WO2000062785A1

WO2000062785A1 - Remedes

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Publication number: WO2000062785A1
Application number: PCT/JP2000/002432
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Sagawa; Takeshi Sakai; Eiji Kobayashi; Tuo-Ping Li; Hiromu Ohnogi; Kaori Nishimura; Eiji Nishiyama; Hua-Kang Wu; Shigetoshi Mizutani; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2000-10-26
Also published as: EP1175907A1; AU3837300A; EP1175907A4

Description

明細書治療剤技術分野

本発明は生理活性を有する酸性糖化合物の医薬、食品、飲料、飼料、又は化粧料としての用途に関する。背景技術

海藻由来の酸性多糖としては、綠藻類由来のラムナン硫酸、紅藻類由来の硫酸化ガラクタン、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖等の硫酸化多糖が知られている。例えば、フコィダンは褐藻類、棘皮動物等に含まれている硫酸化フコース含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。またサメ軟骨等も硫酸化多糖を含有している。

硫酸化多糖、例えばフコィダンの生理作用としてはがん増殖抑制活性、がん転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウィルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている。

肝細胞増殖因子產生誘導作用を有する物質としてはへパリン、へパラン硫酸、平均分子量 4 4 0 0〜5 6 0 0の低分子化へパリンが知られているが（特開平 6 - 3 1 2 9 4 1号公報）、その他の硫酸化多糖、例えばフコィダン、合成硫酸化多糖等の成長因子産生誘導作用についての報告はない。発明の開示

本発明は種々の酸性糖化合物、例えば酸性多糖、例えばフコィダン等の新たな生理作用を見出すことにあり、その目的は種々の酸性糖化合物、例えば酸性多糖、例えばフコィダン等の成長因子産生誘導作用、特に肝細胞増殖因子産生誘導作用、ィンスリン様増殖因子産生誘導作用又は神経成長因子産生誘導作用を利用した医薬、食品、飲料、飼料又は化粧料を提供することにある。

本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるもの（但し、へパリン、へパラン硫酸を除く）を有効成分として含有することを特徵とする成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤に関する。

本発明の第 2の発明は、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の食品、飲料（以下、飲食品という場合がある）又は飼料に関する。

本発明の第 3の発明は、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の化粧料に関する。

本発明の第 4の発明は、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生調整剤に関する。

本発明において、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖としては、好ましくは硫酸化多糖が例示され、硫酸化多糖としては藻類由来の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、例えば棘皮動物由来の硫酸化多糖、例えばナマコ由来の硫酸化多糖、魚類由来の硫酸化多糖、例えばサメ軟骨由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖、植物由来の硫酸化多糖、例えばョモギ由来の硫酸化多糖、合成硫酸化多糖が好適に使用できる。

また、成長因子産生誘導作用を有する藻類由来の硫酸化多糖としてはラムナン硫酸、硫酸化ガラクタン、又は硫酸化フコース含有多糖が好適に使用することができる。合成硫酸化多糖としてはデキストラン硫酸ナトリウム、硫酸化スターチ、硫酸化カードラン、硫酸化べクチン等が例示され、更に硫酸化多糖の硫酸化により得られる高硫酸化硫酸化多糖が好適に使用できる。また硫酸化フコース含有多糖としてはフコィダンが好適に使用することができる。酸性ォリゴ糖としては好ましくは硫酸化オリゴ糖であり、例えば硫酸化マルト一ス、硫酸化ラクトース、硫酸化スクロース、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクッロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルトース、硫酸化ッラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトへキサオース、硫酸化マルトへプタオース、硫酸化ドデシルーマルトへキサオース、下記式（ I ) で表される化合物又は下記式（ I I ) で表される化合物が使用できる。

(式中、 Rは O H又は O S 0₃ H である。）

(式中、 Rは〇H又は〇S 0₃ H である。）また酸性単糖としては、好ましくは硫酸化単糖であり、例えば硫酸化グルコ一ス、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化 2—デォキシ—グルコース、硫酸化夕ロース及び硫酸化マンノースが使用できる。また酸性糖アルコールとしては、糖アルコールの硫酸化物、例えば硫酸化グルシトール等も使用できる。これらの硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖、硫酸化糖アルコールはそれらの一般的な合成方法にて調製しても良い。これらの糖化合物中の硫酸基の位置、硫酸基の数は、これらの硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖、硫酸化糖アルコールが成長因子産生誘導作用を示す限り、特に限定はない。

本発明においては成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物も使用することができる。当該分解物には成長因子産生誘導作用を有する、分子量 4 0 0 0以下のへパリン分解物、へパラン硫酸分解物も包含される。

前記酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコールに例示される物質は、各々単独で若しくは 2種以上混合して用いることができ、またそれらの塩も好適に使用できる。

本発明において、成長因子としては肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、及び神経成長因子が例示される。

本発明の第 1の発明の治療剤又は予防剤、第 2の発明の食品、飲料又は飼料、及び第 3の発明の化粧料には、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質をさらに含有させることができ、当該物質としてはサイト力イン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、ミノキシジル、及び塩化カルプロニゥムから選択される物質が例示される。

また、本発明の第 2の発明の食品、飲料又は飼料は、好適には肝細胞増殖因子産生誘導用、ィンスリン様増殖因子産生誘導用又は神経成長因子産生誘導用の食品、飲料又は飼料である。

また、本発明の第 3の発明の化粧料は、好適には肝細胞増殖因子産生誘導用、ィンスリン様増殖因子産生誘導用又は神経成長因子産生誘導用の化粧料である。本発明の第 3の発明の化粧料としては、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ゲン又は浴用洗剤が例示される。

尚、本発明にかかる「酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるもの」を本明細書において単に Γ 有効成分」という場合がある。図面の簡単な説明

第 1図は、ガゴメ昆布由来フコィダンの D E A E —セル口ファイン A— 8 0 0 カラム溶出パターンを示す図である。

第 2図は、硫酸ナトリゥム溶液を標準試料とした硫酸含量の検量線を示す図であ ο 発明を実施するための最良の形態

本発明において成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖とは、成長因子産生誘導作用を有すれば良く、特に限定はないが、アルギン酸、ぺクチン、ぺクチン酸、ヒアルロン酸等の酸性多糖、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、例えば棘皮動物由来の硫酸化多糖、魚類由来の硫酸化多糖、例えばサメ軟骨由来の硫酸化多糖、植物由来の酸性多糖、例えばョモギ由来の硫酸化多糖、二ガウリ由来の硫酸化多糖、アロエ由来の硫酸化多糖、菊葉由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖、例えばクロレラ由来の硫酸化多糖、スピルリナ由来の硫酸化多糖、藻類由来の硫酸化多糖等が好適に使用することができる。

藻類由来の硫酸化多糖としては藻類由来のラムナン硫酸、紅藻類由来の硫酸化ガラクタン、例えばマクサ、ォゴノリ、ジャイアントゲルプ、プテロクラディアカピラセァ、カラギーナン、寒天類、ァガロース、了ガロぺクチン、ボルフィラン、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖、例えばフコィダン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコグルクロノマンナン、グルクロノキシロフカン、サルガッサン、グルクロノマンノガラクタン、キシロフコグルクロナン、ァスコフイラン、グルクロノガラクトフカン、硫酸化グルクロノフカン等が使用することができる。特に、フコィダン、硫酸化フコガラクタン、 λ—力ラゲナン、コンドロイチン硫酸 Β、コンドロィチン硫酸 D、アルギン酸、ァガ口べクチン等が本発明に好適に使用することができる。また藍藻類由来の酸性多糖、例えばスピルリナ由来の硫酸化多糖、緑藻類由来の酸性多糖、例えばクロレラ由来の硫酸化多糖を使用することができる。特にスピルリナ由来の硫酸化多糖はその肝細胞増殖因子産生誘導作用により、肝機能の改善に有用であり、例えば C型肝炎の症状改善に著効を有する。またリン酸化多糖類、例えば核酸も本願発明の酸性多糖に包含される本発明に使用する硫酸化フコース含有多糖としては、好ましくは前出の藻類由来のフコィダンが例示されるが、硫酸化フコースを構成成分とする多糖で成長因子産生誘導作用を有するものであれば特に限定はなく、棘皮動物、例えばナマコ、ゥニ、ヒトデ等由来のフコィダンを使用してもよい。

これらは単独で若しくは 2種以上混合して用いることができる。また、これら例示される酸性多糖の分解物や塩も成長因子産生誘導作用を示す限り、特に限定なく使用することができる。

これらの酸性多糖の調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該酸性多糖含有物等を本発明に使用することができる。酸性多糖含有物としては硫酸化多糖画分が好適に使用でき、当該画分としては藻類由来硫酸化多糖画分、サメ軟骨由来の硫酸化多糖画分が好適に使用できる。また硫酸化多糖含有物の原料として藻類、ナマコ、サメ軟骨等が使用できる。例えばガゴメ昆布、マ昆布、トロロ昆布、ヒバマ夕、モズク、ォキナヮモズク、ワカメ、クロメ、ァラメ、カジメ、レツソニァニグレセンス、ァスコフィラムノドッサム等の昆布目、ながもつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコィダンを多く含んでおり、原料として好適である。

本発明に使用される合成硫酸化多糖としては、成長因子産生誘導作用を有するものであれば良く特に限定はないが、これまでに医薬品として使用されてきた硫酸化多糖の使用が好適である。当該合成硫酸化多糖としてはデキストラン硫酸ナトリゥムが例示される。当該化合物は L eu c on o s t o c me s en t e r o i de s van T i e g h emによるショ糖の発酵によって生産されたデキストランの部分分解物を硫酸化して得た硫酸化エステルのナトリゥム塩であ。

また本発明においては硫酸化スターチ、硫酸化カードラン、硫酸化べクチン等の合成硫酸化多糖が使用でき、更に硫酸化多糖の硫酸化により得られる高硫酸化硫酸化多糖が好適に使用できる。

本発明に使用する硫酸化多糖の硫酸基の位置は、成長因子産生誘導作用を発現すれば特に限定はないが、構成糖の 2位が硫酸化された硫酸化多糖、フコィダン、 λ—力ラゲナン、コンドロイチン硫酸 D、それらの分解物が本発明に好適に使用することができる。また、硫酸化多糖の硫酸含量（若しくは硫酸基数）は、成長因子産生誘導作用を発現すれば特に限定はない。なお、酸性多糖の分解物はォリゴ糖、単糖も包含し、本発明において 2位が硫酸基を有するオリゴ糖、単糖、例えばフコース一 2—硫酸、グルコース一 2—硫酸を使用することができる。これらの硫酸化単糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化多糖はそれらの一般的な合成法により調製しても良く、調製物、精製物を本発明に使用することもできる。なお本発明においてオリゴ糖とは単糖が 2個から 1 0個の範囲でつながった糖化合物、多糖とは単糖が 1 1個以上つながった糖化合物と定義する。

例えばガゴメ昆布からフコィダンを調製し、該フコィダンをグルクロン酸含有フコィダン（U—フコィダンと称す）とグルクロン酸非含有フコィダン（F—フコィダンと称す）に分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコィダンを使用することが出来る。またガゴメ昆布から硫酸化フコガラクタンを調製し、使用することができる。

更に寒天からァガ口べクチンを調製し、使用することができる。

U—フコィダン及び F—フコィダンはガゴメ昆布からフコィダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ昆布由来の U—フコィダン及び F—フコィダンの存在比は約 1 ： 2であり、 U—フコィダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約 2 0 %、 F —フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約 5 0 %、分子量は両物質共に約 2 0万を中心に分布している（第 1 8回糖質シンポジウム要旨集、第 1 5 9頁、 1 9 9 6年）。

例えばガゴメ昆布から調製したフコィダン溶液を D E A E—セル口ファイン A - 8 0 0カラムにアプライ後、 N a C 1含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、 U—フコィダンと F—フコィダンに分離することができる。第 1図にその 1例を示す。すなわち第 1図は U—フコィダンと F—フコィダンの分離を示す図であり、図中前ピークが U—フコィダン、後ピークが F—フコィダンである。

また例えばマクサ由来硫酸化多糖、ォゴノリ由来硫酸化多糖、プテロクラディァ由来硫酸化多糖、他の藻類由来の硫酸化多糖、ヒバマ夕由来フコィダン、モズク由来フコィダン、ォキナヮモズク由来フコィダン、ワカメ由来フコィダン、レッソニァま来フコィダン、ァスコフィラム由来フコィダン、他の藻類由来のフコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。

フコィダンを含有するナマコとしては、例えば特開平 4一 9 1 0 2 7号公報に記載のナマコがあり、当該公報記載の方法にてナマコよりフコィダンを調製することができる。

また本発明の成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物、例えば硫酸化多糖、フコィダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて調製し、目的の成長因子産生誘導作用を有する分解物を選択し、使用することができる。

尚、分解物とは、分解対象とする酸性多糖にもよるが、酸性多糖を分解して得た、概ね分子量が好ましくは 1 0万〜 2 0 0、より好ましくは 3万〜 1 0 0 0の範囲のものをいう。

本発明で使用する酸性多糖の分解物の好適な調製方法としては酸分解法があり、当該酸性多糖を酸分解することにより、成長因子産生誘導作用を有する分解物を調製することができる。

本発明で使用する酸性多糖の酸分解条件は、成長因子産生誘導作用を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はない o

例えば酸性多糖を酸水溶液等に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。

酸性多糖を溶解又はけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機塩、クェン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、ァスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。

酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは 0. 0 0 0 1〜5規定、より好ましくは 0. 0 1〜1規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定は無いが好ましくは 0〜2 0 0で、より好ましくは 2 0〜1 3 0°Cに設定すれば良い。

また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明に使用する分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、フコィダンの分解物の製造に際しては、クェン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数 1 011 ]\〜数^[、加熱温度は 5 0〜1 1 0°C、好適には 7 0〜 9 5 °C、加熱時間は数分〜 2 4時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコィダンの酸分解物としてはガゴメ昆布由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物は成長因子産生誘導作用、特に肝細胞増殖因子産生誘導作用の強、新生理機能を有する食物繊維として使用することができ。

本発明の分解物は成長因子産生誘導作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。

ゲルろ過法の例としては、セル口ファイン GCL— 3 0 0を使用し、例えば分子量 2 5 0 0 0超、分子量 2 5 0 0 0〜 1 0 0 0 0超、分子量 1 0 0 0 0〜 5 0 0 0超、分子量 5 0 0 0以下等の任意の分子量画分を調製でき、セル口ファイン GCL- 2 5を用い、例えば分子量 5 0 0 0以下の画分を分子量 5 0 0 0〜3 0 0 0超、分子量 3 0 0 0〜 2 0 0 0超、分子量 2 0 0 0〜 1 0 0 0超、分子量 1 0 0 0〜5 0 0超、分子量 5 0 0以下等の任意の分子量画分に調製することができる。

また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製 FE 1 0 -FUSO 382を使用することにより分子量 30000以下の画分を、同 FE— FUS— T653を使用することにより分子量 6000以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を使用することにより分子量 500以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。

本発明で使用できる成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物、例えばフコィダンの分解物としては、式（I)で表される化合物、式（I I)で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第 97 / 26896号バンフレツト、国際公開第 99 / 41288号パンフレツト記載の方法で調製することができる。なお、式（I) で表される化合物の繰返し構造を有する硫酸化多糖、及びォリゴ糖も本発明の成長因子産生誘導作用を有する硫酸化多糖として使用することができる。

式（ I)で表される化合物は前出 F—フコィダンを、アルテロモナス sp. SN- 1009 (FERM B P— 5747 )が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（F—フコィダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ I)で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。

式（I I) で表される化合物は前出 U—フコィダンを、フラボパクテリゥム sp. SA- 0082 (FERM BP— 5402) が産生するェンド硫酸化多糖分解酵素（U—フコィダン特異的分解酵素）で、処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ I I ) で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。

なお式（ I ) で表される化合物の例としては後述の式（V I ) で表される化合物がある。また式（ I I ) で表される化合物の例としては後述の式（V I I ) で表される化合物がある。

またガゴメ昆布由来フコィダンを有機酸存在下で、加熱処理することによりグルクロン酸とマンノースの重合体を得ることができ、この重合体も本発明の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖として使用することができる。また加熱処理条件、加熱時間を調整することにより任意の重合度の重合体を調製することができる。

本発明における成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖としては、合成硫酸化多糖が包含され、セルロース、デンプン、マンナン、キシラン、アルギン酸、ぺクチン、ぺクチン酸、フラクタン、ァラビナン、キチン、プルラン、キシログルカン、デキストラン、スターチ等の硫酸化物を使用することができる。さらに例えば、リボフラナン硫酸、キシロフラナン硫酸、レンチナン硫酸、カードラン硫酸、マンノピラナン硫酸等の合成硫酸化多糖やパルミトイル基を有するリボフラナン硫酸等の合成硫酸化アルキル多糖を使用することができる。更に硫酸化多糖やその分解物を硫酸化することにより、高硫酸化硫酸化多糖又は高硫酸化分解物を調製することができる。これらの硫酸化多糖、高硫酸化硫酸化多糖、高硫酸化分解物はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、その分解物も公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。また市販のデキストラン硫酸、硫酸化セルロースを使用でき、それら合成硫酸化多糖等の塩等を使用しても良い。

酸性オリゴ糖としては、好ましくは硫酸化オリゴ糖を挙げることができ、また、酸性単糖としては、好ましくは硫酸化単糖を挙げることができ、それぞれ具体的には、前記と同様のものが挙げられる。かかる硫酸化オリゴ糖又は硫酸化単糖は、それぞれ対応するオリゴ糖、単糖を原料として、それぞれ公知の方法にて硫酸化して調製することができる。また、これらの塩も好適に使用できる。さらにまた硫酸化多糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖の脂肪酸誘導体等も本発明の硫酸化多糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖に包含される。これらは各々単独で若しくは 2種以上混合して使用できる。

本発明における産生誘導を所望する成長因子とは細胞の成長を促進する活性を有していれば特に限定はないが、肝細胞増殖因子（HGF)、神経成長因子（N GF)、神経栄養因子、上皮成長因子、ミルク由来成長因子、線維芽細胞成長因子、脳由来線維芽紬胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板塩基性タンパク、結合組織活性化ペプチド、インスリン様増殖因子（I GF)、コロニー形成刺激因子、エリスロポエチン、スロンボポェチン、 T細胞成長因子、インタ一ロイキン類（例えばインターロイキン 2、 3、 4、 5、 7、 9、 1 1、 1 5) 、 B細胞成長因子、軟骨由来因子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、骨格成長因子、内皮細胞成長因子、内皮細胞由来成長因子、眼由来成長因子、精巣由来成長因子、セルトリ細胞由来成長因子、乳腺刺激因子、脊髄由来成長因子、マクロファージ由来成長因子、リサイクル間葉成長因子、形質転換増殖因子一ひ、形質転換増殖因子一、へパリン結合性 EG F様増殖因子、アンフィレグリン、 SDGF、ベータ一セルリン、ェピレグリン、ニューレグリン 1 , 2, 3、血管内皮増殖因子、ニューロトロフィン、 BDNF、 NT— 3、 NT —4、 NT- 5. NT- 6. NT- 7. グリア細胞株由来神経栄養因子、幹細胞因子、ミツドカイン、プレイオト口フィン、 Ephr i n、 Ang i opo i e t i n、ァクチビン、腫瘍壊死因子、インタ一フエロン類等が例示される。

これらの中では、肝疾患の予防，治療、神経性疾患の予防，治療、糖尿病の予. 防 -治療という観点から、 HGF、 NGF、 I GFからなる群より選択される少なくとも 1種を本発明にかかる有効成分を用いて産生誘導するのが好ましい。

HGFは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。また HGFの mRNAは脳、腎臓、肺等でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮細胞等にも増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因子である。従って、肝細胞増殖因子の産生を誘導することにより、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変及び肝内胆汁うっ滞、慢性腎炎、肺炎、創傷の治療又は予防を行うことができる。

I G Fは種々の細胞に多彩な生理作用を有する。 I G Fの産生を誘導することによって、 I I 一型糖尿病（インスリン非依存性）や成長障害疾患（小人症）の治療又は予防を行うことができる。

N G Fは神経細胞の生存や機能を維持したり、 N G Fの濃度勾配に従つて神経細胞を伸長させたりする内因性の成長因子であり、 N G Fの産生を誘導することにより、アルツハイマー病等の老人痴呆症や末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒などによる神経機能の修復再生を要する疾患の治療又は予防を行うことができる。また本発明の治療剤又は予防剤は神経栄養因子の産生誘導作用を示し、さらに本発明の治療剤又は予防剤は N G F · 神経栄養因子の産生誘導作用により、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、黄斑変性症等の治療、予防に有用である。

本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖ァルコール、又はこれらの塩は成長因子産生誘導作用を有し、これらの化合物を有効成分として成長因子産生を要する疾患の治療剤又は予防剤を製造することができる。

本発明の成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤は、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば良い。当該製剤の製造は一般的には、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。

医薬用担体は、上記剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。

一方、非経口剤の場合は、常法に従い、本発明の有効成分である、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものを希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。

本発明の治療剤又は予防剤は、剤形に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含され。

本発明の治療剤又は予防剤としての投与量は、その剤形、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状等によって適宜設定され、一定で. はないが一般には製剤中に含有される本発明で使用される酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの量が成人 1 日当り好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g Z k gとなる量である。もちろん投与量は、前記のように種々の条件によって変動するので、上記投与量より少なレ、量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。経口剤の場合、本発明の治療剤又は予防剤は所望の投与量の範囲内において、そのまま経口投与できるほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また本発明で使用される酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを成長因子産生誘導用の飲食品の原料として用いても良い。

部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長年不明であつたが、劇症肝炎患者の血漿中に HGFが見出され、その患者血漿から、単離、精製された（J. Clin. Invest., 88 414-419, 1988)。さらに、ヒト HGFの cDNAもクローニングされ、 HGFの 1次構造も明らかにされた（Biochem. Biophys. Res. Commun. , 163 967-973, 1989)。また、細胞の運動性を亢進させる s c a t t e r f a c t o r (SF) 及び、腫瘍細胞障害因子である t umo r cy t o t ox i c f a c t o r (TC F) と HGFが同一物質であることも明らかになった（Pro Natl. Acad. Sci. USA. 88 7001-7005, 1991 ： Biochem. Biophys. Res. Commun. , 180 1151-1 158, 1991 ) o

HGFは肝細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導し、 HGFは極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器において、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖の促進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を行う。

HGFは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症肝炎、肝硬変及び肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待されている。しかしながら、 HG Fそのものを治療薬として実用化するには至っていない。さらに、遺伝子治療で HGFの遺伝子を導入する方法も試みられているが、不必要な時期、場所で作用することによる副作用により、これも実用化には遠い。このように、 HGFを外から投与するのではなく、任意に誘導できるのであれば、肝炎、肝硬変、肝內胆汁うっ滞等の HGF発現増強を必要とする疾患の治療及び予防に有効であると考えられ、これまでにも、 I L一 1、プロスタグランジン E, 、 E₂ 、へパリン等に誘導作用が確認されている。 I L— 1、プロスタグランジン E, 、 E₂ は、 H G F遺伝子の転写を誘導することにより、 H G Fの産生を誘導する。

