WO1999002543A1 - Derives de 3'-desoxyribonucleotide - Google Patents

Description

明細書

3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体 技術分野

本発明は、 新規な 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体に関する。 さらに詳しく は、 本発明は、 RNAボリメラーゼを用いた塩基配列決定法におけるターミネ一 ターとして有用な、 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体に関する。 景技術

DNAの塩基配列分析は、 分子生物学に於いて基幹的な技術の一つである ₌ DNA塩基配列決定法としては、 現在、 マキサム—ギルバート法 （化学分解法）

[Methods Enzymology, 65, 499-560 (1980) 〕 及びサンガー法 （ジデォキシ連 鎖停止法） [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74， 5463-5467 (1977) 〕 の 2つの 基本的な方法が知られている。 なかでも、 ジデォキシ連鎖停止法は、 化学分解法 よりも簡単で短時間に配列が決定できることから、 DN A塩基配列決定法の主流 となっている。

ジデォキシ連鎖停止法の基本原理は、 以下の如きものである。

まず塩基配列を決めようとする DNA断片を含む一本鎖 DNAを調製し、 これを 複製過程の铸型とする。 次いで、 これに該 DNA断片の挿入部位の近傍に結合す るプライマ一を結合させ、 クレノゥフラグメントと呼ばれる酵素で該一本鎖 DN Aに相補的な DN Aを合成する。 この合成は、 4種の天然の 2' —デォキシリボ ヌクレオチド及び連鎖停止剤 （ターミネータ一） としてラジオアイソトープや蛍 光色素等で標識した 4種の各塩基に対応する標識化 2' ， 3 ' ージデォキシヌク レオチドの存在下で行われる 即ち、 2' ， 3' —ジデォキシヌクレオチドは、 2 ' —デォキシリボヌクレオチドの 3 ' 位の OH基が H基に置換されたもので、 2 '—デォキシリボヌクレオチドと同様にクレノゥフラグメン卜の基質になるが、 2' ， 3 ' ージデォキシヌクレオチドが結合した場合は、 そこで DN Aの連鎖伸 長が停止する ₌ この結果、 共通の 5' 末端をもつが鎖長の異なる様々な DN A鎖 が合成される。

即ち、 アデニン （A) ， グァニン （G) ， シトシン （C) ， チミン （T) 夫々の 塩基について、 2' ， 3' —ジデォキシヌクレオチド体を併用して前記操作を行 つた後、 これを電気泳動にかけると、 塩基配列の順番を DN Aの断片の長さで解 読できるのである _c

しかしながら、 最近の、 所謂ゲノム 'プロジェク トと言われる、 ヒ トゃ動植物の 全 D N A塩基配列の決定や全遺伝子の解析が進められている現状にあっては、 上 記のジデォキシ連鎖停止法に於ける、 操作手順の煩雑さ （铸型一本鎖 DN A調製 等） や、 処理時間の高速化が難しい等の問題点が指摘されている：.

DNA塩基配列決定方法としては、ボリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) 法 [Randall K. Saiki et al. Science, 239: 487 - 491 (1988) ]で増幅した生成物をクロー-ングすること なくシークェンスする方法 （ダイレク ト ·シークェンス法） も有用な方法である [Corinne Wong et al. Nature, 330:384-386 (1988)] ： この方法はライブラリ 一作製やそのスクリーユングが不要であり、 多くのサンブルの配列情報を同時に 得られる迅速な方法である。

しかるに、 上記ダイレク ト ■ シークェンス法には 2つの大きな問題点がある： 一 つは、 取り込めなかったプライマ一及び 2' デォキシリボヌクレオシド 5 ' トリ ホスフユ一ト（2' dNTPs) が反応系中に残存し、 これらがシークェンス反応を妨げ ることである。 従って、 従来法では、 これら残存するプライマーと 2' dNTPsは、 シークェンスの前に PCR 生成物から除去する必要があった。 PCR 生成物の精製 方法には種々の方法があり、 例えば、 電気泳動による精製法、エタノール沈殿法、 ゲル濾過法、 HPLC精製法がある [例えば、 Dorit et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2. l-lo.2.11 (1991) 参照」 。 し力、し、 何れの方法も煩雑である：

2つ目の問題は、 PCR 生成物の迅速な再生 （renaturation) である。 P CR生成 物が 2本鎖 DN Aに再生してしまうと、 1本鎖のテンプレート （鎊型） ではなく なり、 プライマーと 1本鎖テンプレートとの間のアニーリングを妨げる- 再生を 最小限にするための方法として、 例えば変性後の急冷、 1つのプライマ一のピオ チレ一ション （biotilation)とストレプ卜アビジン被覆物への PCR 生成物の吸 着、 エタソヌクレアーゼの使用、 ァシンメ トリ ック PCR 等が報告されている： 例えば、 Barbara Bachmann et al. , Nucleic Acid Res. , 18 : 1309 (1990) に開示 されている： しかし、 これらの方法の殆どは、 長い時間を必要とし、 非常に面倒 である。

これら問題点を解決する手段の一つとして、 RNAボリメラ一ゼの特性を利用し た連鎖伸長反応による DN A塩基配列決定法が考えられている。

このような RNAポリメラーゼを用いる塩基配列決定法のうち、 連鎖停止法につ いては、 4種の天然リボヌクレオチド及びタ一ミネ一ターとしてラジオアイソト ープである ³²P 等の放射性同位元素を標識物として用いた 4種の各塩基に対応す る標識化 3'-デォキシヌクレオチドを用いる方法が知られている [Biochemistry, 24, 5716-5723 (1985) 〕 _c

しかしながら、 この標識ターミネ一ターは、 標識物として放射性同位元素を用い ているので、 人体に対する安全性や廃棄物処理等を考慮すると、 使い勝手のよい ものではない。 そこで、 放射性同位元素に代えて蛍光により標識されたターミネ —ターを利用することが考えられる。

前述したジデォキシ連鎖停止法に用いられる標識化ターミネータ一に関しては、 例えば、 サンガー等の報告 〔J. Mol. Biol. , Η3, 161-178 (1980) 〕 ， スミス 等の報告 Nucleic Acids Res. , 13, 2399-2412 (1985) 〕 、 プロ一バー等の報 ^ [Scince, 238, 336-341 (1987) ]、コンネル等の報告〔BioTechniques， 5, 342-348

(1987) 〕 、 リー等の報告 [Nucleic Acids Res.， 20, 2471-2483 (1992) 〕 、 特公表平 5-502371号公報、 特公平 7- 121239号公報等、 種々の報告がなされてい る: しかるに、 何れの報告も DNAボリメラーゼを用いた方法であるため、 ター ミネ一ターとしては、 2 ' ， 3 ' —ジデォキシリボヌクレオチドが使用され、 蛍 光標識された 3'-デォキシリボヌクレオチドについては何ら言及していない。 また、 特公平 8-5908 号公報には、 標識化 2 ' ， 3 ' ージデォキシリボヌクレオ チド、 標識化 2 ' —デォキシリボヌクレオチド、 標識化 3'-デォキシリボヌクレ ォチド及び標識化リボヌクレオチドが各種記載されている。 しかるに、標識化 3'- デォキシリボヌクレオチドについては、 一般式に含まれる化合物の 1つとして特 許請求の範囲に記載されているにも係わらず、 実施例の記載はなく、 化合物とし て合成されたことは実証されておらず、 未完成の状態である。 さらに、 この公報 では、 これらヌクレオチド誘導体を実際に DN A塩基配列決定に使用した例は記 載されていない _c

ところが、 DNA合成時における DNAボリメラ一ゼによる 2， 一デォキシリボ ヌクレオチドの取り込みには、 ヌクレオチドが有する塩基の種類によりバラツキ があることが知られている。 標識化ヌクレオチド誘導体についても、 同様の傾向 があるとともに、 標識物質の種類によっても DNAボリメラーゼによる取り込み にバラツキがでることが予想される- それにも係わらず上記特公平 8-5908 号公 報には、 開示された誘導体の DN Aボリメラーゼによる取り込みについては全く 評価していない。 さらに、 標識化 3'-デォキシリボヌクレオチドについては、 物 質自体が合成されていないので、 評価しようもない

上記事情は、 D N Aポリメラーゼを用いた D N A塩基配列決定法の場合であるが、 RNAボリメラーゼを用いた DN A塩基配列決定法については、 どのような傾向 があるのかは知られていない。 即ち、 リボヌク レオチドの塩基の種類の違いによ る取り込み効率の違いや、 標識化した 3'-デォキシリボヌクレオチドの取り込み 効率の違いと、 DN A塩基配列決定法に対する影響については、 殆ど知られてい ない。 DN A塩基配列決定の如き高度な技術が要求される分野に於いて、 蛍光標 識化合物や蛍光標識化 3' -デォキシリボヌクレオチドは、 使用する R N Aポリメ ラ一ゼの活性を妨げてはならないという厳しレ、制約を有するジデォキシ連鎖停止 法に用いられる ₌ そのため、 DNAポリメラーゼと RNAボリメラ一ゼとの構造 相関等に基づいて、 上記の如き公知の標識化ターミネータ一から、 RNAポリメ ラーゼを用いる連鎖停止法に有用な蛍光標識化ターミネータ一を推測することは 極めて困難である。

このような状況の中、 本発明者らは、 RN Aボリメラ一ゼを利用した核酸の塩基 配列決定法に於いてターミネータ一として有用な各種の蛍光標識化 3' -デォキシ リボヌクレオチド誘導体を開発し、 先に特許出願した （特願平 8 - 227904号） - その後、 これらの蛍光標識化 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体を実際に RN Aボリメラーゼを利用した核酸の塩基配列決定法に適用した結果、 铸型 DN Aの 塩基配列を決定できた- しかしながら、 理由は定かではないが、 これらの蛍光標 識化 3，-デォキシリボヌク レオチド誘導体は、 実用的なレベルで DNAの塩基配 列決定法に使用するには、 RNAボリメラ一ゼによる取り込み率が十分でなかつ た- そこで、 RN Aポリメラーゼを利用した DN Aの塩基配列決定法を実用化す るという観点から、 RNAポリメラ一ゼによる取り込み率の改善された蛍光標識 化 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体の提供が望まれていた。

そこで本発明の目的は、 RNAボリメラーゼを用いた DN Aの塩基配列決定法に おけるターミネータ一として有用な、 RNAボリメラ一ゼによる取り込み率の改 善された 3' -デォキシリボヌクレオチド誘導体を提供することにある _c 発明の要約

本発明は、 下記一般式 〔 I〕 で示される 3' デォキシリボヌクレオチド誘導体の 発明である。

Q— V— (CH₂) _n— NH— R 〔 I〕

〔式中、 Qは 3' -デォキシリボヌクレオチド残基を表し、 nは 4以上の整数を表 し、 Vは一 C≡C—又は一CH=CH—を表し、 Rは蛍光性を有する基を表す。 〕 即ち、 本発明者等は、 前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた。 その結果、 上記 一般式 〔 I〕 で示される蛍光標識化 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体、 即ち、 - (CH₂ ) _n 一で示されるメチレン鎖の nの数が 4以上であり、 かつ Rで示さ れる蛍光性を有する基を含んでなる蛍光標識化 3'-デォキシリボヌクレオチド誘 導体は、 人体、 環境等への安全性が高く且つ高感度に検出可能であり、 RNAボ リメラ一ゼの基質になり得、 これを RNAボリメラ一ゼを用いる DNAの塩基配 列決定法に於いてターミネータ一として用いた場合に、 RNAポリメラーゼによ る取り込み率が高いことを見い出し、 本発明を完成するに至った _c 発明を実施するための形態

本発明の一般式 〔 I〕 で示される 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 （a)3，- デォキシリボヌクレオチド残基： Q、

(b)リンカ一：一般式 〔VI〕

- V- (CH₂) _n— NH— 〔VI〕

〔式中、 V及び nは前記に同じ。 ]

及び (c)蛍光性を有する基

の 3つの構成部分に分けることができる。

Qで示される 3' -デォキシリボヌクレオチド残基としては、 下記一般式 〔II〕 及 び 〔III 〕 で示される 7-デァザブリンヌクレオチド残基、 下記一般式 〔IV〕 及 び 〔V〕 で示されるピリミジンヌクレオチド残基が挙げられる。 〔ΛΙ〕

〔III〕

〔II

£0€0/86df/XDd ひ SZO/66 OW R30 ₀ 〔

「_/ V〕

OH

尚、 上記一般式 〔Π〕 〜 〔V〕 に於いて、 It - P 0, H₉： 一 P _?0₆H, P

,0₉ Η₄ 又はその塩を表し、 当該塩の具体例としては、 例えばナトリ ウム塩、 力 リゥム塩、 リチウム塩等 リ金属塩、 例えばバリゥム塩等のアル力リ土類 金属塩、 アンモニゥム塩、 例えばトリェチルアンモニゥム塩、 ピリジン塩等の有 機ァミン塩等が好ましく挙げられる- 上記一般式 〔VI〕 で示されるリンカ一は、 Qで示される 3'-デォキシリボヌク レ ォチド残基と蛍光性を有する基とを結合するためのリンカーである。

即ち、 該リンカ一の二重結合又は三重結合を形成する炭素原子の一末端が、 前述 した如き 3'-デォキシリボヌクレオチド残基 Qのうち、 ピリ レ才チド 残基についてはその 5位に、 また、 7—デァザプリンヌクレオチド残基について はその 7位に夫々結合し、 更に、 該リンカ一の- ΝΗ-基は、 蛍光色素基上のカルボ キシル基と結合することにより、 3' -デォキシリボヌク レオチド残基と、 蛍光色 素基とを有する化合物を形成する- 一般式 〔VI〕 で表されるリンカ一に於いて、 ηが 4以上のメチレン鎖としては、 例えば ηが 4〜15 のメチレン鎖が挙げられ、 具体的には、 テトラメチレン基、

.ンタメチレン基、 へキサメチレン基、 ヘプタメチレン基、 ォクタメチ ノナメチレン基、 デカメチレン基等が挙げられる。 R N Aポリメラーゼによる取 り込み率の改善という観点から、 nは 4以上の整数であるが、 好ましくは nは 4 〜10 の整数であり、 より好ましくは、 nは 4〜8の整数を表し、 さらに好まし くは nは 4または 6である。

Rで表される蛍光性を有する基は、 蛍光性を有する基が直接 - NH-基に結合してい ても、 間に何らかのリ ンカ一を介して- NH -基に結合していてもよい。 蛍光性を有 する基としては、 特に限定はなく、 蛍光強度や蛍光の波長、 R N Aボリメラーゼ による取り込みの容易さ等を考慮して適宜選択できる。 但し、 蛍光性を有する基 は、 レーザーのような適切な供給源からのエネルギー吸収による刺激に 引き続いて、 検知可能な発光放射を生じる蛍光色素基であることが好ましい: 蛍光性を有する基 Rとしては、 例えば、 下記一般式 〔VI I 〕 で示される基を挙げ ることができる。 一般式 〔VI I 〕 で示される蛍光性を有する基は、 特に、 ァルゴ ンレーザーのような適切な供給源からのエネルギー吸収による刺激に引き続いて、 検知可能な発光放射を生じる蛍光色素基である。

— c=o

〔式中、 wはカルボキシル基を表し、 Xは一 O— — S — NR' ― (但し、 R' は、 水素原子、 低級アルキル基、 ァラルキル基又はァリール基を表す） 又は一 CH₂—を表し、

環 A及び環 Bは何れか一方が

であり、 他方力';

であり （但し、 Zは、 O又は N + RiR₂を表し、

Yは、 〇H又は一 NI^I^ を表し、 （但し、 R,及び R₂は、 夫々独立して水素原 子又は低級アルキル基を表すか、 または、 R, 及び R₂ が共にトリメチレン基を 表す （但し、 該 2つのトリメチレン基の各他端は、 該 2つのトリメチレン基を有 する窒素原子が結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の両隣 の炭素原子の何れか一方とそれぞれ結合している） ） ） 、

環 C

に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味し、 上記環 A B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更に置換基を有していても よい c 〕 c X

