書集 1 9 9 8年版」 等に記載されている） 。 このような操作により、 吸光度計のセル （キュベヅ ト） の汚れなどに よる影響も補正できるが、 1サンプルにっき異なる 2つの波長において 測定を行う必要がある。
本発明は、 上記のような従来技術の問題点を解決するためになされた ものであり、 その目的は、 P 0 C分析等に適用するのに好適な測定方法 であって、 安価な長波長のレーザ一を励起光の光源とする熱レンズ検出 法により、 キヤビラリ中で微量の生体成分由来試料中の物質を、 安価で 簡便且つ短時間で測定できる方法を提供することにある。
特に、 ヘモグロビン， フォスファターゼ等のような過酸化水素に誘導 し難い物質を測定できる方法を提供することを目的としている。
また、 本発明は、 乳びを呈する血液試料でも、 1回の測定で血液試料 中の物質を定量できる測定方法を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 上記の測定方法において好適に使用され、 微量の 生体成分由来試料中の物質を安定して測定することができる測定試薬を 提供することを目的とする。 発明の開示
前記目的を達成するため、 本発明は次のような構成からなる。 すなわ ち、 本発明の物質の測定方法は、 生体成分由来試料中の物質を検出又は その濃度の測定を行う方法であって、 試料調製工程と光熱変換検出工程 とを備えていて、 前記試料調製工程は、 前記生体成分由来試料と測定試 薬とを混合し反応させ、 過酸化水素を誘導することなく、 前記物質とは 吸収波長が異なる反応生成物を前記物質の量に対応する量だけ生成させ て、 測定試料を調製する工程であり、 前記光熱変換検出工程は、 前記測 定試料に励起光を照射して、 その結果生じる部分的な温度変化に伴う物 理量変化を測定する工程であるとともに、 前記反応生成物は水溶性を有 し、 且つ、 前記励起光の波長領域における前記反応生成物の吸光度は、 前記温度変化を生じさせるに足るものであることを特徴とする。
前記物理量変化を屈折率変化とすれば、 前記光熱変換検出工程は、 前 記屈折率変化により形成される熱レンズに検出用のプローブ光を入射さ せ、 該熱レンズにより生じる該プローブ光の変化を測定することができ る。
また、 前記励起光の波長は、 6 0 0 n m以上であることが好ましい。 さらに、 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とをキヤビラリを有す るマイクロチップに装入し、 前記試料調製工程と前記光熱変換検出工程 とを前記マイクロチップのキヤビラリ内で行うことができる。
前記キヤビラリは、 板面に溝を備えた一対の平板状部材を、 前記溝を 備えた板面を内側にして貼り合わせることにより形成されるものでもよ レ、。 なお、 前記溝は、 前記一対の平板状部材のうち少なくとも一方に備 えられていればよい。
また、 前記生体成分由来試料を血液試料、 前記物質をヘモグロビンと し、 前記試料調製工程を、 前記血液試料と前記測定試薬とを混合し溶血 させて前記測定試料を調製する工程とすれば、 血液試料中のへモグロビ ンを測定することができる。 このとき、 前記励起光の波長を 6 1 0 n mから 6 5 0 n mの範囲とし、 かつ前記プローブ光の波長を前記励起光よりも長波長とすることが好ま しい。
前記励起光の波長を 6 2 0 n mから 6 4 0 n mの範囲とし、 かつ前記 プローブ光の波長を前記励起光よりも長波長とすることもできる。
また、 前記測定試薬は、 赤血球を溶血する濃度の中性界面活性剤と、 ヘモグロビンをメ トヘモグロビンに酸化する濃度の酸化剤と、 p Hを 5 から 7の範囲で維持する濃度の緩衝剤と、 を含むものとすることができ る。
なお、 前記測定試薬はシアニドを含有しないことが好ましい。
さらに、 前記血液試料と前記測定試薬との混合比は、 1 ： 1から 1 ： 2 5 0の範囲であることが好ましい。
さらに、 前記物質をフォスファターゼとし、 かつ、 前記測定試薬を前 記フォスファタ一ゼに対する基質を含有するものとし、 前記試料調製ェ 程を、 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とを混合し、 前記生体成分 由来試料中のフォスファターゼと前記測定試薬中の前記基質とを反応さ せて測定試料を調製する工程とすれば、 生体成分由来試料中のフォスフ ァ夕ーゼを測定することができる。
前記基質はリン酸エステル結合を有するものとすることができる。 なお、 前記基質は、 5—ブロモ— 4一クロ口— 3—インドキシルフォ スフエート及びその塩のいずれかであることことが好ましい。
さらに、 前記フォスファタ一ゼはアル力リフォスファタ一ゼであって もよい。
さらに、 前記測定試料中の前記基質の濃度は、 l 〜 1 5 mMの範囲で あることが好ましい。
さらに、 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とを混合してから、 前 記物理量変化を測定するまでの時間は、 3〜 1 5分とすることが好まし い。
さらに、 本発明の物質の測定方法は、 乳びを呈する血液試料中の物質 を検出又はその濃度の測定を行う方法であって、 前記血液試料と測定試 薬とを混合して測定試料を調製する試料調製工程と、 前記測定試料に励 起光を照射して、 その結果生じる部分的な温度変化に伴う物理量変化を 測定する光熱変換検出工程と、 を備えることを特徴とする。
前記物理量変化を屈折率変化とすれば、 前記光熱変換検出工程は、 前 記屈折率変化により形成される熱レンズに検出用のプローブ光を入射さ せ、 該熱レンズにより生じる該プローブ光の変化を測定することができ る。
また、 前記血液試料と前記測定試薬とをキヤビラリを有するマイクロ チップに装入し、 前記試料調製工程と前記光熱変換検出工程とを前記マ イク口チヅプのキヤビラリ内で行うことができる。
前記キヤビラリは、 板面に溝を備えた一対の平板状部材を、 前記溝を 備えた板面を内側にして貼り合わせることにより形成されるものでもよ い。 なお、 前記溝は、 前記一対の平板状部材のうち少なくとも一方に備 えられていればよい。
さらに、 本発明の測定試薬は、 前記物質がヘモグロビンの場合の測定 方法において用いる測定試薬であって、 赤血球を溶血する濃度の中性界 面活性剤と、 ヘモグロビンをメ トヘモグロビンに酸化する濃度の酸化剤 と、 p Hを 5から 7の範囲で維持する濃度の緩衝剤と、 を含むことを特 徴とする。
さらに、 本発明の測定試薬は、 前記物質がフォスファターゼの場合の 測定方法において用いる測定試薬であって、 リン酸エステル結合を有す る基質を備えることを特徴とする。 なお、 前記基質は、 5—ブロモ—4—クロ口— 3—インドキシルフォ スフエート及びその塩のいずれかであることが好ましい。
以下に、 本発明を詳細に説明する。
血液， 尿等の生体由来の検体や環境分析等の検体に含まれる成分を測 定する方法としては、 検体の量が微量である場合には、 キヤビラリを有 するマイクロチップと熱レンズ検出法とを組み合わせる方法が有用であ る。 背景技術の項で述べたように、 数十から数百 / m程度の深さ及び幅 を有するキヤビラリ中で、 熱レンズ検出法により物質を測定するために は、 励起光とプローブ光とがキヤビラリに集光されることが好ましい。 そのため、 前記両光の光源としては、 色収差などの問題を有する白色 光光源ではなく、 波長のそろったレーザ一や発光ダイォードなどが好ま しい。 ただし、 短波長のレーザ一や発光ダイオードは非常に高価であり、 また、 熱レンズを形成するには励起光の光源がある程度の出力を有して いることが必要である。 したがって、 現在比較的安価であり、 ある程度 の出力を有する長波長の半導体レーザが好ましい。 なお、 数 mW程度以 上の出力を持つものならば、 発光ダイォードも安価な光源として本発明 において使用することができる。
励起光及びプローブ光の波長は、 5 8 0 n mよりも長波長とする。 特 に、 6 0 0 n m以上、 さらには 6 3 0 n m以上の波長の半導体レ一ザ一 や発光ダイォードが安価であり好ましい。
このような背景のもとに、 キヤビラリ内の物質を熱レンズ検出法によ り測定するための条件を以下に記す。
a ) 測定対象物質そのもの、 又は、 それから酵素的 ·化学的に誘導さ れる物質 （以降、 反応生成物と記す） が、 励起光の波長領域において熱 レンズを形成するために十分な吸光度を有すること。
b ) 測定対象物質及び反応生成物が、 キヤビラリ中で沈殿を生じない こと。
さらに、 必須条件ではないが、 プローブ光の波長は励起光の波長より も長波長であることが望ましい。
上記の条件について、 以下に詳述する。
血液， 尿等の生体由来の検体中に存在する物質の内、 5 8 0 n m以上 の波長の吸収、 特に 6 3 0 n m以上の波長の吸収を、 それ自身が有する 物質は極めて少ない。 かなり長波長の吸収を有するへモグロビンですら、 5 4 0〜5 7 7 n mの吸収が大きく、 生体中にわずかに存在するメ トへ モグロビンに由来する弱い吸収が、 6 3 0 n mにあるだけである。
ピリルビンなども 6 3 0 n m以上の波長の吸収はかなり弱いので、 定 量的な測定が困難である。
また、 血中に存在する酵素などは、 通常は紫外領域にしか吸収を持た ない白色蛋白であるものが多く、 さらに、 各酵素ゃ夾雑蛋白の吸収が重 なるので、 定量的な測定が困難である。 そのため、 血中の酵素を定量す る際には、 その酵素によって長波長領域に吸収を有する物質 （反応生成 物） に変化する特異的な基質を用いて反応生成物を生成させ、 この反応 生成物を定量することにより酵素の量 （正確には酵素活性） を定量する ことが必要となる。 なお、 以降はこのような反応を長波長化反応と称す る。
また、 コレステロールなどのような酵素以外の血中物質を定量する際 には、 その物質を選択的に基質 （酵素と反応する物質） とする酵素の作 用や化学反応によって、 長波長領域に吸収を有する反応生成物に前記血 中物質を誘導する必要がある。
したがって、 安価な励起光の光源を使用する測定を可能とするために は、 上記反応生成物の吸収波長が 5 8 0 n m以上、 より安価には 6 0 0 n m以上、 さらに安価には 6 3 0 n m以上になるように、 測定対象物質 から前記反応生成物に誘導する反応や測定試薬を見出す必要がある。 反 応生成物が十分な量の励起光を吸収し、 且つ、 光源が安価であれば、 吸 収波長の上限は特に限定されないが、 通常 8 0 O n m以下がよく用いら れる。
臨床化学分析における発色試薬の開発の流れの一つに、 血液中の干渉 物質の分析に対する影響を低下させるということがある。 このための手 段として、 生体成分に固有の吸収波長を避けるような長波長の吸収を有 する発色試薬が検討された。 現在でも、 溶血検体中のヘモグロビンや黄 疸患者の検体中のピリルビンの吸収波長よりも長波長側に人 max を持つ 発色試薬の開発が続けられている （青山典仁， 臨床検査， 4 1， 9 , 1 0 1 4 ( 1 9 9 7 ) ) 。 血液中のへモグロビン及びピリルビンの影響を 低下させるためには、 少なくとも 6 0 0 n m以上の波長領域で測定する 必要がある （干渉チェック · Aプラス添付参照デ一夕 （国際試薬株式会 社） ） 。 一方、 ヘモグロビン量の測定に関しては、 酸性雰囲気下でメ ト ヘモグロビンが 6 3 0 n mの吸収を示すことから、 ヘモグロビンと他の 生化学項目を共通の光源で測定する場合には、 光源の波長として 6 0 0 〜 6 5 0 n mの領域が重要である。
マイクロチップのキヤビラリ内で混合， 反応させ、 さらに測定を行う ことから、 上記の長波長化反応において沈殿が生じることは好ましくな い。 マイクロチップのキヤビラリ内やマイクロチップのキヤビラリ以外 の部分において、 液体 （測定試料） の流動の障害となるような大きさの 沈殿が生じることは避けなければならない。 液体の流動が少しでも乱れ ると、 定量的な混合や反応時間の制御に対して悪影響が出る恐れがある からである。
また、 マイクロチップの検出部に沈着した沈殿は、 励起光やプローブ 光の散乱を生じさせるので、 測定の定量性を大きく低下させる可能性が ある。 さらに、 本発明者らは、 吸光度法ではほとんど問題にならないよ うな長波長化反応の反応生成物の小さな析出物 （微沈殿、 微結晶） が、 熱レンズ検出法では大きな問題となることを見出した。
一例として、 A L Pの測定について述べる。 A L Pの定量は、 A L P の活性を測定することによって行うのが一般的である。 つまり、 基質中 の燐酸エステル部分が A L Pによって加水分解されて、 基質由来の色素 が発色するので、 その色素を測定するのである。
通常は p—二トロフヱノール燐酸エステルを基質として、 加水分解に より生成した P—二トロフエノールの 4 0 5 n m付近の吸収を吸光度計 で測定する。 しかしながら、 安価な励起光の光源を使用する場合には、 前述のように、 より長波長に吸収を有する反応生成物を生じさせる必要 がある。 6 3 0 n m付近に吸収を有する反応生成物を生じる A L Pの基 質として市販されている研究試薬としては、 5—プロモー 4一クロ口— 3—インドキシルフォスフヱ一トがあげられる。
この基質が加水分解された 5—ブロモ—4—クロロー 3—ヒドロキシ インドールは、 酸素で酸化され二量化することにより、 6 0 0 n m以上 に吸収を有する青色の色素となる。 この二量体は水への溶解度が高くな いため、 A L P濃度， 基質濃度， 及び反応時間等の条件、 つまり、 これ らの組合せの結果による長波長化反応の反応生成物の濃度には、 熱レン ズ検出法に適した範囲が存在することとなる。 そして、 その範囲よりも 反応生成物の濃度が高くなると、 後述する比較例 1のように微結晶が生 じて、 熱レンズ検出法による測定が困難となってしまう。
このような微結晶は、 通常の取り扱いにおいては溶液に浮遊， 分散し ており、 一晩放置しても沈殿するものではない。 この微結晶は、 吸光度 測定ではほとんど悪影響を及ぼさないが、 熱レンズ検出法では測定不能 となるほどの悪影響を及ぼす場合がある。 したがって、 強い遠心操作を 行う等により微結晶を沈殿させる必要がある。
ただし、 励起光を吸収する微結晶 （微沈殿） が浮遊， 分散していると、 熱レンズ検出法による出力 （熱レンズ信号） が不安定になる理論的な理 由については明確ではない。 なお、 同じ微粒子でも、 励起光を吸収しな いポリスチレンなどのラテックスビーズ （直径 5 0 0 n m程度） が存在 しても、 熱レンズ検出法による出力は測定可能である。
このように励起光を吸収しない濁りや微粒子が存在しても熱レンズ検 出法による測定が可能であることは、 乳びを呈する血液試料中の物質を 測定する際には、 特に有利に働く。
すなわち、 背景技術の項で述べたように、 乳びは広い波長範囲におい て吸光度測定に悪影響を与える。 そのため、 測定対象物質の吸収波長に おける測定と、 乳びだけの影響をみる濁度測定のためのより長波長での 測定との 2つの波長における測定が必須となる。
それに対して、 熱レンズ検出法の場合は、 後述するように適度な希釈 を行えば、 乳びは測定に悪影響を与える恐れがほとんどない。 これは、 励起光を 1 0 0〜3 0 0 0 H z程度の周波数でチヨヅビング （o nZ o f f ) して、 それに同期するプローブ光の光量変化のみを取り出して、 熱レンズ検出法による出力を検出しているためである。 励起光を吸収し ない濁りは、 吸光度の絶対値を経時変化なしに大きく見せるが、 チヨッ ビングされた励起光と同期した熱変化を測定試料中に生じさせることは ない。
へモグロビンを熱レンズ検出法により測定するためには、 へモグロビ ンから過酸化水素を誘導し、 この過酸化水素により長波長物質を生成さ せる方法 （測定試薬， 反応） を見出す必要がある。 つまり、 へモグロビ ンに特異的な酸化酵素 （過酸化水素を発生する） を見出したり、 背景技 術の項に記載したヘモグロビン自身のパーォキシダーゼ活性を全血中の ヘモグロビンの測定に応用できるように、 反応系に改良を加えたりする 必要がある。 そうすれば、 過酸化水素及びパーォキシダ一ゼから、 例え ば、 D A O Sと 4—A Aとの酸化縮合生成物 （長波長物質） を生成させ ることができる。
しかしながら、 上記のいずれにおいても、 酸化酵素が容易に入手でき ない、 全血中でのへモグロビンのパ一ォキシダーゼ活性は定量的に活用 しにくい、 などの課題がある。 よって、 長波長物質としては、 へモグロ ビン自身の長波長物質、 すなわち、 メ トヘモグロビンを利用することが、 安価な励起光の光源を使用する場合には適している。
メ トヘモグロビンは水溶性が高いため、 測定時に沈殿が生成するなど の問題はない。 ただし、 メ トヘモグロビンは不安定であるため、 後述す るような工夫を加えることにより、 安定した定量的な測定を可能とした 以下、 ヘモグロビン及び A L Pを測定する方法について、 さらに詳述 する。
(ヘモグロビンの吸収波長について）
血液中のほとんどのへモグロビンは、 2価の鉄に酸素が結合したォキ シへモグロビン、 及び酸素を離したデォキシへモグロビンの状態で存在 し、 ごく一部が酸素を結合することができない 3価の鉄に酸化されたメ トへモグロビンになっている。
ォキシヘモグロビンの吸収は 5 4 0 n mと 5 7 7 n mとにあり、 デォ キシヘモグロビンは 5 5 5 n mに吸収がある。 また、 メ トヘモグロビン は p Hによって吸収が変化し、 酸性では 6 3 0 n m、 強塩基性ではより 短波長領域に吸収があり、 赤味が増す。
このように血液中のヘモグロビンは、 ォキシヘモグロビン、 デォキシ ヘモグロビンだけでも 3つの吸収を持っため、 このままでは全へモグロ ビンの定量は難しい。 そのため、 従来は、 一旦血液試料を溶血させ、 そ れにフェリシアン化力リゥムのような酸化剤を添加することで、 全ての ヘモグロビンをメ トヘモグロビンに酸化していた。 生成したメ トへモグ ロビンは不安定なので、 青酸カリ （K C N ) 等を添加して C Nイオンを ヘム鉄に配位させ、 5 4 0 n mに吸収を持つ安定なシアンメ トへモグロ ビンに誘導してから、 5 4◦ n mの吸光度を測定していた。
しかしながら、 先述したように、 マイクロチップ中でヘモグロビンの 定量を行う場合は、 吸光度法による測定は困難であり、 熱レンズ検出法 により検出することが好ましい。 P O C分析等での使用を考えると、 高 価なガスレーザーではなく、 安価な半導体レーザ一が使用できる波長で ヘモグロビンを励起し、 熱レンズの変化を検出することが好ましい。 現 在における安価な半導体レーザーや発光ダイオードの波長は 6 0 0 n m 以上であるので、 それ以上の吸収を有するように血液中の全てのへモグ 口ビンを誘導する必要がある。
そこで、 励起光が照射されている状態下のメ トヘモグロビンの吸収の 安定性を検討した。 すなわち、 熱レンズ検出法においてマイクロチップ のキヤビラリに照射する励起光と同一波長で、 その測定試料 （反応後の 液） を光路長を 1 c mと長くとったキュベット中に入れて、 吸光度の測 定を行った。
もし吸光度が不安定であれば、 原理的に熱レンズ検出法による出力も 不安定となるため、 吸光度が安定且つ高精度で測定できることが、 熱レ ンズ検出法に対しての必要条件となる。