一方で、へパリンには HGF産生誘導作用が知られているが、 HGF遺伝子の転写は誘導せず、 m R N Aの翻訳以降のステップを促進して H G Fの産生を誘導する。つまり、 HGF遺伝子の転写が誘導されていない状態では、 HGF産生誘導効果はない。反対に、 HGF遺伝子の転写が誘導されている状態においては顕著な産生誘導が見られる。

また、本発明にかかる有効成分は、必ずしも HGF等の成長因子の転写誘導を直接的に行うものではないが、それらの転写が誘導される際に、かかる転写を有意に促進し、さらに翻訳等の転写以降の段階をも促進することができるものと推定され、結果として成長因子の産生の増強を誘導するという作用を有する。すなわち、本発明にいう「成長因子産生誘導作用」とは、成長因子の産生の増強を誘導する作用を意味し、かかる作用は、例えばヒトへの有効成分の投与前後における成長因子の増強により判断する。ここで、「転写が誘導される際に」とは、例えば HGFの転写はそれが必要な時期に行われており、前記有効成分によれば、 HGFの転写が促進されている初期にその転写が更に促進され、その後 HGFが過剰生産とはならず、従って HGFの生産が体内に必要な時に増強されるという. ことを意味しており、これにより極めて安全に HGFの産生誘導を行い得る。本発明の治療剤又は予防剤においては、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質を更に含有させることができる。本発明にいう「相乗的に増加させる物質」とは、本発明にかかる有効成分と該物質を併用すれば、該物質により転写誘導が積極的に行われ、結果として本発明にかかる有効成分の成長因子産生誘導作用が相乗的に増加されるものである。本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖ァルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質としては、かかる酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコ —ル、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる作用を有する物質であれば特に限定はなく、例えばサイト力イン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、ミノキシジル、及び塩化カルプロニゥムから選択される物質が例示される。また生姜等に含まれるシヨーガオール、ジンジヤーオール等、ゥコン等に含まれるクルクミン等も、 H G F産生誘導作用を増加する物質であり、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の H G F産生誘導作用を相乗的に増加する物質として使用することができる。

サイトカイン類としては、前記 I L— 1等を挙げることができ、ブロスタグランジン類としては、前記プロスタグランジン、 E ₂ 等を挙げることができる ο

また、シクロペンテン環を有する化合物としては下記式（ I I I ) で表される化合物及びその誘導体が例示される。

これらは各々単独で若しくは 2種以上混合して使用することができる。

例えば、下記式（ I I I ) 〜（V) でそれぞれ表されるシクロペンテン環を有する化合物は、プロスタグランジン E , 、 E ₂ と同様に、 H G F遺伝子の転写を. 誘導することができ、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩との相乗作用により H G Fの産生を顕著に増加させることができる。すなわち H G Fの転写誘導作用を有するサイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、生姜由来化合物、ゥコン由来化合物から選択される物質と、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものとを混合物として併用することにより、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用が相乗的に増加され、非常に高い H G Fの産生誘導効果が得られる。

また当該混合物を成長因子産生誘導用の飲食品、又は飼料の原料として用いても良い。

H N— CH— CH,— CH₂— C— NH—

OOH 〇

〇一 C— C ₉ H,

(V) 例えば、式（I I I)で表される化合物の製造方法は国際公開第 98/1 33 28号パンフレツト、式（ I V)で表される化合物は国際公開第 98 / 3929 1号バンフレツト、式（V)で表される化合物は国際公開第 98 Z 40346号パンフレツ卜にそれぞれ記載されており、これらに記載の方法により製造することができる。

式（I I I)で表される化合物の製造方法はいかなる方法でもよく、化学合成法〔カーボハイドレートリサーチ（Carbohydrate Res. )、第 2478巻、第 2 17〜222頁（ 1 993 )、ヘルべチカキミ力ァクタ（Helvetica Chimic a Acta)、第 55巻、第 2838〜 2844頁（1 972)〕で合成しても良く、また、ゥロン酸、ゥロン酸誘導体、ゥロン酸及び又はゥロン酸誘導体を含有する糖化合物、ゥ口ン酸及ぴ又はゥロン酸誘導体を含有する糖化合物含有物から選択される少なくとも 1種の物の加熱処理物中に生成するシクロペンテノン、その精製物を使用することもできる。式（IV)で表される化合物は、例えば式 (I I I)で表される化合物とグルタチオンを反応させることにより得ることができる。また、式（V)で表される化合物は、例えば式（I I I)で表される化合物と無水プロピオン酸と反応させることにより得ることができる。

本発明の治療剤又は予防剤において、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の含有量は、当該誘導作用を相乗的に増加させることができる程度であれば良く、特に限定はないが、通常、成人 1日当たり、好ましくは 0. 001〜200 Omg/kgとなる量である。当該誘導作用を相乗的に増加させる物質は、本発明で使甩する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものと合わせて製剤化しても良く、又別に製剤化しても良い。製剤化の方法、投与の態様は、本明細書に記載の方法に準じて行えば良く、成長因子産生誘導が相乗的に増加するというような本発明の所望の効果が得られる。本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖ァルコール、又はこれらの塩はまた、へパラナーゼ阻害活性を有し、がん転移抑制活性、血管新生抑制活性を有する。従って、これらのものから選択されるものを有効成分としてがん転移抑制剤、血管新生抑制剤を製造、提供することができる

。特にフコィダン由来の式（ I ) で表される化合物は強力なへパラナーゼ阻害作用とがん転移抑制作用を有し、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物はがん転移抑制剤として極めて有用である。また当該化合物を含有してなる飲食品はがん転移抑制用、血管新生抑制用の飲食品として価値の高いものである。

成長因子産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の食品、飲料又は飼料は、その成長因子産生誘導作用により、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖ァルコール又はこれらの塩に感受性を示す成長因子産生誘導を要する疾患の症状改善、予防若しくは後述のように生物の体長改善に極めて有用であ。

尚、本発明の食品、飲料又は飼料、或いは後述の化粧料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料又は飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、钦料又は飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料又は飼料の原料を添加するという態様をいうものである。

また、成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる前記物質、例えば、サイト力イン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物から選択されるものをさらに含有させることが、前記疾患の症状改善、予防若しくは体長改善に資する観点から好ましい。

尚、本発明の飲食品においても、前記有効成分、成長因子、又は成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の好ましい態様は、前記治療剤又は予防剤の場合と同様である。特に本発明の飲食品又は飼料としては、肝疾患改善、神経性疾患改善、糖尿病改善という観点から、肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子産生誘導用の飲食品又は飼料が好ましい。

本発明の食品又は飲料の製造法は、成長因子産生誘導作用を有する当該食品又は飲料が得られる限り特に限定はない。例えば、配合、調理、加工等は一般の食品のものに従えばよく、かかる食品又は飲料の製造法により製造することができ、製造された食品又は飲料に成長因子産生誘導作用を有する本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものが有効成分として含有されていれば良い。

本発明の食品又は飲料とは、特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加ェ品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、バン類、あん類、そば類、麩、ビ一フン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等 ) 、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等 ) 、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、ァイスクリーム等）、野菜 ·果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ヮイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰 ·瓶詰め ·袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバ一ペースト、その他のスプレツド、そば，うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麵類、即席カレ一、インス夕ントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産 ·林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。

本発明の食品又は飲料としては、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものが含有されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、成長因子産生誘導作用を有する藻類由来の硫酸化多糖及びその分解物、例えばフコィダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能を合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。

本発明の食品又は飲料中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるもの（有効成分）の食品又は飲料中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択できるが、有効成分の含有量は、例えば食品 1 0 0重量部当たり 1 0— ⁹重量部以上、好ましくは 1 0 - ⁷〜2重量部であり、例えば飲料 1 0 0重量部当たり 1 0— ⁹重量部以上、好ましくは 1 0— ⁷〜2重量部である。

又、成人 1 日当たり、有効成分が 0 . 0 1〜2 0 0 O m g / k gとなるように摂取すれば良く、経口的に成長因子産生誘導が行われるという本発明の所望の効果が得られる。

また本発明により、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる生物用飼料が提供される。

さらに該飼料を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法が提供されるまた成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。

これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ぺット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。飼料としては成長因子産生誘導作用に基づく体調改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。これらの発明において、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物

、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものは、生物の飼育効率、例えば生存率、肥育率、産卵率、産仔率、離乳率等を向上させる効果を有する。

成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものは通常、対象生物の体重 l k g、 1 日当たり好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g投与され、人工配合飼料の原料中に添加混合させるか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合させることができる。

成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの、最終的に得られた対象生物用飼料中の含有量は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、 0 . 0 0 1〜1 5重量％の割合が適当である。例えば、肝機能を改善するということを目的とする場合には、 0 . 0 1〜 1 0重量％の割合が適当である。人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆柏、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油、などの動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤等を原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。

本発明の飼料の製造方法に特に限定は無く、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中に成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるもの有効量が含有されていればよい。

また成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものをプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。

水又は海水中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性ォリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは 0 . 0 0 0 0 1〜 1重量％の割合が適当である。

また成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。

該飲料中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは 0 . 0 0 0 1〜1 重量％の割合が適当である。

成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とする生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の配合及び製造方法で作製すれば良い。

本発明が適用できる生物としては限定は無いが、養殖動物としては、馬、牛、豚、羊、山羊、らくだ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ等の実験動物、鶏、ァヒル、七面鳥、駝鳥等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、ァュ、サケ 'マス類、トラフグ、ゥナギ、ドジヨウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、夕イシヨウェビ、ガザミ等の甲殻類等、ァヮビ、サザェ、ホ夕テ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてはィヌ、ネコ等が挙げられ、陸上 ·水中動物に広く適用できる。

成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有する飼料を摂取させること、又は成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ぺット動物等の体調が改善され、その結果、対象生物の細菌性感染症、ウィルス性感染症が予防又は治療され、感染生物においてはその症状が顕著に改善される。また対象生物の健康が保持され、その生存率、成長率、産卵率、産仔率、離乳率、生育率等の改善が顕著である。

またこれらの養殖動物は（ 1 ) 細菌感染による疾病が頻繁に発生し、限られた領域での養殖のために、伝染病が発生するとたちまちに感染して全滅する、（2 ) 寄生虫病、栄養性疾病、環境性疾病、腫瘍等が発生し易い、（3 ) 狭い飼育領域での養殖動物はストレスが大きく、飼育施設に体表をこすりつけ擦り傷を発生させ、個々に細菌や寄生虫が付着し易い、（4 ) またストレスにより餌食いが低下して、成長が遅くなる等の問題があつたが、本発明の飼料はその体調改善作用により、狭い領域で飼育されている養殖動物のストレスを大幅に低減させ、飼育施設への体表のこすりつけが発生せず、食欲が旺盛になり、成長率、産仔率、産卵率、離乳率、疾病予防率等を顕著に向上させることができる。

成長因子産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩は化粧料の有効成分として有用であり、本発明により本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とする成長因子、例えば H G F産生誘導用の化粧料が提供される。

また、成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる前記物質、例えば、サイト力イン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物から選択されるものを含有させることが、所望の効果に資する観点から好ましい。

尚、本発明の化粧料においても、前記有効成分、成長因子、又は成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の好ましい態様は、前記治療剤又は予防剤の場合と同様である。特に本発明の化粧料としては、上皮細胞の活性化という観点から、肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子産生誘導用の化粧料が好ましい。

当該化粧料の有効成分としてはフコィダン及びその分解物が特に好適であり、例えば F—フコィダン及び Z又はその分解物、又は式（ I ) で表される化合物を有効成分とする成長因子産生誘導作用、例えば H G F産生誘導作用を有するバイォ化粧品が提供できる。成長因子産生誘導用の化粧料における酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の含有量は通常好ましくは 0 . 0 0 0 1〜2 0重量％、より好ましくは 0 . 0 0 1〜5重量 %である。

本発明の成長因子産生誘導用、例えば H G F産生誘導用の化粧料は、公知の配合に準じて常法に従って製造することができる。本発明の成長因子産生誘導用の化粧料としては、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ゲン又は浴用洗剤等を包含するものである。

本発明の化粧料を、それぞれの用途形態に応じて所望の量、例えばローション類であれば、例えばヒトの顔面全体に適用するような場合、 1回の使用当たり好ましくは 0. 0 l〜5 g、より好ましくは 0. 1〜2 g程度を用いれば、上皮細胞が活性化され、美肌効果が得られるという本発明の所望の効果が得られる。本発明はまた、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する成長因子産生誘導剤を提供するものであるが、当該産生誘導剤は成長因子の機能研究、成長因子に関連する疾病用医薬のスクリーニングにも有用である。

さらに本発明は、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖ァルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する成長因子産生調整剤を提供する。

本発明の成長因子産生誘導剤、成長因子産生調整剤は、上記の有効成分を使用し、公知の製剤化方法にて製剤を製造すればよい。成長因子産生誘導剤としては、前記治療剤等もその一例として挙げることができる。また、本発明の成長因子產生調整剤とは、生体内において、成長因子の転写誘導初期に成長因子の転写を促進する製剤を意味する。本発明の成長因子産生調整剤により、成長因子の産生が必要な状態時にのみ、成長因子の産生が増強され、成長因子の産生が過剰とならないという著効を有する。

本発明に使用されるフコィダン及びノ又はその分解物は特に強い成長因子産生誘導作用、成長因子産生調整作用を有し、本発明の製剤に使用する有効成分として極めて有用である。

従来 HGF産生誘導作用が知られていたへパリンは HGFの mRNAの転写は促進しないが、フコィダン及びその分解物は、 HGFの mRNAの転写が促進されている初期段階で、その mRNAの転写を更に促進する。生体内では HGFの mRNAは常には転写されておらず、必要な時期に転写されている。フコィダン及びフコィダン分解物、例えば後述の 7— 1 2 SF d— Fは、生体内で HGFの転写が促進されている初期にのみその転写を更に促進し、その後 HGFが過剰生産とはならず、 H G Fの生産状況が体内に必要な時にのみ促進されるという点において極めて安全な H G F産生調整物質である。

従って、本発明の別の態様においては、前記治療剤又は予防剤、飲食品等を、そのまま成長因子産生誘導を調整する目的で使用することもできる。成長因子産生調整剤の投与量としては、成長因子産生を調整することが可能であれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる有効成分の投与量、例えばヒトに対する有効成分の投与量が、好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g / k g (体重）となるような量を挙げることができる。

尚、本発明に使用する成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、例えばフコィダン及び Z又はその分解物はラッ卜への経口投与において 1 gZk gを経口単回投与しても死亡例は認められない。またデキストラン硫酸ナトリゥムも安全な化合物である。また本発明で使用するその他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩は、その生理的有効量をラットに経口投与しても毒性は認められない。

また、別の態様として、本発明においては、成長因子産生誘導作用を有するョモギ抽出物、二ガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分とする成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤を提供してもよい。

また、成長因子産生誘導作用を有するョモギ抽出物、二ガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分として含有する成長因子産生誘導用の飲食品、又は飼料を提供してもよい。

さらにまた、成長因子産生誘導作用を有するョモギ抽出物、二ガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分として含有する成長因子産生誘導用の化粧量を提供してもよい。かかる植物、微生物からの前記抽出物のの抽出精製は、次のような公知の方法で行うことができる。原料である植物の果実、種子、葉、茎、根、根茎等、また微生物を、適当な時期に採取し、そのままか、通常空気乾燥等の乾燥工程を行つた後、抽出原料とする。原料が植物の搾汁液や樹液の場合はそのまま抽出原料として用いることもできる。

上記の乾燥した植物体、微生物からの前記有効成分を含有する抽出物の抽出は、公知の方法により以下のように行う。原料を粉砕もしくは紬切した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式の抽出方法で行うことができる。抽出溶媒としては、水、クロ口ホルムまたはエタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトンメチルェチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸ェチル等の親水性もしくは親油性の溶媒が、単独で、もしくは混合液として用いることができる。抽出温度は通常 0〜1 5 0 °C、好ましくは 5〜1 2 0 ^eCで行ラ

抽出をバッチ式で行う場合、抽出時間は 1 0分〜 2 0日間程度であり、溶媒量は乾燥原料当たり通常 1〜3 0倍重量、好ましくは 2〜 2 0倍重量用いる。抽出操作は、攪拌によっても浸漬放置によってもよく、また組み合わせてもよい。抽出操作は必要に応じて 2〜3回繰り返してもよい。連続抽出法としては、還流冷却器とサイフォンを組み合わせたソックスレー抽出器を用いた方法等があげられ、溶媒量、抽出時間等は前記のバッチ式抽出法の条件と同様である。

本発明に使用される抽出物には、前期の操作で得た粗抽出液から不溶性残査をろ過もしくは遠心分離により取り除いたものも含まれる。また不溶性残查を活性成分として使用する場合もある。

粗抽出液からの活性成分の精製は、公知の植物由来の活性成分の精製方法であればどのようなものでもよいが、二相溶媒分離法、カラムクロマトグラフィー法等を単独または組み合わせて用いることが好ましい。

得られた抽出物を有効成分とし、目的に応じ薬剤、飲食品、飼料及び化粧料等を製造することができる。それらの製造は、本発明の第 1〜第 3の発明にかかる前記方法に準じて行なえばよい。

各目的に応じた製品中の抽出物の含有量はその成長因子産生誘導作用より決定することができるが、概ね通常製品中に好ましくは 0. 0 0 1〜1 0 0重量％、より好ましくは 0. 0 1〜3 0重量％、さらに好ましくは 0. 1〜2 0重量％であ o

尚、本発明にかかる、これら抽出物は、その有効量をラットに経口投与しても毒性は認められない。以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。尚、実施例における各成分の配合についての％は重量％を意味する。参考例 1

( 1 ) ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物 2 0 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。

水道水 9 0 0 リツトルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製） 7. 3 kg を溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物 2 0 k gを混合した。液温 1 2でから液温 9 0 ^eCとなるまで水蒸気吹込みにより 4 0分間昇温させ、次いで攪拌下 9 0〜9 5°C に 1時間保温し、次いで冷却し、冷却物 1 1 0 0リツトルを得た。

次いで固液分離装置（ウェストファリアセパレ一夕一社製 CNA型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約 9 0 0リツトルの固液分離上清液を調製した。固液分離上清液 3 6 0リツトルをダイセル社製 FE 1 0 -FC-FUS 0 3 8 2 (分画分子量 3万）を用い、 2 0リットルまで濃縮した。次いで水道水を 2 0 リツトル加え、また 2 0リツトルまで濃縮するという操作を 5回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液 2 5リットルを調製した。該抽出液 1 リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコィダン乾燥物 1 3 gを得た。

上記方法に準じ、マ昆布乾燥粉砕物からマ昆布由来フコイダン乾燥物を調製した。また同様に、レソニァニグレセンス（Lessonia nigrescence) の乾燥粉末 (商品名シーウィードパウダー：アンデス貿易株式会社販売）からレソニァニグレセンス由来フコィダン乾燥物を調製した。

(2) 参考例 1一（ 1 ) 記載のフコィダン乾燥物 7 gを、 5 OmMの塩化ナトリウムと 1 0 %のエタノールを含む 2 OmlV [のィミダブ一ル緩衝液（pH 8. 0 ) 700 mlに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。 DEAE—セルロファイン A— 800カラム（01 1. 4 cmx 48 cm) を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの 5 OmMから 1. 95 Mの濃度勾配により溶出させた（1フラクション： 250ml)。フエノール硫酸法及び力ルバブール硫酸法にて、総糖量及びゥロン酸含量を求め、溶出順にフラクション 43〜49、フラクション 50〜55、フラクション 56〜 67の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクシヨン 43〜49より I画分（34 Omg)、フラクション 50〜55より I I画分（870m g)、フラクション 56〜 67より I I I画分（2. 64 g ) をそれぞれ調製した。

第 1図にガゴメ昆布由来フコィダンの DEAE—セル口ファイン A— 800力ラム溶出パターンを示す。第 1図において縦軸は力ルバゾール硫酸法での 530 nmの吸光度（図中黒丸）、フエノール硫酸法での 480 nmの吸光度（図中白丸）、及び電導度（mS/cm：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す

参考例 2

(1) アルテロモナス s p. SN- 1 009 (FERM BP— 574 7) を、グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 0 5 %を含む人工海水（ジャマリンラボラトリ一社製） PH8. 2からなる培地 6 0 0m 1を分注して殺菌した（ 1 20°C、 20分間） 2リットルの三角フラスコに接種し、 2 5°Cで 2 6時間培養して種培養液とした。ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 02 %、下記参考例 2— (2) に記載の硫酸化多糖 0. 2%、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM70) 0. 0 1 %を含む人工海水 PH8. 0からなる培地 20リットルを 30リットル容のジャーファメンターに入れて 1 20 。C、 20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液 6 0 0 m lを接種し、 24 で 24時間、毎分 1 0リットルの通気量と毎分 25 0回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量 1万のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により濃縮後 8 5%飽和硫安塩折し、生じた沈殿を遠心分離により集め、 1 0分の 1濃度の人工海水を含む 2 OmMのトリス一塩酸緩衝液（pH 8. 2) に対して充分透析し、 60 0 m lの硫酸化多糖に選択的に作用するェンド型硫酸化多糖分解酵素液を調製した。

(2) 乾燥したガゴメ昆布 2 kgを直径 l mmのスクリーンを装着させたカツターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを 20リットルの 80%エタノール中に懸濁し、 25°Cで 3時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 9 5 °Cに加温した 4 0リットルの 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 pH 6. 5に懸濁し、時々攪拌しながら 9 5 'Cで 2時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。

抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を 3. 5リットルの 1 0 OmM塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。

両ろ液を合わせた後、 30°Cまで温度を下げ、 3 0 0 0 Uのアルギン酸リア一ゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを 4リットル加え 25°Cで 2 4時間攪拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量 1 0万のホロファイバ一を備えた限外ろ過機により 4リットルに濃縮し、更に、 1 0%のエタノールを含む 1 0 OmMの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。

非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を 5 °Cまで温度を下げ、 0. 5N塩酸により pHを 2. 0とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに 1 N水酸化ナトリウムにより p Hを 8. 0とした。

次に、排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、 2 OmM塩化ナトリウム pH 8. 0により完全に溶媒置換後、再度 p Hを 8. 0として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約 9 5 gの硫酸化多糖を調製した。

