WO2000020565A1

WO2000020565A1 - Immunogene ameliore pour un vaccin inactive contre une infection a virus de l'encephalite japonaise et procede de production associe

Info

Publication number: WO2000020565A1
Application number: PCT/JP1999/002931
Authority: WO
Inventors: Toyokazu Ishikawa; Hironori Yoshii; Toshiyuki Onishi; Tadashi Imagawa; Masahide Ishibashi
Original assignee: The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2000-04-13
Also published as: CA2311336A1; CA2311336C; AU4057899A; KR20010032699A; CN1618464A; AU743546B2; JP5095685B2; EP1057889A1; CN1287573A; MY126520A; JP4371343B2; EP1057889B1; EP1057889A4; US6841374B1; CN1160454C; JP2009225809A; TWI227274B

Description

明細書日本脳炎ウィルス群感染症に対する不活化ワクチンのための増強免疫原

およびその製造方法技術分野

本発明は、フラビウィルス属の日本脳炎ウィルス群による感染症に対する不活化ワクチンおよび診断剤、特に、その有効成分として優れて有用な増強免疫原あるいは抗原およびその製造方法、並びに不活化日本脳炎ワクチンに関するものである。背景技術

日本脳炎ウィルス群による感染症の代表例として、以下、日本脳炎を挙げ、そのワクチンにっき説明する。最初の日本脳炎ワクチンは、 1 9 54年に実用化された。このワクチンは、マウス脳内で培養したウィルスから調製した抗原を有効成分とし、その精製度は低く、不純物が多いため、アレルギー性の中枢神経障害を锈発する危険性があった。その後、改良され、アルコール沈殿、硫酸プロ夕ミン処理、および超遠心法等の組合せによる高度精製ワクチンが 1 9 6 5年に実用化され、品質が著しく向上した。そして、かかるワクチンおよびその製造技術が踏襲され現在に至っている（ "Vaccine Handbook", pp. 103-113, Researcher' s Associates, National Institute of Health (Japan) , Maruzen (Tokyo) 1996) 。一方、マウス脳を使用しない不活化ワクチンの開発も試行された。即ち、 1 9 6 5年に日本脳炎ヮクチン研究会が結成され、初代細胞培養による組織培養ヮクチンが開発された。しかし、不活化ワクチン抗原の量産に要する膨大な量の初代細胞培養の確保が製造コストの点で実用上不可能であったので、このワクチンは実用化に至らなかった。これは、その当時、ワクチン製造用の認可細胞が初代培養細胞に限定され、継代細胞株の使用が危険視かつ否認されていたためである。組織培養の日本脳炎生ワクチンに関しては、中国で初代ハムスター腎細胞培養で増殖させた弱毒ウィルスを有効成分として用いる生ワクチンが 1 9 9 4年頃に実用化されている。しかし、中国以外の諸外国では、有効性および安全性が未確認であり、その使用は知られていない。更に、 1 9 8 6年頃から組換え遺伝子技術を駆使した日本脳炎ワクチン、例えば、エンベロープ（E ) 夕ンパク抗原、組換えウィルス等を用いる第二世代ワクチンが多種多様に報告されている。しかし、これ等のワクチンはいずれも、実験あるいは前臨床試験の段階にあり、未だ実用化されていない ( "Vacc i ne" , 2nd ed. , pp. 671-713, S. A. P L o t oki nおよび E. A. M or t imer著， W. B. Sauders Co. 1 994； The J ordan Repor t , pp. 26-27, 1998) 。

不活化ワクチン用の抗原あるいは免疫原の量産に細胞株を用いる技術としては、例えば、ポリオ（米国特許第 4， 525, 349号）、狂犬病（米国特許第 4, 664, 912号）、 A型肝炎（米国特許第 4, 783, 407号）、ダニ媒介脳炎（米国特許第 5, 71 9, 051号）等の各ウィルス抗原の量産における V e r o細胞の使用が公知である。これ等のうち、前 2者の実用化はそれぞれ衆知であるが、後 2者については、量産された各抗原のワクチンとしての安全性および有効性の確認、並びに実用化は知られていない。

従来の日本脳炎ワクチンの有効成分は、マウス脳内で増殖させた日本脳炎ウイルスの不活化粒子である。かかるワクチン用抗原の量産には、膨大な数のマウスおよび感染動物のバイオハザード対策等を要するので、生産コストが非常に高くつく。また、製品中へのマウス脳の有害成分、例えば、脱髄を生じる塩基性タンパクの混入や、マウス由来ウィルスの迷入等の危険性を常に伴うため、精製工程および品質管理は複雑多岐にわたる。その上、最近では製造用マウスの入手が困難となり、計画的なワクチン製造に支障が生じていた。更に、マウスを犠牲にする従来技術は、動物愛護や宗教の観点から望まれなくなつている。発明の開示

この発明では、前記課題の解決のために、マウスの代わりに細胞株を用いてゥィルス粒子を量産する。これにより、生産コストが大幅に低減されるだけではなく、バイオハザード対策、製造作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が省力化される。特筆すべきは、本発明が新規なウィルス粒子についての予測困難な驚くべき発見に基づいていることである。この発明により、従来の不活化ヮクチンの免疫原に比べ、中和抗体価で表される力価が 2倍〜 1 0倍増強された免疫原としての新規な不活化ウィルス粒子およびその製造方法が提供される。即ち、日本脳炎ウィルス群の感染症に対する不活化ワクチン、特に、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として、あるいは診断剤の抗原として、卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウィルス粒子およびその製造方法が提供される。かかる粒子は、技術的には、日本脳炎ウィルス群に属するウィルス、例えば、日本脳炎ウィルスを細胞株で培養する工程および/またはその後の濃縮、精製、および不活化を含む一連の工程下で生成されるが、その純科学的な生成機構は未だ定かでない。以上に基づき、この発明により、次の（1 ) 〜（1 0 ) が提供される：

