CN109668881A

CN109668881A - 基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109668881A
Application number: CN201910099989.9A
Authority: CN
Inventors: 王青; 刘晓峰; 王柯敏; 羊小海; 邹利媛
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-04-23
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109668881B

Abstract

本发明公开了一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用，碱性磷酸酶便携式检测试剂盒包括二氧化锰纳米片、L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐、多巴胺和缓冲溶液。该检测试剂盒利用便携式近红外激光器对反应产物进行照射，基于其温度变化，低成本的温度计或变色测温贴片便可实现对目标物的灵敏检测，可应用于检测碱性磷酸酶，具有简便、快捷、选择性好、灵敏度高等优势。

Description

基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒及其应用。

背景技术

近年来，用于在事发地或家庭以及偏远地区快速、低成本的检测目标物(如蛋白质、核酸、小分子及离子)的便携式传感(无大型仪器及专业操作人员)研究已成为研究热点。该类产品的研究与开发对于科学研究、临床检测及生物传感领域有重大意义。随着科学技术的快速发展，即时检测(POCT)已经风靡全球，很多产品均已经商业化。然而，目前比较成熟的便携式传感器只是寥寥无几，还无法满足人们的需求。因此，发展低成本、操作简单的便携检测传感器是十分迫切的。

温度检测设备(温度计，温度贴纸等)，是我们生活中常见的家用设备，基于这些常见的设备通过简单的设计用来检测一些疾病标志物是十分有意义的。由于这些设备本身价格便宜，使用方便，且不需要专业的人才，有望用于目标物的POC检测。近些年来也有人发展了一些温度传感器(温度计)用于对疾病标志物及其他目标物进行检测，然而也存在一些不足，如需要预先采用脂质体等包埋近红外染料，光热转换能力弱等。因此，构建一个操作简单，无需复杂修饰，灵敏度高的温度传感平台是十分必要的。

碱性磷酸酶是一种膜结合酶，存在于生物组织中，可以催化多种磷酸基底物的去磷酸化过程，同时，碱性磷酸酶在细胞生长凋亡进程中的信号传导和细胞内调节过程中扮演重要角色。血浆中碱性磷酸酶的异常表达与多种疾病有关，如骨骼疾病，糖尿病，乳腺癌，前列腺癌及肝功能异常等。因此，发展更灵敏、更优选择性的检测方法去标记碱性磷酸酶水平对于多种疾病的临床诊断具有重要意义。而传统检测碱性磷酸酶活性的方法包括同位素标记法，操作复杂，耗时低效，且需要危害较大的放射性同位素标记物。研究者又创建了一些通过不同的分析技术检测碱性磷酸酶活性的新方法，如色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，光谱法，表面增强共振拉曼散射法。比色方法尽管操作简单，但是检测的灵敏度低，其他方法尽管灵敏度有所提升，但仍存在一些不足，如需要大型仪器，复杂的表面修饰以及标记等。因此发展性能优良、便携的分析方法用于碱性磷酸酶活性检测是十分重要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，可采用方便、快速检测的信号输出方式——温度进行检测，无需大型仪器和专业操作人员。还提供一种操作简便、快速、便携、灵敏度高、选择性好、且无需专业培训即可快速对碱性磷酸酶进行检测的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，包括二氧化锰纳米片、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、多巴胺和缓冲溶液。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，还包括氯化镁。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述二氧化锰纳米片的浓度为15μg/mL～20μg/mL。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的浓度为23μg/mL～46μg/mL。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述多巴胺的浓度为20～40μg/mL。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述氯化镁的浓度为0.48mg/mL～4.8mg/mL。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。

上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，优选的，所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒包括20μg/mL的二氧化锰纳米片、23μg/mL的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、0.48mg/mL的氯化镁和20μg/mL的多巴胺和Tris-HCl缓冲液。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒在检测碱性磷酸酶中的应用。

上述的应用，优选的，应用方法包括以下步骤：

(1)将二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入到缓冲液中得到检测试剂；

(2)将梯度浓度的碱性磷酸酶溶液加入所述检测试剂中孵育；

(3)加入多巴胺反应试剂进行反应；

(4)用近红外光照射，用温度计采集温度变化，以碱性磷酸酶溶液的浓度为横坐标，以温度计上温度的变化为纵坐标绘制标准曲线；根据标准曲线计算出待测碱性磷酸酶的含量；

或，用近红外光照射Ep管，观察Ep管上变色测温贴片的变化，根据碱性磷酸酶标准样品的浓度，以Ep管上变色测温贴片的变化绘制标准比色卡，根据所述标准比色卡，来与待测样品所得的条带进行对比，确定待测样品的碱性磷酸酶浓度。

