WO2000061776A1

WO2000061776A1 - Derives de vitamine d et procede de production correspondant

Info

Publication number: WO2000061776A1
Application number: PCT/JP2000/002410
Authority: WO
Inventors: Koji Takeda; Kaichiro Kominato; Masateru Kumazawa; Masato Shimizu; Sachiko Yamada
Original assignee: Mercian Corporation; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2000-10-19
Also published as: EP1172442A4; EP1172442A1; AU3837100A

Description

明細書ビ夕ミン D誘導体及びその製造方法技術分野

本発明は、ビタミン D誘導体の 2位、 2 4位、 2 5位及び/または 2 6位の水素原子を水酸基に変換する生物学的な水酸化方法及びその方法により製造された新規なビタミ D ₃誘導体に関する。さらに詳しくは、

( 1 ) ビタミン D誘導体の 2位、 2 4位、 2 5位及びノまたは 2 6位の水素原子を微生物を用いて水酸基に変換することを特徴とするビ夕ミン D誘導体の製造方法（水酸化方法）、及び

( 2 ) 一般式（I )

(式中、全ての記号は後記と同じ意味を表わす。）で示される新規なビ夕 D ₃誘導体に関する。背景技術

ビタミン D誘導体は体内でのカルシウムの吸収、骨のカルシウム代謝促進または表皮ケラチン細胞の分化等に関係する重要なビ夕ミンであり、その活性は肝臓で 2 5位、腎臓で 1 α位が水酸化を受けて発揮されることが知られている [ェイチ ·エフ ·デル一力及びエイチ ·ケー ·ジヨーンズ：ァニユアル · レビュー ·ォブ ·バイオケミストリー（Ann. Rev. Bi ochem. ) ，第 5 2 巻， 4 1 1頁（1983年) ] 。ところが、肝機能障害を持つ患者では、 2 5—ヒドロキシビタミン D ₃の生体内における生成量が不足していることが知られており、この様な患者に対する 2 5 —ヒドロキシビタミン D ₃の投与は、生体内での不足分を補うという観点から有効である。特に腎不全（腎不全性くる病等）や骨粗鬆症患者等には 1 α， 2 5—ジヒドロキシビタミン D ₃が著効を頭す。

1 a , 2 5 —ジヒドロキシビタミン D ₃は 2 5 —ヒドロキシビタミン D ₃を原料として微生物を用いて酵素化学的に変換生成されることが知られているが、その変換効率は十分ではなかった（特開平 2-469号及び特開平 2-231089 号（米国特許第 4. 892, 821号） ) 。

そこで、本発明者らは微生物を用いるビタミン D誘導体からの 2 5—ヒドロキシビタミン D誘導体、あるいは 1 α， 2 5 —ジヒドロキシビタミン D誘導体への変換において、シクロデキストリン類を反応液中に共存させることによりその変換効率を増大する方法を先に提案した（特開平 4-166090 号 (米国特許第 5， 474, 923号））。

さらに、近年、 1 a及び 2 4位をヒドロキシル化した合成ビタミン D誘導体（1 α， 2 4—ジヒドロキシビタミン D ₃ ) が 1 α， 2 5—ジヒドロキシビタミン D ₃の特異的レセプ夕一に結合し、 1 α， 2 5—ジヒドロキシビ夕ミン D ₃と同様な活性を示すことが報告されている [ジャーナル ·ォブ ·デルマトロジー（The Journal o f Dermat o l ogy) , 第 1 7巻， 1 3 5頁（1990 年) ] 。

このように、ビタミン Dの各種誘導体は、その本来の活性であるカルシゥムの吸収、骨のカルシウム代謝促進、表皮ケラチン細胞の分化等の活性が増強され、選択性が増し、あるいは体内での吸収性の改善が期待される。発明の開示

本発明者らは、先に本発明者らが開発した微生物を用いるビタミン D誘導体からのヒドロキシビタミン D誘導体の微生物変換反応液についてさらに検討を進めた結果、これまで構造が知られていない新規なヒドロキシビタミン D誘導体を数種確認した。これらの新規化合物について現在その活性の詳細について調査中であるが、ビタミン D作用を有する新たな医薬として期待される。

本発明者らは先に提案した生物学的方法（特開平 4-166090 号（米国特許第 5， 474, 923 号））による 1 α—ビタミン D ₃の 2 5位を水酸化したビ夕ミン類の製造方法について、基質として、ビタミン D ₃のほか、 1 9—フルォ口ビタミン D ₃、 1 9一フルオロー 1 α—ジヒドロキシビタミン D ₃、 4， 4 —ジフルォロビタミン D ₃、 4， 4ージフルオロー 1 α—ヒドロキシビタミン D ₃、 1 α—ヒドロキシビタミン D ₃についての反応液について検討した結果、 2 5位だけでなく、 2位、 2 4位及び 2 6位に水酸基が導入された新規なヒドロキシビタミン D ₃が存在することを確認し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は

1 ) ビタミン D類を水酸化する微生物菌体またはその菌が生産する酵素を含有する溶液中に、必要ならばシクロデキストリン類を共存させ、ビタミン D 類の 2位、 2 4位、 2 5位及び/または 2 6位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とするヒドロキシビタミン D誘導体の生物学的製造方法、及び

2 ) —般式（I )

(式中、 R R²、 R²⁴、 R²⁵及び R²⁶はそれぞれ独立して水素原子またはヒドロキシル基を表わし、 R⁴及び R ¹⁹はそれぞれ独立して水素原子またはフッ素原子を表わすが、 R²、 R ²⁴及び R ²⁶のうち 1っはヒドロキシル基であり、残りの 2つは水素原子である。）

で示されるビタミン D₃誘導体（ただし、 R¹及び R²⁴がヒドロキシル基を表わし、 R²、 R⁴、 R¹⁹、 R²⁵及び R²⁶が水素原子を表わす 1 α， 24- ジヒドロキシビタミン D₃は除く。）を提供する。発明の詳細な説明

一般式（I) で示される新規なビタミン D₃誘導体の具体例としては、以下の（1) 〜（10) の化合物が挙げられる。

(1) 1 , 26—ジヒドロキシビタミン D₃、

(2) 2 , 25—ジヒドロキシビタミン D₃、

(3) 19—フルォロ一 24—ヒドロキシビタミン D ₃、

(4) 19一フルォロ _ 26—ヒドロキシビタミン D₃、

(5) 19—フルォロ一 1 α， 24—ジヒドロキシビタミン D₃、

(6) 19—フルォロ一 1 α， 26—ジヒドロキシビタミン D₃、

(7) 4， 4ージフルォロ一 24—ヒドロキシビタミン D₃、

(8) 4, 4—ジフルオロー 26—ヒドロキシビタミン D ₃、 (9) 4， 4ージフルオロー l a, 24—ジヒドロキシビタミン D₃、

(10) 4, 4—ジフルオロー l a, 26—ジヒドロキシビタミン D₃。

本発明の微生物的製造方法で水酸化の対象となるビ夕ミン D類とは、 2位、 24位、 2 5位及びノまたは 2 6位に水素原子を有するビタミン D誘導体である。

例えば、ビタミン D₂誘導体、ビタミン D₃誘導体、ビタミン D₄誘導体、ビタミン D₅誘導体、ビタミン D₇誘導体をいい、それらの水素原子、または水酸基がフッ素原子などの八ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基等で置換されたもの、さらには 4， 4位の 2個の水素原子及び Zまたは 1 9位の水素原子がフッ素原子などのハロゲン原子で置換されているものでもよい。