後述する実験例 1に示すように、 青酸カリを添加しないで、 6 3 0 η mの吸収を持つメ トヘモグロビンにヘモグロビンを酸化した。 そして、 これに 6 3 3 n mのレーザー光を照射して、 その吸光度変化が容量依存 性があるかを検討した。 その結果、 6 3 0 n mの波長でもヘモグロビン を定量することが可能であった。 (血液試料と測定試薬の混合比について）
しかしながら、 本発明者らの検討により、 血液試料とヘモグロビン測 定試薬とを混合して測定試料とする際に、 通常の混合比 （ 1 ： 2 5 0以 上） では、 熱レンズ検出法による出力が時間に対してやや不安定で、 経 時的に少しずつ減少していくことがわかった。 例えば、 1 : 2 5 0では、 6 3 0 n mの吸光度が 2 0分で 8 . 5 %減少するにとどまるが、 1 : 4 1 5では 1 6 %の減少、 1 ： 1 2 5 0では 3 1 %もの減少となり、 臨床 診断には適用しにくい精度となる。
比較的低い精度のへモグロビン測定であれば、 これでも測定は可能だ が、 精度の高い測定を行うには、 改善が必要であった。 本発明者らは、 種々検討した結果、 血液試料と後述する組成を持つ測定試薬との混合比 を、 1 ： 1から 1 ： 2 5 0以下にすれば、 この熱レンズ検出法による出 力の経時変化 （減少） が避けられることを見出した。
さらに、 マイクロチップ中でヘモグロビン測定を行う場合は、 血液試 料と測定試薬との混合比は 1 ： 2 5 0を越える場合、 例えば 1 : 5 0 0 等の場合はマイクロチップ内で混合することは難しい。 なぜなら、 まず、 血液試料が微量でも、 大量の測定試薬が必要なため、 マイクロチップ内 の測定試薬リザーバが大きくなりすぎる欠点がある。
また、 1 : 5 0 0という混合は、 マイクロチップの細いキヤビラリ中 で均一に混合することは困難である。 したがって、 均一な混合を実現す るための特殊な流路構造 （邪魔板、 撹拌など） や、 著しく長い流路等が 必要となる。 その点からも、 混合比を小さくすることは好ましい。
本発明における血液試料と測定試薬との混合比は、 1 ： 1から 1 ： 2 5 0が好ましく、 より好ましくは 1 ： 1から 1 ： 5 0、 さらに好ましく は 1 ： 1から 1 ： 1 0である。 この混合比が 1 ： 1より小さいと、 例え ば 1 ： 0 . 1などになると、 溶血に十分な測定試薬， 浸透圧を与えるこ とが難しくなる上、 マイクロチップ内の送液において血液の粘度の影響 を無視できなくなる。
(測定試薬の組成について）
本発明のへモグロビンの測定方法において使用される測定試薬中に含 まれる中性界面活性剤は、 全赤血球を溶解する十分な界面活性能があれ ば、 特に限定されない。 中性界面活性剤の種類としては、 具体的には、 6—ォクチルフヱノキシポリエトキシエタノール （例えば、 シグマ社の トリ トン X— 1 00) 等のポリオキシエチレンエーテル類や、 ポリオキ シエチレンソルビ夕ンモノラウレート （例えば、 I C I社やシグマ社の ツイ一ン 20) ， ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノォレエイ ト （例 えば、 I C I社， シグマ社等のツイ一ン 80 ) 等のポリオキシエチレン ソルビ夕ン類 （ツイーン） などが用いられる。
また、 S L S等のァニオン性界面活性剤や、 セチルトリプチルアンモ 二ゥムブ口マイ ド （CTAB) 等のカチオン性界面活性剤なども、 用い ることができる場合もある。 溶血時に pH変化を来さない程度であれば、 これらのィオン性界面活性剤も使用可能である。 界面活性剤の詳細なリ ストは、 成書に記載されている。 例えば、 Gowe r社の Handb o o k o f Sur f a c t ant 第 2版， 第 1卷及び第 2巻 （ 1 9 97年） などである。
本発明における測定試薬は、 血液試料中の赤血球をすベて溶血させる 量を添加すればよい。 本発明における測定試薬は、 1 ： 1〜 1 ： 250 の比で血液試料に添加される。 その結果、 得られる混合物中の界面活性 剤の濃度は、 0. 5から 1. 1重量％であることが好ましく、 より好ま しくは 0. 7から 0. 9重量％、 さらに好ましくは 0. 8重量％である。 また、 測定試薬中に使用しうる酸化剤は、 ヘモグロビンをメ 卜へモグ 口ビンに酸化するものであれば特に限定されないが、 好ましくはフェリ シアン化力リウムである。 本測定試薬は全へモグロビンを酸化するのに 十分な量を、 血液試料に添加する。
後述の実験例 1に酸化剤濃度の検討結果を示したように、 熱レンズ検 出法の必要条件であるメ トヘモグロビンの酸化は、 血液試料 1〃 に対 し酸化剤が 50〜： L 0000 nmo (絶対量） であることが好ましく、 より好ましくは、 血液試料 1〃 に対し酸化剤が 1 00〜400 O nm o Ά (絶対量） である。
また、 本測定試薬の pH値は、 メ トヘモグロビンの吸収を 630 nm に保っため、 弱酸性〜弱アルカリ性の範囲であることが好ましい。 実験 例 1と同様に、 熱レンズ検出法の必要条件である、 励起光が照射されて いる状態下のメ トヘモグロビンの吸収の安定性を検討した結果 （後述す る実験例 2を参照） 、 その pHは 4〜 8であることが好ましく、 より好 ましくは pH 5. 0から 7. 0であり、 さらに好ましくは pH 5. 7か ら 6. 3である。 上記のような pH値を維持するため、 PB S等のリン 酸バッファ一や種々のグッ ドバッファーなど、 通常の緩衝剤が使用され る。
本発明の測定方法における反応系及び反応生成物の性状の必要条件は、 c) 過酸化水素を経由しない反応系であること
d) 反応生成物が、 安価な半導体レーザーの波長に吸収を有する色素 系の物質であること
e) 反応生成物の性状は、 レーザーの光径に対して十分な均一性を有 する溶液状であること
である。
現在市販されている半導体レーザ一の中で安価な物は、 おおよそ 63 5 ~ 645 nm以上の波長の物である。 したがって、 本発明の測定方法 における反応系としては、 上記波長に吸収を有する色素系の物質を生成 する反応が好ましい。
(アル力リフォスファタ一ゼ活性の定量測定について）
フォスファターゼ活性を測定する方法としては、 フヱニル燐酸の分解 物であるフエノールと 4—AAとを酸化縮合させた赤色キノン色素 （久 max ： 500 nm) の吸収スぺク トルを 600 nm以上の波長領域で測 定する方法がある。 また、 glycerophosphateを直接基質に用い、 生成す る glycerolを glycerol dehydrogenaseと酸ィ匕型ニコチンアミ ドアデニン ジヌクレオチド（ 以下、 NAD +と記す） とを用い、 還元型ニコチンァ ミ ドアデニンジヌクレオチド （以降は NADHと記す） と dihydroxycet one とに還元する方法もある (A.Bianchi, etal. , J.Biochem.Biophys.Me thods,28,35,1994) 。
また、 glycerophosphateを基質とする反応系としては、 NAD H及び テトラゾリゥム塩、 具体的には株式会社同仁化学研究所の W S Tシリー ズを基質として用い、 フエナジンメ夕サルフェート （以降は PMSと記 す） 若しくはジァホラ一ゼ活性により還元し発色させる反応系を加えて、 600 nm以上の波長で測定する方法があげられる。
しかし、 人 max が 500 nmの赤色キノン色素を 600 nm以上の波 長で測定する方法では、 フォスファターゼ活性の測定において分解能が 小さくなつてしまう。 また、 glycerophosphateを基質とする反応系は有 効であると考えられるが、 多段階反応であるために基質の反応系の組み 合わせ等の最適化が必要である。 したがって、 本発明の測定方法におけ る反応系に用いるには、 さらに検討期間が必要となる。
フォスファターゼ活性測定用の基質で 600 nm以上の発色を示す物 としては、 例えば、 日本国特許公開公報 平成 7年第 33789号に開 示されているものがある。 このものは、 644 nmに吸収を有する水溶 性のフォスファ夕ーゼ基質で、 A L P測定用の基質として本発明の測定 方法において用いることができるが、 容易に入手できる物ではない。 巿 販品として入手可能な物としては、 5-Bromo- 4- chloro- 3- indoxyl phosp hate (以降は、 B C I Pと記す） が分解されて 6 1 5 nmに、 また、 3- Indoxyl phoshateが 6 8 0 n mに発色することが知られている （SUBSTR TE and Reagent, BI0SYNTH 社カタログ） 。
本発明の測定方法の有効性を示す一例として、 A L P測定用の基質と して B C I Pを用いた例を示す。 5- Bromo- 4- chloro- 3- indoxyl (以降は B C Iと記す） は、 A L P活性を用いた遺伝子等の発現確認、 若しくは 組織染色での検出に用いられることが広く知られている （J.P.Horwitz, eta l.，J.Med.Chem. ,9,447,1966)。 また、 5—ブロモ— 4—クロロー 3 —ヒドロキシインドールの二量体 （以降は B C I 2と記す） は、 水溶性 が悪く可溶化するのが難しいことも一般的に知られている （J.J.Leary, etal .， Proc .Natl. Acad. Sc i， USA.80,4045， 1983 )。
よって、 AL P活性の定量において B C Iを液状で測定することが困 難であることは自明である。 しかし、 本発明者は鋭意検討の結果、 測定 試料中の B C I Pの濃度を最適なものとすることによって、 臨床化学で 用いられる A L P活性の測定に本発明の測定方法が有効であることを見 出した。
具体的には、 直径が約 0. 1〜 1〃m以下の範囲の B C I 2の色素粒 子の生成を抑えるような B C I Pの濃度及び反応時間を規定した。
さらに具体的には、 緩衝液を J S C C常用基準法にしたがって作製し た。 すなわち、 1. 0 1 M 2-Ethylaminoethanol -H C £ (アルドリ ツチ社） / ^0. 5 0 5mM Mg C β 2 (ρ Η 9. 8 7 ) の緩衝液を作 製した （以降は緩衝液 1と記す） 。 血液試料と反応させる直前に、 基質 として B C I Ρ (和光純薬工業株式会社） を最終の濃度で 1〜 1 5 mM となるように緩衝液 1に溶解し、 AL P測定試薬 （測定試薬） を調整し た。
なお、 最終の濃度とは、 血液試料と測定試薬とを混合し測定試料とした ときの濃度のことである。
そして、 反応時間を 3分〜 1 5分、 さらに望ましくは 3〜 6分とした c (B C I Pの溶解度について）
基質である B C I Pの純水への溶解度は、 ナトリウム塩の場合は 2 0 mg/ £, すなわち 54 mMである （シグマ総合カタログ， S I GM A社） 。 緩衝液 1に対する B C I Pの溶解度は、 約 7 OmMであった。 B C I Pの最適濃度を求める目的で、 緩衝液 1に最終の濃度で 7 OmM の B C I Pを溶解した ALP測定試薬を調製し、 これを緩衝液 1で段階 的に希釈して、 B C I Pの最終の濃度が 70 mM, 3 5 mM, 1 5mM: 1 0 mM, 6. 25mM, 5 mM, 2. 5 mM, 1. 2 5mMの ALP 測定試薬をそれぞれ調製した。
AL P検体として、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬 株式会社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 (共栄製薬株式会社） 2 50 0 / で溶解し、 AL P活性が計算値で 8 0 0 I になるように調製し、 ストック溶液とした。 次に、 ストツ ク溶液を精製水で希釈して、 計算値で 400 I U/ 及び 5 0 I /£ の ALP活性を含む溶液を調製した。
( A L P活性の吸光度計による測定について）
AL P測定試薬 1 000 と前記検体 2 udとを試験管の中で十 分混和し、 37°Cで正確に 2分 3 0秒間保温する。 その後、 反応液全量 を光路長 1 cmの石英セルに入れ、 3 7 °Cに空気恒温されている吸光度 計により、 反応開始から 1 2分 30秒まで 63 5 nmにおける吸収度を 測定した。
その結果、 全ての B C I P濃度の A LP測定試薬において、 濃度依存 性を有する検量線が得られ、 測定が可能なことが判った （第 1 2図参 昭)
( A L P活性の熱レンズ検出法による測定について）
AL P測定試薬 1 0 0 0 と前記検体 2 5 j £とを試験管の中で十 分混和し、 3 7°Cで正確に 2分 3 0秒間保温する。 その後、 反応液全量 を光路長 5 0〃mの石英セルに入れ、 3 7 °Cに空気恒温されているステ 一ジに載置し、 反応開始から 5分まで熱レンズ検出法により測定を行つ た。
その結果、 7 0mM, 3 5 mM以外の B C I P濃度の AL P測定試薬 において、 濃度依存性を有する検量線が得られ、 測定が可能なことが判 つた （第 1 0， 1 1図参照） 。
このことから、 吸光度計では全ての B C I P濃度で測定可能だが、 熱 レンズ検出法では測定が困難な B C I P濃度があることが判った。 この 理由を、 有色の微粒子 （色素粒子） が存在することが原因であると仮定 し、 各 B C I P濃度の A L P測定試薬について反応生成物の粒度分布を 測定した。
(レーザー回折/散乱式粒度分布計による B C I 2粒子径の測定につ いて）
B C I P濃度が 7 O mM及び 6. 2 5 mMの A L P測定試薬 2 5 m Q を、 予め 3 7°Cに予備加温した。 そこに AL P活性を計算値で 8 0 0 I U/ に調製した標準血清 （血液試料） を、 以下のように混合したもの (試料 1〜4) をそれぞれ用意した。
まず、 試料 1は、 B C I P濃度が 7 OmMの AL P測定試薬に、 前記 標準血清 2 5 0 0〃 を混合し、 3 7 °Cで 3日間反応したものである。 次に、 試料 2は、 B C I P濃度が 7 OmMの AL P測定試薬に、 前記 標準血清 6 2 5 を混合し、 3 7°Cで 3日間反応したものである。 さらに、 試料 3は、 BCI P濃度が 6. 25mMの ALP測定試薬に、 前記標準血清 625 z を混合し、 37 °Cで 3時間反応したものである ( さらに、 試料 4は、 BCI P濃度が 6. 25mMの ALP測定試薬そ のものである （前記標準血清は混合せず） 。
測定装置には HORIBA LA— 910型レーザー回折/散乱式粒 度分布測定装置を用いて、 該装置のマニュアルにしたがって粒度分布測 定を行った。 具体的には、 約 50m£の精製水が入った前記測定装置付 随の超音波分散バスに 10：11 の試料1〜4を添加し、 測定を行った。 粒度分布の測定条件である相対屈折率は、 1. 26— 0. 00丄とした( 測定の結果、 ALP測定試薬と標準血清とを混合し反応して得られた ものの中には、 前記反応の結果生成する B C I 2が存在することが分か つた。 そして、 その B C I 2の粒子 （微細結晶） は、 おおよそ数百 nm の粒径を有することが分かった （第 16図参照） 。
また、 粒度分布の測定結果より、 数/ zmの大きさの粒子も存在するこ とが明らかになった。 ただし、 反応時間が長時間である試料、 すなわち、 反応時間が 3日間である試料 1 , 2の場合は、 粒径が数百 nmの粒子が 主に存在することから、 数〃 mの大きさの粒子は B C I Pであると考え られる。 しかし、 この BC I Pの粒子が、 どのような状態で存在するの かは不明である。
よって、 熱レンズ検出法に適した測定試薬としては、 測定試薬と生体 成分由来試料との反応生成物として色素粒子を生成しないことが必要で ある。 また、 ALP測定試薬の B C I P濃度や反応時間も適切なものと する必要がある。
なお、 測定試薬と生体成分由来試料との反応以前に、 BCI 2の粒子 等の有色の微細結晶が存在することが好ましくないことは言うまでもな い。 (ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の定量測定について）
ラクテートデヒドロゲナーゼ （以降は LDHと記す） 活性を測定する 場合は、 LDH活性によって lactate と NAD +とを、 pyruvateと N A DHとに変化させ、 さらに、 NADHと NTBとを diaphorase活性によ つて NAD +と不溶性 diformazanとに定量的に変換する。 そして、 不溶 性 diformazanを 0. 1 N— H C で可溶化して、 570 nmの波長で測 定を行う。 なお、 Diaphoraseの代わりに、 フエナジンメ夕サルフヱ一ト (以降は PMSと記す） を使用することもある。
可溶化した色素 （不溶性 diformazan) は、 吸収波長スペクトルから 6 00 nm以上の領域において十分に定量測定が可能である。
また、 NTBの代わりに水溶性ホルマザン基質を応用する方法が、 知 られている （石山宗孝， 臨床検査， 41,9,995,1997 ) 。 株式会社同仁化 学研究所製の水溶性ホルマジンの中でも W S T— 4並びに W S T— 5は、 溶液の p H変化に対してスペクトルの変化が認められない特性があり (石山宗孝， DOJIN News, 82, 10, 1996) 、 最大吸収波長が 55 O nmであ るが、 吸収波長スぺクトルから 600 nm以上の領域で定量測定が可能 である。
また、 WS T— 1， WS T— 3 , WS T— 8は、 最大吸収波長がそれ それ 438 nm， 433 nm, 46 O nmであり、 60 O nm以上に吸 収波長スペク トルが認められない。 しかし、 上記反応終了後にアルカリ を用いて pHを大きくすることにより、 600 nm以上に吸収を有する ようにできるので （スペク トルシフト） 、 本発明の測定方法に適用する ことができる。
しかし、 不溶性色素の可溶化やスペク トルシフ トを目的に、 強酸， 強 アルカリにより pHの調製をマイクロチップ中で行ったり、 溶媒等によ る不溶性色素の可溶化をマイクロチップ中で行ったりすることは、 マイ クロチップを構成するポリマー等に溶解等の損傷を生じさせる恐れがあ る。 そうすると、 キヤビラリの断面積等が変化し、 キヤビラリ内を流動 する液体の流量が経時変化する恐れがあり好ましくない。
そこで、 水溶性基質として、 W S T— 4及び W S T— 5を応用した。 本発明者は、 W S T— 4及び W S T— 5を使用することによって、 臨床 検査において測定される L D H活性の範囲における本発明の測定方法の 有効性を示すことができた。
次に、 過酸化水素を経由しない反応系の例を示し、 本発明の測定方法 の有効性を示す。
(血液総蛋白の定量測定について）
測定対象物質から過酸化水素を誘導する反応を用いることなく血液総 蛋白 （以降は T Pと記す） を測定する方法としては、 ビュレッ ト比色法 による方法がある。 これは、 アルカリ雰囲気中で、 C uイオンとぺプチ ド鎖中の窒素原子との錯体発色を、 5 4 0〜5 5 0 n mの波長において 定量測定を行うものである。