( 1 ) 日本脳炎ウイルス群に属するウイルスの感染細胞培養物から調製された不活化ウィルス粒子であって、該ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、マウス脳内で培養されたウィルスから調製された不活化ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の 2倍〜

1 0倍である、増強免疫原としての不活化ウィルス粒子。

( 2 ) 日本脳炎ウィルス群に属するウィルスを細胞株で培養する工程、ならびに細胞培養物を不活化および精製する工程を含む、不活化ウィルス粒子の製造方法。

( 3 ) 細胞株が V e r◦細胞である、上記 2に記載の製造方法。

( 4 ) 不活化が精製の前に行われる、上記 2または 3に記載の製造方法。 (5) 不活化が約 4 °C〜約 10 で行われる、上記 2〜 4のいずれかに記載の製造方法。

(6) 精製が、物理的方法により行われる、上記 2〜 5のいずれかに記載の製造方法。

(7) 日本脳炎ウィルス群に属するウィルスが日本脳炎ウィルスの北京株または Th CMA r 67/93株である上記 2〜 6のいずれかに記載の製造方法。

(8) 上記 2〜 7のいずれかに記載の製造方法によって製造される、不活化ゥィルス粒子。

(9) 上記 1または 8に記載の不活化ウィルス粒子を含有する不活化ワクチン。

(10) 上記 8に記載の不活化ウィルス粒子の全部または一部を抗原として含む、日本脳炎ウィルス群感染症の診断剤。図面の簡単な説明

図 1は、北京株についての試作ワクチンに含まれる本発明のウィルス粒子（R 粒子； A) およびマウス脳由来の市販ワクチンに含まれる従来技術のウィルス粒子（MB粒子； B) の電子顕微鏡写真である。発明を実施するための最良の形態

この発明の実施形態の特徴は、代表例としての従来の日本脳炎ワクチンの免疫原と本発明のそれとの間の物質および製造の両側面の比較において顕現される。これを考慮し、以下、上記両者の免疫原性および形態の相違、免疫原としてのゥィルス粒子、ウィルス培養の宿主、ウィルスの精製、ウィルスの不活化、力価試験、および電子顕微鏡解析の順に説明する。

従来の日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、現在市販の不活化日本脳炎ヮクチンの有効成分（免疫原）を意味する。この免疫原は、薬事法（昭和 35年法律第 145号）第 42条第 1項の規定に基づく厚生省告示第 217号「生物学的製剤基準」（英語版： Minimum■ Requirements for Biological Products, Associatio n of Biologicals Manufacturers of Japan, 1986) に定める「日本脳炎ヮクチン J または「乾燥日本脳炎ワクチン」の規程に準拠して製造され、かつ、安全性 '有効性等に係る種々の試験を行い、その適格性が確認されたものである。このワクチンの有効成分すなわち免疫原は、日本脳炎ワクチン製造用株ウィルスをマウス脳内に接種して増殖 ·量産させた後、それに伴う発症マウス脳の磨砕物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化して得られる日本脳炎ウィルス粒子、即ち、マウス脳（MB) に由来の不活化ウィルス粒子が免疫原として用いられる。以下、これを「MB粒子」または「MB免疫原」と略記する。

本発明に係る日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、不活化日本脳炎ワクチンの有効成分（免疫原）であって、日本脳炎ウィルスの培養宿主として細胞株の培養細胞を用いること以外は、前述の日本脳炎ワクチンの規程に準拠して製造され、かつ、種々の品質管理試験を行い、その適格性が確認されたものを意味する。したがって、この免疫原は、日本脳炎ウィルスを細胞株の培養細胞に接種して増殖させ量産した後、その細胞培養物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化することにより調製された日本脳炎ウィルス粒子、即ち、組織培養に由来の不活化ウィルス粒子が免疫原として用いられる。この免疫原は、次の（1) に示す特徴を有し、さらに、通常、次の（2) に示す主な特徴をも併せて有する：

(1) 上記粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、後述する力価試験により測定される場合、従来の MB粒子または MB免疫原で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の約 2倍〜約 10倍である（以下、これを「増強免疫原」と呼び、「R粒子」または「R免疫原」と略記する）；および

(2) 電子顕微鏡解析に基づく粒子構造、特に、粒子表面またはエンベロープ層の外観が、 MB粒子が滑らかであるのに対し、 R粒子は粗いか若しくは毛羽立っている。

以上の日本脳炎ワクチンの免疫原の説明は、本発明に係る日本脳炎ウィルス群により生じる感染症に対するワクチン用の免疫原の代表例として記載されたものである。本発明に係るワクチン、例えば、日本脳炎ワクチンは、液状または乾燥の形態で、密栓したバイアル瓶ないしは熔封したアンプルに入れて提供される。液状製剤はそのまま、乾燥製剤は溶解液で液状にもどした後、これを、例えば、ヮクチン被接種者一人当たり 0.2m 1〜 1.0m 1ずつ、皮下接種することにより使用される。