具体的には、ビタミン D ₂、ビタミン D ₃、ビタミン D₄、ビタミン D₅、ビタミン D₆、ビタミン D ₇、 24_ォキソビタミン D₃、 l a—ヒドロキシビタミン D₂、 1 a—ヒドロキシビタミン D₃、 1 a—ヒドロキシビタミン D ₄、 1 a—ヒドロキシビタミン D₅、 1 a—ヒドロキシビタミン D₆、 1 a - ヒドロキシビタミン D₇、 1 a—ヒドロキシ一 24—ォキソビタミン D ₃、 1 a, 24—ジヒドロキシビタミン D₃、 2 a—ヒドロキシビタミン D₂、 2 —ヒドロキシビタミン D₃、 2 a—ヒドロキシビタミン D₄、 2 a—ヒドロキシビタミン D₅、 a—ヒドロキシビタミン D₆、 2 a—ヒドロキシビタミン D ₇、 2 a—ヒドロキシー 24—ォキソビタミン D₃、 2 a, 24—ジヒドロキシビタミン D ₃、 24—ヒドロキシビタミン D₃、 23—ヒドロキシビタミン D₃、 23—ヒドロキシビタミン D₄、 1 , 2 3—ジヒドロキシビタミン D ₃、 1 , 2 3—ジヒドロキシビタミン D₄、 2 , 23—ジヒドロキシビ夕ミン D₃、 2 a, 23—ジヒドロキシビタミン D₄、 26—ヒドロキシビタミン D₂、 2 6—ヒドロキシビタミン D₃、 2 6—ヒドロキシビタミン D₄、 1 a, 2 6—ジヒドロキシビタミン D₂、 1 , 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃、 1 , 26—ジヒドロキシビタミン D₄、 2 , 2 6—ジヒドロキシビ夕ミン D₂、 2 , 26—ジヒドロキシビタミン D₃、 2 , 2 6—ジヒドロキシビタミン D₄、 2 3， 24_ジヒドロキシビタミン D₃、 2 3， 26—ジヒドロキシビタミン D₃、 23， 26—ジヒドロキシビタミン D₄、ビタミン D₃— 26， 23—ラク卜ン、 1 α—ヒドロキシビタミン D₃— 26， 23— ラク卜ン、 2 α—ヒドロキシビタミン D₃_26， 23—ラク卜ン、 24, 24—ジフルォロビタミン D ₃、 24， 24—ジクロロビタミン D ₃、 24， 24—ジブロモビタミン D₃、 26， 26， 26， 27， 27， 27—へキサフルォロビタミン D₃、 26， 26， 26， 27， 27， 27—へキサクロロビタミン D ₃、 24, 24—ジフルォロ一 25—ヒドロキシ _ 26， 2 7—ジメチルビ夕ミン D ₃、 24， 24—ジクロロ一 25—ヒドロキシ一 2 6， 27—ジメチルビ夕ミン D₃、 25—ヒドロキシビタミン D₂、 25—ヒドロキシビタミン D₃、 25—ヒドロキシビタミン D₄、 25—ヒドロキシビ夕ミン D₅、 25—ヒドロキシビタミン D₆、 25—ヒドロキシビタミン D₇、 24—ォキソ一 25—ヒドロキシビタミン D₃、 24， 25—ジヒドロキシビタミン D₃、 23， 25—ジヒドロキシビタミン D₃、 23, 25—ジヒドロキシビタミン D₄、 25， 26—ジヒドロキシビタミン D ₂、 25， 26— ジヒドロキシビタミン D₃、 25， 26—ジヒドロキシビタミン D₄、 25— ヒドロキシビタミン D₃— 26， 23—ラクトン、（10E) — 19-フルォロビタミン D₃、 ( 10 E) 一 19—フルォロ一 1 α—ヒドロキシビタミン D₃、 ( 10 E) — 19 _フルォロ一 2ひ一ヒドロキシビタミン D₃、 4， 4—ジフルォロビタミン D₃、 4， 4—ジフルォロ一 1 α—ヒドロキシビ夕ミン D₃、 4， 4—ジフルォロ一 2 α—ヒドロキシビタミン D ₃、 4， 4—ジフルォロ一プロビタミン D₃、（10E) — 19—クロ口ビタミン D₃、 (1 0 E) 一 19—クロロー 1 α—ヒドロキシビタミン D₃、 ( 10 E) 一 19 —クロ口一 2 α—ヒドロキシビタミン D₃、 4， 4—ジクロロビタミン D₃、 4， 4—ジクロロ一 1 α—ヒドロキシビタミン D ₃、 4， 4ージクロロー 2 α—ヒドロキシビタミン D₃、 4， 4—ジクロロ一プロビタミン D₃等が挙げられる。

これらの中でも好ましいものとして、下記一般式（Π)

(式中の記号は前記と同じ意味を表わす。）で示されるビタミン D₃誘導体、具体的にはビタミン D₃、 19—フルォロビタミン D₃、 19—フルォロ _ 1 α—ヒドロキシビタミン D ₃、 4， 4—ジフルォロビタミン D ₃、 4， 4—ジフルオロー 1 α—ヒドロキシビタミン D ₃、及び 1 α—ヒドロキシビタミン D₃等が挙げられる。

本発明に用いられるビタミン D類の水酸化能を有する微生物とは、ノカルディア属、ストレプトマイセス属、スフインゴモナス属またはアミコラータ属に属するものである。

ノカルディア属に属するものとしては、例えばノカルディア ·ォゥトトロフイカ (Nocardia autotrophics) N-102 (生命研条寄第 1573 号（FERM BP - 1573)) などが挙げられる。

ストレプトマイセス属に属するものとしては、例えばストレプトマイセス · ロゼォスポラス (Streptomyces roseosporus) A-5797 (生命研条寄第 1574 号（FERM BP-1574) ) 、ストレブトマイセス，スクレ口チアラス (Streptomyces sclerot ialus ) T-JSI (生命研条寄第 1370 号（FERM BP- 1370)) などが挙げられる。