また、 ピロガロールレツド色素を用いた 6 0 0 n mにおける定量方法 も一般的である （体外診断用医薬品集， 薬事日報社 1997) 。 しかし、 ピ ロガロールレツ ド色素を用いた測定法は、 定量測定できる血液総蛋白の 濃度が低く、 血液中の T P測定を行うためには血液を千倍以上希釈する 必要がある。
マイクロチップ中での定量的な希釈は可能である。 しかし、 千倍以上 の希釈を行うには、 マイクロチップ中に設ける希釈用のリザ一バが大き くなりすぎることから、 現実的には不可能である。
本発明者は、 ビュレッ ト比色法の測定試薬の市販品 （カイノスオート シリーズ T P試薬、 カイノス株式会社製） の吸光度スペクトルを確認し、 6 3 5 n mにおける T Pの定量測定が可能なことを見いだした。 (尿素窒素の定量測定について）
血液中の尿素窒素を測定する方法としては、 ジァセチルモノォキシム 法、 ゥレアーゼ ·インドフエノール法、 ウレァ一ゼ · υ ν法、 酵素法に より過酸化水素を定量的に生成させ定量する方法等がある。 一般的には、 ゥレア一ゼ ·インドフエノール法が最も使用されている （体外診断用医 薬品集， 薬事日報社 1997) 。
ゥレアーゼ ·インドフエノール法は、 測定対象物質から過酸化水素を 誘導する反応を用いることがない方法であって、 5 7 0 n mの吸収波長 で定量測定を行うものである。
本発明者は、 ゥレアーゼ ·インドフヱノール法の測定試薬の市販品
(自動分析用試薬 「生研」 U N— I、 デンカ生研株式会社製） を用い、 ゥレアーゼ ·ィンドフエノール法のスぺク トルを確認し、 6 3 5 n mに おける尿素窒素の定量測定が可能なことを見出した。
(総ピリルビンの定量測定について）
血液中の総ピリルビンを測定する方法としては、 ジァゾ色素とビリル ビンとを結合させてァゾビリルビンを生成するジァゾ法や、 ビリルビン ォキシダーゼによりピリルビンを酸化する酵素法が一般的である （体外 診断用医薬品集， 薬事日報社 1997) 。
しかし、 酵素法はビリルビンの酸化により特有の吸収波長 （4 5 0 η m付近） が減少することを利用して定量を行っていることから、 本発明 の測定方法に用いることはできない。
本発明者は、 アルカリァゾビリルビン法 （測定波長： 6 0 0 n m) を 用い、 6 0 0 n m以上の領域で定量測定が可能なことを確認した。
(ァ— G T P活性の定量測定について）
血液中のァ— G T P活性を測定する方法としては、 p—ニトロァニリ ド法又はカルボキシ— p—二卜ロア二リ ド法 （4 0 5 ~ 4 1 5 n m) 、 3一カルボキシ一 4—ヒ ドロキシァ二リ ド法 （ 4 1 0~ 63 5 nm) 、 ジメチルアミノアニリ ド法又はジェチルアミノアニリ ド法 （ 660 η m) 、 ァ— G JS U— DBHA法 （ 60 0〜 6 1 0 n m) 等が一般的であ る （体外診断用医薬品集， 薬事日報社 1997) 。
しかし、 p _二トロア二リ ド法又はカルボキシー p—二トロアニリ ド 法は、 反応生成物の吸収波長の点で本発明の測定方法には適用できない ( 3—カルボキシ一 4—ヒドロキシァニリ ド法、 ジメチルアミノアニリ ド 法又はジェチルアミノアニリ ド法、 y— G u—DBHA法は、 測定対 象物質から過酸化水素を誘導する反応を用いることがない方法であって、 本発明の測定方法に適用可能である。
本発明者は、 ァー G u_DB HA法が本発明の測定方法に適応可能 であることを確認した。
(アルブミンの定量測定について）
血液中のアルブミンを測定する方法としては、 プロモクレゾールグリ —ン法 （以降は B CG法と記す） 若しくはプロモクレゾールパープル法 (以降は B CP法と記す） が一般的である （体外診断用医薬品集， 薬事 日報社 1997) o
何れの方法も、 アルブミンに色素を結合させることによりアルブミン を発色させて、 定量を行うものである。 これらの方法は、 測定対象物質 から過酸化水素を誘導する反応を用いることがない方法であり、 また 6 00 nm以上の波長領域で測定が可能である。
本発明者は、 B C G法が本発明の測定方法に適応可能であることを確 認した。
(過酸化水素を経由する測定項目に関する例）
例として、 過酸化水素の生成を経由して測定対象物質を定量測定する 反応に、 本発明の測定方法が有用であることを述べる。 まず、 測定対象物質に特異的な酵素による反応によって、 過酸化水素 を生成する。 そして、 この過酸化水素によって、 ペルォキシダーゼ活性 を介し 4—AAと色源素とを酸化縮合する。 この時、 適当な色源素を選 択することによって、 発色する波長を選ぶことができる。 すなわち、 6 00 nm以上の波長領域で測定することが可能となる。
以下に、 8つの具体例を述べる。
くァスパラギン酸ァミノ トランスフエレース及びァラニンアミノ トレ ンスフヱレースの活性の定量方法 >
血液中のァスパラギン酸ァミノ トランスフェレ一ス （以降は AS Tと 記す） 及びァラニンアミノ トレンスフェレ一ス （以降は ALTと記す） の活性の定量方法としては、 UVによる測定法、 ピルビン酸ォキシダー セ （以降は POPと記す） —ペルォキシダ一ゼ （以降は PODと記す） 法、 ホルマザン比色法、 ライ トマン—フランケル法等が知られている (体外診断用医薬品集， 薬事日報社 1997) 。
本発明者は、 POP— POD法の測定試薬の市販品 （TA— LNカイ ノス ： カイノス株式会社） の一部を改変した物を本発明の測定方法に適 応して、 AST, ALTの活性の定量が可能であることを確認した。
<尿酸の定量方法 >
血液中の尿酸の定量方法としては、 ゥリカーゼー POD法、 ゥリカ一 ゼ ·力タラ一ゼ法などが知られている （体外診断用医薬品集， 薬事日報 社， 1997) o
本発明者は、 ゥリカーゼ— POD法の測定試薬の市販品 （ィアト口 Q UA、 ャトロン株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 尿酸の定 量が可能であることを確認した。
<グルコースの定量方法 >
血液中のグルコースの定量方法としては、 ブドゥ糖酸化酵素比色法、 UV法等が知られている （体外診断用医薬品集， 薬事日報社， 1997) 。 本発明者は、 ブドウ糖酸化酵素比色法の測定試薬の市販品 （デ夕ミナ
— GL— E、 協和メデックス株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 グルコースの定量が可能であることを確認した。
<総コレステロールの定量方法 >
血液中の総コレステロールの定量方法としては、 コレステロールォキ シダ一ゼ法等が知られている （体外診断用医薬品集， 薬事日報社， 199
7)。
本発明者は、 コレステロールォキシダーゼ法の測定試薬の市販品 （H A テス卜ヮコ一 コレステロール E— HA テストヮコ一、 和光純 薬工業株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 総コレステロールの 定量が可能であることを確認した。
<HD L—コレステロールの定量方法 >
血液中の HD L—コレステロールの定量方法としては、 直接法ゃデキ ストラン硫酸 Mg · リンタングステン酸 Mg法が知られている （体外診 断用医薬品集， 99追補版， 薬事日報， 1999) 。
本発明者は、 直接法の測定試薬の市販品 （コレステスト HDL、 第 一化学薬品株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 HDL—コレス テロールの定量が可能であることを確認した。
< L D L—コレステロールの定量方法 >
血液中の L D L—コレステロールの定量方法としては、 直接法が知ら れている （体外診断用医薬品集' 99追補版， 薬事日報， 1999) 。
本発明者は、 直接法の測定試薬の市販品 （LDL— EX、 デンカ生研 株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 LDL—コレステロールの 定量が可能であることを確認した。
<中性脂肪の定量方法 > 血液中の中性脂肪の定量方法としては、 酵素比色法等が知られている
(体外診断用医薬品集， 薬事日報社， 1997 ) 。
本発明者は、 酵素比色法の測定試薬の市販品 （自動分析装置用試薬一 H R トリグリセライ ド— H R、 和光純薬工業株式会社） を本発明の測 定方法に適応して、 中性脂肪の定量が可能であることを確認した。
<クレアチニンの定量方法 >
血液中のクレアチニンの定量方法としては、 ヤッフェ法， 酵素比色法: 酵素 U V法等が知られている （体外診断用医薬品集， 薬事日報社， 199 7) o
本発明者は、 酵素比色法の測定試薬の市販品 （Lタイプヮコ一 クレ ァチニン F、 和光純薬工業株式会社） を本発明の測定方法に適応して、 クレアチニンの定量が可能であることを確認した。
(熱レンズ検出法の乳び耐性について）
励起光の波長に特異的な吸収を示さない直径数十 n m程度の微粒子、 例えば乳びに対して、 熱レンズ検出法が耐性を有することを示す例を述 ベる。
乳びの度合いを定量化するために干渉チェック · Aプラス （国際試薬 株式会社） を用いた。 一般的に強乳びとされる 2 1 0 0ホルマジン度の 血清 （検体） を、 スィ トロール A (日水製薬株式会社） を用い仕様書に 従って作製した。 そして、 H A テストヮコ一 コレステロール E— H A テス トヮコー （和光純薬工業株式会社） を検体に反応させた後、 熱レンズ検出法及び吸光度法 （ 6 3 5 n m ) により測定を行った。
その結果、 吸光度法ではバックグラウンドが生じるが、 熱レンズ検出 法では乳びの影響が生じないことを確認した。 この結果より、 熱レンズ 検出法は乳びに対して耐性を有することが分かった。
(励起光及びプローブ光について） 本発明者等が、 励起光に 633 nmの波長を持つ He— Neレーザ一 を用い、 プローブ光に 488 nmの波長を持つ A rレーザ一を用いて、 熱レンズ検出法によるヘモグロビンの測定を行ったところ、 後述する参 考例 1に記したように、 熱レンズ検出法による出力が異常に大きく、 且 っ絰時的に上昇するという現象が見られた。
この励起光とプロ一ブ光との組み合わせは、 コレステロールなどの生 化学項目を D A◦ Sなどの色素に誘導して測定した場合には、 問題なく 熱レンズ検出法による出力が検出でき、 定量できた組み合わせである。 このことは、 例えば、 国際公開 WO 99— 64846号 （国際出願 P CT/J P 99ノ 03 1 58明細書、 「分析装置」 ） 、 日本国特許公開 公報 平成 12年第 2675号 （曰本国特許願 平成 1 0年第 1 8 1 5 87号明細書、 「キヤビラリ光熱変換分析装置」 ） 、 日本国特許公開公 報 平成 1 2年第 2677号 （日本国特許願 平成 10年第 1 6760 3号明細書、 「分析装置」 ） 、 日本国特許願 平成 10年第 18 158 6号明細書 （ 「混合分析装置及び混合分析方法」 ) 、 日本国特許願 平 成 10年第 1 6 7603号明細書 （ 「分析装置」 ） 等に記載されている c 本発明者らが種々検討した結果、 488 nm及び 633 nmの両方の 波長の光がメ トヘモグロビンに照射されると、 光反応が起こり異常値と なることがわかった。 そこで、 プローブ光を励起光より長波長の、 メ ト ヘモグロビンが吸収しない波長であるレーザーに変えたところ、 正常な 熱レンズ検出法による出力が得られ、 へモグロビンの定量が可能であつ た。
ヘモグロビンの測定のために本発明で用いる励起光の光源は、 メ トへ モグロビンの 630 nmの吸収帯を励起できる波長を有し、 熱レンズを 形成させるのに十分な出力を備えたものが必要である。 励起光の波長は、 メ トヘモグロビンの吸収から、 6 1 0 ηπ！〜 650 nmが好ましく、 よ り好ましくは、 630 nm± 10 nmである。 励起光の光源は、 630 nm付近に励起に必要な光度を持つものなら、 特に限定されない。
例えば、 キセノンランプなどから必要とする波長の光をプリズムを用 いて取り出してもよいが、 分光すると出力が小さくなつてしまう。
測定対象物質を励起することが可能な波長を有するレーザー又は十分 な出力を備えた発光ダイオードでもよい。 レーザーとしては 633 nm の H e— N eレーザーなども用いられるが、 半導体レーザーを用いると 検出装置が小さくなり、 PO C分析等の用途に適する。 半導体レーザー としては、 東芝社製 TOLD 945 OMC等の 650 nmの波長のもの も用いられるが、 より好ましい励起光の光源としては、 シャープ社製 L T 050 M Sや、 三洋電機社製 D L— 3088 - 0 1 1、 DL4038 — 025等の 635 nmの波長の半導体レーザーがあげられる。
ヘモグロビン測定におけるプローブ光の波長は、 前述したように 60 0 nmより長波長が好ましく、 より好ましくは励起光の波長の 630 η m± 20 nmよりも長波長のものである。 1064 nmの Y A Gレーザ —や、 900〜 1200 nmに 1◦ 0本程度の発振線をもつ炭酸ガスレ —ザ一等も使用できるが、 日本科学エンジニアリング社製 LDT 783 0や三洋電機社製 D L— 4034— 1 5 1等の 780 nmの波長を有す る半導体レーザーがより好ましい。 三洋電機社製 DL— 7032 - 00 1やシャープ社製 L T 0 15 PDや日立社製 HL 8325 G等の、 83 0 nmの波長を有する半導体レーザーも好ましく使用できる。 なお、 励 起光， プローブ光ともにキヤビラリ付近に焦点を結ぶようにするために、 集光レンズが必要である。
以上述べた励起光の光源及びプローブ光の光源は、 へモグロビン以外 のものを測定する場合にも用いることができる。
熱レンズによるプローブ光の変化は、 フォトダイオード， CCDカメ ラ， 光電子倍増管などで捉えられる。 特に、 フォトダイオードが検出装 置の小型化には適している。
励起光はチョッパー等で 0 . 1〜2 0 m秒程度のパルス光 （周波数 5 0 H z〜 1 0 0 0 0 H z ) とされ、 そのチョッパーと同調するロヅクイ ンアンプなどで、 プローブ光の変化のみを取り出すようになつている。 より好ましいチヨッパ一の周波数は 1 0 0 H zから 4 0 0 0 H zである c ロックィンアンプの構造は、 単機能の半導体素子などで簡略化が可能 である。 また、 励起光のパルス化は、 半導体レーザーを電気的に変調さ せることにより行ってもよい。 また、 プローブ光の検出の際、 一般には ロックインアンプを用いるが、 日本国特許公開公報 平成 9年第 2 2 9 8 8 3号に開示される暗視野型光熱変換分光分析装置の方法を用いても よい。 すなわち、 遮蔽板でポンプ光及びプローブ光の光軸付近の光束を 遮蔽し、 熱レンズによって発散されたプローブ光のみを検出する手段で ある。
チヨッパ一によりパルス光となった励起光によって形成される熱レン ズの変化を、 プローブ光で検出する際には、 プローブ光中の振動成分 (励起光のパルスと同一周波数） のみを検出することとなる。 よって、 散乱などによつて光の絶対量 Iが減少しても、 光量 Iに対する振動成分 iの比 （ i / I ) は不変となり、 安定して正しい値を得ることが可能と なる。
(マイクロチップについて）
本発明のへモグロビンの測定方法において使用されるマイクロチップ は、 その内部に血液試料や測定試薬等が流れるキヤビラリを有していれ ば、 その構成等は特に限定されるものではない。
例えば、 以下のようなマイクロチップは本発明における好ましい形態 の一つである。 すなわち、 マイクロチップが一対の平板状部材から構成 されているものである。 一対の平板状部材のうち少なくとも一方は、 表 面に液体が流れる溝を有している。 そして、 該平板状部材の前記溝を内 側にして 2つの平板状部材を貼り合わせることにより、 内部にキヤビラ リを形成している。
このようなマイクロチップは、 シリコン， ガラス等の無機材料や有機 ポリマーで製造することができる。 ただし、 熱レンズ検出法の検出部分 は、 励起光及びプロ一ブ光に対して透明であることが必要である。 マイクロチップをシリコンやガラスで製造する場合は、 ガラス， 石英 もしくは S iの基板にエッチング保護膜 （C r等） を真空蒸着等の方法 で数百 n mの厚さに製膜を行う。 そして、 その上にパ夕一ニングレジス トをスピナ一等を用いて塗布する。 その後、 フォトリソ用マスクを用い て、 紫外光にてレジストを露光し、 続いて現像 （未硬化部分を溶剤で除 去） して、 所望の形状にパターニングする。
次に、 パターニングされたレジストをエッチングマスクとして、 エツ チング保護膜をフヱリシアン化カリウム水溶液等で溶解除去しパター二 ングする。 続いて、 パ夕一ニングされたレジスト及びエッチング保護膜 をマスクとして、 基板を例えばフッ酸水溶液にてエッチングして溝を形 成する。 その後、 レジス ト及び保護膜をエッチング除去する。 また、 上 記基板とは別に、 レーザ一や超音波加工等の方法で貫通孔を開けたガラ ス等の基板を準備する。
最後に、 溝を設けた基板と貫通孔を有する基板とを、 溝を内側にして 張り合わせ、 例えば、 真空炉中にて加熱 （ガラス基板同士の場合には、 6 0 0 °C程度に数時間加熱） した後、 自然冷却することで融着しマイク 口チップを作ることができる。
マイクロチップを有機ポリマーで製造する場合は、 光学的検出を行う ので、 測定に用いられる波長の光に対して透明性を有する樹脂を使用す る必要がある。 例えば、 光熱変換検出法による測定の場合は、 A S T M D 1 0 0 3で測定される樹脂の光線透過率が、 6 0 0 η π！〜 8 0 0 η mの波長範囲で、 8 0 %以上、 好ましくは 9 0 %以上のものが好適に使 用できる。 上記の光線透過率は、 マイクロチップの表面での反射率及び 有機ポリマ一基材そのものによる吸収率の総和を、 1 0 0 %から減じた 値である。
マイクロチップの表面などで散乱される光は、 有機ポリマ一に対して は何の効果も発揮しないのに対し、 有機ポリマ一基材によって吸収され る光は、 有機ポリマーに対しても熱を発生させる効果を有する。 よって、 光が有機ポリマーを通過する際に熱レンズと同様な効果が生じ、 熱レン ズ検出法による出力のバックグラウンドとなるため、 測定の誤差の原因 となる。 よって、 マイクロチップの作成に先立って有機ポリマー材料の 評価を行い、 熱レンズ検出法に影響を及ぼさない透過率の範囲を調査す る必要がある。
吸光度法により測定する場合は、 有機ポリマーに 1 0 %程度吸収され たとしても、 全体の光量を 9 0 %に低下させるにすぎないから、 検出感 度には大きな影響を及ぼさない。 しかしながら、 光熱変換検出法の場合 は、 1 0 %以下の吸収であっても、 有機ポリマー製のマイクロチップに 形成される熱レンズのため、 測定結果に大きな影響が出る。 特に、 測定 対象物質の濃度が低く、 且つキヤビラリが細い （溝が浅い） というよう な、 測定に高感度が要求される場合には、 1 %以下の吸収であっても、 ときには 0 . 5 %以下のわずかな吸収であっても、 測定結果に悪影響が 出る恐れがある。
