WO2000057719A1 - Additifs pour aliments de crustacees ou de poissons et aliments - Google Patents

Additifs pour aliments de crustacees ou de poissons et aliments Download PDF

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crustaceans
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low
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Genichiro Soma
Yukinori Takahashi
Denichi Mizuno
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Taiho Pharmaceutical Company, Ltd.
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    • A61K35/74—Bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a crustacean or fish feed additive and a feed to which the feed additive is added, and in particular, a feed additive having a remarkable effect on immunostimulation and infectious disease prevention, and an appropriate ratio of this feed additive.
  • the present invention relates to feedstuffs added in, and preventive and breeding methods using them.
  • antibiotics and synthetic antibacterials are used as remedies for bacterial diseases, but resistant bacteria against the antibacterial substances have appeared, and sufficient therapeutic effects have not been obtained.
  • public health problems have arisen due to the use of the drug in shellfish and fish, preventive measures that do not rely on chemotherapy are strongly desired.
  • vaccines and remedies have not been developed for crustacean and fish virus diseases, and the disease is still occurring frequently.
  • peptide darican derived from Bifidobacterium thermophilum (Patent No. 2547371), cell walls of Gram-positive bacteria such as Bacillus sp. Ingredients (Tokuhei 3—1 7 3 8 2 6 It is already known to use polysaccharides such as i3-1-1,3-glucan derived from Suehirotake (Japanese Patent Publication No. 6-65649). Also, it has been reported that high molecular weight lipopolysaccharide activates the immune function of fish (Sal at i, F. and R.
  • the low-molecular-weight lipopolysaccharide (hereinafter, abbreviated as low-molecular-weight LPS) used in the present invention is basically composed of the above-mentioned peptide darican derived from a gram-positive bacterium, a cell wall component, and 3-1 and 3-glucan derived from a mushroom. It has a different structure and components, and is composed of a specific lipid lipid A, an oligosaccharide called R-core covalently bonded to the lipid A, and a ⁇ specific polysaccharide. It is a substance composed of three components, and is based on the enhancement of tumor necrosis factor (TNF) production effect for animals.
  • TNF tumor necrosis factor
  • crustaceans and fish are prone to various infectious diseases, some of which can result in death, causing enormous economic damage. This is due to the reduced immune function of these crustaceans or fish due to overcrowding in restricted environments.
  • Various substances have already been used to activate reduced immune functions, but crustaceans do not have the ability to produce antibodies, and lymphocytes, neutrophils, and neutrophils found in vertebrates do not.
  • the ability to produce antibodies is limited in fish, such as the absence of base spheres.Furthermore, antibody production is greatly affected by water temperature because it is a variable temperature animal. Both have significant differences in the defense mechanisms of mammals, such as the inadequate function of such immune functions (Fish Pathology, 30 (2), 141-150, 1995.6). Satisfactory for prevention of crustacean and fish infectious diseases due to the fact that it may not be used in aquaculture sites due to its high toxicity, such as LPS, and its immune function is rather reduced after long-term administration. There was nothing I could do.
  • An object of the present invention is to activate the immune function inherently provided by crustaceans and fish in a very small amount to prevent infectious diseases, and to provide a safe crust free from public health problems such as drug residues.
  • An object of the present invention is to provide a feed additive for growing fishes and fish, a feed to which the feed additive is added, and a preventive method and a breeding method using the same. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a low-molecular-weight lipopolysaccharide obtained from gram-negative microbial cells and having a molecular weight of 5000 ⁇ 2000 as measured by SDS-PAGE using a protein marker and substantially containing no high-molecular-weight lipopolysaccharide.
  • the present invention relates to a feed additive for crustaceans or fishes having an immunostimulatory effect and a preventive effect against infectious diseases, characterized by containing a ride as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a feed additive for crustaceans or fish containing the low-molecular-weight lipopolysaccharide and a carrier acceptable to crustaceans and fish.
  • the present invention also relates to the use of the low-molecular-weight lipopolysaccharide for producing a crustacean or fish feed additive.
  • the present invention also relates to a method for immunostimulating crustaceans or fish and preventing infectious diseases, which comprises administering an effective amount of the low-molecular-weight lipopolysaccharide to crustaceans or fish.
  • the present invention also relates to a crustacean or fish mortality preventive agent comprising the low-molecular-weight lipopolysaccharide as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the low molecular weight lipopolysaccharide and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention relates to a crustacean or fish mortality preventive agent containing a body.
  • the present invention also relates to the use of the low molecular weight lipopolysaccharide for producing a crustacean or fish mortality preventive agent.
  • the present invention also relates to a method for preventing death of crustaceans or fish, comprising feeding an effective amount of the low-molecular-weight lipopolysaccharide to crustaceans or fish.
  • the present invention also relates to a feed additive for crustaceans or fishes, wherein the gram-negative microorganism cells are microorganism cells belonging to the genus Pantoea.
  • the present invention also relates to a feed additive for crustaceans or fish wherein the gram-negative microbial cell is Pantoea agglomerans.
  • the present invention also relates to a crustacean or fish feed to which the above-mentioned feed additive or mortality preventive agent has been added.
  • the present invention also relates to a method for breeding crustaceans or fish, wherein the feed is fed to crustaceans or fish.
  • the present invention relates to a substance purified from gram-negative microbial cells by, for example, the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-189902, and has a low molecular weight LPS of 500,000 ⁇ 200,000.
  • LPS low molecular weight
  • the low-molecular-weight LPS of the present invention has a molecular weight of 500,000 obtained from gram-negative microbial cells, for example, by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-189902.
  • Ability to describe lipopolysaccharide of 0 ⁇ 20000 The feature is that its safety against crustaceans and fish is higher than conventional high molecular weight LPS (molecular weight 1,000,000 to 100,000), and is remarkable. It has an excellent immune activating effect, an infectious disease preventive effect, and a mortality preventive effect.
  • substantially not containing a high molecular weight lipopolysaccharide means not containing a lipopolysaccharide having a molecular weight of 800 or more.
  • examples of the gram-negative microbial cells include microorganisms belonging to the genus Pantoea, Salmonella, Aeromonas, Serratia, Enterobaclos, etc. Gram-negative microbial cells can be mentioned. Preferred microorganisms are those belonging to the genus Pantoea, more preferably Pantoea agglomerans.
  • the low-molecular-weight LPS of the present invention is obtained by culturing a gram-negative microorganism or the like by a conventional method, collecting cells from a culture medium, and then using a known method from the collected cells, for example, a hot phenol method [ ⁇ -Westfar ( ⁇ ) Westphal), Ed., Methods in Carbohydrate Chemistry, Volume 5, Page 83, Academic Press, 1966.5], and more. It can be produced by purification using an anion exchange resin. That is, microbial cells are suspended in distilled water, this suspension is added to a mixture of distilled water and an equal volume of hot phenol, and the mixture is stirred, and then centrifuged to collect an aqueous layer.
  • the layer is dialyzed to remove the phenol, concentrated by ultrafiltration to collect the crude LPS fraction, and this fraction is subjected to conventional anion exchange chromatography (e.g., Mono Q-Sepharose or Is purified using Q-Sepharose) and desalted by a conventional method.