一般式 〔VI I 〕 に於いて、 Xとして表される一 N R ' —に於ける R ' で示される 低級アルキル基としては、 直鎖状、 分枝状或いは環状の何れにても良く、 例えば 炭素数 1 6のアルキル基が挙げられ、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n—プ 口ピル基、 イソプロピル基、 n —ブチル基、 イソブチル基、 sec-ブチル基、 ベン チル基、 イソペンチル基、 tert—ベンチル基、 1 一メチルベンチル基、 n キ シル基、 イソへキシル基、 シクロプロピル基、 シクロベンチル基、 シクロへキシ ル基等が挙げられる。 R ' で示されるァラルキル基としては、 例えば炭素数 7 20 のァラルキル基が挙げられ、 具体的にはべンジル基、 フエネチル基、 フエ二 ルブロピル基、 メチルベンジル基、 メチルフエネチル基、 ェチルベンジノレ基、 ナ フチルメチル基、 ナフチルェチル基等が挙げられ、 また、 ァリール基としては、 例えばフエニル基、 トリル基、 キシリル基、 ナフチル基等が挙げられる。

一般式 〔VI I 〕 に於いて、 Zとして表される = N⁺ R , R₂又は Yとして表される — N R ! I^に於ける 及び R₂ で示される低級アルキル基としては、 直鎖状、 分枝状或いは環状の何れにても良く、 例えば炭素数 1 6のアルキル基が挙げら れ、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n—ブロピル基、 イソプロピル基、 n—ブ チル基、 イソブチル基、 sec-ブチル基、 ベンチル基、 イソベンチル基、 tert—べ ンチル基、 メチルペンチル基、 n キシル基、 イソへキシノレ基、 口ブ 口ピル基、 シクロベンチル基、 シクロへキシル基等が挙げられる。

上記一般式 〔VI I〕 に於いて、 Wで示されるカルボキシル基が下記一般式 〔VI I I〕 に示す如き位置に結合している場合、

〔VIII〕

本発明の 3'-デォキシリポヌクレオチド誘導体に於ける蛍光色素基の部分は、 下 記式の何れの状態をも取り得る。

また、 該カルボキシル基は、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩、 リチウム塩等の アルカリ金属塩、 例えばバリウム塩等のアルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩、 例えばトリエチルアンモニゥム塩、 ピリジン塩等の有機アミン塩等の塩を形成し ていてもよい。

上記一般式 〔VI I 〕 に於いて、 環 A又は環 Bに於ける置換基 Zが = N⁺ R , R₂で あり、 Yがー N R! R₂である場合で、 R ,及び R₂が共にトリメチレン基を表し、 該 2つのトリメチレン基の各他端が、 該 2つのトリメチレン基を有する窒素原子 が結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の両隣の炭素原子の 何れか一方とそれぞれ結合している場合としては、 例えば下記式で示すものが挙 げられる。 C X

上記一般式 〔VII 〕 に於いて、 環 C

に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味する ものであるが、 これを具体的に示すと、 例えば以下の如くになる。

即ち、 環 Aが

である場合は、 環 Cに於ける結合手の位置は以下に示す如きであり

また、 環 Bが

である場合は、 環 cに於ける結合手の位置は以下に示す如きである.

Xが— NH—である場合、 環 A (又は環 B) と環 Cとは、 下記に示す何れ の状態をも取り得る：

上記一般式 〔VI I 〕 に於ける環 A B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更 に置換基を有していてもよいが、 このような置換基としては、 アルキル基、 アル コキシ基、 ハロゲン原子等が挙げられる _c

アルキル基としては、 直鎖状、 分枝状或いは環状の何れにても良く、 また、 二重 結合を有していても良く、 例えば炭素数〗 〜 20 のアルキル基が挙げられ、 好ま しくは、 炭素数 1 6の低級アルキル基が挙げられる。 具体的にはメチル基、 ェ チル基、 n—プロピル基、 イソプロビル基、 n —ブチル基、 イソブチル基、 sec- ブチル基、 ペンチル基、 イソベンチル基、 tert—ペンチル基、 1 一メチルベンチ ル基、 n—へキシノレ基、 イソへキシル基、 シクロブ口ビル基、 シクロベンチル基、 シクロへキシル基等が好ましく挙げられる。 アルコキシ基としては、 低級アルコ キシ基、例えば炭素数 1 6のアルコキシ基が好ましく、具体的にはメ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 イソブロボキシ基、 n—ブトキシ基、 ベンチル ォキシ基、 イソペンチノレォキシ基、 tert—ペンチ/レオキシ基、 1—メチルベンチ ルォキシ基、 n キシルォキシ基、 イソへキシルォキシ基等が挙げられる。 ま た、 ハロゲン原子としては、 フッ素、 塩素、 臭素、 沃素等が挙げられる。

上記一般式 〔VI I 〕 で示される蛍光色素基としては、 より具体的には、 例えば 5 (または 6 ) カルボキシテトラメチルローダミン （以下、 T M Rと略記する。 ) 、 5 (または 6) カルボキシローダミン X (以下、 XRと略記する。 ） 、 5 (また は 6) カルボキシローダミン 6 G (以下、 R 6 Gと略記する。 ) 、 5 (または 6) カルボキシ口一ダミン 1 1 0 (以下、 R 1 1 0と略記する。 ) 、 5 (または 6) カルボキシフルォレツセイン、 5 (または 6) 力ルポキシー 2， ， 7 ' ージクロ 口フルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシー 2' ， 4， ， 5， ， 7 ' —テ トラクロ口フゾレオレツセィン、 5 (または 6) 力/レポキシ 4， 7ージクロロ一 2 ' ， 7 ' ージメ トキシフノレオレツセイン、 5 (または 6) 力ノレボキシー4， 7 , 4 ' ， 5 ' ーテトラクロロー 2' ， 7 ' ージメ トキシフルォレツセィン、 5 (または 6) カルボキシー 4' ， 5 ' ージクロロー 2' ， 7 ' —ジメ トキシフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシー 4， A7—ジクロロ一 1 ' ， 2' ， 7 ' ， 8 ' —ジ ベンゾフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ一 4， 7—ジクロロー 1 ' ， 2' , 7' ， 8 ' ージベンゾフルォレツセイン等の蛍光色素から誘導されたもの が好ましく挙げられる。

一般式 〔 I〕 で示される本発明の 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 例え ば以下の如き合成スキームに従えば容易に合成することができる。

尚、 下記合成スキーム中、 R₄ は上記した如き蛍光色素基を表わす。 また、 下記 合成スキームに於いて使用される略称の正式名は下記の通りである。

C AN ：硝酸二アンモニゥムセリウム （IV) 、

A c OH ：酢酸、

NP ETFA : 5—トリフルォロアセタミ ドー 1一ベンチン

NHET F A： 6— ト リフルォロアセタミ ドー 1一へキシン

NOT F A ： 8—トリフルォロアセタミ ドー 1ーォクチン E t₃ N ： トリエチルァミン、

(P h₃ P) ₄ P d ：テ トラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) 、 DMF ： N, N—ジメチルホルムアミ ド、

NHT f a ： トリフルォロアセタミ ド、

(E t O) PO ： リン酸トリエチル、

T r i s (TB A) P P ： ト リス （ト リー n—ブチルアンモニゥム） ピロホスフ ェ一ト、

TEAB ：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液、

TBDMS C 1 ： ten—ブチノレジメチノレシリルク ロ リ ド、

THF :テトラヒ ドロフラン、

TCD 1 ： 1 , 1 ' —チォカルボニルジイミダゾ一ル、

n - B u ₃ S n H ：水素化一 トリー n—ブチルすず、

A I B N ： 2 , 2 ' —ァゾビス （ィソブチロニ トリノレ） 、

p y r . ： ピリジン、

n - B u NF ： テ トラブチルアンモニゥムフルオラィ ド、

A c₂ O ：無水酢酸、

Me OH ： メタノール、

N I S ： N—ョードコハク酸ィミ ド、

S TC ： 4—チォクレゾ一ル、

HMP A ：へキサメチルホスホルァミ ド、

MCPBA ： m—クロ口過安息香酸、

R⁴ -0 S u ： 蛍光色素基のコハク酸ィ ミジルエステル体- ( 1 ) 蛍光標識 3'-デォキシゥリジン 5' — トリホスフヱ一ト （一般式 〔 I〕 こ於いて、 V がー C三 C—であって、 η = 4の化合物） の合成

H〇

(2) 蛍光標識 3'-デォ: 5 ' — トリホスフェート （一般式 [； I〕 に於いて、 V が— C三 C一であって、 n = 4の化合物） の合成 _c

(3) 蛍光標識 3'-デォキシシチジン 5' — トリホスフェート （一般式 〔 I〕 こ於いて、 V が— C≡C一であって、 _n==6の化合物） の合成

q¾s Pd

I。

(4) 蛍光標識 7—デァザ— 3，-デォキシアデノシン 5， 一 トリホスフェー ト (一般式 〔 I〕 に於いて、 V が— C≡C一であって、 n = 4の化合物） の合成-

(5) 蛍光標識 7—デァザ— 3，一 5， 一 トリホスフ . (一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C一であって、 _n = 6の化合物） の合成:

(6) 蛍光標識 7—デァザ一 3，-デォキシグアノシン 5， 一 トリホスフェート (一般式 〔 I〕 に於いて、 V が一 C三 C一であって、 n = 4の化合物） の合成.

32

(7) 蛍光標識 3，-デォキシゥリジン 5， 一トリホスフェート （一般式 〔 I〕 ：於いて Vが— CH=CH—であって、 n = 4の化合物） の合成 _c

H,,

34

二於いて Vが— CH=CH—であって、 n = 4の化合物） の合成 _c

(9) 蛍光標識 7—デァザ一 3'-デォキシシチジン 5 ' — トリホスフェー ト (一般式 〔 I〕 に於いて Vがー CH = CH—であって、 n = 4の化合物） の合成—

( 1 0) 蛍光標識 7—デァザ一 3，-デォキシアデノシン 5， 一 トリホスフエ ト （一般式 〔 1 ] に於いて Vがー CH = CH—であって、 n = 4の化合物） の 合成。

( 1 1 ) 蛍光標識 7—デァザ一 3'-デォキシグアノシン 5' — トリホスフエ ート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが— CH = CH—であって、 n = 4の化合物） の 合成。

本発明の 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 RN Αポリメラ一ゼを用いる 連鎖停止法による DN A塩基配列決定法に於ける RN A伸長反応停止剤として非 常に有効であるので、 これらを用いることにより DN A塩基配列を簡便且つ短時 間に決定することができる。 即ち、 塩基配列を決定すべき鎵型 DN Aを各 RN Aポリメラ一ゼのプロモータ一 の下流に繋ぎ、 アデニン （A) 、 グァニン （G) 、 シトシン （C) 、 ゥラシル （U) の 4種類のリボヌクレオチドと該リボヌクレオチドに対応する本発明の異なる蛍 光色素で修飾された 4種の 3，-デォキシリボヌクレオチド誘導体の存在下で各塩 基の部位で RN Aポリメラ一ゼの伸長停止反応を行い、 それらの産物を混合して 1つのレーンで電気泳動した後、 レーザーの励起による蛍光波長を分光すること により DN A塩基配列を逐次決定することができる。

上記の如き R N Aポリメラーゼを用いる連鎖停止法に於レ、て使用される R N Aボ リメラーゼとしては特に限定されないが、 伸長反応のァロセッシビティの高いプ 口モータ一依存型ファージ由来の RNAボリメラーゼが好ましく挙げられる。 こ れら RN Aポリメラーゼの具体例としては、 T 7 RNAボリメラーゼ、 T3 RN Aポリメラーゼ、 S P 6 RNAポリメラーゼ等が挙げられる ₌

以下に、実施例及び参考例並びに実験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明はこれらにより何等限定されるものではない。 実施例

参考例 1

3， -デォキシ- 5—ョードシチジン （前述の合成スキーム中の化合物 6に相当。 以 下、 化合物 6と略記する。 尚、 以下の化合物についても同様に合成スキーム中の 化合物を夫々示す。 ） の合成

3， -デォキシシチジン （化合物 5 ： 3.0g， 13.2画 ol)を 1,4-ジォキサン （300ml ) とエタノール （30ml) の混合溶液に懸濁させ、 10^CCまで冷却させた後、 トリフル ォロ酢酸銀 （7.0g，31.7mmol)及びヨウ素 （8.04g， 31.7mmol)を添加し、 室温で 2 時間撹拌した。 反応終了後、 沈澱物をセライ トを通して濾別し、 1，4-ジォキサン で洗浄し、 ろ液と洗液を合わせて濃縮して、 3' -デォキシ -5—ョードシチジン （化 合物 6 ) を 3.84g 得た （収率 4% ) 。

1H-NMR (270MHz, DMSO— d6) δ ppm: 1.64— 1.70 (m, 1H, 3'— Ha) , 1.88—1.99 (m, 1H, 3' - Hb), 3.60-3.89 (m, 2H, 5' -Ha, b) , 4.20-4.21 (m, 1H, 4，-ト 1)， 4.37-4.39 (m, 1H， 2'-H), 5.59 (s, 1H, H)， 7.58 (brs, 1H, NH 2 a), 8.41 (brs， 1H， NH 2 b), 8.79 (brs, 1H, 6— H)

参考例 2

5-トリフルォロアセタミ ド -1 ベンチンの合成

水素化ナトリウム （⁶0%油性； 5.99g, 0. mol ) の DMF (340ml ) 溶液にトリ フルォロアセタミ ド （19.2g，0.17mol ) を氷冷下、 10 回にわけて添加した。 次 いでヨウ化ナトリウム （20.4g, 0.136tnol) を加え、 その後 5-クロ口 _1一ペンチ ン （13.⁹7g, 0.136mol ) のジメチルホルムアミ ド （DMF) (50ml) 溶液を加て、 室温で 4.5 時間、 次いで 60°Cで 21時間撹拌反応させた。 反応液を冷却後、 リン 酸二水素力リウム （59.2g)水溶液（500ml )を加え、 この溶液をエーテル（500ml ) で抽出した。 エーテル層を水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮 し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一（溶出液；へキサン -酢 酸ェチル混合溶媒）で精製して、 5-トリフルォロアセタミ ド -1-ペンチン 17.6gを 得た （収率 67% ) 。

1H -剛 R (270MHz， CDC1 3) δ ppm: 1.83 (m, 2H, -CH₂ CH₂CH₂-) , 2.04 (t, 1H， J=2.7Hz, H-CC-) , 2.31 (dt, 2H， J=2.7, 6.6Hz, — CCCH₂— ) , 3.52 (q, 2H, J=6.7Hz, CH₂N) , 6. 88 (brs, 1H， NHTfa)

参考例 3

3'-デォキシ -5- (5' トリフルォロアセタミ ド- 1 "-ペンチニル） シチジンの合 成

3，-デォキシ -5- ョードシチジン （化合物 6 ： 777mg, 2. 20mmol)の DMF ( 1 1ml ) 溶液に窒素気流下、 参考例 2で得た 5-トリフルォロアセタミ ド- 1- ペンチン

( 1. 18g, 6. 60mmol)、 よう化銅 （ I ) (83. 8m_g， 0. 44圆 ol)、 テ トラキス （トリフ 工ニルホスフィン） パラジウム （0 ) (254nig, 0. 22mmo l)及びト リェチルァミン

(0. 613ml , 4. 4圆 ol )を加え室温で 30分間反応させた。反応液を塩化メチレン -メ タノール混液（20ml ) で希釈しイオン交換樹脂 AG 1X8 (バイオラド社製： HC0₃—型；

2. 02g ) を加え 30 分間撹拌した 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカ ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノ一ル混合溶液） で 精製し、 メタノール-エーテル混合液より結晶化して、 新規物質 3， -デォキシ- 5-

(5"- トリフルォロアセタミ ド - '-ベンチニル） シチジン 409mg を得た （収率 46. 0% ) _:

融点 19卜 193 。C

1H-NMR (270MHz, DMSO— d6) 6 ppm: 1. 63-1. 78 (m, 3H, 3' -Ha and CH₂ CH₂CH₂N) , 1. 86-1. 96 (m， 1H, 3' _Hb)， 2. 39-2. 44 (m, 2H, CH,CH₂CH₂N) , 3. 27-3. 31 (m, 2H, CH₂N) ,