例えば、 1 c mのキュベッ トでの吸光度が 0 . 1程度の物質 （液体） の測定を、 仮に 5 0 mのキヤビラリを備えた有機ポリマー製のマイク 口チップを用いて行ったとする （すなわち、 光路長が 5 0 / m) 。 そう すると、 1 c mの光路長での吸光度 0 . 1は、 5 0〃mのキヤビラリで の吸収率 0 . 1 0 3 %に相当する。 有機ポリマー製のマイクロチップの 有機ポリマ一部分による吸収 （熱レンズの形成） を、 この 1 0倍まで許 容するとすると、 吸収率は 1 %、 2倍までとすると吸収率は 0 . 2 %と なる。
つまり、 1 c mの光路長の場合の吸光度が 0 . 1程度の測定を、 本発 明の測定方法で行うには、 マイクロチップを形成する有機ポリマーによ る光の吸収が 1 %以下、 より好ましくは 0 . 2 %以下であることが望ま しいということになる。
ただし、 この値は、 測定対象物質の濃度やキヤビラリの細さの違い等 により変化し得る。 例えば、 測定対象物質の濃度を高くすることによつ て、 1 c mのキュベッ トでの吸光度を 0 . 5程度まで上げれば、 5 0〃 mのキヤビラリでの吸収率 0 . 3 4 2 %に相当する。 よって、 有機ポリ マ一製のマイクロチップによる吸収 （熱レンズの形成） をこの 1 0倍ま で許容するとすると、 有機ポリマー製マイクロチップによる吸収率はお よそ 3 . 5 %、 2倍までとすると吸収率は 1 %弱となる。
また、 前記平板状部材に溝を設ける際の加工性も、 樹脂の種類の選択 において重要な要素である。 加工性の面から良好に使用できるのは、 一 般の溶融加工可能な熱可塑性樹脂や U V硬化によって得られた樹脂があ げられる。 特に良好に使用できるのは、 表面に溝を有する平板状部材を 大量に且つ安価に成形できる点で、 溶融加工可能な熱可塑性樹脂である c その中でも、 非結晶性熱可塑性樹脂、 非結晶性樹脂が主成分の熱可塑性 ポリマ一ァロイ、 あるいは結晶化度が低い一部の結晶性熱可塑性樹脂が 好適である。
また、 血液との親和性、 特に凝集， 凝固， 及び血小板の活性化などが 起こらないことも、 好ましい材料の条件の一つである。 以上のような光の透過性と加工性とを満足し、 特に良好に使用できる のは、 具体的には、 ポリスチレン， スチレン一アクリロニトリル共重合 体等のスチレン系樹脂、 ポリメチルメタクリレート （P MM A ) , メチ ルメ夕クリレ一ト一スチレン共重合体等のメ夕クリル樹脂、 ポリカーボ ネート （P C ) 、 ポリスルホン、 ポリエーテルスルホン、 ポリエーテル イミ ド、 ポリアリレート、 ポリメチルペンテン等である。
1 , 3—シクロへキサジェン系重合体も好適に用いられる。 ホモポリ マーとして使用することも可能であるが、 共重合体として用いる場合は、 1 ， 3 —ブタジエン、 イソプレン、 1 ， 3—ペン夕ジェン、 1 , 3—へ キサジェン等の鎖状共役ジェン系モノマー、 スチレン、 ひーメチルスチ レン、 p—メチルスチレン、 1 , 3—ジメチルスチレン、 ビニルナフ夕 レン、 ビニルスチレン等のビニル芳香族系モノマー、 メ夕クリル酸メチ ル、 アクリル酸メチル、 アクリロニトリル、 メチルビ二ルケトン、 ひ一 シァノアクリル酸メチル等の極性ビニルモノマ一若しくはエチレンォキ シド、 プロピレンォキシド、 環状ラク トン、 環状ラクタム、 環状シロキ サン等の極性モノマー、 又はエチレン、 ひ一ォレフィン系モノマーとの 共重合体があげられる。 この場合の共重合比は重量比で 1 , 3—シクロ へキサジェンモノマ一ノコモノマー = 7 5 Z 2 5〜 1 0 0 / 0が好まし い。
光透過性の高いシクロへキサジェン系ポリマ一については、 日本国特 許願 平成 9年第 2 7 7 0 4 5号明細書や曰本国特許願 平成 1 0年第 2 8 7 0 0 7号明細書中に詳細に記述されている。 該ポリマーは、 2 0 0 n m以上の波長においては吸収はほとんどない。
前記のような、 溝を有する有機ポリマー製の平板状部材は、 平板から の切削加工、 レーザー等によるエッチング加工、 型内でのモノマ一やマ クロモノマーの U V硬化や熱硬化、 熱可塑性樹脂の溶融加工ゃ塑性加工 等の方法により成形できる。 良好に使用できる成形加工法としては、 前 記平板状部材を大量に且つ安価に成形加工できることから、 熱可塑性樹 脂の溶融加工ゃ塑性加工があげられる。 より良好に使用できるのは、 金 型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形法、 圧縮成形法、 エンボス成形法で ある。
特に、 樹脂の金型キヤビティへの充填工程中に、 金型に接する樹脂表 面の固化温度を低下させつつ射出成形する射出成形法 （日本国特許公開 公報 平成 1 0年第 1 2 8 7 8 3号， 日本国特許願 平成 1 0年第 4 6 6 6 5号明細書に開示されている） は、 成形精度の高い微細な溝を有す る平板状部材を生産性良く成形することができる。 この射出成形方法の 具体例としては、 キヤビティ一内に炭酸ガスを満たしておき射出成形す る方法があげられる。 この場合の炭酸ガスの圧力は、 l O M P a以下、 より好ましくは 0 . 3〜 2 M P aである。
また、 成形直前に高周波誘導加熱で金型表面を加熱して成形する射出 成形方法 （日本国特許公告公報 昭和 6 2年第 5 8 2 8 7号、 米国特許 第 4 4 3 9 4 9 2号等に記載） や、 成形直前に輻射加熱で金型表面を加 熱して成形する射出成形方法 （成形加工シンポジァ， 9 5 , 2 4 1 < 1 9 9 5 >、 成形加工' 9 6 , 6 9 < 1 9 9 6 > , 合成樹脂， 4 2卷 ( 1 ) ， 4 8 < 1 9 9 2 >等に記載） などの、 金型表面を加熱して成形 する射出成形方法も、 本発明におけるマイクロチップの製造に好ましい 成形方法である。
つまり、 前記成形方法は、 金型温度を低く設定し、 高周波誘導加熱や ハロゲンランプ等の熱源により成形直前に金型表面だけを選択的に加熱 して、 型表面転写性と成形サイクルとの両立をはかれる成形方法である からである。
このようなマイクロチップ成形用の金型は、 鉄又は鉄を主成分とする 鋼材、 アルミニウム、 アルミニウムを主成分とする合金、 亜鉛合金、 ベ リ リウム—銅合金等の、 一般に合成樹脂の成形に使用されている金属か らなる金型が良好に使用できる。
金型作製方法の 1つの例をあげる。 まず、 金属， プラスチック， シリ コン， ガラス等の材料から、 切削加工， エッチング加工， 紫外線硬化樹 脂のフォトリソグラフィ加工等の方法により、 目的とする微細な溝を有 する有機ポリマ一製の平板状部材の表面形状を有する母型を 1つ作成す る。 そして、 この母型からニッケル等の電気化学的鎵造法により、 金型 が作製される。
また、 日本国特許公開公報 平成 6年第 2 8 3 8 3 0号のレジストパ ターンを形成する方法を用いて金型を作ることも可能である。 金属基板 にレジストパ夕一ンを形成した後、 レジストの無い部分を金属メツキで 埋める。 そして、 レジス トを除去して、 基板表面に微細なパターンを施 した金属板を形成する。 この金属板を金型として、 樹脂や焼結ガラスな どの加工を行うことが可能である。
本発明において使用される有機ポリマー製のマイクロチップを、 前述 の日本国特許公開公報 平成 6年第 2 8 3 8 3 0号の回路基板を製造す る方法に基づいて製造することも可能である。
また、 ガラス基板を使用してマイクロチップを製造する場合、 ガラス 基板上にレジストパ夕一ンを形成して、 サンド ' ブラスト法でガラス基 板を加工する方法があげられる。 この方法によれば、 飛来する粒子の方 向が厚いレジス 卜により垂直方向に揃うため、 通常の薄いレジス卜に比 ベてシャープな加工が可能で、 高ァスぺク ト比の溝を作ることができる。 さらに、 ガラスや樹脂基板上に感光性レジス トを塗布し溝以外の部分 を露光した後、 未硬化部分を除去して、 溝の形状のレジストパターンを 基板上に形成する手法も採用可能である。 さらにまた、 レーザ一等で両面を貫通する溝を設けたガラス平板を、 別の 2枚のガラス平板で挟むことによつても、 本発明において使用され るマイクロチップを製造することが可能である。
また、 ガラス基板上にレジストパターンを形成した後、 フッ化水素な どによるウエッ トエッチングによって、 ガラス基板上に溝を形成する方 法も用いることができる。
また、 溝を有する平板状部材からなる前記マイクロチップは、 溝の内 面をポリエチレングリコールなどで蛋白吸着防止処理をしてもよい。 ま た、 後述する電気浸透流を送液手段として使う場合は、 安定した電気浸 透流を発生させるための表面処理を行ってもよい。
本発明におけるマイクロチップとしては、 2枚の平板状部材から構成 されるものが好ましい。 その少なくとも一方は上記のような溝を有して いて、 該溝を有する面を内側にして他方の平板状部材と貼り合わせる。 そして、 超音波融着， 熱融着， ホットメルト接着剤や U V接着剤等の接 着剤による接着， 粘着剤による粘着， 直接又は薄い弾性シートを介して の圧接等の方法で一体化して作られる。
溝を有していない平板状部材 （以降は、 被せ平板と記す） の材料は、 上記溝を有する平板状部材に用いられる材料の中から選ぶことができる また、 薄いガラス板なども用いることができる。 2つの平板状部材の材 料は、 同じ材料でもよいし、 異なる材料であってもよい。 厚みは、 測定 の障害になることがなければ、 特に限定されるものではないが、 0 . 0 5〜数 mm程度が好ましい。 どのような材料を用いる場合でも、 熱レン ズ検出法による検出部においては、 励起光及びプロ一ブ光の吸収率が、 前述のように 5 %以下、 より好ましくは 1 %以下であることが重要であ る。
また、 本発明におけるマイクロチップの構成は、 加工生産性の点から は、 上記のように 2枚の平板状部材から構造されることが好ましい。 そ して、 その少なくとも一方は溝を有していて、 該溝を有する面を内側に して他方の平板状部材と貼り合わせた構造をとることが好ましい。 ただ し、 貫通溝をもつ平板状部材を、 他の平板状部材 2枚で挟んで溝を形成 させた 3枚構成とすることも可能である。
前記被せ平板には、 リザーバ用の貫通孔があいていてもよいし、 被せ 平板から突起する形で円筒形のリザ一バ （廃液溜めを含む） が装着され ていてもよい。 このリザーバの大きさは特に限定されるものではないが、 高さが 1〜数 mm、 径が 1〜数 mm程度が好ましい。 溝を有する平板状 部材ゃ被せ平板が、 数 mm程度の厚みを有する場合、 該貫通孔が液溜め を兼ねることもできる。
なお、 本発明における流量とは、 溝 （キヤビラリ） 中を一定時間内に 移動する液体の体積を意味する。
また、 前記平板状部材の表面に有する液体の流れる溝の断面形状は、 四角形であることが好ましいが、 三角形等の他の多角形の形状， 半円形: 半楕円形等、 他の形状でもよい。 また、 マイクロチップが何種類かの異 なった形状の溝を組み合わせてなる流路を有していてもよい。 ただし、 熱レンズ検出法による検出部に関しては、 溝の断面形状は長方形である ことが好ましい。 なお、 溝の上面 （開放面） の幅は、 溝の下面 （底） の 幅と同じであるか、 又は広くてもよい。
また、 この溝は、 あまり小さすぎると、 測定試料等に混入した微粒子 がや血球などにより目詰まりが生じる原因となる。 また、 あまり大きす ぎると、 二液が合流した際の拡散による混合の効率が低下する。 そのた め、 血液試料の通過部分は、 幅が 2 0〜5 0 0〃m、 深さが 2 0〜 1 0 0 0 mであることが必要である。 好ましくは、 幅が 5 0〜3 0 0 m、 深さが 3 0〜 2 0 0 mである。 へモグロビン測定などで血球を溶血する場合は、 溶血した後の流路は、 幅が 1〜： L 000 m、 深さが 0. 1〜： L 000〃m、 断面積が 1〜 1： 000 , 000 zm2 であることが好ましい。 さらに好ましくは、 幅が 30〜： 1000〃 m、 深さが 20〜： L 000 m、 断面積が 600〜 1 : 000 , 000〃m2 であり、 幅は深さと同等以上である。
前記平板状部材の溝の寸法精度は、 極微料成分の分析や定量分析等を 行う上では、 優れていることが好ましい。 すなわち、 溝の寸法精度 （寸 法転写精度） は、 操作の精度及び個々の分析装置間の再現性を得るため、 設計寸法に対し、 幅及び深さが ± 5%以内、 断面積が ± 7%以内である ことが好ましい。 また、 高精度の定量分析を行うためには、 幅及び深さ が ± 2%以内、 断面積が ±4%以内の寸法精度を有することが、 さらに 好ましい。
(送液方法について）
本発明においては、 マイクロチップ内での定量反応を、 マイクロチッ プ内又は外で、 血液試料と測定試薬とを計量槽によって各々一定量秤取 して混合することにより行うことができる。 あるいは、 測定試薬に対す る血液試料の流量比を制御することによって、 測定試薬と血液試料とを 一定比率で混合し、 少なくとも一定時間以上連続的に反応する方法によ り行うこともできる （前述の日本国特許願 平成 10年第 18 1 586 号明細書、 「混合分析装置及び混合分析方法」 ） 。
送液方法としては、 チップ外のポンプや遠心力や重力を送液手段とす る方法を用いることができる。
また、 溝 （キヤビラリ） 中の液体に電界を印加して、 電気泳動や、 電 気浸透流によって送液を行うこともできる （ 「キヤビラリ電気泳動」 、 講談社等に詳しく記載されている） 。
電気浸透流は、 キヤビラリ内面の表面のィオンの移動によってキヤピ ラリ内の液体が一緒に移動するものである。 キヤビラリがガラスゃシリ コンで形成される場合は、 ガラス表面のケィ酸のプロ トンなどが移動力 となる。 また、 P M M Aや P Cなどの有機ポリマ一等からなるマイクロ チップで、 キヤビラリ内面に特別のイオン種が存在しない場合でも、 キ ャビラリ内を流す液体の組成によっては、 その液体中の電解質をキヤピ ラリ内面に吸着させ、 その電解質の移動により電気浸透流を生じさせる ことができる。 安定した電気浸透流を発生させるため、 キヤビラリ内面 の表面に、 スルホン酸基やカルボン酸基を有する有機ポリマ一をグラフ ト重合などで付加してもよい。 また、 水酸化ナトリウム水溶液等で、 P M M Aなどの表面を加水分解して、 キヤビラリ内面の表面にカルボン酸 基を形成することも有効である。
電気浸透流では、 電圧の制御により、 細かく即応的に、 また、 設定し たプログラムに従って正確な流量を制御できる。 したがって、 マイクロ チップ内での反応や分離を、 精度良く制御できるので好ましい。
電気浸透流を発生させる電源としては、 高電圧電源装置 （例えば、 Mo del HCZE- 30PNO, 25 、 松定プレシジョン、 3 0 k Vまで印加可能） を用 いる。 高電圧電源装置は、 イン夕一フェイスボード （例えば、 DAQCard -1200, CB- 50コネクターブロック、 ナショナルインスツルメント） を介 して外部のコンピュータ一から出力制御できる。 電圧の印加のタイミン グ等のプログラムは、 例えば N I—D A Qドライブソフ トウェア （L a b V I E W) などで作製できる。
重力を駆動力として送液を行うことも可能であり、 この送液法につい ては、 本出願人により出願されている （日本国特許願 平成 1 1年第 3 5 2 4 4 5号明細書） 。
(マイクロチップのキヤビラリ （流路） 形態について）
測定試薬や血液試料の混合や希釈を主な目的としたマイクロチップの 流路 （キヤビラリ） の形状には、 1本の流路に他の流路を合流させた形 状や、 1本の流路に複数本の流路を一力所で合流させた形状を採用する ことができる。 1本の流路に他の流路又は複数の流路を合流させ一本の 流路とすることにより、 混合操作や希釈操作を行うことができる。 また、 この時、 各々の流量を変えることにより、 異なった比率での混合や希釈 も可能である。
混合や希釈の比率は、 送液方法がポンプによる場合には、 合流する各 流路の流量を機械的に変えることにより決定することができる。 また、 電気浸透流による場合には、 合流する各流路の断面サイズや長さを変え たり、 各流路への電圧のかけ方を変えたり、 各流路のキヤビラリ内表面 の荷電状態を表面処理等により変えることにより、 合流する各流路の流 量を調節することができる。
また、 遠心力による送液では、 中心からの距離、 回転数なども考慮し て流路設計をする必要がある。
血液試料と測定試薬とを反応させた後、 分離のために一定量を秤取す ることなく、 混合から反応， 測定まで一貫した流路で連続的に処理が可 能である。
このような、 流量比で混合比率を規定する方法は、 反応を長時間連続 的に行う必要はない。 例えば、 混合に 1 0秒かかるとしたら、 最低 1 0 秒間 （通常はやや多めに 2 0秒程度） 、 血液試料と測定試薬との合流を 行い、 この血液試料と測定試薬との混合物を、 反応に十分な時間だけ流 路内を移動させ、 その後に他の測定試薬との合流を同じく最低 1 0秒間 行えばよい。 そして、 それから必要時間、 流路中を流して反応させてか ら測定を行う。
また、 マイクロチップ中に計量槽 （メスシリンダー） を設けて、 この 計量槽にて血液試料や測定試薬を計り取り、 それを混合して熱レンズ検 出装置に供することもできる。
本発明においては、 血液試料と測定試薬との反応は、 混合のため、 反 応の完結のために、 2〜 10分の時間を取ることが好ましい。
(実験例 1 ：血液試料と測定試薬との混合比及び酸化剤濃度について の検討）
熱レンズ検出法の必要条件として、 波長 633 nmの励起光の吸光度 に対する測定試薬の混合比の影響を検討した。 測定試薬 （溶血酸化試薬 液） としては、 フェリシアン化カリウム （K3 F e (CN) 6 ) 、 2— (N—モルフォリノ） エタンスルフォン酸 （以降は MESと記す） 、 ト リ トン X— 100を、 それぞれ 0. 6 lmM、 10 mM、 0. 8重量％ の濃度で溶解させた溶液 （pH6. 0) を用いた。
血液試料は健常人からへパリン採血したものを用いた。 血液試料と上 記測定試薬との混合比が 1 ： 250の場合では、 血液試料 4〃 に対し 上記測定試薬を 996〃 、 混合比 1 ： 415では、 P B S (燐酸緩衝 液） で 60%に希釈した血液試料 4〃 に対し上記測定試薬を 996〃 £ヽ 混合比 1 ： 1245では、 PB Sで 20%に希釈した血液試料 4〃 に対し上記測定試薬を 996 添加した。
添加直後からの経時的な吸光度変化を、 第 1図 （混合比 1 ： 250 ) 、 第 2図 （混合比 1 ： 415 ) 、 第 3図 （混合比 1 : 1245 ) に示す。 添加直後に比べて、 1200秒 （ 20分） 後の吸光度の低下は、 混合比 1 ： 250で 8. 5 %、 混合比 1 ： 415で 16. 3 %、 混合比 1 ： 1 245で 31 %であった。
混合比を 1 ： 4にした場合は、 上記測定試薬 800〃 と血液試料 2 00 を混合して室温下で 5分放置しても、 第 4図に示すように、 メ トヘモグロビンへの酸化が不十分であった。
そこで、 測定試薬中の酸化剤の濃度を上げて、 フェリシアン化力リウ ム、 ME S、 トリ トン X_ 1 00の濃度を、 それぞれ 1 OmM、 1 2.
5mM、 1重量％とした （pH 6. 0) 。