(3) 乾燥したガゴメ昆布 2 k gを直径 1 mmのスクリーンを装着させた力ッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを 2 0リットルの 8 0%ェタノ一ル中に懸濁し、 25°Cで 3時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 3 0m lの上記参考例 2— ( 1 ) で調製したェンド型硫酸化多糖分解酵素液、 1 0%のエタノール、 1 0 0 mMの塩化ナトリウム、 5 0mMの塩化カルシウム、及び 5 OmMのィミダゾールを含む 2 0リットルの緩衝液（ρΗ 8. 2) に懸濁し、 25 °Cで 4 8時間攪拌した。この懸濁液を網目の直径 3 2 // mのステンレス金網でろ過し、残渣を 5 OmMの塩化カルシウムを含む 1 0 %のエタノールで洗浄した。更にその残渣を 1 0 リットルの 5 OmM塩化カルシウムを含む 1 0%のエタノール中に懸濁し、 3時間攪拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、 1 6時間攪拌し、直径 32 /zmのステンレス金網でろ過、洗浄した。

こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量 3 0 0 0のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約 3リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に 0. 1 Mとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ 5 OmMの酢酸カルシゥムにより平衡化させた DEAE—セル口ファイン（樹脂量 4リットル）にかけ、 5 OmMの酢酸カルシウム及び 5 OmMの塩化ナトリウムで充分洗浄後、 50 m M〜80 OmMの塩化ナトリウムのグラジェントにより溶出させた。この時の分取量は 1本当り 500 mlで行った。分取した画分をセルロースァセテ一ト膜電気泳動法 [アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry ) 、第 37巻、第 197〜202頁（1970) ] により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約 0. 4 Mで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー 63付近）が均一であつ 7こ o

そこで、まずフラクションナンバー 63の液を 1 50mlに濃縮後、濃度が 4 Mとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ 4Mの塩化ナトリウムにより平衡化した Pheny 1—セル口ファイン（樹脂量 200 ml) にかけ、 4M の塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液 505 mlを得た

O

得られた脱塩液のうち 4 Om 1を 1 0 のエタノールを含む 0. 2 Mの塩化ナトリウムによって平衡化させたセル口ファイン GCL— 90のカラム（4. 1 c mx 87 cm) にかけて、ゲルろ過を行った。分取は 1フラクション当り 9. 2 m 1で行った。

全フラクションに対して総糖量の分析をフエノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analytical Chemistry)、第 28巻、第 350頁（1956) 〕により行つ τこ。

この結果、硫酸化糖は 1つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー 63〜70を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透折器により脱塩後、凍結乾燥し、 1 1 2mgの下記式（V I) で表される化合物の乾燥品を得た。以下、該化合物を 7— 1 2 S F d— Fと称す。

(4) 参考例 1— (2) で調製した I I I画分（F—フコィダン）の 2. 5% 水溶液 80mlに 1M トリス塩酸緩衝液（pH7. 6) を 1 6ml、 1 M C a C 12 水溶液を 1 6 m 1、 4M Na C 1水溶液を 24 in 1、参考例 2— （ 1 ) で得たェンド型硫酸化多糖分解酵素液を 8 m 1、蒸留水を 1 76 m 1添加し、 30°Cで 3時間加熱した。この酵素処理 F—フコィダン溶液を酵素処理 F—フコィダンの最終濃度が 2%になるようにロータリーェヴアポレーターで濃縮し、その後蒸留水中で透析操作を行い、 2 %酵素処理 F一フコィダン水溶液を調製した。この試料を HPLC (カラム： SB802. 5、カラム温度： 35°C、移動相： 50m Na Cl、流速： 0.5ml/min、検出： RI ATT= 8) で分析した。その結果、試料中の約 40%が 7— 1 2 SFd— Fであることが明らかになった。参考例 3

( 1 ) 乾燥ガゴメ昆布 2 k gを穴径 1 mmのスクリーンを装着した力ッ夕一ミル（増幸産業社製）により破砕し、 20リツトルの 80%エタノール中で 25°C 、 3時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残さを 5 OmMの塩化カルシウム、 1 0 OmMの塩化ナトリウム、 1 0 %のエタノール、及び参考例 2— （ 1 ) で調製したアルテロモナス s p. SN- 1 0 0 9 (FERM BP- 5747) ェンド型硫酸化多糖分解酵素を 1 U含む 2 0リットルの 3 OmMィミダゾ一ル緩衝液（pH 8. 2) に懸濁し、 25°Cで 2日攪拌し、次いで穴径 32 /zmのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを 1 0 OmMの塩化ナトリゥ厶、 1 0 %のェタノール、及び 4 gのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む 4 0リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 6) に懸濁し、 2 5で、 4日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、 1 0%のエタノールを含む 1 0 OmMの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の 4 0 OmM酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、 1 Nの塩酸で pH2とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を 1 Nの水酸化ナトリウムにより pH 8. 0とした。この溶液を限外ろ過により 1 リットルに濃縮後、 1 0 OmMの塩化ナトリゥムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に 1 Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、 1 Mの塩化ナトリゥムで平衡化した 3リットルのフエニルセル口ファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、 2 OmMの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は 2 9. 3 gであった。

(2) 上記の凍結乾燥物 1 5 gを 4 0 OmMの塩化ナトリゥム及び国際公開第 97 26 8 9 6号パンフレット記載のフラボパクテリゥム s p. SA— 0 0 82 (FERM BP- 5402) を培養し、該培養物から得られたェンド型硫酸化多糖分解酵素を 9 U含む 1. 5 リットルの 5 OmMトリス塩酸緩衝液に溶解し、 25 で 6日反応後、エバポレーターで約 3 0 0 m lに濃縮した。濃縮液を排除分子量 3 500の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、 5 OmMの塩化ナトリゥムで平衡化した 4リットルの DE AE—セル口ファイン A— 8 0 0にかけ、 5 OmM塩化ナトリウムで充分洗浄後、 5 0〜 6 5 0 mMの塩化ナトリゥムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを 65 OmMの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち 6 5 OmMの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量 1 0万の限外ろ過機により濃縮後、 1 OmMの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を 0. 8 5 g得た。得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約 2 ： 1であった。参考例 4

参考例 2— （2) で調製した硫酸化多糖 1 20 gを 2 OmMの塩化カルシウム、 30 OmMの塩化ナトリウム、 1 0%のエタノール、及び 1 0 Uの参考例 2— ( 1 ) で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素を含む 8リットルの 2 OmMィミダゾール緩衝液（pH7. 5) に懸濁し、 25 °Cで 3日間攪拌し、排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用い、上記緩衝液を添加しながら限外ろ過した。

限外ろ過内液に 34 Uの参考例 3— (2) で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素を添加して、 25でで 2日間攪拌し、排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過を行い、水を添加しながら限外ろ過した。

ろ液を集め、エバポレーターで 1. 5リットルに濃縮後、脱塩装置により完全に脱塩し、あらかじめ 3 OmMの塩化ナトリウムを含む 5mMのィミダブールー塩酸緩衝液（PH 6. 5) で平衡化した 3リットルの DEAE—セル口ファイン A— 8 0 0のカラムにかけ、 6 リットルの同緩衝液で洗浄後、 3 OmMから 5 0 OmMの塩化ナトリゥムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に要した液量は 4 8リットルであった。溶出液は 1 8 0m lずつ分取し、その糖含量をフヱノール —硫酸法により測定した。また、 232 nmにおける吸光度も同時に測定した。 1 3 OmMから 1 7 OmMの塩化ナトリゥ厶溶出画分が一つのピークを形成したので、これらの画分を集め、脱塩装置により脱塩後、凍結乾燥し、 5. 85 gのオリゴ糖を得た。このオリゴ糖は質量分析により、分子量 1 1 28であり NMR 分析により下記式（V I I) で表される化合物であることを確認した。以下、該化合物を 6— 2Sと称す。

参考例 6

市販のワカメメカブの乾燥物 1 k gを穴の径が 1 mmのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、 1 0リツトルの 80 %エタノール中に懸濁し、 3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残査を得た。残查を 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 4 OmMのリン酸緩衝液（pH 6. 5) 20リットルに懸濁し 95 で 2時間処理した。処理液を 37°Cまで冷却後、 1 0%となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リア一ゼ K (ナガセ一生化学工業社製）を 1 2000 U添加後、室温で 24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を 5 °Cに冷却後 0 . 5 Nの塩酸を添加して pHを 2. 0とした後 30分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清の pHを 0. 5 Nの水酸化ナトリウムにより 8. 0 とし、限外ろ過により溶液を 2 OmMの塩化ナトリウムに置換した。溶液の pH を 8. 0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、 9 0. 5 gのワカメメカブ由来フコィダンを得た。参考例 7

粉砕したヒバマ夕（Fucus vesiculosus ) の乾燥物 1 kgを、 1 0リツトルの 8 0%エタノール中に懸濁し、 3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残查を得た。残査を 1 0 OmMの塩化ナトリウムを含む 3 OmMのリン酸緩衝液（pH 6. 0 ) 30リツトルに懸濁し 95°Cで 2時間処理した。処理液を 3 7°Cまで冷却後、 1 0 0 gの活性炭を添加し 3 0分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼ Kを 3 00 0 U添加後、 1 0%となるようにエタノールを添加し室温で 24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量 1 0万のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を 5でに冷却後 0. 5 Nの塩酸を添加して pHを 2. 0とした後 30分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清の pHを 0. 5N の水酸化ナトリウムにより 8. 0とし、限外ろ過により溶液を 2 OmMの塩化ナトリウムに置換した。溶液の pHを 8. 0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、 7 1 gのヒバマ夕由来フコィダンを得た。

上記方法に準じ、ァスコフィラムノドスム（Ascophyllum nodosum ) の乾燥粉末（商品名アルギンゴールド：アンデス貿易株式会社販売）からァスコフイラムノドスム由来フコィダンを調製した。参考例 8

参考例 1 一（ 1 ) 記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコィダン 2 gを 1 0 0m lの水に溶解し、その pHをクェン酸にて pH 3に調整後、 1 0 0°Cで 3時間処理し、当該フコィダンの酸分解物を調製した。この加水分解物をセルロファイン GCL— 3 0 0、又はセル口ファイン GCL— 2 5によるゲルろ過で分子量分画し、分子画 2 5 0 0 0超（A画分）、 2 5 0 0 0〜 1 0 0 0 0超（B画分）、 1 0 0 0 0〜5 0 0 0超（C画分）、 5 0 0 0〜2 0 0 0超（D画分）、 2 0 0 0〜5 0 0超（E画分）、 5 0 0以下（F画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物及び酸分解物の各分画物を調製した。参考例 9

市販の塩蔵モズク 5 kgを 2 0リツトルのエタノールと混合し、はさみで細断した。 1晚放置後ろ紙でろ過し、得られた残查を 1 2. 5 リットルの水に懸濁し、 9 5 °Cで 2時間処理した。処理液をろ紙によりろ過後、 3 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 2. 5%の塩化セチルピリジニゥム溶液を 2 6 0 Om 1添加し 3日放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に 2. 5リットルの 3 5 OmlV [の塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を 3回繰り返した。得られた沈殿に 4 0 Om 1の 4 0 OmM 塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、 8 0 %となるようにエタノールを添加して 3 0分間攪拌後ろ紙でろ過した。得られた残渣に 5 0 0 m lの塩化ナトリゥ厶飽和 8 0 %エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、 1 リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノ —ルを添加して 3 0分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の 2 6 O n mの吸光度がゼロになるまで繰り返した（通常 5回）。得られた残査を 1. 5リットルの 2 Mの塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離により除去し、あらかじめ 2 Mの塩化ナトリゥムにより平衡化した 1 0 0m lの DEAEセルロファイン A— 8 0 0のカラムを素通しさせた。素通り画分を排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、限外ろ過により溶液を 2 mMの塩化ナトリゥムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、 22. 9 gのモズク由来フコィダンを得た。参考例 1 0

( 1 ) 乾燥したマクサ 5 0 gをはさみで細断し、 5 0 0 m 1の 8 0 %ェタノ一ル中に懸濁後 25 °Cで 3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを 1 リットルの 1 0 OmMの塩化ナトリゥムを含む 3 OmMのリン酸ナトリゥム緩衝液（P H 6. 5) に懸濁し、 95°Cで 2時間処理後、穴径 1 0 6 /mのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に上記のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、 3リツトルとし、 5 gの活性炭を添加し、 25°Cで 1晚攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で 20 0 m

1に濃縮後、限外ろ過機により溶液交換して 1 OmM塩化ナトリウム溶液とした。溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、マクサ由来硫酸化多糖画分の乾燥物を 2. 3 g得た。

(2) 参考例 1 0— （ 1 ) 記載の方法により乾燥ォゴノリ 5 0 gよりォゴノリ由来硫酸化多糖 4. 4 gを調製した。また、同様に乾燥べテロクラディアキヤビラセラより、ぺテロクラディア由来硫酸化多糖 1. O gを調製した。

(3) —① 市販の乾燥レソニァニグレセンスの粉末 1 k gを 1 0リットルの 8 0%エタノール中に懸濁後 25°Cで 3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを 20リットルの 1 0 OmMの塩化ナトリゥムを含む 3 OmMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 5) に懸濁し、 9 5°Cで 2時間処理後、穴径 1 0 6 / mのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に 1 0 O gの活性炭、 2. 4 リットルのエタノール、 6, 0 0 0 Uのアルギン酸リア一ゼ Kを添加し、 2 5°C で 22時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量 1 0万のホロファィバーを装着させた限外ろ過機で 1. 2リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、 5°Cで 24時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶液交換して 1 0 OmM塩化ナトリウム溶液とした。この溶液を 4 °C以下に冷却後、塩酸により pHを 2. 0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清の pHを水酸化ナトリウムにより 8. 0 とし、 2リットルに濃縮後、限外ろ過機により 2 OmMの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、レソニァ由来フコィダン画分の乾燥物を 4 1 gを得た。

(3) —② 上記の凍結乾燥物 6 gを 1 0 OmMの塩化ナトリウムを含む 60 Om lの 2 OmMイミダブールー塩酸緩衝液（pH 6) に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化した 5リットルの DEAE—セル口ファイン A— 8 0 0にかけ、 1 0リツトルの同緩衝液で洗浄後、 1 0 0〜 1 6 0 OmMの塩化ナトリゥムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に使用した液量は 1 3リットルで、分取は 1本あたり 5 0 Om 1で行った。溶出画分のうち 25 OmM, 5 3 0 mM、及び 70 OmM付近の塩化ナトリウム溶出画分をそれぞれ 5 0 Om 1ずつ純水で透析し、凍結乾燥して凍結乾燥物をそれぞれ DEAE 3 3画分、 DEAE 37画分、 DE AE 4 0画分と命名し、それぞれ 57mg、 24mg、及び 6 2mg得た。参考例 1 1

マナマコを 5 k g解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量 20 O g 当り 5 0 Om 1のアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、 1 4 0 gの乾燥物を得た。この乾燥物に 0. 4 Mの食塩水 2. 8リットルを加え、 1 00でで 1時間処理後、ろ過し、残渣を 0. 4 Mの食塩水で充分洗浄し、抽出液 3. 7リツトルを得た。この抽出液に 5 %のセチルピリジニゥムクロリドを沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を 0. 4M の食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、攪拌しながら 4リットルのエタノールを添加し、 1時間攪拌後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、 80%エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。得られた沈殿を 2リットルの 2M食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量 3万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し 3. 7 gのナマコ由来フコィダンを得た。参考例 1 2

寒天末（ナカライテスク株式会社製） 500mgを 1 00mlの蒸留水に懸濁後、加熱し、寒天を溶解させた。その後、 45 °Cまで冷却し 45 °Cで保温した。

この寒天溶解液に X 50 /Sァガラーゼバッファー（FMC社製： /3ァガラ一ゼに付属）を 2ml添加し、 l U/zz l ァガラーゼ（FMC社製） 1 00^ 1を添加した。この溶液を 45でで 24時間保温後、 2. 5倍量のエタノールを添加し、冷却後遠心分離して、沈澱を回収した。この沈澱を乾燥し、 20mlの蒸留水に溶解した。この溶解液を凍結乾燥してパウダー状のァガ口べクチン画分を調製した。参考例 1 3

(1) スピルリナプラテンシス（Spirulina platensis ) の乾燥菌体 1 0 g を 1 00m 1のクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 5回繰り返した。その後、 1 0 Om 1のエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 0 Om 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60°Cで保温した後、遠心分離して上清を得た。この上清をさらにろ過し、濾液に 2. 5倍量のェ夕ノールを添加して、一 20°Cで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のスピルリナ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。

(2) 乾燥スピルリナ粉末（発売：（株）スピルリナ研究所） 2 O gをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、 4 0 0 m lのァセトンを加え、 8 0 0 0 r p m、 1 0分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。残渣を前記の操作と同じようにアセトン洗浄を 3回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、 9 0 %エタノールで 4 回、 8 0%エタノールで 4回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。

エタノール洗浄残渣に 6 0 0 m 1の 1 0 OmMの塩化ナトリウムと 1 0 %エタノールを含む 3 OmMのリン酸緩衝液（pH7. 0) を加え、室温で 1 8時間攪拌した。この混合物を 1 0 0 0 0 r pmで 4 0分間遠心分離し、上清を得た。上清に混入した不溶物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量 1万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で 30 Om l まで濃縮した後、 2リットルの 1 0%エタノールを含む 1 0 OmM塩化ナトリウ厶を加えながら限外濾過した。この後、 1 0%エタノール及び 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 OmMイミダゾールー塩酸緩衝液（pH 7. 0) に溶媒置換し、スピルリナ高分子画分を 24 0 m lを得た。

スピルリナ高分子画分を 1 0 %エタノール及び 5 OmM塩化ナトリウムを含む 1 OmMィミダゾ一ルー塩酸緩衝液（pH7. 0) で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 8 0 0カラム（Φ3χ 14.2cm ) に添加して、同じ緩衝液 3 60 m 1でカラムを洗浄した後、 0. 0 5M (20 Om 1 ) カヽら 2M (20 Om 1 ) までの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出液は一本あたり 1 Om lで分画した。溶出画分のうち、フラクション No.14 から 30までをスピルリナ硫酸化多糖画分— I (SSP-I ) 、フラクション No.69 から 77までをスピルリナ硫酸化多糖画分— I I (SSP-II) 、フラクション No.78 から 83までをスピルリナ硫酸化多糖画分- I I I (SSP-III ) 、フラクション No.84から 99までをスピルリナ硫酸化多糖画分— IV (SSP-IV) とそれぞれ名付けた。 SSP-I、 SSP-IK SS Ρ-ΙΠ 及び SSP-IVを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ 200mg、 260mg、 1 00 m g及び 60 m gであった。

(3) クロレラブルガリス（Chlorel la vulgaris) の乾燥菌体 1 O gを 1 0 Omlのクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。その後、 1 0 Om 1のエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 00m 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60°Cで保温した後、ろ過した。濾液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、一 20°Cで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダ一状のクロレラ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。

(4) 乾燥クロレラ粉末（発売：（株）クロレラ 'センタ一） 20 gをホモジナイザ一（日本精機社製）に入れ、 400 m 1のアセトンを加え、 8000 r p m、 1 0分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。残渣を以上の操作と同じようにアセトン洗浄を 3回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、 90%エタノールで 4 回、 80 エタノールで 4回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。

エタノール洗浄残渣に 600 m 1の 1 00 mMの塩化ナトリウムと 1 0 %エタノールを含む 3 OmMのリン酸緩衝液（pH7. 0) を加え、室温で 1 8時間攪拌した。この混合物を 1 0000 r pmで 40分間遠心分離し、上清を得た。上清に混入した不溶物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量 1万のホロフアイバーを装着させた限外濾過装置で 310ml まで濃縮した後、 3リットルの 1 0%エタノールを含む 1 0 OmM塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、 1 0%エタノール及び 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 1 OmMイミダゾールー塩酸緩衝液（pH7. 0) に溶媒置換し、ク πレラ高分子画分を 203 mlを得た。

クロレラ高分子画分を 1 0%エタノール及び 5 OmM塩化ナトリウムを含む 1 OmMィミダゾ一ルー塩酸緩衝液（pH7. 0) で平衡化した D E A E—セル口ファイン A— 800カラム（Φ3χ 14.2cm ) に添加して、同じ緩衝液 297 m 1でカラムを洗浄した後、 0. 05M (200ml) から 2M (200ml) までの塩化ナトリウムのグラジェントにより溶出させた。溶出液は一本あたり 1 0 mlで分画した。溶出画分のうち、フラクション No.63から 68までをクロレラ硫酸化多糖画分一 I (CPS-I ) と名付け、フラクション No.69 から 75までをクロレラ硫酸化多糖画分一 I I (CPS-II) と名付けた。 CSP-I 及び CSP-IIを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ 1 4 Omg及び 20 Omgであつた。

(5)市販のョモギ（Altemisia princeps pampan ：阪本漢方堂製）を粉砕したョモギ粉末 1 08を1 0 Om 1のクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。その後、 1 0 Om 1のエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 5回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 0 Om 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60°Cで保温した後、ろ過した。濾液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、一 20°Cで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿とョモギ上清画分を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してバウダ一状のョモギ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。

(6)乾燥ョモギ葉（発売：阪本漢方堂） 50 gをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、 50 Om 1のアセトンを加え、 8000 r pm、 1 0分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。以上の操作を 2度行レ、、得られた 1 00 gのョモギ葉の残渣をホモジナイザーに入れ、 50 Om 1のアセトンを加えて、 8000 r pm、 1 0分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過し、残渣を得た。この操作を 4回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、 90%エタノールで 4回、 8 0%エタノールで 4回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。

エタノール洗浄残渣に 5リットルの 1 0 OmMの塩化ナトリウムと 1 0%エタノ一ルを含む 3 OmMのリン酸緩衝液（pH 8. 0) を加え、室温で 1 9時間攪拌した。この混合物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量 1万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で 2リットルまで濃縮した後、 1 0リツトルの 1 0%エタノールを含む 1 0 OmM塩化ナトリゥムを加えながら限外濾過した。この後、 5 0 0 m lまで濃縮し、 1 0%ェタノ —ル及び 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 OmMイミダゾールー塩酸緩衝液（ pH 7. 0) に溶媒置換した。この液をビーカーに移し、 l gの活性炭を入れ、室温で 4 0分間攪拌した後、 1 0 0 0 0 r pm、 4 0分間遠心分離した。上清に混入した活性炭は濾紙で濾過して、除去した。このようにして、ョモギ葉高分子画分を 5 6 0 m lを得た。

ョモギ葉高分子画分を 1 0%エタノール及び 5 OmM塩化ナトリウムを含む 1 OmMイミダゾ一ルー塩酸緩衝液（pH 7. 0) で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 8 0 0カラム（Φ3.5 X 31cm) に添加して、同じ緩衝液 94 0 m 1でカラムを洗浄した後、 0. 0 5M (6 0 0m l ) から 2M (6 00m l ) までの塩化ナトリウムのグラジェントにより溶出させた。溶出液は一本あたり 1 0 m lで分画した。溶出画分のうち、フラクション No.180から 202 までをョモギ葉酸性多糖画分（YAP ) と名付け、フラクション No.203から 270 までをョモギ葉硫酸化多糖画分（YSP ) と名付けた。 YAPを蒸留水に対して充分透折し、凍結乾燥したところ、 25 0 mgであった。