スフィンゴモナス属に属するものとしては、例えばスフィンゴモナス ·マリー (Sp ingomonas mali) IF015500, スフインゴモナス ·バウチモビリス (Sphingomonas paucimobi 1 is) IF013935, スフインゴモナス 'パラバウチモビリス (Sphingomonas parapaucimobi 1 is) IF015100, スフインゴモナス 'ヤノイクヤエ (Sphingomonas yano ikuyae) IF015102, スフインゴモナス ' アドハエシバ (Sphingomonas adhaes iva) IF015099, スフインゴモナス 'カプスラー夕 (Sphingomonas capsulata) IF012533, スフインゴモナス 'サンギス (Sphingomonas sangui s) IF013937, スフインゴモナス 'マクロゴルタビダス (Sphingomonas macrogo l tabi dus) IFO15033、スフインゴモナス ·テラーェ (Sphingomonas terrae) IFO15098などが挙げられる。

アミコラータ属に属するものとしては、例えばアミコラ一夕 ·サツルネア (Amycolata saturnea) A- 7983 (生命研条寄第 2307 号（FERM BP- 2307) ) 、アミコラ一夕 'サツルネア (Amycol ata saturnea) A-1246 (生命研条寄第 5544 号（FERM BP-5544) ) のほか、アミコラ一夕 'サツルネア (Amycol ata saturnea ) IF014499、アミコラ一夕 · ォゥトトロフイカ（Amycolata autotrophica) ATCC19727, アミコラ一夕ォゥトトロフイカ (Amycolata autotrophica) ATCC1318K アミコラ一夕ォゥトトロフイカ (Amycolata autotrophica) ATCC33794、アミコラ一夕ォゥトトロフイカ (Amycolata autotrophica) ATCC33795, アミコラ一夕ォゥトトロフイカ (Amycolata autotrophica) ATCC33796、アミコラ一夕ォゥトトロフイカ (Amycolata autotrophica) ATCC33797, アミコラ一夕ォゥトトロフイカ（Amycolata autotrophica) JCM4010 , アミコラ一夕 ' ヒドロカルボンォキシダンス (Amycolata hydrocarbonoxidans) IF014498などが挙げられる。

これらは単独で用いてもよいし、 2種以上を混合して用いてもよい。

本発明では、シクロデキストリン類を添加しなくても水酸化反応は進行するが、好ましくはシクロデキストリン類を添加することが有効な手段である。本発明で用いられるシクロデキストリン類には、 α—シクロデキストリン、

3—シクロデキストリン、 τ—シクロデキストリン、 /3—ジメチルシクロデキストリン、 3—トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロデキストリン（以下、 P M C Dと略記することがある。）、分枝シクロデキストリンなどがある。これらのシクロデキストリン類は単独で用いてもよいし、あるいは 2種以上を混合したものを用いてもよい。 [本発明化合物の製造方法]

本発明の方法では微生物の菌体またはその菌が生産する酵素を含有する溶液中でシクロデキストリン類を共存させることにより、その反応速度、反応効率を上げることができる。微生物を培養する培地は、主として液体培地を用い、炭素源としてグルコース、マルトース、シユークロース、デキストリン、澱粉、ァラビノース、キシロース、グリセリド、植物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒素源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミ —ル、カゼイン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等を単独または混合して用いる。その他生育に必要な、あるいは 2 4位、 2 5位、 2 6位、 1位または 2位水酸化酵素の生産を促進する有機物及び無機物を必要に応じて添加することができる。

培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの好気培養が適している。

培養温度は 2 0〜 3 3 、好ましくは 2 5〜 3 0 で行ない、培養 1 2〜 9 6時間後、好ましくは 2 4〜 4 8時間後に基質となるビタミン D誘導体、及び所望によりシクロデキストリン類を添加する。ビ夕ミン D誘導体の添加量は培地中 1 O〜1000 /z g /mし好ましくは 5 0〜 5 0 0 g /m 1が好適であり、シクロデキストリン類の添加量は 0. 1〜 1 5質量％、好ましくは 0. 1〜 2質量％が好適である。培養の p Hは 5〜 9、好ましくは 6〜 8が好適である。

本発明の製造方法では、培養液中あるいは培養菌体あるいは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは通気撹拌することが適しており、基質であるビ夕ミン D誘導体、及び所望によりシクロデキストリン類を添加後 1 〜 1 3 0時間好気的に撹拌を行なう。好気的条件を得るために培養器内の圧力を上げたり酸素気流下で反応を行なうことも有効である。

シクロデキストリン類の添加方法は、基質であるビタミン D誘導体と予め混合しておく方法、ビタミン D誘導体を先に添加し、つづいてシクロデキストリン類を添加する方法、シクロデキストリン類を先に添加しておき、後からビタミン D誘導体を添加する方法のいずれでも可能である。

これらの反応により製造されたビタミン D誘導体を単離するには有機溶剤による抽出、カラムクロマトグラフィー等の方法が採られる。例えば反応終了後、反応液を塩化メチレンにより抽出し、濃縮、乾固する。これを 2—プロパノール、 n—へキサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ過、遠心分離などにより不溶物を除いた後シリカゲルカラム、例えばゾルバックス S I L (米国デュポン社製）、シムパック ODS (島津製作所製）、ハイバー RT 250— 1 0リク口ソルブ S i 60 (シカ ·メルク社製）等を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC) によりヒドロキシビタミン D誘導体の単離を行なうことができる。産業上の利用可能性

本発明の方法により微生物菌体またはその生産する酵素を用いて、 2位、 24位、 25位及びまたは 26位の水素原子が水酸基に変換された新規なビ夕ミン0₃誘導体を製造することができる。

特に、本発明の方法によれば、 2位、 24位、 25位及び 26位に結合した水素原子の 1つまたは 2つが水酸基によつて変換されたモノヒドロキシ置換体またはジヒドロキシ置換体を容易に製造することができる。

本発明の方法により製造される新規なビタミン D₃誘導体は、その本来の活性であるカルシウムの吸収、骨のカルシウム代謝促進、表皮ケラチン細胞の分化等の活性が増強され、選択性が増し、あるいは体内での吸収性の改善が期待される。

[薬理活性]

実施例に記載した下記 8種類の新規ビタミン D₃誘導体及び対照化合物 (検体 1〜9) について、（1) ビタミン D受容体（VDR) 結合能、 (2) ビタミン D結合蛋白（DBP) 結合能及び（3) HL— 60分化誘導能の評価試験を行なった。検体 1 :対照（l a， 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ ( 1， 2 5 (0 H) ₂D₃) ) 、