免疫原としてのウィルス：この発明に係る日本脳炎ウィルス群には、例えば、日本脳炎、クンジン、マレ一バレー脳炎、セントルイス脳炎、ウェストナイル等のウィルスが含まれ、その詳細は、 Archives of Virology, Supplement 10, pp. 415-427, 1995 (" Virus Taxonomy" , Classification and Nomenclature of V iruses； Sixth Report of the Internai ional Committee on Taxonomy of Virus es) に記載の通りである。これ等のうち、日本脳炎ウィルスについては、例えば、マウス脳由来の北京一 1株、この株を本発明者らが更にマウス脳内で継代することにより得た J WS— P— 4 (Am 29 Sm 1 Am 5 ；すなわち、成熟マウス (Am) において 29代、次いでは乳のみマウス（Sm) において 1代、さらに

Amにおいて 5代継代して得られた株を意味する）、 JWS— P_4を更にVe r o細胞で 2代継代して得たマスターシード J MS V001 (北京一 1株、 JW

S— P - 4、および J MS V001を以下「北京株」という）、中山一予研株 (以下「中山株」という）、 J aOA r S 982株、 J aOH 0566株、また、

90年代に五十嵐らが新たに分離した Th CMA r 67/93および Th CMA r 44/92両株（Aliら、 Archives of Virology, 140, 1557-1575, 1995, ならびに Aliおよび Igarashi, Microbiology and Immunology, 41, 241-252, 1977) 等々を用いることができる。この発明において、免疫原として使用する日本脳炎ウィルス株としては、北京株および Th CMA r 67/93が特に好ましい。これらのウィルス株を用いると、抗原スペクトルの広いワクチン、即ち、ワクチン製造に用いたウィルス株以外の複数の株に対しても極めて良好な防御作用を有するワクチンを得ることができる。北京株は J MS V001が好ましい。

この発明において、 2種類のウィルス株、例えば、北京株および ThCMAr 67/93株から製造されるワクチンを混合することにより 2価ワクチンを調製してもよい。混合比は、例えば、抗原タンパク量として、 0.5 ： 1〜1 ： 0.5 が好ましい。かかる混合により、従来の 1価ワクチン単独に比べ、感染防御の抗原スぺクトルが更に広いワクチンを得ることができる。

ウィルス培養は、宿主として適切な細胞株の培養細胞にウィルスを接種した後、感染細胞を維持培養することにより行う。培養方法は後述の細胞培養と同じである。以下、便宜的に、ウィルス培養物を低速遠心した上清を「細胞外ウィルス」と呼び、一方、遠心ペレットから集めた感染細胞を 0.2 % (W/V) ゥシ血清ァルブミン添加イーグル最少必須培地（MEM) で元の体積に浮遊させて超音波処理した後、これを再度、低速遠心した上清を「細胞内ウィルス」と称する。細胞外ウィルスおよび細胞内ウィルスのいずれからも本発明の不活化ウィルス粒子を得ることができる。細胞外ウィルスが好ましい。その理由は、ウィルス粒子の収率が高く、しかも、成熟粒子であり、さらに細胞内ウィルスに比べ、細胞由来成分の取り込みが少ないので、精製が容易だからである。

ウィルス培養の宿主：ウィルス培養の宿主として既知の細胞株、例えば、二倍体細胞株である W I— 38、 MRC- 5, FRhL— 2等、また、連続継代細胞株である Ve r o、 BHK— 21、 CHO等が使用できる。連続継代細胞が好ましい。その理由は、細胞の量産が容易かつ計画的に行えると共に、細胞の性状が明らかにされており、迷入ウィルスの存在が否定されているからである。更に、常用の CV— 1、 BSC— 1、 MA 104, MDCK、 CaCO— 2等、ならびにウィルスワクチンの製造に従来から用いられている DBS— FLC— 1、 DB S - FLC— 2、 DBS-FRhL-2, ESK - 4、 HEL、 I MR- 90, WRL 68等も使用できる（ "ATCC Microbes & Cells at Work" , 2nd ed.. pp.

144, American Type Culture Collection (ATCC) 1991, USA) 。前述の日本脳炎ウィルス株の培養宿主には、このウィルスの増殖が良好な許容細胞を選別して採用することが望ましい。例えば、 Ve r o (ATCC番号 CCL— 81) 、 B HK- 2 1 [C— 13] (ATCC番号 CCL— 10) 、 C 6/36 (ATCC 番号 CRL— 1660) 等の細胞の使用が好ましい。これ等の細胞株の使用に際しては、世界保健機構（WHO) が勧告する生物学的製剤の製造用細胞に関する基準（Requirements for Biological Substances No. 50) に準拠して迷入因子および腫瘍原性等に関する種々の試験を行い、ワクチン製造用細胞としての適格性を確認する必要がある（WHO Technical Report Series, No. 878, pp.19-52, 19 98) 。

細胞培養：上記細胞株の培養方法には、静置培養、灌流システム培養、振盪培養、ローラーチューブ培養、ローラ一ボトル培養、浮遊培養、マイクロキャリア一培養等を採用できる。例えば、細胞のマイクロキャリア一として市販の種々の規格の Cy t od e x [フアルマシアバイオテク社（スウェーデン）製] を用い、市販の種々の動物細胞培養装置により行うことができる。

ウィルスの不活化：ホルマリン、 /3—プロピオラクトン、ダル夕ルジアルデヒド等の不活化剤を、ウィルス浮遊液に添加混合し、ウィルスと反応させて不活化する。例えば、ホルマリンを使用の場合、その添加量は約 0. 00 5 %〜約 0.