3. 51-3. 82 (m, 2H, 5' -Ha, b) , 4. 12-4. 31 (m, 2H, 2'— H and 4'— H) , 5. 15 (t, 1H, J = 5. 1Hz, 5' -OH) , 5. 51 (d, 1H, J = 4. lHz， 2'— OH)， δ. 62 (s, 1H, H)， 6. 69 (brs, 1H, 4-NHa) , 7. 64 (brs, 1H, 4- NHb)， 8. 30 (s， 1H， 6 - H)， 9. 50 (brs, 1H, NHTfa) 参考例 4

トリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートの合成

ピロリン酸テトラナトリウム十水和物 （2.23g ) を水 （50ml) に溶解し、 イオン 交換樹脂ダウエックス 50WX8 (ダウエックス社製； H+ 型、 45ml) のカラムに通 した _c カラムは更に水で溶出し、 溶出液の pH がほぼ中性になるまで集めた ト リー n—ブチルァミン （3.55ml) を溶出液に加え良く撹拌した。 混合液を減圧濃 縮し残渣はエタノール、 ピリジン、 DMFで更に共沸濃縮乾固した。 得られた残 渣を乾燥 DMFに溶解し 10mlにメスアップして 0.5M濃度のトリス （トリ一 n— ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ一 卜を得た：

参考例 5

5- (5"-ァミノ- Γ' -ペンチュル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ一卜の 合成

3，-デォキシ- 5- (5"-ト リ フルォロアセタ ミ ド- -ベンチニル） シチジン (121mg, 0.3議 ol)をリン酸トリェチル （1.21ml) に溶解し、 一 20。Cまで冷却した 後ォキシ塩化リン （25//1 ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ 塩化リン （22 μ ΐ ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した ₌ この反応液を、 一 20°Cに 冷却した参考例 4で得たトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ一 トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了 後、 トリェチルァミン-水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 (20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得 た残渣を DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （東ソ一社 製： 1.7 X30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M → 0.3M 直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5- (5"-アミノ- '-ペン チェル） - 3' 0 トリホスフェート 105mgを得た（収率 36· 6%)—一 参考例 6

XR—標識 3'-デォ 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、

V がー C≡C一であって、 n = 3の化合物） の合成

5- (5"—ァミノ- '-ペンチニル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ一ト （8 μπιοΐ) を溶解した DM F (300 μ 1) -水 （300 μΐ) 混合液に、 トリェチルァミン

(Ιθμ 1) と 5-カルボキシ -X-ローダミンコハク酸イ ミ ドエステル （モレキユラ —プロ一ブ社製） （26.9 mol ) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパ一ルイオン交換カラムクロマ トグラフィー

(l.7X15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M -→ 0.7M直線濃度勾配 （全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される XR -標識 3'-デ ォキシシチジン- 5' -トリホスフ. ト 〔一般式 U〕 に於いて、 V が一 C≡C 一であって、 n = 3の化合物。 以下、 XR— 3 ' d CTP (n 3) と略記する。 〕 6.28μπιο1 を得た （収率 78.5% ) _r.

また、 得られた XR- 3 ' d CTP (n 3) を、 D U 640紫外可視分光解析シ ステム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スべク トルを測定した結 果 （測定波長： 700nm〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1に示す。

参考例 7

6-トリフルォロアセタミ ド-卜 へキシンの合成

1 ) 5-へキシュル- p- トルエンスルフォネートの合成

氷冷した塩化 p-トルエンスルフォニル （20. l lg, 105. 5mmol)のヒ リシン (30ml 溶液に 5-へキシン- 1-オール （東京化成 （株） 製； ^^ ^ 圆^ を滴下し、 そ の後室温で 20時間撹拌した。 反応液に水 （15ml ) を加え攪拌した後水 （500ml ) に投入した この溶液をエーテル （300ml ) で抽出し、 エーテル層を冷 1 N- 塩 酸、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥 後減圧下に濃縮して、 5-へキシュル- P-トルエンスルフォネート 7. 33gを得た（収 率 32% ) 。

2 ) 6-ョード -1—へキシンの合成

5-へキシュル- p-トルエンスルフォネート （7. 33g, 33. 3mmol)、 よう化ナトリウム

(4. 99g, 33. 3mmol)およびアセ トン （37ml ) の混合液を 1時間還流反応させた _c 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した。 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロ マトグラフィ一 （溶出液；へキサン） で精製し、 6-ョード -卜へキシン 3. 31g を 得た （収率 54. 8% ) 。

3 ) 6-トリフルォロアセタミ ド- 1- へキシンの合成

水素化ナトリウム （60%油性； 2. 55g，63. 6mol ) の D M F (50ml) 溶液にトリフ ルォロアセタミ ド （8. 9⁹g，⁷⁹. 6mmol )を氷冷下、 約 10部分にわけて添加した。 次 いで 6-ョード -1- へキシン （3· 31 g, 15. 9mmol)の D M F ( 15ml) 溶液を加えた _c 反応液を室温で 4時間撹拌した。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水 （100ml ) お よびエーテル （100ml ) を加え抽出した。 エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥 後減圧下に濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出 液；へキサン-酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 6-トリフルォロアセタミ ド- 1 - へキシン 2. 0gを得た （収率 65. 4% ) 。

融点 41. 0-42. 5 。C

1H-NMR (270MHz, CDC1 ₃ ) δ ppm: 1. 53-1. 80 (m, 4H， - C¾ (CH ,) ,-) , 1. 98 (t, 1H， J=2. 7Hz, H-CC-) , 2. 26 (dt, 2H, J=2. 5, 6. 7Hz, CC— CH₂— ) , 3. 41 (q, 2H, J=6. 8Hz, CH₂-N ) , 6. 48 (brs, 1H, NHTfa)

参考例 8

3， -デォキシ- 5— （6"— トリフルォロアセタミ ド -Γ'-へキシュル） シチジン （化 合物 7 ) の合成

3，-デォキシ- 5—ョ一ドシチジン （化合物 6 ： 800mg， 2. 27國 ol)の DMF (1 1. 4ml) 溶液に窒素気流下、 参考例 7で得た 6-ト リ フルォロアセタミ ド- 1- へキシン

(1. 31g, 6. 80mmol) , よう化銅 （ I ) (86. 3mg， 0. 453mmol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0 ) (262mg， 0. 227mmol)及びトリェチルァミン

(0. 632ml, 4. 53mmol)を加え室温で 30分間反応させた。反応液を塩化メチレン-メ タノール混液 （20ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃—型； 2. 02g ) を加 え 30 分間撹袢した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合溶液） で精製し、 メタ ノール— エーテル混合液より結晶化して、 新規物質 3'-デォキシ- 5- (6"- トリ フルォロアセタミ ド- Γ'-へキシニル） シチジン （化合物 7 ) 399mg を得た （収率 42. 1% ) 。 融点 195-197 °C

1H-匪 R (270MHz, DMS0-d6) 5 ppm: 1.52-1.69 (m， 5H, 3' - Ha and CH₂ g¾ ¾CH₂N) , 1.86-1.96 (m, 1H, 3' - Hb)， 2.39-2.50 (m, 2H, CC 一）， 3.18-3.28 (m, 2H, CH₂N) , 3.50— 3.83 (m， 2H, 5' - Ha, b)， 4.11-4.33 (m, 2H, 2'— H and 4' - H)， 5.14 (t, 1H, J = 4.9Hz, 5' -OH) , 5.50 (d, 1H， J = 4.0Hz, 2'— OH), 5.62 (s, 1H， — H) , 6.65 (brs, 1H, 4-NHa) , 7.59 (brs， 1H, 4— NHb)， 8.29 (s, 1H, 6— H) , 9.41 (brs, 1H， NHTfa)

参考例 9

δ- (6 "—ァミノ -1' へキシュル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ一ト （化 合物 8) の合成

3'-デォキシ- 5— (6"— トリフルォロアセタミ ド -Γ'-へキシュル） シチジン （化 合物 7 ： 125.5mg,0.3画 ol)をリン酸トリェチル （1.26ml) に溶解し、 一20°Cまで 冷却した後ォキシ塩化リン （25.11 μ 1 ) を添加し一 20⁼Cで撹拌した。 30 分経 過後、 ォキシ塩化リン （22.32 μ 1 ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反 応液を、 一 20=Cに冷却したトリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ ートを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア 水 （20ml) を加え 4時間静置した- 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して 得た残渣を DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1·7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直線 濃度勾配（全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5 - （6"-ァミノ- 1"-へキシニル） -3' - -5' -トリホスフェート （化合物 8 ) 200mgを得た （収率 69.0% ) 。 実施例 1

XR—標識 3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成

5- (6"-ァミノ- '-へキシュル） - 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （化 合物 8 ： ΙΟμπιοΙ ) を溶解した DMF (300 μ 1) 一水 （300// 1) 混合液に、 トリ ェチルァミン （10 / 1) 、 5-カルボキシ一 X—口一ダミンコハク酸イミ ドエステ ル （モレキュラープローブ社製） （15//mol ) を加え室温で一夜撹拌した。 反応 液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨバ一ルイオン交換カラムクロ マトグラフィ一 （1.7 X 15cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモユウム緩衝液 (pH7.5)0.1M— 0.7M直線濃度勾配 （全量 2L)) で精製して、 下記式で示されるリ ンカ一部のメチレン鎖の nの数が 4個である X R—標識 3，-デォキシシチジン - 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 1 ] に於いて、 V がー C三 C一であって、 n =4の化合物。 以下、 XR- 3 ' d CTP (n 4) と略記する。 〕 8.02 mol を 得た （収率 80.2%) 。

また、 得られた XR- 3 ' d CTP (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析シ ステム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した結 果 （測定波長： 700nm 〜200議 、 対照：蒸留水） を図 2に示す。

参考例 1 0

8-トリフルォロアセタミ ド -1- ォクチンの合成

1 ) 7 -ォクチン- 1一オールの合成

リチウムァセチリ ドエチレンジアミン錯体（アルドリツチ社製； 1 1. 3_g， 122. 5mmo l) とジメチルスルホキシド （50ml ) の懸濁液を 5 〜 10^eCに冷却し、 1 -ブロモ- 6- テ トラヒ ドロビラ二ルォキシへキサン （シグマ社製： 25_g， 94. 3mmol)を 2時間かけ て滴下した。 その後室温で 2時間撹拌した。 反応液に水 （10ml) を加え 10 分間 撹拌した後水 （150ml ) に投入しエーテル （300ml ) で抽出した。 ヱ一テル層を 水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮し、 油状物として 8- (テ トラヒ ドロビラニルォキシ） - 1-ォクチン 18. l gを得た （収率 91. 2% ) _: 8 - (テ トラヒ ドロビラニルォキシ） -1 -ォクチン （18g， 85. 6mmol)とクロ口ホルム （40ml ) とメタノール ( 140ml ) の混合液にダウエックス 50WX8 (ΙΓ 型、 18g ) を添加 し環流下に 1時間加熱した ₌ 樹脂を濾別後、 濾液を濃縮して得られた残渣をシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液：へキサン 酢酸ェチル混合液） で精 製し、 7-ォクチン - 1- オール 9. 6gを得た （収率 88. 6% ) ：.

2 ) 7-ォクチ二ノレ- p- トルエンスルフォネ一卜の合成

氷冷した塩化 p-トルエンスルフォニル （17. 4g, 91. 3mmo l)のピリジン （30ml ) 溶 液に 7 -ォクチン- 1 - オール （9. 6g, 76. 1瞧 o l)を滴下し、 その後 5 〜10⁼Cで 20時 間撹拌した。 反応液に水 （15ml ) を加え攪拌後反応液を水 （500ml ) に投入しェ 一テル （500ml ) で抽出した。 ヱ一テル層を冷 1N- 塩酸、 飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液および水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後减圧下に濃縮して、 7 - ォクチニル- p- トルエンスルフォネート 18.3g を得た （収率 85.7% ) 。

3) 8-ョード -1ーォクチンの合成

7 -ォクチニル- p— トルエンスルフォネー ト （18.3g, 65.2mmol)、 よう化ナトリウ ム （9.77g，65.2mmol)およびアセ トン （91ml) の混合液を 4時間環流反応した： 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィー （溶出液：へキサン） で精製し、 8-ョード -1-ォクチン 14.5gを 得た （収率 94.2% ) 。

4) 8-トリフルォロアセタミ ド- 1- ォクチンの合成

水素化ナトリウム （60%油性； 9.82g, 245mmol)の DMF (200ml ) 溶液にトリフ ルォロアセタミ ド （34.7g， 307隱 ol)を氷冷下、 10回にわけて添加した。 次いで 8- ョ一ド - 1- ォクチン （14.5 ，61.4画₀1)の131 1⁷ (60ml) 溶液を加え、 室温で 2 時間撹拌させた。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水溶液 （400ml ) およびェ一テ ル （400ml ) を加え抽出した。 エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥後减圧下に 濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液；へキサ ンー酢酸ヱチル混合溶媒） で精製し、 へキサンより結晶化して 8-トリフルォロ ァセタミ ド- 1- ォクチン 10.8g を得た （収率 79.3% ) ,

融点 29.5-30.0 °C

1H-NMR (270MHz, CDC1₃ ) 6 ppm:l.36-1.63 (m, 8H， -CH₂ (CH₂1₄-) , 1.94(t, 1H， J=2.7Hz, H-CC-) , 2.20 (dt, 2H, J=2. δ, 6.7Hz, CC - CH₂- )， 3.37 (q, 2H, J=6.8Hz, CH₂ - N ), 6.28 (brs, 1H, NHTfa)

参考例 1 1

3， -デォキシ- 5— （8 "—トリフルォロアセタミ ド -1"-ォクチュル） シチジン （化 合物 9) の合成

3' -デォキシ -5—ョードシチジン （化合物 6 ： 450mg, 1.27mmol)の DMF (6.4ml) 溶液に窒素気流下、 参考例 1 0で得た 8-トリフルォロアセタミ ド- 1- ォクチン

(846mg， 3.82mmol)、 よう化銅 （ I ) (48.5mg, 0.25誰 ol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0) (147mg, 0.127imol)及びトリェチルァミン

(0.355ml, 2.55mmol)を加え室温で 30分間反応させた ₌ 反応液を塩化メチレン一 メタノール混液 （12ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC( 型； 1.17_g) を加 え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合溶液） で精製し、 メ タノ一ルーエーテル混合液より結晶化して、 新規物質 ₃'—デォキシー ₅— (₈"- ト リフルォロアセタミ ド -1' ォクチニル） シチジン （化合物 9) 219mg を得た （収 率 38.5% ) _:

融点、 165-167 ⁼C

1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) ό pptn: 1.27-1.54 (m， 8H, -(CH. -) , 1.63-1.69 (m, 1H， 3' - Ha)， 1.86-1.97 (m， 1H, 3'— Hb)， 2.37(t, 2H, J=7.0Hz， CCCH₂) , 3. M - 3.21 (m, 2H, CH₂N)， 3.49-3.56 (m, 1H, 5'— Ha), 3.75—3.81 (m， 1H, 5' - Hb)， 4.08-4.31 (m, 2H, 2' -H and 4' H) , 5.13 (t, 1H, J = 5.0Hz, 5' -OH) , 5.49 (d, 1H， J = 4. lHz， 2' - OH), 5.62 (d, 1H, J=1.4Hz, Γ H)， 6.62 (brs, 1H， 4-NHa) , 7.58 (brs, 1H,

4- NHb) , 8.28 (s， 1H, 6-11) , 9.41 (brs, 111, NHTfa)

参考例 1 2

5- (8"—アミノ- 1' ォクチュル） - 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （化 合物 1 0) の合成。 3'-デォキシ -5- (8"- トリフルォロアセタミ ド- Γ'-ォクチ二ル） シチジン （ィ匕 合物 9 ： 134mg, 0.3画 ol)をリン酸トリェチル （1.34ml) に溶解し、 一 20^CCまで冷 却した後ォキシ塩化リン （25.11 μ 1 ) を添加し— 20^eCで撹拌した。 30 分経過 後、 ォキシ塩化リン （22.32 μ 1 ) を追加し、 さらに 3.5 時間撹拌した。 この 反応液を、 一 20¾に冷却したト リス （トリ -_η- ブチルアンモニゥム） ピロホスフ エートを 0.5Μ含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応 終了後、 トリヱチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニ ァ水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DE AE- トョパールイオン交換カラムク口マトグラフィ一（1.7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリュチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M — 0.3M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5 - （8"- アミノ- -ォクチュル） - 3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （化合物 1 0 ) 2⁶²mg を得た （収率