血液試料 20 O i Qとこの酸化剤の濃度を上げた測定試薬 80 O JL Q とを混合し、 5分後の吸光度を測定した。 その結果、 第 5図に示すよう に、 ヘモグロビンの酸化が進んでいた。 この条件での、 混合後 3 0秒後、
1 0分後、 20分後の吸収スペク トルを第 6図に示す。 この場合の混合 直後に比べた 1 200秒 （2 0分） 後の吸光度の低下は、 2. 9 %と安 定であった。
(実験例 2 ： pH値の影響についての検討）
フェリシアン化カリウム、 トリ トン X— 1 00を、 それぞれ 0. 6 1 mM、 0. 8重量％の濃度で溶解させた溶液を測定試薬として用いて、 pH値の検討を行った。 pH値は、 以下に示す pH値調整用の試薬を用 いて調整した。 pH 2及び pH4は、 1 OmMクェン酸バッファ一を N a〇Hで調整したもの、 pH 6は 1 OmMの ME Sバッファー、 pH 8 は 1 OmMの TR I ZMA (シグマ社製） ノ ッファー、 p H 1 0は約 1 mMの NaOH溶液、 pH 1 2は約 1 0 mMの N a〇 H溶液を用いて、 それぞれ調整した。
633 nmにおける吸光度を第 7図に示した。 メ トへモグロビンの吸 収 （ 630 nm) は、 pH 2 , 6， 1 0ではピークを示すが、 pH4 , 8， 1 2ではショルダーとなり、 ピークを示さなかった。 700 nmに おけるバックグラウンド吸光度は、 pH 2で0. 34, 114で 0. 0
5 , pH 6で 0. 02 , pH 8で 0. 00， pH I Oで 0. 00 , pH
1 2で 0. 00であった。
かく して、 本発明の物質の測定方法によれば、 微量の検体、 とりわけ 血液や尿などの生体由来の検体から、 ヘモグロビン等の物質の濃度測定 が可能である。 また、 励起光として長波長のレーザーを用いることがで きるため、 熱レンズ検出装置が安価に製造でき、 経済的である。 したが つて、 本発明の物質の測定方法及び該測定方法に用いる測定試薬は、 P 0 C分析等に好適な測定方法及び測定試薬である。
さらに、 本発明のヘモグロビン測定方法は、 毒物であるシアン化カリ ゥム等のシアニドを測定試薬中に含有しないため、 煩雑な廃液処理が不 要である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬との混合比が 1 ： 2 5 0の場合の、 6 3 5 n m (上の曲線） と 7 8 0 n m (下の曲線） と における測定試料の吸光度の経時変化を示すグラフである。
第 2図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬との混合比が 1 ： 4 1 5の場合の、 6 3 5 n m (上の曲線） と 7 8 0 n m (下の曲線） と における測定試料の吸光度の経時変化を示すグラフである。
第 3図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬との混合比が 1 ： 1 2 4 5の場合の、 6 3 5 n m (上の曲線） と 7 8 0 n m (下の曲線） とにおける測定試料の吸光度の経時変化を示すグラフである。
第 4図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬とを 1 ： 4で混合 し、 5分間反応させた後の測定試料の吸収スペク トルである （測定試薬 中の酸化剤濃度は、 第 1図〜第 3図の場合と同じ） 。
第 5図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬とを 1 ： 4で混合 し、 5分間反応させた後の測定試料の吸収スペク トルである （測定試薬 中の酸化剤濃度を、 第 4図の場合より上げた場合） 。
第 6図は、 実験例 1において、 血液試料と測定試薬とを 1 ： 4で混合 した後の、 測定試料の吸収スペク トルの経時変化である （測定試薬中の 酸化剤濃度は、 第 5図の場合と同じ） 。 （a ) は混合後 3 0秒後、 (b) は 10分後、 （c) は 20分後を示す。
第 7図は、 実験例 2における、 pH2, 4, 6, 8, 10, 12の各 条件下での測定試料の吸収スぺク トルである。
第 8図は、 （a) は、 実験例 3における、 ヘモグロビン濃度と熱レン ズ検出法による出力の関係を示すグラフである。 （b) は、 （a) の横 軸のへモグロビン濃度の低濃度の部分を拡大したグラフである。 なお、 横軸上段の g/d 1単位の数字は、 血液試料中のヘモグロビン濃度を示 し、 横軸下段の〃 g/ml単位の数字は、 測定試料中のヘモグロビン濃 度を示す。
第 9図は、 有機ポリマー製のマイクロチップの流路形状を示す図であ る。
第 10図は、 ガラス製キュべッ ト中での光熱変換検出法による AL P 活性の測定結果を示すグラフである。
第 1 1図は、 比較例 1における光熱変換検出法による ALP活性の測 定結果を示す測定チャートである。
第 12図は、 吸光度法による ALP活性の測定結果を示すグラフであ る。
第 13図は、 実施例 5における送液系の構成を示す概略図である。 第 14図は、 第 13図中のベリス夕ポンプの構成を説明する概略図で ある。
第 15図は、 樹脂製マイクロチップ中での光熱変換検出法による A L P活性の測定結果を示すグラフである。
第 16図は、 B C I 2の粒度分布の測定結果を示す図である。
第 17図は、 光熱変換検出法による LDH活性の測定結果を示すグラ フである。
第 18図は、 光熱変換検出法による総蛋白濃度の測定結果を示すグラ フである。
第 1 9図は、 光熱変換検出法による尿素窒素濃度の測定結果を示すグ ラフである。
第 2 0図は、 光熱変換検出法による総ピリルビン濃度の測定結果を示 すグラフである。
第 2 1図は、 光熱変換検出法によるァー G T P活性の測定結果を示す グラフである。
第 2 2図は、 光熱変換検出法によるアルブミン濃度の測定結果を示す グラフである。
第 2 3図は、 光熱変換検出法による A S T活性の測定結果を示すグラ フである。
第 2 4図は、 光熱変換検出法による尿酸濃度の測定結果を示すグラフ である。
第 2 5図は、 光熱変換検出法によるグルコース濃度の測定結果を示す グラフである。
第 2 6図は、 光熱変換検出法による総コレステロール濃度の測定結果 を示すグラフである。
第 2 7図は、 光熱変換検出法による H D L—コレステロール濃度の測 定結果を示すグラフである。
第 2 8図は、 光熱変換検出法による L D L—コレステロール濃度の測 定結果を示すグラフである。
第 2 9図は、 光熱変換検出法による中性脂肪濃度の測定結果を示すグ ラフである。
第 3 0図は、 光熱変換検出法によるクレアチニン濃度の測定結果を示 すグラフである。
第 3 1図は、 乳びを呈する検体中の総コレステロール濃度の光熱変換 検出法による測定結果を示すグラフである。
第 3 2図は、 乳びを呈する検体中の総コレステロール濃度の吸光度法 による測定結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
(実施例 1 )
H e— N eレーザ一を励起光として用いた熱レンズ検出法によるへモ グロビンの測定において、 血液試料の希釈度合いと熱レンズ検出法によ る出力との直線性について検討を行った。 以下に、 その内容を説明する 光熱変換検出装置の構成は、 以下の通りである。 顕微鏡にはステージ 上での測定試料の取り扱いの容易さを勘案し、 倒立型顕微鏡 （ 1 X 7 0、 Olympus製） を使用した。 これは落射型の顕微鏡であっても構わない。 この顕微鏡は、 顕微鏡外の光学系により同軸にされたレーザー光を導入 できるよう改造を加えてある。
レーザ一は、 励起用には H e — N eレーザー （ 6 3 3 n m、 1 0 mW、 エドモントサイエンティフィ ック製） を、 検出用 （プローブ光） には半 導体レーザー （ 7 8 0 n m、 日本科学エンジニアリング社 L D T 7 8 3 0 ) を使用した。 ミラー， ビームェクスパンダー等の光学系はメスグリ ォ社製品で統一した。
励起用のレーザ一光はライ トチョッパーにより変調された後、 ダイク 口イツクミラ一により検出用レーザーと同軸にされ、 顕微鏡に導かれ測 定試料に照射される。 測定試料を照射した後、 同軸にされたレーザー光 の内、 励起光のみを選択的にフィル夕一により除去しフォトセンサーに 導く。 レーザー光の受光部分の素子には、 取り扱いの簡便性を考えファ ィバ一付きのフォトセンサ一アンプ （C 6 3 8 6、 浜松ホトニクス社 製） を使用した。 このフォトセンサー受光部は、 ピンホールを持つカバ 一で覆われている。 フォトセンサー及びセンサーアンプからの出力は低 雑音プリアンプ （L I一 75 A、 ェヌエフ回路プロヅク社製） で増幅さ れた後、 ロックインアンプに導かれ信号処理される。
このような熱レンズ検出装置を用いて、 血液試料の希釈度合いとへモ グロビンの定量性との関係を、 以下のように検討した。
へパリンを加えた健常人の血液 （ヘモグロビン濃度は 1 6 g/d β ) を血液試料として用いた。 測定試薬には、 フヱリシアン化カリウム、 Μ E S、 トリ トン X— 1 00を、 それぞれ 8mM、 1 0mM、 0. 8重量 %の濃度で溶解させた溶液 （pH 6. 0) を用いた。
測定試料中のヘモグロビン （Hb) 濃度が 640 O gZmjgの場合 は、 血液試料 40〃 £に前記測定試薬を 9 60 加え （混合比は 1 ： 24) 混合し、 室温で 5分以上静置した後に、 熱レンズ検出法により測 定した。 測定試料中の Hb濃度が 640 g/mjgの場合は、 血液試料 4 に測定試薬 9 9 6〃 を加え混合し、 測定試料中の Hb濃度が 3 84〃 g/m の場合は、 P B Sで 6 0%に希釈した血液試料 4 に 測定試薬 9 9 6 を加え混合し、 測定試料中の Hb濃度が 1 2 8 g /m の場合は、 PB Sで 2 0 %に希釈した血液試料 4 に測定試薬 996 Qを加え混合した。
こうして得られた各測定試料を、 5 0 zmの深さ， 数 mmの幅の溝を 持つ平板ガラス製キュベッ ト （G L S c i e n c e s社製 Qu a r t z C e Q G T e AB 2 0 - SQ- 0. 0 5) に移し、 このキ ュベッ トを倒立顕微鏡のステージ上に設置した。 このキュベッ トは、 複 雑な溝パターンを有するマイクロチップのモデル版として、 幅広ではあ るが溝深さはマイクロチップと同程度のものを採用した。 熱レンズ検出 法においては、 溝の幅は数十/ zm以上あれば、 それより広くても大きな 支障はない （ただし、 溝内での拡散混合などには影響がある） 。 溝深さ は、 樹脂製のマイクロチップなどにおいては、 金型の母型の製作の点か ら制限があり、 熱レンズ検出法の感度にも大きな影響がある。 よって、 本実施例で用いた平板ガラス製キュべットと、 後述する樹脂製のマイク 口チップとは、 ほぼ同程度の溝深さとした。
対物レンズの焦点合わせには、 励起用レーザーを使用した。 すなわち、 モニター画面を参照しつつ、 ガラス製キュべッ 卜の溝の縁辺の位置での 焦点合わせを実施した。 そして、 その後、 溝のほぼ中央部で熱レンズ検 出を行った。
励起用レーザ一は、 ライ トチョッパーにより 3 2 8 9 H zに変調され、 メ トヘモグロビンを励起し発熱を生じさせた。 このライ トチョッパーに よる変調の周波数は、 S /N比等の影響により変更することも有り得る c この発熱により発生した熱レンズにより検出用レーザ一の焦点位置がず れ、 それによりピンホールを通じたフォトセンサーの受光量が発熱量に 応じ変化する。 フォトセンサーからの信号は口ックインアンプにより処 理されるが、 ここでは時定数として 1秒を用い、 ライ トチョッパーと同 じ周波数 3 2 8 9 H zの信号のみを選択的に出力として用いた。
この結果を第 8図に示す。 縦軸は熱レンズ検出法による出力の強度 ( mV ) 、 横軸上段は、 血液試料中のヘモグロビン濃度、 横軸下段は、 測定試薬を混合後の測定試料中のへモグロビン濃度である。
(実施例 2 )
有機ポリマ一製のマイクロチップを用い、 励起光として 6 3 5 n mの 半導体レーザーを用いて、 血液試料中のへモグロビンの測定を行った。 以下にその内容を説明する。
マイクロチップを構成する、 表面に溝を有する平板状部材は、 射出成 形により成形した。 射出成形に使用した樹脂は、 メ夕クリル樹脂 （旭化 成工業製デルぺッ ト 8 0 N H ) である。 ガスとしては純度 9 9 %以上 の二酸化炭素を使用し、 その圧力は I M P aとした。 成形機は住友重機 械工業製 S G 5 0を使用した。 成形品は、 厚み 2 mmで、 縦横が 1 2 0 mm , 6 0 mmの平板状部材である。
この平板状部材の表面には、 幅 1 0 0〃m , 深さ 5 0 ju , 長さ 3 c mの直線状の溝が設けられている。 そしてその溝の両端には、 測定試料 を導出入する貫通孔を設けるための円形溝 （直径 3 mm， 深さ 5 0〃 m ) が形成されている。 その円形溝に、 ドリル等により直径 2 mmの貫 通孔をあけて、 測定試料の導出入部とした。
なお、 金型の母型は、 シリコンを R I Eの手法でエッチングしたもの や、 D F R (ドライフィルムレジスト） で光硬化させたものが使用でき る。 母型を電錶してスタンパ一を作成後、 平板状部材を射出成形して、 これらを比較したところ、 どちらの母型もほぼ同じ成形品が得られた。 また、 金型の表面状態の転写性は、 光学顕微鏡による観察及びレーザ 一顕微鏡による形状測定で評価する。 また、 成形品も、 光学顕微鏡によ る観察、 切断断面の溝形状の光学顕微鏡や電子顕微鏡での観察、 レーザ 一顕微鏡による形状測定等で観察する。
こうして得られた平板状部材の溝を有する面に、 2 0 0 in厚みのメ タクリル樹脂シートに光硬化型接着剤を塗布したものを貼り合わせた。 そして、 U V光を照射して、 両端のみが開放されたキヤビラリを形成さ せ、 これを測定用のマイクロチップとした。
光熱変換検出装置としては、 基本的には実施例 1に記載の装置を用い た。 ただし、 励起光用レーザ一を、 6 3 3 n mの H e— N eガスレーザ —から 6 3 5 n mの発光を持つ半導体レーザー （三洋電機社製 D L— 4 0 3 8 - 0 2 5 ) に変え、 それに伴い光学系を調整した。
測定試料としては、 へパリンを加えた健常人血液 （ヘモグロビン濃度 は 1 6 g/ d ） を、 測定試薬 （フェリシアン化カリウム、 M E S、 ト リ トン X— 100を、 それぞれ 8 mM、 10mM、 0. 8重量％の濃度 で溶解させた溶液 （pH 6. 0) ) と混合し反応させたものを用いた。 すなわち、 測定試料中のヘモグロビン濃度が 6400〃g/mjgの場 合は、 前記血液試料 40 に前記測定試薬を 960 加え混合し、 測定試料中のヘモグロビン濃度が 640 / g/m の場合は、 血液試料 4 / に を加えたものに測定試薬液 996 を加え混 合し、 それぞれ室温で 5分以上静置したものを用いた。
これらの測定試料 2〃 & (これに含まれている検体血液量は 40 η £ 及び 4 η ) を、 前述のように作成したマイクロチップの貫通孔からキ ャビラリに導入し、 熱レンズ検出法による出力を測定した。 その結果、 ヘモグロビン濃度 640〃g/m では 0. 5mV、 6400〃g/m では 5 mV程度の出力が検出された。
(実施例 3)
次に、 血液試料と測定試薬とを混合， 反応させる測定試料の調製と、 熱レンズ検出法による測定試料のヘモグロビン測定とを、 有機ポリマ一 製のマイクロチップ中で行った例について、 その内容を説明する。
光熱変換検出装置は、 実施例 2と同様のものを用いた。
また、 マイクロチップについても、 実施例 2と同様の方法で作成した。 まず、 第 9図のような表面に溝を有する P MM A製の平板状部材 3 1を、 射出成形により成形した。 該平板状部材 3 1の外形寸法は実施例 2と同 じである。 そして、 この平板状部材 3 1の円形溝 1， 2の部分に、 ドリ ルで直径 1 mmの貫通孔をあけて、 血液試料及び測定試薬の導入部とし た。 また、 同様に、 円形溝 3の部分に貫通孔をあけて、 廃液の導出部と した。
こうして得られた貫通孔を有する平板状部材 3 1の溝を有する面に、 厚み 200 zmのメ夕クリル樹脂シートに光硬化型接着剤を塗布したも のを貼り合わせた。 そして、 UV光を照射して、 溝の端部のみが閧放さ れたキヤビラリを形成させ、 これを測定用のマイクロチップとした。 第 9図は、 形成されたキヤビラリの流路形状を示すものである。 流路 の端部には、 血液試料用リザ一バ 1、 測定試薬用リザ一バ 2、 及び廃液 溜め 3が設けられており、 両リザーバ 1， 2及び廃液溜め 3の貫通孔部 分を除く大きさは、 直径 3mm, 深さ 50〃mである。
キヤビラリ （流路） はすべて、 深さ 50〃m、 幅 150〃mであり、 長さは、 流路 1 1が 9mm、 流路 12が 9mm、 流路 13が 65 mmで ある。 流路 13には、 光熱変換検出法 （熱レンズ検出法） による検出部 21が設けてあり、 流路 1 1と流路 12との合流点 22から検出部 21 までの距離は 6 Ommである。
測定試薬としては、 フェリシアン化カリウム、 MES、 トリ トン X— 100を、 それぞれ 8mM、 10mM、 0. 8重量％の濃度で溶解させ た溶液 （pH6. 0) を用いた。 血液試料としては、 へパリンを加えた 健常人血液 （へモグロビン濃度は 16 g/d d ) 、 及びそれを PB Sで 希釈してヘモグロビン濃度を 10 g/d £に調整したものを用いた。
25 のマイクロシリンジ （ハミルトン社製） に血液試料を 4 取り、 該マイクロシリンジをテフロンチューブにより、 血液試料用リザ —バ 1の貫通孔に連結した。 また、 別のマイクロシリンジに測定試薬を 20 取り、 該マイクロシリンジを別のテフロンチューブにより、 測 定試薬用リザーバ 2の貫通孔に連結した。
両マイクロシリンジを 2台のマイクロシリンジポンプ （ハーバ一ド社 製） に別々に装着し、 血液試料の流速が 0. 2〃 /hr、 測定試薬の 流速が 4. 8〃 /hrになるように、 各マイクロシリンジポンプを設 定した。 これで、 血液試料と測定試薬との混合比は 1 ： 24となる。 混 合後の反応時間は、 第 9図の流路 13を流れる時間であるので、 5. 4 分程度となる。
室温下で前記両マイクロシリンジポンプを駆動させ、 熱レンズ検出法 による出力を測定した。 その結果、 ヘモグロビン濃度 16g/d の血 液試料で 4. OmV程度の出力が得られ、 ヘモグロビン濃度 10 g/d に調整した希釈血液試料では、 2. 5 mV程度の出力が得られた。 (参考例 1 )
プローブ光の光源として、 488 nmに発光を持つ A rレーザ一を用 いた以外は、 実施例 1と同様にして、 ヘモグロビンの測定を行った。 血液試料としては、 へパリンを加えた健常人 2名の血液 （へモグロビ ン濃度は 16 g/d ) を、 検体 1及び検体 2として用いた。 これらの 血液試料を PBSで 60%, 20%になるように希釈し、 0. 6 x検体， 0. 2 X検体とした。 この希釈検体又は希釈しない血液試料 （ 1 X検 体） 4〃 に、 測定試薬 （フェリシアン化力リゥム、 ME S、 トリ トン X— 100を、 それぞれ 0. 61mM、 10mM、 0. 8重量％の濃度 で溶解させた溶液 （pH 6. 0) ) を 996〃 加え混合し、 室温で 5 分以上静置した後に熱レンズ検出法による測定を行った。