1 % (V/V) 、不活化温度は約 4で〜約 38°C、不活化時間は主に不活化温度に依存し、例えば、 38ででは約 5時間〜約 1 80時間、 4 では約 20日〜約

90日である。

ウィルスの精製：精製方法には、物理学的方法および化学的方法がある。物理的方法とは、精製対象物の大きさ、密度、沈降係数などの物理的性質を利用する精製方法であって、例えば、ゾーナル超遠心、密度勾配遠心、濾過等を包含する。物理的方法は、通常、 P H、塩濃度などの周囲環境を変化させることなく行うことができる。化学的方法とは、化学ないし物理化学反応による吸脱着を利用する精製方法であって、例えば，イオン交換カラムクロマトグラフィー、ァフィニティークロマトクロマトグラフィー、塩析等を包含する。かかる操作は、約 4 〜室温で行う。

ウィルスの濃縮：不活化および/または精製に先だって、低速遠心、限外濾過膜による濃縮を行ってもよい。

この発明によれば、 R粒子の不活化は、約 4 °C〜約 1 0 °Cで、その精製前に行うことが望ましい。また、精製工程では、物理的方法の採用が望ましい。これにより、精製後に不活化した粒子あるいは化学的方法により精製された粒子に比べ、より高い免疫原性なレ ^しは抗原性を確保することができる。

電子顕微鏡解析：例えば、 2 % (W/V) 酢酸ゥラニルを用いるネガティブ染色法により調製したウィルス標本を、電子顕微鏡（株式会社日立製作所製）で観察できる。ウィルス粒子の形状等を、写真撮影により得られる 2万〜 1 0万倍に拡大したウィルス粒子画像について解析できる。

ワクチンの調製：本発明の不活化ウィルス粒子を、所望の力価を与えるように、適切な希釈剤で希釈することができる。公知の担体またはアジュバントをヮクチンに添加しても良い。ワクチンはまた、必要に応じて、防腐剤、安定剤などを含み得る。

力価試験：前述「生物学的製剤基準」に定める「日本脳炎ワクチン」に規定の「力価試験」に準拠して行う。例えば、 4週齢の d d Yマウスを各群 1 5匹ずつ使用し、 2倍階段希釈した各ワクチンを 0 . 5 m 1 /マウス、腹腔内に接種した後、その 7日目に第 2回接種を行い追加免疫する。第 2回接種後、 7日目に各マウスから個体別に採血して血清を分離した後、各群ごとにマウス血清を等量プールし、 5 6 °Cにて 3 0分間の非働化を行い、これを免疫血清として中和試験に供する。中和試験にはウィルス培養宿主としてニヮトリ胚細胞培養を使用し、攻撃ウィルスには、ワクチン抗原あるいは免疫原に用いたウィルス、例えば、北京株、中山株、 ThCMAr 67/93株等を使用できる。中和抗体価は、攻撃ウィルスが形成するプラーク数を 50 %減少させる上記免疫血清の最高希釈倍数を以て表わす。

別の局面において、この発明により得られるウィルス粒子（R粒子）は、診断用抗原、例えば、免疫沈降法、 H I試験、 CF反応、 EL I SA、ラジオィムノアツセィ、蛍光抗体法等の抗原として使用できる。かかる診断用抗原としての該 R粒子の特徵は、ポリク口一ナル抗体および特定のモノク口一ナル抗体と反応する粒子あたりの感度が、 MB粒子のそれに比べ、約 2~ 10倍高いことにある。すなわち、本発明の不活化ウィルス粒子の全部または一部を用いると、日本脳炎ウィルス群の感染、特に日本脳炎ウィルスの感染を検出する高感度の診断剤が可能になる。ここで、不活化ウィルス粒子の「一部」とは、ウィルス粒子に由来する所望の抗原性を保持するウィルス粒子の画分である。これには、例えば、下記実施例 1に記載の精製工程下で可溶化されたウィルスの構造タンパク質が含まれる。以下、この発明の態様並びに構成および効果を実験例および実施例によって示し、具体的に説明する。但し、この発明は、これ等に限定されるものではない。 (参考例）

北京および Th CMA r 67/93両株の遺伝子配列表：この発明での使用に特に適切な日本脳炎ウィルス北京株および Th CMA r 67/93株の同定を容易にするため、これ等の両株のゲノム RN Aに相補的なエンベロープタンパク遺伝子 c DN Aの塩基配列と、それがコードする推定アミノ酸配列とを配列番号 1 〜4に示す。配列番号 1および 2は Th CMA r 67/93株（Archives of Vir ology, 140, 1557-1575, 1995) 、配列番号 3および 4は北京株であるマスターシードウィルス JMSVO 01に関する。以下の実施例における「北京株」は、この J MS V 001である。

c DN Aの塩基配列の決定は、上記 Aliらの文献（1995) に記載の方法で行つた。すなわち、 Ve r o細胞によるウィルス培養物から、そのゲノム RNAを抽出の後、エンベロープタンパクをコードする領域を、プライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT- PCR) で増幅し、得られた cDN A断片の塩基配列をジデォキシチェーン夕一ミネーシヨン法により決定した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ユニバーサルコードにより解読した。 (実験例 1)

ウィルス感染価の測定：後述の Ve r o—M細胞を用いるプラーク法により、ウィルス感染価 PFU (プラーク形成単位） / m 1で計数した。

ウィルス抗原量の測定：日本脳炎ウィルス抗原量は、抗日本脳炎ウィルスモノクローナル抗体 [G r ou p— 8 C l on e 503 (東京都神経科学総合研究所保井博士から分与： K. Yasuiら、 Journal of General Virology, 67, 2663- 2672, 1986) ] I g Gを用いる E L I S Aにより測定した。 E L I S A値は、マウス脳由来自家標準品（北京株）を 100単位とし、その相対値を平行線検定法により算出した。