  • conventional anion exchange chromatography e.g., Mono Q-Sepharose or Is purified using Q-Sepharose
  • the purified LPS thus obtained is disclosed in JP-A-4-1187640, JP-A-4-49240, JP-A-4-99948 and JP-A-5-155778. It is substantially equivalent to the disclosed molecular weight of about 5,000 to 6,000 LPS. Further, the obtained purified LPS is subjected to gel filtration in the presence of a surfactant such as sodium deoxycholate to recover only a fraction containing low-molecular-weight LPS and remove mixed high-molecular-weight LPS. As a result, highly purified low molecular weight LPS of the present invention can be obtained.
  • a surfactant such as sodium deoxycholate
  • the crustaceans that are the subject of the present invention include all lobsters including lobsters, such as prawns (Penaeus japonicus), prawns (Penaeus monodon), prawns (Penaeus chinensis), and prawns (Penaeus morguiensis).
  • lobsters such as prawns (Penaeus japonicus), prawns (Penaeus monodon), prawns (Penaeus chinensis), and prawns (Penaeus morguiensis).
  • shrimp, prawn) Shanghai crab, thistle, etc., preferably shrimp, and more preferably kuruma shrimp.
  • Fish includes all fish, such as puri, puffer fish, red sea bream, flounder, eel and rainbow trout.
  • Infectious diseases include acute crustacean viremia, vibrio disease, parasitic diseases such as Bpisty
  • Zoothamnium sp. Mycosis such as Lagenidium sp. And Siropidium sp., Irid virus infection in fish, Rhabdovirus disease, Neuronecrosis, Infectious hematopoietic necrosis, Nodulation disease, Streptococcal disease, Enterococci disease, Vibrio disease, Cold water disease, Pseudomonas disease, Gliding bacterium disease, Hydrobic disease, and all viruses, Infections caused by mycoplasmas, bacteria, fungi and parasites, preferably acute crustacean viremia, streptococcal fish in fish, enterococcal disease, vibriopathy.
  • Irid virus infection in fish Rhabdovirus disease, Neuronecrosis, Infectious hematopoietic necrosis, Nodulation disease, Streptococcal disease, Enterococci disease, Vibrio disease, Cold water disease, Pseudomonas disease, Gliding bacterium disease
  • low molecular weight LPS may be used as it is or by adding known carriers, stabilizers, etc., and further, if necessary, various nutrients such as vitamins, amino acids, and minerals, antioxidants, antibiotics, and antibacterial agents.
  • additives may be added to make a feed additive for crustaceans or fish, and the shape may be adjusted to an appropriate state such as powder, granules, pellets, suspensions, etc. .
  • crustaceans or fish may be fed alone, or may be fed as a mixture with feed. Feeding may be done at all times to prevent disease, or added at the latter half of feeding.
  • the feed of the present invention is not particularly limited, and may be powder feed, solid feed, Any feed can be used, including pellet pellet feed, dry pellet feed, EP (Extruder Pellet) feed, and raw feed.
  • the amount of the low molecular weight LPS to be added to the feed additive or the feed can be selected from a wide range, but is preferably 0.00000001 to 0.001% by weight, particularly preferably the feed additive or the feed.
  • the power is 0.00000 to 0.00005% by weight.
  • the amount of low-molecular-weight LPS to be fed may be determined as appropriate.For example, daily doses of 1 to 100 g, preferably 10 to 20 g per kg of crustaceans and fish, should be administered.
  • the low molecular weight LPS used in the examples is an LPS having a molecular weight of about 50,000
  • the high molecular weight LPS is an LPS having a molecular weight of 8,000 to 50,000.
  • L-one broth medium 100 ml
  • a single colony was isolated and inoculated from a strain of Pantoea agglomerans stored at -80 in a 500-ml 1-volume Sakaguchi flask and shake-cultured overnight at 35.
  • a 3 liter Sakaguchi flask containing 1, 000 ml of L broth medium was inoculated and cultured in the same manner.
  • the obtained crude LPS lyophilized product is dissolved in distilled water, filter-sterilized, buffer is added, and subjected to anion exchange chromatography (Pharmacia, Q-Sepharose Fast Flow), and 1 OmM Tris_HC1
  • the sample solution was passed through the column with a buffer containing (pH 7.5) and 1 OmM NaCl, and the limulus-active fraction was eluted with 200 to 400 mM NaClZl OmM Tris-HCl (H7.5).
  • the eluate was subjected to ultrafiltration under the same conditions as above, desalted and concentrated, and lyophilized to obtain about 30 Omg of purified LPS from about 70 g of wet cells.
  • the obtained purified LPSIOOmg was dissolved at a concentration of 5 mgZml in a solubilization buffer [3% sodium hydroxycholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0.2 M sodium chloride, 5 mM EDTA—2Na and 2 OmM Tris—HCl
  • a solubilization buffer [3% sodium hydroxycholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0.2 M sodium chloride, 5 mM EDTA—2Na and 2 OmM Tris—HCl
  • the purified LPS solution was gently layered on top of a Sephacryl S-200 HR column (Pharmacia), and the elution buffer [0.25% sodium doxycholate] was dissolved in pH8.3.
  • each fraction was mixed, lyophilized, suspended in ethanol, centrifuged to remove ethanol-soluble dexocholic acid, and low-molecular-weight LPS was recovered as an insoluble fraction.
  • the ethanol treatment of the low molecular weight LPS fraction was repeated twice more to remove dexcholate, then resuspended in 70% ethanol, centrifuged to remove the buffer components, and repeated this operation three more times.
  • the low molecular weight LPS was recovered in the insoluble fraction, lyophilized, and purified to obtain about 2 Omg of low molecular weight LPS.
  • the shrimp with an average body weight of 20 g were divided into 5 groups of 20 fish each, and the low molecular weight LPS (molecular weight of about 5,000) of the present invention was weighed 1 kg or 1 Og for the shrimp and 5 Omg for the 2nd shrimp.
  • Omg and conventional high molecular weight LPS LPS derived from E. coli, E. coli 0111, manufactured by DI FC ⁇ , molecular weight of about 8,000 to 50,000
  • 10 mg in section 3 and 4 in section 4 was administered intramuscularly in the third gastrocnemius so as to be 2 Omg.
  • District 5 includes LP S No saline was administered. The survival of the shrimp up to 120 hours after the administration was confirmed, and the mortality was determined. The results are shown in Table 1.
  • the mortality in the 1 Omg and 2 Omg sections of the high molecular weight LPS was 65 and 100%, respectively, whereas the mortality rates in the low molecular weight LPS section were 5 Omg and 10 Omg. Did not show any dead individuals. From this, it is clear that the low-molecular-weight LPS of the present invention is a substance having extremely high safety against shrimp as compared with the conventional high-molecular-weight LPS.
  • Magoi with an average body weight of 85 g was divided into three groups of 40 fishes per group, and 1 kg of low molecular weight LPS 10 Omg / kg and 2 high molecular weight LPS (E. coli 0 1 1 1) , Manufactured by DI FCO) was administered intramuscularly in each case. In the 3rd section, physiological saline without LPS was administered. The survival of Magoi up to 120 hours after the administration was confirmed, and the mortality was determined. The results are shown in Table 2.
