WO2000061711A1 - Composition de decomposition de proteines - Google Patents

Description

明 細 書 タンパク質分解用組成物 技術分野

本発明は、 タンパク質分解用組成物に関する。 詳細には、 本発明は、 洗剤、 さ らに詳しくは、 難分解性タンパク質性汚れ成分に対する洗浄力に優れた、 家庭内 での使用並びに工業的な使用に有用な洗剤組成物に関する。 さらに、 本発明は、 アレルゲンタンパク質除去ラテックスおよびその製造方法、 さらに詳しくは、 ィ匕 学工業分野、 特に天然ゴムの加工において有用な、 アレルゲンタンパク質の分角军 及び Z又は除去された天然ゴムラテツクスおよびその製造方法に関する。 背景技術

プロテアーゼはタンパク質中のペプチド結合を切断する酵素であり、 種々の動 物、 植物、 微生物より数多くの酵素が見出されている。 その用途は研究用試薬、 医薬の他、 食品の加工、 逆反応を利用した化学合成等といった工業的分野にも及 び、 産業上極めて重要な酵素といえる。

プロテア一ゼはタンパク質中のぺプチド結合を切断する活性を持つことから、 タンパク質性の汚れに対する洗浄力を改善するための商業的洗剤の成分としても 広く用いられている。 洗剤中の成分としてのプロテアーゼとしては、 広い基質特 異性を有すること、 比較的高い耐熱性を示し、 物理的、 化学的に安定であること から、 バチルス （Bacillus) 属細菌由来のプロテアーゼが広く利用されている。 実用に供されているプロテアーゼとしては、 バチルス · リへニフォルミス

(Bacillus licheniformis) 由来のプロテアーゼであるアルカラーゼ （A L C A L A S E ^TM、 ノボ ·ノルデイクスネ: t$¾ 、 好アルカリ性バチルス属細菌由来の プロテアーゼであるエスペラーゼ （E S P E RA S E ^TM、 ノボ 'ノルデイクス 社製） 及びサビナーゼ （ S A V I N A S E ^TM、 ノボ 'ノルディクスネ ±¾) 等が あ 。

タンパク質性の汚れは、 単にタンパク質が衣類繊維や食器等に付着しただけの ものばかりではない。 例えば衣類に付着したタンパク質は、 繊維上で乾燥固化し、 次第に水不溶性となり、 油性汚れや無機汚れを衣類に結びつけるバインダ一の役 目を果たすようになり極めて洗浄の困難な難分解性の汚れを形成する。 また、 食 器においては主に加熱処理で熱変性を受けたタンパク質が食器表面に固着し、 難 分解性の汚れを形成する。

このような難分解性タンパク質性汚れ成分に対しては、 上記したバチルス属細 菌由来プロテアーゼを含有する洗剤糸且成物の洗浄力は十分ではない。 バチルス属 細菌由来プロテアーゼより更に高い耐熱性を示すプロテア一ゼとして、 サーモバ クテロイデス （Thermobacteroides) 属細菌由来プロテアーゼ （特表平 5— 5 0 7 6 1 6号） 、 スタフイロサーマス （Staphylothermus) 属細菌由来プロテア一 ゼ （特表平 5— 5 0 7 6 2 0号） 、 サーモコッカス （Thermococcus) 属細菌由来 プロテアーゼ （特表平 5— 5 0 7 6 2 1号） が知られているが、 これらを洗剤組 成物に使用した例は知られていない。

このように難分解性タンパク質汚れ成分の洗浄に有効な従来技術はなく、 更に 高い洗浄力を示すプロテアーゼ含有洗剤組成物が求められていた。

天然ゴムラテックスは、 ゴムの榭木から採取された樹液を精製、 濃縮して高分 子ェマルジヨンの状態としたものであり、 天然ゴム製品の原料である。 天然ゴム は可塑性、 弾性、 防水性に優れているため、 これを使用、 あるいは配合した製品 は粘着テープや防水シートのような生活用品のみならず、 手術用手袋、 力テーテ ルのような医療用具にもわたっている。

天然ゴムラテックスは c i s — 1， 4 _ポリイソプレンを主成分とするゴム分 の他に脂質、 タンパク質、 無機塩類等の非ゴム成分を含んでいる。 天然ゴム製品 を製造する際には、 必要に応じてラテックスの精製度を調節したり、 あるいは保 存剤等の成分を添カ卩した上で加工に使用されている。

し力 し、 天然ゴムラテックスより加工された製品、 たとえば試験用手袋等を着 用した人の中に蓴麻疹、 呼吸困難、 アナフィラキシー症状といったアレルギー反 応を引き起こす人がいることが問題となっている。 このようなアレルギー反応は ラテックス中に含まれている抗原性物質に起因するが、 該抗原性物質はタンパク 質であることが明らかにされてきている。 ラテックス中に含まれている抗原性タンパク質 （アレルゲンタンパク質） を低 減させる方法として、 タンパク分解酵素、 すなわちプロテアーゼを使用する方法 (特開平 6— 5 6 9 0 2号、 特開平 8 _ 2 5 3 6 0 2号、 特開平 9一 6 7 4 0 8 号） が提案されている。

プロテアーゼは、 その種類に特有の基質特異性を有している。 したがって、 あ るプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列に乏しいタンパク質は、 当該タ ンパク質の作用に対して抵抗性を有し、 容易に低分子化されることはない。 ラテ ッタス中に含有されるアレルゲンタンパク質のァミノ酸配列は明らかになつてい ないため、 これを効果的に分解できるプロテアーゼは明らかではなく、 また、 当 該タンパク質のプロテアーゼ感受性が高まるような条件、 たとえば温度、 p H等 も知られていない。

上記の公報に記載のラテックス中のァレルゲンタンパク質の低減法は、 ラテツ クス、 あるいは成形加硫後の天然ゴムにタンパク分解酵素、 すなわちプロテア一 ゼを作用させ、 これらに含まれているタンパク質を分解、 低分子化した後に洗浄 除去するというものである。 し力 し、 これらの公報ではプロテアーゼを用いた処 理によってラテックス中の総タンパク量が低減することを開示するのみであり、 抗原性を有するアレルゲンタンパク質が実際に分解除去されているかどうかは明 らかにされていなレヽ。 了レルギ一反応は微量の抗原性物質の存在によつても惹起 されること力 ら、 安全な天然ゴム製品を作成するためにァレルゲンタンパク質の 低減に有効な方法が求められている。

発明の目的

本発明は上記従来技術に鑑みて行われたものであり、 本発明の目的は、 従来技 術の欠点を克服し、 難分解性タンパク質性汚れ成分に対して優れた洗浄力を持つ 洗剤組成物及び洗浄液を提供することにある。

さらに、 本発明の目的は、 天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質を、 確実に低減させるための有効な方法および該方法によりァレルゲンタンパク質が 除去された天然ゴムラテックスを提供することにある。 発明の概要

本発明者らは、 ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プ口テアーゼを含有する洗剤 組成物が、 繊維上で乾燥固化して油性汚れや無機汚れと結びついた汚れや、 食器 等に熱変性を受けたタンパク質が固着した汚れ等、 従来の洗剤では除去できなか つた難分解性のタンパク質性の汚れに対する洗浄に有効であることを見出し、 本 発明を完成した。

すなわち、 本発明は、 ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテア一ゼを含むこ とを特徵とする洗剤組成物を提供するものである。

さらに、 本発明者等は、 上記の従来技術の課題を解決するため鋭意検討を重ね た結果、 高温条件下、 天然ゴムラテックスに超耐熱性プロテアーゼを作用させる ことにより、 ラテックス中のァレルゲンタンパク質含量が著しく低減されること を見出し、 本発明を完成させた。

すなわち、 本発明は、 超耐熱性プロテアーゼを作用させる工程を包含すること を特徴とするァレルゲンタンパク質の分解及び/又は除去された天然ゴムラテツ タスの製造方法を提供する。 また、 もう一つ別の態様において、 本発明は、 ァレ ルゲンタンパク質の分角 ¥及び Z又は除去された天然ゴムラテックス、 即ち、 抗原 性、 ァレルゲン性が低減した天然ゴムラテツクスを提供する。

より詳細には、 本発明は、

( i ) 超耐熱性プロテアーゼを含有することを特徴とする、 下記から選択され るタンパク質分解用組成物：

( 1 ) 洗剤、 および

( i i ) ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテアーゼを含む洗剤である上記 ( i ) 記載のタンパク質分解用組成物；

( i i i ) ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテアーゼが界面活性剤に対し て耐性を有する上記 ( i i ) 記載のタンパク質分解用組成物；