50.0% ) _c

実施例 2

X R—標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 _n = 6の化合物） の合成

5- (8"—ァミノ- 1" -ォクチュル） -3，-デォキシシチジン - 5'-トリホスフエ一ト （化 合物 1 0 : 8 μ mol ) を溶解した DMF (300 μ 1) -水 （300μ1) 混合液にトリ ェチルァミン （ΙΟμΙ) と 5-カルボキシ- X-口一ダミンコハク酸イ ミ ドエステル (モレキュラープローブ社製） （12 μ mol ) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液 に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパ一ルイオン交換カラムクロマ トグラフィー （1.7 X 15cm；溶出液：炭酸水素ト リェチルァンモユウム緩衝液 (_PH7.5)0.1M -0.7 直線濃度勾配 （全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される

XR-標識- 3'-デォ: トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、

V が一 C≡C一であって、 ₁1 = 6の化合物。 以下、 XR- 3 ' d CTP (n 6) と略記する。 〕 5.34 ίπιο1 を得た （収率 66· 7% ) 。

また、 得られた X R— 3 ' d CT P (n 6) を、 D U 6 4 0紫外可視分光解析シ ステム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スベタ トルを測定した結 果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 3に示す。

参考例 1 3

6—クロ口— 9— {2，，5' -ビス (0-tert- ル） - 3 0- [ (ィ ミダ ゾ一ル -1 -ィル） チォカルポニル] 一 β - D -リボフラノシル } -7-デァザブリン （化 合物 1 3 ) の合成

6-ク ロ 口 - 9- ( ;3 - D-リ ボフラ -7 -デァザプリ ン （化合物 1

3.58g， 12.5mmol)を THF ( 160ml) に溶解後、 ピリジン （5. lml, 62.7mmol)、 硝酸 銀 ( 4.68g, 27.6mmol) 及び tert 一ブチルジメ チルシ リ ルク 口 ライ ド (4.16g，27.6闘 ol)を添加し、 室温で一晩撹拌した ₌ 反応終了後、 沈澱物をセラ ィ トを通して濾別し、 濾液を濃縮、 クロ口ホルムに溶解後、 0.2N塩酸及び飽和 食塩水にて洗浄した。 クロ口ホルム層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、 クロ 口ホルムを留去し、 新規物質 6 -クロロ- 9一 [2, 5-ビス （0-tert—ブチルジメチ ルシリル） — /3-D- リボフラノシル] -7—デァザプリン （化合物 1 2) 6.42g を 定量的に得た。 このものを更に精製することなく DMF (120ml ) に溶解後、 1, 1'_ チォカルボエルジイミダゾ一ル （13.36g, 75.0瞧 ol)を添加し、 室温でー晚撹拌し た。 反応終了後、 酢酸ェチル及び水を加えたのち、 有機層を飽和食塩水にて洗浄 した： 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 减圧濃縮し、 得られた残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液：酢酸ェチル -n-へキサン混合 溶媒） で精製して、 新規物質 6 -クロロ- 9- '， 5'-ビス （0 - tert-ブチルジメチ ルシリル） - 3'-0- [ (イ ミダゾ一ル- 1-ィル） チォカルポニル] -J3-D-リボフラ ノシル } -7-デァザプリン （化合物 1 3) 4.03g を得た （収率 51.5% ) 。

参考例 1 4

6 -クロ口- 9一 [2'，5'-ビス （0 - tert -ブチルジメチルシリル） _3'-デォキシー）3- D—リボフラノシル] -7—デァザアリン （化合物 1 4) の合成

6-クロ口- 9- {2'，5'-ビス （0 - tert ブチルジメチルシリル） -3' - 0- [ (イ ミダ ゾール -1-ィル） チォカルボニル] - /3-D-リボフラノシル} -7-デァザプリン （化 合物 1 3 ： Og, 6.4immol)をトルエン （200ml ) に溶解後、 2,2'- ァゾビス （ィ ソブチ口二 ト リル） （0.21g, 1.3mmol)及び水素化一 ト リ ー n—ブチルすず (3.45ml, 13mmol)を添加し、 窒素気流下、 80¾：で 30分間撹拌した。 反応終了後、 トルエンを留去し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル- _n- へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 6-クロロ- 9- [2' ,5'-ビス （0-tert-

- 3'-デォキシ- ;3 - D-リボフラノシル] -7- デァザプリン (化合物 1 4) 2.60g を得た （収率 81.5% ) 。

参考例 1 5

₆一クロロー ₉— (3'-デォキシ - j3- D-リボフラノシル） -7-デァザプリン （化合物 1 5) の合成

6-クロ口- 9- [2'，5'-ビス （0- tert-ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ-; S - D- リボフラノシル] - ⁷_デァザプリン （化合物 1 4 ： 2.6g, 5.2睡 ol)を THF (30ml) に溶解し、 1M テトラプチルアンモニゥム フルオライ ド （12.5ml, 12.5mmol)を 添加し、 室温で一晩撹拌した ₌ 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 シリカゲル力 ラムクロマトグラフィ （溶出液： ク口口ホルム- メタノール混合溶媒） で精製し て、 新規物質 6-クロロ - 9- (3'-デォキシ- /3-D-リボフラノシル） -7 -デァザプ リ ン （化合物 1 5) 1.47g を定量的に得た ₌

1H-NMR (270MHz, DMSO- d6) ό ppm: 1.93, 2.23 (m, 2H, 3' -Ha, b) , 3.55, 3.71 (2dd, 2H， J = 4.1, 11.9; 3.2, 11.6 Hz, 5' -Ha, b) , 4.36 (m, 1H, 2' - 11)， 4.45 (in, 1H， 4' - H), 5.02 (brs, 1H, 5' -OH), 5.66 (brs, 1H, 2' - OH)， 6.19 (d， 1H, J = 2.4Hz, l'-H), 6.70 (d， 1H, J = 3.8Hz， 7 - H)， 8.02 (d， 1H, J = 1. lHz， 8 - H)， 8.66 (s, 1H， 2-H)

参考例 1 6

6 -クロロ- 9- (3'-デォキシ- 2' ,5'-ジ- 0-ァセチル -|3-D-リボフラノシル） -7 -デ ァザプリン （化合物 1 6) の合成

6 -クロ口 -9- (3'-デォキシ- β -D-リボフラノシル） -7-デァザプリン （化合物 1 5 ： 1.47g，5.45tnmol)をピリジン （15ml) に溶解後、 無水酢酸 （5ml) を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 に冷却しメタノール （5ml) を加え減圧 濃縮し、 クロ口ホルムに溶解後 0.5N 塩酸及び飽和食塩水にて洗浄した。 クロ口 ホルム層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、 クロロホルムを留去して新規物質 6 -クロ口- 9- (3，-デォキシ- 2' , 5， -ジ- 0-ァセチル -D-リボフラノシル） -7 -デ ァザプリン （化合物 1 6) 2.00g を定量的に得た。

参考例 1 7

6 -クロ口- 7-ョ ード -9- (3'-デォキシ- 2， ， 5' -ジ- 0-ァセチル- β -D-リボフラノシ ル） デァザプリン （化合物 1 7) の合成

6 -クロ口- 9- (3'-デォキシ -2',5'-ジ- 0-ァセチル -|3 - D-リボフラノシル） -7 -デ ァザプリン （化合物 1 6 ： 1.4½,4.07瞧₀1)をァセ 卜二トリル （67ml) に溶解後、 硝酸二アンモニゥムセリゥム（IV) (0.62_g, 2.44國 ol)及びョゥ素（1.12g, 2.03mmol) を添加し、 80 :で 30 分間撹拌した。 反応終了後、 ァセ トニ トリルを减圧濃縮し 酢酸ェチルに溶解後、 5 %亜硫酸水素ナトリゥム溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム 溶液及び飽和食塩水で洗浄した _;：酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去し、 塩化メチレン -ェ一テルで結晶化させ、 新規物質 6-クロ口 -7-ョ一ド -9- (3'-デォキシ- 2'，5'-ジ- 0 -ァセチル -/3-D-リポフラノシル） -7 -デ ァザブリン （化合物 1 7) 1.46gを得た （収率 75.0% ) ：:

融点： 149-150 °C

1H-隱 (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 2.14, 2.17 (2s, 611, 2Ac), 2.23-2.49 (m, 2H, 3'— Ha，b), 4.25- 4.48 (m， 2H, 5' -Ha, b) , 4.58-4.68 (m, 1H, 4' - H) , 5.52-5.54 (m, 1H， 2， — H)， 6.33 (d, 1H, J = 1.4Hz, Γ H)， 7.64 (s， 1H, 8—H) , 8.63 (s， 1H, 2-H)

参考例 1 8 7-ョード - 3'-デォキシ- 7- デァザアデノシン （化合物 1 8) の合成

6-クロ口- 7- ョ一ド- 9- (3'-デォキシ- 2'， 5'- ジ- 0- ァセチル- |3-D- リボフ ラノシル） - 7- デァザブリン （化合物 1 7 ： 1.63g，3.40mmol)とアンモニア- メ タノール （70ml) を 110 ^QCで 20時間反応させた。 反応終了後、 反応液を減圧濃 縮し、 メタノールで結晶化させ、 新規物質 7 -ョ一ド- 3'-デォキシ -7- デァザァ デノシン （化合物 1 8) 1.00g を得た （収率 78.8% ) _c

融点： 223-225 °C (分解）

参考例 1 9

7 -デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- -へキシニル） -3'-デォキシアデ ノシン （化合物 1 9) の合成

7-ョ一ド -3'-デォキシ- 7- デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 220mg, 0.585irmiol)の DMF (3ml ) 溶液に窒素気流下、 参考例 7で得た 6-卜リフルォロアセタミ ド -1 -へ キシン （339mg， 1.75國 ol)、 よう化銅 （ I ) (22.3mg， 0. llTmmol), テ トラキス （ト リフエニルホスフィン） パラジウム （0) (67.5m_g，0.058mmol)及びトリェチル ァミン （0.163ml, 1.17議 ol)を加え室温で 30分間反応させた。 反応液を塩化メチ レン-メタノール混液 （6ml ) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃—型； 0.55_g ) を加え 30 分間撹拌した- 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィ （溶出液； クロロホルム-メタノ一ル混合溶液） で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド -Γ へキシュル） -3' -デ ォキシアデノシン （化合物 1 9) 210mgを得た （収率 81.6%) 。 1H-刚 R (270MHz， DMS0-d6) ό ppm: 1.55-1.63 (m, 4H， -（CH₂)₂— ), 1.83—1.92 (m, 1H, 3' -Ha), 2.13-2.24 (m， 1H, 3， - Hb)， 2.47-2.52 (m, 2H, CCCH₂ -） ， 3.16 - 3.24 (m, 2H, CH₂N)， 3.46-3.54 (m, 1H， 5' -Ha) , 3.62-3.68 (m, 1H, 5' - Hb) , 4.23—4.38 (m, 2H, 2，— H and 4'-H), 5.03 (t， 1H， J = 5.5Hz, 5，— OH) , 5.56 (d, 1H， J = 4.3Hz, 2' -OH) , 6.01 (d, 1H, J = 2.2Hz, l'-H), 6.60 (brs, 2H, 6- NH₂) , 7.65 (s， 1H， 8 - H)， 8.11 (s, 1H， 2— H)， 9.44 (brs, 1H， NHTfa)

参考例 20

7-デァザ- 7- (6"- アミノ- 1" -へキシニル） - 3'-デォ: シン- 5' -ト リホ スフ ト （化合物 20) の合成

7 -デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-へキシニル） - 3，-デォ： ノシン （化合物 1 9 ： 181mg，0.41咖 ol)をリン酸卜リエチル （1.81ml) に溶解し、 一 20¾：まで冷却した後ォキシ塩化リ ン （34.32 μ 1)を添加し一 20¾：で撹拌した： 30 分経過後、 ォキシ塩化リ ン （30.5μ 1)を追加し、 さらに 4時問撹拌した _c こ の反応液を、 一 20。Cに冷却したトリス （トリ - n- ブチルアンモニゥム） ピロホス フェートを 0.5M含む DMF 溶液 （4.9ml ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反 応終了後、 ト リェチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモ ニァ水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固 して得た残渣を DE AE- トヨバ一ルイオン交換カラムクロマトグラフィー（1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素ト リエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直 線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7- (6"- アミノ- 1" - へキシニル） -3,-デォ: -5' -トリホスフ —ト （化合物 20 ) 283mg を得た （収率 69.6% )

実施例 3

R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォ: '- 5'-トリホスフエ一ト（一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 n = 4の化合物） の合成 7-デァザ- 7- (6"- ァミノ -1 へキシュル） -3'-デォキシアデノシン- 5，-トリホ スフェート （化合物 20 ： 8 / mol ) を溶解した DM F (0.6ml ) —水 （0.3ml ) の混合液に、 トリェチルァミン （ΙΟμ Ι ) と 5-カルボキシローダミン 6 Gコハ ク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （16μπιο1 ) の DMF (1.3ml ) 溶液を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEA E - トヨバールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X30cm；溶出液：炭 酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M -→0.6M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識 7 デァザ- 3'-デォキシアデノ シン- 5にトリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C—であって、 n = 4の化合物。 以下、 R 6 G- 3 ' d AT P (n 4 ) と略記する。 〕 5·33μπιο1 を得た （収率 66.7% ) 。

〔式中、 E tはェチル基を、 また、 VI eはメチル基を夫々示す。 ]

また、 得られた R 6 G— 3 ' d AT P (n 4) を、 Dし 6 4 0紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700_nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 4に示す。 参考例 2 1

7-デァザ- 7— （8"—トリフルォロアセタミ ド- -ォクチニル） -3'

ノシン （化合物 2 1 ) の合成

7-ョ一ド -3'-デォキシ- 7- デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 220mg,0.585mmol)の 匪 F (3ml ) 溶液に窒素気流下、 参考例 1 0で得た 8-トリフルォロアセタミ ド- 1ーォクチン （388m_g， I.75mmol)、 よう化銅 （ I ) (22.3mg, 0.117隱 ol)、 テトラ キス （ ト リ フエニルホスフィン） バラジウム （0) (67.5mg， 0· 058瞧 ol)及びト リエチルァミン （0.163ml， 1. mmol)を加え室温で 30分間反応させた- 反応液を 塩化メチレン-メタノール混液 （6ml ) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃—型； 0.55g ) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカ ゲル力ラムクロマ トグラフィ （溶出液： クロロホルム- メタノ一ル混合溶液） で 精製して、 新規物質 7-デァザ- 7— (8"- トリフルォロアセタミ ド- -ォクチ二 ル） -3'-デォキシアデノシン （化合物 2 1 ) 216mg を得た （収率 78.⁷% ) -一

1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) ό ppm: 1.29-1.58 (m, 8H, - (CH₂) ₄ -) , 1.83—1.91 (m, 1H， 3'— Ha), 2.14-2.24 (m, 1H, 3'— Hb)， 2.44-2.51 (m, 211, CCCH₂) , 3.15—3.22(m， 2H， CH₂N), 3.46-3.54 (m, 1H, 5' - Ha) , 3.62-3.70 (m, 1H， 5'- Hb), 4.26-4.36 (m， 2H, 2'—H and 4, - H), 5.04 (t, 1H, J = δ.4Hz, 5' -OH) , 5.56 (d， 1H, J = 4.6Hz, 2 OH) , 6.01 (d, 1H， J = 2.4Hz, 1'— H)， 6.60 (brs, 2ト 1， 6— NH₂)， 7.65 (s, 1ト 1， 8— H)， 8.11 (s， 1H, 2-H), 9.38 (brs, 1H, NHTfa)

参考例 2 2

7 -デァザ - 7 - (8"- ァミノ- -ォクチニル） - 3' -デォキシアデノシン- 5 トリホ スフニー ト （化合物 2 2) の合成 7-デァザ - 7- (8"- トリフルォロアセタミ ド- 1" -ォクチニル） -3，-：