  • the prawns with an average body weight of 20 g were divided into 6 groups of 20 fish, and in the sections 1, 2 and 3 of the present invention, the low molecular weight LPS was set to be 20. 400 and 100 ig, and high molecular weight LPS were mixed with the feed so as to obtain 100 g in the fourth section and 100 ⁇ g in the fifth section, and were administered for 7 days. Section 6 was fed LPS-free feed. On days 0, 1, 5, and 7 after administration, blood was collected from the shrimp thoracic sinus using a syringe containing K-199 medium containing L-cysteine as an anticoagulant, and blood cells were obtained by centrifugation. Was.
  • Phagocytosis rate [number of blood cells incorporating beads Z total number of observed blood cells] X 1 0 0
  • the phagocytic index of blood cells in the shrimp to which low-molecular-weight LPS was administered was higher in all of the inventive groups than in the 6 groups, and a significant difference was observed (0 ⁇ 0.01). , 0.05).
  • the phagocytosis index of blood cells in conventional shrimp to which 100 g of high molecular weight LPS was administered did not increase at 1, 5, and 7 days after administration. Also significantly increased (P 0.05). From the above, it is clear that the low-molecular-weight LPS of the present invention is much smaller than the high-molecular-weight LPS and activates the biological defense ability such as the phagocytic activity of shrimp blood cells.
  • the prawns with an average body weight of 20 g were divided into 6 groups of 20 fish, and low-molecular-weight LPS was used as a daily dose per 1 kg of shrimp weights in sections 1, 2, and 3 of the plots of the present invention.
  • 40, 100 / zg, and high molecular weight LPS were mixed with feed at 100 ⁇ g in section 4 and 100 xg in section 5 and administered for 7 days.
  • Section 6 was fed LPS-free feed.
  • blood was collected from the thoracic sinus of the shrimp using a syringe containing KHE medium containing EDTA, and blood cells were obtained by centrifugation.
  • Test results The host defense mechanism of crustaceans is composed of cellular factors and humoral factors, and the latter is deeply involved in the PO activity of blood cells. The presence or absence is also revealed by examining PO activity. Therefore, the P ⁇ activity of the low-molecular-weight LPS section and the high-molecular-weight LPS section of the present invention at 0, 1, 5, and 7 days after the start of administration was examined.
  • the ⁇ activity of blood cells in the shrimp to which the low-molecular-weight LPS was administered was higher in all the inventive groups than in the 6 groups, and a significant difference was observed ( ⁇ ⁇ 0.01). , 0.05).
  • the PO activity of blood cells in the conventional shrimp administered with 100 g of high-molecular-weight LPS did not increase until 7 days after administration, and was significantly higher in the 1000 g group than in the 6 and 5 days after administration. (P ⁇ 0. 05). From the above, it is clear that the low-molecular-weight LPS of the present invention is much smaller than the high-molecular-weight LPS and activates biological defense functions such as PO activity of shrimp blood cells.
  • the prawns with an average body weight of 14 g were divided into 5 groups of 20 fish, and in sections 1, 2 and 3 of the plot of the present invention, low molecular weight LPS was used as a daily dose per kg of shrimp weights of 20 and 40, respectively. , 100 ig, and in the fourth section, high-molecular-weight LPS was mixed with the feed so as to become 1,000 g and administered for 18 days.
  • the amount of peptidoglycan (PG) derived from Bifidobacterium samorphophilum described in Japanese Patent No. 2547371 is 0.2 mgZkg (200 Mg / kg).
  • PRDV penaeid rod-shaped DNA virus
  • the infection was performed by removing the head and chest shells of the three shrimp killed by the disease, homogenizing in 40 ml of sterile seawater, and centrifuging (10,000 Xg, 10 minutes, 4 minutes). ) was added to 20 liters of seawater.
  • LPS was infected by a method of immersing the shrimp 8 days after the start of administration for 2 hours. The death status was observed for 10 days after infection, and the dead shrimp was Inspection by the PCR (Polymerase chain reaction) method confirmed that death was due to PRDV.
  • Test results Cumulative mortality and mortality of prawns after PRDV infection in the low-molecular-weight LPS section, high-molecular-weight LPS section and LPS-free section of the present invention are shown in Tables 5 and 6 [Table 5].
  • the staff with an average body weight of 230 g was divided into 6 groups of 20 fish, and in the first, second and third sections of the present invention, low-molecular-weight LPS was used as a daily dose per kg of the male.
  • g and high molecular weight LPS were mixed into moist pellets at 100 / X g in section 4 and 100 2 g in section 5, and administered for 7 days.
  • Section 6 received moist pellets without LPS.
  • the head kidney was excised from each of the five pre-purities, and blood cells were separated in a plastic dish containing 0.25% NaCl-added RPM1-1640-HAH medium Then, the mixture was passed through a cell strainer to obtain a cell suspension. This solution was layered on a discontinuous density gradient of percoll, and then centrifuged at 1,600 rpm for 20 minutes (at 4) to obtain a leukocyte layer.
  • the means having an average body weight of 63 g was divided into 5 groups of 30 fish each.
  • low-molecular-weight LPS was used as a daily dose per kg of shrimp weights of 20, 40, and 100, respectively.
  • high molecular weight LPS was mixed with a moist pellet so as to be 1000 g, and administered daily.
  • Five control plots received a moisture pellet without LPS.
  • enterococcus seriolicida a causative agent of enterococci, was intraperitoneally inoculated at 4.0 x 10 6 cells per fish, and the mortality rate was determined for 15 days after inoculation. .
  • Tables 9 and 10 The results are shown in Tables 9 and 10.
  • the immune function of crustaceans and fish is precisely and precisely activated in a very small amount to prevent infectious diseases, to prevent crustaceans and fish from dying, and to improve public health such as drug residues. It is possible to provide feed additives and feed for raising safe crustaceans and fish without any problem.