検体 2 :実施例 1 (1) (2 a, 25—ジヒドロキシビタミン D₃) 、検体 3 :実施例 2 (1 a, 26—ジヒドロキシビタミン D₃) 、

検体 4 :実施例 4 (1) (1 9—フルオロー l a, 24—ジヒドロキシビ夕ミン D₃) 、

検体 5 :実施例 4 (2) (1 9—フルォロ— 1 ひ， 25—ジヒドロキシビ夕ミン D₃) 、

検体 6 ：実施例 4 (3) 1 9—フルォロ— 1 a， 26—ジヒドロキシビタミン D₃) 、

検体 7 :実施例 5 (1) (4， 4—ジフルオロー 24—ヒドロキシビタミン D₃) 、

検体 8 :実施例 5 (3) (4， 4ージフルォロ— 26—ヒドロキシビタミン D₃) 、

検体 9 :実施例 6 (2) (4, 4—ジフルオロー 1ひ， 25—ジヒドロキシビタミン D ₃) 、

(1) ビタミン D受容体（VDR) 結合能

VD Rに対する結合能は以下のラジオレセプ夕一アツセィ（radio receptor assay： RRA) 法により行なった。

1, 25 (OH) ₂D₃及び各検体をそれぞれ 1 Ο 'Μ〜： L 0-⁶Mになるように段階希釈した。小試験管に [26， 27-³H] — 1、 25ジヒドロキシビタミン D₃ (³H— 1， 25 (OH) ₂D₃) 溶液 20 z Lと 1， 2 5 (OH) ₂D₃及び各検体溶液を 60 Lずつ加え、 VDR溶液（ニヮトリ小腸レセプ夕一） 0.5mLを加えて混合し、 4でで 3時間放置した。次に、デキストラン—活性炭懸濁液 0.125m Lを加えて混合した後、氷冷中で 30分間放置し、 3000 r pmで 1 5分間遠心分離して VD Rに結合しなかった³ H

- 1, 25 (OH) ₂D₃を除き、上清 0.5m 1を用いて VDRに結合した³ H

— 1， 25 (OH) ₂D₃量を測定した。 VDR結合能は、 1， 2 5 (OH) ₂D ₃及び各検体が競合して存在した場合の³ H— 1， 2 5 (OH) ₂D₃の VDR結合量（B) 力 ³H— 1， 2 5 (OH) ₂D₃のみ存在した場合の VDR結合量（Β₀) を 5 0 %阻害した値 (ΒΖΒ。 5 0 %値）を求めて比較し、 1， 2 5 (OH) ₂D₃の ΒΖΒ。 5 0%値を1 0 0とした場合の各検体の相対値を表 1に示した。

ビタミン Dのカルシウム代謝調節作用や細胞の増殖抑制作用、分化誘導作用等の種々の作用は、ビタミン D受容体（VDR) を介して発現されるが、表 1から明らかなように本発明のビタミン D₃誘導体は VDR結合能を有し、前記各種の作用を発現する医薬としての用途が期待される。

(2) ビタミン D結合蛋白（DBP) 結合能

DBPに対する結合能は以下の競合的蛋白結合法（competitive protein binding assay： C P BA) を用いて評価した。 1， 2 5 (OH) ₂D₃及び各検体は 1 0— "M〜 1 0— ⁵Mとなるように希釈した。小試験管に [2 6， 2 7 -³H] 一 2 5ヒドロキシビタミン D₃ (³H- 2 5 (OH) D₃) 溶液 5 O Lと 1， 2 5 (OH) ₂D₃及び各検体溶液を 1 00 Lずつ加え、 DB P溶液（ラット血清をバルピタール酢酸緩衝液にて希釈） lmLを加えて混合し、 4でで 1時間放置した。次にデキストラン活性炭懸濁液 0.5mLを加えて混合した後、氷冷中で 10分間放置し、 3000 r pmで 15分間遠心分離して DBPに結合しなかった³ H— 2 5 (OH) D₃を除き、上清 lmLを用いて DBPに結合した³ H— 2 5 (OH) D₃量を測定した。

DBP結合能は、 1, 2 5 (OH) ₂D₃及び各検体が競合して存在した場合の³ H— 2 5 (OH) D₃の DB P結合量（B) が、 ³H— 2 5 (OH) D ₃のみ存在した場合の DBP結合量（B。）を 5 0 %阻害した値（BZB。 5 0%値）を求めて比較し、 1, 2 5 (OH) ₂D₃の BZB。 5 0 %値を 1 0 0とした場合の各検体の相対値を表 1に示した。

ビタミン D類は血液中でビタミン D結合蛋白（DBP) に結合されて安定に存在する。 D B Pに結合する性質を有する本発明に係るビ夕ミン13₃誘導体は血液中に安定に存在できることを示し、血液によって必要な部位、臓器に運ばれ、ビタミン Dとしての作用を発現できる可能性が示唆され、血液中に安定に存在する、あるいは血流で標的臓器に運ばれる医薬としての用途が期待される。

(3) HL-60分化誘導能

HL- 60細胞を 10 %ゥシ胎児血清を含む RPM I - 1640培地にて、 37で、 5%C〇₂条件下で継代培養した。

ビタミン D誘導体による HL— 60細胞の分化誘導は、 1 。—"〜上 0-5 Mの 1, 25 (OH) ₂D ₃及び各検体を含む培養液中で、 37でで 4日間培養することによって誘導した。分化誘導能はフオルボールミリステートァセテート（PMA) 刺激により産生されるスーパオキサイドの量をチトクローム Cの還元を指標として評価した。すなわち、培養液を吸引除去後、ビタミン D誘導体処理細胞を 1.5m Lの反応混合液（フェリチトクローム C (ferricytochrome C) (80 /M) 、 PMA (500 n g/mL) ) に懸濁し 37 で 1時間培養した。培養終了後、遠心上清の吸光度 OD₅₅。一 OD ₅₄。を測定した。還元チトクローム Cの濃度は、分子吸光係数 19. IX 1 0³c nr¹を用いて下記の式により計算した。

還元チトクローム C濃度（nmo 1ZL) =

(〇D₅₅。一〇D₅₄。） /19. IX 10³ X 1.5/10³ X 10⁹

HL-60分化誘導能は、還元チトクローム C濃度から求めた EC ₅₀値により比較し、 1， 25 (OH) ₂D₃の EC₅₀値を 100とした場合の各検体の相対値を表 1に示した。

ビタミン D類は、未分化な腫瘍細胞を分化した正常細胞（マクロファージ）へと導く作用を有する。 HL— 60はヒト前骨髄性白血病細胞株であり、表 1から明らかな通り HL— 60を分化させる作用を有する本発明に係るビタミン0₃誘導体は分化誘導作用を有する医薬としての用途が期待できる。表 1 検体 VDR HL- 6 0 DB P

番号 ¾±A台ヒ

和口 B匕分化誘導能和 α Β匕

1 対照 100.00 100.00 100.00

2 実施例 1 (1) 32.480 3.285 11433.718

3 実施例 2 107.557 34.715 168.529

4 実施例 4 (1) 72.878 196.572 23.665

5 実施例 4 (2) 62.386 87.404 35.792

6 実施例 4 (3) 29.129 12.296 35.257

7 実施例 5 (1) 81.860 105.243 16.633

8 実施例 5 (3) 34.067 <6.092 28.106

9 実施例 6 (2) 92.716 79.906 26.684 発明を実施するための最良の形態

以下実施例により本発明を詳細に説明するが、これによつて本発明が限定されるものではない。なお、下記の例中の％は特にことわらないかぎり質量基準による。

実施例中、各試料の機器分析には以下の方法を用いた。

微生物変換後の試料は日本分光製 MD— 9 1 0型マルチ検出器を装備した HPLCシステムを用いて分離、精製し、以下の分析を行なった。

iH— NMR及び¹⁹ F— NMRはブルカー製 ARX— 40 0型により測定した。 — NMRの場合はテトラメチルシラン（tetramethylsilane； TM S) を内部標準として、また¹⁹ F—NMRの場合はトリフルォロトルエン (trifluorotoluene) を外部標準（δ =— 6 3 p pm) として、化学シフトを δ値で示した。 NMRの記載は次の略号によった。 s =singlet、 d = doublet, t = triplet, m=multipleu b r =broad signal MSスぺクトルは日本電子製 JMS— AX 5 0 5 HA型を用い電子衝撃法（E I ) により測定した。 UVスぺクトルは日立製 U— 3200型により測定した。実施例 1 ：ビタミン D₃の微生物変換