ョモギ硫酸化多糖画分をさらに分画するために、ョモギ葉硫酸化多糖画分を 3 リットルの 1 0%エタノール及び 1 0 OmM塩化ナトリウムを含む 1 OmMィミダゾール-塩酸緩衝液（pH7. 0) で透析した。透析した硫酸化多糖画分（3 27m l ) を同じ緩衝液で平衡化した DE A E—セル口ファイン A— 8 0 0力ラム（(D3cm x 14.2cm) に添加した。カラムを 273mlの緩衝液で洗浄した後、 0. 1M (200ml) -2M (200ml) の塩化ナトリゥムのグラジェントで溶出した。溶出液は 1本あたり 5mlで分画した。溶出画分のうち、フラクシヨン NO.140から 154 までをョモギ葉硫酸化多糖画分— I (YSP-I ) と名付け、フラクション No.155から 200 までをョモギ葉硫酸化多糖画分— I I (YSP- II) と名付けた。 YSP-I と YSP- 1【をそれぞれ蒸留水に対して、充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ 2017 2及び1 3 Omgであった。

YSP-II (1 1 9. 4mg) に 1 0 %エタノールを 59. 71111及ぴ0. 2 M塩化ナトリウムを含む 1 OmMィミダゾ一ルー塩酸緩衝液（pH7. 0) を加え、室温で一晩攪拌して溶解した。溶解した YSP-I Iは同じ緩衝液で平衡化した D E A E—セル口ファイン A— 800カラム（02.5 X 10.2cm) に添加した。カラムを 200 m 1の緩衝液で洗浄した後、 0. 2M (1 00ml) — lM (1 00m 1 ) の塩化ナトリゥムのグラジェン卜で溶出した。溶出液は 1本あたり 5m 1で分画した。溶出画分のうち、フラクション No.54から 70までをョモギ葉硫酸化多糖画分— I 1— 2 (YSP-II-2) と名付け、フラクション No.71 から 90までをョモギ葉硫酸化多糖画分— I I一 3 (YSP-II-3) と名付け、フラクション No.91 から 1 20までをョモギ葉硫酸化多糖画分— I I一 4 (YSP-II-4) と名付けた。 YSP - II -2、 YSP-II-3及び YSP-II-4をそれぞれ蒸留水に対して、充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ 39. 5mg、 6 1mg、 57. 3 m であった。

(7)市販の食用二ガウリをミキサーで粉砕した粉砕物を凍結乾燥し、二ガウリ乾燥物を得た。二ガウリ乾燥物 1 0 を1 00m 1のクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 5回繰り返した。その後、 1 00mlのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 00m 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60てで保温した後、ろ過した。濾液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、 — 20°Cで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。

(&) 市販のキダチアロエの葉 5枚から透明状の葉肉部分を回収し、凍結乾燥した。このアロエ葉肉凍結乾燥物 0. 48 1 gを 1 0 Οπι 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60てで保温した後、ろ過した。濾液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、 — 20でで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してバウダー状のァ口ェ葉肉由来硫酸化多糖を含有する画分を調製した。

—方、上記方法で透明状の葉肉部分を回収した残りの緑色の葉表面部分を粉砕後、凍結乾燥した。その凍結乾燥物 3. 43 gを 1 0 Om 1のクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。その後、 1 00ml のエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 0 Omlの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60°Cで保温した後、ろ過した。濾液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、一 2 (TCで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のアロエ葉表面物由来硫酸化多糖を含有する画分を調製した。参考例 1 4

( 1 ) D— （ + ) —グルコース 200 mg ( 1. 1 mmo 1 ) をピリジン 1 0 mlに溶解し、室温にて Pyridine Sulfer Trioxide Complex (Py r · S〇₃ ：東京化成） 1. 05 g (6. 6 mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌した。反応液を水で希釈し、飽和水酸化バリウム水溶液で pHを中性付近に調整してから減圧乾固した。得られた濃縮物に再度水を添加し再び減圧乾固した。この操作をもう一度繰り返した。得られた濃縮物に少量の水を添加し遠心で硫酸バリウムの沈澱を除去し、得られた上清を陽イオン交換カラム〔アンバーライト I RA— 1 20 (Na⁺ ) (オルガノ）〕に供した。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化 D— （ + ) -グルコースナトリウム塩 70 0 mgを調製した。

(2) D— （ + ) —ガラクトース 24 Omg ( 1. 3mmo 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Py r ' S0₃ 1. 05 g (6. 6mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 6 0で 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化 D— ( + ) —ガラクトースナトリゥム塩 4 0 6 mgを調製した。

(3) D— ( + ) —マンノース 20 Omg ( 1. 3mm o 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Py r ' S0₃ 1. 05 g (6. 6mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 6 O'C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化 D— ( + ) —マンノースナトリウム塩 70 Omgを調製した。

(4) マルトース 205 mg (0. 5 7mmo 1 ) をピリジン 1 Om lに溶解し、室温にて Py r · S 0₃ 8 1 6 mg (5. 2mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60度 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4 - （ 1 ) と同様の操作で、硫酸化マルトースナトリウム塩 52 Omgを調製した。 ·

(5) マルトトリオース 2 0 Omg ( 0. 4mmo 1 ) をピリジン 1 Om 1に溶解し、室温にて Py r ' SOs 7 0 Omg (4. 4 mm o 1 ) を添加した後、室温数分、 6 0度 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化マルトトリオースナトリウム塩 42 Omgを調製した。

(6) トレハロース 25 Omg (0. 73mmo 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Py r · S0₃ 1. 1 g ( 7 mm o 1 ) を添加した後、室温数分、 6 0°C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化トレハロースナトリウム塩 75 Omgを調製した。

(7) ラクト一ス 222mg (0. 62mmo 1 ) をピリジン 1 Om lに溶解し、室温にて Py r · S〇₃ 7 8 5 mg (4. 9mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60°C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化ラクトースナトリウム塩 476 mgを調製した。

(8) スクロース 220mg (0. 62mmo 1 ) をピリジン 1 Omlに溶解し、室温にて Py r · S 0₃ 785mg (4. 9mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60°C1時間攪拌し、以下、参考例 1 4— (1) と同様の操作で、硫酸化スクロースナトリウム塩 48 1 mgを調製した。

(9) ラクッロース 370 m g ( 1. 08 mm 01 ) をピリジン 1 0 in 1に溶解し、室温にて P y r · S O3 1. 38 g (8. 8mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一 ( 1 ) と同様の操作で、硫酸化ラクッロースナトリウム塩 1 gを調製した。

(1 0) メリビオース 379 m g ( 0. 9mmo 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Py r · SOs 1. 43 g (9. Ommo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4— ( 1 ) と同様の操作で、硫酸化メリビオースナトリウム塩 95 Omgを調製した。

(1 1 ) D— ( + ) —キシロース 1 5 Omg ( 1. Ommo 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Pyr ' SO₃ 770mg (4. 8mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化 D— （ + ) —キシロースナトリウム塩 35 Omgを調製した。

(1 2) 2—デォキシーグルコース 20 Omg ( 1. 2mm 01 ) をピリジン 1 0mlに溶解し、室温にて Py r ' S0₃ 920 m g ( 5. 8mmo l) を添加した後、室温数分、 60°C1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（1) と同様の操作で、硫酸化 2—デォキシーグルコースナトリウム塩 50 Omgを調製した

O

(1 3) D—グルシトール 1 50 m g ( 0. 83 mm o 1 ) をピリジン 1 0 m 1に溶解し、室温にて Py r ■ S 0₃ 955 mg (6mmo 1) を添加した後、室温数分、 60°C1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（1) と同様の操作で、硫酸化 D—グルシトールナトリゥム塩 57 Omgを調製した。 (1 4) セロビオース 1 47mg (0. 43 mm o 1 ) をジメチルスルフォキシド 5m 1に溶解し、室温にて Py r · S 0₃ 657 mg (4. 1 3mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60°C1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（1) と同様の操作で、硫酸化セロビオースナトリウム塩 23 Omgを得た。

( 1 5) ィソマルトース 62mg (0. 1 8mmo 1 ) をピリジン 5m 1に溶解し、室温にて P y r · S 0₃ 275 mg ( 1. 73mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化イソマルトースナトリウム塩 1 62mgを得た。

(1 6) ッラノース 293mg (0. 86 mm 01 ) をピリジン 5mlに溶解し、室温にて Py r ' S0₃ 1 3 1 Omg (8. 22mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60°C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一 ( 1 ) と同様の操作で、硫酸化ッラノースナトリウム塩 835 mgを得た。

(1 7) パラチノース 31 5mg (0. 875 mmo 1 ) をピリジン 5mlに溶解し、室温にて Py r · S 0₃ 1. 34 mg (8. 4mmo l) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化パラチノースナトリゥム塩 845 mgを得た。

(1 8) ひ一 D—夕ロース 56mg (0. 31 mm 01 ) をピリジン 5mlに溶解し、室温にて Py r - SO₃ 300mg (l. 9mmo 1 ) を添加した後、室温数分、 60 °C 1時間攪拌し、以下、参考例 1 4一（ 1 ) と同様の操作で、硫酸化 D- 夕ロースナトリウム塩 1 5 Omgを得た。

(1 9) ひ—サイクロデキストリン 7 gの完全ァセチル化体を無水酢酸と硫酸の混合液（49 : 1) により処理することによりマルトへキサオースの完全ァセチル化体を得、これをメタノール中、ナトリウムメトキシド（NaOMe) で脱ァセチル化することにより、マルトへキサオース 1. 5 gを得た。マルトへキサオース 79mg (0. 83mmo 1 )、ピペリジン硫酸 1. 33 gをジメチルスルフォキシド（DMSO) 5mlに溶解し、 80°C2時間攪拌した。反応液を冷却後、分子量 1 000カツ卜の透析膜にて 2日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライト I RA— 1 20 (Na⁺ ) (オルガノ）〕に供じた。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化マルトへキサオースナトリウム塩 1 67 mgを調製した。

(20) —サイクロデキストリン 2. 2 gの完全ァセチル化体を無水酢酸と硫酸の混合液（49 : 1) により処理することによりマルトヘプ夕オースの完全ァセチル化体得、これをメタノール中、 NaOMeで脱ァセチル化することにより、マルトヘプ夕オース 0. 5 gを得た。マルトヘプ夕オース 2 Omg (0. 8 3mmo l) 、ピぺリジン硫酸 325 m gを DMS 05 m 1に溶解し、 80 °C 2 時間攪拌した後、以下、参考例 1 4— (1 9) と同様の操作で、硫酸化マルトへプ夕オースナトリウム塩 45. 6mgを調製した。

(21) マルトへキサオースの完全ァセチル化体をジクロロメタン中、トリクロロァセトニトリル、炭酸カリウム存在下攪拌することにより、ァセチル化マルトへキサオースのィミデート体を得た。ァセチル化マルトへキサオースのィミデ ―ト体とドデカノールをジクロロメタン中、トリフルォロメタンスルホン酸トリメチルシリルを触媒として反応し、得られた反応物を脱ァセチル化することによりドデシルーマルトへキサオースを得た。ドデシルーマルトへキサオース 370 mg (0. 32mmo 1 ) を DMS〇 1 0mlに溶解し、 80°Cにて 2時間攪拌した後、以下、参考例 1 4一（1 9) と同様の操作で、硫酸化ドデシルーマルトへキサオースナトリゥム塩 70 Omgを調製した。

(22) スターチ 276mgを DMSO l 0mlに溶解し、室温にて Py r · S 0₃ 2. 76 gを添加した後、 80°Cにて 2時間攪拌した。反応液を冷却後、ァセトンを添加し、生じた不溶画分をメタノールで数回洗浄した後、水で希釈して陽イオン交換カラム〔アンバーライト I RA— 1 20 (Na⁺ ) (オルガノ）〕に供じた。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し、硫酸化スターチナトリウム塩 350mgを調製した。 (23) カードラン 1 1 1 mgを DMS〇 5m 1に溶解し、室温にて Py r · SOs 1. 1 1 gを添加した後、 8 0°Cにて 2時間攪拌した。反応液を冷却後、アセトンを添加し、生じた不溶画分を水で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水で P H中性付近に中和した後、分子量 1 0 0 0カツトの透析膜にて 1日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライト I RA— 1 2 0 ( a + ) (オルガノ）〕に供じた後、減圧乾固することにより硫酸化カードランナトリウム塩 1 8 Omgを調製した。

(24) ぺクチン 26 7111£を01^3051111に溶解し、室温にて Py r · S 〇₃ 2. 6 7 gを添加した後、 8 0°Cにて 2時間攪拌した。反応液を冷却後、参考例 1 4— (23) と同様の操作で、硫酸化べクチンナトリゥム塩 3 84 mgを調製した。実施例 1

( 1 ) 1 X 1 0⁵ c e l l s Zm l となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MR C- 5細胞（CCL 1 7 1 _:大日本製薬社製、 c o d e . 0 2 - 0 2 1 ) 5 0 0 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 37。C、 5 % C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料として参考例 1一（ 1 ) に記載のガゴメ昆布由来フコイダンを最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 gZm l となるように添加し、さらに 24時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF ) ELISA Kit (フナコシ社製、 C o d e. RS- 0 64 1- 00) を用いて、培地中の H G Fの量を測定した。

コントロールとして試料と同量の蒸留水を添加した。コントロールの HGF量は 7. S n gZm lであり、この値を 1 0 0 %とした、各試料添加区の HG F産生量を表 1に示す。なお、実験は全て 2連で行い、その平均値を採用した。表 1 ガゴメ昆布由来フコィダン HGFの産生量

0 1 00

1 2 1 4

1 0 339

1 00 339

ガゴメ昆布由来フコィダン添加群は、蒸留水添加のコントロールより、有意に HGFの産生量が増加していた。またへパリン、あるいは低分子化へパリンを添加した場合に比べ、顕著に HGFの産生量が増加することにより、ガゴメ昆布由来フコィダンはこれまで HGFの産生誘導が確認されているへパリンあるいは平均分子量約 5000の低分子化へパリンより高い HGF産生を促進する活性を有ることが示された。

( 2 ) 実施例 1一（ 1 ) と同一の条件で、参考例 1一（ 2 ) 記載の方法で調製した I画分、 I I画分、 I I I画分、参考例 2記載の方法で調製した 7— 1 2 S Fd_F、参考例 4記載の方法で調製した 6-2 S、参考例 6記載の方法で調製したワカメメカブ由来フコィダン、及び参考例 7記載の方法で調製したヒバマ夕由来フコィダンのそれぞれの H G F産生誘導作用を測定した。その結果を表 2 〜4に示す。試料濃度 HGFの産生量

(UL s m 1 ) (%)

I画分 1 1 67

1 0 0 234

I I画分 1 20 8

1 0 0 3 5 9

I I I画分 1 1 4 6

1 0 0 2 9 1

(3ン卜 ϋ- -ルの HGF産生量は 8. 3 n g/m 1であった。）

表 3 試料濃度 HGFの産生量

ヒノくマ夕由来フコィダン 1 1 4 8

1 0 2 4 6

1 0 0 3 3 5 ワカメメカブ由来 1 1 7 9

フコィダン 1 0 2 5 0

1 0 0 2 9 1

7 - 1 2 S F d -F 1 1 4 9

1 0 2 7 6

1 0 0 3 3 9

(コントロールの HGF産生量は 8. 6 n gZm lであった。）

試料濃度 HGFの産生量

6 - 2 S 1 0 1 1 2

1 0 0 2 4 6

(コントロールの HGF産生量は 9. 9 n gノ m lであった。）ガゴメ昆布由来フコィダンの分画物、即ち、 U—フコィダン、 F—フコィダン、ヒバマ夕由来フコィダン、ワカメメカブ由来フコィダン、 F—フコィダン由来の 7— 1 2 SFd— F、 U—フコィダン由来の 6— 2 Sにそれぞれ強い HGF 産生誘導作用が認められた。また、参考例 1一（ 1 ) 記載のマ昆布由来フコイダン、レソニァニグレセンス由来フコィダン、参考例 7記載のァスコフィラムノドスム由来フコィダン、参考例 8記載の酸分解物、及び A〜F画分もそれぞれ強い H G F産生誘導作用が認められた。

(3) ー① 参考例 1一（ 1 ) 記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダンの 2%溶液をクェン酸又は硫酸で pH 3に調製し、それぞれを 1 0 0°Cで加熱し、 3 0分後、 1時間後、 2時間後、 4時間後にそれぞれの加水分解液を調製し、その HGF産生誘導作用を実施例 1 - ( 1 ) と同一の条件で測定した。なお試料は酸分解液の 1 0倍希釈液を用いた。

表 5 試料加熱時間 HGFの産生量

{%) 未分解液 4 4 8 硫酸分解液 3 0分間 3 6 4

1時間 3 8 5

2時間 3 6 8

4時間 3 4 5 未分解液 4 8 0 クェン酸分解液 3 0分間 4 0 2

1時間 4 2 9

2時間 3 9 7

4時間 3 4 1

(コントロールの HGF産生量は 8. 6 n g/ 1であった。）

(3) —② 実施例 1一（3) —①で調製したガゴメ昆布由来フコィダンのクェン酸存在下での 4時間加熱処理物をゲルろ過により分画した。

すなわちトヨパール HW4 0 C 1. 5リットルを充塡したカラムを水で平衡化し、このカラムにガゴメ昆布由来フコィダンの加熱処理物 1 0m lをアプライし、その後流速 l m lノ分で水で溶出した。最初の 6 8 0 m lは、そのまま溶出し、その後 1 4m lづっ分画し、加熱処理物のゲルろ過分画物を得た。

この分画物を TLC (溶媒、酢酸プチル：酢酸：水 = 3 : 4 : 3、検出剤オシォノール硫酸）で分析し、スポットのパターンより、分画 1 2〜1 3、 1 6〜1 7、 26〜40等のゲルろ過分画として集め、凍結乾燥した。得られた各画分のの凍結乾燥物を、 1 0 Omg/m 1になるように水に再溶解し、その HGF産生誘導作用を実施例 1一（1) と同一の条件で測定した。

その結果、分画 1 2〜1 3、及び分画 1 6〜1 7の各々の分画物に HGF産生誘導活性が認められた。

分画 1 2〜1 3の分画物は構造決定を行い、その分析値は、国際公開第 91/ 26896号パンフレツトに記載の下記式（V I I I) で表される化合物の分析値と一致し、グルクロン酸とマンノースの重合体に H G F産生誘導活性が認められた。

(4)市販のデキストラン硫酸ナトリウム（シグマ社製）溶液を調製し、その HGF産生誘導作用を実施例 1一（1)記載の方法にしたがって測定した。表 6 に示すように、デキストラン硫酸ナトリウムは HGF産生誘導作用を示した。表 6 デキストラン硫酸ナトリウム HGFの産生量

(平均分子量） ( g/m 1 )

1万 1 5 88

1 0 655

1 0 0 78 7

8千 1 3 95

1 0 5 73

1 0 0 6 95

5千 1 3 9 8

1 0 4 2 1

1 0 0 5 65

(コントロールの HGF產生量は 6. 7ngZmlであった。）

(5) 市販の； I一力ラギ一ナン（ナカライテスク社製）の溶液を調製し、その GF産生誘導作用を実施例 1一（ 1 ) の方法に従って測定した。表 7に示すように； I—カラギーナンは HGF産生誘導作用を示した。

λ—力ラギーナン HGFの産生量

{p. g/m 1 ) (%)

1 1 5 2

1 0 1 4 0

(コントロールの HGF産生量は 1 3. 4 n g/ 1であった。）

(6) —① 市販のアルギン酸（和光純薬社製：膨潤性）の溶液を調製し、その HGF産生誘導作用を実施例 1 - （ 1 ) の方法に従って測定した。表 8に示すようにアルギン酸は HGF産生誘導作用を示した。表 8 アルギン酸 HGFの産生量

( z /m 1 ) {%)

1 1 2 5

1 0 1 5 4

1 0 0 3 2 7

(コントロールの HGF量は 7. 3 n g/m lであった。）

( 6) ー② 同様に、アルギン酸（膨潤性、和光純薬社製：試料①）、アルギン酸（非膨潤性、和光純薬社製：試料②）、アルギン酸（ 1 0 0〜1 5 Ocp、和光純薬社製：試料③）、アルギン酸（ 3 0 0〜 4 0 0 cp、和光純薬社製：試料④ ) 、アルギン酸（5 0 0〜6 0 Ocp. 和光純薬社製：試料⑤）の HGF産生誘導活性を検討した。表 9に示したように、試料①から⑤は全て HGFの産生を誘導した。以上のことより、酸性多糖であるアルギン酸にも HGF産生誘導活性があることが明らかになった。表 9

HGFの産生量（）

試料① 試料② 試料③ 試料④ 試料⑤

1 0 1 54 1 38 1 1 5 1 27 1 04

1 00 327 1 58 1 84 1 52 1 87

(試料①、 ②のコントロールの HGF産生量は 7. 3ngZml、試料③、 ④、 ⑤のコントロールの HGF産生量は 6. 7ngZmlであった。）

(6) ー③ 同様に、ぺクチン酸（ナカライテスク社製）の HGF産生誘導活性を検討した。表 1 0に示したように、ぺクチン酸は HGFの産生を誘導した。以上のことより、酸性多糖であるべクチン酸にも HGF産生誘導活性があることが明らかになった。

表 1 0 試料濃度 HGFの産生量

( g/m 1 ) ぺクチン酸 1 1 45

1 0 21 8

1 00 684

(コントロールの HGF産生量は 5. 91 n g/m 1であった。）

(7) サケ精子 DNA (株式会社二チロ社製）の HGF産生誘導活性を検討した。 DNAは最終濃度が 1、 1 0、 1 00 zgZm 1になるように添加した。表 1 1に示したように、サケ精子 DNAは HGF産生誘導活性を示した。表 1 1 試料 HGFの産生量

( g/m 1 ) (%)

1 1 1 0

サケ精子 DNA 1 0 1 82

1 00 285

(コントロールの HGF産生量は 9. 9ngZmlであった。）

(8)参考例 9、 1 1で調製したモズク由来フコィダン、ナマコ由来フコイダンの溶液を調製し、その HGF産生誘導作用を実施例 1 _ (1) の方法に従って測定した。表 1 2に示すように各フコィダンは HGF産生誘導作用を示した。表 1 2 試料 HGFの産生量