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Description

明 細 書 甲殻類又は魚類用飼料添加剤及び飼料 技術分野
本発明は、 甲殻類又は魚類の飼料添加剤及び該飼料添加剤を添加した飼料に係 わり、 特に免疫賦活、 感染症予防に著効を示す飼料添加剤と、 この飼料添加剤を 適宜の割合で添加した飼料、 並びにこれらを用いた予防方法及び飼育方法に関す る。 背景技術
近年、 甲殻類や魚類の養殖産業が発展するに伴って、 細菌病並びにウィルス病 が多発し、 甚大な経済的被害をもたらしている。 甲殻類や魚類の疾病については、 クルマエビの急性ウィルス血症、 ビブリオ病、 プリの類結節症、 腸球菌症、 ァュ の冷水病、 シュ一ドモナス病、 マダイ、 カンパチ、 ブリなどのイリ ドウィルス感 染症などの発生が多く、 経済的被害が大きい。
これらの病気のうち細菌性疾病については、 治療薬として抗生物質や合成抗菌 剤が用いられているが、 抗菌性物質に対する耐性菌が出現し、 充分な治療効果が 得られていない。 また、 使用した薬剤の甲殻類、 魚類への残留による公衆衛生上 の問題が生じていることから、 化学療法に依存しない予防対策が強く望まれてい る。 一方、 甲殻類及び魚類のウィルス病については、 ワクチンや治療薬が開発さ れておらず、 病気が依然として多発している状況にある。
甲殻類及び魚類の免疫機能の増強と感染症の予防を目的として、 ビィフィ ドバ クテリウム ·サーモフィラム由来のペプチドダリカン （特許第 2 5 4 7 3 7 1号 公報） 、 バチラス属などグラム陽性菌の細胞壁成分 （特公平 3— 1 7 3 8 2 6号 公報） 、 スェヒロタケ由来の i3— 1 , 3ーグルカン （特公平 6 - 6 5 6 4 9号公 報） などの多糖類を利用することは、 既に知られている。 また、 高分子量リポポ リサッカライドが魚類の免疫機能を活性化することは、 既に報告されている （S al at i, F . and R. Kusuda, 日本水産学会誌、 5 3巻、 2 0 1〜2 0 4ページ、 1 9 8 7年） （Odean, M. J . ら、 I niec t ion and I匪 un i ty、 5 8巻、 4 2 7〜4 3 2ページ、 1 9 9 0年） 。
本発明で使用される低分子量リポポリサッカライ ド （以下、 低分子量 L P Sと 略す） は、 上記のグラム陽性菌由来のペプチドダリカン、 細胞壁成分及びキノコ 由来の 3— 1， 3—グルカンと基本構造及び成分が異なり、 特異な脂質リピド A とそれに共有結合した Rコアと呼ばれるオリゴ糖、 さらに〇特異多糖の 3成分よ りなる物質であり、 腫瘍壊死因子 （T N F ) 産生効果増強に基づく動物用の免疫 機能活性剤として公知であるが、 甲殻類及び魚類の感染症予防作用については全 く知られていなかった。 また、 既報の研究に用いられた高分子量リポポリサッカ ライド （L P S ) は分子量が 1 0 0万〜 1 0 0 0万と、 極めて大きく毒性が強い ために甲殻類及び魚類に長期間投与して、 常時免疫機能を活性化しておくことが 不可能であった。 さらに、 前述の既知の物質は分子量が大きく腸管からの吸収が 悪いために、 多量の経口投与を必要とし、 長期間投与すると免疫機能が低下する ものが多かった。
既に述べた様に、 甲殻類及び魚類には種々の感染症が多発し、 その結果斃死に 至るものもあり、 甚大な経済的被害をもたらしている。 この背景には、 これらの 甲殻類又は魚類が限られた環境で過密に飼育されることによる免疫機能の低下が 挙げられる。 また、 低下した免疫機能を活性化する目的で、 既に種々の物質が用 いられているが、 甲殻類は抗体を産生する能力がなく、 脊椎動物にみられるリン パ球、 好中球、 好塩基球等が認められない等、 また魚類は抗体を産生する能力が 限定されており、 更に変温動物であるために抗体産生が水温に大きく影響され、 このような免疫機能は充分機能していない等、 両者は哺乳動物とは生体防御機構 にかなりの差があること （Fish Pathology, 30 (2) , 141 - 1 50, 1 995. 6) 、 既往の LP Sのように毒性が強いために養殖現場では使用でき ない場合があること、 長期間投与するとむしろ免疫機能が低下するものが多いこ と等により、 甲殻類及び魚類の感染症防止に満足できるものはなかった。
本発明の目的は甲殻類及び魚類が本来的に備えている免疫機能を、 ごく微量で 的確に活性化して感染症を予防し、 薬物残留などの公衆衛生上の問題のない、 安 全な甲殻類及び魚類を育成するための飼料添加剤、 この飼料添加剤を添加した飼 料、 並びにこれらを用いた予防方法及び飼育方法を提供することにある。 発明の開示
本発明はグラム陰性の微生物菌体から得られ、 タンパク質マーカーを用いて S DS -PAGE法で測定した分子量が 5000±2000で、 高分子量リポポリ サッカライ ドを実質的に含まない、 低分子量リポポリサッカライ ドを有効成分と して含有することを特徴とする免疫賦活、 感染症予防効果を有する甲殻類又は魚 類用飼料添加剤に係る。
また本発明は、 上記低分子量リポポリサッカライド及び甲殻類及び魚類に許容 される担体を含有する甲殻類又は魚類用飼料添加剤に係る。
また本発明は、 甲殻類又は魚類用飼料添加剤を製造するための上記低分子量リ ポポリサッカライドの使用に係る。
また本発明は、 上記低分子量リポポリサッカライドの有効量を甲殻類又は魚類 に投与することを特徴とする甲殻類又は魚類の免疫賦活、 感染症予防方法に係る。 また本発明は、 上記低分子量リポポリサッカライドを有効成分として含有する ことを特徴とする甲殻類又は魚類の斃死予防剤に係る。
また本発明は、 上記低分子量リポポリサッカライド及び薬学的に許容される担 体を含有する甲殻類又は魚類の斃死予防剤に係る。
また本発明は、 甲殻類又は魚類の斃死予防剤を製造するための上記低分子量リ ポポリサッカライ ドの使用に係る。
また本発明は、 上記低分子量リポポリサッカライドの有効量を甲殻類又は魚類 に給餌することを特徴とする甲殻類又は魚類の斃死予防方法に係る。
また本発明は、 グラム陰性の微生物菌体がパン卜エア属に属する微生物菌体で ある甲殻類又は魚類用飼料添加剤に係る。
また本発明は、 グラム陰性の微生物菌体がパントエア · アグロメランスである 甲殻類又は魚類用飼料添加剤に係る。
また本発明は、 上記飼料添加剤又は斃死予防剤を添加したことを特徴とする甲 殻類又は魚類用飼料に係る。
また本発明は上記飼料を甲殻類又は魚類に与えることを特徴とする甲殻類又は 魚類の飼育方法に係る。
本発明は、 グラム陰性の微生物菌体から例えば特開平 8— 1 9 8 9 0 2号公報 において開示された方法によって精製した物質で、 分子量が 5 0 0 0 ± 2 0 0 0 の低分子量 L P Sを飼料に添加して、 甲殻類及び魚類に投与したところ、 甲殻 類 ·魚類が本来的に備えている免疫機能が活性化され、 ウィルスや細菌による感 染症が防御され、 斃死が予防され、 しかも安全性が非常に高いことを確認して、 本発明を完成した。
本発明の低分子量 L P Sは、 前記したようにグラム陰性の微生物菌体から、 例 えば特開平 8— 1 9 8 9 0 2号公報において開示された方法によって得られた分 子量が 5 0 0 0 ± 2 0 0 0のリポポリサッカライドを言う力 その特徴は従来の 高分子量 L P S (分子量 1 0 0万〜 1 0 0 0万） に比べて甲殻類及び魚類に対す る安全性が高く、 顕著な免疫活性化作用及び感染症予防効果並びに斃死予防効果 を有することにある。 本発明において、 実質的に高分子量リポポリサッカライ ドを含まないとは 8 0 00以上の分子量のものを含まないことを意味する。