HA試験：試験には U型マイクロプレートを使用した。至適 pHに調整したリン酸緩衝液による 0.33 % (V/V) ガチョウ赤血球浮遊液とウィルス液とを等量混合の後、 37 で 60分間、反応させ、赤血球凝集の有無を判定した。 HA 価は、赤血球凝集が陽性であるウィルス液の最高希釈倍数で表わした。

ゥシ血清抗原量の測定：抗ゥシ血清ャギ I gGを用いる EL I S Aにより測定した。ゥシ血清標準抗原におけるタンパク質含量に対する相対値を平行線検定法により算出し、その値を抗原量とした。 (実験例 2)

ウィルス培萎用の細胞株の増殖性：付着性の 2系統の Ve r o細胞、 Ve r o 一 A ( 丁0 番号0じ —81に由来）および Ve r o— M (国立感染症研究所から入手した V e r oに由来）、 3系統の BHK— 2 1細胞、 BHK/WI 2 (大阪府立公衆衛生研究所から入手した付着性 BHK— 2 1に由来）、 BHK/

JH IH (国立家畜衛生試験場から入手した浮遊性 BHK— 21に由来）および BHK— 21 [C— 13] (ATCC番号 CCL— 10に由来）、並びに蚊由来の C 6/36細胞（ATCC番号 CRL— 1660に由来）をウィルス培養用の候補細胞株とし、これ等の各細胞株の増殖性を観察した。 2系統の Ve r o、およびに BHK/W I 2および BHK— 21 [C 13] は、各々 1.5 X 10⁵細胞 /m 1になるよう増殖培地で調製し、これを 37でで 3日間、静置培養した後、それぞれ細胞数を計測した。上記と同様にして、浮遊性 BHK/J N I Hでは 2. 0 X 1 0⁵細胞/ m 1を調製し、これを 37 °Cで 3日間、振盪培養の後、また、 C 6/36では 1.0 X 10⁵細胞/ m 1を調製し、これを 28°Cで 7日間静置培養の後、各々細胞数を計測した。尚、増殖培地には、最終濃度 8% (V/V) ゥシ血清を添加混合した MEMを用いた。その結果、 2系統の Ve r o、並びに B HK/W 12および BHK— 21 [C 13] は 7.0〜 9.0 X 1 0⁵細胞/ m 1、浮遊性 BHK/AN I Hおよび C 6/36は、 2.8 X 1 0⁶細胞/ m 1であった。 (実験例 3 )

候補細胞株における日本脳炎ウィルスの増殖性：実験例 2で用いた候補細胞株にっき、 C 6/36細胞は 28 °Cで 7日間、それ以外の細胞は 37 °Cで 3日間培養の後、各細胞に北京株を感染多重度（MO I) が 0. 1になるよう接種し、細胞外ウィルス量の経時的変移を、ウィルス感染価（PFU) 、ウィルス抗原量 (EL I SA価）および HA価で測定し比較した。その結果を表 1に示す。数値は、 2回実験した各細胞株でのウィルス増殖曲線における最高値の平均値であり、 C 6/ 37では、ウィルス感染価は培養 3日目に、 EL I SA価および HA価は共に、培養 4日目に各々最高値であった。その他の細胞株では、ウィルス感染価は培養 2日目に、 EL I S A価および H A価は培養 3日目または 4日目に各々最高値であった。表 1

細胞 PFUノ ml 隱価 HA価付着性

BHK-21/WI2 1.5χ10⁸ 27 40

BH -21[C13l 2.3 χ10⁸ 48 320

(実験例 4 )

Cy t o d e Xの種類および V e r o - A細胞の増殖性： 1.5 X 10⁵細胞/ m 1の Ve r o_ A細胞浮遊液を 50 Omlずつ入れた細胞培養用フラスコ 3本の各々に、 Cy t od ex 1、 2または 3のいずれか 1種を 1.5 g/Lになるように添加の後、 37でにて回転数 40 r pmによる攪拌下で 7日間、培養した。その結果を以下に記載する：培養 7日目の細胞数/ m 1は、 C y t o d e X 1、 2、および 3について，それぞれ 7.5 X 10⁵、 8.3 X 10⁵, および 9.4 X 10⁵であった。また、 Cy t o d e x 1での 7日間培養により、全てのビ一ズの表面に 100個以上の Ve r o— A細胞が隙間なく付着し増殖した。

(実験例 5) Cy t o d e xの濃度および V e r o一 A細胞の増殖性： 1.5 X 10⁵細胞/ m 1の細胞浮遊液を 500m 1ずつ入れた細胞培養用フラスコ 4本（A、 B、 C および D) のうち、 Aおよび Bには Cy t o d e x 1を各々 l: 5 g/L、じには 3.0 g/L、 Dには 4.5 g/Lになるようそれぞれ添加した後、 37°Cにて回転数 40 r pmによる攪拌下で 7日間、培養し、細胞数および細胞が付着したビ —ズの割合（付着率）を計測した。付着率の算出には、 200個以上の各ビーズを観察し、 5個以上の細胞が付着しているビ一ズを細胞付着ビーズとした。尚、 Cy t od ex 1を 1.5 g/L添加した Aは、培養終了時まで同じ増殖培地で培養し、残りの B、 Cおよび Dの各フラスコについては、培養開始から 3、 4、および 5日目の各日に、培養液の 1/2量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下記載する：培養液の交換の有無（Aおよび B) は細胞数には影響しなかつた。 7日間培養後の細胞数/ m 1は、 Bが 9.1 X 10⁵ 、 C力 7.7 x 1 0⁵ 、 Dが 8.0 X 10⁵ であった。付着率は、 Aおよび Bが培養 1日目から 98 %以上で培養 4日目には 100%に達し、培養 1日目の Cは 93%、 Dは 80%と低かった。しかし、培養 6日目には A、 B、 Cおよび Dは共に 1 00 %に達した。