( i V ) ピロコッカス属細菌由来超耐 f 性プロテアーゼがピロコッカス · フリ ォサス由来超耐熱性プロテアーゼである上記 ( i i ) 記載のタンパク質分解用組 成物； (v) ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテアーゼが、 80〜95°Cの至適 温度、 pH5. 5〜8の至適 pHを有する上記 (i i) 記載のタンパク質分解用 組成物；

(V i ) 洗剤が固体洗剤または液体洗剤である上記 ( i i ) 記載のタンパク質 分解用組成物；

(V i i ) 界面活性剤を含有する上記 ( i i ) 記載のタンパク質分解用組成 物；

(V i i i ) 難分解性タンパク質の洗浄用である上記 ( i i ) 記載のタンパク 質分解用組成物；

( i x) 食器または繊維製品の高温洗浄用である上記 (i i) 記載のタンパク 質分解用組成物；

( X) ピロコッカス属細菌由来、 あるいはサーモコッカス属細菌由来の超耐熱 性プロテアーゼを含有するアレルゲンタンパク質除去剤である上記 ( i) 記載の タンパク質分解用組成物；

(x i) 界面活性剤を含有するアレルゲンタンパク質除去剤である上記 ( i ) 記載のタンパク質分解用組成物；

( X i i ) セルラーゼ、 ぺクチナーゼ、 アミラーゼ、 リパーゼおよびエステラ ーゼより選択される 1種以上の酵素を含有するアレルゲンタンパク質除去剤であ る上記 (i) 記載のタンパク質分解用組成物；

(X i i i ) 超耐熱性プロテアーゼを作用させる工程を包含することを特徴と するアレルゲンタンパク質の除去された天然ゴムラテックスの製造方法；

(X i V) 界面活性剤の存在下に超耐熱性プロテアーゼを作用させる上記 （X i i i) 記載の天然ゴムラテックスの製造方法；

(X V) 超耐熱 1"生プロテアーゼがピロコッカス属細菌由来、 またはサーモコッ カス属細菌由来の超耐熱性プロテアーゼである上記 （X i i i) 記載の天然ゴム ラテックスの製造方法；

(X V i ) さらに、 セルラーゼ、 ぺクチナーゼ、 アミラーゼ、 リパーゼおよび エステラーゼより選択される 1種以上の酵素を使用する上記 (x i i i) 記載の 天然ゴムラテックスの製造方法； (x v i i ) 上記 （ i) 、 （x) 〜 （x i i) のいずれかに記載のタンパク質 分解用組成物を使用する上記 （X i i i ) 記載の天然ゴムラテックスの製造方 法；

(x V i i i ) 80°C以上の温度で超耐熱性プロテアーゼを作用させる上記 (x i i i) 記載の天然ゴムラテックスの製造方法；ならびに

(X i X) 上記 （X i i i ) 〜 （X V i i i ) のいずれかに記載の方法により 得られる、 アレルゲンタンパク質の除去された天然ゴムラテックス、

を提供するものである。 図面の簡単な説明

図 1 ：プロテアーゼ含有量を変化させた洗剤組成物の洗浄効果を示す。

図 2 ：プロテアーゼ PFUSで処理したラテックスタンパク質の SDS—PA GEの結果を示す図である。

図 3 ：アルカラーゼで処理したラテックスタンパク質の SDS— PAGEの結 果を示す図である。

図 4 ：エスペラーゼで処理したラテックスタンパク質の SDS— PAGEの結 果を示す図である。

図 5 ：プロテアーゼで処理したラテックスタンパク質の阻害 EL I SA法によ る分析の結果を示す図である。 発明の詳細な説明

1. プロテアーゼ

本発明に使用されるプロテアーゼは高い熱安定性を有するものが好ましく、 た とえば超耐熱性プロテアーゼとして知られている酵素が好適である。 本明細書に 記載の超耐熱性プロテアーゼとは、 特に限定するものではないが、 80°C以上の 温度においてその活性を示す酵素を言う。 その起源には特に制限はなく、 細菌、 酵母、 糸状菌由来のプロテア一ゼ等を挙げることができる。 特に好適には、 超好 熱个生古細菌に属するピロコッカス · フリオサス （Pyrococcus furiosus) 、 サー モコッカス 'セラー （Thermococcus celer) 等の生産するプロテアーゼを使用す ることができる。 プロテアーゼはその触 構から大きく 4種のカテゴリーに分 類されるが、 本発明にはキレート剤や酸化によって容易に失活することのないセ リンプロテアーゼに属するプロテアーゼが好ましい。

ピロコッカス属細菌は古細菌に属する超好熱性細菌であり、 高温環境で生育可 能な細菌である。 ピロコッカス属細菌はプロテアーゼを生産することが知られて おり、 これらのプロテアーゼは高温で活性を示す超耐熱性プロテアーゼである。 尚、 本明細書において超耐熱性プロテアーゼとは、 70°C以上の温度においてプ 口テアーゼ活性を示す酵素を指す。

特に限定するものではないが、 本発明に使用できる超耐熱性プロテアーゼとし ては、 例えば洗剤への添加の観点から、 界面活性剤に耐性を示すプロテアーゼが 好ましく、 また、 キレート剤ゃ酸ィ匕によって容易に失活することのないセリンブ 口テアーゼに属するプロテアーゼが好ましい。

このようなプロテアーゼとして、 例えば、 ピロコッカス ·フリオサス

(Pyrococcus furiosus) の生産するプロテアーゼが挙げられ、 W095Z34 645号、 WO 97Z21823号、 WO 98/56926号国際公開公報には 該酵素の性質、 ならびにその製造方法が記載されている。 当該プロテアーゼは 9 0°C以上の高温条件化においても酵素活性を示すとともに、 極めて高い熱安定性 を有している。

たとえば、 WO 97/21823号国際公開公報に記載の、 ピロコッカス ·フ リォサス由来の超耐熱 1"生プロテアーゼであるプロテアーゼ P F U Sは下記に挙げ るような' t生質を有している。

( 1 ) 作用：

カゼイン、 ゼラチンを分 し、 短鎖ポリペプチドを生成する。

スクシニル一 L—ロイシノレ一 L—ロイシノレ一 L—バリノレ一 L—チロシン一 4一 メチルクマリン一 7—アミ ド （S u e— L e u— Le u— Va l— Ty r— MC

A) を加水分解し蛍光物質 （7—アミノー 4—メチルクマリン） を生成する。 スクシニル一 Lーァラニル一 L—ァラニルー L—プロリル一 L—フエ二ルァラ ニン _p—二トロアニリ ド （Su e— A l a— A l a— P r o— Ph e_p— N A) を加水分解し黄色物質 （p—二トロア二リン） を生成する。 (2)

40〜1 10°Cで酵素活性を示し、 その至適温度は 80〜95°Cである。

(3) 至適 p H：

pH5〜l 0の間で酵素活性を示し、 その至適 pHは pH6〜8である。

(4) 熱安定性：

95°C、 8時間の処理後も 90 %以上の酵素活性を保持している。

(5) p H安定性

pH5〜l l、 95°C、 60分間の処理後も 95%以上の活性を保持している。

(6) 分子量

SDS— PAGE上で約 45 kD aの分子量を示す。

また、 プロテアーゼ PFUSは、 種々の有機溶媒、 界面活性剤に対して耐性を 有している。 当該酵素は、 強力な界面活性剤である SDS (終濃度 1%) の存在 下、 95°C、 3時間の処理の後も処理前の約 80%の活性を有しており、 本発明 の方法に使用される酵素として特に適している。

上記のプロテアーゼ PFUSは、 例えば、 該酵素をコードする遺伝子が挿入さ れた組換えプラスミ ドであるプラスミ ド p SNP 1で形質転換された Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1 (FERM B P— 5634 ) を培養して得 ることができる。 また、 上記のプロテアーゼ PFUSは、 該酵素をコードする遺 伝子が揷入された組換えプラスミ ドであるプラスミ ド P SP0124ACで形質 転換された Bacillus subtilis DB 104 p S PO 124 AC (FERM B

P-6294) を培養して得ることができる。

また、 上記の W097/21823号公報にはサーモコッカス ·セラー

(Thermococcus celer) DSM2476が生産する超耐熱性プロテアーゼである プロテアーゼ TCESについても記載されている。 該プロテアーゼの主な性質は 以下のとおりである。