その結果を表 1に示す。 なお、 表 1中の数値はバックグラウンドを差 し引いた後の熱レンズ検出法による出力である。
この結果から明らかなように、 全体に熱レンズ検出法による出力が安 定せず、 特に希釈検体で異常な高値を示した。 これらの現象は、 前述の 各実施例では見られなかったものである。
このような現象が起こる原因の一つとしては、 633 nmの励起光と、 488 nmのプロ一ブ光とが同時に照射されることにより、 へモグロビ ンの種々の励起状態が惹起され、 ェキサイプレックスのような光反応が 生じたか、 あるいは、 血液中の他の成分が 488 nmの光を吸収して、 ヘモグロビンと相互作用したことが考えられる。 しかし、 詳細は明かで はない (
(表 1 ) 検体 1 検体 2
20 %希釈 200〜300 mV 3mVから 10分後には
25 OmVまで増加
60%希釈 2〜 6 mV 3〜6mV 漸増 希釈なし 6mV 不安定 3. lmVで安定
(実施例 4)
本発明の一実施例として、 光熱変換検出法により血清中の A LP活性 の定量測定を行った結果を示す。
(光熱変換検出系の構成）
光熱変換検出系 （光熱変換検出装置） としては、 実施例 1と同じ基本 構成のものを用いた。 ヘモグロビン以外の物質の測定における該光熱変 換検出系による測定の一般的な手順は、 以下の通りである。
溝パターンを有する平板マイクロチップ （あるいは、 測定試料を入れ たガラス製のセル。 該ガラス製のセルの深さは 50 , 100， 200 , 500〃m) を倒立顕微鏡のステージ上に載置する。 対物レンズの焦点 合わせには励起用レーザーを使用し、 モニタ一画面を参照しつつ溝パ夕 ーンの上辺及び下辺の位置での焦点合わせを実施した後、 その中間点を 溝の中心位置とした。
焦点合わせの後、 前述したような検体と測定試薬との反応を行わせ、 反応生成物を含む溶液を検出部分に導く。 励起用レーザーはライ トチヨ ッパ一により 1 1 7 0 H zに変調され、 溝内の反応生成物を励起し発熱 を生じさせる。 このライ トチョッパーによる変調の周波数は、 S /N比 等の影響により変更することも有り得る。
この発熱により発生した熱レンズにより検出用レーザーの焦点位置が ずれ、 それによりピンホールを通じたフォトセンサーの受光量が発熱量 に応じ変化する。 測定中は、 測定試料は流動が停止した状態でも、 流動 している状態でも構わないが、 本実施例では停止した状態で測定を行つ た。 フォトセンサ一からの信号はロックィンアンプにより処理されるが、 ここでは時定数として 1秒を用い、 ライ トチョッパーと同じ周波数 1 1 7 0 H zの信号のみを選択的に出力として用いた。 口ックインアンプの 出力電圧は励起光により励起される反応生成物の濃度に比例するため、 反応生成物の定量化が可能である。
(測定試薬の調製）
J S C C常用基準法にしたがって、 前述と同様に緩衝液 1を作製した c そして、 血液試料と反応させる直前に、 基質として B C I P (和光純薬 工業株式会社） を最終の濃度で 3 0 , 1 5 , 及び 7 mMになるように緩 衝液 1に溶解し、 A L P測定試薬 （測定試薬） を調整した。
(検体：標準血清の調製）
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） 2 5 0 0 で溶解し A L P活性が、 計算値で 3 0 2 I U になるように調製し、 ストック溶液とした。 次に、 ストック溶液を 精製水で希釈して、 計算値で 1 0 1 1 U / 及び 5 1 I U/ の A L P 活性を含む溶液を調製した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものと を検体とした。
(AL P活性の検出）
AL P測定試薬 1 0 0 0〃 と検体 2 5 ju 2とを試験管の中で十分混 和し、 3 7°Cで正確に 2分 3 0秒間保温する。 その後、 該混合溶液 （測 定試料） を、 5 0〃mの深さを有する平板ガラス製キュベッ ト （GL S c i e n c e s社製 Q u a r t z C e £ £ T yp e AB 2 0 - S Q- 0. 0 5 ) に移し、 このキュベッ トを 3 7°Cの空気恒温装置の付 いた倒立顕微鏡のステージ上に設置する。 対物レンズの焦点合わせは、 ロックインアンプの出力値を見ながら、 最高値を示す位置を指標に行う c 測定開始から約 1 5分間の熱レンズ検出法による出力を前述のソフ ト ウェア L a b V I EWにより処理した。 すなわち、 得られた曲線を直線 回帰し、 回帰した直線の傾きを 1秒当たりに生じた反応量として数値化 した。 この間、 キュベッ トは、 顕微鏡のステージ上で 3 7°Cに空気恒温 されている。 上記測定で得られた結果を、 第 1 0図に示す。
(比較例 1 )
本発明の一比較例として、 不溶性の基質 （B C I ) の沈殿が生じるこ とにより、 熱レンズ検出法による測定が困難であった例を示す。
(光熱変換検出系の構成）
実施例 4と同様の構成である。
(測定試薬の調整）
実施例 4と同様に調整した。 ただし、 B C I P濃度は 7 O mMとした c (検体の調整）
実施例 4と同様に調整した。 ただし、 AL P活性は 8 0 0 I U/jgと した。
(A LP活性の検出） 実施例 4と同様にして行った。 その結果、 第 11図に示すように、 B C I P濃度が 7 OmMの A LP測定試薬では、 安定した熱レンズ検出法 による出力が得られず、 反応が生じた量を測定することができなかった < これに対して、 BC IP濃度が15mMのALP測定試薬では、 経時的 に安定した傾きの熱レンズ検出法による出力が得られた。
また、 B C I P濃度が 70 mMの A LP測定試薬を 4 °Cで数時間保冷 した結果、 B C I Pの再結晶が認められた。 この現象は、 BC I P濃度 が 35 mMの A LP測定試薬でも認められたが、 B C I P濃度が 15m M以下の A L P測定試薬では認められなかった。
このことから、 熱レンズ検出法による出力が安定しなかった原因は、 有色の微細結晶が生成し、 この微細結晶 （微細粒子） により散乱が生じ たためであると考えられた。
(比較例 2)
本発明の一比較例として、 不溶性の基質 （BCI) の微細結晶が生じ た場合でも、 吸光度測定は可能である例を示す。 ALP測定試薬及び検 体は、 実施例 4と同様にして調製したものを用いた。 吸光度計は、 島津 社 UV 2200を用いた。 その結果、 第 12図に示すように、 B C I P 濃度が 70mMの ALP測定試薬を用いた場合でも検量線が得られた。
(実施例 5)
キヤビラリ （溝） を備えた樹脂製のマイクロチップを用いて、 ALP 測定試薬及び検体の流量を制御しながら A L P活性の定量を行った。 送 液及び流量の制御は、 各液溜めに配管で連結されたマイクロシリンジを、 直列に繋がれた一台のシリンジポンプとシリンジポンプを改良した微量 ベリス夕ポンプとを用いて駆動することにより、 機械的に行った。 以下 にその詳細を説明する。
(マイクロチップの作製） マイクロチップは、 実施例 3とほぼ同様にして作製した。 成形された 平板状部材 3 1の寸法は、 縦 1 2 0 mm , 横 8 0 mm , 厚み 5 mmで、 第 9図と同様のパターンの溝が形成されている。
液溜め 1〜3の部分には、 直径 1 . 5 mmの貫通孔がドリル等により 設けられている。 液溜め 1は検体用、 液溜め 2は測定試薬用、 液溜め 3 は廃液用である。 なお、 測定試薬を 2種類用いて測定する場合は、 溝 1 3の合流点 2 2と検出部 2 1との間の適切な位置に、 さらに液溜め 4を 設けたパターンを有するマイクロチップを用いる。
溝の深さはすべて 5 0 2 m、 溝の幅及び長さは、 溝 1 1は幅 5 0〃m 及び長さ 5 mm、 溝 1 2は幅 5 0〃m及び長さ 5 mm、 溝 1 3は幅 1 0 0 m及び長さ 9 mmである。 この平板状部材 3 1の溝を有する面に、 3 0 0 z m厚みのメ夕クリル樹脂シ一トを、 メタァクリレートモノマー で溶解したアクリル系光硬化性接着剤により貼り合わせた。
そして、 ディスポ一ザブルの注射針をその根本から 3 mm程度の位置 で切断し、 先端部分を除去することにより、 円錐形の外付け液溜めを作 製した。 この外付け液溜の大きさは、 内径 4 mm、 高さ 1 0 mmであつ た。 3個の外付け液溜めを、 液溜め 1〜3にそれぞれ連通するように、 平板状部材 3 1に接着しマイクロチップを完成した。
(送液系の構成）
マイクロシリンジ 4 1 , シリンジポンプ 4 0 , 及びシリンジボンプを 改良したベリス夕ポンプ 5 0から構成される送液系を第 1 3図に示す。 また、 ベリス夕ポンプ 5 0の構成を説明する概略図を第 1 4図に示す。 シリンジポンプ 4 0 (ハーバード社製） に取り付けられたマイクロシ リンジ 4 1， 4 1 (ハミル卜ン社製、 容量は 5 0 0 の先端と、 ぺ リス夕ポンプ 5 0に取り付けられたベリス夕チューブ 5 1 , 5 1 (内径 2 5 0 ja m ) の一端とが、 エチレンビニルアセテートチューブ 4 2， 4 2 (内径 3 5 0〃m) により連結されている。 そして、 ペリスタチュー ブ 5 1 , 5 1の他端とマイクロチップ 6 0の液溜め 1 , 2に連通する 2 つの外付け液溜め 6 1 , 6 1とが、 S U S製のチューブ 5 2， 5 2によ り連結されている。
ペリス夕ポンプ 5 0においては、 チューブストッパ 5 5によりべリス 夕ポンプ 5 0に固定されたベリス夕チューブ 5 1が、 口一ラー 5 3とァ ルミ平板 5 4との間に挟まれている。 そして、 ローラ一 5 3がべリス夕 チューブ 5 1の長手方向に移動することにより、 ベリス夕チューブ 5 1 内の液体がポリマ一チップ 6 0の方へ押し出されるようになつている。 このような構成により、 A L P測定試薬及び検体が流量を制御されて、 マイクロシリンジ 4 1からマイクロチップ 6 0に送液されるようになつ ている。
(光熱変換検出系の構成）
光熱変換検出系 （光熱変換検出装置） としては、 実施例 1と同じ基本 構成のものを用いた。 ただし、 励起光用レーザ一を、 波長が 6 3 3 n m の H e — N eガスレーザ一から 6 3 5 n mの発光をもつ半導体レ一ザ一 (三洋電機社製 D L— 4 0 3 8 - 0 2 5 ) に変更した。 そして、 その変 更に伴い光学系を調整した。
(測定試薬の調整）
実施例 4と同様に調整した。 ただし、 B C I P濃度は 1 5 mMとした c (検体：標準血清の調製）
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） 2 5 0 0〃 で溶解し、 A L P活性が計算値で 3 5 0 I U / になるように調製し、 ストック溶液とした。 次に、 ストック溶液を 精製水で希釈して、 A L P活性が計算値で 1 7 5 I U/ 及び 1 0 0 I U/ である溶液を調製した。 さらに、 前記 2つの溶液及び精製水各 2 0〃 に 480 の緩衝液 1を混合し、 これらを検体として用いた。 各液には、 流動を確認するための直怪 0. 5〃mのラテックスビーズ (大塚電子株式会社製、 平板試料用セルモニター粒子） の懸濁液を、 少 量 （ 0. 1 V o £ %) 添加した。
(ALP活性の検出）
シリンジ等を用いて手動により、 液溜め 1に測定試薬を、 液溜め 2に 検体を注入した。 両液を注入したマイクロチップ 60を、 37°Cの空気 恒温装置を取り付けた倒立顕微鏡のステージ上に設置した。
次に、 マイクロチップ 60の液溜め 1及び液溜め 2と、 ペリス夕ボン プ 50に取り付けられたベリス夕チューブ 51とを、 S U Sチューブで 連結して、 第 13図に示すような構成の送液系を完成した。
シリンジポンプ 41を駆動させることにより、 測定試薬及び検体を 6 00 /£/hの流量で約 3分間流して、 マイクロチヅプ 60のキヤビラ リ中に前記両液を送り込んだ。 その後、 シリンジポンプ 41を停止して、 実施例 4と同様の方法により ALP活性の測定を行った。 その結果、 第 15図に示すような検量線が得られた。
(実施例 6)
(粒度分布測定）
ALP測定試薬と検体 （生体成分由来試料） とを混合して得られた測 定試料には、 微細結晶が存在する場合がある。 この微細結晶の粒度分布 を測定したので、 その結果について説明する。
B C I P濃度が 7 OmM及び 6. 25 mMの A LP測定試薬 25 m £ と、 A LP活性を計算値で 800 IU/βに調製した標準血清 （検体） とを、 以下のように混合したもの （試料 1〜4) をそれぞれ用意した。 まず、 試料 1は、 BC I Ρ濃度が 7 OmMの A LP測定試薬に、 標準 血清 2500 £を混合し、 37°Cで 3日間反応したものである。
次に、 試料 2は、 B C I P濃度が 7 OmMの AL P測定試薬に、 標準 血清 625〃 を混合し、 37°Cで 3日間反応したものである。
さらに、 試料 3は、 BC I P濃度が 6. 25mMの ALP測定試薬に、 標準血清 625〃 βを混合し、 37 °Cで 3時間反応したものである。 さらに、 試料 4は、 BC I P濃度が 6. 25 mMの A LP測定試薬そ のものである （標準血清は混合せず） 。
測定装置には、 HORIBA L A— 910型レーザ一回折/散乱式 粒度分布測定装置を用いて、 粒度分布測定を行った。 具体的には、 約 5 Om£の精製水が入った前記測定装置付随の超音波分散バスに 10m の試料 1〜4を添加し、 測定を行った。 粒度分布の測定条件である相対 屈折率は、 1. 26— 0. 00 iとした。
測定の結果を第 16図に示す。 ALP測定試薬と標準血清とを混合し 反応して得られた測定試薬中には、 前記反応の結果生成する B C I 2が 存在する。 そして、 その BC 12の粒子 （微細結晶） は、 おおよそ数百 nmの粒径を有することが分かった。
また、 粒度分布の測定結果より、 数// mの大きさの粒子も存在するこ とが明らかになった。 ただし、 反応時間が長時間である試料、 すなわち、 反応時間が 3日間である試料 1， 2の場合は、 粒径が数百 nmの粒子が 主に存在することから、 数 zmの大きさの粒子は B C I Pであると考え られる。 しかし、 BC I Pの粒子が、 どのような状態で存在するのかは 不明である。
よって、 熱レンズ検出法に適した測定試薬としては、 測定試薬と生体 成分由来試料との反応生成物として色素粒子を生成しないことが必要で ある。 また、 ALP測定試薬の B C I P濃度や反応時間も適切なものと する必要がある。 なお、 測定試薬と生体成分由来試料との反応以前に、 BC I 2の粒子 等の微細結晶が存在することが好ましくないことは言うまでもない。
(実施例 7)
本発明の一実施例として、 血清中の L D H活性の定量測定を行った結 果を示す。 なお、 該測定は、 樹脂製のマイクロチップ内で、 光熱変換検 出法により行った。
(光熱変換検出系の構成）
光熱変換検出系 （光熱変換検出装置） としては、 実施例 1と同じ基本 構成のものを用いた。 ただし、 励起光用レーザ一を、 波長が 633 nm の H e—N eガスレーザーから 635 nmの発光を持つ半導体レ一ザ一 (三洋電機社製 DL— 4038— 025) に変更した。 そして、 この変 更に伴って、 光学系を調整した。
(測定試薬の調整）
測定試薬キッ トである LDHカイノス （カイノス社製） を利用して、 測定試薬を作製した。
すなわち、 LDHカイノスから発色色素である N T Bを除いたものに、 2,2， -Dibenzothiazolyl-5, 5' -bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylpheny 1] - 3，3， - (3，3， -dimethoxy-4, 4， -bisphenylen)ditetrazolium disodium salt (株式会社同仁化学研究所製、 WS T— 5) を添加した。 より具 体的には、 NTBを除いた LDHカイノス （基質緩衝液） 1 6m に、 0. 5 mMの WS T— 5を溶解し、 次に、 反応試薬を溶解して測定試薬 とした。
(検体：標準血清の調製）
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） 5m で溶解し、 LDH活性が計算値で 700WUになる ように調製し、 ストック溶液とした。 次に、 ス トック溶液を精製水で希 釈して、 計算値で 4 0 0WU及び 1 0 0 11の1^011活性を含む溶液を 調製した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
(L DH活性の検出）
実施例 5と同様の方法により、 LD H活性の測定を行った。 その結果、 第 1 7図に示すような検量線が得られた。
(実施例 8 )
(T Pの測定）
測定試薬には、 カイノスォ一トシリーズ T P試薬 （カイノス株式会 社） を仕様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 T P濃度が計算値で 9. 7 5 g d £, 7. 5 g/d 及び 5. 0 g/d となるように調整した。 そして、 これら の溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 前記検体と前記測定試薬との混合， 反応を、 前記測定試薬の仕様書に従 い行った。 その後、 測定試料を 5 0 /mの深さを有する平板ガラス製キ ュベッ ト （GL S c i e n c e s社製 Qu a r t z C e £ 2 T y p e AB 2 0— S Q— O . 0 5 ) に移し、 このキュベッ トを倒立顕微 鏡のステージ上に設置した。 対物レンズの焦点合わせは、 ロックインァ ンプの出力値を見ながら、 最高値を示す位置を指標にして行う。 この最 高値を前述のソフ トウエア L a bV I EWにより処理して、 T P濃度の 測定を行った。 その結果、 第 1 8図に示すような検量線が得られた。
(実施例 9 )
(尿素窒素の測定） 測定試薬には、 自動分析用試薬 「生研」 UN— I (デン力生研株式会 社） を仕様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスイ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 尿素窒素濃度が計算値で 99. 4mg/d 、 24. 9mg/d 、 及び 6. 2 m g/d となるように調整した。 そ して、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして尿素窒素濃度の測定を行った。 その結果、 第 19 図に示すような検量線が得られた。 .
(実施例 10)
(総ピリルビンの測定）