(u g/m 1 ) ナマコ由来フコィダン 1 2 8 2

1 0 3 5 6

1 0 0 4 9 5 モズク由来フコィダン 1 2 1 8

1 0 2 7 9

1 0 0 3 0 7

(コントロールの HGF量は 7. 7 T n g/Zm lであった。）

(9) 参考例 1 0で調製したマクサ由来硫酸化多糖（試料①）、ォゴノリ由来硫酸化多糖（試料②）、ぺテロクラディア由来硫酸化多糖（試料③）の溶液を調製し、実施例 1 - ( 1 ) と同様の方法で、 HGF産生誘導活性を検討した。試料 ①、 ③は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 gZm 1になるように、試料②は最終濃度が 1 0、 1 0 0 gZm lになるように添加した。表 1 3に示したように、試料①から③は全て H G Fの産生を誘導した。表 1 3 試料 HGFの産生量 in g/m 1 ) 試料① 1 1 00

1 0 1 77

1 0 0 1 6 9 試料② 1 0 1 1 7

1 00 1 98 試料③ 1 1 1 6

1 0 207

1 0 0 228

(コントロールの HGF産生量は 7. S n gZm lであった。）

( 1 0) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、参考例 1 0— （3) で調製したレソニァ由来フコィダン（試料①）、 DEAE33画分（試料②）、 DEAE37画分（試料③ )、 DEAE40画分（試料④）の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 gZm 1になるように添加した。表 1 4に示したように、試料①から④は全て HGFの産生を誘導した。表 1 4 濃度 HGFの産生量 (%)

ill g/m 1 ) 試料① 試料② 試料③ 試料④

1 1 38 1 0 5 235 1 2 1

1 0 1 67 22 1 25 3 254

1 0 0 33 1 2 6 5 2 6 1 29 5

(コントロールの HGF産生量は 1 1. 5 n gZm lであった。）

( 1 1 ) 実施例 1— ( 1 ) と同一の条件で参考例 3— ( 2 ) 記載の硫酸化フコガラクタン、参考例 1 2記載のァガロぺクチン、コンドロイチン硫酸 B (生化学工業社製）、コンドロイチン硫酸 D (生化学工業社製）の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 /zgZm 1になるように添加した。表 1 5〜1 7に示したように、硫酸化フコガラクタン、了ガロぺクチン、コンドロィチン硫酸は HGFの産生を誘導した。表 1 5 試料濃度 HGFの産生量

(n g/ 1 ) (%) 硫酸化フコガラクタン 1 1 94

1 0 35 5

1 0 0 4 29

(コントロールの HGF産生量は 4. S n gZm lであった。）表 1 6 試料 HGFの産生量

( g/m 1 ) ァガロぺクチン 1 1 1 7

1 0 1 2 1

1 0 0 2 5 6

(コントロールの HGF産生量は 6. 7 n gZm lであった。）表 1 7 試料 HGFの産生量

コンドロイチン硫酸 B 1 1 1 7

1 0 1 2 1

1 0 0 2 5 6 コンドロィチン硫酸 D 1 0 1 1 9

1 0 0 1 4 4

(コントロールの HGF産生量は 1 1. 9 n g/m lであった。）

( 1 2) 実施例 1一（ 1 ) と同一の方法で参考例 1 3— （ 1 ) 、 1 3 - (3) 、 1 3— （5) 、 1 3— (7) 、 1 3— (8) でそれぞれ調製したスピルリナ由来硫酸化多糖、クロレラ由来硫酸化多糖、ョモギ由来硫酸化多糖、二ガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、及びアロエ葉表面物由来硫酸化多糖の HGF産生誘導活性を検討した。スピルリナ由来硫酸化多糖、ョモギ由来硫酸化多糖は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 g/m 1になるように添加した。クロレラ由来硫酸化多糖、二ガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、アロエ葉表面物由来硫酸化多糖はそれぞれ最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0、 1 0 0 0 /m 1になるように添加した。表 1 8〜2 0に示したように、スピルリナ由来硫酸化多糖、クロレラ由来硫酸化多糖、ョモギ由来硫酸化多糖、二ガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、アロエ葉表面物由来硫酸化多糖は HGFの産生を誘導した。表 1 8 試料 HGFの産生量

(u s/m 1 ) (%) スピルリナ由来硫酸化多糖 1 1 4 9

1 0 2 9 3

1 0 0 3 9 8 クロレラ由来硫酸化多糖 1 1 0 8

1 0 1 4 9

1 0 0 1 7 5

1 0 0 0 3 9 6

(コントロールの HGF産生量は 7. 9 n gZm lであった。）表 1 9 試料 HGFの産生量

{β g/ 1 ) (%) ョモギ由来硫酸化多糖 1 1 3 7

1 0 2 8 4 1 0 0 2 6 5

(コントロールの HGF産生量は 1 2. 7 n g/m 1であった。）

表 20 試料濃度 HGFの産生量

二ガウリ由来硫酸化多糖 1 1 1 1

1 0 1 04

1 0 0 1 33

1 0 0 0 1 9 0 アロエ葉肉由来 1 1 1 1

硫酸化多糖 1 0 1 25

1 00 1 50

1 0 0 0 4 0 1 アロエ葉表面物由来 1 1 06

硫酸化多糖 1 0 1 25

1 0 0 1 20

1 0 0 0 328

(コントロールの HGF産生量は 8. 7 n g/m 1であった。）

( i 3) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、参考例 1 3— (2) で調整したスピルリナ分画物 SSP-I (試料①）、 SSP- II (試料②）、 SSP- ΠΙ (試料③）、 SS P - IV (試料④）の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 /Z gZm 1になるように添加した。表 2 1に示したように、試料①から④は全て H G Fの産生を誘導した。表 2 1 濃度 HGFの産生量 (%)

in gZm 1 ) 試料① 試料② 試料③ 試料④

1 24 0 1 6 5 1 4 1 2 1 8

1 0 24 3 1 5 2 270 282

1 0 0 3 02 2 1 2 28 0 35 1

(コント -ルの HGF産生量は、 7. 3 n g/m 1であった,

( 1 4) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、参考例 1 3— （4) で調整したクロレラ抽出物の CSP- 1 画分（試料①）、 CSP-II画分（試料②）の HGF産生誘導活性を検討した。試料①は最終濃度が 1 0、 1 00 / g/m 1、試料②は最終濃度が 1 0 0 gZm 1になるように添加した。表 22に示したように、試料①、 ②は H G Fの産生を誘導した。表 22 試料 HGFの産生量

試料① 1 0 1 1 1

1 0 0 1 7 3 試料② 1 0 0 1 7 5

(コントロールの HGF産生量は、 1 1. 4 n gZm lであった。） ( 1 5) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、参考例 1 3— （6) で調整したョモギ抽出物の YAP画分（試料①）、 YSP-I 画分（試料②）、 YSP-II画分（試料③ ) 、 YSP-II- 2画分（試料④）、 YSP-II -3画分（試料⑤）、 YSP-II-4画分（試料⑥ ) の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 zgZm 1になるように添加した。表 2 3、表 24に示したように、試料① から⑥は全て HGFの産生を誘導した。特に、 YSP- II画分（試料③）、 YSP-II— 3画分（試料④）、 YSP-II - 4画分（試料⑤）に強い HGF産生誘導活性が確認された。表 23 試料 HGFの産生量

試料① 1 0 1 2 1

1 0 0 26 6 試料② 1 1 04

1 0 1 4 8

1 0 0 3 8 1 試料③ 1 328

1 0 38 6

1 0 0 3 9 0

(コントロールの HGF産生量は 1 1. 5 n gZm lであった。）表 24

HGFの産生量（％)

i g/ 1 ) 試料④ 試料⑤ 試料⑥

1 1 5 2 29 0 22 6

1 0 4 6 2 38 3 3 22

1 0 0 4 75 32 1 3 1 4

(コントロールの HGF産生量は 7. 7 n gZm lであった。）

( 1 6) 実施例 1一（ 1 ) と同一の方法で参考例 1 4で調製した硫酸化マルト —スナトリウム塩、硫酸化マルトトリオースナトリウム塩、硫酸化ラクトースナトリウム塩、硫酸化スクロースナトリウム塩、硫酸化トレハロースナトリウム塩、硫酸化グルコースナトリウム塩、硫酸化ラクッロースナトリウム塩、硫酸化メリビオースナトリウム塩、硫酸化ガラクトースナトリウム塩、硫酸化マンノースナトリウム塩、硫酸化キシロースナトリウム塩、硫酸化 2—デォキシ—グルコースナトリウム塩、硫酸化グルシトールナトリウム塩、硫酸化セロビオースナトリウム塩、硫酸化イソマルトースナトリウム塩、硫酸化ッラノースナトリウム塩、硫酸化パラチノースナトリウム塩、硫酸化夕□—スナトリウム塩、硫酸化マルトへキサオースナトリウム塩、硫酸化マルトヘプ夕オースナトリウム塩、硫酸化ドデシルーマルトへキサオースナトリウム塩、硫酸化スターチナトリウム塩、硫酸化カードランナトリウム塩、硫酸化べクチンナトリウム塩の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0〃 gZm 1、又は 1 0、 1 0 0、 1 00 0〃g /m 1、又は 1 0 0 gZm 1になるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。また、硫酸化していないそれぞれの糖もそれぞれの硫酸化糖と同濃度で H G F産生誘導活性を測定した。

表 25〜34に示したように、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖は HGFの産生を誘導した。なお、硫酸化されていないそれぞれの糖は、 HGFを誘導しなかった更に硫酸化ドデシルーマルトへキサオースナトリウム塩の結果より、糖が脂質により修飾を受けていても HGF産生誘導活性は保持されることが明らかになつた _c 表 25 試料 HGFの産生量

(u s/m 1 ) (%) 硫酸化マルトース 1 1 4 2

ナトリウム塩 1 0 273

1 0 0 4 3 9 硫酸化マルトトリオース 1 1 5 1

ナトリウム塩 1 0 28 6

1 0 0 3 87

(コントロールの HGF産生量は 8. T n gZm lであった。）

表 2 6 試料 HGFの産生量

( ig m 1 ) (%) 硫酸化ラクトース 1 1 1 8

ナトリゥム塩 1 0 1 8 5

1 0 0 4 1 0 硫酸化スクロース 1 1 73

ナトリウム塩 1 0 3 5 5

1 0 0 5 0 1 硫酸化グルコース 1 1 7 8

ナトリウム塩 1 0 3 7 7

1 0 0 8 6 4

(コントロールの HGF産生量は 5. 5 n g/m 1であった。）表 2 7 試料濃度 HGFの産生量

( g/m 1 ) 硫酸化トレハロース 1 2 7 7

ナトリゥム塩 1 0 4 4 7

1 0 0 4 2 1

(コントロールの HGFの產生量は 4. 3 n gZm lであった。）表 2 8 試料濃度 HGFの産生量

( z g/m 1 ) (%) 硫酸化ガラクトース 1 0 0 1 6 6

ナトリゥム塩

(コントロールの HGF産生量は 1 2. 7 n g/m 1であった, 表 2 9 試料濃度 HGFの産生量

( g/m 1 ) {%) 硫酸化マンノース 1 1 1 2

ナトリウム塩 1 0 1 7 5

1 0 0 4 5 6

(コントロールの HGF産生量は 6. 2 n gZm lであった。）

表 3 0 試料 HGF産生量

( gZm 1 ) (%) 硫酸化ラクッロース 1 0 1 39 ナトリウム塩 1 0 0 3 76

1 0 0 0 5 8 3 硫酸化メリビオース 1 0 24 0 ナトリゥム塩 1 0 0 4 03

1 0 0 0 6 67 硫酸化キシロース 1 0 1 1 0 ナトリウム塩 1 0 0 1 1 2

1 0 0 0 2 84 硫酸化 2—デォキシ 1 0 1 27 グルコースナトリゥム塩 1 0 0 1 02

1 0 0 0 2 3 9 硫酸化グルシトール 1 0 1 1 2 ナトリウム塩 1 0 0 20 3

1 0 0 0 3 35

(コントロールの HGF産生量は 5. 9 n gZm lであった。）表 3 1 試料濃度 HGF産生量

in g/m 1 ) 硫酸化セロビオース 1 0 1 0 0

ナトリゥム塩 1 0 0 1 4 3

1 0 0 0 5 4 6 硫酸化ィソマルト一ス 1 0 1 3 4

ナトリゥム塩 1 0 0 3 0 1

1 0 0 0 4 7 7 硫酸化ッラノース 1 0 1 2 7

ナトリゥム塩 1 0 0 2 0 3

1 0 0 0 3 7 9 硫酸化パラチノース 1 0 1 3 2

ナトリゥム塩 1 0 0 2 7 8

1 0 0 0 5 1 9

(コントロールの HGF産生量は硫酸化セロビオースナトリウム塩が 1 1 . 1 n gZm 1、硫酸化イソマルトースナトリウム塩が 1 1. 3 n gZm 1、硫酸化ッラノースナトリウム塩と硫酸化パラチノースナトリウム塩が 8. 6 n g/m 1であった。）表 3 2 試料 HGFの産生量

(JI g/m 1 ) 硫酸化夕ロース 1 0 1 1 2

ナトリゥム塩 1 0 0 2 6 3

1 0 0 0 4 9 4

(コントロールの HGF産生量は 9. 5 n gZm lであった。）表 3 3 試料 HGFの産生量

硫酸化マルトへキサオース 1 0 4 0 7

ナトリウム塩 1 0 0 5 7 1

1 0 0 0 7 6 1 硫酸化マルトへプタオース 1 0 3 4 1

ナトリウム塩 1 0 0 4 8 6

1 0 0 0 7 0 6 硫酸化ドデシルー 1 0 2 8 9 マルトへキサオース 1 0 0 3 7 1 ナトリウム塩 1 0 0 0 3 5 9

(コントロールの HGF産生量は 8. 1 5 n gZm lであった。）表 34 試料 HGFの産生量

( z g/m 1 ) (%) 硫酸化スターチ 1 0 78 1

ナトリウム塩 1 00 864

1 000 804 硫酸化ガードラン 1 0 359

ナトリゥム塩 1 00 503

1 000 6 1 7 硫酸化ぺクチン 1 0 721

ナトリウム塩 1 00 780

1 000 648

(コントロールの HGF産生量は 8. 1 5ng//mlであった。）実施例 2

( 1 ) 実施例 1一（ 1 ) と同一の方法で参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンとプロスタグランジン、 I L一 1との HGF産生誘導作用に対する相乗効果について検討した。

すなわち当該フコィダンと PGE, (和光純薬社製）、 I L一 1ひ（ジンザィム社製）を同時に添加し、 HGF産生誘導活性の相乗効果を検討した。

フコィダン試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 00〃gZm 1になるように添加した。 PGE, は 0. 1、 1 uM、 I L一 1ひは 1 n g/m 1になるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。

それぞれ、フコィダン試料あるいは PGE, 、 I L一 1ひの単独添加時の産生量と比較して、その相乗効果について検討した。

その結果を表 35、 3 6に示す。表 35、 3 6において、コントロールの HG F産生量を 1 0 0%として表した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。表 3 5、 3 6に示すようにフコィダンと、 PGE, 又は I L— 1 ひの同時添加により、 H G Fの産生誘導に対する相乗効果が認められた。表 35 フコィダン添加量 PGEi 添加量（ αΜ)

(fi g/m 1 ) 0 0. 1 1

HGFの産生量 (%)

0 1 00 1 1 9 1 5 7 1 1 95 3 34 4 1 5

1 0 33 1 5 1 7 5 6 1

1 0 0 3 82 7 3 1 6 82

表 3 6 フコィダン添加量 I L- 1 ひ添加量 (n g/m 1 )

( g/ 1 ) 0 1

HGFの産生

0 1 0 0 1 6 3

1 2 0 6 4 2 1

1 0 3 5 0 6 7 2

1 0 0 4 0 3 7 8 0

(コントロールの HGF産生量は 9. 1 n gZm 1であった。）

(2) 実施例 2— （ 1 ) と同様の方法で参考例 2の 7— 1 2 SF d— Fとプロス夕グランジン、 I L一 1 との HGF産生誘導作用に対する相乗効果について検討した。 7— 1 2 SF d— Fと PGE! 、 I L- 1 ひを同時に添加し、 HGF産生誘導活性の相乗効果を検討した。それぞれの 7— 1 2 SF d— Fは最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 gZm 1になるように添加した。それぞれの 7— 1 2 S F d 一 F添加細胞にさらに同時に PGE, 、 I L一 1 ひを添加した。 PGE! は、 0 . 1、 1 zM、 1しー 1 は、 0. 1、 1 n g/m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。それぞれ、 7— 1 2 SF d— Fあるいは PGE, 、 I L— 1 ひの単独添加の産生量と比較して相乗効果について検討した。 HGFの産生量は、蒸留水のみを添加したネガティブコントロール 1 0 0 %として表した。その結果を表 3 7、 3 8に示した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。表 37

7 - 1 2 S PGE, 添加量（ /M)

F d-F 0. 1 1

添加量

( β g / 1 ) HGFの産生量（）

0 1 00 1 23 1 70 1 1 20 1 5 8 2 1 6

1 0 2 1 8 30 9 3 1 7 1 0 0 2 1 9 3 6 5 38 2

(コントロールの HGF産生量は 5. 1 n g/m 1であった。）

表 38

7 - 1 2 S I L- 1 ひ添加量（n gZm l )

Fd-F 0 0. 1 1

添加量

( g/m 1 ) HGFの産生量（）

0 1 0 0 1 30 1 5 1 1 1 4 0 1 6 8 1 5 9

1 0 1 9 1 1 54 20 8

1 0 0 2 0 3 25 5 222

(コントロールの HGF産生量は 5. 1 n g/m 1であった。）

実施例 3

( 1 ) 1 X 1 0⁵ c e 1 1 sZm 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D MEM培地に懸濁した KG— 1— C細胞（グリオ一マ：ヒューマンサイエンス振興財団販売）を 500 1ずつ 48穴の細胞培養プレートに入れ、 37 、 5 % C0₂ 存在下で一晚培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DMEM培地に交換した。その後、被検試料を添加し、さらに 20時間培養した後、培地を回収し、実施例 1記載の HGF EL I SA キットを用いて、培地中の H G Fの量を測定した被検試料はそれぞれ最終濃度が、参考例 1一（1) 記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、 1、 1 0、 1 00 gZm 1になるよう、へパリン（和光純薬社製）は 1、 1 0 gZm 1になるように添加した。またコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行い、その平均値を採用した。結果は表 39に示す。表 39において、コントロールの HGF産生量を 1 00%として表した。

フコイダン試料を添加した細胞群は全て、蒸留水添加のコントロールより有意に HGFの産生量が増加していた。さらに、へパリン添加よりも顕著に HGFの産生量が増加していた。このことより、当該フコィダンには、これまで HGFの誘導が確認されているへパリンより高い H G Fの産生を促進する活性があることが示された

表 39 試料 HGFの産生量

( g/m 1 ) (96) ガゴメ昆布由来フコィダン 1 1 94

1 0 285

1 00 35 1 へパリンナトリウム塩 1 1 76

1 0 21 5

(コントロールの HGF産生量は 4. 4 n g/m 1であった。）

(2) 1 0%牛胎児血清を含んだ RPM I 1 640培地で培養した HL— 60 細胞（前骨髄性白血病細胞： ATCC CCL— 240) を l x l 0⁵ c e l l s/m 1となるように 1 %牛胎児血清を含んだ RPM I 1 640培地に懸濁し、 500 1ずつ 48穴の細胞培養プレートに入れた。その後、 1 0 nMの 1 2— 0—テトラデカノィルホルボール 1 3—アセテート（TPA :ギブコ BRL社製）を添加し、さらに、被検試料を同時に添加した。添加後 20時間培養した後、培地を回収し、 HGF EL I S A キットを用いて、培地中の HGFの量を測定した。

被検試料はそれぞれ最終濃度が、参考例 1— (1) 記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、 1、 1 0、 1 00〃 gZm 1になるように添加した。へパリンは、 1 、 1 0 g/m 1になるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行い、その平均値を採用した。結果は表 40 に示す。表 40においてコントロールの HGFの産生量を 1 00%として表したフコィダン試料を添加した細胞群は全て、蒸留水添加のコントロールより有意に HGFの産生量が増加していた。さらに、へパリン添加よりも顕著に HGFの産生量が増加していた。このことより、当該フコィダンには、これまで HGFの誘導が確認されているへパリンより高い HGFの産生を促進する活性があることが示ざれた。表 40 試料 HGFの産生量

( g/m 1 ガゴメ昆布由来フコィダン 1 1 9 1

1 0 342

1 00 490 へパリンナトリゥム塩 1 140

1 0 1 89

(コントロールの HGFの産生量は 0. 4ng "mlであった。）実施例 4

1 X 1 0⁵ c e l l s/m 1となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ DME培地に懸濁した MRC- 5細胞液 500 1を 48穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5¾C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに 24時間培養した。この培地を回収し、 HGF EL I SA キットを用いて、培地中の HGFの量を測定した。さらに、細胞を PBSで洗浄後、 500 1の細胞溶解バッファー（5 OmM HEPES pH 7. 4、 1 OmM EDTA、 0. 1 % T r i t o nX 1 0 0、 1 mM PMSF、 1 fi g/ 1 p e p s t a t i nA 1 μ. g/m 1 1 e u p e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。

被検試料である、参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは、最終濃度が、 1、 1 0、 1 0 0 ^ gZm 1になるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。その結果を表 4 1に示す。表 4 1に示すように、当該フコィダン添加群の培地中の HGFは、蒸留水添加のコントロールより有意に、フコィダンの濃度依存的に HGF量が増加していた。一方、細胞内の HGF量はフコィダンの濃度依存的に減少していた。次に、細胞内外のトータル HGF量は濃度依存的に増加していた。このことより、当該フコィダンには、 HGFの産生を促進する活性があることと細胞中からの HG Fの遊離を促進する働きがあることが示された。表 4 1 ガゴメ昆布由来 HGFの産生量（ngZwe 1 1 )

フコィダン

( i g/m l ) 培地中細胞中全量コントロール 4. 2 5. 7 9. 8

1 9. 3 3. 2 1 2. 5

1 0 1 5. 9 0. 9 1 6. 8

1 0 0 1 6. 9 0. 4 1 7. 3

実施例 5

( 1 ) 1 X 1 0⁵ c e 1 1 s/m 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC— 5細胞液 50 0 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 3 7 °C、 5 % C 0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに 0、 0. 5、 K 2、 4、 8、 1 2、 24時間培養した後、培地を回収し、 HGF EL I SA キットを用いて、培地中の HGFの量を測定した。参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは、最終濃度が 1 0 ^gZm 1 となるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。その結果を表 42に示す。表 4 2に示すように、フコィダン添加群は、コントロールより有意に時間依存的に HGF の産生量が増加していた。

このことより、フコィダンには、高い HGFの産生促進活性があり、 HGFの産生量は、経時的に増加することが示された。表 42 培養時間（時間）

0.5 2 4 8 12 24

HGFの産生量（n g/m 1 ) コントロール 0.02 0.03 0.81 0.90 2.31 3.90 6.94 9.39 フコィダン添加 0.19 1.90 5.75 6.87 9.04 15.9 20.1 31.3