( 1 ) 作用：

カゼイン、 ゼラチンを分解し、 短鎖ポリペプチドを生成する。

スクシニノレ一 L—ロイシノレ一 L—ロイシルー L—バリル一 Lーチロシン一 4 - メチルクマリン一 7—アミ ド （Su e— Le u— L e u— Va l— Ty r— MC A) を加水分解し蛍光物質 （7 _アミノー 4—メチルクマリン） を生成する。 スクシニル一 Lーァラニル一 L—ァラニル一 L一プロリル一 L—フエニルァラ ニン一 p—二トロア二リ ド （Su e— A l a -A 1 a— P r o— Ph e— p— N A) を加水分解し黄色物質 （p—二トロア二リン） を生成する。

(2) 至適温度：

37〜95 °Cで酵素活性を示し、 その至適温度は 70〜80°Cである。

(3) 至適 p H：

pH5. 5〜9の間で酵素活性を示し、 その至適 pHは pH7〜8である。

(4) 熱安定性：

80°C、 3時間の処理後も 90%以上の酵素活性を保持している。

プロテアーゼ TCE S遺伝子が挿入された組換えプラスミ ドであるプラスミ ド p STC 3で形質転換された Bacillus subtilis DB 104/p STC 3 (FE RM BP— 5635) を培養し、 プロテアーゼ T C E Sを取得することができ る。

また、 WO 95/34645号公報には上記のプロテアーゼ P FUSとは異な る、 ピロコッカス ·フリオサス由来のプロテアーゼが記載されている。 該酵素を コードする遺伝子を含有するプラスミ ドはプラスミ ド pTPR 12と命名され、 該プラスミ ドで形質転換された Escherichia coli JM109/pTPR 1 2 (FERM BP— 5103) を培養することにより所望の酵素が得られる。 以 下、 本明細書においてはこのプロテアーゼをプロテアーゼ P FULと呼ぶ。 プロ テアーゼ P FULは高い熱安定 1·生を有するプロテアーゼであり、 95°Cにおいて もプロテアーゼ活性を示す。 また、 該プロテアーゼは SDS等の界面活性剤に対 しても耐性を有している。 プロテアーゼ PFULは、 その遺伝子の塩基配列から の推定によれば、 1398アミノ酸残基からなり、 分子量 15万をこえる高分子 量のプロテアーゼであるが、 プロテアーゼ活性に必須な領域はその N末側に存在 して ヽる。

プロテアーゼ PFUSをコードする遺伝子を保持する微生物、 例えば W〇97 /21 823号公報に記載の Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1 (FE RM B P— 5634) 、 Bacillus subtilis DB 104/pNAP S 1、 或い は WO 98/56926号公報に記載の Bacillus subtilis DB 104/p S P O 124AC (FERM BP—6294) を培養し、 当該酵素を含有する培養 物を得ることができ、 該培養物より得られた菌体、 もしくは培養液上清より公知 の酵素精製法、 例えば塩析法、 イオンクロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフ ィ一等を利用してプロテアーゼ PFUSを精製することが出来る。 また、 精製ェ 程中に試料を熱処理し、 プロテアーゼ PFUS以外のタンパク質を変性、 除去す ることにより、 効率よく精製を行うことができる。

より詳細には、 上記のプロテアーゼは、 当該酵素を生産する微生物より、 公知 の酵素精製方法を使用して精製することができる。 たとえば、 プロテアーゼ PF USは以下に例示する工程によつて取得することができる。

プロテアーゼ P FUSをコードする遺伝子を含有するプラスミ ド p SNP 1を 導入した Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1 (FERM BP— 563 4) を、 10 μ g/m 1のカナマイシンを含む LB培地 （トリプトン 10 gノリ ットル、 酵母エキス 5 gノリットル、 N a C 1 5 gZリットル、 pH7. 2) 中で培養し、 得られた培養液を遠心分離して培養液上清を得る。

培養液上清を透析によつて脱塩した後、 陰イオン交換力ラムクロマトグラフィ 一に供する。 カラムに吸着した酵素は、 たとえば塩ィ匕ナトリウムの直線濃度勾配 により溶出させる。 得られたプロテアーゼ活性画分を 95 °Cで 1時間加熱処理し て夾雑する熱に不安定なタンパク質を変性させ、 さらに 3分の 1量の飽和硫酸ァ ンモニゥム溶液を加えた後に、 生じた不溶物をろ過あるいは遠心分離によって除 去する。 回収されたろ液または上清を疎水クロマトグラフィーに供する。 疎水ク 口マトグラフィ一は、 たとえば硫酸アンモニゥムの存在下でプロテアーゼをカラ ムに吸着させた後、 硫酸アンモニゥム濃度を低下させると同時にァセトニトリル を緩衝液に添カ卩してプロテア一ゼを溶出させることにより実施することができる。 こうしてプロテアーゼ PFUSの精製酵素標品を得ることができる。

上記の酵素精製は、 必要に応じてその操作の順序を入れ替えたり、 上記以外の 精製操作を加える 、 あるいは上記の操作の一部と置き換えて実施してもよい。 さらに培養液から回収された菌体からプロテアーゼ PFUSを精製することもで きる。 この場合には菌体を破壊して得られる無細胞抽出液を出発材料として精製 操作を行えばよレ、。

さらに、 Bacillus subtilis DB 104Zp NAP S 1または Bacillus subtilis DB 104/p S PO 1 24 AC (FERM B P— 6294) を使 用し、 上記同様の操作でプロテアーゼ P F U Sを精製することもできる。

本発明に使用されるプロテアーゼは、 その本来の起源より精製して取得された もの、 あるいは遺伝子工学的に生産された組換え酵素のいずれであつてもよい。 また、 該酵素は、 本発明の方法が実施される高温条件においてその活性を示す限 りにおいて、 遺伝子工学的、 あるいはその他の手法によって、 その本来のァミノ 酸配列に置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加えられたものであってもよい。 さ らに、 本発明に使用されるプロテアーゼは、 公知方法によって上記の酵素に化学 的な修飾を施されたものであってもよい。

また、 複数の超耐熱性プ口テアーゼの遺伝子を遺伝子工学的に繋ぎあわせた遺 伝子がコードするハイブリッドプロテア一ゼも本発明に使用できる。 このような ハイブリッドプロテアーゼとして、 N末端側が Thermococcus celer由来プロテア ーゼ TCESに由来し、 C末端側がプロテアーゼ PFUSに由来するハイブリツ ドプロテアーゼ （以降、 本明細書では TCE S_P FUSと呼ぶ） が W097Z 21823号国際公開公報に記載されている。 上記プロテアーゼ TCES— PF USは 95°Cにおいてカゼイン、 ゼラチン、 スクシニル一 L—口イシルー L一口 イシル一 L—バリル一 Lーチロシン一 4—メチルクマリン一 7_アミ ド （Su e -L e u-Le u-Va 1 -Ty r -MCA) 、 スクシニル一 Lーァラニル一 L

—ァラニル一 L—プロリル—L—フエ二ルァラニン一 p—二トロアユリ ド （Su c -A 1 a -A 1 a -P r o-Ph e -p-NA) を分解する活性を有し、 該酵 素をコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミ ドである p S P T 1で形質 転換されたバチルス ·サブチリス DB 104を培養して得ることができる。 本発明は、 上記のような超耐熱性プロテアーゼを含有することを特徴とする、 洗剤または天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質除去剤であるタンパク 質分解用組成物を提供する。 以下、 本発明の洗剤および天然ゴムラテックス中の アレルゲンタンパク質除去剤について説明する。

尚、 本発明において除去とは、 タンパク質を分解し、 そのタンパク質の特性を 失わせることをも含む。 例えば、 アレルゲンタンパク質を分解し、 その抗原性を 低減させることも本発明で言う除去に含まれる。

2. 洗剤

本発明に使用される超耐熱性プロテアーゼは、 例えばプロテアーゼ PFUSの ように、 洗剤の主要成分である界面活性剤の作用に対して耐性を有しており、 洗 浄中にぉレ、ても十分にその作用を発揮する。

本発明に使用される超耐熱性プロテアーゼは、 目的とする洗浄能力を洗剤組成 物に付与するものであれば精製された酵素であつても良いし、 未精製の酵素であ つても良い。 未精製の酵素としては、 例えば菌体外酵素の場合は酵素生産微生物 の培養上清、 菌体内酵素の場合は細胞粗抽出物、 またはこれらの濃縮物、 乾燥物 等が挙げられる。

1つの実施態様において、 本発明のタンパク質分解用組成物は難分解性タンパ ク質の洗浄用である。 難分解性タンパク質の例として、 衣類に付着し、 繊維上で 乾燥固化し、 次第に水不溶性となり、 油性汚れや無機汚れを衣類に結びつけるバ インダ一の役目を果たすタンパク質、 食器において、 加熱処理で熱変性を受け、 食器表面に固着したタンパク質が挙げられる。

本発明の洗剤組成物において、 超耐熱性プロテアーゼは、 難分解性タンパク質 性汚れ成分に対する洗浄に効果を示す量が含まれていれば良く、 例えば、 洗浄効 果の観点から洗剤組成物中に 0. 00001 % (w/w) 以上、 好ましくは 0.