上述的应用，优选的，所述(2)为将氯化镁溶液和梯度浓度的碱性磷酸酶溶液加入所述检测试剂中孵育。

上述的应用，优选的，所述(2)中孵育的时间为：30min～60min。进一步的，孵育时间为40min。

上述的应用，优选的，所述(3)中所述反应的时间为20min。所述反应时间为室温，具体为20～30℃。

上述的应用，优选的，所述(4)中所述近红外光照射的功率为0.4W/cm²～1.0W/cm²；照射的时间为8min～20min，所述近红外光照射时的温度为室温，具体为20～30℃。进一步的，所述近红外光照射的功率为0.7W/cm²；照射的时间为10min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，将碱性磷酸酶加入到检测试剂中进行催化反应，若无碱性磷酸酶存在，二氧化锰纳米片会催化多巴胺形成聚多巴胺，呈现出强的光热转换能力；而待测样品中含有碱性磷酸酶，碱性磷酸酶能够催化L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐去磷酸化，生成抗坏血酸。生成的抗坏血酸能够水解二氧化锰纳米片，则无法形成聚多巴胺纳米颗粒，表现为弱的光热转换能力。利用便携式近红外激光器对所得反应产物进行照射，基于其温度变化，利用温度传感器(如温度计或变色测温贴片)即可实现对目标物的便携式检测，不需要另外的载体包埋近红外染料及复杂的修饰步骤，属于一种新颖的信号获取方式，其不需要大型、复杂、昂贵的检测仪器和设备，利用简单、低成本的温度计或变色测温贴片便可实现对目标物的灵敏检测，有望发展为一种通用的便携式温度传感器。

(2)本发明提供了一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒的应用方法，该方法不需要复杂的修饰步骤及专业人员操作，也不需要大型或者昂贵的仪器设备，仅只需几步简便的混合及温度检测器(如温度计、变色测温贴片)就可进行碱性磷酸酶的检测，检测方式简变、快速、便携、成本低，同时特异性强，检测灵敏度高。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例中碱性磷酸酶的检测方法原理示意图。

图2为本发明实施例1中，不同浓度的碱性磷酸酶标准液的检测结果图(温度计作为信号采集)。

图3为本发明实施例1中不同浓度的碱性磷酸酶标准液的检测结果图及标准比色卡(变色测温贴片作为信号采集)。

图4为本发明实施例2中，不同缓冲液对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图5为本发明实施例3中，不同浓度的多巴胺溶液对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图6为本发明实施例4中，不同浓度的二氧化锰纳米片溶液对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图7为本发明实施例5中，不同酶催化反应时间对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图8为本发明实施例6中，不同浓度的镁离子对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图9为本发明实施例7中，不同浓度的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(AAP)对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图10为本发明实施例8中，不同近红外光照射时间对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图11为本发明实施例9中，不同近红外光照射功率对碱性磷酸酶检测的影响结果图。

图12为本发明中实施例10中，不同环境温度对碱性磷酸酶的检测结果图。

图13为本发明中实施例11中，不同物质的特异性检测结果图(温度计和变色测温贴片)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种本发明的基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，包括：20μg/mL的二氧化锰纳米片、23μg/mL的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、0.48mg/mL的氯化镁和20μg/mL多巴胺。

一种本实施例的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒在检测碱性磷酸酶中的应用，其应用方法包括以下步骤：

(1)将二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入到Tris-HCl缓冲液中((Tris-HCl缓冲液的成分为：10mmol/L Tris-HCl buffer，pH 7.4)得到检测试剂，检测试剂中二氧化锰纳米片浓度为20μg/mL，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的浓度为23μg/mL。

(2)配制碱性磷酸酶的标准溶液：以Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制浓度分别为0.1U·L^-1，0.5U·L^-1，1U·L^-1，2U·L^-1，5U·L^-1，10U·L^-1，20U·L^-1，50U·L^-1，100U·L^-1，200U·L^-1和300U·L^-1的碱性磷酸酶溶液，室温保存。