(2) 1 X 1 0⁵ c e 1 1 sZm 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC- 5細胞（CCL 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 0 2 - 0 2 1 ) 5 0 0〃 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに 0、 0 . 5、 1 、 2、 4、 8 、 12、 24、 48、 72時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HG F) EL ISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 64 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。さらに、培地を回収した後、細胞を PBSで洗浄後、 5 0 0 1の細胞溶解バッファ一（50mM HE PES H7. 4 lOmM EDTA 0 . 1¾ Tr i t onXlOO、 1 mM PMSF、 1 u g m 1 p e p s t a t i n A 1 n g/m 1 1 e up e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは、最終濃度が 1 0 zg/m lになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。当該フコィダン添加群の培地中の HGF濃度は、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に時間依存的に増加していた。一方、当該フコィダン添加群の細胞内の HGF量は、添加後、 4時間まで減少するが、その後は一定の低い値になった。蒸留水添加のネガティブコントロールでは、このような変化はなく、常に増加傾向にあった。このことより、当該フコィダンには、細胞から HG Fを遊離させる効果と HGFの產生を促進する活性があり、 H G Fの産生量は、経時的に増加することが示された。これらの結果を表 4 3〜4 5に示す。表 4 3 培地中 H G F量の経時変化

0 0.5 1 — 2 4— _ 8 12 24 48 72

HGFの産生量（n g/we 1 1 ) コントロール 0 0.11 0.19 0.29 1.07 1.56 2.34 3.46 7.45 10.5 フコィダン添加 0.51 0.46 1.23 2.86 4.00 6.70 9.15 12.4 22.8 29.3 表 4 4 細胞中 HGF量の経時変化培養時間（時間）

0 0.5 1 2 4 8 12 24 48 72

HGFの產生量（n g/we 1 1 ) コント ϋ-ル 0.51 0.52 0.66 0.56 0.71 0.63 0.86 0.73 1.02 1.20 フコィダン添加 0.88 0.66 0. 5 0.46 0.25 0.29 0.20 0.20 0.18 0.23

表 4 5 培地中と細胞中の全 HGF量の経時変化培養時間（時間）

0.5 1 2 4 8 12 24 48 72

HGFの産生量（n g/ e 1 1 ) コントロ-ル 0.51 0.63 0.85 0.84 1.78 2.19 3.19 4.19 8.47 11.6 フコィダン添加 1.39 1.12 1.68 3.31 4.25 7.00 9.35 12.6 22.9 29.5

(3) 1 1 0⁵ c e l l s Zm l となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC- 5細胞（CCL 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 02 —0 2 1 ) 5 0 0 1を 48穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに 0、 0 . 5、 1 、 2、 4、 8、 12、 24、 48、 72時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF ) EL ISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 6 4 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。さらに、培地を回収した後、細胞を PBSで洗浄後、 5 0 0〃 1の細胞溶解バッファー（50mM HE PES pH7 . 4、 10mM E DTA、 0 . 1 % Tr i t o nXlOO、 1 mM PMSF、 1 g m 1 p e p s t a t i nA、 l g/m 1 1 e u p e p t i n) に溶角率した。さりに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。 7— 1 2 3 1ー？は、最終濃度が 1 0〃g/m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。 7— 1 2 SF d_F添加群の培地中の HGF濃度は、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に時間依存的に増加していた。一方、 7— 1 23? <^—？添加群の紬胞内の110?量は、添加後、しばらくは減少するがその後増加に転じた。蒸留水添加のネガティブコントロールでは、このような変化はなく、常に一定であった。このことより、 7— 1 2 SF d— Fには、細胞から HGFを遊離させる効果と高い HGFの産生を促進する活性があり、 HGFの産生量は、経時的に増加することが示された。その後は一定の低い値になった。これらの結果を表 4 6〜4 8に示す。

表 4 6 培地中 HGF量の経時変化

培養時間（時間）

0.5 1 2 4 8 12 24 48 72

HGFの産生量（n gZwe 1 1 ) コント π-ル 0.14 0.33 0.36 0.63 1.29 1.60 2.54 3.89 7.99 13.3 7-12S

Fd-f添加 0.48 1.82 2.16 2.53 3.12 4.01 5.84 9.82 17.0 23.5

表 4 7 細胞中 H G F量の経時変化

培養時間（時間）

0.5 1 2 4 8 12 24 48 72

HGFの産生量（n g/we 1 1 ) コント π-ル 2.65 3.11 2.73 2.77 2.31 2.82 2.80 4.61 5.36 6.74 7-12S

Fd - F添加 2.79 1.78 1.65 1.31 1.06 1.31 1.07 1.56 2.66 3.09

表 4 8 培地中と細胞中の全 HGF量の経時変化培養時間（時間）

0.5 1 2 4 8 12 24 48 72

HGFの産生量（n g/we 1 1 ) コントロ-ル 2.79 3.43 3.09 3.39 3.60 4.41 5.34 8.50 13.3 20.2 7-12S

Fd-F添加 3.26 3.60 3.81 3.84 4.18 5.31 6.91 11.4 19.7 26.6

(4) 1 X 1 0⁵ c e l l s /m 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC-5細胞（CCL 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 02 — 02 1 ) 5 0 0 ti 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 3 7°C、 5 %C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに 24時間培養した。この培地を回収し、 Quantikine H uman Hepatocyte Growth Factor (HGF) EL ISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 64 1 - 00 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。さらに、細胞を PBSで洗浄後、 500 1の細胞溶解バッファー（50mM HEPES pH 7 . 4、 10mM EDTA、 0 . 1% Tr i t o n xlOO、 1 mM PMSF、 1 p. g/ 1 p e p s t a t i nA^ 1 n g/m 1 l e up e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。 7— 1 2 SFd— Fは、最終濃度が、 1、 1 0、 l O O ^gZm lになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果、表 4 9に示すように、 7— 1 2 SF d— F添加群の培地中の HGFは、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に 7— 1 2 SF d-Fの濃度依存的に H G Fの産生量が増加していた。一方で、細胞内の HGF量は 7— 1 2 SF d— Fの濃度依存的に減少していた。さらに、細胞内外のトータル HGF量も濃度依存的に増加していた。このことより、 7— 1 2 SF d— Fには、細胞から HGFを遊離させる効果と HGFの産生を促進する活性があることが示された。この結果を表 4 9に示十。表 4 9 7— 1 2 SF d-F添加時のHGFの産生量

7 - 1 23 （1ー？添加量（最終濃度 g/m l ) 0 1 1 0 1 0 0

HGFの産生量（n g/we 1 1 ) 培地中 5. 6 6 8. 4 6 1 7. 1 22. 0 細胞中 6. 28 6. 04 4. 1 5 1. 5 9

1 1. 9 1 4. 5 2 1. 3 23. 6

実施例 6

( 1 ) 1 X 1 0⁵ c e 1 1 s /m 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MR C— 5細胞液 5 0 0 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 37 °C、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に交換した。その後、最終濃度が 0、 1、 1 0 ; gZm 1になるようにシクロへキシミド（タンパク合成阻害剤：ナカライテスク社製）を添加し、さらに、被検試料を添加した後、 24時間培養した。この培地を回収し、 HGF E L I SAキットを用いて、培地中の HGFの量を測定した。参考例 1 — ( 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは、最終濃度が、 1、 1 0、 l O O gZm lになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。その結果を表 5 0に示す。表 5 0においてコントロールの HGFの産生量を 1 0 0 %として表した。

表 5 0に示すように、シクロへキシミドを添加することにより、当該フコイダン添加群の培地中の H G F濃度はシクロへキシミド濃度依存的に減少しており、その阻害率は、フコィダン無添加のコントロール群のシグロへキシミドによる阻害と同程度にシクロへキシミドの濃度に依存して阻害されていた。これらのことより、フコィダンによる HGFの産生誘導にはタンパク合成が関与することが明らかになつた。表 5 0 ガゴメ昆布由来シクロへキシミド添加量（ g/m l )

フコィダン 0 1 1 0

( gZm 1 ) HGFの産生量の対コントロール比（％) コントロール 1 00 3 5 27

1 226 1 1 0 72

1 0 3 1 7 1 3 0 1 1 0

1 0 0 4 5 6 20 6 1 27

(コントロールの HGF產生量は 7. 3 n gZm lであった。）

( 2 ) 1 X 1 0⁵ c e 1 1 s /m 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC-5細胞（CCL 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 02 — 0 2 1 ) 5 00 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、最終濃度が 0、 1、 1 0〃 g/m 1になるようにシクロへキシミド（タンパク合成阻害剤：ナカライテスク社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、 2 4時間培養した。この培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Fac tor (HGF) ELISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 064 1 - 00 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。また、細胞を PBSで洗浄後、 500 1 の細胞溶解バッファー（5 OmM HEPES pH 7. 4、 1 OmM EDT A、 0. 1 % Tr i t onX 1 00、 lmMPMSF、 1 n g/m 1 p ep s t a t i n A 1 g/m 1 1 e υ p e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。 HGFの産生量は、ネガティブコントロール 1 00%として表した。阻害率は、各濃度の 7— 1 2SFd— Fのみを添加した際の HGFの産生量を基準にし、シクロへキシミド添加画分の阻害率（％) を算出した。 7— 1 2SFd— Fは、最終濃度が、 1 、 1 0、 1 00 gZm 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果、表 5 1、 52に示すように、シクロへキシミドを添加することにより、 7— 12SFd— F添加群の培地中、細胞中と培地中の合計の HGF量はどちらもシクロへキシミド濃度依存的に減少しており、これらのことより、 7— 12SFd— Fによる HGFの産生誘導は、単なる細胞からの H G Fの遊離ではなく、タンパク合成が関与することが明らかになつた。

表 5 1 HGF産生誘導の阻害（培地中）

7 - 1 2 S シクロへキシミド添加量（^g/m 1 )

F d-F 0 1 1 0

添加量

{ g/m 1 )

HGFの産生量：％ / シクロへキシミド無添加を

1 0 0%とした場合の阻害率：％

0 1 0 0/0 4 0/6 0 4 0/6 0 1 1 24/0 6 1/5 1 3 9/6 9

1 0 2 1 6/0 8 8/5 9 5 3/75 1 0 0 26 5 /0 1 1 7/5 6 74/72

表 52 HGF産生誘導の阻害（細胞中と培地中の合計）

7 - 1 2 S シクロへキシミド添加量（ ugZm l )

Fd-F 0 1 1 0

添加量

HGF産生量： / シクロへキシミド無添加を

1 0 0 %とした場合の阻害率： %

0 1 0 0/0 3 1/6 9 27/73 1 1 04/0 3 1/7 0 25/76

1 0 1 28/0 3 8/7 0 28/78 1 0 0 1 37/0 4 7/6 6 3 7/73

(3) i x i 0⁵ c e l l s/m l となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC-5細胞（CCL 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 0 2 一 02 1 ) 50 0 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5 %C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、最終濃度が 0、 0. 1、 1 〃g/m 1になるようにァクチノマイシン D (R N A合成阻害剤：シグマ社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、 24時間培養した。この培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor ( HGF) EL ISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 64 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。 HGFの産生量は、ネガティブコントロール 1 0 0%として表した。阻害率は、各濃度のフコィダンのみを添加した際の HGFの産生量を基準にし、ァクチノマイシン D添加画分の阻害率（％) を算出した。参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは、最終濃度が、 1、 1 0、 1 0 0 n g/m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。その結果、表 5 3に示すように、ァクチノマイシン Dを添加することにより、当該フコィダン添加群の培地中の HG F濃度はァクチノマイシン D濃度に依存して阻害された。これらのことより、フコィダンによる HGFの産生誘導には RNA合成が関与する可能性が示唆され、単なる細胞からの H G Fの遊離ではないことが明らかになつた。

表 5 3 ガゴメ昆布由来ァクチノマイシン D添加量（ / g/m l )

フコィダン 0 0. 1 1 gZm l ) HGFの産生量：％ / ァクチノマイシン D

無添加を 1 0 0 %とした場合の阻害率：％

0 1 0 0/0 7 9/2 1 8 3/1 7 1 24 4 /0 1 3 8/4 3 1 1 9/5 1

1 0 34 3/0 2 2 4/3 5 2 3 9/3 0 1 0 0 4 9 2/0 3 4 1 /3 1 2 8 5/4 2

(4) 1 X 1 0⁵ c e l l s Zm l となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D ME培地に懸濁した MRC- 5細胞（CCL 1 7 1 :大日本製薬社製、 c o d e. 0 2 -0 2 1 ) 5 0 0 1を 4 8穴の細胞培養プレートに入れ、 3 7て、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、最終濃度が 0、 0. 1、 1 〃 gZm 1になるようにァクチノマイシン D (R NA合成阻害剤：シグマ社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、 2 4時間培養した。この培地を回収し、 Quant ikine Human Hepatocyte Growth Factor ( HGF) EL ISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 6 4 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。また、細胞を PBSで洗浄後、 5 0 0 lの紬胞溶解バッファー（5 0mM HEPES pH 7. 4、 1 OmM EDTA、 0 . 1 % Tr i t o nX l 0 0, 1 mMPMS F, 1 n g/m 1 p e p s t a t i nA、 1 ug/m 1 1 e u p e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の H G F量を培地中の H G F濃度と同様に測定した。 H G Fの産生量は、ネガティブコントロール 1 0 0%として表した。阻害率は、各濃度の 7— 1 2 S F d— Fのみを添加した際の H G Fの産生量を基準にし、ァクチノマイシン D添加画分の阻害率（）を算出した。 7— 1 2 SFd— Fは、最終濃度が、 1、 1 0. 1 0 0 g/m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果、表 54、 5 5に示すように、ァクチノマイシン Dを添加することにより、 7— 1 2 SF d— F添加群の培地中、細胞中と培地中の合計の HGF量はどちらもァクチノマイシン D濃度に依存して阻害された。これらのことより、 7— 1 2 SF d— Fによる HGFの産生誘導には R N A合成が関与する可能性が示唆され、単なる細胞からの H G Fの遊離ではないことが明らかになつた。

表 54 HGF産生誘導の阻害（培地中）

7 - 1 2 S ァクチノマイシン D添加量（ gZm 1 )

Fd-F 0 0. 1 1

( z g/m 1 )

^[〇？の産生量：％ / ァクチノマイシン D無添加を

1 00 %とした場合の阻害率：％

0 1 0 0/0 76/24 8 0/20 1 1 3 0/0 95/2 7 9 6/26

1 0 225/0 1 82/1 9 1 5 2/32 1 0 0 2 9 5 /0 2 1 2/2 8 1 8 7/4 8 表 5 5 HGF産生誘導の阻害（細胞中と培地中の合計）

7 - 1 2 S ァクチノマイシン D添加量（； gZm l ) F d-F 0 0. 1 1

( gZm 1 )

HGFの產生量：％ Zァクチノマイシン D無添加を

1 0 0 %とした場合の阻害率：％

0 1 0 0/0 6 1 /3 9 5 9/4 1 1 9 8/0 6 4/3 5 6 1 /3 8

1 0 1 1 3/0 8 3/2 7 7 1/3 7 1 0 0 1 2 6/0 9 1 /2 8 8 1/3 6

実施例 7

( 1 ) 7週齢の雄 Wi s t a rラットを用い、外科的処置により部分肝切除を次のように行った。すなわちエーテル麻酔下でラットを開腹し、肝臓の約 3 0 % 部分を外科用縫合糸で根元の血管を結さっした後、切除した。開腹部は縫合針により縫合した。

参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンは切除の直後を一回目とし、 1 2時間間隔で腹腔内投与した。コントロール群には生理食塩水を腹腔内投与した。

肝切除後、 2 4時間あるいは 7 2時間目にラットを麻酔下で腹大動脈より採血し、 0. 1 %エチレンジァミン四酢酸ニナトリウムによる血漿を遠心にて分離した。血漿中の HGF量は、 HGF EL I S A キット（株式会社特殊免疫研究所製）を用いて測定した。

結果を表 5 6示す。表中の数字は平均値土標準誤差を表し、（）内は一群あたりのラットの匹数を示す。また表中の *はコントロール群と比較して 5%以下の危険率で有意な差を有することを意味する < 表 5 6 又里 JHLS Ψ JTILT Γ i η g Z m lリ

(mg/k g) 24時間 Ί 2時間生理食塩水 0.28 土 0.04 (4) 0.30 土 0.02 (3)

(コントロール群）ガゴメ昆布由来 0. 1 0.40 土 0.12 (4) 0.52 ± 0.06 (5)* フコィダン 1 0.65 ± 0.18 (4) 0.64 土 0.09 (2)*

フコィダン投与群はコントロール群に比べ、肝切除 24時間後で、血漿中の H GF量が上昇する傾向がみられ、 72時間後では有意な上昇がみられた。

以上、フコィダンは HGF産生を誘導することにより、外科的手術を必要とする肝疾患において術後の速やかな再生を促すとともに、残存肝の機能回復に有用である。

(2) 7週齢の雄 Wistarラットを用い、外科的処置により部分肝切除を行った。エーテル麻酔下で開腹し、肝臓の約 3 0 %部分を外科用縫合糸で根元の血管を結さっした後切除した。開腹部は縫合針により縫合した。参考例 2— （4) で調製した酵素処理 F—フコィダンは切除の直後を一回目とし、朝夕二回に分けて経口投与した。コントロール群には生理食塩水を投与した。肝切除 24時間後にラットを麻酔下で腹大動脈より採血し、 0. 1 %エチレンジァミン四酢酸ニナトリゥムによる血漿を遠心にて分離した。血漿中の HGF量は、 HGF ELISAキット (株式会社特殊免疫研究所）を用いて測定した。

結果を表 5 7に示す。表中の数字は平均値土標準誤差を表し、（）内は一群あたりのラットの匹数を示す。また表中の *は対照群と比較して 1 %以下の危険率で有意な差を有する群を意味する。表 57 血漿中 HGF濃度（ng/ml) 群 24時間生理食塩水 0. 1 84 士 0. 33 ( 6) 酵素処理 F—フコィダン 0. 505 ± 0. 97* (5) ( 1 g/k g/ά a y)

酵素処理 F—フコィダン投与群はコントロール群に比べ、肝切除 24時間後で有意な上昇がみられた。

以上、フコィダン、 7— 1 2SFd— F高含有の F—フコィダンは HGF産生を誘導することにより、外科的手術を必要とする肝疾患において術後の速やかな再生を促すともに、残存肝の機能回復に有用である。実施例 8

インスリン様増殖因子の一種である h— I G F— 1を高発現するヒト新生児包皮上皮細胞株の Hs 68細胞（ATCC CRL— 1 635 ) を 1 0%ゥシ胎児血清（FBS ：バイオウイタッカー社製）を含む DMEM培地（ギブコ BRL社製）にて、 5%C0₂ 存在下、 37°Cで細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリブシン一 EDTA溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を 3 X 1 0³ 個ゥエルとなるように上記培地に懸濁し、 96穴マイク πタイタープレートの各ゥエルに 200 (11ずつ分注した。培養 5〜7日後、ほぼ細胞が培養器に飽和になつた時点で培地を捨て、 0、 1 2. 3、 37、 1 1 し 333、 1 0 0 0、又は 3 0 0 0 / /m 1の参考例 1一（ 2 ) 記載の I画分、 I I画分、 I I I画分、又は参考例 1— ( 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンを含有する上記培地を 2 0 0〃 1 /ゥエルで加えた。 24時間のタイムコースを取って、 1、 4、 1 2、 24時間目に経時的に培養上清を回収し、 Hs 6 8細胞に対する h— I GF産生誘導活性を、 h— I GF— 1 EL I SA キット（ダイァグノスティックス社製）を用いて測定した。結果を表 5 8〜6 1に示す。なお対照は試料無添加であ。表 5 8 ガゴメ昆布由来培地中 h-IGF- 1濃度

フコィダン (ng/ml)

( g/ml) 1時間 4時間 12時間 24時間対照 4.3 2.9 4.1 4.5

12.3 22.9 14.7 10.5 11.8

37 17.5 13.9 10.8 11.4

111 14.6 13.7 10.3 7.8

333 13.8 17.6 9.4 7.7

1000 13.9 14.7 14.6 7.5

3000 15.9 14.0 14.0 7.2 表 5 9

I画分培地中 h- IGF-1 濃度

Og/ml) (ng/ml)

1時間 4時間 12時間 24時間対照 6.8 5.4 5.0 5.0 12.3 13.9 10.5 7.6 7.3 37 19.0 11.7 8.3 10.1 111 20.4 11.0 9.5 9.9 333 18.7 12.2 10.9 10.3 1000 17.7 13.2 12.7 11.3 3000 19.0 12.1 13.1 11.7

表 6 0

Π画分培地中 h-IGF - 1 濃度

(ng/ml)

1時間 4時間 12時間 24時間対照 4.3 2.9 4.1 4.5 12.3 18.5 10.2 6.9 7.0 37 20.1 9.9 9.2 9.2 111 20.0 11.1 9.8 8.9 333 16.3 12.7 9.7 9.2 1000 17.0 12.2 10.0 8.8 3000 17.9 11.3 10.0 7.6

表 61

III 画分培地中 h-IGF-1 濃度

(ng/ml)

(^g/ml) 1時間 4時間 12時間 24時間対照 4.3 2.9 4.1 4.5

12.3 16.5 10.9 8.5 8.6

37 16.7 10.2 11.1 8.4

111 11.8 11.5 8.6 6.9

333 9.6 11.2 8.0 5.9

1000 7.9 10.4 10.6 6.6

3000 7.1 9.4 9.7 6.2

表 58〜6 1に示すようにガゴメ昆布由来フコィダン、 I画分、 I I画分、及ぴ I I I画分は h— I GF— 1産生誘導活性を示した。 h— I GF— 1產生誘導活性は、 1 2〜1 00 gZm 1の試料添加により、 1時間目で最高値を示した。なお各試料において Hs 68細胞に対する毒性、増殖抑制活性は認められなかつた。参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩についても同様の h— I GF- 1産生誘導活性を認めた。実施例 9

ラット繊維芽 L一 M細胞（ATCC CCL- 1. 2) を 0. 5%のパクトぺプトン（D i ί c ο社製）を含む Μ 1 99培地（ I CN社製）で 1. 5 x 1 0⁵ 細胞/ m 1に懸濁し 96穴プレートに 0. 1mlずつまき無菌的に培養した。