0001% (w/w) 以上含まれていれば良く、 経済的な観点から 1% (wZ w) 以下、 好ましくは 0. 1% (w/w) 以下含まれていれば良い。

本発明の洗剤糸且成物は、 その洗浄能力が発揮される濃度で使用することができ、 例えば、 洗浄効果の観点から 0. 01% (w/v) 以上、 好ましくは 0. 1% (w/v) 以上であれば良く、 溶解性、 洗浄後のすすぎの観点から 10% (wZ

V) 以下、 好ましくは 1% (w/v) 以下の濃度で使用することができる。

また、 本発明の洗剤組成物は、 該洗剤組成物に含まれる超耐熱性プロテアーゼ の洗浄時における濃度が難分解性タンパク質性汚れ成分に対する洗浄に効果を示 す濃度となるように使用することができ、 例えば、 使用時における超耐熱性プロ テアーゼ濃度が、 洗浄効果の観点から 0. 000000001% (w/v) 以上、 好ましくは 0. 00000018% (w/v) 以上となるように使用すれば良く、 溶解性、 洗浄後のすすぎの観点または経済的な観点から 0. 1% (w/v) 以下、 好ましくは 0. 00018% (w/v) 以下となるように使用すれば良い。

本発明の洗剤組成物の形態には特に限定はないが、 例えば、 粉末、 顆粒、 ぺー ストまたは液体の形態であることが出来る。 液状洗剤は水性あるいは非水性とす ることができる。 水性の液体洗剤糸且成物は、 典型的には 70 %までの水および 0 〜 30 %の有機溶媒を含有するものが挙げられる。 何れの形態においても使用時 の超耐熱性プロテアーゼ濃度が 0. 000000001〜0. 1% (w/ V ) 、 好ましくは 0. 00000018〜0. 00018% (w/ v) となるよう、 各 種の成分の濃度が調製されていれば良レ、。

固体形態の本発明の洗剤組成物に使用されるプロテアーゼは、 喘息様症状等の 呼吸器疾患の原因となることがある酵素の微粉末の発塵を防ぐために、 無粉塵性 顆粒の形態にすることができる。 無粉塵性顆粒は、 例えば特公昭 56—4955 3、 特公昭 58— 26315、 特公昭 63— 38397に記載に従って調製する ことが出来る。 調製された無粉塵性顆粒は、 必要であれば公知の手法によってコ ートすることもできる。

プロテアーゼはタンパク質を分解する酵素であり、 タンパク質であるプロテア ーゼ自身をも分解する。 このことは、 特に液体洗剤の形態においては、 添加した プロテアーゼが保存中に自己分解して活性を失っていくことを意味している。 従 来技術で用いられているプロテアーゼは、 通常の洗剤の保存温度である常温にお いてプロテアーゼ活性を有するため、 洗剤の保存中に自己分解によりプロテア一 ゼの活性が速やかに失われるという欠点を有していた。

一方、 本発明に使用される超耐熱性プロテア一ゼは常温においてはプロテア一 ゼ活性を有さないため、 液体洗剤の形態においても常温保存中にプロテアーゼ活 性が自己分解によつて失われることはなレ、という利点を有する。

このように、 本発明に使用されるプロテアーゼは従来技術では困難であった液 体洗剤での使用にも適しており、 液体洗剤中で安定に存在しうるが、 更に、 例え ば、 特開昭 62— 248486号に開示された方法に従って加工したり、 或いは 公知の酵素安定剤、 例えば、 プロピレングリコール、 糖、 糖アルコール、 乳酸、 ほう酸等、 を添加することによって、 液体洗剤中における安定性を更に高めるこ とができる。

本発明の洗剤組成物は、 ァニオン性、 カチオン性、 非イオン性、 または両性ィ オン性の界面活性剤またはこれらの混合物を含む。 ァニオン性界面活性剤として は特に限定はないが、 例えば直鎖アルキルベンスルホネート （LAS) 、 アルキ ルスルフェート （AS) 、 α—ォレフインスルホネート （AOS) 、 アルコール ェトキシスルホネート （AOESまたは AES) 、 第二アルカンスルホネート (SAS) 、 ct—スルホ脂肪酸メチルエステル、 アルキルまたはアルケニルコノヽ ク酸、 および天然脂肪酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。 洗剤組成物中におけ るこれらのァニオン性界面活性剤の割合は、 通常 0〜 50 %、 好ましくは 1〜 2 0%である。

非イオン性界面活性剤としては特に限定はないが、 例えばアルコールエトキシ レート （AEOまたは AE) 、 カルボキシル化アルコールエトキシレート、 ノ- ルフエノールエトキシレート、 アルキルポリダルコシド、 アルキルジメチルアミ ンォキシド、 エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミ ド、 脂肪酸モノエタノール アミ ド、 およびポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミ ド等が挙げられる。 洗剤組成 物中におけるこれらの非イオン性界面活性剤の割合は、 通常 0〜40%、 好まし くは:！〜 20%である。

本発明の洗剤組成物は、 プロテアーゼに加えて更に 1種以上の他の酵素、 例え ば、 アミラーゼ、 リパーゼ、 クチナ一ゼ、 セルラーゼ、 ォキシダーゼ、 カタラー ゼ等を含むことが出来る。 アミラーゼ、 リパーゼ、 クチナ一ゼを添加することに より、 デンプン質、 脂肪分、 クチン （植物の表面に存在するろう状物質） 力 な る汚れに対する洗浄力が向上する。 また、 セルラーゼを含む洗剤組成物は、 セル ロース繊維内部の汚れを効果的に洗浄することができる。 また、 ォキシダーゼ、 カタラーゼを添加することにより、 漂白効果を高めることが出来る。 尚、 これら の酵素は、 特に限定するものではないが、 使用される温度においてその活性を示 し、 また、 十分な安定性を有するものであることが望ましい。

また、 これらの酵素は、 上述したプロテアーゼの場合と同様に、 無粉塵性顆粒 とすることが出来、 また、 液体洗剤中での失活を抑制するために、 例えば特開昭 62-248486に開示された方法に従って加工することが出来る。

本発明の洗剤組成物は、 洗浄ビルダー、 例えば、 ゼォライト、 二リン酸塩、 三 リン酸塩、 ホスホン酸塩、 クェン酸塩、 二トリ口 トリ酢酸 （NTA) 、 エチレン ジアミンテトラ酢酸 （EDTA) 、 ジエチレントリアミンペンタ酢酸 (DTMP

A) 、 アルキルまたはアルケニルコハク酸、 可溶性ケィ酸塩、 または層状ケィ酸 塩等を含有することが出来る

本発明の洗剤組成物は、 ポリマー、 例えば、 カルボキシメチルセルロース （C MC) 、 ポリビニルピロリ ドン （PVP) 、 ポリエチレングリコール （PEG) 、 ポリビエルアルコール （PVA) 、 ポリカルボキシレート等を含有することが出 来る。

本発明の洗剤組成物は、 漂白剤を含有することが出来る。 この漂白剤は過酸ィ匕 水素源、 例えば過ホウ酸塩または過炭酸塩を含むことが出来、 これらは過酸形成 漂白活性化剤、 例えば、 テトラァセチルエチレンジァミン （TAED) またはノ ナノィルォキシベンゼンスルホネート （NOBS) と組合わせることが出来る。 本発明の洗剤組成物は、 当業者に公知の他の洗剤成分、 例えば、 粘土を含有す る布帛柔軟剤、 起泡増進剤、 起泡抑制剤、 腐蝕防止剤、 汚れ懸濁剤、 汚れ再付着 防止剤、 染料、 殺菌剤、 蛍光増白剤、 または香料等を含有することが出来る。 本発明の洗剤組成物は、 従来の洗剤組成物に比較して高い温度、 例えば 50°C 以上、 好ましくは 70°C以上で使用することが出来る。 高温状態では汚れの中の 成分がより効果的に可溶ィ匕される。 更に、 高温での使用は、 低温では溶解性が低 く、 使用が困難であった界面活性剤の使用を可能とし、 使用目的により適した固 体または液体の洗剤組成物を提供することが出来、 各種の洗浄液としても使用で さる。