本発明において、 グラム陰性の微生物菌体としては例えばパン卜エア属、 サル モネラ属、 ァエロモナス属、 セラチア属、 ェンテロバクロ一属等に属する微生物 菌体、 その他特開平 4一 9948 1号公報に記載のグラム陰性の微生物菌体など を挙げることができる。 好ましい微生物はパン卜エア属に属する微生物であり、 より好ましくはパントエア 'アグロメランス （Pantoea agglomerans) である。 この発明の低分子量 L P Sは、 グラム陰性の微生物等を、 常法により培養し、 培地から菌体を集め、 集めた菌体から公知の方法、 例えば、 熱フエノール法 [ォ 一 ·ウェストファール （〇. Westphal) 編、 メソッズ ·イン 'カーボハイドレ ート 'ケミストリー（Methods in Carbohydrate Chemistry) 、 第 5巻、 第 8 3ページ、 アカデミック 'プレス（Academic Press)、 1 96 5年] 、 により抽 出し、 さらに、 陰イオン交換樹脂により精製して製造できる。 すなわち、 微生物 の菌体を蒸留水に懸濁し、 この懸濁液を蒸留水および等容量の熱フエノールの混 合液に添加して撹拌し、 次いで遠心分離して水層を回収し、 この水層を透析して フエノールを除去し、 限外瀘過法により濃縮して粗 L P S画分を採取し、 この画 分を常法の陰イオン交換クロマトグラフィー （例えば、 モノ Q—セファロ一スま たは Q—セファロースを使用する） により精製し、 常法により脱塩する。
このようにして得られた精製 L P Sは特開平 4一 1 8 7 640号公報、 特開平 4 - 49 240号公報、 特開平 4— 9948 1号公報および特開平 5— 1 557 7 8号公報に開示される分子量 5， 000から 6， 00 0程度の L P Sと実質的に 等しい。 さらに、 得られた精製、 L P Sを、 例えばデォキシコール酸ナトリウム 等の界面活性剤の存在下でゲル濾過し、 低分子量 L P Sを含有する画分のみを回 収し、 混在する高分子量 LP Sを除去することによって、 高度に精製された本発 明の低分子量 L P Sを得ることができる。 この界面活性剤存在下でのゲル瀘過の 工程は、 特開平 4 1 87640号公報、 特開平 4 49240号公報および特 開平 5— 1 55778号公報に開示される分子量 5, 000から 6， 000程度の LP Sを更に高度に精製するためのものであり、 この工程により混在する高分子 量 L P Sが完全に排除されるのである。
本発明の対象となる甲殻類とは、 クルマエビ （Penaeus japonicus) 、 ゥシェ ビ (Penaeus monodon) 、 コゥライェビ (Penaeus chinensis) 、 ノ ナナェビ (Penaeus morguiensis) 等のクルマエビ類を含む全てのェビ類 （lobster, shrimp, prawn を含む） 、 上海ガニ、 ガザミ等の全ての力二類を含み、 好ましく はェビ類であり、 更に好ましくはクルマエビ類である。 魚類とは、 プリ、 フグ、 マダイ、 ヒラメ、 ゥナギ、 ニジマス等の、 全ての魚類を含む。 感染症とは甲殻類 の急性ウィルス血症、 ビブリオ病、 Bpistylis sp. , Zoothamnium sp. 等の寄 生症、 あるいは Lagenidium sp. , S iropidium sp. 等の真菌症、 魚類のイリ ド ウィルス感染症、 ラブドウィルス病、 神経壊死症、 伝染性造血器壊死症、 類結節 症、 連鎖球菌症、 腸球菌症、 ビブリオ病、 冷水病、 シユードモナス病、 滑走細菌 症、 水力ビ病のほか、 全てのウィルス、 マイコプラズマ、 細菌、 真菌及び寄生虫 に起因する感染症を言い、 好ましくは、 甲殻類の急性ウィルス血症、 魚類の連鎖 球菌症、 腸球菌症、 ビブリオ症である。
本発明においては、 低分子量 LP Sを、 そのまま、 あるいは公知の担体、 安定 剤等を加えて、 更に必要に応じてビタミン、 アミノ酸類、 ミネラル等の各種養分、 抗酸化剤、 抗生物質、 抗菌剤及びその他の添加剤等を加えて、 甲殻類又は魚類用 の飼料添加剤となしてもよく、 その形状としては、 粉体、 顆粒、 ペレット、 懸濁 液等の適宜の状態に調製すればよい。 本発明の飼料添加剤を給餌する場合は、 甲 殻類又は魚類に対し、 単独で給餌しても良いし、 飼料に混合して給餌しても良い。 給餌時期は、 疾患予防のために常時給餌しても、 また飼養後半に添加してもよい。 また、 本発明の飼料は特に限定されるものではなく、 粉末飼料、 固型飼料、 モ イス卜ペレツ卜飼料、 ドライペレット飼料、 EP (Extruder Pellet) 飼料、 生餌など、 どのような飼料でもよい。
本発明において低分子量 L P Sの飼料添加剤又は飼料等への配合量は広い範囲 から選択できるが、 好ましくは飼料添加剤又は飼料に対して 0. 00000 1〜 0. 00 1重量％、 特に好ましくは 0. 00002〜0. 00005重量％である 力^ これに限定されるものではない。 低分子量 L P Sの給餌量は適宜決定すれば 良いが、 例えば甲殻類及び魚類の体重 1 k gあたり 1日量として 1〜 1 00 g、 好ましくは 10〜20 gを投与するのがよいが、 これに限定されるものではな レ^ 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明について説明するが、 これら実施例に何ら限定さ れるものではない。 尚、 実施例に用いられた低分子量 LPSとは分子量約 5， 0 00の LPSであり、 高分子量 L P Sとは分子量 8, 000〜5万の LPSであ る。
参考例 1 (低分子量 L P Sの製造）
トリプトン （ディフコ社製） 1 0 g、 酵母エキス （ディフコ社製） 5 g、 Na CI (和光純薬工業社製、 特級） 1 0 gを蒸留水 1リットルに添加し、 NaOHで pHを 7. 5に調整し、 オートクレープで滅菌し、 別に滅菌したグルコース （和 光純薬工業社製、 特級） を 0. 1 %の割合で添加した培地 （以下 L一肉汁培地と 記載する） 100m 1の入った 500m 1容の坂口フラスコに、 — 80でで保存 されているパントエア 'アグロメランス（Pantoea agglomerans) 保存菌株から 単一コロニーを分離して接種し、 35 で 1夜振とう培養し、 そのまま全量を 1, 000m lの L一肉汁培地の入った 3リットル容の坂口フラスコに接種し、 同様 に培養した。 o さらに、 7リットルの L—肉汁培地の入った 1 0リットル容の卓上型ファーメ ン夕一 （丸菱バイオェンジ社製） に培養した菌体を接種し、 同条件で通気培養し、 のち集菌し、 約 70 gの湿菌体を回収し、 これを凍結保存した。 凍結保存菌体約 + + 70 gを 500m lの蒸留水に懸濁し、 500m 1の 90 %熱フエノールを 添加して 65〜70でで 20分間撹拌し、 冷却し、 1 0, 000 G、 4 :で 20 分間遠心処理し、 水層を回収した。 フエノール層を更に 1回前記と同一の操作を 反復し、 回収した 2回の水層を合し、 1夜透析してフエノールを除去し、 透析内 液を限外瀘過装置 （アドヴアンテック · トーョ一社製、 UK— 200) を用いて 分子量 20万カツトーオフ膜により 2気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮した。 得られた粗 L P S凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、 フィルター滅菌し、 緩衝液を 添加し、 陰イオン交換クロマトグラフィー （フアルマシア社製、 Q—セファロー ス · ファースト · フロー） にかけ、 1 OmMトリス _HC1 (p H 7. 5) および 1 OmMの NaClを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、 200〜 400m MNaClZl OmMトリス— HC1 ( H 7. 5) でリムラス活性画分を溶出させ た。 この溶出液を前記と同一条件で限外濾過して脱塩および濃縮し、 凍結乾燥し、 約 70 gの湿菌体から約 30 Omgの精製 L P Sを得た。