バクトソィトン（ディフコ社製） 1.5%、コーンスチ一プリカ一 0.5%、グルコース 1.5%、 N a C 1 0· 5%、 C aC〇₃ 0.2% (ρΗ7· 2)からなる培地（BG培地） 10 Om 1を 50 Om 1容三角フラスコに入れ、 12 O ：、 20分間加圧滅菌した。これにアミコラ一タ ·ォゥトトロヒカ ATTC 33797 (Amyco lata autotrophica ATTC 33797) を一白金耳接種し 28 X：で 7 2時間振盪し好気培養した。

培養液を遠心分離し菌体を集め、 pH7.4の 0.01Mトリス酢酸バッファー (2mM 酢酸マグネシウム、 7mM 2メルカプトエタノール、 20%ダリセリン含有）で 1回洗浄後、同じバッファー 10 Om 1に懸濁した。この懸濁液を超音波（20 kHz、 50 W、 2分間）破碎し、遠心分離（10， 000X g、 1 5分間）して上澄液を得た。この上澄液にポリエチレングリコール 6000を最終濃度 25 %になるように少しずつ加えて溶解した後、 4でで 10 分間放置した。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。この粗酵素沈澱物の湿重量 1 gを pH7.4 のトリス酢酸バッファー（7 OmMニコチンアミド、 2 mM酢酸マグネシウム、 1 0 OmM NADP、 5 mM ATP、 6 mM グルコース— 6—リン酸を含む。） 10m lに懸濁し、グルコース— 6—リン酸デヒドロゲナーゼ 5ュニット、 1 OmgZm 1のビタミン D ₃ エタノール溶液 0.2m 1及び 50 %部分メチル化) 3—シクロデキストリン（メルシャン社製）溶液 0. lm 1を加え、 2 8でで 1時間撹拌、振盪して酵素反応を行なった。

反応終了後、培養液と等量のメタノールを添加混合し、 3000 r pm、 1 0 分間の遠心分離（島津製作所製、 C ST 06 0 LF型）を行ない、上清を回収した。回収した上清をダイアイオン HP 2 0 S S (三菱化成社製）を充填したカラム（内径 1 cmx長さ 1 5 cm) に流速 0.5m 1 Zm i nで通液し、 5 0〜1 0 0 %メタノール濃度勾配溶出でピーク画分を得た。このピーク画分を濃縮乾固し、 2—プロパノール： n—へキサン（1 : 9) の混合溶媒 3 m lに溶解し、一 2 Otで 2時間放置し、生じた不溶成分を遠心分離によつて除去した。この上清液を減圧濃縮し、生成物（2.2mg) を得た。 HPL Cにより各ピーク画分を集め、これを 40で以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し、以下に示す 2 α, 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ (20 g) を得た。

また、上記とは別の画分を以下の条件でセミ分取用 HP LCにて精製し、 1 , 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ (400 g) を得た。

HPLC条件：

カラム： Hibar RT 250-10 LiChrosorb Si60(7 ^m) 、

溶出溶媒： 1 5 % 2 _プロパノール一へキサン、

流速 : 7m l /m i n、

温度：室温、

検出波長： 2 6 5 nm。

(1) 2 , 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

SI

°uiu g g ^ : (H01H) ΧΒΙΠΥ ΛΠ

： mm '(00D2SI '(6)isz '(oi)69z '(LDLU

' I)S9S U)m '(12)86£ '(6t ' + JM)9 ： ( ) ζ ,ιιι s K 01

： S 'SH '6 "i l Ί ΉΙ '6 ΊΖΙ '9 "ill 'Z "Sll Ί "91 '8 ' l "U

'L "9S '9 '99 Ί ·9 '9 · 'Ζ Ί 'Ζ "It 'L Of '9 '9S 'ε '9S '9 '6Ζ 'f '6Ζ 'Ζ '6 ΊΙ 'ί 'δΖ 'S 'ΖΖ Ό Ό '61 'S ί> ： (^£1303) Ν— _ει

' (Η-9 'ΖΗ

8 ·Π=ί 'Ρ ' )LZ '9 '(H-i, 'ZH g *II=f 'Ρ ΉΙ)6 -S '(Η-61 'S ' q 'HI I 'S '(H-61 'ZH 8 "I '8 Ί = ί ' P Ή0161 '(Η-2 Ή-2 'ω 'HZ)6S Έ '(H-6 'in Ή0Ζ8 'Z "(Η-ί' Ή-Ι 'in 'HZ)Z9 -6 '(H-1Z Ή-9Ζ 's 'm)ZZ Ί '(H-IZ 'ZH '9=f 'P ΉΟ S6 Ό '(H-81 's Ή2) Ό 9 ： \dQd) ¾KN-H_T

oino/oodr/iDd 9Z..I9/00 O/W ^-NMR (CDCI3) ： (5 0.5 (3H, s, 18-H), 0.94 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-H), 1.22 (6H, s, 26-H, 27-H), 2.31 (1H, dd, J = 13.3, 6.6 Hz, 4-H), 2.60 (1H, dd, J=13.3, 3.3 Hz, 4-H), 2.82 (1H, m, 9-H), 4.23 (1H, m, 3- H), 4.43 (1H, m, 1-H), 5.01 (1H, s, 19-H), 5.33 (1H, s, 19-H), 6.02 (1H, d， J=ll.2 Hz, 7-H), 6.38 (1H, d, J = ll.2 Hz, 6H) ；

M S / z ( % ) ： 416(M ⁺ , 15), 398(91), 380(93), 365 (18), 362 (24), 287 (9), 285 (16), 251 (27), 152 (36), 134(100) ；

UV Amax(EtOH) ： 264 nm。実施例 2 ： 1 α—ヒドロキシビタミン D 3の微生物変換

パクトソィトン（ディフコ社製） 1.5%、コーンスチープリカー 0.5%、グルコース 1.5%、 N a C 1 0.5%, C a C0₃ 0.2% (pH7.2)からなる培地（BG培地） 10 Om 1を 50 Om 1容三角フラスコに入れ、 120 、 20分間加圧滅菌した。これにアミコラ一夕 ·ォゥトトロヒカ ATTC 33797 (Amycolata autotrophica ATTC 33797) を一白金耳接種し 28 °C、 2 20 r pmで 48時間振盪し好気培養した。