測定試薬には、 総ピリルビン測定用 HAテストヮコ一総ピリルビン I I— HAテストヮコー （和光純薬工業株式会社） を仕様書に従い用いた ( 検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 総ピリルビン濃度が計算値で 1. 68mg/d 0. 4mg/d 、 及び 0. 1 mg/d となるように調整した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして総ピリルビン濃度の測定を行った。 その結果、 第 20図に示すような検量線が得られた。
(実施例 1 1 )
(ァ— G TP活性の測定）
測定試薬には、 ァ— GTPカイノス （カイノス株式会社） を仕様書に 従い用いた。 検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 ァ— G TP活性が計算値で 1 2 1 I U / 、 8 0 I U/ 、 及び 40 I U/ となるように調整した。 そして、 これら の溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にしてァ— G TP活性の測定を行った。 その結果、 第 2 1図に示すような検量線が得られた。
(実施例 1 2)
(アルブミンの測定）
測定試薬には、 アルブミン試薬 · A (国際試薬株式会社） を仕様書に 従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 アルブミン濃度が計算値で 7. 0 g/d 4. 7 1 g/d 、 及び 2. 35 g/d dとなるように調整した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にしてアルブミン濃度の測定を行った。 その結果、 第 2 2図に示すような検量線が得られた。
以下の参考例 2〜 9に、 種々の物質の測定例を参考として示す。
(参考例 2 )
(AS T活性の測定）
測定試薬には、 TA— LNカイノス （カイノス株式会社） を仕様書に 従い用いた。 ただし、 この測定試薬は、 T A— LNカイノスに通常含ま れる TOO Sの代わりに D AOS (株式会社同仁化学研究所） を含有し ている。 その濃度は、 通常 T〇0 Sが含まれている濃度と同一である。 検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 AS T活性が計算値で 2 3 8 KU、 3 3. 6 K U、 及び 1. 7 KUとなるように調整した。 そして、 これらの溶液と精 製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 4と同様にして A S T活性の測定を行った。 その結果、 第 2 3図 に示すような検量線が得られた。
(参考例 3 )
(尿酸の測定）
測定試薬には、 ィァトロ L Q UA (ャトロン株式会社） を仕様書に 従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロ一ル A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 尿酸濃度が計算値で 9. 7 Q mg/d Q^ 6. 5 3mg/d 、 及び 3. 2 5mg/d Άとなるように調整した。 そし て、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして尿酸濃度の測定を行った。 その結果、 第 2 4図に 示すような検量線が得られた。
(参考例 4 )
(グルコースの測定）
測定試薬には、 デ夕ミナ— GL · Ε (協和メデックス株式会社） を仕 様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール Α (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 グルコース濃度が計算値で 305mg/d 、 101. 7 mg/d 、 及び 50. 9 m g/d となるように調整した c そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にしてグルコース濃度の測定を行った。 その結果、 第 2 5図に示すような検量線が得られた。
(参考例 5)
(総コレステロールの測定）
測定試薬には、 総コレステロール測定用 HAテス トヮコーコレステロ ール E— HAテストヮコ一 （和光純薬工業株式会社） を仕様書に従い用 いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 総コレステロール濃度が計算値で 80 Omg/ d 、 400 mg/d £ , 及び 200 m g/d となるように調整した c そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして総コレステロール濃度の測定を行った。 その結果、 第 26図に示すような検量線が得られた。
(参考例 6 )
(HD L—コレステロールの測定）
測定試薬にはコレステスト HDL (第一化学薬品株式会社） を仕様書 に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 HD L—コレステロール濃度が計算値で 76. 8 mg/d £ 48mg/d jg、 及び 24 m g/d となるように調整 した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして HDL—コレステロール濃度の測定を行った。 そ の結果、 第 2 7図に示すような検量線が得られた。
(参考例 Ί )
(L D L一コレステロールの測定）
測定試薬には、 コレステス ト LD L (第一化学薬品株式会社） を仕様 書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 LD L—コレステロール濃度が計算値で 2 70 mg/d 1 35 mg/d 、 及び 62. 5 m g/d となるように 調整した。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。 光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして LDL—コレステロール濃度の測定を行った。 そ の結果、 第 28図に示すような検量線が得られた。
(参考例 8 )
(中性脂肪の測定）
測定試薬には、 自動分析装置用試薬一 HRトリグリセライ ドー HR (和光純薬工業株式会社） を仕様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 中性脂肪濃度が計算値で 2◦ 8mg/d 、 1 0 mg/d 及び 34， 7 m g/d となるように調整した。 そし て、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして中性脂肪濃度の測定を行った。 その結果、 第 29 図に示すような検量線が得られた。
(参考例 9 )
(クレアチニンの測定）
測定試薬には、 クレアチニン測定用 Lタイプクレアチニン F (和光純 薬工業株式会社） を仕様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 クレアチニン濃度が計算値で 1. 5 8mg/d 12、 0. 7 9mg/d 、 及び 0. 3 9 m g/d となるように調整し た。 そして、 これらの溶液と精製水そのものとを検体とした。
光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にしてクレアチニン濃度の測定を行った。 その結果、 第 3 0図に示すような検量線が得られた。
次に、 乳びを呈する血液試料の測定結果について説明する。
(実施例 1 3 )
測定試薬には、 H Aテストヮコーコレステロール E— H Aテストヮコ — （和光純薬工業株式会社） を仕様書に従い用いた。
検体には、 調製法を一部改変したスィ トロール A (日水製薬株式会 社） を用いた。 具体的には、 1バイャルの凍結乾燥品を精製水 （共栄製 薬株式会社） で溶解し、 総コレステロールが計算値で 8 0 Omg/d 、 40 Omg/d 20 0mg/d £、 及び 0mg/d (精製水その もの） となるように調整した。 そして、 これらの溶液を、 干渉チェック • Aプラス （国際試薬株式会社） の乳び及び乳びブランクで、 1/1 0 に希釈したものを検体とした。 なお、 干渉チェック · Aブラスの乳びで 希釈したものが乳びを呈する検体であり、 干渉チェック · Aプラスの乳 びプランクで希釈したものが乳びを呈さない検体である。
希釈後の乳びを呈する検体のホルマジン度は、 2 1 0 0度であった。 光熱変換検出装置は、 実施例 4と同様の構成の物を用いた。 そして、 実施例 8と同様にして総コレステロール濃度の測定を行った。 その結果、 第 3 1図に示すような検量線が得られた。 第 3 1図のグラフから分かる ように、 乳びを呈する検体の検量線と乳びを呈さない検体の検量線とは、 ほぼ一致している。 この結果から光熱変換検出法においては、 乳びの影 響がほとんどないことが分かる。
次に、 同様にして調製した測定試料について、 吸光度計 （島津 U V 2 2 0 0 ) により、 波長 6 3 5 n mにおける吸光度の測定を行った。 その 結果を第 3 2図に示す。
この結果から、 乳びを呈する検体は、 乳びを呈さない検体と比較して、 吸光度が約 0 . 2程度高い値を示すことが分かった。 このことから、 吸 光度測定においては、 バックグラウンドを差し引くために、 異なる 2つ の波長において測定を行うことがが必要であることが分かる。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明の物質の測定方法によれば、 極微量の生体成分 由来試料中のヘモグロビン， A L P等の物質の量を、 光熱変換検出法に より簡便且つ短時間に測定することができる。 さらに、 本発明の物質の 測定方法によれば、 キヤビラリ中に沈殿や反応生成物の微結晶が生じる ことなく、 光熱変換検出法により安定した測定が可能である。 特に、 励 起光として長波長のレーザーを用いるので光熱変換検出装置を安価に製 造でき、 測定を低コストで行うことができる。 また、 本発明の物質の測定方法は、 試料調製工程と光熱変換検出工程 とをマイクロチップ内において行うので、 測定に要する生体成分由来試 料及び測定試薬が微量である。 さらに、 生体成分由来試料と測定試薬と を混合して測定試料を調製する操作が簡便であり、 また、 廃棄物も少な くなる。
特に、 本発明のヘモグロビンの測定方法によれば、 ヘモグロビンの安 定な測定が可能である。 そして、 測定試薬に毒物であるシアニドを含有 しないので、 測定試薬の取扱いに危険を伴うことがなく、 また、 煩雑な 廃液処理も不要である。
さらに、 本発明の物質の測定方法によれば、 臨床検査上問題になる乳 びを呈する血液試料であっても、 異なる 2つの波長において測定を行う 必要がなく、 1回の測定で定量的な測定が可能である。
また、 本発明の測定試薬を用いれば、 極微量の生体成分由来試料中の ヘモグロビン， A L P等の物質の量を、 光熱変換検出法により安定して 測定することが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生体成分由来試料中の物質を検出又はその濃度の測定を行う方法 であって、
試料調製工程と光熱変換検出工程とを備えていて、
前記試料調製工程は、 前記生体成分由来試料と測定試薬とを混合し反 応させ、 過酸化水素を誘導することなく、 前記物質とは吸収波長が異な る反応生成物を前記物質の量に対応する量だけ生成させて、 測定試料を 調製する工程であり、
前記光熱変換検出工程は、 前記測定試料に励起光を照射して、 その結 果生じる部分的な温度変化に伴う物理量変化を測定する工程であるとと もに、
前記反応生成物は水溶性を有し、 且つ、 前記励起光の波長領域におけ る前記反応生成物の吸光度は、 前記温度変化を生じさせるに足るもので あることを特徴とする物質の測定方法。
2 . 前記物理量変化が屈折率変化であり、 前記光熱変換検出工程では、 前記屈折率変化により形成される熱レンズに検出用のプローブ光を入射 させ、 該熱レンズにより生じる該プローブ光の変化を測定することを特 徴とする請求の範囲第 1項記載の物質の測定方法。
3 . 前記励起光の波長が 6 0 0 n m以上であることを特徴とする請求 の範囲第 1項又は第 2項記載の物質の測定方法。
4 . 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とをキヤビラリを有するマ イク口チップに装入し、 前記試料調製工程と前記光熱変換検出工程とを 前記マイクロチップのキヤビラリ内で行うことを特徴とする請求の範囲 第 1項〜第 3項のいずれかに記載の物質の測定方法。
5 . 前記キヤビラリは一対の平板状部材を張り合わせることにより形 成されるものであって、 前記一対の平板状部材のうち少なくとも一方が その板面に溝を備えていて、 前記一対の平板状部材は前記溝を備えた板 面を内側にして張り合わされていることを特徴とする請求の範囲第 4項 記載の物質の測定方法。
6 . 前記生体成分由来試料が血液試料であり、 前記物質がへモグロビ ンであって、 前記試料調製工程は、 前記血液試料と前記測定試薬とを混 合し溶血させて前記測定試料を調製することを特徴とする請求の範囲第
1項〜第 5項のいずれかに記載の物質の測定方法。
7 . 前記励起光の波長が 6 1 0 n mから 6 5 0 n mの範囲であり、 か つ前記プローブ光の波長が前記励起光よりも長波長であることを特徴と する請求の範囲第 6項記載の物質の測定方法。
8 . 前記励起光の波長が 6 2 0 n mから 6 4 0 n mの範囲であり、 か つ前記プローブ光の波長が前記励起光よりも長波長であることを特徴と する請求の範囲第 6項記載の物質の測定方法。
9 . 前記測定試薬が、 赤血球を溶血する濃度の中性界面活性剤と、 へ モグロビンをメ トヘモグロビンに酸化する濃度の酸化剤と、 p Hを 5か ら 7の範囲で維持する濃度の緩衝剤と、 を含むことを特徴とする請求の 範囲第 6項〜第 8項のいずれかに記載の物質の測定方法。
1 0 . 前記測定試薬がシァニドを含有しないことを特徴とする請求の 範囲第 9項記載の物質の測定方法。
1 1 . 前記血液試料と前記測定試薬との混合比が、 1 ： 1から 1 ： 2 5 0の範囲であることを特徴とする請求の範囲第 6項〜第 1 0項のいず れかに記載の物質の測定方法。
1 2 . 前記物質がフォスファタ一ゼであり、 前記測定試薬は前記フォ スファ夕一ゼに対する基質を含有するとともに、 前記試料調製工程は、 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とを混合し、 前記生体成分由来試 料中のフォスファタ一ゼと前記測定試薬中の前記基質とを反応させて測 定試料を調製することを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれ かに記載の物質の測定方法。
1 3 . 前記基質がリン酸エステル結合を有することを特徴とする請求 の範囲第 1 2項記載の物質の測定方法。
1 4 . 前記基質が、 5 _ブロモ— 4 —クロ口— 3 —インドキシルフォ スフエート及びその塩のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第 1 2項又は第 1 3項記載の物質の測定方法。
1 5 . 前記フォスファタ一ゼがアル力リフォスファターゼであること を特徴とする請求の範囲第 1 2項〜第 1 4項のいずれかに記載の物質の 測定法。
1 6 . 前記測定試料中の前記基質の濃度が、 1 〜 1 5 mMの範囲であ ることを特徴とする請求の範囲第 1 2項〜第 1 5項のいずれかに記載の 物質の測定方法。
1 7 . 前記生体成分由来試料と前記測定試薬とを混合してから、 前記 物理量変化を測定するまでの時間が、 3 〜 1 5分であることを特徴とす る請求の範囲第 1 2項〜第 1 6項のいずれかに記載の物質の測定方法。
1 8 . 乳びを呈する血液試料中の物質を検出又はその濃度の測定を行 う方法であって、 前記血液試料と測定試薬とを混合して測定試料を調製 する試料調製工程と、 前記測定試料に励起光を照射して、 その結果生じ る部分的な温度変化に伴う物理量変化を測定する光熱変換検出工程と、 を備えることを特徴とする物質の測定方法。
1 9 . 前記物理量変化が屈折率変化であり、 前記光熱変換検出工程で は、 前記屈折率変化により形成される熱レンズに検出用のプローブ光を 入射させ、 該熱レンズにより生じる該プローブ光の変化を測定すること を特徴とする請求の範囲第 1 8項記載の物質の測定方法。
2 0 . 前記血液試料と前記測定試薬とをキヤビラリを有するマイクロ チップに装入し、 前記試料調製工程と前記光熱変換検出工程とを前記マ イク口チップのキヤビラリ内で行うことを特徴とする請求の範囲第 1 8 項又は第 1 9項記載の物質の測定方法。
2 1 . 前記キヤビラリは一対の平板状部材を張り合わせることにより 形成されるものであって、 前記一対の平板状部材のうち少なくとも一方 がその板面に溝を備えていて、 前記一対の平板状部材は前記溝を備えた 板面を内側にして張り合わされていることを特徴とする請求の範囲第 2 0項記載の物質の測定方法。
2 2 . 請求の範囲第 6項〜第 1 1項の物質の測定方法において用いる 測定試薬であって、
赤血球を溶血する濃度の中性界面活性剤と、 ヘモグロビンをメ トへモ グロビンに酸化する濃度の酸化剤と、 p Hを 5から 7の範囲で維持する 濃度の緩衝剤と、 を含むことを特徴とする測定試薬。
2 3 . 請求の範囲第 1 2項〜第 1 7項の物質の測定方法において用い る測定試薬であって、 リン酸エステル結合を有する基質を備えることを 特徴とする測定試薬。
2 4 . 前記基質が、 5—プロモー 4 —クロロー 3 —インドキシルフォ スフヱート及びその塩のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第 2 3項記載の測定試薬。
PCT/JP2000/004792 1999-07-16 2000-07-17 Procede de mesure d'une substance et reactif a cet usage WO2001006243A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU60188/00A AU6018800A (en) 1999-07-16 2000-07-17 Method for measuring substance and measurement reagent to be used in the method
EP00946365A EP1211505A4 (en) 1999-07-16 2000-07-17 METHOD FOR DETERMINING A SUBSTANCE AND MEASURING LIMIT FOR USING THE METHOD
KR1020027000593A KR20020035101A (ko) 1999-07-16 2000-07-17 물질 측정 방법 및 이 측정 방법에 사용되는 측정 시약