ノシン （化合物 2 1 ： 189mg，0.403隱。1)をリン酸トリェチル （1.89ml) に溶角早し、 — 2( Cまで冷却した後ォキシ塩化リン （33.7 / 1)を添加し一20°じで撹拌した₌ 30 分経過後、 ォキシ塩化リ ン （30·0μ 1)を追加し、 さらに 4時間撹拌した。 この反 応液を、 一 20^CCに冷却した 0.5Μ- ト リス （ト リ- n- ブチルアンモニゥム） ピロ ホスフェー トの DMF 溶液 （4.8ml ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した- 反応終 了後、 ト リェチルァミン- 水混液 （15ml) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア 水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して 得た残渣を DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルァンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.6M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7 -デァザ - 7- (8"- ァミノ- 1"-ォ クチニル） -3'-デォキシアデノシン- 5， -トリホスフエート （化合物 2 2) 143mgを 得た （収率 35% ) 。

実施例 4

R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフエ一ト （一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C一であって、 _n = 6の化合物） の合成

7-デァザ - 7- (8"- アミノ- 1 -オタチュル） -3, -デォキシアデノシン - 5，-トリホ スフヱー ト （化合物 2 2 ： 8 mol ) を溶解した DMF (0.6ml ) -水 （0.3ml ) の混合液に、 トリェチルァミン （ΙΟμ Ι ) と 5-カルボキシローダミン 6 Gコハ ク酸イミ ドエステル （モレキュラーブロ一ブ社製） （16μπιο1 ) の DMF (1.3ml ) 溶液を加え室温で一夜撹拌した ₌ 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEA E - トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X 30cm ;溶出液：炭 酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M →0.6M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識 7 -デァザ- 3，-デォキシアデノ シン- 5， -トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V が一 C三 C一であって、 n = 6の化合物。 以下、 R6G- 3 ' d AT P (n 6 ) と略記する 〕 4.3 ^mol を得た （収率 53.8% )

〔式中、 E Uまェチル基を、 また、 M eはメチル基を夫々示す。 〕

また、 得られた R 6G- 3 ' d AT P (n 6) を、 Dじ 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 5に示す。

参考例 23

3， -デォキシ- 5- ョードウリ (化合物 2) の合成

3'-デォキシゥリ (化合物 1 ： 2.08_g，9. U誦 ol)を酢酸 (75ml) に溶解後、 硝 酸二アンモニゥムセリウム （IV) (2.50g,4.56mmol)及びョゥ素（1.39g, 2.73mmol) を添加し、 8( Cで 30 分間撹拌した： 反応終了後、 酢酸を減圧濃縮し次いでエタ ノ一ル- トルエン混液（l:2v/v;30ml )で 3回、水-エタノ一ル混液（1： 2v/v； 30tnl ) で 3回共沸濃縮し油状物を得た _ε 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトダラ フィ （溶出液；塩化メチ メタノール混合溶媒） で精製して、 3'-デォキシ- 5- ョードウリジン （化合物 2 ) 1.78g を得た （収率 55.08%) 。

1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.89-1.92 (m, IH, 3' -Ha) , 2.17- 2.26 (m, IH, 3' - Hb), 3.51-3.56 (m， IH, 5' - Ha), 3.74—3.79 (m, IH, 5， - Hb) , 4.22 - 4.30 (m， 2H, 2， — H and 4'— H), 5.59 (s, IH, - H)， 8.31 (s, IH, 6 - H) , 11.72(s, 1H， NH) 参考例 24

3，-デォキシ- 5- (6"- トリフルォロアセタミ ド -1 へキシニル） ゥリジン （化 合物 3) の合成

3，-デォキシ- 5- ョードウリジン （化合物 2 ： 805mg, 2.27画 ol)の DMF (12ml) 溶液に窒素気流下、 参考例 7で得た 6-ト リ フルォロアセタミ ド- 1- へキシン

(1.31g, 6.80睡 1)、 よう化銅 （ I ) (86.3mg，0.453圃 ol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） バラジウム （0 ) (262mg, 0.227mmol)及びトリェチルァミン

(0.63ml, .53酬 ol)を加え室温で 4時間反応させた： 反応液を減圧濃縮して得た 残渣を塩化メチレン-メタノール混液（20ml) に溶解しイオン交換樹脂 AG1X8 (バ ィオラド社製， HC0₃— 型； 2g) を加え 30 分間撹拌した:. 濾別後、 濾液を濃縮し 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフ f (溶出液；塩化メチレン- メ タノール混合溶液） で精製して、 新規物質 3'-デォキシ- 5- (6"- トリフルォロ ァセタミ ド- -へキシュル） ゥリジン （化合物 3) 419tngを得た （収率 45.5% ) 1H-NMR (270MHz, DMSO- d6) δ ppm: 1.49-1.64 (m, 4H, (CH₂)₂- )， 1.92 - 1.97 (m, IH, 3， 一 Ha)， 2.17—2.28 (m, IH, 3'— Hb)， 2.39 (t, 2H, J=6.9Hz, - CCCH₂)， 3.21 (q, 2H， J=6.3Hz， CH,N) , 3.49-3.54 (m， 1H_; 5'— Ha), 3.72-3.75 (m, 1H，5' - Hb)， 4.24-4.35 (m, 2H， 2'-H and 4'H) , δ.20 (t, IH, J=4.9Hz, 5' -OH) , 5.52 (d, IH, J=3.8Hz, 2'- OH), 5.75 (s， IH, J = 2.2Hz, Γ— H) , 8.23 (s， IH, 6— H)， 9.42 (brs, IH, NHTf a) , 11.57 (s, 1H, 3-NH)

参考例 2 5

5 - (6"-ァミノ- 1' へキシュル） -3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト （化 合物 4) の合成

3，-デォキシ -5- (6"- トリフルォロアセタミ ド -1" -へキシェル） ゥリジン （化 合物 3 ： 122.5mg, 0.3mmol)をリン酸トリェチル （1.23ml) に溶角 し、 一20°Cまで 冷却した後ォキシ塩化リン （25/i l ) を添加し一 20⁼Cで撹拌した。 30分経過後、 ォキシ塩化リン （22 μ ΐ ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 一 20 に冷却したトリス （トリ- η-ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートを 0.5Μ 含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 4時問撹拌した- 反応終了後、 トリ ェチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を D E AE- トヨパールイオン交換カラムク口マトグラフィ一（東ソ一社製； L 2 X 30cm：溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5- (6"- アミノ- 1"-へキシニル） - 3' -デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト （化合物 4 ) 172mg を得た （収率 60.0% ) 。

実施例 5

TMR- 標識 3，-デォキシゥリジン- 5' -トリホスフヱ一ト （一般式 〔 I〕 に於レヽ て、 V がー C≡ C一であって、 n = 4の化合物） ₌ の合成。

5 - (6"-ァミノ- '-へキシニル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート （化 合物 4 ： 8 μπιοΐ ) を溶解した DM F (300 μ ΐ ) - 水 （300 μ 1 ) 混合液にト リエチルァミン （ΙΟμΙ ) と 5 -カルボキシテ トラメチルローダミンコハク酸ィ ミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （ μπωΐ ) を加え室温で一夜撹拌 した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパ オン交換 カラムクロマトグラフィー （1.7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニ ゥム緩衝液（pH7.5)0.05M→0.7M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下記式 で示される T MR- 標識 3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 1〕 に於いて、 V がー C≡ C一であって、 n = 4の化合物。以下、 TMR- 3 ' d UT P (n 4) と略記する。 〕 5.9 /imol を得た （収率 73.8% ) _c

〔式中、 Meはメチル基を示す。 〕

また、 得られた TMR- 3 ' d UTP (n 4 ) を、 Dじ 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 6に示す。

参考例 26

⁶-メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- 12'，5，-ビス （0-tert - - 3'- 0- [ (イ ミダゾール- 1- ィル） チォカルボニル] - β - D - リボフラ

ン （化合物 25) の合成

6-メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- (/3-D- リボフラ -7- デァザプリン （化

00 合物 2 3 ： 12.86g, 39.28隱 ol) を THF ( 580ml ) に溶解後、 ピ リ ジン

(16.8ml,208mmol), 硝酸銀 （15.55_g, 91.5nmiol)及び tert - ルクロライ ド （13.80g,91.5mmol)を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 沈澱物をセライ トを通して濾別し、 濾液を濃縮、 クロ口ホルムに溶解後、 0.2N 塩酸及び飽和食塩水にて洗浄した。 クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムにて 乾燥後、 クロ口ホルムを留去し、 粗 6 -メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- [2' ,5' -ビ ス (0-tert- β - D- リボフラ -7- デァザブリ ン （化合物 24 ) 24.0gを得た- 得られた化合物 24 (24.0g ) を DMF (400ml に溶解後、 1'-チォカルボ二 ダゾ一ル (35.0g, 196. Smmol)を添力 Πし、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 酢酸ェチル及び水を加えたのち、 有機層を飽 和食塩水にて洗浄した。 酢 層を無水硫酸マ ゥムで乾燥後、 減圧濃 縮し、 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル

- クロ口ホルム混合溶媒） で精製して、 新規物質 6 -メ -2 - メチルチオ - 9-

{2',5 ビス （0- tert- -3' -0- [ (ィミダゾ一ル- 1- ィ ル）チォカルボニル] -iS-ϋ-リボフラ 一 7 リン（化合物 2 5 )20.45g を得た （収率 78.2% )

参考例 2 7

6-メ トキシ- 2-メチルチオ- 9- [2'，5 ビス （0- tert-ブ: ル） - 3' デォキシ- /3- D-リボフラノシル] -7-デァザプリン （化合物 2 6) の合成

6-メ トキシ- 2 -メチルチオ- 9- {2'， 5' -ビス（0- tert-ブ: ル）— 3， - 0 -

[ (ィミダゾ一ル- 1- チォカルボニル] - ;3 - D-リボフラノミ -7-デァザ プリン （化合物 2 5 ： 20.45g, 30.7隱 ol)をトルエン （1L) に溶解後、 2， 2' -ァゾ ビス （イソブチロニトリル） （1.01g， 6. 1議 ol)及び水素化- n-トリブチル すず (16.5ml, 61.4咖 ol)を添加し、 窒素気流下、 80=Cで 30 分間撹拌した。 反応終了 後、 トルエンを留去し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチ ル- n-へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 6-メ トキシ -2-メチルチオ- 9 - [2'， 5' -ビス （0 - tert -ブチルジメチルシリル） - 3，-デォキシ- jS -D-リボフラノ シル] -7-デァザプリン （化合物 2 6 ) 14.57gを得た （収率 87.9%) 。

ォクチュル） - 3，-デォキシアデノシン- 5' _トリホスフェート （化合物 2 2 ) 143mg を得た （収率 35% ) 。

実施例 4

R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5' -卜 リホスフエ一ト （一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 _n = 6の化合物） の合成

₇—デァザ一 ₇_ ₍₈ "— ァミノ— ―ォクチニル） -3'-デォキシアデノシン - 5' -トリホ スフヱ一ト （化合物 2 2 ： 8 ιηοΐ ) を溶解した DM F (0.6ml ) -水 （0.3ml ) の混合液に、 トリェチルァミン （ΙΟμ Ι ) と 5-カルボキシローダミン 6 Gコハ ク酸イ ミ ドエステル （モレキュラーブローブ社製） （【6μ ιτιο1 ) の DMF (1.3ml ) 溶液を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 D E A E- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭 酸水素卜リエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0. 1 →0.6 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識 7-デァザ - 3，-デォキシアデノ シン- 5' -トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 n = 6の化合物- 以下、 R 6 G- 3 ' d AT P ( n 6 ) と略記する。 〕 4.3 μ

を得た （収率 53.8% ) 。 C=0

0 0 0

II II !1

o— p- — 0— P— 0— p-

1 1 1

0一 0一 o一

OH

〔式中、 E Uまェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す。 〕

また、 得られた R 6 G- 3 ' d AT P (n 6) を、 D U 64 0紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm 〜200賺 、 対照：蒸留水） を図 5に示す ₌

参考例 2 3

3' -デォキシ -5- ョードウリジン （化合物 2) の合成

3' -デォキシゥリジン （化合物 1 ： 2.08g，9. limmol)を醉酸 （⁷5ml) に溶解後、 硝 酸二アンモニゥムセリ ゥム （IV) (2.50g，4.56tnmol)及びョゥ素（1.39g, 2· 73mtnol) を添加し、 80⁼Cで 30 分間撹拌した。 反応終了後、 酢酸を減圧濃縮し次いでエタ ノ一ル- トルエン混液（l:2v/v;30ml )で 3回、水-エタノ一ル混液（1： 2v/v； 30ml ) で 3回共沸濃縮し油状物を得た。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ フィ （溶出液：塩化メチレン- メタノール混合溶媒） で精製して、 3'-デォキシ- 5- ョードウリジン （化合物 2) 1.78g を得た （収率 55.08%) _c

1H-NMR (270MHz, DMSO- d6) δ ppm: 1· 89- 1.92 (m, 1H， 3， -Ha) , 2.17- 2.26 (m, 1H, 3' - Hb)， 3.51-3.56 (m, 1H, δ' -Ha) , 3.74-3.79 (m, 111, 5' - Hb) , 4.22 - 4.30 (m, 2H, 2'-H and 4' -H) , 5.59 (s, 1H, Γ— H)， 8.31 (s， 1H， 6— H)， 11.72(s, 1H, NH) 参考例 24 3， -デォキシ- 5- (6"- トリフルォロアセタミ ド-ド-へキシニル） ゥリジン （化 合物 3) の合成

3'-デォキシ- 5- ョ一ドウリジン （化合物 2 ： 805mg, 2.27mmol)の DMF (12ml) 溶液に窒素気流下、 参考例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1- へキシン

(1.31g， 6.80mmol)、 よう化銅 （ I ) (86.3mg, 0.453mmol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） バラジウム （0 ) (262mg，0.227mmol)及びトリェチルァミン

(0.63ml, 4.53mmol)を加え室温で 4時間反応させた。 反応液を減圧濃縮して得た 残渣を塩化メチレン-メタノール混液（20ml) に溶解しイオン交換樹脂 AG1X8 (バ ィオラド社製， HCC 型； 2g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液：塩化メチレン - メ タノ一ル混合溶液） で精製して、 新規物質 3，-デォキシ -5 (6"- トリフルォロ ァセタミ ド- -へキシュル） ゥリジン （化合物 3) 419mgを得た （収率 45.5% ) _c 1H-N R (270MHz, DMSO- d6) ό ppm: 1.49-1.64 (m, 4H, — (CH₂)₂— )， 1.92-1.97 (m, 1H, 3'— Ha)， 2.17-2.28 (m, 1H， 3'— Hb)， 2.39(t, 2H, J=6.9Hz, — CCCH₂) , 3.21 (q, 2H, J=6.3Hz, CH₂N) , 3.49-3.54 (m, 1H， 5'- Ha), 3.72 - 3.75 (m， 1H, 5' - Hb), 4.24-4.35 (m, 2H， 2' -H and 4'H) , 5.20 (t, 1H, J=4.9Hz， 5， - OH)， 5.52 (d, 111, J=3.8Hz， 2' - 0H)， 5.75 (s, 1H, J = 2.2Hz, Γ - H) , 8.23 (s, 1H, 6- H),9.42 (brs， 1H, NHTfa) , 11.57 (s， 1H, 3-NH)

参考例 2 5

5- (6"-ァミノ -Γ へキシュル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト （化 合物 4) の合成

3， -デォキシ- 5- (6"- ト リフルォロアセタミ ド- 1"-へキシェル） ゥリジン （化 合物 3 ： 122.5mg, 0.3瞧 ol)をリン酸トリェチル （1.23ml) に溶角？し、 一20^CCまで 冷却した後ォキシ塩化リン （25 μ 1 ) を添加し一 20⁼Cで撹拌した。 30分経過後、 ォキシ塩化リン （22 μΐ ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 一 20^CCに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートを 0.5M 含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 4時間撹拌した。 反応終了後、 トリ ェチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を D E AE- トヨバ一ルイオン交換カラムク口マ トグラフィー （東ソ一社製； 1.2 X 30cm：溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5 (6"- ァミノ- -へキシュル） 3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト （化合物 4) 172mg を得た （収率 60.0% ) _c