また、部分メチル化 /3—シクロデキストリン（メルシャン社製）を 1 %添加した BG培地 5 Om 1を 25 Om 1容三角フラスコに入れ、 12 1°C、 2 0分間加熱殺菌を行なった。

この BG培地に、先に培養した培養液 lm 1を無菌的に移し、 28で、 2 20 r pmで 48時間培養した。この培養液に 0.5m 1のエタノールに溶解した 1 α—ヒドロキシビタミン D₃ ( 1 5mg) を添加し、 33時間酵素反応を行なった。

反応終了後、培養液と等量のメタノールを添加混合し、 3000 r pm、 10 分間の遠心分離（島津製作所製、 CST 060 LF型）を行ない、上清を回収した。回収した上清をダイアイオン HP 20 S S (三菱化成社製）を充填したカラム（内径 1 cmx長さ 15 cm) に流速 0.5m 1 Zm i nで通液し、 50〜 100 %メタノール濃度勾配溶出でピーク画分を得た。このピーク画分を濃縮乾固し、 2—プロパノール： n—へキサン（1 : 9) の混合溶媒 3 mlに溶解し、 — 20 で 2時間放置し、生じた不溶成分を遠心分離によつて除去した。この上清液を減圧濃縮し、生成物（20.5mg) を得た。 HPL Cにより各ピーク画分を集め、これを 40で以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固した。それぞれのピーク画分について、セミ分取用 HPLCによる精製（条件は下記の通り。）及び分析を行ない、 1 α， 24—ジヒドロキシビタミン D ₃ ( 808 /X g) 、 1 , 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ (5.41mg) 、 1 , 26—ジヒドロキシビタミン D ₃ (53 1 i g) を得た。

HPLC条件：

カラム： Hibar RT 250—10 LiChrosorb Si60(7 ^m) 、

溶出溶媒： 1 5% 2—プロパノール—へキサン、

流速 : 7ml /m i n、

温度：室温、

検出波長： 265 nm。

スペクトルデータ： 1 α， 26—ジヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

¹H— NMR (CDClg) ： δ 0.5 (3H, s, 18-H), 0.92 and 0.93 (each 3H, d, J=6.6 Hz, 21-H, 27-H), 2.31 (1H, dd， J=13.3, 6.6 Hz, 4— H)， 2.60 (1H, dd, J = 13.3, 3.2 Hz, 4-H), 2.82 (1H, m, 9 - H), 3.42 (1H, dd， J = 10.5, 6.5 Hz, 26-H), 3.52 (1H, dd, J = 10.5, 5.6 Hz, 26-H), 4.23 (1H, m, 3-H), 4. 3 (1H, m, 1-H), 5.01 and 5.33 (each 1H, s, 19-H), 6.01 (1H, d, J=ll.3 Hz, 7-H), 6.38 (1H, d, J=ll.3 Hz, 6-H) ；

MS mZz (%) : 416(M+, 38), 398(58), 380(48), 365 (5), 287(9), 251 (16), 152(50), 134(100) ；

UV 久 max (EtOH) : 264 nm。実施例 3 ： 19—フルォロビタミン D 3の微生物変換

基質として 19一フルォロビタミン D₃ (4.90mg) を用いた以外は実施例 2と同様に行ない、生成物（1.7mg) を得た。以下の条件でセミ分取用 HPLCにて精製し、 19—フルオロー 24—ヒドロキシビタミン D₃ ( 1 4 ti g) 、 1 9—フルオロー 2 5—ヒドロキシビタミン D₃ ( 2 0 6 g) 及び 1 9—フルオロー 26—ヒドロキシビタミン D₃ (2 8 fi g) を得た。 HPLC条件：

カラム： Hibar RT 250- 10 LiChrosorb Si60(7 ^m) 、

溶出溶媒： 8 % 2—プロパノール—へキサン、

流速 : 5m l / i n、

温度：室温、

検出波長： 26 5 nm。

スぺクトルデータ：

(1) 1 9—フルオロー 24—ヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

!H-NMR (CDC1₃) ： (5 0.55 (3H. s, 18-H), 0.90-0.95 (m, 21-H, 26- H, 27-H), 2.57 (2H, m), 2.80 (1H, m, 9— H), 3.33 (1H, m, 24-H), 3.93 (1H, m, 3-H), 5.93 (1H, d, J=ll.2 Hz, 7-H), 6.28(11H, d， J=ll.1 Hz, 6— H), 6.51 (1H, d, J=87.3 Hz, 19-H) ；

M S m/ z ( % ) ： 418(M ⁺ , 28), 400(19), 398(21), 380(21), 362 (6), 289 (15), 271 (19), 269 (16), 251 (17), 154(57), 136 (98), 135 (100) ；

UV Amax (EtOH) ： 261.2nm。

(2) 1 9—フルオロー 2 5—ヒドロキシビタミン D₃

iH— NMR (CDCI3) ： 6 0.5 (3H, s, 18-H), 0.9 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-H), 1.22 (6H, s, 26-H, 27-H), 2.26 (IH, dd, J=13.1, 7.8 Hz), 2.56 (2H, m), 2.79 (IH, m, 9—H), 3.9 (IH, m, 3-H), 5.93 (IH, d, J=ll.1 Hz, 7-H), 6.28 (IH, d, J=ll.1 Hz, 6-H), 6.51 (IH, d, J=87.3 Hz, 19H) ；

¹⁹F— NMR (CDCI3) δ ： -132.5 (d, J=87.3 Hz) ；

MS m/z ( ) : 418(M+， 7), 400(18), 380(13), 362 (6), 289(9), 271 (10), 269 (10), 251 (13), 154(53), 136 (100), 135 (98) ；

UV Amax (EtOH) ： 260.0nm。

(3) 1 9—フルオロー 26—ヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

^-NMR (CDCI3) ： δ 0.54 (3Η, s, 18-H), 0.90-0.9 (6H, m, 21-H, 27-H), 2.80 (IH, m, 9—H), 3.40-3.56 (2H, m, 26-H), 3.9 (IH, m, 3-H), 5.93 (IH, d, J = ll.1 Hz, 7-H), 6.28 (IH, d, J = ll.1 Hz, 6-H), 6.51 (IH, d， J=87.3 Hz, 19H) ；

M S m/ z ( % ) ： 418(M ⁺ , 18), 400(40), 380(16), 362(9), 289 (27), 271 (21), 269 (12), 251 (16), 154(55), 136 (91), 135 (100) ； UV Amax (EtOH) ： 260. Onm。実施例 4 ： 1 9—フルオロー 1 α—ヒドロキシビタミン D 3の微生物変換

基質として 1 9—フルオロー 1 α—ヒドロキシビタミン D₃ (2.44m g) を用いた以外は実施例 2と同様に行ない生成物（2.8mg) を得た。以下の条件でセミ分取用 HP LCにて精製し、 1 9—フルオロー 1 α， 24—ジヒドロキシビタミン D₃ (46 g) 、 1 9—フルォロ一 1 ひ， 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ (9 8 0 fi g) 及び 1 9—フルオロー 1 α， 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃ (5 0 g) を得た。