3日間培養後、培地をとり除き、 0. 5 %のゥシ血清アルブミン（シグマ社製 ) を含む M l 9 9培地に置き換えた。これに参考例 1一（ 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダン例を終濃度が 0、 6 2. 5、 25 0、 1 0 0 0 gZm 1になるように添加し、 24時間培養した。コントロールとして蒸留水を添加したものを用いた。培養終了後、培養液中の NGFの濃度をェンザィムィムノアツセィ法（ NGF Em a X I mm u n o As s a y S y s t e m：プロメガ社製）にて測定した。 NGFの産生量は、コントロールの NGFの産生量を 1 00%として表した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。その結果、表 62に示す。表 6 2に示すように、ガゴメ昆布由来フコィダンは濃度依存的に L一 M細胞の神経増殖因子産生を促進した。更にその分画物も同様の活性を示した。また参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩も同様の N G F産生誘導作用を示した。表 62 試料 NGFの産生量の増加

(f gZm 1； (.%) ガゴメ昆布由来 62. 5 1 1 7

フコィダン 25 0 1 6 6

1 0 0 0 1 79

(コントロールの NGF産生量は 1 5 5 p g/m 1であった。）同様に、参考例 1一（2) に記載の I画分、 I I画分、 I I I画分について神経増殖因子産生の促進活性を測定し、各画分に活性を認めた。その結果を表 6 3 に示す。また、参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩も同様に NGF産生誘導作用を示した。表 6 3 試料 NGFの産生量の増加

in g/m 1 )

I画分 25 0 5 0 5. 6

5 0 0 6 1 9. 6

1 0 0 0 8 0 6. 5

I I画分 25 0 6 64. 5

5 0 0 8 64. 5

1 0 0 0 1 1 3 7. 4

I I I画分 25 0 1 0 2 1. 1

5 0 0 1 1 8 7. 0

1 0 0 0 1 26 5. 0

(コントロールの NGF産生量は 5 0. 0 3 p g/m 1であった。）実施例 1 0

( 1) 雄性 C 3HZHeマウスを日本 SLC社から購入し、予備飼育の後 5週齢より実験に用いた。参考例 1一（ 1 ) で調製したガゴメ昆布由来フコィダンをエタノールで 3 %濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に 1匹あたり 20 0 α 1づっ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は 1 日 1回とし、連日 8日間行った。投与開始 9日目に皮膚を剝離し、皮膚中の HGF活性を EL I S Aキット（株式会社特殊免疫研究所）にて測定した。

結果を表 64に示す。表中の数字は、 5例の平均値土標準誤差を表す。

皮膚中より抽出した HG F活性は、フコィダン塗布群では対照群より明らかに上昇し、フコィダン塗布による H G F産生誘導作用が認められた。表 64 皮膚中 HGF活性

(ng/g tissue ) 対照群（N=5 ) 16.31 ±2.86

フコィダン塗布群（N=5 ) 104.46 ±4.05 平均値土標準偏差

(2) 後述の実施例 26— （ 1 ) 記載の本発明の化粧水と、フコィダンを含有しない対照の化粧水とを比較して、 20〜35才の成人女性 25人に対しブラインドで官能検査を行った。その結果、より有効と判定した人数を表 6 5に示す。表 6 5 肌のしっとりさ肌のなめらかさ肌のはり本発明の化粧水 21 19 16

対照の化粧水 5 6 9

以上の結果、フコィダンの HGF產生誘導作用により、フコィダン配合の本発明の化粧水は肌のしっとりさ、なめらかさ、はりのいずれも優れていることが示された。実施例 1 1

( 1 ) 参考例 1一（2) 記載の方法で調製した F—フコィダン 9 8mgを DM SO 5m 1に溶解し、室温にてピぺリジン硫酸 980 m gを添加した後、 80 °C にて 2時間攪拌した。反応液を冷却後、分子量 1 000カツトの透析膜にて 2日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライト IRA— 1 20 (Na + ) 〕に供じた後、減圧乾固することにより F—フコィダンの高硫酸化体 98 mgを調製した。

(2) 参考例 2記載の方法で調製した 7— 1 2SFd-F 341118を0^：30 4mlに溶解し、その後、実施例 1 1一（1) と同様の操作で、 7— 1 2SFd - Fの高硫酸化体 98 m gを調製した。

(3) 実施例 1と同様の方法で、実施例 1 1一（1) で調製した F—フコイダンの高硫酸化体（試料①）、実施例 1 1一（2) で調製した 7— 1 2SFd-F の高硫酸化体（試料②）、参考例 1一（2) で調製した F—フコィダン（試料③ ) 、及び参考例 2で調製した 7— 1 2SFd-F (試料④）の HGF産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 00 g/mlになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。

その結果を表 66に示す、表 66において、コントロールの HGF生産量を 1 00%として表した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。表 66に示したように、試料①〜④は HGFの産生を誘導した。さらに、高硫酸化体において、その HGF產生誘導活性は、未高硫酸化処理のものより上昇した。このことより、既に存在する天然の硫酸化糖もさらに硫酸化処理を施すことにより、その HGF産生誘導活性が増強することが明らかになつた。

なお、硫酸含量の定量は、それぞれの試料の IN HC 1 0. 2ml (1〜1 OmgZml) 溶液を、 1 05°Cにて 4時間加熱し、うち 0. 1mlに 0. 1N

HC 1溶液 1. 9m 1と 1 %塩化バリウム— 0. 5%ゼラチン溶液 0. 25m 1を添加し 20分間放置後、 500 nmの吸光度を測定することにより行った。検量線は、 0、 1、 3、 5、 7、 1 0、 1 5、 2 OmM硫酸ナトリウムの 1 N HC 1溶液を標準試料として作成し、この検量線から各試料の硫酸含量（S〇₃ 換算）を求めた。この検量線は第 2図に、各試料の硫酸含量は表 67に示す c 表 66 濃度 HGFの産生量（％)

g m l 試料① 試料② 試料③ 試料④

1 346 1 92 31 2 1 92 1 0 71 5 21 4 493 229 1 00 794 499 598 355

(コントロールの HGF産生量は、 8. 1 5 ngZmlであつ。）表 67 試料硫酸含量（S0₃ 換算， %)

F—フコィダン 40

F—フコィダンの高硫酸化体 47

7 - 1 2 S F d -F 40

7- 1 2 SF d— Fの高硫酸化体 48

実施例 1 2

1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地で培養した NHDF細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞： Bio Wittaker社製）を l x l O⁵ c e l l s Zmlとなるように 1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地に懸濁し、 500 ;/ 1ずつ 48穴の細胞培養プレートに入れ、 24時間培養した。その後、 1 %牛胎児血清を含んだ DM EM培地に交換し、 ΙΟηΜの Tetradecanoylphorbol 13- acetate (TPA：ギブコ BR L社製）と試料を添加した。添加後 20時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HG F) ELISA Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 64 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の H G Fの量を測定した。 HGFの産生量は、ネガティブコントロール 1 0 0 %として表した。試料はそれぞれ最終濃度が、参考例 1一（ 1 ) 記載のフコィダンは 1、 1 0、 1 0 0 g/m 1になるように添加した。へパリンは 1、 1 0 gZm 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。誘導実験の培養は、試料添加と同時に 1 0 nMの TPAを添加して行った。実験は全て 3連で行い、その平均値を採用した。その結果を表 6 8に示す。フコィダンを添加した細胞群は全て、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に HG F の産生量が増加していた。さらに、へパリン添加よりも顕著に HGFの産生量が増加していた。このことより、参考例 1一（ 1 ) 記載のフコィダンには、これまで H G Fの誘導が確認されているへパリンより高い H G Fの産生を促進する活性があることが示された。表 6 8 へパリンフコィダン

( g/m 1

0 1 00 1 0 0

1 9 5 0 1 1 4 0

1 0 2 1 70 24 70

1 0 0 277 0

(ただし、コントロールの HGF産生量は、 0. 2 0 n gノ m 1であった。）実施例 1 3

1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地で培養した Hs68細胞（ヒト新生児包皮細胞：大日本製薬社製 ATCC CRL -1635) を 1 x 1 0⁵ c e 1 1 s Zm 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ DM EM培地に懸濁し、 5 0 0 / 1ずっ4 8 穴の細胞培養プレートに入れ、 24時間培養した。その後、 1 %牛胎児血清を含んだ DMEM培地に交換し、 1 0 nMの TPAと試料を添加した。また、 TPA を添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、 Quan tikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kitを用いて、培地中の HGFの量を測定した。さらに、細胞を PBSで洗浄後、 5 0 0 の細胞溶解バッファ一（50mM HEPES p H7 . 4、 10mM EDTA、 0 . 1 % Tr i t onx l O O. l mM PMS F. 1 u g/m 1 p e p s t a t i n A、 1 g/m 1 1 e u p e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。参考例 2— (3) で調製した 7— 1 2 SFd— Fは、最終濃度が、 0. し 1、 1 0、 1 0 0 g /m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果を表 6 9〜7 1に示す。 TPA無添加において顕著な HGFの産生は認められなかつた。しかし、 TP Aを添加した場合は、細胞中の HGF量は、 7_ 1 2 SF d- Fの濃度依存的に低下し、培地中の HGF量とトータル HGF量は 7— 1 2 SF d— Fの濃度依存的に増加し、さらにトータル HGF量は、無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このように mRNAが増加している場合の H GF量の増加は、 TPA無処理で mRNA量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、 7— 1 2 SF d— Fは、 mRNAの転写が促進され、大量の HGFが必要とされている場合は、 HGFの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになつた。表 6 9 Hs68/7 - 1 2 S F d - F培地中 H G F量（pg/Well)

7 - 1 2 SF d-F TPA無し 1 0 nMTPA ( z g/m 1 )

0 N. D. 6 5. 5 4 0 N. D. 7 1. 0 4 1 N. D. 9 9. 2 5

1 0 N. D. 2 2 6. 1 4 1 0 0 N. D. 2 6 0. 4 9

N. D. は検出限界以下を示す _c 表 7 0 Hs68Z7 - 1 2 S F d— F細胞中 H G F量（pg/Well) 一 1 2 SF d-F TP A無し 1 0 nMTPA g/m 1 )

0 9 8. 6 2 1 5 5. 6 5 0 8 7. 6 0 1 5 1. 9 9 1 6 2. 4 7 1 4 2. 1 7

1 0 N. D. 1 2 0. 7 0 1 0 0 N. D. 9 5. 6 7

N. D. は検出限界以下を示す _c 表 7 1 Hs68/ 7 - 1 2 SF d-Fトータル HGF量（pg/Well)

7 - 1 2 SF d-F TPA無し 1 0 nMTP A

in g/ 1 )

0 22 1. 1 9

0 223. 02

1 24 1. 4 2

1 0 34 6. 84

1 0 0 3 5 6. 0 5

実施例 1 4

1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地で培養した MRC - 5細胞（CCし 1 7 1 ：大日本製薬社製、 c o d e. 02— 02 1 ) を 2. 5 x 1 0⁵ c e 1 1 s/ m l となるように 1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地に懸濁し、 6穴の細胞培養プレートに入れ、 5%炭酸ガス存在下、 37でで 24時間培養を行った。その後、 1 %牛胎児血清を含んだ DMEM培地に交換し、さらに 22時間培養を行つた。その後、最終濃度が 1 0 0〃gZm lになるように参考例 2— (3) で調製した 7— 1 2 SF d— Fを、 1 〃 g/m 1になるように LMへパリン（Celsus laboratories 社製）を、 1； Μになるようにジメチルスルホキシド（DMSO ) に溶かしたプロスタグランジン E, (PGEi ) (和光純薬工業社製）を添加したそれぞれの培養液に交換した。対照群として、 DMS〇を添加した培地を使用した。尚、前記各添加物の溶媒がすべて 1 %になるように添加した。さらに培養を行い、 0、 2、 4 、 6、 8 、 10、 12、 24時間目に全 R N Aの抽出を行った。全 RNAの抽出には RNeasy Mini Kit (QIAGEN社製）を使用した。 RT— PCR は、 RNA PCR Kit ver.2.1(宝酒造社製、 R019A)を使用した。逆転写反応は全 RN Aに熱変性処理を行った後、ランダムプライマー（N 6) (宝酒造社製、 3801) を使用して 3 0でで 1 0分、 4 2°Cで 30分、 9 9^eCで 5分で行った。 HGFの mRN Aを検出するために、センスプライマーとして配列表の配列番号 1に記載のプライマーを、アンチセンスプライマーとして配列表の配列番号 2に記載のプライマ一を用いた。このプライマーにより増幅される産物は 415bp である。また半定量的な実験を行うためにハウスキーピング遺伝子である /S—ァクチンの検出も行った。プライマーは、センスプライマ一として配列表の配列番号 3に記載のプライマ一を、アンチセンスプライマ一として配列表の配列番号 4に記載のブライマ一を用いた。このプライマ一により増幅される産物は 275bp である。 PCR は、 PJ9600 (パーキンエルマ一社製）により行った。 PCRサイクルは熱変性を 9 4 °Cで 2分行った後、熱変性を 94 で 3 0秒、ァニーリングを 5 9 °Cで 30 秒、伸長反応を 72 °Cで 6 0秒のサイクルを 24サイクル行った。反応後、 2% ァガロースゲル電気泳動及びェチジゥムブ口マイド染色を行い、 UV照射下でゲルを観察した。すべてのサンプルにおいて HGFの mRNAが検出された。コントロールに比べて、 PGE, による mRNAの誘導は認められたが、 7— 1 2 SF d— F及び LMへパリンによる mRNAの誘導は認められなかった。このことより、常に HGFの mRNAを転写しているような状態においては、 7— 1 2 S F d— F及び LMへパリンの添加による HGFの mRN Aの転写の促進は起こらないことが明らかになり、 7— 1 2 SF d— F及び LMへパリンは、過剰な H GFの産生誘導を起こさないことが明らかになった。実施例 1 5

実施例 1 3で用いた HS 6 8細胞の代わりに NHDF細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞： Bio Whittaker社製）を用い、その他は実施例 1 3と同様にして、 NH DF細胞における 7― 1 2 SF d— Fによる HGF産生誘導活性について調べた。その結果を表 72〜 74に示す。

TPA無添加において、細胞中の HGF量は、 7— 1 2 SF d— Fの濃度依存的に低下し、培地中の HGF量とトータル HGF量は 7— 1 2SFd_Fの濃度依存的に増加し、さらにトータル HGF量は、 7— 1 2SFd— F無添加のコントロールより有意に増加していた。このことから、 TP A無処理のような HGF の mRN Aが少ない場合でも、細胞表面の HGFの遊離と HGFの合成の両方を促進することが明らかになった。さらに、 TP Aを添加した場合は、細胞中の H GF量は、 7— 1 2 SFd— Fの濃度依存的に低下し、培地中の HGF量とトータル HGF量は 7— 1 2 SFd— Fの濃度依存的に増加し、さらにトータル HG F量は、 7— 1 2SFd— F無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このように mRNAが増加している場合の HGF量の増加は、 TPA無添加で mRNA量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、 7— 1 2SFd— Fは、 mRNAが少量の場合は少ないなりに HGFの遊離と産生を促進し、さらに、 mRNAの転写が促進され、大量の HGFが必要とされている場合は、 HGFの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。表 72 NHDFZ7 - 1 2 S F d - F培地中 H G F量（ng/Well)

7 - 1 2SFd-F TPA無し 1 0 n TPA

( g/m 1 )

0 N. D. 0. 39

1 0. 05 0. 68

1 0 0. 1 8 1. 22

1 00 0. 385 1. 625

N. D. は検出限界以下を示す。表 73 NHDF/ 7 - 1 2 S F d— F細胞中 H G F量（ng/Well)

7- 1 2 SF d-F TPA無し 1 0 n TP A

( gZm 1 )

0 0. 1 85 0. 24

1 0. 1 4 5 0. 1 9

1 0 0. 0 75 0. 1 2

1 0 0 0. 0 25 0. 0 5 5

表 74 NHDF/ 7 - 1 2 SF d - Fトータル HGF量（ng/Well) 一 1 2 SFd - F TPA無し 1 0 nMTP A

(fi g/m 1 )

0 0. 6 3

1 0. 1 9 5 0. 8 7

1 0 0. 25 5 1. 3 35

1 0 0 0. 4 1 1. 6 8

実施例 1 6

1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地で培養した NHDF細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞）を 2. 5 X 1 0⁵ c e 1 1 sノ m 1 となるように 1 0 %牛胎児血清を含んだ D MEM培地に懸濁し、 2m lずつ 6穴の細胞培養プレートに入れ、 5%炭酸ガス存在下、 37 ^eCで 24時間培養した。その後、 1 牛胎児血清を含んだ DMEM培地に交換し、 1 0 nMの Tetradecanoylphorbol 13- acetate (T PA：ギブコ BR L社製）と参考例 2— (3) で調製した 7— 1 2 SF d— Fを最終濃度が 1 00〃g /mlになるように添加した。また、 TPAを添加せず、 7 一 1 2 SF d— Fのみを添加する区分も同様に行った。さらに培養を行い、 4、 6、 8、 10時間目に全 RNAの抽出をおこなった。全 RNAの抽出には RNeasy M ini Kit (QIAGEN) を使用した。 RT— PCRは PCRのサイクルを 28サイクルにしたこと以外は、すべて実施例 1 4と同様に行った。反応後、 2%ァガロースゲル電気泳動及びェチジゥ厶ブ口マイド染色を行い、 UV照射下でゲルを観察した。

その結果、 TPA無添加の場合、 HGFの mRNAの転写量は非常に少ないが、 7— 1 2SFd— Fの添加により、添加後、 4時間で、若干の mRNAの転写量の上昇が見られた。一方、 TPAの添加により、 HGFの mRNA量は、どの時間においても、顕著に上昇した。 TP Aと 7— 1 2 SF d— Fを添加した場合は、 TPAだけを添加した場合と比較して、 HGFの mRNA量が、添加後、 4 時間で、増加していることが明らかになつたが、 6時間では、 7— 1 2SFd— Fの添加による差は無かった。つまり、 7— 1 2SFd— Fは、 HGFを必要として、 mRN Aの転写が活発に行われはじめた初期において、顕著にその転写を促進するが、その後、その促進効果は、消失することが明らかになった。このことより、 7— 1 2 SF d— Fは HGFが必要とされた瞬時の HGF産生を誘導し、その後過剰な HGF産生を誘導することは無いことが明らかになった。実施例 1 7

1 0%牛胎児血清を含んだ RPMI 1 640培地で培養した HL 60細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）を 5 X 1 0⁵ c e 1 1 s/m 1 となるように 1 %牛胎児血清を含んだ RPM 1 1 640培地に懸濁し、 500 1ずつ 48穴の細胞培養プレートに入れた。その後、 1 01 1^の丁？八を添加し、さらに試料を添加した。添加後 24時間培養した。また、 TPAを添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kitを用いて、培地中の HG Fの量を測定した。さらに、細胞を P B Sで洗浄後、 5 0 0 1の細胞溶解バッファー（50mM HEP ES pH7 . 4、 lOmM EDTA、 0 . 1% T r i t o n x 1 0 0. 1 mM

PMS F、 1 j g/m 1 p e p s t a t i nA、 l g/m 1 1 e υ p e p t i n) に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内の HGF量を培地中の HGF濃度と同様に測定した。参考例 2— (3) で調製した 7— 1 2 SF d— Fは、最終濃度が、 1、 1 0、 1 0 0 gZm 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果を表 7 5〜7 7に示す。

TPA無添加において、細胞中の HGF量は、 7— 1 2 SF d— Fの濃度による変化は無かった。培地中の HGF量も、 1 0 0 ; g/m 1で増加が見られたものの、 7— 1 2 SF d— Fの濃度による顕著な変化は無かった。また、 TPAを添加した場合は、細胞中の HGF量は、 7— 1 2 SF d— Fの濃度による変化は無かったが、全体的に低い値になっていた。一方、培地中の HGF量とトータル HGF量は、 7— 1 2 SF d— Fの濃度依存的に顕著に増加し、さらにトータル HGF量は、 7— 1 2 SF d— F無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このように mRNAが増加している場合の HGF量の増加は、 TPA無処理で mRNA量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、 7— 1 2 SF d— Fは、 mRNAの転写が促進され、大量の HGFが必要とされている場合は、 HGFの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになつた。表 75 HL60/7- 1 2 S F d— F培地中 HG F量（pg/Well)

7 - 1 2 SFd-F TPA無し 1 0 nMTPA {β g/m 1 )

0 7 6. 74 2 6 1. 6 0 1 67. 1 0 2 9 5. 94

1 0 78. 54 4 64. 5 5 1 0 0 1 6 2. 8 5 84 3. 84

表 76 HL60/7 - 1 2 S F d - F細胞中 H G F量（pg/Well)

7 - 1 2 SF d-F TPA無し 1 0 nMTPA in g/m 1 )

0 2 94. 1 2 8 3. 37 1 27 6. 6 7 8 9. 39

1 0 23 6. 30 6 7. 0 9 1 0 0 25 7. 04 8 5. 77

表 77 HL60/7- 1 2SFd-Fトータル HGF量（pg/Well)

7 - 1 2 S F d -F TP A無し 1 0 nMTP A

β gZm 1 )

0 370. 85 344. 97 1 343. 77 385. 32

1 0 3 1 4. 84 531. 64

1 00 420. 26 929. 60

実施例 1 8

1 0%牛胎児血清を含んだ RPMI 1 640培地で培養した HL 60細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）を S x l OS c e l l sZmlとなるように 1 %牛胎児血清を含んだ RPM 1 1 640培地に懸濁し、 2mlずつ 6穴の細胞培養プレートに入れた。その後、 1 OnMの TPAと参考例 2— (3) で調製した 7— 1 2 SFd— Fを最終濃度が 1 0 O gZmlになるように添加した。また、 TPA を添加せず、 7— 12 SFd— Fのみを添加する区分も同様に行った。さらに培養を行い、 4、 6、 8、 10時間目に全 RNAの抽出をおこなった。全 RNAの抽出には RNeasy Mini Kit (QIAGEN社製）を使用した。 RT— PCRは PCRサイクルを 32サイクルにしたこと以外は実施例 1 4と同様に行った。反応後、 2 % ァガロースゲル電気泳動及びェチジゥムブ口マイド染色を行い、 UV照射下でゲルを観察した。

その結果、 TPA無添加の場合、 HGFの mRNAの転写量は非常に少ないが、 7— 1 2 SF d - Fの添加により、添加後 4時間で、若干の HGFの mRNA 量の上昇が見られた。一方、 TPAの添加ににより、 HGFの mRNA量は、どの時間においても、顕著に上昇した。 TP Aと 7— 1 2 SFd— Fを添加した場合は、 TPAだけを添加した場合と比較して、 HGFの mRNA量が、添加後、 4時間で増加していることが明らかになつたが、 6時間では、 7— 1 2 SF d— Fの添加による差は無かった。つまり、 7— 1 2 SF d— Fは、 HGFを必要として mRN Aの転写が活発に行われはじめた初期において、顕著にその転写を促進するが、その後その促進効果は、消失することが明らかになった。このことより、 7— 1 2 SF d— Fは、 HGFが必要とされた瞬時の HGF産生を誘導し、その後過剰な H G F產生を誘導することは無いことが明らかになつた。実施例 1 9