実施例 5

TMR- 標識 3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト （一般式 〔 I〕 に於い て、 V がー C≡C一であって、 n = 4の化合物） 。 の合成. ₌

5- (6"-ァミノ- Γ-へキシェル） -3'-デォキシゥリジン- 5' -トリホスフェート （化 合物 4 ： 8 / mol ) を溶解した DMF (300 μΐ ) - 水 （300 μ 1 ) 混合液にト リエチルァミン （10 1 ) と 5-カルボキシテ トラメチル口一ダミンコハク酸ィ ミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （ ^moi ) を加え室温で一夜撹拌 した _c 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨバールイオン交換 カラムクロマトグラフィー （1.7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニ ゥム緩衝液（ρΗ7.5)0·05Μ→0.7M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下記式 で示される TMR- 標識 3'-デォキシゥリ - 5'-トリホスフエ一ト 〔一般式

〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C—であって、 n = 4の化合物。以下、 TMR- 3 d UTP (n 4) と略記する。 〕 5.9 /imol を得た （収率 73.8% ) 。

〔式中、 Meはメチル基を示す。 〕

また、 得られた TMR- 3 ' d UT P (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 6に示す。

参考例 26

6-メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- {2',5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） - 3'- 0- [ (イ ミダゾール-卜 ィル） チォカルボニル] - /3-D- リボフラノシル} - 7 - デァザアリン （化合物 25) の合成

6 -メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- (|3-D- リボフラノシル） -7- デァザプリン （ィ匕 合物 2 3 ： 12.86g, 39.28mmol) を THF ( 580ml ) に溶解後、 ピ リ ジン (16.8ml, 208mmol)、 硝酸銀 （15.55_g， 91.5mmol)及び tert - ブチルジメチルシリ ルクロライ ド （13.80g，91.5mm₀l)を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 沈澱物をセライ トを通して濾別し、 濾液を濃縮、 クロ口ホルムに溶解後、 0.2N 塩酸及び飽和食塩水にて洗浄した クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムにて 乾燥後、 クロ口ホルムを留去し、 粗 6-メ トキシ -2- メチルチオ- 9- [2'，5'-ビ ス （0- tert- ブ: - -D- リボフラ -7- 'ザブリ ン （化合物 24 ) 24.0gを得た。 得られた化合物 24 (24.0g ) を DMF (400ml ) に溶解後、 1， 1' -チォカルボニルジイミダゾ一ル （35.0g， 196.5mmol)を添加し、 室温で一晩撹拌した。 反応終了後、 酢酸ェチル及び水を加えたのち、 有機層を飽 和食塩水にて洗浄した。 齚酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 減圧濃 縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ フィ （溶出液；酢酸ュチル

- クロ口ホルム混合溶媒） で精製して、 新規物質 6 -メ トキシ- 2- メチルチオ - 9-

{2'，5'-ビス （0-tert -プチ., ル） 3，-()- [ (ィミダゾール -1- ィ ル）チォカルボ二ル]- /3 -D-リボフラノ - 7 -デァザブリン（化合物 2 5)20.45g を得た （収率 78.2% )

参考例 2 7

6-メ トキシ- 2 -メチルチオ - 9- [2'，5'-ビス （0-tert-ブ -3'- デォキシ- jS- D-リボフラ -7-デァザプリン （化合物 2 6) の合成

6 -メ トキシ- 2 -メチルチオ - 9- { 2'， 5' -ビス（0 - tert ブチルジメチルシリル） -3' - 0-

[ (ィ -ル— 1- チォカルボニル] - j3 - D-リボフラ -7 -デァザ ブリン （化合物 2 5 ： 20.45g，30.7画 ol)をトルエン （1L) に溶解後、 2, 2' -ァゾ ビス （ィソブチロニ ト (1. Olg, 6.丄瞧 ol)及び水素化- n-トリブチル すず

(16.5_[111，61.4國₀1)を添加し、 窒素気流下、 80⁼Cで 30 分間撹拌した。 反応終了 後、 トルエンを留去し、 シリカゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチ ル- n -へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 6 -メ トキシ- 2-メチルチオ - 9-

[2，，5'-ビス （0- tert-ブ: ル） - 3'- '- /3- D-リボフラノ -7-デァザプリン （化合物 26) .57gを得た （収率 87.9%) 参考例 2 8

7-ョード- 6 -メ トキシ 2-メチルチオ- 9- [2' ,5'-ビス （O-tert -ブ:

リル） -3'-デォキシ- iS- D-リボフラノ -7-デァザプリン （化合物 2 7) の 合成

6-メ トキシ- 2-メチルチオ- 9- [2'，5'-ビス （O-tert-ブ:

デォキシ- ）3 - D- リ ボフ ラ ノ シル ] - 7- ザプ リ ン （化合物 2 6 ：

15.57g, 28.84mmol)を DMFに溶解し、 ョ一ドこはく酸ィミ ド（7.79g, 34.61画 ol) を加え、 窒素気流下遮光し、 室温で 5時間撹拌した： 反応終了後、 反応液を

：冷却し酢酸ュチノ ,有機層を 5 %チォ硫酸ナトリゥム溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液、 飽和食塩水で洗浄した： 酢酸ェチル層を無水硫酸 マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去し、 シリカゲルカラムクロマトグラフ ィ （溶出液； クロ口ホルム- n -へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 7 -ョ一 ド -6-メ トキシ -2-メチルチオ - 9- [2',5'-ビス （0 - tert-ブチル

-3'-デォキシ -]3- D-リボフラ -デァザアリン （化合物 2 7 ) 19.06g を 得た （収率 99.3%) 。

1H- MR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: —0.10， —0.06， 0.12, 0.13 (4s, 12H， 4MeSi),

0.80, 0.93 (2s, 18H, 2t—Bu)， 1.90-2.10 (m, 1H， 3' -Ha) , 2.18-2.28 (m， 1H,

3' -Hb) , 2.54 (s, 3H， SMe)， 3.72 (dd， 1H, J = 2.7, 11.6Hz, 5，— Ha) , 3.94 (dd, 1H, J = 2.2, 11.6Hz, 5' - Hb)， 4.03 (s， 3H, OMe) , 4.32-4.48 (m, 2H， 2' - H， 4' - H) , 6.07 (d, 1H, J = 3.0Hz, Γ— H) , 7.59 (s， 1H, 8— H)

参考例 2 9 7-ョ一ド -2-メチルチオ- 9- [2',5'-ビス （0-tert -ブ：

デォキシ - ]3- D-リボフラノシル] -7-デァザプリン- 6-オン （化合物 2 8) の合成 4-チォク レゾール （3.36g, 2ァ. Ommol)をメタノールに溶解後、 ナトリ ウムメ トキ シド （1.61g，29.7mmol)を添カ卩し、 5分間撹拌後メタノールを留去した ₌ これに、 トルエン （150ml ) に溶解した ⁷ -ョード- 6-メ トキシ- 2-メチルチオ - 9- [2' , 5' - ビス （0-tert -ブチルジメチルシリル） -3，-デォキシ - ;3 -D-リボフラノシル] -Ί- デァザプリ ン （化合物 2 7 ： 4.00g，6睡 ol)及びへキサメチルホスホルアミ ド (10ml，57.1画 ol)を添加し、 窒素気流下、 4.5 時間還流した。 反応終了後、 酢酸 ェチルと水を加え、 有機層を飽和食塩水で洗浄した： 有機層を無水硫酸マグネシ ゥムで乾燥後減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶 出液：塩化メチレンーメタノ一ル混合溶媒） で精製して、 新規物質 7 -ョード -2 - メチルチオ- 9- [2',5 ビス （0 - tert-ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ- /3 -D -リボフラノシル] - ⁷ -デァザブリン - 6-オン （化合物 2 8 ) 2.35g を得た （収 率 59.9% ) _:

1H-雞 (270MHz, DMS0-d6) ό ppm: 0.06, 0.08， 0.20, 0.24 (4s, 12H, 4MeSi), 0.92, 1.03 (2s, 18H, 2t- Bu), 2.07-2.13 (m, 1H, 3' -Ha), 2, 34—2.38 (m, 1H, 3，— Hb) , 2.63 (s， 3H, SMe), 3.81-4.05 (m， 2H, 5' - Ha, b) , 4.46-4.57 (m， 2H， 2' - H, 4' - H)， 6.12 (d， 1H, J = 3.0Hz, 1 '- H) , 7.47 (s， 1H， 8— H)， 12.44 (s, 1H, 1一 H) 参考例 3 0

7-3—ド -2' , 5'-ビス （0- tert-ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ- 7_デァザ グアノシン （化合物 2 9) の合成

7-ョード -2 -メチルチオ - 9- [2',5'-ビス （0 - tert-ブチルジメチルシリル） - 3'- デォキシ- ]3 -D-リボフラノシル] -7-デァザプリ ン- 6-オン （化合物 2 8 ： 2. 30g，3. 53mmo l)を塩化メチレン （90ml ) に溶解し、 0 ⁼Cに冷却後、 m-クロ口過 安息香酸 （0. 96g, 3. 88隱 ol )を添加し で 15分間撹拌、 さらに室温で 1時間撹 拌した。 反応終了後、 反応液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び飽和食塩水で洗 浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後塩化メチレンを留去した ₌ 得られた残渣を シリカゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロロホルム -メタノ一ル混合溶 媒） で精製しスルホキシド体 2. 02g (収率 83. 9%) を得た ₌ これを 1，4-ジォキ サン （20ml ) に溶解し、 一 78=Cに冷却後、 液体アンモニア （60ml ) を加え、 1 10 C で 6時間加熱した。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣をシリ力ゲ ルカラムクロマ トダラフィ （溶出液；塩化メチレン- メタノ一ル混合溶媒） で精 製して、 新規物質 7-ョード -2' , 5 ビス （0- t ert-ブチルジメチルシリル） - ³，- デォキシ- ⁷_デァザグアノシン （化合物 2 9 ) 1 . 60g を得た （収率 7³. ） 参考例 3 1

3， -デォキシ -7-ョード- 7-デァザグァノシン （化合物 3 0 ) の合成 _c

7-ョ一ド- 2'，5' -ビス （0- t ert-ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ -7-デァザ グアノシン （化合物 2 9 ： 1· 6g, 2. 58mmo l)を THF (50m] ) に溶解し、 1M -テトラ ブチルアンモニゥムフルオライ ド （6. 2ml , 6. 17mmol )を添加し、 室温でー晚撹拌 した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、 シリカゲル力ラムクロマトグラフィ （溶 出液；クロロホルム一メタノール混合溶媒） で精製後、 メタノールで結晶化させ、 新規物質 3'-デォキシ- 7-ョ一ド- ?-デァザグアノシン （化合物 3 0 ) 0. 80g を得 た （収率 79. 1% ) _c

融点： 176-178 ⁼C (分解）

6o 1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.81-1.89 (m, 1H, 3'— Ha)， 2.10-2.20 (m, 1H, 3'— Hb)， 3.43-3.64 (m， 2H， 5'- Ha, b), 4.18-4.29 (m, 2H， 2'— H， 4' - H) , 4.91 (t, 1H, J = 5.5Hz, 5' - OH), 5.46 (d, 1H, J = 4.3Hz, 2， - OH) , 5.80 (d, 1H, J = 2.4Hz, l'-H), 6.30 (brs, 2H， 2— NH2) , 7.10 (s, 1H, 8 - H) , 10.45 (brs, 1H， 1— H) 参考例 3 2

3，-デォキシ- 7- (6"-トリフルォロアセタミ ド 1"-へキシュル） -7-デァザグアノ シン （化合物 3 1 ) の合成

3'-デォキシ- 7-ョード- 7-デァザグアノシン （化合物 3 0 ： 765mg, 2.0隱 ol)の DMF (10ml) 溶液に窒素気流下、 参考例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1-へキ シン （1.16_g，6.0mmol)、 よう化銅 （ I ) (76.4mg， 0.40画 ol)、 テトラキス （トリ フエニルホスフィン） バラジウム （0 ) (226mg，0.20隱 ol)及びトリェチルアミ ン （0.56ml, 4. Ommol)を加え室温で 1時間反応させた， 反応液を塩化メチレン -メ タノ一ル混液 （20ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃— 型； 2.0g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロ マトダラフィ （溶出液： ク口ロホ/レム- メタノー/レ混合溶液） で精製して、 新規 物質 3，-デォキシ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド へキシニル） -7- デァ ザグアノシン （化合物 3 1 ) 616mg を得た （収率⁶⁹.5% ) 。

m 185-187

1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.47-1.68 (m, 4H, - (CH.，）₂— )， 1.80— 1· 88 (m, 1H, 3' - Ha), 2.09-2.19 (m, 1H, 3'- Hb), 2.38 (t, 2H, .1=6.9Hz, CCCH₂) , 3.25 (q, 2H， J=6.8Hz, CH₂N) , 3.42-3.62 (m, 2H, 5， -Ha, b)， 4.17—4.30 (m， 2H, 2, - H, 4' - H) , 4, 90 (t, 1H, J = δ.5Hz, 5'- OH), 5.45 (d， 1H, J = 4.3Hz, 2' -OH) , 5.80 (d, 1H, J = 2.7Hz, l'-H), 6.28 (brs， 2H, 2— NH₂)， 7.11 (s, 1H, 8 - H)， 9.42 (brs, 1H, NHTf a) , 10.39 (s， 1H, 1-H)

参考例 33

7-デァザ - 7- (6"- ァミノ -1"-へキシュル） -3， -デォキシグァノシン- 5' -トリホ スフェート （化合物 3 2) の合成

3' -デォキシ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- 1' へキシュル） - 7- デァザグ ァノシン （化合物 3 1 ： 133mg， 0.3隱 ol)をリン酸トリェチル （1.33ml) に溶角 し、 — 20⁼Cまで冷却した後ォキシ塩化リ ン （25/ 1)を添加し 20Cで撹拌した： 30 分経過後、 ォキシ塩化リ ン （22μ ])を追加し、 さらに一晩撹拌した。 この反応液 を、 20。Cに冷却したトリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフェート を 0.5M含む DMF溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終了後、 トリェチルァミン- 水混液（4ml) を添加、 反応液をエーテルにて洗浄後、 DEA E- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.7 X30cm ;溶出液：炭 酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.6M 直線濃度勾配（ 全量 2し） ) で精製した- これに 25%アンモニア水 （20ml) を加え 1時問静置し、 减 圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E- トヨパールイオン交換カラムクロマト グラフィー （1.7 X30cm； 溶出液 ： 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (pH7.5)0M→0.3M直線濃度勾配（全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7-デァザ - 7- (6"-ァミノ- 1' へキシュル） -₃' -デォキシグアノシン—₅ '—トリホスフェート （化 合物 32) 108mg を得た （収率 36· 4% ) ,

実施例 6

R 1 1 0標識 7-デァザ- 3，-デォキシグアノシン- 5'-ト リホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡ C一であって、 n = 4の化合物） の合成

7 -デァザ- 7- (6"- ァミノ- Γ' -へキシュル） -3'-デォキシグアノシン- 5' -トリホ スフェー ト （化合物 3 2 ： 8 μ mol ) と 5-カルボキシローダミン 110-ビス - 卜 リフルォロアセテート コハク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製）

(lS^ mol ) を DMF (500 μ 1 ) - 水 （250 μ 1 ) に溶解し、 トリェチルアミ ン （0. 16ml) 及びピリジン （0.29ml) を加え、 一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 D E A E- トヨバールイオン交換カラムクロマトグラフィー

(1.7 X 0cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5 ) 0. 1M →0.8M 直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 下記式で示される R l 1 0標識 7 -デァザ- 3'-デォキシグアノシン- 5' トリホスフヱ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡ C一であって、 n = 4の化合物:. 以下、 R 1 1 0- 3 ' d G T P ( n 4 ) と略記する。 〕 3.38μ πιο1 を得た （収率 42.3% ) .