また、 高温での洗浄が可能であることから、 例えば食中毒防止の観点から高温 での洗浄が望ましい食器の洗浄等においても優れた効果を示す。

3. 天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質除去剤

本明細書に記載のァレルゲンタンパク質とは、 特に限定するものではなレ、が、 一部のヒトに対してアレルギー反応を引き起こす性質を有するタンパク質をいう。 アレルギー反応は I型〜 I V型の 4種に分類されているが、 本明細書でいうァレ ルゲンタンパク質は特定の型のアレルギー反応を引き起こすものに限定されるも のではない。

下記実施例に示すように、 天然ゴムラテックス由来のアレルゲンタンパク質は、 代表的な産業用プロテアーゼであるバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼ

(サブチリシン型プロテアーゼ） を使用し、 当該酵素が活性を示す範囲の高温条 件 （5 0 °C) で処理された場合には分解されない。 しかしながら、 上記のプロテ ァーゼが使用できないような高温条件下で、 高い耐熱性を有するプロテアーゼを 作用させた場合には、 天然ゴムラテックス由来のアレルゲンタンパク質は分解さ れる。 こうして分解されたアレルゲンタンパク質はラテックスアレルギー患者の 血清との反応性が著しく低下しており、 すなわち、 当該タンパク質はその抗原性 を失っている。

本発明の天然ゴムラテックス中のァレルゲンタンパク質除去剤は、 超耐熱性プ 口テアーゼを含有するものであれば特に限定はなく、 通常の酵素製剤と同様の公 知の方法により、 製剤ィ匕し、 調製することができる。 該添加剤を天然ゴムラテツ タスに添加し、 天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質を分解、 除去する ことができる。

本発明のァレルゲンタンパク質除去剤に含有される超耐熱性プ口テアーゼは、 アレルゲンタンパク質を分解、 もしくは低分子化する作用を有していれば、 精製 した酵素標品であってもよいし、 未精製の酵素であってもよい。 未精製酵素とし ては、 たとえば、 菌体外酵素の場合は酵素生産微生物の培養上清、 菌体内酵素の 場合は細胞粗抽出物、 またはこれらの濃縮物または乾燥物等が挙げられる。 本発 明のァレルゲンタンパク質除去剤は、 上記の精製酵素及び未精製酵素から選択さ れる 2以上の物の混合物を含有してもよい。

さらに、 本発明のアレルゲンタンパク質除去剤は、 より効率よくアレルゲンタ ンパク質を分解及び Z又は除去しうるように、 超耐熱性プロテアーゼ以外の成分 を含有してもよい。 このような成分としては、 特に限定するものではないが、 界 面活性剤やプロテアーゼ以外の高分子分解酵素、 例えばセルラーゼ、 ぺクチナ一 ゼ、 アミラーゼ、 リパーゼおよびエステラーゼ等が挙げられる。 さらに、 当該除 去剤中に含有される酵素を安定ィ匕するための成分や、 当該除去剤および/または ァレルゲンタンパク質除去反応時の混合物の p Hを調整するような成分を含んで いてもよい。

特に限定されるものではないが、 本発明の方法においては、 6 0 °C以上、 好ま しくは 8 0 °C以上、 さらに好ましくは、 9 0 °C〜1 0 0 °Cの温度で天然ゴムラテ ッタスにプロテアーゼを作用させることが好ましい。 また、 プロテアーゼ処理を 行う p Hは、 使用するプロテアーゼが活性を示すことのできる p Hであれば特に 限定はない。

アレルゲンタンパク質含量の低減された、 あるいは該タンパク質に由来する抗 原性の低減された天然ゴム製品は、 下記に例示するような行程によって調製され る。

工程 1 ：プロテアーゼ処理

天然ゴムラテックスにプロテアーゼ、 緩衝液を添加してインキュベートするこ とにより、 天然ゴムラテックスに含まれるタンパク質を分解する。 これによりゴ ム分子に吸着していたタンパク質が低分子に分解され、 可溶化される。

原料となる天然ゴムラテックスには特に制限はない。 また、 プロテアーゼとし ては、 上記の超耐熱性プロテアーゼ、 たとえばプロテアーゼ P F U S、 プロテア ーゼ T C E S、 プロテアーゼ P F U L等を使用することができる。 緩衝液の種類、 使用濃度には特に限定はなく、 ラテックス中の抗原性タンパクが効率よく分解さ れる条件となるように調整すればよい。 緩衝液の p Hにも特に限定はないが、 好 ましくは使用するプロテア一ゼの至適 p H付近に調整される。 インキュベーショ ンの温度は、 天然ゴムラテックス中のタンパク質を効率良く分解するために、 6 0 °C以上、 好ましくは 8 0 °C以上、 さらに好ましくは 9 0 °C〜1 0 0 °Cがよい。 また、 インキュベーションの時間はラテックス中のタンパク質が分解されるのに 十分な時間であればょレ、が、 作業効率の面からは、 例えば 1〜 4 8時間が望まし レ、。

さらに、 界面活性剤を添加することにより、 ラテックス粒子の凝集を防止して プロテアーゼの作用効率を向上させることができる。 界面活性剤としては、 陰ィ オン界面活性剤、 非イオン界面活性剤、 両性界面活性剤を挙げることができ、 使 用するプロテァーゼや反応条件に応じて適当なものを選択すればよレ、。 例えば、 陰イオン界面活性剤としては、 アルキルベンゼンスルホン酸ナトリゥム、 非ィォ ン界面活性剤としては、 ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、 両性界面活性 剤としては、 ァシルアミノ酸塩等が挙げられる。 界面活性剤の使用量は、 プロテ ァーゼがその活性を発揮し、 力つアレルゲンタンパク質が効率よく除去される量 であれば特に限定はないが、 例えば、 天然ゴムラテックスを含む反応液中の終濃 度として 0 . 0 1 %から 1 0 %が好ましい。 この他、 酵素の安定化やその他の目 的で中性塩等を添加してプロテアーゼ処理を行ってもよい。

プロテア一ゼとそれ以外の他の酵素、 例えばセルラーゼ、 へミセルラーゼ、 ぺ クチナーゼ、 アミラーゼ、 リパーゼ、 エステラーゼ等とを組み合わせて天然ゴム ラテックスに作用させることができる。 これらの酵素を併用してラテックス中に 混在するセルロース、 脂質などを同時に分解することにより、 より効率的に抗原 性タンパクを分解させることができる。 上記の酵素としては、 特に限定するもの ではないが、 プロテアーゼを作用させる条件においてその活性を発揮しうるもの を使用することができる。

工程 1で得られた処理ラテッタスは、 そのまま次の行程に使用することができ るが、 処理後の懸濁液を遠心分離して上清を除くことにより、 タンパク質が分解、 除去されたラテックス成分を回収し、 以降の加硫、 成形工程を実施することもで さる。

工程 2 ：加硫

ゴム特有の弾性を与えるために、 天然ゴムラテックスに加硫操作が施される。 当該操作は、 鎖状のゴム分子に架橋構造を導入するためのものである。 加硫工程 は硫黄加硫法、 無硫黄加硫法、 過酸化物加硫法、 放射線加硫法等の公知方法によ り実施される。 加硫条件に特に制限はなく、 通常使用されている条件で行えばよ レ、。 例えば、 約 2 0〜6 0 °Cで、 約 0 . 1〜2 4時間の加硫が例示される。

工程 3 ：成形

加硫後の天然ゴムを所望の形に成形する。 成形方法は特に制限されず、 公知の 方法、 例えば浸漬法、 注型法、 押し出し法等を適用することができる。 工程 4 ：抽出洗浄

抽出洗浄工程により成形体表面が洗浄され、 非ゴム分が洗浄、 除去される。 抽 出洗浄方法に特に制限は無く、 適当な容器中に成形体と抽出液を加え、 必要に応 じて攪拌ざせながら抽出、 洗浄を行うことができる。 この際、 製品は型に付いた ままでも良いし、 離型してあっても良い。

抽出洗浄工程において抽出液にプロテアーゼを加えてィンキュベートすること により、 成形体のゴム分子に吸着していたタンパク質を分解、 可溶化することも できる。 この場合のプロテアーゼ処理の条件としては、 上記の行程 1の項に記載 された条件を使用することができる。 また、 上記のようなプロテアーゼ以外の酵 素を添加してインキュベートを行ってもよい。