得られた精製 L PS I O Omgを 5mgZm lの濃度で可溶化緩衝液 [3 %デ ォキシコール酸ナトリウム （和光純薬社製） 0. 2M塩化ナトリウム、 5mME DTA— 2Naおよび 2 OmM卜リス—塩酸からなり、 pH8. 3] に溶解し、 精製 L P S溶液 2 Om 1をセフアクリル S— 200 HRカラム （フアルマシア社 製） の上部に静かに重層し、 溶出緩衝液 [0. 25 %デォキシコール酸ナ卜リウ ム （和光純薬社製） 、 0. 2M塩化ナトリウム、 5mMEDTAおよび 1 OmM トリス—塩酸からなり、 pH 8. 3] により流速 1 6m 1 Z時で 800m l (5 0時間） 溶出した。
ベリス夕ポンプ P I (フアルマシア社製） を用いて流速を制御しながら、 得ら れた溶出液を、 フラクションコレクタ一 （アドバンテック社製、 S F 2 1 20) により分画し、 最初の 240m l (24フラクション分） を廃棄し、 その後 1 0 m 1ノフラクションで 80フラクションまで分画した。 溶出した各画分について 原液または希釈液でフエノール Z硫酸法 （福井作蔵、 「還元糖の定量法 ·第 2 版」 、 第 50〜52ページ、 学会出版センター、 1 990年） により糖の定量を 行い、 溶出状態を調べた。 得られた溶出状態の結果から、 LP Sの存在が予想さ れる分画 （フラクション 30〜60) のうち、 フラクション 37〜55の各フラ クシヨン 0. 5m lを用いて S D S一 PAGEを行い、 LP Sの分画パターンを 調べた。
その結果、 フラクション 45— 55は低分子量 （分子量約 5, 000) LP S のみが認められ、 フラクション 37 - 44は高分子量および低分子量の両方の L P Sが認められたので、 フラクション 45 _ 55の低分子量 L P S分画を次のと おりさらに精製した。
各画分を混合して凍結乾燥し、 エタノールに懸濁し、 遠心分離によりエタノー ルに可溶なデォキシコール酸を除去し、 低分子量 L P Sを不溶性画分に回収した。 低分子量 L P S画分のエタノール処理をさらに 2回反復し、 デォキシコール酸を 除去し、 次に 70%エタノールに再度懸濁し、 遠心分離で緩衝液成分を除去し、 この操作をさらに 3回反復し、 低分子量 LP Sを不溶性画分に回収し、 凍結乾燥 し、 精製した低分子量 LP Sを約 2 Omg得た。
実施例 1 (甲殻類に対する低分子量 L P Sの安全性）
平均体重 20 gのクルマエビを 20尾ずつの 5群に分け、 本発明の低分子量 L PS (分子量約 5， 000) をェビの体重 1 k gたり 1区には 5 Omg、 2区に は 10 Omgを、 また従来の高分子量 LP S (大腸菌由来 LP S、 E. coli 0 1 1 1, D I FC〇社製、 分子量約 8, 000〜5万） を 3区には 1 0mg、 4 区には 2 Omgとなるように第 3腹節筋肉内に投与した。 5区には LP Sを含ま ない生理食塩水を投与した。 投与後 1 2 0時間までのェビの生死を確認し、 斃死 率を求めた。 結果を表 1に示した。
【表 1】
Figure imgf000012_0001
表 1から明らかなように、 高分子量 L P Sの 1 Omg及び 2 Omg区の斃死率 がそれぞれ 6 5、 1 00 %であったのに対して、 低分子量 L P Sの 5 Omg区及 び 1 0 Omg区は、 いずれも斃死する個体が全くみられなかった。 このことから、 本発明の低分子量 L P Sは従来の高分子量 L P Sに比べて、 ェビに対する安全性 が極めて高い物質であることが明らかである。
実施例 2 (魚類に対する低分子量 L P Sの安全性）
平均体重 8 5 gのマゴィを 40尾ずつ 3群に分け、 マゴィの体重 1 k g当たり、 1区には低分子量 L P S 1 0 Omgを、 2区には高分子量 L P S (E. coli 0 1 1 1 , D I FCO社製） 2 Omgを、 いずれも背部筋肉内に投与した。 3区に は L P Sを含まない生理食塩水を投与した。 投与後 1 20時間までのマゴィの生 死を確認し、 斃死率を求めた。 結果を表 2に示した。
【表 2】
Figure imgf000012_0002
表 2から明らかなように、 高分子量 L P S 2 Omg区の斃死率が 85 %であつ たのに対して、 低分子量 L P S 1 0 Omg区は斃死する個体が全くみられなかつ た。 このことから、 本発明の低分子量 L P Sは従来の高分子量 L P Sに比べて、 魚類に対する安全性が極めて高い物質であることが明らかである。
実施例 3 (甲殻類における血球の貪食能に対する活性化作用）
平均体重 2 0 gのクルマエビを 2 0尾ずつの 6群に分け、 本発明区の 1、 2、 3区には低分子量 L P Sをェビの体重 1 k g当たり 1 日量として、 それぞれ 2 0 . 4 0、 1 0 0 i gを、 また高分子量 L P Sを 4区には 1 0 0 g、 5区には 1 0 0 0 μ gとなるように飼料に混合して 7日間投与した。 6区には L P Sを含まな い飼料を与えた。 投与開始 0、 1、 5、 7日後に、 抗凝固剤としての L システ インを含む K— 1 9 9培地を入れた注射器を用いてェビの胸洞から採血し、 遠心 分離によって血球を得た。 懸濁液 1 1当たり 1 X 1 0 5細胞の血球と 1 X 1 0 8個のラテックスビーズ （直径 1 . 9 8 6 ) を混合し、 2 5でで 3 0分間反 応させたのち、 ダルタールアルデヒドで固定後、 風乾した。 風乾後、 ギムザ液で 染色し、 オイキットを用いてスライドガラス上に固定した。 この標本をェビ 1尾 当たり 5枚作製し、 落射蛍光顕微鏡を用いて標本 1枚当たり 2 0 0個の血球を無 作為に観察し、 血球のラテックスビーズ貪食率、 血球 1細胞当たりのビーズ取り 込み数を調べ、 下式によって貪食指数を求めた。
貪食率 = [ビーズを取り込んだ血球数 Z観察した血球の総数] X 1 0 0
平均取り込み数 =血球に取り込まれたビーズ数/ビーズを取り込んだ血球数 貪食指数 = [ビーズを取り込んだ血球数/"観察した血球の総数] X [血球に取り 込まれたビーズ数 観察した血球の総数] X 1 0 0