また、 得られた R 1 1 0 - 3 ' d G T P ( n 4 ) を、 DU 6 4 0紫外可視分 光 解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定 した結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 7に示す。

参考例 3 4 N- プロパルギルトリフルォロアセタミ ドの合成

に冷却したトリフルォロ酢酸メチル （東京化成製； 69.2g，0.54mol ) にブロ パルギルァミン （アルドリツチ社製： 25g， 0.45mol ) を滴下した。 0。Cで 2時間 反応後、 减圧蒸留 （23画 Hg; 沸点 77°C) により精製して、 N- プロパルギルト リフルォロアセタミ ド 43.8g (86.0% ) を得た。

参考例 3 5

3，-デォキシ -5- (3"- トリフルォロアセタミ ド -1"-プロピニル） ゥリジンの合 成

3'-デォキシ- 5- ョ一ドウリジン （化合物 2 ： 1.56g， 4.4画 ol)の DMF (22ml) 溶 液に窒素気流下、 参考例 3 4で得た N- ブロパルギルト リフルォロアセタミ ド

(1.54ml， 13.2画 ol)、 よう化銅 （ I ) ( 168mg， 0.88隱。1)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0 ) (508mg, 0.44瞧 ol)及びトリェチルァミン

(1.23ml, 8. Smmol)を加え室温で 4時間反応させた。 反応液を減圧濃縮して得た 残渣を塩化メチレン-メタノール混液（40ml) に溶解しイオン交換樹脂 AG1X8 (バ ィオラド社製， HC( 型； ½) を加え 3 0分間撹拌した： 濾別後、 濾液を濃縮し 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン- メ タノール混合溶液） で精製して、 3'-デォキシ- 5- (3"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-プロピニル） ゥリジン 918mg を得た （55.3% ) _;

1H-NMR (270MHz, D S0-d6) δ ppra: 1.89-1.92 (m， 1H， 3' -Ha), 2.17-2.26 (m, 1H, 3' -Hb) , 3.53, 3.76 (2dd， 2H， J = 3.1， 11.9; 2.7, 12.1Hz, 5' - Ha，b)， 4.22-4.30 (m, 4H, 2'— H， 4' - H， — CH₂— )， 5.20 (brs, 1H, δ' -OH) , 5.52 (d， 1H, J = 4.0Hz, 2'— OH), 5.75 (d， 1H, J = 1.9Hz, - H) , 8.34 (s， 1H, 6-H) , 10.06 (t， 1H, J=5.4Hz, NHTfa) , 11.67 (s, 1H, NH)

参考例 36

5- (3"- ァミノ- プロピエル） -3'-デォキシゥリジン- 5 トリホスフェートの 合成-

3'-デォキシ- 5- (3"- ト リフルォロアセタミ ド- 1"-プロピニル） ゥリジン (42tng,0.11瞧 oUをリン酸トリェチル （1.13ml) に溶解し、 - 20 。Cまで冷却した 後ォキシ塩化リン （25μ 1 ) を添加し - 20 ⁼Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ 塩化リ ン （22 μΐ ) を追加し、 さらに 5 時間撹拌した ₌ この反応液を、 -20 ^;C に冷却した参考例 4で得たトリス （トリ -n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ —トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜静置後、 25% アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した- 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （東ソ —社製； 1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素トリヱチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0·³Μ直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 5- (3"- ァミノ-じ-ブロビニル） -3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート 1 _mg を得た （収率 41.3% ) _c 参考例 3 7

TMR- 標識 3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て、 V がー C≡C一であって、 _n = 1の化合物） の合成

5- (3"- ァミノ- Γ'-プロピエル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト (10.5μιηο1 ) の 1M- 炭酸水素ト リェチルアンモニゥム緩衝液 （ρΗ9.05； 1.2ml) に 5-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミ ドエステル （モレキユラ 一プロ一ブ社製） （I5mg) の DMF 溶液 （0.9ml ) を加え室温で一夜撹拌した： 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨバールイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩 衝液（pH7.5)0.05M→0.7M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 TMR- 標識 3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於ける n= lの化 合物。 以下、 TMR- 3 ' d UT P (n 1 ) と略記する。 〕 7.38^ 11101を得た （収 率 70.2% ) ₀

参考例 38

3'-デォキシ- 5- (3"- トリフルォロアセタミ ド -1"-ブロビニル） シチジンの合 成

3， -デォキシ -5- ョードシチジン （化合物 6 ： 1.0g, 2.83mmol)の DMF 4ml) 溶 液に窒素気流下、 参考例 2で得た N- ブロバルギル ト リ フルォロアセタ ミ ド

(0.99mi, 8.50mmol)、 よう化銅 （I ) (108mg, 0.566mmol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0 ) (327mg, 0.283mmol)及びト リェチルァミン

(0.8ml，5.66國 ol)を加え室温で 30分反応させた- 反応液を塩化メチレン- メタ ノール混液 （25ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃— 型； 2.6g) を加え 3 0分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマ トグラフィ （溶出液；塩化メチレン- メタノール混合溶液） で精製して、 3'_デ ォキシ -5- (3"- トリフノレオロアセタミ ド- -ブ口ビュル） シチジン 879mg を 得た （収率 82.5% ) _c

1H- MR (270MHz, DMS0-d6) ό ppm: 1.64-1.71 (m， 1H， 3' _Ha) , 1.86-1.96 (m, 1H, 3'-Hb), 3.52-3.57 (m, 1H, 5' -Ha), 3.79-3.83 (m， 1H, 5，— Hb), 4.14-4.28 (m， 4H, 2，- H, 4'— H, — CH₂ -）， 5.18 (t, 1H， J = 5.0Hz， 5' - OH) , δ.53 (d, 1H, J = 3.8Hz, 2' -OH), 5.63 (s, 1H， 1 '- H)， 6.76 (brs, 1H, NH₂a)， 7.74 (brs, 1H, NH,b) , 8.38 (s， 1H， 6— H), 9.93 (brs, 1H， NHTfa)

参考例 3 9

5- (3 アミノ- '-プロビニル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ一卜の 合成

3'-デォキシ -5- (3 - ト リ フルォロアセタ ミ ド- Γ'-ブロ ビニル） シチジン (113mg，0.3讓 ol)をリン酸トリェチル （1.13ml) に溶解し、 - 20 ^CCまで冷却した 後ォキシ塩化リン （25 ) を添加し - 20 で撹拌した ₌ 30 分経過後、 ォキシ 塩化リン （22 μ ΐ ) を追加し、 さらに 5 時間撹拌した:. この反応液を、 -20 ⁼C に冷却した参考例 4で得たトリス （トリ - n- ブチルァンモニゥム） ピロホスフエ ートを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （½il ) を添加、 一夜静置後、 25% アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した ₌ 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を D E AE- トョバ一ルイオン交換カラムク口マ トダラフィ一（1.2 X 30cm：溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（ρ117. δ)0Μ -→0.3Μ 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 5- (3"- ァミノ- 1"-プロビュル） -3，-デォ キシシチジン- 5' -トリホスフェート 115mg を得た （収率 41.3% ) 。

参考例 4 0

XR-標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェー ト （一般式 〔 I〕 に於いて、 V が一 C≡C一であって、 n = lの化合物） の合成

5- (3"-ァミノ- Γ'-プロビニル） -3,-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （8 β mol ) を溶解した 1M- 炭酸水素トリェチルアンモ -ゥム緩衝液 （pH⁹.05; 0.4ml ) に、 5-カルボキシ- X- ローダミンコハク酸イ ミ ドエステル （モレキュ ラ一プローブ社製） （I5mg) の DMF溶液 （0.9ml ) を加え室温で一夜撹拌した ₌ 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨバールイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩 衝液（pH7.5)0.1M—0.7M直線濃度勾配 （全量 2い ) で精製して、 X R-標識 3' - デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V が— C三 C—であって、 n = 1の化合物 ₌ 以下、 X R- 3 ' d CT P (n 1 ) と略記する- 〕 2.93 μ mol を得た （収率 36.6% ) ₌

参考例 4 1

7-デァザ- 7- (3"-トリフルォロアセタミ ド -1' プロビュル） -3'-デォキシアデノ

7 -ョード- 3'-デォキシ- 7-デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 0.5g， 1.33圍。1)の DMF (6.7ml ) 溶液に窒素気流下、 参考例 34で得た N- ブロバルギルトリフルォロ ァセタミ ド （0.47ml, 3.99mmol)、 よう化銅 （ I ) (51tn_g, 0.266睡 ol)、 テ トラキ ス （ トリ フエニルホスフィン） バラジウム （0) (154mg， 0.133mmol)及びト リェ チルァミン （0.37ml,2.66mmol)を加え室温で 30 分反応させた。 反応液を塩化メ チレン-メタノール混液（12ml)で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃—型； 1.22g ) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィ （溶出液：塩化メチレン-メタノール混合溶液） で精製して、 7-デァザ- 7- (3 - トリフルォロアセタミ ド- -プロビニル） - 3'-デォ： ノシン 436mg を得た （収率 82.3% ) _c 1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) 0 ppm: 1.83-1.91 (m, 1H， 3， - Ha)， 2.14-2.24 (m, 1H, 3'— Hb)， 3.48—3.56 (m， 1H, 5' -Ha), 3.66-3.73 (m, 1H, 5' - Hb) , 4.30-4.35 (ra, 4H， 2'-H， 4'一 H， — CH₂— ), 5.08 (t, 1H, J 二 5.5Hz, 5'— OH) , 5.59 (d， 1H, J = 3.8Hz， 2' - OH), 6.02 (d， 1H, J = 2.2Hz, l'-H), 6.80 (brs, 2H， NH₂)， 7.79 (s, 1H, 8— H) , 8.12 (s， 1H, 2— H), 10.08 (brs, 1H， NHTfa)

参考例 4 2

7 -デァザ- 7- (3" -ァミノ- -ブロビニル） -3，-デォキシアデノシン - 5'-ト リホス フニ一トの合成

7-デァザ- 7- (： Γ-トリフルォロアセタミ ド- '-ブロヒニル） -3'-デォキシアデノ シン （120mg， 0.3國。1)をリン酸トリェチル （1.2ml ) に溶解し、 - 20 ^CCまで冷却 した後ォキシ塩化リン （25μ 1)を添加し- 20 tで撹拌した。 30 分経過後、 ォキ シ塩化リ ン （22/i l)を追加し、 さらに 4 時間撹拌した： この反応液を、 -20 ^ZC に冷却した参考例 4で得たトリス （トリ -n- ブチルァンモニゥム） ピロホスフエ ートを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 3 時間撹拌した。 反応終 了後、 ト リェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜静置後、 25% アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DE AE- トョパールイオン交換カラムクロマトグラフィー（1.2 X 30cm：溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 7 -デァザ- 7- (3"- アミノ- 1"-プロピニレ） -3' -デォキシアデノシン- 5' -ト リホスフェート 114mg を得た （収率 39.9% ) ： 参考例 4 3

R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5' -ト リホスフェー ト （一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C—であって、 n= lの化合物） の合成 7-デァザ- 7— (3"- ァミノ- 1"-プロビュル） - 3，-デォキシアデノシン- 5' -トリホ スフヱート （8 //mol ) を溶解した 1M- 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝 液 （pH9.05;0.4ml) に、 5-カルボキシローダミン 6Gコハク酸ィミ ドエステル （モ レキュラープローブ社製） （14.5mg) の DMF 溶液 （0.8ml ) を加え室温で一夜 撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨバールイオン 交換カラムクロマ トグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアン モニゥム緩衝液（ρΗ7·5)0.1M—0.6M直線濃度勾配（全量 2し） ） で精製して、 R6 G 標識 7 -デァザ- 3' -デォキシアデノシン - 5'-卜リホスフエ一ト 〔- 般式 〔 1〕 に 於いて、 V が— C三 C—であって、 _η = 1の化合物。 以下、 R6G— 3 ' d A TP (n 1 ) と略記する。 〕 2·54μπιο1 を得た （収率 31.7% ) 。

参考例 44

3， -デォキシ -7- (3 "-ト リフルォロアセタミ ド -1' プロビュル） -7-デァザグアノ

3'-デォキシ- 7-ョ一ド- 7-デァザグァノシン （化合物 30 : 0.65g, 1.7mmol)の MF (8.5ml ) 溶液に窒素気流下、 参考例 34で得た N- ブロバルギルトリフルォロ ァセタミ ド （0.58ml, 5. Ommol)、 よう化銅 （ I ) (63mg， 0.33mmol)、 テ トラキス (トリフエニルホスフィン） バラジウム （0) (192mg，0.17画 ol)及びト リェチ ルァミン （0.46ml，3.31mmol)を加え室温で 1 時間反応させた。 反応液を塩化メ チレン -メタノール混液 （16ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC0₃—型； 1.6g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム-メタノ一ル混合溶液） で精製して、 3' -デォキシ- 7- (3"- トリフルォロアセタミ ド- -プロビュル） -7-デァザグァ ノシン 485mg を得た （収率 70.5% ) 。

1H-N R (270MHz, DMSO— d6) δ ppm: 1.81- 1.91 (m， 1H, 3' -Ha) , 2.10-2.21 (m, 1H， 3' - Hb), 3.42-3.68 (m， 2H, 5' - Ha, b)， 4.22-4.30 (m, 4H, 2'— H, 4， - H, - CH₂ -）， 4.94 (t， 1H, J = 5.5Hz, 5'— OH) , 5.49 (d, 1H, J = 4.3Hz, 2'— OH)， 5.81 (d, 1H, J = 2.4Hz, — H)， 6.32 (brs, 2H, 2 - NH₂) , 7.27 (s, 1H, 8 - H) , 10.05 (brs, 1H， NHTfa) , 10.50 (brs, 1H, 1— H)

参考例 4 5

7 -デァザ - 7- (3' ァミノ- 1 "-フ口ビニル） -3， -デォキシグァノシン - 5' -ト リホス フエ一卜の合成

3， -デォキシ- 7- (3"- トリフルォロアセタ ミ ド- -プロピニル） -7-デァザグァ ノシン （125mg, 0.3mmol)をリン酸トリェチル （1.25ml) に溶解し、 - 20 ^CCまで冷 却した後ォキシ塩化リン （25 μ 1)を添加し- 20 Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォ キシ塩化リン （22μ 1)を追加し、 さらにー晚撹拌した。 この反応液を、 -20 ⁼Cに 冷却した参考例 4で得たトリス （トリ - n- ブチルァンモニゥム） ピロホスフエ一 トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6mi ) に添加し、 室温で 3 時間撹拌した。 反応終了 後、 トリェチルァミン- 水混液（4ml) を添加、 反応液をエーテルにて洗浄後、 D EAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ一 （1.2 X30cm:溶出液： 炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.6.M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製した。 これに 25% アンモニア水 （15ml) を加え 1 時間静置し、 减 圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E- トヨパールイオン交換カラムクロマト グラフィー （1.2 X 30 ； 溶出液 ：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (ρΗ7· δ)0Μ →0.3Μ直線濃度勾配（全量 1L) ) で精製して、 ⁷-デァザ-⁷- (3"-ァ ミノ- -プロピエル） -3'-デォキシグアノシン- 5' -トリホスフェー ト 75mg を得 た （収率 25.9% ) 。

参考例 4 6

R 1 1 0標識 7-デァザ- 3'-デォキシグアノシン- 5， -ト リホスフェート （一般式

〔 I〕 に於いて、 V がー C≡ C一であって、 n = lの化合物） の合成

7 -デァザ - 7— (3"- ァミノ- -プロビュル） -3'-デォキシグアノシン - 5' -卜リホ スフェー ト （10.5 i mol ) と 5-力ノレボキシローダミ ン 110-ビス- トリフルォ 口アセテート コハク酸イ ミ ドエステル （モレキュラーブローブ社製） （31.5mg) を 腿 F (0.49ml) - 水 （0.23ml) に溶解し、 ト リェチルァミン （0. 16ml) 及び ピリジン （0.29ml) を加え、 一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した 後、 D E A E- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィー （1.2 X30cm； 溶出液：炭酸水素トリュチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5 ) 0. 1M→0.8M 直線濃 度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 R l 1 0標識 7-デァザ - 3'-デォキシグアノシ ン- 5' -トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡ C一であって、 n = 1の化合物。 以下、 R 1 1 0 - 3 ' d G T P ( n 1 ) と略記する。 〕 3. & 7 μ mol を得た （収率 34.9% ) ₀

実施例 7

R 1 1 0標識 3'-デォキシシチジン- 5' -トリホスフェー ト （一般式 〔 I〕 に於 いて、 V がー C≡ C一であって、 n = 4の化合物） の合成。

5- (6"-ァミノ- 1' へキシニル） -3'-デォキシシチジン- 5' -トリホスフェー ト (化合物 8 : 8 μ πιο1) を溶解した DM F (400 μ 1) -水 （200 μ 1) 混合液にトリ ェチルァミン （20μ 1) と 5-カルボキシローダミン 110 -ビス-トリフルォロア セテート コハク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （21 mol) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE - トヨパールイオン交換カラムク口マ トグラフィ一 · 7 X 15cm；溶出液：炭酸水 素トリェチルアンモニゥム緩衝液（p_H7.₅)0._1M→0._8M 直線濃度勾配 （全量 1L)) で精製して、 下記式で示される R l 1 0標識- 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホス フェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C一であって、 n = 4の化合物 ₌ 以下、 R 1 1 0- 3 ' d CT P (n 4 ) と略記する。 〕 5.83^mol を得た （収率 72.9%) .