プロテアーゼを用いたタンパク質分解処理は、 工程 1、 あるいは工程 4のみで 行ってもよいし、 工程 1、 4の両方で繰返し行ってもよい。

また、 本発明の方法においては、 天然ゴム製品の製造において使用される上記 の工程以外の公知の工程の処理を必要に応じて組み合わせることができる。

天然ゴムラテックスを原料とし、 以上に例示された工程にしたがって製造を行 うことにより、 アレルゲンタンパク質の含量が著しく低減された、 あるいは該タ ンパク質に由来する抗原性の低減された、 極めて安全性の高い天然ゴム製品が提 供される。 参考例

プロテアーゼ P F U S精製酵素標品の調製

超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミド p SNP 1を導入したバチ ルス ·サブチリス DB 1 04、 Bacillus subtilis DB 1 04/p SNP lを、 1 0 μ g/m 1のカナマイシンを含む LB培地 5 m 1を含む試験管 2本に接種し、 3 7 °Cで 7時間振とう培養した。 同様の培地 1 25m lずつを含む 500 m 1容 の三角フラスコ計 6本を準備し、 フラスコ 1本当たり上記培養液を lm 1接種し て 37°Cで 1 7時間振とう培養した。 培養液は遠心分離して、 培養液上清を得た。 培養液上清 75 Om 1は 25mM トリス _HC 1、 pH 8. 0に対して透析 し、 同じ緩衝液で平衡化した E c o n o-P a c k Qカートリッジ （5m l ： バイオラッド社製） に吸着させた。 ついで、 吸着した酵素を 0〜1. 5M Na C 1の直線濃度勾配により溶出させた。 得られた活性画分を 95°Cで 1時間加熱 処理した後、 3分の 1量の飽和硫酸アンモニゥム溶液を加えた。 0. 45 /imフ ィルターユニット （ステリベックス HV： ミリポア社製） を用いてろ過を行った 後、 ろ液を 25%飽和の硫酸アンモニゥムを含む 25 mM トリス _HCし p

H 7. 5で平衡化した POROS PHカラム （4. 6mmX 150mm :ノ ーセプティブネ： t^) に負荷した。 カラムを平衡ィ匕に使用した緩衝液で洗浄した後、 硫酸アンモニゥム濃度を 20%飽和から 0%飽和に低下させると同時にァセトニ トリル濃度を 0%から 20%に増加させる直線濃度勾配溶出を行って酵素を溶出 させ、 プロテアーゼ PFUS精製酵素標品を得た。

プロテアーゼ p F U S精製酵素標品の適量に終濃度 8. 3 %のトリクロ口酢酸 を加えて標品中のタンパク質を沈殿させ、 これを遠心分離によって回収した。 回 収されたタンパク質沈殿物を蒸留水に溶解した後、 1 4量の試料用緩衝液 (5 OmM トリス一 HC 1、 pH7. 5、 5% SDS、 5% 2—メルカプトェ タノール、 0. 005% ブロモフエノールブルー、 50% グリセロール） を 添加し、 100°C、 5分間処理した後に 0. 1%SDS— 10%ポリアクリルァ ミ ドゲルを用いて電気泳動を行った。 泳動終了後、 2. 5%クーマシー ·ブリリ アントブルー R— 250、 25 %ェタノール、 10 %酢酸中で 30分間染色を行 レ、、 続いて 25%メタノール、 7%酢酸中にゲルを移し、 3〜 15時間かけて余 分の色素を除いた。 プロテアーゼ PF US精製酵素標品は単一のバンドを示し、 泳動距離からの推定分子量は約 45 kDaであった。 実施例

次に、 本発明を実施例により更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施 例によって限定されるものではない。 試験例 1

市販洗剤、 ハイゥォッシュ S (株式会社ェヌシーシー製） を用いて、 ピロコッ カス ·フリオサス由来超耐熱性プロテアーゼ PFUSの添加による洗浄力改善の 効果を調べた。

ピロコッカス .フリオサス由来超耐熱性プロテアーゼ PFUSは参考例に示し た方法に従って調製した精製酵素標品を用いた。

ハイゥォッシュ Sは界面活性剤 2% (脂肪酸系 （非イオン） 、 高級アルコール 系 （非イオン） からなる） 、 過炭酸ナトリウム、 有機酸塩、 炭酸塩、 硫酸塩、 酵 素を含む顆粒状の固体洗剤である。

このハイゥォッシュ S顆粒を 3. 6% (w/v) の水懸濁液とし、 95°Cで 2 時間処理することによつて洗剤に含まれている酵素を失活させた後、 ピロコッカ ス ·フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ PFUS (P f uプロテア一ゼ3、 宝酒造社製） 、 または好アルカリ性バチルス属細菌由来プロテアーゼのエスペラ ーゼ （ES PERASE^TM、 ノボ 'ノルデイクス社製） を、 ハイゥォッシュ S 顆粒の重量に対して 0. l°/o (w/w) となるよう添加した。 このようにして得 られた液体洗剤組成物を難分解性タンパク質性汚れ成分に対する洗浄試験に用い た。 対照実験としてプロテアーゼを添カ卩しない液体洗剤組成物での洗浄試験も行 なった。

難分解性タンパク質性汚れ成分としては、 卵と牛乳の混合液を熱変性させたも のを用いた。 溶き卵と牛乳を 1 ： 2の体積比で混合した混合液をガラスプレート に塗布し、 160°Cで 20分間熱処理を加え、 ガラスプレート表面に凝固付着さ せた。

このガラスプレートを洗浄試験に使用した。

洗浄は、 上記した液体洗剤組成物を 20倍に希釈した洗浄液 30 m 1を 50 m 1容量の試験管に分注して 77°Cで保温し、 上記ガラスプレートを該洗浄液に浸 して 10分間静置させることによって行った。 洗浄後、 ガラスプレートを取り出 し、 77 °Cの水中で一度すすいでから 95。Cで乾燥させた。 乾燥したガラスプレ —トを 0. 1 %クーマシーブリリアントブルー R250溶液に浸して染色し、 流水中で十分脱色させた後、 95°Cで乾燥させた。 洗浄効果を表 1に示す。 プロテア一ゼ 洗浄効果

プロテアーゼなし

エスペラーゼ

P FUS 汚れが 90 %以上除去、 ++：汚れが 60 %以上除去、 +：汚れが 3 0%以上除去、 一：汚れがほとんど除去されない プロテアーゼを含まない洗浄液、 またはプロテアーゼとしてエスペラ一ゼを添 加した洗浄液で洗浄した場合にはガラスプレートに付着した汚れは殆ど除去され ていない。 それに対し、 プロテアーゼ PFUSを添加した洗浄液で洗浄した場合 には汚れが顕著に除去された。

試験例 2

次に、 ハイゥォッシュ S顆粒の重量に対するプロテア一ゼ量を◦· 0001% (w/w) 、 0. 001% (w/w) 、 0. 01 % (w/w) 、 0. 1 % (w/ w) と変化させた洗剤組成物の洗浄効果を検討した。

即ち、 実施例 1に準じて、 PFUSまたはエスペラーゼの添加量を、 ハイゥォ ッシュ S顆粒の重量に対して、 0. 0001% (w/w) 、 0. 001% (w/ w) 、 0. 01% (w/w) 、 0. 1% (w/w) と変化させた洗剤組成物を調 製し、 その洗浄効果を調べた。 対照実験として、 プロテアーゼを含まない洗剤組 成物での洗浄も行なった。 洗浄方法は実施例 1と同様であるが、 エスペラーゼを 添加した洗剤組成物については、 エスペラーゼの推奨反応温度である 60°Cでの 洗浄効果も調べた。

洗浄効果は、 ガラスプレートに付着させた難分解性タンパク質性汚れ成分の分 解率を以下のように数値化して評価した。

実施例 1と同様の方法で染色、 脱色、 乾燥させたガラスプレートをスキャナー GT-9500 (エプソン社製） で解析し、 ガラスプレート上の染色像の濃淡を 0〜 2 4 0の階調ィ直で求めた。 ガラスプレート上のタンパク質量は染色像の濃淡 として検出され、 更に、 染色像の濃淡の階調値として数値化されることになる。 被験ガラスプレートについて単位面積当たりの平均階調値を計算し、 以下の式に 従って洗浄率を求めた。 洗浄率 （％) = { (A - B ) /A} X 1 0 0

A：プロテアーゼを含まない洗浄液にて洗浄したガラスプレートの平均階調値 B ： プロテアーゼを添加した各洗浄液にて洗浄したガラスプレートの平均階調 値 このようにして求められた洗浄率は、 プロテアーゼを含まない洗浄液では除去 されな!、汚れの分解率を示すものである。