(実験例 6)

Cy t od ex 1により高密度培養した Ve r o— A細胞の増殖性： Cy t od e xの濃度および細胞数をそれぞれ 3倍にした高密度培養を行った。 4.5 X 10⁵細胞/ m 1の V e r o— A細胞浮遊液に、 Cy t od e x 1を 4.5 g /Lになるよう添加して、培養液量 50リットルの動物細胞培養装置を用いて培養した。回転数は最初の 24時間が 15 r pm、それ以降は 20 r pm、 H 7. 0、溶存酸素を 5 p pmに設定した。培養 3日目および 5日目に培養液の 1/2 量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下に記載する：培養 5日目の細胞数は 2.0 X 10⁶細胞/ mし 7日目には 2.6 X 10⁶細胞/ m 1であった。また。培養 2日目における細胞のビーズへの付着率は 100%であった。 (実験例 7)

ワクチン製造用ウィルス候補株の Ve r o— A細胞における増殖性：シャーレで 3日間静置培養した Ve r o— Aに、マウス脳由来の日本脳炎ウィルスの上記候補株、北京株、中山株、 J aOHO 566、および J a〇Ar S 982の 4株をそれぞれ MO Iが 0. 1になるように接種し、ウィルスを 90分間吸着後、 2 % (V/V) ゥシ血清を含む MEMを加え 37°Cで 7日間培養した。そして、細胞外および細胞内ウィルスの感染価および抗原量の経時的変移を観察した。その結果を以下に記載する：感染価について、中山株を除く 3株の細胞外ウィルスは培養 2日目の値が最も高く 1.0 X 1 0⁸P FU/m 1以上、細胞内ウィルスのそれは細胞外ウィルスの 1/3以下であり、中山株の細胞外ウィルスのそれは、培養 3日目が最高であつたが、他の 3株の値の 1/5以下であった。 EL I SA 抗原価に関し、中山株を除く 3株の細胞外ウィルスのそれは培養 3〜5日目が最も高く、いずれも約 70単位、細胞内ウィルスのそれは細胞外ウィルスの 1/5 以下であり、中山株では培養 5〜7日目にプラトーとなり、 30単位であった。 HA価は、培養 2〜4日目の細胞外ウィルスにっき、中山株が 160、他の 3株は 640〜 1280であった。

(実験例 8 )

Cy t od e x 1による V e r o— A細胞培養での北京株の増殖： C y t o d e x 1を用いて培養した 20リットルの V e r o— A細胞（1.96 X 10 ⁶細胞/ m l) に、 Ve r o— Aで 4代継代した北京株ウィルスを M〇 Iが 0.1 になるよう接種し、ゥシ血清を含まない MEMで培養した。その結果を以下に記載する：細胞内ウィルスの感染価は培養 2日目が最も高く 1.3X 10⁸PFU/ m I、細胞外ウィルスは培養 3日目が最も高く 4.0 x 10⁸ P F U/m 1であつた。 EL I S A抗原価は細胞外ウィルスは培養 4日目が最も高く 67単位、細胞内ウィルスは培養 3日目が最も高く 26単位であった。細胞外ウィルスの HA価は培養 3日目で 320であり、細胞内ウィルスは 40であった。

(実験例 9 )

株の遺伝学的安定性：マウス由来ウィルス（JWS— P— 4) を Ve r o細胞で 2代継代することにより調製したマスタ一シード（JMSV001) を、さらに Ve r o細胞で 7代連続継代しても、コア、 pre- M、およびエンベロープの各夕ンパク質の遺伝子の塩基配列に変異は見られず、マスターシ一ドは遺伝学的に安定であった。また、これ等の遺伝子がコ一ドするアミノ酸配列は JWS—P— 4のそれと同一であった。なお、遺伝子解析は、参考例 1に記載の方法で行った。

(実施例 1 )

試作ワクチンの調製： C y t o d e X 1を用いて培養した V e r o一 A細胞に、マウス由来ウィルス（JWS— P— 4) を Ve r o—Aにおいて 4代継代した北京株を、 M〇 Iが 0. 1になるように接種し、ゥシ血清を含まない MEMで 37でにて 4日間、培養した。培養上清（すなわち、細胞外ウィルス）を採取し、分画分子量が 100 k D aの限外濾過膜で 1/10量に濃縮した後、最終濃度 11 1500 (V/V) 量のホルマリンを添加混合し、ウィルスを不活化した。不活化条件は、 4°Cで 50日間であった。次に、不活化ウィルス浮遊液を、蔗糖密度勾配ゾーナル超遠心に 2回かけ、ウィルスを精製した。 2回超遠心の条件は共に、 P 35 ZTロー夕一（日製産業社製）を用いる 25〜 50 % (W/W) 蔗糖密度勾配、 30， 000 r pm、 13時間であった。これよりウィルス画分（蔗糖密度 41 %) を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS) 透析の後、これをワクチン原液とした。この原液について、前記の「生物学的製剤基準」に準拠して安全性および有効性に関する各種試験を行い、ワクチンとしての適格性を確認した。次いで、この原液のタンパク質含量が 7.8 n g/m 1になるよう 199培地（TC Medium 199: Difco Laboratories, USA) で希釈調整し、これを 3ml容のバイアル瓶に lmlずつ分注の後、各瓶を密栓し、試作ワクチンとした。タンパク質含量は、前述の「生物学的製剤基準」に規定の一般試験法（加熱トリクロル酢酸 (TCA) により沈殿するタンパク質をローリー法で定量する）に準拠して測定した。