また、 得られた R 1 1 0- 3 ' d CTP (n 4 ) を、 DU 640紫外可視分 光解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測 定した結果 （測定波長： 700腦〜 200n_m、 対称：蒸留水） を図 8に示す:.

実施例 8

R 6 G標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て、 V がー C≡C一であって、 n = 4の化合物） の合成。

5 - （6 ァミノ- しへキシェル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェー ト (化合物 8 : 8//mol) を溶解した DMF (2.9ml) -水 （0.9ml) 混合液にトリェ チルァミン （20 /i l) 、 6-カルボキシローダミン 6Gコハク酸イミ ドエステル （モ レキュラーブローブ社製） （16 xniol) とを加え室温で一夜撹拌した。 反応液に 水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE-トヨパ- オン交換カラムク口マ ト グラフィ一 （1.7X15cm； 溶出液： 炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液

(pH7.5)0.1Μ-→0.7M 直線濃度勾配 （全量 1L)) で精製して、 下記式で示される R

6 G標識- 3'-デォ: - 5' -ト リホスフ ト 〔一般式 〔 I〕 において n

=4の化合物:. 以下、 R 6G- 3 ' d CTP ( n 4 ) と略記する。 〕 5.83/zmol を得た （収率 43.1%) ：:

〔式中、 E tはェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す _c ]

また、 得られた R6G- 3 ' d CTP (n 4) を、 DU 640紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定し た結果 （測定波長： 700nm〜200nm、 対称：蒸留水） を図 9に示す。

実施例 9

X R標識 7-デァザ- 3'-デォ: -5'-ト リホスフェー ト （一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C一であって、 _n = 4の化合物） の合成。

7-デァザ- 7- (6"-アミノ- 1"-へキシュル） - 3，-デォキシアデノシン- 5'-トリホ スフヱ一ト （化合物 20： 8μιτιο1) を溶解した DMF (400 μ 1) -水 （400μ 1) の 混合液に、 トリェチルァミン （20μ 1) と 6-カルボキシ- X -ローダミンコハク酸 イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （22/imol) を加え室温で一夜撹 拌した： 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE-トヨパ一ルイオン交 換カラムク口マトグラフィー （1.7X 15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモ ニゥム緩衝液（ρΗ7·5)0· 1M→0.6M直線濃度勾配（全量 1L)) で精製して、 下記式で 示される XR標識 7-デァザ - 3，-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフェート 〔一般 式〔 I ] に於いて、 V がー C三 C—であって、 n = 4の化合物。 以下、 X R- 3 ' d AT P (n 4) と略記する： 〕 4.39 molを得た （収率 54.8%) 。

また、 得られた XR- 3 ' d AT P (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製] を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm〜2()0nm、 対称：蒸留水） を図 1 0に示す。

実施例 1 0 X R標識 7-デァザ- 3'-デォキシグァノシン- 5' -トリホスフェート（一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 η = 4の化合物） の合成。

7-デァザ- 7- (6"-ァミノ- -へキシュル） - 3'-デォキシグアノシン -5'-トリホ スフ工一ト （化合物 3 2 ： 8 πιο1) と 5-カルボキシ- X-ローダミンコハク酸ィ ミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （19μηιο1) を DMF (400^ 1) -水 （200 μ 1) に溶解し、 トリェチルァミン （20 μΐ) を加え、 一夜撹拌した。 反応液に水 (30ml) を加え希釈した後、 DEAE-トヨパ一ルイオン交換カラムクロマトグ ラフィ一 （1.7 X cm;溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5) 0.1M— 0.8M直線濃度勾配（全量 1L)) で精製して、 下記式で示される XR -標識- 7 - デァザ- 3，-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフエ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V が— C三 C—であって、 1 =4の化合物₌ 以下、 XR- 3 ' d GT P (n 4) と略記する。 〕 2.68/ molを得た （収率 33.5%) ₌

また、 得られた XR- 3 ' d GT Ρ (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 1 1に示す。 実験例 1

リンカ一鎖長の異なる 3，-デォキシターミネータ一の取り込み率の評価

この評価は、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.86， pp.4076-4080, June 1989 に記 載の方法に基づいて行った _c

〔鎵型 DNA〕

p B SKS ( + ) /p v u II (ス トラタジーン社製）

〔ターミネータ一〕

X R- 3 ' d CTP (n 4) (実施例 1の化合物）

XR- 3 ' d CTP (n 6) (実施例 2の化合物）

XR- 3 ' d CT P (n 1 ) (参考例 40の化合物）

X R- 3 ' d CTP (n 3 ) (参考例 6の化合物）

R6 G- 3 ' d AT P (n 4) (実施例 3の化合物）

R6G- 3 ' d AT P (n 6) (実施例 4の化合物）

R 6 G- 3 ' d AT P (n 1 ) (参考例 43の化合物）

TMR- 3 ' d UT P (n 4) (実施例 5の化合物）

TMR- 3 ' d UT P (n 1 ) (参考例 3 7の化合物）

R 1 1 0- 3 ' d GT P (n 4) (実施例 6の化合物）

R 1 1 0- 3 ' d GTP (n 1 ) (参考例 46の化合物）

〔操作方法〕

鐯型 DN A 1 μ g を、 各ターミネータ一， グアノシン- 5'-トリホスフェート （ r GTP) , ゥリジン- 5，-トリホスフェート （r UTP) , アデノシン -5'-トリホ スフェート （ r ATP) ， シチジン- 5'-トリホスフェート （r CTP) ， MgCl₂, スペルミジン- （HC1)₃， ジチオスレイ ト一ル （DTT ) ， トリス/ HC1 (ρΗ7. δ ) 及び Τ 7 R N Αボリメラ一ゼを終濃度が下記条件となるように含むサンプルチュ ーブに添加した後、 蒸留水により全体量を 10μ 1 とし、 これを試料とした e 〈条 件〉

ターミネータ'

X R- 3 ' d C T P μ Μ

R 6 G— 3 ' d AT P ： 20 μ Μ

TMR- 3 ' d U T P ： ΙΟ

R 1 1 0- 3 ' d G T P μ

G T P 500 μ Μ

r U T P 500 μΜ

r AT P 250 μ Μ

r C T P 250 μ Μ

MgCl₂ 5〜 10mM

スぺノレミ (HC1). 2mM

DTT ： 10m

トリス ZHC1 (_PH7.5 ) 40mM

T 7 R NAポリメラ一ゼ ： 25units ZlO μ 1

試料を 37 Cで 1時間加温した後、 ゲル濾過法により取り込まれなかったターミ ネーターを除去し、遠心分離により沈澱を採取した。次いで、該沈殿物を 3 μ 1ホ ルムアミ ドダイ （95%ホルムアミ ド含有 lOmME D T A) に溶解した後、 80^eCで 5分間加温した これを冷却した後、 4 %シークェンスゲルに 1.5 μ 1 ァブラ ィし、 AB I 3 7 7蛍光自動シークェンサ一 （AB I社製） による泳動を 5時間 行った。 シークェンサ一のゲルイメージ上での最終シグナル （ベース） を求める と共に、 最終ベース Zターミネ一ター濃度を算出し、 取り込み率を比較した。 その結果を表 1に示す。 表 1

*表中の値は最終ベースの実測値を、 nの数が 1の場合の取り込み率を 1とした取 リ込み率（相対値）として示す。

〔結果〕 表 1から明らかな如く、 XR- 3 ' 01じ丁？及び1^ 60- 3 ' d AT Pについて は、 nの数が 1のものよりも 4及び 6のものの方が取り込み率が著しく向上する ことが判る。 また、 TMR- 3 ' 0)し了丁？及び1¾ 1 1 0- 3 ' d G T Pについて も、 最終ベースの値の比較から、 nの数が 1のものよりも 4のものの方が取り込 み量が著しく向上することが判る。 更にまた、 X R- 3 ' d CT Pに於いては、 nの数が 1のものと 3のものとでは、 取り込み率に違いがないことが判る ₌ 以上のことから、 蛍光標識 3 ' d NT Pに於いて、 nの数を 4以上とすることに よりその取り込み量を著しく向上させることが判る- 言い換えれば、 これらを R N Aポリメラーゼを用いる連鎖停止法による D N A塩基配列決定法に於いてター ミネ一ターとして用いれば DNA塩基配列を簡便且つ短時間に、 高感度に決定し 得ることが判る。 参考例 4 7

6-トリフルォロアセタミ ド- 1 -へキセンの合成。

1 ) 5—へキセニノレー p—トルエンスノレフォネ一トの合成 ₌

氷冷した塩化 p-トルエンスルフォニル （54.78g，287mmol)のピリジン （100ml) 溶液に 5 -へキセン- 1 -オール 〔東京化成 （株） 製； 20ml,239mm_Ol〕 を滴下し、 その後 5^eCで 16時間撹拌した。 反応液を氷水 （500ml) に投入した後、 エーテル (500ml) で抽出し、 エーテル層を冷 1N -塩酸、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 および飽和食塩水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮して、 5-へ

44.37 gを得た （収率 72.9%) 。

5-へキセニル p-トルエンスルフォネート （44.3g, 174mmol)、 よう化ナトリウ ム （31.³g， 209画 ol)およびァセ トン （250ml) の混合液を 3時間環流反応させた： 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した- 得られた残渣をェ一テル （500ml) に 溶解後、 飽和亜硫酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液およ び飽和食塩水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮して、 6 -ョ 一 ド -1-へキセン 31· 27gを得た （収率 85.5%) 。

3) 6-トリフルォロアセタミ ド- 1 -へキセンの合成。

水素化ナトリ ウム （60%油性； 14.89g, 372讓 ol)の DMF (370ml) 溶液にト リ フルォロアセタミ ド （50.39g, 446誦 ol)を氷冷下、 約 10部分にわけて添加した： 次いで 6-ョード-卜へキセン （31.27g, 149mmol)の DMF (130ml) 溶液を加え、 室温で 3 時間撹拌した。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水 （300ml) およびエー テル （300ml) を加え抽出した。 エーテル層を飽和食塩水 （300ml) で二回洗浄後、 硫酸マグネシウムで乾燥して減圧下に濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー （溶出液；へキサン -酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 6- トリフルォロアセタミ ド- 1 -へキセン 24.36gを得た （収率 83· 8%) 。

1H-NMR (270MHz, CDC1₃) δ ppm: 1.39-1.69 (m, 4H, -CH, (CH ) ,CH₉-) , 2.04- 2.14 (m, 2H, H₂C=C— )， 3.37 (dd, 2H， J=7.0， 13.8Hz, CH₂N), 4.96-5.06 (m, 2H， =CHCH^ ), 5.71-5.86 (m, 1H, H₂C=CH) , 6.45 (brs, 1H, NHTfa)

参考例 4 8

3'-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド- 1"-へキセニル） ゥリジン （化 合物 3 3) の合成。

塩化パラジウム （1.77g, lOmmol)と塩化リチウム （0.85g, 20mmol)のメタノール (100ml) 溶液をー晚撹拌し、 リチウムテトラクロ口パラデートの 0.1M溶液を調 製した。 3'-デォキシゥリ ジン （化合物 1 ： 1.14g，5mmol)と酢酸水銀 （Π)

(1.60g，5mmol)を水 （50ml) に溶解し、 60:Cで 5時間撹拌した。 反応液を減圧下 に濃縮後、 残渣を無水メタノール （55ml) に懸濁させ、 先に調製したリチウムテ トラクロ口パラデ一トの 0.1M溶液 （55ml ) と参考例 4 7で得た 6-トリフルォロ ァセタミ ド- 1-へキセン （3.42g， 17.5mmoi)を加え 16 時間還流反応させた。 反応 液を硫化水素ガスで飽和させた後、 沈澱をセライ 卜を通して濾別し、 濾液を濃縮 した： 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； ジクロロメ タン -メタノール混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0 X 250mm, 溶出液：ァセトニトリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 3'-デォ キシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド- Γ'-へキセニル） ゥリジン （化合物 3 3)

Claims

請求の範囲

( 1 ) 下記一般式 〔 I〕 で示される 3' -デォキシリボヌクレオチド誘導体

Q— V— (CH₂) _n— NH— R 〔 I〕

〔式中、 Qは 3'-デォキシリボヌクレオチド残基を表し、 nは 4以上の整数を表 し、 Vは一 C≡C一又は一CH = CH—を表し、 Rは蛍光性を有する基を表す： 〕

(2) n力； 4〜 1 0の整数を表す請求項 1記載の 3' -デォキシリボヌクレオチド 乃導体。

(3) n力 4〜 8の整数を表す請求項 1記載の 3' -デォキシリボヌクレオチド誘 導体:.

(4) nが 4または 6である請求項 1記載の 3，-デォキシリボヌクレオチド誘導 体。

(5) Rが下記一般式 〔VII 〕 で示される請求項 1記載の 3'-デォキシリボヌク レオチド誘導体。

C二 0

〔式中、 wはカルボキシル基を表し、

Xは一 O—、 —S—、 -NR' 一 （但し、 R' は、 水素原子、 低級アルキル基、 ァラルキル基又はァリール基を表す） 又は一 CH₉ —を表し、 環 A及び環 Bは何れか一方が

であり、 他方が

であり （但し、 Zは、 〇又は =N⁺ R, R₂ を表し、

Yは、 OH又は NR, R, を表し、 （但し、 R, 及び R, は、 夫々独立して水 素原子又は低級アルキル基を表すか、 または、 R, 及び R₉ が共にトリメチ 基を表す （但し、 該 2つのトリメチレン基の各他端は、 該 2つのトリメチレン基 を有する窒素原子が結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の 両隣の炭素原子の何れか一方とそれぞれ結合している） ） ） 、

環 C

に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味し、 上記環 A、 B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更に置換基を有していても よい。 〕

(6) Xが一 O—である請求項 5記載の 3，-デォキシリボヌクレオチド誘導体-

(7) Zが = Ν⁺Ι^Κ₂であり、 Υがー NR,R₂である請求項 5または 6記載の 3， - デォキシリボヌクレオチド誘導体。

(8) R, 及び R₂ は、 夫々独立して水素原子又は炭素数 1〜6の低級アルキル 基を表すか、 または 及び R₂ が共にトリメチレン基を表す請求項 7に記載の 3'-デォキシリボヌクレオチド誘導体：

(9) 環 A、 B及び C並びに Wを有するベンゼン環の少なくとも 1.つの環が置換 基として炭素数 1〜6の低級アルキル基を有する請求項 5〜 8のいずれか 1項に 記載の 3，-デォキシリボヌクレオチド誘導体

(1 0) Vがー CH二 CH—である請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の 3' -デ ォキシリボヌクレオチド誘導体。

(1 1 ) Vがー C三 C—である請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の 3，-デォキ シリボヌクレオチド誘導体。

( 1 2) 請求項 1〜1 1のいずれか 1項に記載の 3'-デォキシリボヌク レオチド 誘導体からなる R N Aポリメラーゼを用いた塩基配列決定法に用いられるタ一ミ ネーター。