結果を図 1に示す。

エスペラーゼを添加した洗浄液で洗浄した場合、 検討した何れのプロテアーゼ 濃度、 何れの温度でも洗浄率は低い。 これはプロテアーゼを含まない洗浄液で除 去されなレ、汚れは、 エスペラーゼを添加した洗浄液でも殆ど除去できないことを 示している。 。

一方、 プロテアーゼ P F U Sを含む洗剤液を用いた場合には、 検討した何れの プロテアーゼ濃度においてもエスペラーゼを含む洗浄液の場合より高い洗浄率を 示し、 例えば、 プロテアーゼ量が 0 . 1 % (w/w) の場合には、 プロテアーゼ を含まなレ、洗浄液では除去されなレ、汚れを、 エスペラーゼを添加した洗浄液は殆 ど除去できないのに対し、 P F U Sを添加した洗浄液では 7 5 %以上除去するこ とができた。 このことは、 プロテアーゼ P F U Sを含む洗浄液が、 プロテアーゼ を含まなレ、洗浄液、 あるいはエスペラーゼを含む洗浄液で除去されなレ、難分解性 タンパク質性汚れ成分を分解除去できることを示している。

実施例 1

以上の結果に基づき、 以下に示すように P F U S含有洗剤組成物を調製した _c 市販洗剤ハイゥォッシュ S (株式会社ェヌシ一シー製） の 3. 6% (w/v) 水懸濁液を調製し、 該水懸濁液を 95 °Cで 2時間処理しハイゥォッシュ Sに含ま れている酵素成分を失活させた。

このようにして得られた洗剤溶液に、 ピロコッカス ·フリォサス由来の超耐熱 性プロテアーゼの PFUS (P f uプロテア一ゼ≤、 宝酒造社製） をハイゥォッ シュ S顆粒の重量に対して 0. 1% (w/w) となるよう添カ卩し、 均一に分散さ せ P F U S含有洗剤組成物を調製した。

実際の洗浄にあたっては、 該洗剤組成物を 10〜40倍、 例えば 20倍希釈し て使用することが出来る。

なお、 この洗剤組成物は、 界面活性剤 （脂肪酸系 （非イオン） 、 高級アルコー ル系 （非ィオン） ） を 0 · 072%、 酵素 PFUSを◦. 036 %含む。

以下に、 本発明の洗剤組成物の配合例を示す。

実施例 2

固体洗剤配合例

直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 20 %

ポリオキシ アルキレン アルキルエーテル 10%

過ホウ酸ナトリウム 10%

ケィ酸ナトリウム 5%

酵素 PFUS 0. 1%

実施例 3

(1) プロテアーゼ処理によるラテックス中のアレルゲンタンパク質の分解 ゴム Hevea brasiliensisの木から採取したラテックスを 2倍量の 50% (W/ V) グリセロールおよび 5 mMシスティンを含む 0. 1M重炭酸ナトリウム溶液 と混合し、 この懸濁液を 50000 X gで 2時間遠心してその上清を回収した。 この上清のタンパク質濃度を BCA プロテイン 'アツセィ 'キット （ピアス ' ケミカル社製） を用いて測定したところ、 2. 89mg/m lであった。 この上 清をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を用いてタンパク質濃度 lmgZm 1 とな るように希釈し、 ラテックスタンパク液を得た。 (2) ラテックスタンパクのプロテアーゼ処理

上記ラテックス液 50 1、 25 μ 1 2. 5 μ 1 (それぞれタンパク質量 として 50// g、 25 μ g 1 2. 5 / gに相当） 、 プロテアーゼ PFUS (P f uプロテアーゼ S、 宝酒造社製） 457. 5mUに終濃度 1 5 OmMとなる ようリン酸カリゥム緩衝液 ( pH7. 0) を加えて 100 // 1の反応液を調製 した。 同様にプロテア一ゼ PFUSを加えない 3種の反応液を調製した。 これら の反応液を 95 °Cで 1時間インキュベートした。 50 / し 25/ 1、 12. 5 μ 1のラテックスタンパク液を使用し、 プロテアーゼ PFUS存在下でインキュ ベートして得られた反応液をそれぞれ P— 50、 P—25、 P- 12. 5とし、 プロテアーゼ P FUSを加えずにインキュベートして得られた反応液をそれぞれ PC— 50、 PC_25、 PC- 12. 5として以下の実験に使用した。

また、 上記ラテックス液 50 / 1、 25 /2 1 , 12. 5 μ 1に 102 OmUの ァノレカラーゼまたは 250. 5 mUのエスペラーゼ （ともにノボ .ノノレディス ク ·バイオインダストリ一社製） と、 終濃度 1 50 mMのトリス一塩酸緩衝液 ( PH8. 0) を加えて 100 μ 1の反応液を調製し、 これらの反応液を 50°Cで 1時間インキュベートした。 50μ 1、 25 // I , 12. 5 /i lのラテックスタ ンパク液を使用し、 アルカラーゼ存在下でィンキュベートして得られた反応液を それぞれ A— 50、 A— 25、 A- 1 2. 5、 また、 エスペラーゼ存在下でイン キュベートして得られた反応液をそれぞれ E— 50、 E—25、 E- 1 2. 5と した。 さらに、 プロテアーゼを加えずにトリス一塩酸緩衝液中で 50°Cで 1時間 インキュベートしたラテックスタンパク反応液を調製し、 これをそれぞれ C一 5 0、 C— 25、 C- 12. 5として以下の実験に使用した。

実施例 4 SDS— PAGEによるラテックスタンパク分解の確認 上記の （1) で調製された反応液のそれぞれからその一部を取って 4〜 25% 濃度勾配ゲルを使用した SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ S D S— P AGE) に供した。 泳動後のゲルをクマシ一.ブリリアント .ブルー （CBB) 染色することにより、 各反応液中に含まれるタンパク質を分析した。

図 2、 3、 4にそれぞれプロテアーゼ PFUS、 アルカラーゼ、 エスペラ一ゼ で処理して得られた反応液の SDS— PAGEの結果を示す。 図 2中、 1〜8は それぞれ分子量マーカー、 P_50、 P_25、 P- 12. 5、 PC— 50、 P C一 25、 PC— 1 2. 5および未処理のラテックスタンパク液の泳動されたレ ーンを示す。 また、 図 3中、 1〜8はそれぞれ分子量マーカー、 A— 50、 A- 25、 A— 12. 5、 C— 50、 C— 25、 C— 12. 5および未処理のラテツ クスタンパク液の泳動されたレーンを示す。 さらに、 図 4中、 1〜8はそれぞれ 分子量マ一カー、 E—50、 E—25、 E- 12. 5、 C_50、 C—25、 C -1 2. 5および未処理のラテックスタンパク液の泳動されたレーンを示す。 プロテア一ゼ PFUSで処理された反応液 （P—50、 P_25、 P- 12. 5、 それぞれレーン 2、 3、 4) ではゲル上にタンパク質のバンドはほとんど認 められず、 ラテックス由来のタンパク質は該酵素の作用により効果的に分解され ることが示された。 一方、 アルカラーゼあるいはエスペラーゼを作用させたもの では、 酵素を添加しない場合に比べてタンパク質が低分子化されてはいるものの、 ゲル上に明瞭なバンドが認められた。 これはラテックスタンパク液量を 1 2. 5 μ 1まで減らしたものでも同様であった。

実施例 5 ィムノブロット法によるァレ ゲンタンパク質の角军析

上記の （2) で調製された反応液のそれぞれからその一部を取り、 非還元状態 で 4〜25%濃度勾配ゲルを使用した SDS— PAGEに供した。 得られたゲル に二トロセルロース膜 （アプライド ·バイオシステムズ社製） を密着させ、 10 mM CAPS緩衝液 Z 1 5 %メタノール存在下、 400 m A、 1時間の条件で エレク トロブロッテイングを行い、 ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に 転写した。 この膜を 10倍希釈したラテックスアレルギー患者の血清で処理した 後、 1 0 0 0倍希釈したフォスファターゼ標識抗ヒ ト I g E抗体 （Kirkeggard and Perry Laboratories社製） と反応させ、 B C I P /N B T (Kirkeggard and Perry Laboratories社製） を用いてラテックスアレルギー患者が保有する抗体と 反応性を有するタンパク質の検出を行なった。 その結果、 プロテア一ゼ P F U S で処理した反応液ではァレルギ一患者の血清と反応するタンパク質、 すなわちァ レルゲンタンパク質は検出されなかったが、 アルカラーゼ反応液およびエスペラ ーゼ反応液では検出された。