(実施例 2)

試作ワクチンの主な工程時の性状：実施例 1に記載の試作ワクチンの主な製造工程の各々を終了した時点で採取した各検体について、実験例 1に記載の各種試験を行った。その結果を以下に示す：ウィルスの培養上清、即ち、ウィルス浮遊液の感染価は 2.2 X 10⁸P FU/m 1、 E L I S A抗原価は 70単位、 HA価は 1 60であった。該ウィルス浮遊液を限外濾過膜を用いて 1/10容に濃縮したときの感染価および抗原量は共に 10倍高い値を示した。ゾ一ナル超遠心 1回後のウィルス抗原について、蔗糖濃度 41 %および 34%の 2つの画分にその極大値が見られた。電子顕微鏡観察によれば、 41 %の画分はウィルス粒子であり、 34%の画分はウィルス抗原活性を有するウィルス粒子より微細な粒子であつた。また、細胞培養からの持ち込みゥシ血清抗原は、蔗糖濃度 28%以下の画分に検出され、ウィルス粒子画分から分離された。上記のウィルス粒子画分を再度、ゾ一ナル超遠心により精製したウィルス粒子は、蔗糖濃度 40%の画分に単一性のピークとして確認された。この画分から試作ワクチンを調製した。試作ワクチンの EL I S A抗原価は 45単位、タンパク質含量は 7.8 μ. g/m 1であった。

(実施例 3 )

試作ワクチンの電子顕微鏡観察：試作ワクチンおよびマウス脳由来の市販ワクチンの両者について、前述の電子顕微鏡解析を行った（図 1〉。その結果、ウイルス粒子表面またはエンベロープ層の外観に関し、市販ワクチン中の MB粒子が滑らかであるのに対し（図 I B ) 、この発明に係る試作ワクチン中の R粒子は粗いか若しくは毛羽立つていた（図 1 A) 。

(実施例 4 )

中和反応に基づく試作ワクチンの力価：実施例 1で得た試作ワクチン、マウス脳由来の市販ワクチン、および力価試験用参照ワクチンの 3種類の各ワクチン (いずれも有効成分として不活化された北京株ウィルスを含有）の力価を、前述の「力価試験」により測定した。即ち、各ワクチンを P B Sで 2倍階段希釈し、これ等をそれぞれ用いてマウスを免疫し、得られた各血清の北京株ウイルスに対する中和抗体価を比較した。ワクチンの希釈倍数と、中和抗体価の常用対数値との関係を表 2に示す。

試作および市販の両ワクチン（同等タンパク質含量）を免疫することにより得られる抗血清中の中和抗体価の常用対数値の差は、ワクチンの希釈倍数 8〜 3 2 について、 0 . 3 8〜 1 . 1 1であった。即ち、試作ワクチン免疫原で得られる中和抗体価は、市販ワクチン免疫原によるそれの約 2倍〜約 1 0倍であった。更に, これ等の測定値を平行線検定法に基づき推計した結果、試作ワクチン/市販ワクチンの力価、中和抗体価の算出倍率は約 3倍であった。

表 2 ヲンパク質含量ワクチン中和抗体価差 (A— B)

g/ml 希釈倍数の常用対数値

8 3.87 0.64

試作ワクチン 7.8 16 3.51 0.38

(A)

32 3.33 1.11

8 3.23

市反ワクチン

7.5 16 3.13

(B)

32 2.21

参照ワクチン 5.4 16 1.87 差（A— B) ：同一希釈倍数での [Aの中和抗体価の常用対数値一 Bの

中和抗体価の常用対数値] 。例えば、希釈倍率 8のとき、

3.87-3.24 = 0.64

タンパク質含量： TC Aタンパク質定量法（加熱トリク□ル酢酸によって

沈殺するワクチン中のタンパク質を、ローリ一法により

定量する方法）を用いて測定された。

(実施例 5)

交差中和反応に基づく試作ワクチン間の免疫原性の相違： Ve r o— A細胞で 4代継代した北京株、および Ve r o— A細胞で 2代継代した、タイ国由来の T h CMA r 67/93ぉょび丁11〇1^ 44/92の 3株をそれぞれシードウイルスに用い、実施例 1の記載と同様にして各株の不活化ウィルスを有効成分として含有する試作ワクチンを調製した。これら各ワクチンを免疫してマウスで得られる抗血清の中和抗体価を実施例 4の記載と同様にして測定比較し、株間の交差反応性を解析した。比較対照として、北京株および中山株の各不活化ウィルスを有効成分として含有するマウス脳由来の市販ワクチン、および参照ワクチンとして TC Aタンパク質含量が 5.4 g/m 1のマウス脳由来ワクチン（北京株）を用いた。マウス免疫では、試作および市販の合計 5種の各ワクチンの TCAタンパク質含量が 7.5 g/m 1になるよう調整の後、 PBSで 16倍希釈した。中和試験における攻撃ウィルスには、前記 4株ウィルス、即ち、北京株、中山株、 T CMA r 67/93, および ThCMAr 44/92の各ウィルスを用いた。結果を表 3に示す。交差反応スペクトルの観点から、北京株および ThCMAr 67/93株の両ウィルス抗原が、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として優れていた。表 3 ウィルス