試験結果： 甲殻類の生体防御機構は、 細胞性因子と液性因子によって構成されて おり、 前者には異物に対する血球の貪食能が深く関与していることから、 ェビの 生体防御能が活性化しているか否かは、 異物に対する血球の貪食活性を調べるこ とによって明らかになる [高橋幸則ら ：魚病研究 3 0 ( 2 ) 、 1 4 1〜 1 5 0 ( 1 9 9 5 ) ] 。 そこで、 本発明の低分子量 L P S区及び高分子量 L P S区にお ける投与開始 0、 1、 5、 7日後の貪食指数を調べ、 表 3に示した。 【表 3】
Figure imgf000014_0001
※ 1 ： 6区との間に有意差 （Ρぐ 0. 0 5)
※ ： 6区との間に有意差 （Ρ<0. 0 1 )
表 3から明らかなように、 低分子量 L P Sを投与したェビにおける血球の貪食 指数は、 いずれの本発明区ともに 6区に比べて高く、 有意な差が見られた （Ρ< 0. 0 1、 0. 0 5) 。 しかし、 従来の高分子量 L P Sを 1 0 0 g投与したェビ における血球の貪食指数は投与 1、 5、 7日後ともに上昇せず、 l O O O ^ g区 においては投与 5、 7日後に 6区よりも有意に高くなつた （Pぐ 0. 0 5) 。 以 上のことから、 本発明の低分子量 L P Sは高分子量 L P Sよりも極めて微量で、 ェビ血球の貪食活性などの生体防御能を活性化することが明らかである。
実施例 4 (甲殻類における血球のフエノールォキシダーゼに対する活性化作 用）
平均体重 2 0 gのクルマエビを 2 0尾ずつの 6群に分け、 本発明区の 1、 2、 3区には低分子量 L P Sをェビの体重 1 k g当たり 1 日量として、 それぞれ 2 0、 40、 1 00 /z gを、 また高分子量 L P Sを 4区には 1 00 μ g、 5区には 1 0 00 X gとなるように飼料に混合して 7日間投与した。 6区には L P Sを含まな い飼料を与えた。 投与開始 0、 1、 5、 7日後に、 EDTAを含む KHE培地を 入れた注射器を用いてェビの胸洞から採血し、 遠心分離によって血球を得た。 得 られた血球を Ca— Mg Hepes培地に 1 X 106細胞 Zm 1 となるように懸濁し たのち、 凍結融解と超音波によって破壊し、 遠心分離によって得られた上清をメ ンブレンフィルターでろ過した。 この液 900 /i 1 と基質溶液としての L—DO P A溶液 1 00 ^ 1を混合後、 60°C温度下で 60分間反応させ、 分光光度計を 用いて 490 nmにおける吸光度を測定し、 フエノールォキシダ一ゼ （PO) 活 性とした。
試験結果： 甲殻類の生体防御機構は、 細胞性因子と液性因子によって構成されて おり、 後者には血球の PO活性が深く関与していることから、 ェビの生体防御能 が活性化しているか否かは、 PO活性を調べることによつても明らかになる。 そ こで、 本発明の低分子量 LPS区及び高分子量 LP S区における投与開始 0、 1、 5、 7日後の P〇活性を調べ、 表 4に示した。
【表 4】
Figure imgf000015_0001
※ 1 ： 6区との間に有意差 （P<0. 05) ： 6区との間に有意差 （Ρぐ 0. 0 1 )
表 4から明らかなように、 低分子量 L P Sを投与したェビにおける血球の ΡΟ 活性は、 いずれの本発明区ともに 6区に比べて高く、 有意な差がみられた （Ρ< 0. 0 1、 0. 0 5) 。 しかし、 従来の高分子量 L P Sを 1 00 g投与したェビ における血球の PO活性は投与 7日後まで上昇せず、 1 000 g区においては 投与 5、 7日後に 6区よりも有意に高くなつた （P<0. 05) 。 以上のことか ら、 本発明の低分子量 LP Sは高分子量 L P Sよりも極めて微量で、 ェビ血球の PO活性などの生体防御能を活性化することが明らかである。
実施例 5 (クルマエビ急性ウィルス血症に対する予防効果）
平均体重 1 4 gのクルマエビを 2 0尾ずつの 5群に分け、 本発明区の 1、 2、 3区には低分子量 L P Sをェビの体重 1 k g当たり 1 日量として、 それぞれ 20、 40、 1 0 0 i gを、 また 4区には高分子量 L P Sを 1 000 gとなるように 飼料に混合して 1 8日間投与した。 5区には特許第 2 547 3 7 1号公報記載の ビィフイ ドバクテリゥム ·サ一モフィラム由来のペプチドグリカン （PG) を 0. 2mgZk g (200 M g/k g) となるように、 6区には特公平 6 _ 6 564 9号公報記載のスェヒロタケ由来の i3— 1， 3—グルカン （ 1， 3— G) を 50m g/k g (50000 /i g/k g) となるように飼料に混合して 1 8日間投与し た。 7区の対照区には、 L P Sを含まない飼料を与えた。
L P Sを投与開始 8日後に、 クルマエビ急性ウィルス血症の原因ウィルスであ る PRDV (penaeid rod-shaped DNA virus) を用いて感染試験を行った。 感染方法は、 本病によって斃死した 3尾のクルマエビの頭胸部甲皮を剥がしたの ち、 40m 1の滅菌海水中でホモジナイズし、 遠心分離 （ 1 0, 000 X g、 1 0分間、 4で） によって得られた上清 1 Om 1 を 20リットルの海水に加えた。 この中に L P Sを投与開始 8日後のェビを 2時間浸漬する方法によって感染させ た。 感染後 1 0日間の斃死状況を観察し、 斃死したェビについては病理学的及び PCR (Polymerase chain reaction) 法による検査を行って P R D Vによる 斃死であることを確認した。
試験結果：本発明の低分子量 L P S区、 高分子量 L P S区及び L P S無添加区の PRDV感染後におけるクルマエビの累積斃死尾数と斃死率を表 5〜6に示した 【表 5】
Figure imgf000017_0001
※※ 7区との間に有意差 （Pぐ 0. 05) 7区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 1)
PRD Vによる感染後に、 L P S無添加飼料を与えた対照区のェビは 9日以内 に 1 00 %が斃死したのに対し、 本発明区の斃死率は低分子量 L P S 20 /X g区 が 20 %、 40 区が 3 5%、 1 00 区が 40 %といずれも低く、 対照区 との間に有意な差がみられた （Pぐ 0. 0 1) 。 一方、 高分子量 L P Sを 1 00 0 g投与したェビの斃死率は 5 5 %、 P Gを 0. 2 mg投与したェビの斃死率 は 50 %、 1, 3— Gを 5 Omg投与したェビの斃死率は 60 %であり、 低分子 量 LP Sを投与した各区に比べて多数のェビが斃死した。 以上の結果から、 本発 明の低分子量 L P Sはェビのウィルスによる感染を防御し、 その効果は従来の高 分子量し P Sよりもすぐれていることが明らかである。
実施例 6 (魚類の免疫機能に対する活性化作用）
平均体重 2 30 gのプリを 20尾ずつの 6群に分け、 本発明の 1、 2、 3区に は低分子量 L P Sをプリの体重 1 k g当たり 1日量として、 それぞれ 20、 40、 1 00 gを、 また高分子量 L P Sを 4区には 1 0 0 /X g、 5区には 1 0 00 2 gとなるようにモイストペレットに混合して 7日間投与した。 6区には L P Sを 含まないモイストペレットを与えた。 投与開始 0、 1、 5、 7日後に 5尾ずつの プリから頭腎を摘出し、 0. 2 5 %NaCl添加 R PM 1 - 1 640一 HAH培地 を入れたプラスチックシャーレ内で血球細胞を分離し、 細胞ろ過器に通して細胞 懸濁液を得た。 この液を percoll不連続密度勾配上に重層したのち、 1 600 r pm、 20分間 （4で） の遠心分離を行って白血球層を得た。