HPLC条件：

カラム Hibar RT 250- 10 LiChrosorb Si60(7 ^m) 、

溶出溶媒 1 5% 2—プロパノ一ルーへキサン、

流速 6 m 1 Zm i n、

温度全温、

検出波長 26 5 nm。

スぺクトルデータ：

(1) 1 9—フルォロ , 2 4—ジヒドロキシビタミン D 2 (新規化合物）

— NMR (CDCI3) ： δ 0.54 (3H, s, 18— H), 0.917 and 0.927 (each 3H, d, J=6.9 Hz, 26-H, 27-H), 0.935 (3H, d, J=6.7 Hz, 21-H), 2.19 (IH, m), 2.32 (IH, m), 2.68 (IH, m), 2.80 (IH, m, 9-H), 3.32 (IH, m, 2 -H), 4.17(1H, m, 3-H), 5.09 (IH, m, 1-H), 5.90 (IH, d, J=ll.2 Hz, 7-H), 6.46 (IH, d, J=ll.2 Hz, 6-H), 6.50(IH, d， J=86.0 Hz, 19-H) ；

MS m/z (%) : 434(M+, 8), 416(4), 396(9), 378(28), 360(100), 135(40) ；

UV Amax (EtOH) ： 261.6nm。

(2) 19ーフルォロ一 1ひ， 25—ジヒドロキシビタミン D₃

^XH-NMR (CDCI3) ： <5 0.53 (3H, s, 18-H), 0.9 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-H), 1.22 (6H, s, 26-H, 27-H), 2.19(1H, t, J=ll.5 Hz, 4-H), 2.32 (IH, m), 2.68 (IH, m), 2.80 (IH, m, 9-H), 4.17(1H, m, 3-H), 5.09 (IH, m, 1- H)， 5.90 (IH, d, J=ll.1 Hz, 7-H), 6.47 (IH, d, J=ll.1 Hz, 6-H), 6.51 (1H, d, J=86.1 Hz, 19H)；

¹⁹F-NMR (CDC1₃) ： δ -129.8(d, J=86.1 Hz) ；

MS m/z (%) ： 434 (M⁺, 2), 416 (9), 396 (9)， 378(17), 360(100), 305(2), 287 (4), 267(6), 135 (32) ；

UV Amax (EtOH) ： 262· 2nm。

(3) 1 9—フルオロー 1ひ， 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

iH— NMR (CDCI3) ： δ 0.53 (3Η, s, 18-H), 0.92 and 0.93 (each 3H, d, J=6.2 Hz， 21-H, 27-H), 2.19 (1H, m), 2.32 (1H, m), 2.68 (1H, m, 4-H), 2.80 (1H, m, 9-H), 3.40-3.56 (2H, m, 26-H), 4.17 (1H, m, 3-H), 5.09 (1H, m, 1-H), 5.90 (1H, d, J=ll.7 Hz, 7-H), 6. 6 (1H, d, J=ll.7 Hz, 6 - H), 6.51 (1H, d, J=86.0 Hz, 19H)；

MS m/z (%) ： 43 (M⁺, 9)， 416 (8), 396(17), 378(56), 360 (21), 305 (3)， 287(10), 267(12), 135 (100) ；

UV Amax (EtOH) ： 263.2nm。実施例 5 : 4， 4—ジフルォロビタミン D₃の微生物変換

基質として 4， 4ージフルォロビタミン D₃ (4.90m g) を用いた以外は実施例 2と同様に行ない、生成物（3.3mg) を得た。以下の条件でセミ分取用 HP LCにて精製し、 4， 4—ジフルオロー 24—ヒドロキシビタミン D₃ (86 Z g) 、 4， 4—ジフルオロー 25—ヒドロキシビタミン D₃ (8 57 g) 及び 4， 4—ジフルォロ— 26—ヒドロキシビタミン D₃ (137 g) を得た。

HPLC条件：

カラム： Hibar RT 250- 10 LiChrosorb Si60(7 urn) 、

溶出溶媒： Ί % 2—プロパノール一へキサン、

流速 : 5ml /m i n、

温度：室温、

検出波長： 265 nm。

スぺクトルデータ：

(1) 4， 4ージフルオロー 24—ヒドロキシビタミン D, (新規化合物）

^-NMR (CDC1₃) ： δ 0.56 (3H, s, 18-H), 0.92 and 0.93 (each 3H, d, J=6.6 Hz, 26-H, 27-H, overlapped with 21-H), 2.47 (1H, m), 2.90 (1H, m, 9-H), 3.32 (1H, m, 24 - H), 3.98 (1H, m, 3-H), 5.00 (1H, s, 19-H), 5.23 (1H, s， 19-H), 6.09 (1H, d, J=ll.4 Hz, 7-H), 6.94 (1H, d, J=ll.4 Hz, 6-H) ；

M S m/ z ( % ) : 436(M十， 34), 418(6), 398(83), 380(74), 378(48), 307(28), 269(100), 135 (79) ；

UV Amax (EtOH) ： 269.8nm。

2

7

(2) 4， 4ージフルオロー 2 5—ヒドロキシビタミン D₃

¹H— NMR (CDCI3) ： δ 0.55 (3Η. s, 18-H), 0.9 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-H), 1.22 (6H, s, 26, 27-H), 2.21 (1H, m), 2.47 (1H, m), 2.89 (1H, m, 9-H), 3.98 (1H, m, 3-H), 5.00 (1H, d, J = l.4 Hz, 19-H), 5.23 (1H, s, 19- H), 6.09 (1H, d, J=ll.5 Hz, 7-H), 6.94 (1H, d, J=ll.5 Hz, 6-H) ；

^{1 9} F - NMR (CDC1₃) ： (5 - 114.1 (dd, J=234.1 and 11.5 Hz), - 108.0(d, J=234.1 Hz) ；

M S m/ z (%) ： 436(M ⁺ , 61), 418(61), 398(60), 380(100), 378(38), 307 (64), 269 (58), 135 (79) ；

UV Amax (EtOH) ： 269.6 nm。

(3)4， 4—ジフルオロー 26—ヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

!H-NMR (CDClg) ： δ 0.55 (3H, s, 18-H) , 0.92-0.9 (m, 21-H, 27- H)， 2.35 (1H, m), 2.47 (1H, m), 2.89 (1H, m, 9-H), 3.40-3.56 (2H, m, 26 -

H), 3.98 (H, m, 3-H), 5.00 (1H, d, J = l.4 Hz, 19-H), 5.23 (1H, s, 19一 H)， 6.09 (1H, d, J = ll.5 Hz, 7-H), 6.94(1H, d, J=ll.5 Hz, 6-H) ；

M S / z ( %) : 436(M + , 71), 418(10)， 398(44), 378(34), 376(100), 307(48), 269(33), 135 (70) ；

UV Amax (EtOH) ： 270.0nm。実施例 6 ： 4， 4—ジフルオロー 1 α—ヒドロキシビタミン D₃の微生物変換

基質として 4， 4ージフルオロー 1ひーヒドロキシビタミン D₃ (1.76m g) を用いた以外は実施例 2と同様に行ない、生成物（0.9mg) を得た。以下の条件でセミ分取用 HP LCにて精製し、 4, 4ージフルオロー 1 α， 24—ジヒドロキシビタミン D₃ ( 1 15 g) 、 4， 4—ジフルオロー 1 a, 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ ( 6 5 2 g) 及び 4， 4—ジフルォ口一 1 α， 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃ (3 3 X g) を得た。

HPLC条件：

カラム： Hibar RT 250- 10 LiChrosorb Si60(7 um) 、

溶出溶媒： 1 5 % 2—プロパノール一へキサン、 .