(3)将不同浓度的碱性磷酸酶溶液和氯化镁加入到步骤(1)的检测试剂中，孵育40min，检测试剂中氯化镁的浓度为0.48mg/mL。

(4)随后再加入多巴胺，使多巴胺在检测试剂中的浓度为20μg/mL，反应20min。

(5)用近红外光(近红外光的波长为780nm，功率是0.7W/cm²，激光器为普通近红外激光器或便携式近红外激光器)照射10min，用温度计采集温度变化或观察Ep管上变色测温贴片(即温度变色贴纸)的变化。其检测原理如图1所示：若无碱性磷酸酶存在，二氧化锰纳米片会催化多巴胺形成聚多巴胺，呈现出强的光热转换能力；而待测样品中含有碱性磷酸酶，碱性磷酸酶能够催化L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐去磷酸化，生成抗坏血酸。生成的抗坏血酸能够水解二氧化锰纳米片，则无法形成聚多巴胺纳米颗粒，表现为弱的光热转换能力。

以碱性磷酸酶溶液的浓度为横坐标，以温度计上温度的变化为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线的回归方程：y＝0.774x+0.039，相关系数R²＝0.9969。

图2为不同浓度的碱性磷酸酶标准液的检测结果图(温度计作为信号采集)

或者，根据碱性磷酸酶标准样品的浓度，以Ep管上变色测温贴片的变化绘制标准比色卡。

图3为不同浓度的碱性磷酸酶标准液的检测结果图及标准比色卡(变色测温贴片作为信号采集)。

(6)将待测溶液和氯化镁加入到步骤(1)的检测试剂中，孵育40min，随后再加入20μg/mL多巴胺反应试剂，室温下反应20min。用近红外光(近红外光的波长为780nm，功率是0.7W/cm²，激光器为普通近红外激光器或便携式近红外激光器)照射10min，根据标准曲线计算出碱性磷酸酶的含量。

或者，根据此标准比色卡，来与待测样品所得的条带进行对比，确定待测样品的碱性磷酸酶浓度。

实施例2：

考察不同的缓冲溶液对检测效果的影响：

将二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐分别加入到磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的成分为：10mmol/L phosphate buffer，pH 7.4，全文中磷酸缓冲液的成分均一致)、Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液的成分为：10mmol/L Tris-HCl buffer，pH 7.4，全文中磷酸缓冲液的成分均一致)、HEPES缓冲液(10mmol/L HEPES buffer，pH 7.4，全文中HEPES缓冲液的成分均一致)中，按照实施例1的方法进行检测。

检测结果如图4所示：Tris-HCl缓冲液中温度变化值最大，信号最强。因此，在后续实施例中选取Tris-HCl缓冲液作为最佳缓冲液。

实施例3：

考察多巴胺溶液浓度对检测效果的影响：

将多巴胺溶解于Tris-HCl缓冲液中，配制不同浓度的多巴胺溶液：0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL。按照实施例1的步骤，加入不同浓度的多巴胺溶液，进行检测。

检测结果如图5所示：在检测试剂中多巴胺浓度为20～40μg/mL时达到平台，温度变化值最大，信号最强。因此，在后续实施例中选取20μg/mL为最佳多巴胺溶液浓度。

实施例4：

考察二氧化锰纳米片浓度对检测效果的影响：

将二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入到Tris-HCl缓冲液中配制成不同浓度的检测试剂，其中二氧化锰纳米片的浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的浓度均为23μg/mL。按照实施例1的方法进行检测。

检测结果如图6所示：在二氧化锰纳米片浓度为20μg/mL时，温度变化值最大，信号最强。故而选取20μg/mL为后续实施例中的二氧化锰纳米片浓度。

实施例5：

考察酶催化反应时间对检测效果的影响：

按照实施例1的步骤将待测溶液加入含有二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的Tris-HCl缓冲液中，分别反应0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min，考察温度变化对检测结果的影响。

检测结果如图7所示：随着反应时间的延长，温度变化值逐渐升高，到达40min时，温度变化值达到平台，信号最强。故而选取40min为后续实施例中的最佳酶催化反应时间。

实施例6：

考察镁离子浓度对检测效果的影响：

步骤(6)中将待测溶液加入检测试剂中，同时加入不同浓度的镁离子：0.00mg/mL、0.12mg/mL、0.24mg/mL、0.48mg/mL、0.96mg/mL、1.92mg/mL和4.8mg/mL，反应40min。其余步骤与实施例1相同。

检测结果如图8所示：随着镁离子浓度的增加，温度变化值也随之提升，而当镁离子浓度高于0.48mg/mL时，达到平台。因此，选取0.48mg/mL(5mmol/L)为后续实施例中最佳的镁离子浓度。

实施例7：

考察L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度对检测效果的影响：

将二氧化锰纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入到Tris-HCl缓冲液中配制成不同浓度的检测试剂，其中二氧化锰纳米片的浓度均为20μg/mL，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的浓度分别为2.87μg/mL、5.75μg/mL、11.5μg/mL、23μg/mL、34.5μg/mL和46μg/mL。将待测溶液和浓度为5mmol/L的镁离子加入到检测试剂中，按照实施例1的方法进行检测。