この層を採取後、 遠心洗浄して 1 0 %FB S (Fetal Bovire Serum) を 含む 0. 2 5 %NaCl添加 RPM 1— 1 640—H培地に懸濁し、 白血球の細胞 数を 1 X 1 06細胞 Zm 1に調整した。 この白血球懸濁液 500 μ 1と、 プリ血 清でォプソニン化しておいた酵母の懸濁液 （1 X 1 08細胞 Zm 1 ) 500 ^ 1 をシリコン処理したガラス試験管に入れ、 1 0分おきに撹拌しながら 2 5 :で 6 0分間インキュべ一卜した。 インキュベート終了後、 プリ 1個体当たり 5枚の塗 抹標本を作製し、 ライ ト染色を施してオイキットで封入した。 さらに、 光学顕微 鏡によって 1標本あたり 200細胞の血球を無作為に観察し、 白血球の酵母貪食 数を調べ、 実施例 3と同様の計算式によって貪食指数を求めた。 結果を表 7〜8 に示した。
【表 7】
Figure imgf000019_0001
※ 1 ： 6区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 5)
※ ： 6区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 1)
【表 8】
Figure imgf000019_0002
※ェ ： 6区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 5) ※？ ： 6区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 1)
表 7〜 8から明らかなように、 低分子量 L P Sを投与したプリにおける白血球 の貪食指数は、 いずれの発明区ともに 6区に比べて高く、 有意な差がみられた
(Pぐ 0. 0 1、 0. 05) 。 しかし、 従来の高分子量 L P Sを 1 00 / g投与し たプリにおける白血球の貪食指数は、 投与 7日後まで上昇せず、 1 000 /i g区 においては投与 5日後以降に 6区よりも有意に高くなつた （Pぐ 0. 01) 。 以 上のことから、 本発明の低分子量 L P Sは高分子量 L P Sよりも極めて微量で、 白血球の貪食作用などの魚類の免疫機能を活性化することが明らかである。
実施例 7 (プリの腸球菌症に対する予防効果）
平均体重 63 gのプリを 30尾ずつの 5群に分け、 本発明の 1、 2、 3区には 低分子量 LPSをェビの体重 1 k g当り 1日量として、 それぞれ 20、 40、 1 00 gを、 また 4区には高分子量 LP Sを 1000 gとなるようにモイス卜 ペレツ卜に混合して、 毎日投与した。 5区の対照区には、 LP Sを含まないモイ ス卜ペレツトを与えた。 投与開始 7日後にプリの腸球菌症の原因菌 Enterococcu s seriolicidaをプリ 1尾当たり 4. 0 x 1 06細胞となるように腹腔内接種し、 接種後 1 5日間の鱉死率を求めた。 結果を表 9〜10に示した。
【表 9】
Figure imgf000020_0001
※ 数字は累積斃死尾数を示す （他も同じ） 【表 1 0】
Figure imgf000021_0001
※※ 5区との間に有意差 （P<0. 0 5)
※※※ 5区との間に有意差 （Pぐ 0. 0 1 )
E. Seriolicidaを接種して 1 5日後に、 L P S無添加飼料を与えた対照区の プリの 7 3. 3 %が斃死したのに対し、 本発明区の斃死率は低分子量 L P S 2 0 ； 区が 1 3. 3 %、 4 0 区が 2 6. 7 %、 1 0 0 区が 23. 3 %といず れも低く、 対照区との間に有意な差が見られた （Pぐ 0. 0 5) 。 一方、 高分子 量 L P Sを 1 0 0 0 g投与したプリの斃死率は 3 6. 7 %であり、 低分子量 L P Sの各区に比べて高い斃死率を示した。 以上の結果から、 本発明の低分子量 L P Sは魚類の細菌による感染を防御し、 その効果は従来の高分子 L P Sよりもす ぐれていることが明らかになった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 甲殻類及び魚類の免疫機能を、 ごく微量で的確に活性化して 感染症を予防し、 また、 甲殻類及び魚類の斃死を予防し、 薬物残留などの公衆衛 生上の問題のない、 安全な甲殻類及び魚類を育成するための飼料添加剤及び飼料 を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. グラム陰性の微生物菌体から得られ、 タンパク質マーカーを用いて S D S— PAGE法で測定した分子量が 5000 ± 2000で、 高分子量リポポリ サッカライドを実質的に含まない、 低分子量リポポリサッカライドを有効成分と して含有することを特徴とする免疫賦活、 感染症予防効果を有する甲殻類又は魚 類用飼料添加剤。
2. 請求の範囲第 1項の低分子量リポポリサッカライ ド及び甲殻類又は魚 類に許容される担体を含有する甲殻類又は魚類用飼料添加剤。
3. 甲殻類又は魚類用飼料添加剤を製造するための請求の範囲第 1項の低 分子量リポポリサッカライドの使用。
4. 請求の範囲第 1項の低分子量リポポリサッカライドの有効量を甲殻類 又は魚類に投与することを特徴とする甲殻類又は魚類の免疫賦活、 感染症予防方 法。
5. 請求の範囲第 1項の低分子量リポポリサッカライドを有効成分として 含有することを特徴とする甲殻類又は魚類の斃死予防剤。
6. 請求の範囲第 1項の低分子量リポポリサッカライド及び薬学的に許容 される担体を含有する甲殻類又は魚類の斃死予防剤。
7. 甲殻類又は魚類の斃死予防剤を製造するための請求の範囲第 1項の低 分子量リポポリサッカライドの使用。
8. 請求の範囲第 1項の低分子量リポポリサッカライドの有効量を甲殻類 又は魚類に投与することを特徴とする甲殻類又は魚類の斃死予防方法。
9. グラム陰性の微生物菌体がパン卜エア属に属する微生物菌体である請 求の範囲第 1項の甲殻類又は魚類用飼料添加剤。
1 0. グラム陰性の微生物菌体がパントエア ·ァグロメランスである請求 の範囲第 9項の甲殻類又は魚類用飼料添加剤。
1 1 . 請求の範囲第 1項の飼料添加剤を添加したことを特徴とする甲殻類 又は魚類用飼料。
1 2 . 請求の範囲第 5項の斃死予防剤を添加したことを特徴とする甲殻類 又はび魚類用飼料。
1 3 . 請求の範囲第 1 1項の飼料を甲殻類又は魚類に与えることを特徴と する甲殻類又は魚類の飼育方法。
1 4 . 請求の範囲第 1 2項の飼料を甲殻類又は魚類に与えることを特徴と する甲殻類又は魚類の飼育方法。
1 5 . 感染症が甲殻類の急性ウィルス血症、 ビブリオ病、 寄生症、 真菌症、 魚類のイリ ドウィルス感染症、 ラブドウィルス病、 神経壊死症、 伝染性造血器壊 死症、 類結節症、 連鎖球菌症、 腸球菌症、 ビブリオ病、 冷水病、 シユードモナス 病、 滑走細菌症、 水力ビ病である請求の範囲第 1項の甲殻類又は魚類用飼料添加 剤。
1 6 . 高分子量リポポリサッカライ ドが 8 0 0 0以上の分子量を有するも のである請求の範囲第 1項の甲殻類又は魚類用飼料添加剤。
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