流速 : 6m l /m i n、

¾m度：温、

検出波長： 2 6 5 nm。

スぺクトルデータ：

(1) 4， 4ージフルオロー 1 α， 24—ジヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

— NMR (CDC1₃) ： δ 0.56 (3Η, s, 18- H), 0.92 and 0.93 (each 3H, d, J=6.7 Hz, 26-H, 27-H, overlapped with 21-H), 2.90 (1H, m, 9-H), 3.32 (1H, m, 2 -H), 4.26 (1H, m, 3-H), 4.49 (1H, m, 1— H), 5.18(1H, s,

19-H), 5.50 (1H, s, 19-H), 6.07 (1H, d, J = 11.4 Hz, 7-H), 7.06 (1H, d, J = ll.4 Hz, 6-H) ；

M S m/ z (%) ： 452 (M ⁺ , 34). 434(25), 414(41), 396(100),

378(80), 376 (80), 323(29), 305 (33). 285 (46)， 267 (79), 265 (54), 135 (92) ；

UV Amax (EtOH) ： 270.6 nm。 (2) 4, 4—ジフルォロ一 1 α， 25—ジヒドロキシビタミン D

^XH-NMR (CDC1₃) ： δ 0.56 (3Η, s, 18 - H), 0.9 (3H, d, J=6.3 Hz, 21-H), 1.22 (6H, s, 26-H, 27-H), 2.90 (1H, m, 9-H), 4.25 (1H, m, 3-H), 4.49 (1H, m, 1-H), 5.18(1H, s, 19-H), 5.50 (1H, s, 19-H), 6.07 (1H, d, J = ll.5 Hz, 7-H), 7.06 (1H, d, J=ll.4 Hz, 6-H) ；

¹⁹F-NMR (CDCI3) ： δ -116.3(d, J=234.2 Hz), -107.7 (d, J=234.2 Hz) ；

M S m/ z ( ) ： 452 (M ⁺ , 15), 434(45), 416 (22), 396 (65), 378(58), 376 (31), 323 (49), 305 (20), 285 (27), 267(48), 265 (27), 135(100) ；

UV Amax (EtOH) ： 270.6nm。

(3)4, 4—ジフルォロ— l a， 26—ジヒドロキシビタミン D₃ (新規化合物）

'H-NMR (CDCI3) ： δ 0.55 (3H, s, 18-H), 0.92 and 0.93 (each 3H, d=6.8 Hz, 26-H, 27-H, overlapped with 21-H), 2.90 (IH, m, 9 - H), 3.40- 3.56 (2H, m, 26-H), 4.26 (IH, m, 3-H), 4.49 (IH, m, 1-H), 5.18(1H, s, 19-H), 5.50 (IH, s, 19-H), 6.07 (IH, d, J-ll.6 Hz, 7-H), 7.06 (IH, d, J=ll.6 Hz, 6-H) ；

M S m/ z ( ) ： 452 (M ⁺ , 32)， 434(17), 414(21), 396(32), 378(13), 323(55), 305 (18), 285 (25), 267(39), 265 (20), 135 (100) ； UV Amax (EtOH) ： 270.4nm。

Claims

請求の範囲

1 . ビタミン D類の水酸化能を有する微生物、またはその微生物が生産する酵素を含有する溶液中で、ビタミン D類の 2位、 2 4位、 2 5位及びまたは 2 6位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とするヒドロキシビ夕ミン D誘導体（但し、 2 5位のみが水酸基に変換されたビタミン D誘導体は除く。）の製造方法。

2 . ビタミン D類の水酸化能を有する微生物、またはその微生物が生産する酵素を含有する溶液中に、ビタミン D類とシクロデキストリン類とを共存させる請求の範囲 1に記載のヒドロキシビタミン D誘導体の製造方法。

3 . 前記ビタミン D類の水酸化能を有する微生物が、ノカルディア属、ストレプトマイセス属、スフィンゴモナス属またはアミコラ一夕属に属する微生物である請求の範囲 1または 2に記載のヒドロキシビタミン D誘導体の製造方法。

4. ビタミン D類の 2位、または 2位及び 2 5位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とする請求の範囲 1乃至 3のいずれかに記載のヒドロキシビ夕ミン D誘導体の製造方法。

5 . ビタミン D類の 2 4位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とする請求の範囲 1乃至 3のいずれかに記載のヒドロキシビタミン D誘導体の製造方法。

6 . ビタミン D類の 2 6位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とする請求の範囲 1乃至 3のいずれかに記載のヒドロキシビタミン D誘導体の製造方法。

7. 一般式（ I )

(り

(式中、 R R²、 R²⁴、 R ²⁵及び R ²⁶はそれぞれ独立して水素原子またはヒドロキシル基を表わし、 R ⁴及び R ¹⁹はそれぞれ独立して水素原子またはフッ素原子を表わすが、 R²、 R ²⁴及び R ²⁶のうち 1っはヒドロキシル基であり、残りの 2つは水素原子である。）

で示されるビタミン D₃誘導体（ただし、 R¹及び R²⁴がヒドロキシル基を表わし、 R²、 R⁴、 R¹⁹、 R ²⁵及び R ²⁶が水素原子を表わす 1 ひ， 24 - ジヒドロキシビタミン D₃は除く。）。

8. 一般式（ I ) で示されるビタミン D₃誘導体が、

(1) 1 α, 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃、

{1) 2 , 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃、

(3) 1 9—フルォロ一 2 4—ヒドロキシビタミン D ₃、

(4) 1 9—フルォ口一 2 6—ヒドロキシビタミン D₃、

(5) 1 9一フルォロ _ 1 α , 2 4—ジヒドロキシビタミン D ₃，

(6) 1 9—フルォロ一 1 α， 2 6—ジヒドロキシビタミン D ₃,

(7) 4， 4—ジフルオロー 2 4—ヒドロキシビタミン D ₃、 (8) 4， 4ージフルオロー 26—ヒドロキシビタミン D ₃、

(9) 4， 4—ジフルオロー 1 α, 24—ジヒドロキシビタミン D₃、または

(10) 4， 4ージフルォロ— 1 α, 2 6—ジヒドロキシビタミン D₃である請求の範囲 7に記載のビタミン D誘導体。