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20340699 1999-07-16
JP11/203406 1999-07-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001006243A1 true WO2001006243A1 (fr) 2001-01-25

Family

ID=16473544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/004792 WO2001006243A1 (fr) 1999-07-16 2000-07-17 Procede de mesure d'une substance et reactif a cet usage

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1211505A4 (ja)
KR (1) KR20020035101A (ja)
CN (1) CN1129790C (ja)
AU (1) AU6018800A (ja)
WO (1) WO2001006243A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1251348A1 (en) * 2000-01-28 2002-10-23 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Photothermic transducing spectroscopic analyzer
WO2007145298A1 (ja) * 2006-06-16 2007-12-21 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology 核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置
CN106442430A (zh) * 2015-08-05 2017-02-22 首都师范大学 一种基于光热转换纳米材料温度变化的检测溶液浓度的方法
CN109668881A (zh) * 2019-01-31 2019-04-23 湖南大学 基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用
WO2020256017A1 (ja) * 2019-06-21 2020-12-24 小林製薬株式会社 乳び血漿改善剤

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008136321A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Arkray, Inc. キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる添加剤
JP5465008B2 (ja) 2007-10-30 2014-04-09 パナソニック株式会社 ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定方法、測定キット
US8613214B2 (en) 2008-01-09 2013-12-24 Orono Spectral Solutions, Inc. Apparatus and method for determining analyte content in a fluid
US8393198B2 (en) * 2008-01-09 2013-03-12 OronoSpectral Solutions, Inc. Apparatus and method for determining analyte content in a fluid
KR101247371B1 (ko) 2009-11-24 2013-03-26 연세대학교 산학협력단 적혈구의 광열효과를 이용한 세포 내외부 헤모글로빈의 차이 측정방법
KR101507313B1 (ko) * 2012-02-20 2015-04-08 연세대학교 산학협력단 광열 바이오센서를 이용한 시알산 정량측정 장치 및 방법
KR101531158B1 (ko) 2014-03-13 2015-06-25 연세대학교 산학협력단 광열효과를 이용한 헤모글로빈 농도측정장치 및 그 방법
KR101622121B1 (ko) 2014-09-26 2016-05-18 연세대학교 산학협력단 광열 광산란을 이용한 혈액 내 헤모글로빈 농도 측정 장치 및 방법
CN105067815A (zh) * 2015-09-16 2015-11-18 浙江凯成生物科技有限公司 一种测定人血清中胃蛋白酶原i/ii含量的试剂盒
CN106596409B (zh) * 2015-10-19 2019-08-09 首都师范大学 一种阶梯式检测过氧化氢溶液浓度的方法
DE112018000325T5 (de) * 2017-01-06 2019-09-19 Hoya Corporation Feststoffprobe zur Kalibrierung, Endoskop-System und Herstellungsverfahren für Feststoffprobe
EP3717903B1 (fr) * 2017-11-30 2024-01-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Procédé d'étude spectrale d'un fluide biologique
KR102094024B1 (ko) * 2017-12-29 2020-03-26 (주)큐브바이오 종양 진단을 위한 퓨린 대사체의 농도 측정장치
EP3887800B1 (en) 2018-11-30 2024-04-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale - Inserm Method for determining one content in protein and associated devices and methods
CN109323910B (zh) * 2018-12-03 2021-01-08 徐州市中心医院 一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10142177A (ja) * 1996-11-13 1998-05-29 Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk 光熱変換分光分析装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10153561A (ja) * 1996-11-22 1998-06-09 Bunshi Baiohotonikusu Kenkyusho:Kk 光熱変換分光分析装置
JP2000002675A (ja) * 1998-06-12 2000-01-07 Asahi Chem Ind Co Ltd キャピラリー光熱変換分析装置
CN1309769A (zh) * 1998-06-12 2001-08-22 旭化成株式会社 分析仪

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10142177A (ja) * 1996-11-13 1998-05-29 Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk 光熱変換分光分析装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1211505A4 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1251348A1 (en) * 2000-01-28 2002-10-23 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Photothermic transducing spectroscopic analyzer
EP1251348A4 (en) * 2000-01-28 2005-01-12 Asahi Chemical Ind SPECTROSCOPIC ANALYZER WITH PHOTOTHERMIC TRANSDUCTION
US7036979B2 (en) 2000-01-28 2006-05-02 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Photothermal transducing spectroscopic analyzer
WO2007145298A1 (ja) * 2006-06-16 2007-12-21 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology 核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置
JP2007333649A (ja) * 2006-06-16 2007-12-27 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology 核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置
US8367329B2 (en) 2006-06-16 2013-02-05 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method of detecting interaction between nucleic acid and protein, and apparatus for the same
CN106442430A (zh) * 2015-08-05 2017-02-22 首都师范大学 一种基于光热转换纳米材料温度变化的检测溶液浓度的方法
CN106442430B (zh) * 2015-08-05 2021-04-30 首都师范大学 一种基于光热转换纳米材料温度变化的检测溶液浓度的方法
CN109668881A (zh) * 2019-01-31 2019-04-23 湖南大学 基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用
WO2020256017A1 (ja) * 2019-06-21 2020-12-24 小林製薬株式会社 乳び血漿改善剤
JP2021001143A (ja) * 2019-06-21 2021-01-07 小林製薬株式会社 乳び血漿改善剤

Also Published As

Publication number Publication date
CN1129790C (zh) 2003-12-03
EP1211505A1 (en) 2002-06-05
KR20020035101A (ko) 2002-05-09
EP1211505A4 (en) 2004-06-30
AU6018800A (en) 2001-02-05
CN1370276A (zh) 2002-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2001006243A1 (fr) Procede de mesure d&#39;une substance et reactif a cet usage
CN104995310B (zh) 快速、低样品体积胆固醇和甘油三酯测定
AU746051B2 (en) Analyzer
JP3698696B2 (ja) 生体試料調製方法、生体試料定量方法及び生体試料保存容器
JP5646323B2 (ja) 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット
CN101522885A (zh) 减少流体装置中的光干扰
JP2012191953A (ja) コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
KR20170014014A (ko) 유체 장치에서 광학 간섭의 감소
US20110053192A1 (en) Method Of Rapid Detection Of An Analyte In Bodily Fluids Using A Fluorescent Dry Test Strip Biosensor
US20200166528A1 (en) Methods for Improving Assays of Biological Samples
JP2000002675A (ja) キャピラリー光熱変換分析装置
Rocca et al. Rapid quantitative assays for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and hemoglobin combined on a capillary-driven microfluidic chip
JP3421655B2 (ja) 血液分離器具及び血液分離方法
Lu et al. Rapid microfluidic fluorescence detection platform for determination of whole blood sodium
JP3895307B2 (ja) 対象物質の定量方法及び定量チップ
Karmacharya et al. Lab-on-a-disc for ultrafast plasmonic assay of cysteamine
Ren et al. based analytical device for fast colorimetric detection of total hemoglobin and free hemoglobin from human blood sample
Wang et al. An automatic whole blood analyzer for renal function analysis with a centrifugal microfluidic device
JP2001286297A (ja) コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
JP2023508910A (ja) 液体試料の分析のための方法及び装置
Tachi et al. Microchip-based homogeneous immunoassay using a cloned enzyme donor
JPH07507634A (ja) イムノアッセイ法
KR20200134925A (ko) 수용성 키토산 유도체를 포함하는 비색검출센서
JPH1118798A (ja) コレステロールの定量方法及び定量用試薬
EP3853607A1 (en) Assay

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 510831

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10031073

Country of ref document: US

Ref document number: 1020027000593

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000946365

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 008116679

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020027000593

Country of ref document: KR

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000946365

Country of ref document: EP

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 1020027000593

Country of ref document: KR

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000946365

Country of ref document: EP