ワクチン

北京株中山株 Ar67 Ar44

試作北京株 3.68 3.04 2.87 2.66

市固反北京株 3.09 2.69 1.88 1.88

市販中山株 0.86 2.05 1.45 1.04

試作 Ar67 2.84 3.15 3.02 2.97

参照（北京株） 1.85 NT NT NT

A r 67 _: ThCMAr 67/93株； Ar 44 : ThCMAr 44/92株。

試作： Ve r o細胞で製造した不活化ワクチン；市販：マウス脳に由来の

不活化ワクチン：参照：マウス脳由来の自家製標準の不活化ワクチン。

数値：中和抗体価の常用対数値； NT：実施せず。

(実施例 6 )

試作 2価ワクチンの調製：北京株および Th CMA r 67/93株の各ヮクチン原液を、実施例 1の記載と同様に調製後、これ等の原液の各タンパク質含量が 10 g/mgになるよう PBSで希釈調整した。次いで両者を等量混合し、ノィアル瓶に分注して、 2価ワクチンを得た。この 2価ワクチンは、それぞれの 1 価ワクチン単独よりさらに広い交差反応スぺクトルを有した。 (実施例 7)

診断剤の調製：実施例 1で調製した北京株ワクチン原液中の R粒子を診断用抗原として使用し、その有効性を前述の「ウィルス抗原量の測定」と同様の EL I S Aにより検定した。比較対照抗原として市販の北京株ワクチン中の MB粒子を用いた。抗体として、モノクローナル抗体 5 03 (MAb 5 0 3 :全ての日本脳炎ウィルスに共通かつ特異的な中和ェピトープに対する抗体）、 MA b 3 0 2 (日本脳炎ウィルス群に特異的なェビトープに対する抗体）、およびポリクロ一ナル抗体（PAb ：マウスの過免疫血清）を用いた。抗原量を一定（タンパク量 7. 6 g/m 1 ) に保ち、抗体を階段希釈し EL I S A価をそれぞれ測定した。 (R粒子の EL I S A価/ MB粒子の EL I S A価）は、 Ma b 5 03では、 5 3/4 7、 Ma b 3 0 2では 2 2 6/2 2、および P A bでは 1 2 0 / 5 2であつた。この結果に基づき、 Ma b 3 0 2および PAbに対する R粒子の感度は、 M B粒子のそれに比べ、約 2〜約 1 0倍高いと判断された。 Ma b 3 0 2についての結果から、本発明の抗原は、日本脳炎ウィルス群の予備的検出用の抗原として有用であると考えられる。産業上の利用可能性

本発明では、飼育管理が繁雑かつ微妙な上に高価なマウスの代わりに、取扱いが容易かつ低廉な細胞株を用い、ウィルス粒子が量産される。従って、多数のマウスを犠牲にしないので、動物愛護の観点から望ましい。また、経済的には、生産コストが大幅に低減されるばかりなく、バイオハザード対策、製造に係る作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が著しく省力化される。特に、従来の不活化ワクチンに比べ、約 2倍〜約 1 0倍の力価を発揮する、増強免疫原として新規なウィルス粒子、およびその製造方法が提供される。特に，この発明により、不活化日本脳炎ワクチン用の免疫原あるいは診断剤用の抗原として卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウィルス粒子およびその製造方法が提供される。従って、この発明は、低廉でしかも優れた品質のワクチンや診断剤の提供を可能にし、日本脳炎ウィルス群感染症の予防および診断の全世界にわたる飛躍的な普及および向上をもたらす。

Claims

請求の範囲

1 . 日本脳炎ウィルス群に属するウィルスの感染細胞培養物から調製された不活化ウィルス粒子であって、該ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、マウス脳内で培養されたウィルスから調製された不活化ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の 2倍〜 1 0倍である、増強免疫原としての不活化ウィルス粒子。

2 . 日本脳炎ウィルス群に属するウィルスを細胞株で培養する工程、ならびに細胞培養物を不活化および精製する工程を含む、不活化ウィルス粒子の製造方法であって、該ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、マウス脳内で培養されたウィルスから調製された不活化ウィルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の 2倍〜 1 0倍である、製造方法。

3 . 細胞株が V e r o細胞である、請求項 2に記載の製造方法。

4 . 前記不活化が前記精製の前に行われる、請求項 2または 3に記載の製造方法。

5 . 前記不活化が約 4で〜約 1 0 °Cで行われる、請求項 2〜 4のいずれかに記載の製造方法。

6 . 前記精製が物理的方法により行われる、請求項 2〜 5のいずれかに記載の製造方法。

7 . 前記日本脳炎ウィルス群に属するウィルスが、日本脳炎ウィルスの北京株または丁 h C M A r 6 7 / 9 3株である、請求項 2〜 6のいずれかに記載の製造方法。

8 . 請求項 2〜 7のいずれかに記載の製造方法によって製造される、不活化ウイルス粒子。

9 . 請求項 1または 8に記載の不活化ウィルス粒子を含有する不活化ワクチン。

1 0 . 請求項 8に記載の不活化ウィルス粒子の全部または一部を抗原として含む、日本脳炎ウィルス群感染症の診断剤。