実施例 6 阻害 E L I S A法による抗原性の解析

( 1 ) で得られた反応液の 5、 5 0、 5 0 0、 5 0 0 0倍希釈液とラテックスァ レルギ一患者の血清とを 4 °Cで 2時間反応させた。 上記の （1 ) で得られたラテ ックスタンパク液を用いて、 あらかじめラテックスタンパク質をコートしておい たマイクロタイタ一プレートにこの希釈された反応液の 5 0倍希釈液を加えて反 応させた後、 1 0 0 0倍希釈したペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト I g E抗体

(Kirkeggard and Perry Laboratories 製) と反 j¾、 せ、 T N B (Kirkeggard and Perry Laboratories社製） を用いて標識抗体の検出を行なった。 こうして得 られた結果より、 （1 ) で得られた反応液中に含まれる成分の、 ラテックス由来 抗原タンパク質と該タンパクに対する抗体の間の結合を阻害する活性を調べた。 その結果を図 5に示す。 図中、 横軸は （1 ) で得られた反応液の希釈率を、 また 縦軸は標識抗体のマイクロプレートへの結合の阻害率、 すなわちラテックス由来 抗原タンパク質と該タンパクに対する抗体との結合の阻害率を示す。 また、 図中 四角 （國） はプロテアーゼ P F U S、 ひし形 （令） はアルカラーゼ、 丸 （秦） は エスペラーゼを使用した反応液での結果を示す。

図 5に示されるように、 プロテア一ゼ P F U Sで処理して得られた反応液が示 す阻害率はアルカラーゼおよびエスペラーゼで処理されたものよりも低い。 すな わち、 プロテア一ゼ P F U Sで処理した反応液中では、 他のプロテアーゼを使用 したものに比較してラテックス由来ァレルゲンタンパク質と当該タンパク質に特 異性を有する抗体との反応を阻害する物質の量が低減されていることが明らかと なった。 このことは、 ラテックス由来アレルゲンタンパク質がプロテアーゼ PF USにより効果的に分解され、 その抗原性が低下していることを示している。

実施例 7 ドットプロット法による抗原性の解析

上記の （2) で調製された反応液のうち、 ラテックスタンパク液 50 μ 1を使 用して調製された Ρ— 50、 PC— 50、 A— 50、 E— 50、 C— 50ならび に未処理のラテックスタンパク液を二トロセルロース膜にブロットし、 ドットブ 口ット膜を作製した。 この膜を 10倍希釈したラテツクスァレルギ一患者の血清 と反応させた後、 1000倍希釈したフォスファタ一ゼ標識抗ヒト I g E抗体と 反応させ、 BC I PZNBTを用いて検出を行なった。 その結果を表 2に示す。 表中、 一はシグナルが認められなかったことを、 +は弱いシグナルが認められた ことを、 + +は中程度のシグナルが認められたことを、 また、 + + +は強いシグ ナルが認められたことをそれぞれ示す。

表 2に示されるように、 プロテアーゼ PF US反応液の抗原性は著しく低かつ たが、 アルカラーゼ反応液およびェスペラ一ゼ反応液の抗原性はプロテアーゼ P FUS反応液のものよりも高いことが示された。

表 2

実施例 8 低アレルゲン天然ゴムの調製

工程 1 ：高アンモニア天然ゴムラテックス （マレーシア産、 固形分濃度 60% 総窒素含量 0. 2 %) 160 g、 固形分濃度 20 %のラウリン酸カリゥム水溶液 10 gを混合したうえ、 0. 5 gのプロテアーゼ PFUSを添加した。 この懸濁 液を 90°C 5時間、 均一に分散させた状態でィンキュベートした。

工程 2 ：工程 1終了後、 反応液を放冷し、 固形分濃度 50%の硫黄分散体 4 g、 固形分濃度 50 %の亜鉛華分散体 2 g、 固形分濃度 50 %のジー n—プチ ルジチォカルバミン酸亜鉛分散体 （加硫促進剤、 総窒素含有量 0. 06%) l g および固形分濃度 50%のフエノール系老化防止剤分散体 （老化防止剤、 総窒素 含量 0%) l gを加え、 50°Cで 1 5時間、 撹拌しながら加熱して加硫されたラ テックスを得た。

工程 3 ：得られた加硫ラテックスをガラス板上でフィルム状に流延し、 室温で

24時間放置して成形体とした。

工程 4 ：得られた成形体を 10リットルの 0. 1 %水酸化ナトリゥム水溶液中、

40 °Cで撹拌しながら 2分間洗浄した。 洗浄後の成形体に 90 C 30分間の後 力 tl硫操作を施し、 98. 2 gの天然ゴムフィルムを得た。

以上の操作により、 アレルゲンタンパク質含量の低下した天然ゴムフィルムが 得られた。 産業上の利用の可能十生

本発明により、 従来技術では洗浄することが出来なかった難分解性のタンパク 性の汚れを分解除去することができる優れた洗剤組成物が提供される。 本発明の 洗剤組成物は、 衣類、 食器等の難分解性のタンパク性の汚れの洗浄に利用され、 優れた洗浄効果を示す。

さらに、 本発明により、 天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質を、 確 実に低減させるための有効な方法および該方法によりアレルゲンタンパク質が除 去された天然ゴムラテックスが提供される。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 超耐熱 I"生プロテアーゼを含有することを特徴とする、 下記から選択される タンパク質分解用組成物：

(1) 洗剤、 および

( 2 ) 天然ゴムラテックス中のアレルゲンタンパク質除去剤。

2. ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プ口テアーゼを含む洗剤である請求項 1 記載のタンパク質分解用組成物。

3. ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテアーゼが界面活性剤に対して耐性 を有する請求項 2記載のタンパク質分解用組成物。

4. ピロコッカス属細菌由来超耐熱 1生プロテアーゼがピロコッカス 'フリオサ ス由来超耐熱性プロテアーゼである請求項 2記載のタンパク質分解用組成物。

5. ピロコッカス属細菌由来超耐熱性プロテア一ゼが、 80〜95°Cの至適温 度、 pH5. 5〜8の至適 pHを有する請求項 2記載のタンパク質分解用組成物。

6. 洗剤が固体洗剤または液体洗剤である請求項 2記載のタンパク質分解用組 成物。

7. 界面活性剤を含有する請求項 2記載のタンパク質分解用組成物。

8. 難分解性タンパク質の洗浄用である請求項 2記載のタンパク質分解用組成 物。

9. 食器または繊維製品の高温洗浄用である請求項 2記載のタンパク質分解用 糸且成物。

10. ピロコッカス属細菌由来、 あるいはサーモコッカス属細菌由来の超耐熱 性プロテァーゼを含有するァレルゲンタンパク質除去剤である請求項 1記載のタ ンパク質分解用組成物。

1 1. 界面活性剤を含有するアレルゲンタンパク質除去剤である請求項 1記載 のタンパク質分解用組成物。

12. セルラ一ゼ、 ぺクチナーゼ、 アミラーゼ、 リパーゼおよびエステラーゼ より選択される 1種以上の酵素を含有するアレルゲンタンパク質除去剤である請 求項 1記載のタンパク質分解用組成物。

1 3 . 超耐熱性プロテアーゼを作用させる工程を包含することを特徴とするァ レルゲンタンパク質の除去された天然ゴムラテックスの製造方法。

1 4 . 界面活性剤の存在下に超耐熱性プロテア一ゼを作用させる請求項 1 3記 載の天然ゴムラテックスの製造方法。

1 5 . 超耐熱性プロテアーゼがピロコッカス属細菌由来、 またはサーモコッカ ス属細菌由来の超耐熱性プロテアーゼである請求項 1 3記載の天然ゴムラテック スの製造方法。

1 6 . さらに、 セルラーゼ、 ぺクチナーゼ、 アミラーゼ、 リパーゼおよびエス テラーゼより選択される 1種以上の酵素を使用する請求項 1 3記載の天然ゴムラ テックスの製造方法。

1 7 . 請求項 1、 1 0〜 1 2のいずれか 1項記载のタンパク質分解用組成物を 使用する請求項 1 3記載の天然ゴムラテツクスの製造方法。

1 8 . 8 0 °C以上の温度で超耐熱性プロテア一ゼを作用させる請求項 1 3記载 の天然ゴムラテックスの製造方法。

1 9 . 請求項 1 3〜1 8のいずれか 1項記載の方法により得られる、 アレルゲ ンタンパク質の除去された天然ゴムラテックス。