考察结果如图9所示：随着L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度的增加，温度值变化也随之增加，当L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度大于23μg/mL时，温度变化值达到平台。故而选取23μg/mL为后续实施例中的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐浓度。

实施例8：

考察近红外光照时间对检测效果的影响：

步骤(6)中，用近红外光照射下(近红外光的波长为780nm，功率是0.7W/cm²，激光器为普通近红外激光器或便携式近红外激光器)，分别照射0min、2min、4min、6min、8min、10min、15min和20min；用用温度传感器监测温度变化。其余步骤与实施例1相同。

考察结果如图10所示：随着照射时间的延长，温度变化值逐渐升高，到达10min时，温度变化值达到平台，信号最强。故而选取10min为后续实施例中的最佳近红外光照射时间。

实施例9：

考察近红外光照功率对检测效果的影响：

步骤(6)中，用不同功率的近红外光(0.4W/cm²、0.5W/cm²、0.6W/cm²、0.7W/cm²、0.8W/cm²、0.9W/cm²、1.0W/cm²)照射10min；用用温度传感器监测温度变化。其余步骤与实施例1相同。

考察结果如图11所示：当功率为0.7W/cm²时，温度变化值最大，信号最强。因此，选取0.7W/cm²作为后续实施例中最佳的近红外光功率。

实施例10：

考察不同环境温度对检测效果的影响：

步骤(6)中，在不同的温度(20～30℃)，用近红外光照射下，照射10min；用用温度传感器监测温度变化。其余步骤与实施例1相同。

考察结果如图12所示：温度在20～30℃对碱性磷酸酶检测效果影响很小。因此，该发明可以在20～30℃下均可使用。

实施例11：特异性考察

一种实施例1的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒在检测碱性磷酸酶中特异性考察方法，本实施例采用碱性磷酸酶的检测试剂及近红外激发器与实施例1相同。

具体特异性考察方法包括以下步骤：

(1)配置不同物质(包括酶和蛋白)的标准溶液，作为本实施例中特异性考察的待测溶液有：辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(Gox)、葡萄糖淀粉酶(GA)、溶菌酶(LZM)、C反应蛋白(CRP)和牛血清白蛋白(BSA)，其中酶浓度均为20U/L，蛋白的浓度为2mg/mL。

(2)将上述待测溶液分别加入到与实施例1相同条件的反应体系中进行检测，记录此时的温度变化并观察Ep管变色测温贴片的颜色变化，结果如图13所示。

从图13的检测结果可以看出：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、C反应蛋白、牛血清白蛋白对检查结果几乎没有影响，只有当加入碱性磷酸酶后，温度差异才会显现，Ep管变色测温贴片颜色才会变化，由此证明本实施例的方法对碱性磷酸酶有很好的特异性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种基于温度变化的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，其特征在于，包括二氧化锰纳米片、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、多巴胺和缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，其特征在于，还包括氯化镁。

3.根据权利要求2所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求3所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，其特征在于，所述二氧化锰纳米片的浓度为15μg/mL～20μg/mL；

和/或，所述L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的浓度为23μg/mL～46μg/mL；

和/或，所述多巴胺的浓度为20μg/mL～40μg/mL；

和/或，所述氯化镁的浓度为0.48mg/mL～4.8mg/mL；

和/或，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒，其特征在于，所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒包括20μg/mL的二氧化锰纳米片、23μg/mL的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、0.48mg/mL的氯化镁和20μg/mL的多巴胺和Tris-HCl缓冲液。

6.一种权利要求1至5中任一项所述的碱性磷酸酶便携式检测试剂盒在检测碱性磷酸酶中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：

(2)将梯度浓度的碱性磷酸酶溶液加入所述检测试剂中孵育；

(3)加入多巴胺反应试剂进行反应；

(4)用近红外光照射，用温度计采集温度变化，以碱性磷酸酶溶液的浓度为横坐标，以温度计上温度的变化为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算出待测碱性磷酸酶的含量；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述(2)为将氯化镁溶液和梯度浓度的碱性磷酸酶溶液加入所述检测试剂中孵育。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述(2)中孵育的时间为：30min～60min；

和/或，所述(3)中所述反应的时间为20min。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述(4)中所述近红外光照射的功率为0.4W/cm²～1.0W/cm²；照射的时间为8min～20min；环境温度为20～30℃。