( 1 ) 市販の菊菜を凍結乾燥し菊菜凍結乾燥物を得た。この菊菜凍結乾燥物を粉砕した菊菜粉末 1 0 gを 1 0 Om 1のクロ口ホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。その後、 1 0 Om 1のエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を 3回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、 1 0 Om 1の蒸留水に懸濁した。この懸濁液を 1時間 60 で保温した後、ろ過した。瀘液に 2. 5倍量のエタノールを添加して、一 20でで冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状の糖を含有する画分、菊菜抽出物を得た。

(2) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、実施例 1 9一（ 1 ) で調製した菊菜抽出物の HGF産生誘導活性を検討した。試料は最終濃度が 1、 1 0、 1 0 0 g/m 1になるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。 HGFの産生量は、ネガティブコントロール 1 0 0%として表した。その結果を表 7 8に示した。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。表 78に示したように、菊菜抽出物は HGFの産生を誘導した。表 78 菊菜抽出物（ zgZml) HGFの産生量（％)

1 1 25

1 0 1 4 8

1 0 0 3 1 4

(ただし、コントロールの HGF産生量は 8. 2 1 n gZm 1であった。）実施例 20

実施例 1— ( 1 ) と同様の方法で、参考例 1 3— （5) で調製したョモギ上清画分の HGF産生誘導活性を測定した。ただし、ョモギ上清画分は培地量の 1 0 0 0分の 1量を添加した。その結果を表 7 9に示した。その結果、ョモギ抽出物は、エタノール沈殿で沈殿しなレ、画分にも H G F産生誘導活性があることが明らかになつた。このことより、エタノール沈殿で沈殿しない低分子画分にも活性があることが考えられた。表 79 ョモギ上清画分 HGFの産生量

添加量 {%)

0 1 0 0

1000 分の 1 添加 4 6 3

(ただし、コントロールの HGF産生量は 4. 3 1 n gZm 1であった。）実施例 2 1

( 1 ) 乾燥ョモギ葉（発売：阪本漢方堂） 5 0 gをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、 500ml のアセトンを加え、 8000rpm、 10分間ホモジナイズし、濾紙で濾過して、残渣を得た。以上の操作を 2度行い、得られた 100gのョモギ葉の残渣をホモジナイザーに入れ、 500ml のアセトンを加えて、 8000rpm、 10分間ホ乇ジナイズし、濾紙で濾過し、残渣を得た。この操作を 4回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、 9 0 %ェ夕ノールで 4回、 8 0 %エタノールで 4回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。以上の操作を最初からもう一回行い、合わせて 200 gのョモギ葉のエタノール洗浄残渣を得た。

( 2 ) エタノール洗浄残渣に 10リットルの 100mM の塩化ナトリウムと 10%エタノールを含む 30m のリン酸緩衝液（pH8, 0 ) を加え、室温で 19時間攪拌し、濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量 1万のホ口ファイバーを装着させた限外濾過装置で 2 リットルまで濃縮した後、 20リットルの 10% エタノールを含む lOOmM塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、 668ml まで濃縮し、 1 gの活性炭を入れ、室温で 30分攪拌した後、 10000r pm、 40分遠心分離し、活性炭を除去した。上澄みに残った微量の活性炭は No. 5c のフィルターで除去した。活性炭処理液から 66. 8mlを取り、蒸留水で充分に透析した後、凍結乾燥し、 670mg の乾燥物を得た。この乾燥物をョモギ高分子画分（ YPS ) と名付けた。残った 601. 2ml の活性炭処理液を限外ろ過装置に入れ、 10% エタノール及び 50m の塩化ナトリウムを含む 10mMイミダブール- 塩酸緩衝液（pH 7. 0 ) に溶媒置換して、溶媒置換ョモギ高分子画分を得た。

( 3 ) 溶媒置換ョモギ高分子画分を 10% エタノール及び 50mM塩化ナトリウムを含む 10mMィミダゾ一ル- 塩酸緩衝液（PH7. 0 ) で平衡化した DEAE—セルロフアイン A- 800 カラム（Φ4. 05Χ 37. 8cm) に添加して、同じ緩衝液 1200mlでカラムを洗浄した後、 0. 1M (1000ml) から 2 M(lOOOml)までの塩化ナトリウムのグラジェントにより溶出させた。溶出液は一本あたり 30mlで分画した。溶出画分のうち、フラクション 13から 33までをョモギ葉高分子画分一 I (YPS-I ) と名付け、フラクシヨン No.69から 78までをョモギ葉高分子画分一 II (YPS-II) と名付け、フラクシヨン No.79から 137 までをョモギ葉高分子画分—III (YPS-III ) と名付け。 YPS-I、 YPS-IU YPS-III を蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥した。それぞれの凍乾物を 530mg、 420mg、 380mgを得た。

(4) YPS -III をさらに分画するために、 200mgの YPS- III を 50mlの 4M塩化ナトリウムを含む 5mMイミダゾ一ル- 塩酸緩衝液（ΡΗ8.0 ) に溶かし、同じ緩衝液で平衡化したフヱニルーセル口ファインカラム（Φ3.1 X 14.3 cm ) に添加した。 200ml の同じ緩衝液で洗浄した後、それぞれ 200ml の 1M塩化ナトリウムを含む 5mMィミダゾール-塩酸緩衝液（pH8.0 )、 200ml の蒸留水、 200ml のェ夕ノールで溶出した。

溶出液は一本あたり 10mlで分画した。溶出画分のうち、フラクション 1 から 32 までをョモギ葉高分子画分一 II I-l (YPS-III-1 ) と名付け、フラクション No.3 3から 53までをョモギ葉高分子画分一 in-2(YPS-III- 2)と名付け、フラクション No.54から 66までをョモギ葉高分子画分一 III- 3(YPS-III-3)と名付けた。 YPS - II I-l、 YPS-III-2、 YPS-III-3 を水に対して充分に透析後、凍結乾燥して、それぞれの凍乾物を 20. llmg、 32.59mg、 113.75mgを得た。

( 5 ) 実施例 1一（ 1 ) と同様の方法で、実施例 21— （2) 、 21— （3) で調製したョモギ抽出物の分画物、 YPS (試料①）、 YPS — I (試料②）、 YPS -II (試料③）、 YPS - III (試料④）の HGF産生誘導活性を測定した。その結果を表 80に示した。その結果、これらのョ乇ギ抽出物の分画物は HGF産生誘導活性を示した。表 8 0 試料 HGFの産生量

in g/m 1 ) (%) 試料① 0 1 0 0

1 2 1 4

1 0 2 6 7

1 0 0 2 1 5 試料② 0 1 0 0

1 1 2 1

1 0 1 1 3

1 0 0 2 6 0 試料③ 0 1 0 0

1 0 1 2 9

1 0 0 24 3 試料④ 0 1 0 0

1 2 3 2

1 0 3 2 3

1 0 0 2 7 2

(ただし、コントロールの HGF産生量は 8. 4 3 n gZm 1であった。）

(6) 実施例 1 — ( 1 ) と同様の方法で、実施例 2 1 — （4) で調製したョモギ抽出物の分画物、 YPS - III — 1 (試料①）、 YPS — III 一 2 (試料②）、 YP S 一 III -3 (試料③）の HGF産生誘導活性を測定した。その結果を表 8 1に示した。その結果、これらのョモギ抽出物の分画物は HGF産生誘導活性を示した。表 8 1 添加量 HGFの産生量（％)

(^ /ml) 試料① 試料② 試料③

0 1 00 1 00 1 00

1 1 88 290 247

1 0 1 8 1 304 21 7

1 00 348 295 243

(ただし、コントロールの HGF産生量は 8. 26 n gZin 1であった。）実施例 22

参考例 1— ( 1 ) 記載のガゴメ昆布由来フコィダン 30 gを蒸留水 1 2 Lに室温で 30分間攪拌溶解した。この懸濁液を 1 0000 xgで 40分間遠心分離し、その上液を集めた。これをメンブレンフィルタ一（0. 22/ m) (ミリポア社製）で無菌ろ過し、凍結乾燥品 21. 4 gを得た。これを Taka r aコンブフコィダン B f (以下、フコィダン Β ίと称す）とした。

実施例 1— (1) と同様の方法で、フコィダン B f (試料①）の HGF産生誘導活性を測定した。その結果を表 82に示した。ただし、実験は 2連で行い、その平均値を採用した。その結果、フコィダン B ίは HGF産生誘導活性を示した表 82 添加量 HGFの産生量（％)

{ g/m 1 ) 試料①

0 1 00

1 209

1 0 333

1 00 377

(ただし、コントロールの HGF産生量は 9. 1 7 n gZm 1であった。）実施例 23

(1)乾燥ガゴメコンブ 500 gを細断し、 1 0Lの 80%エタノールで洗浄後、 50 Lの 1 mM塩化カリウムを含有する 1 0 %エタノール中にて、 25でで 3日間攪拌し、網目の直径 32 mのステンレス金網でろ過してろ液約 45 Lを得た。このろ液 34 Lを 8 (TCで 3時間加熱した後、 50°Cまで冷却した。これを分子量 1万カツ卜の限外ろ過 OMEGAカセット（フィルトロン社製）で液温 50°Cに保ちながら濃縮した。さらに 50°Cに加温した蒸留水 5 Lで脱塩を行い、同蒸留水 20 OmLを加えて流路を 2回洗浄して回収し濃縮液 1. 5 Lを得た。これを凍結乾燥し、 8. 2 gの F— r i c hフコィダンを得た。

(2) 実施例 1一（1) と同様の方法で、実施例 23— （1) で調製した F— r i chフコィダン（試料①）の HGF産生誘導活性を測定した。その結果を表 83に示した。その結果、 F— r i c hは HGF産生誘導活性を示した。表 8 3 添加量 HGFの產生量（％)

ill g/ 1 ) 試料①

0 1 0 0

1 1 1 7

1 0 1 8 6

1 00 244

(ただし、コントロールの HGF産生量は 9. 60 n gZm 1であった。）実施例 24

1 0%牛胎児血清を含んだ DMEM培地で培養した NHDF細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞）を 1 X 1 0⁵ c e 1 1 sZm 1となるように 10%牛胎児血清を含んだ DMEM培地に懸濁し、 500 1ずつ 48穴の細胞培養プレートに入れ、 24時間培養した。その後、 1 %牛胎児血清を含んだ DMEM培地に交換し、 10 g / mlまたは、 100 zg Zmlのミノキシジル（和光純薬工業社製）と試料を添加した。なお、 F— r i c hフコィダン添加時については、ミノキシジル 1 zgZm l 添加についても試験を行った。また、ミノキシジルを添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) EL ISA Kit を用いて、培地中の HGFの量を測定した。試料として、実施例 22で調製したフコィダン B ί、実施例 23で調製した F— r i c hフコィダン、参考例 2— (3) で調製した 7— 1 23? (1—？を、最終濃度が、 1、 1 0、 1 0 0 g/m 1になるように添加した。なお、フ'コィダン B f については最終濃度が 0. 1 g/m 1添加についても試験を行った。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て 3連で行いその平均値を採用した。その結果を表 8 4〜8 6に示す。ミノキシジル無添加において、培地中の HGF量は、フコィダン B i、 F- r i c hフコィダン、 7— 1 2 SF d— Fの濃度依存的に増加し、無添加のコントロールより有意に増加していた。このことから、ミノキシジル無処理のような H GFの mRNAが少ない場合でも、細胞表面の HG Fの遊離と HGFの合成の両方を促進することが明らかになった。さらに、ミノキシジルを添加した場合は、培地中の HGF量は、フコィダン B i、 F— r i chフコィダン、 7- 1 2SF d一 Fの濃度依存的に増加し、無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このように mRNAが増加している場合の HGF量の増加は、ミノキシジル無処理で mRNA量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、フコィダン B f、 F— r i chフコィダン、 7— 1 2SFd— Fは、 mRNAが少量の場合は少ないなりに HGFの遊離と産生を促進し、さらに、 mRNAが大量に存在し、大量の HGFが必要とされている場合は、 HGFの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。表 84 NHDFZフコィダン B ί培地中 HGF濃度（pg/ml) フコィダン B f ミノキシジル無しミノキシジルミノキシジル

(U g/m 1 ) 1 0 g/m 1 1 00 ^ g/τη 1

0 N. D. 1 26. 04 1 48. 83 0 300. 20 307. 00 478. 90 1 428. 83 448. 1 7 624. 60

1 0 79 1. 93 799. 90 794. 20 1 00 729. 33 709. 97 860. 23

N. D. は検出限界以下を示す _c 表 8 5 NHDF/F- r i c hフコィダン培地中 H G F濃度（pg/ml)

F— r i c h ノキシジルミノキシジルミノキシジルミノキシジルフコィダン無し 1 zg/ml 10 /ml 100 g/ml

( fi g/m 1 )

0 N. D. N. D. N. D. N. D.

1 1 32. 75 N. T. N. T. 20 3. 0 3

1 0 3 1 6， 90 2 3 9. 9 0 3 1 0. 20 4 34. 1 0 1 0 0 3 6 9. 33 372. 70 372. 70 5 37. 87

N. D. は検出限界以下を示す。また、 N. T. は評価していないことを示す _c 表 8 6 NHDF/ 7 - 1 2 S F d - F培地中 H G F濃度（pg/ml)

7-12SFd-F ノキシジル無しミノキシジルミノキシジル

{p.g/ 1 ) 1 0 μ. g/m 1 1 0 0〃 g/m 1

0 N. D. N. D. 1 37. 20 1 228. 73 1 64. 00 37 8. 30

1 0 34 5. 9 3 3 76. 07 4 5 0. 8 3 1 0 0 4 39. 6 7 4 8 3. 20 820. 1 0

N. D. は検出限界以下を示す。実施例 25

マウス（CDF 1系雌性 7週齢、体重：約 2 0 k g)

に、ガラクトサミン（2 OmgZマウス）と LPS (リポポリサッカライド： 0 . 0 3 /g/マウス）を同時に腹腔内投与し劇症肝炎による致死モデルを作製し、参考例 1— ( 1 ) 記載のフコィダンによる延命効果を検討した。フコィダンは蒸留水で 1 0%に調整し、 1 On^Zkg体重（フコィダンとして 1 gZkg) の用量で、ガラクトサミンと LPS同時投与の 1時間前および 1時間後の 2回強制経口投与した。コントロール群には同様に蒸留水を投与した。

実験開始 72時間後の生存率はコントロール群で 8例中 1例、フコィダン投与群で 8例中 7例であり、フコィダン投与により顕著な延命効果が認められた。さらに、生存例における血清生化学値にも改善効果が認められた。その結果を表 8

7に示した。表 87 群 GPT (UZ1 ) GOT (U/1 ) 総ピリルビン

(mg/d 1 ) コントロール 385 6 1 3 1. 0

フコィダン投与群 94 ± 22 233 ± 53 0. 3 ± 0. 02

実施例 26

( 1 ) ガゴメ昆布 5 0 0 gを細断し、 1 0リットルの 8 0 %エタノールで洗浄後、 5 0リットルの 1 mM塩化カリウムを含有する 1 0%エタノール中にて内径 4 0 cmの容器で 25°Cで 2日間、 1分当り 1 20回転の速度で攪拌し、フコィダンを抽出し、抽出物を網目 32 t mのステンレス金網でろ過し、フコィダン溶液を調製した。

該フコィダン溶液 4 6リットルに、 1 gのパ一厶オイル（花王社製：化粧品用：) を 1 リツトルのエタノールに溶解し調製した、パ一ムオイル溶液 1 リットルを攪拌しながら添加し、更に 1 リツトルのグリセロールを添加し、化粧水を調製した。 (2) 実施例 26— （1) で調製したフコィダン溶液に、終濃度が 0. 02% となるようにゼラチン及び香料を添加しゼラチン使用の化粧水を得た。また同様にコラーゲンを添加しコラーゲン使用の化粧水を得た。寄託された生物材料

( 1 ) 寄託機関の名称 ·あて名

通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所

日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305 )

(2) 寄託された微生物

( i ) アルテロモナス（Alteromonas) s p. SN- 1 009

原寄託日： 1 996年 2月 1 3日

国際寄託への移管請求日： 1 996年 1 1月 1 5日

受託番号： FERM BP - 5747

(ii) フラボパクテリゥム（Flavobacterium) s p. S A- 0082 原寄託日： 1 995年 3月 29日

国際寄託への移管請求日： 1 996年 2月 1 5日

受託番号： FERM BP— 5402 産業上の利用可能性

本発明により成長因子産生誘導活性を示す物質を有効成分として含有する成長因子産生を要する疾患に有効な医薬が提供される。該医薬は、生体内における H GF産生誘導活性、 h- I GF産生誘導活性、 NGF ·神経栄養因子産生誘導活性等を有し、肝炎、糖尿病、がん、神経性疾患等のこれらの成長因子の産生を必要とする疾患の治療剤又は予防剤として有用である。

更に、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、硫酸化多糖、例えばフコイダン、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸高含有サメ軟骨抽出物、それらの分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩から選択されるものを用いて飲食品を製造することが可能になり、日常の飲食品として摂取することにより、成長因子の産生を要する疾患の症状改善等が可能となる。また同様の生理機能を有する飼料が提供される。

従って、 H G F産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、硫酸化フコース含有多糖、例えばフコィダン、それらの分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩から選択されるものを有効成分とする機能性飲食品、機能性飼料は、その成長因子産生誘導作用により、生体の恒常性の維持に有用な機能性飲食品、又は飼料である。

本発明により H G F産生誘導用ノィォ化粧料も提供され、これらは肌の健康管理等に極めて有用である。更にがん転移抑制剤も提供される。

また成長因子の産生誘導剤も提供され、当該誘導剤は成長因子の機能研究、成長因子に関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩からなる群より選択されるもの（但し、へパリン、へパラン硫酸を除く）を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤。

2 . 酸性多糖が硫酸化多糖である請求項 1記載の治療剤又は予防剤。

3 . 硫酸化多糖が藻類由来の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、植物由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖又は魚類由来の硫酸化多糖である請求項 2 記載の治療剤又は予防剤。

4 . 硫酸化多糖が合成硫酸化多糖である請求項 2記載の治療剤又は予防剤。

5 . 硫酸化多糖がフコィダンである請求項 2記載の治療剤又は予防剤。

6 . 酸性単糖が硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化 2—デォキシーグルコース、硫酸化夕ロース又は硫酸化マンノースである請求項 1記載の治療剤又は予防剤。

7 . 酸性オリゴ糖が硫酸化マルトース、硫酸化ラクトース、硫酸化スクロース、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクッロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルトース、硫酸化ッラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトへキサオース、硫酸化マルトへプタオース、硫酸化ドデシルーマルトへキサオース、下記式（ I ) で表される化合物及び下記式（I I)で表される化合物からなる群より選択される硫酸化オリゴ糖である請求項 1記載の治療剤又は予防剤。

(式中、 Rは OH又は OS〇₃ H である。）

(式中、 Rは 0H又は 0S0₃ H である。）

8 . 成長因子が肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子又は神経成長因子である請求項 1〜 7いずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤。

9 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質をさらに含有してなることを特徴とする請求項 1〜 8いずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤。

1 0 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質がサイトカイン類、プロスタグランジン類及びシクロペンテン環を有する化合物からなる群より選択される物質である請求項 9記載の治療剤又は予防剤。

1 1 . 成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の食品、飲料又は飼料。

1 2 . 酸性多糖が硫酸化多糖である請求項 1 1記載の食品、飲料又は飼料。

1 3 . 硫酸化多糖が藻類由来の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、植物由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖又は魚類由来の硫酸化多糖である請求項 1 2記載の食品、飲料又は飼料。

1 4 . 硫酸化多糖が合成硫酸化多糖である請求項 1 2記載の食品、飲料又は飼料。

1 5 . 硫酸化多糖がフコィダンである請求項 1 2記載の食品、飲料又は飼料。

1 6 . 酸性単糖が硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化 2—デォキシーグルコース、硫酸化夕ロース又は硫酸化マンノースである請求項 1 1記載の食品、飲料又は飼料。

1 7 . 酸性オリゴ糖が硫酸化マルトース、硫酸化ラクトース、硫酸化スクロ一ス、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクッロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルト一ス、硫酸化ッラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトへキサオース、硫酸化マルトへプタオ一ス、硫酸化ドデシルーマルトへキサオース、式（ I ) で表される化合物及び式（ I I ) で表される化合物からなる群より選択される硫酸化オリゴ糖である請求項 1 1記載の食品、飲料又は飼料。

(式中、 Rは O H又は〇S〇₃ H である。）

(式中、 Rは〇H又は O S 0₃ H である。）

1 8 . 肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子産生誘導用である請求項 1 1〜1 7いずれか 1項に記載の食品、飲料又は飼料。

1 9 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質をさらに含有してなることを特徴とする請求項 1 1〜 1 8のいずれか 1項に記載の食品、飲料又は飼料。

2 0 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質がサイトカイン類、プロスタグランジン類及びシクロペンテン環を有する化合物からなる群より選択される物質である請求項 1 9記載の食品、飲料又は飼料。

2 1 . 成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の化粧料。

2 2 . 酸性多糖が硫酸化多糖である請求項 2 1記載の化粧料。

2 3 . 硫酸化多糖が藻類由来の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、植物由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖又は魚類由来の硫酸化多糖である請求項 2 2記載の化粧料。

2 4 . 硫酸化多糖が合成硫酸化多糖である請求項 2 2記載の化粧料。

2 5 . 硫酸化多糖がフコィダンである請求項 2 2記載の化粧料。

2 6 . 酸性単糖が硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化 2—デォキシーグルコース、硫酸化タロース又は硫酸化マンノースである請求項 2 1記載の化粧料。

2 7 . 酸性オリゴ糖が硫酸化マルトース、硫酸化ラクト一ス、硫酸化スクロース、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクッロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルトース、硫酸化ッラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトへキサオース、硫酸化マルトへプタオ一ス、硫酸化ドデシルーマルトへキサオース、式（ I ) で表される化合物及び式（ I I ) で表される化合物からなる群より選択される硫酸化オリゴ糖である請求項 2 1記載の化粧料。

(式中、 Rは OH又は 0S0₃ H である。）

(式中、 Rは〇H又は OS〇₃ H である。）

28. 肝細胞増殖因子産生誘導用、ィンスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子產生誘導用の化粧料である請求項 21〜27いずれか 1項に記載の化粧料。

2 9 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質をさらに含有してなることを特徴とする請求項 2 1〜2 8のいずれか 1項に記載の化粧料。

3 0 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はそれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質がサイトカイン類、プロスタグランジン類及ぴシクロペンテン環を有する化合物から選択される物質である請求項 2 9記載の化粧料。

3 1 . ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ゲン、又は浴用洗剤である請求項 2 1〜3 0のいずれか 1項に記載の化粧料。

3 2 . 酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩からなる群より選択されるものを有効成分として含有することを特徵とする成長因子産生調整剤。